JPH02262060A - 免疫分析方法及び免疫分析試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） 本発明は試料中の特定の被検物質を定量分析するための
免疫分析方法及び免疫分析試薬に関する。

（従来の技術） 抗原抗体反応を利用して特定の抗原または抗体を定量す
る免疫分析方法は、抗原抗体反応が特異的な反応であり
特定の抗原及び抗体が選択的な反応をするため、非常に
有効な方法として知られている。特に補体を加えて補体
の働きによりリポソームを破壊し、遊山した標識物質を
測定することにより特定の抗原または抗体を定量する免
疫分析方法はこれまで数多く示されている。一方このよ
うな補体を利用した免疫分析方法では、被検物質以外に
検定試薬と反応する非特異因子と補体の働きにより、一
部のリポソームが被検物質が関与することなく破壊され
て標識物質が遊山してしまい、測定誤差を生じるという
問題があった。

先に本発明者らが出願した特開昭６１−２５０５５９号
は、このような免疫分析方法を行なう前にあらかじめ前
処理用試薬を投入し、被検物質以外に検定試薬と反応し
て標識物質の遊山をもたらす非特異因子と前処理用試薬
とを反応させることにより、非特異因子に由来する測定
誤差を除去しようとするものである。

しかしながらこの免疫分析方法においても、検定試薬に
よって免疫分析を行なう際に、前記非特異因子と前処理
用試薬との反応生成物が共存しているために、非特異因
子に由来する測定誤差が完全に取り除かれてはいなかっ
た。

（発明が解決しようとする課題） 前述したように従来の免疫分析方法では、非特異因子が
検定試薬と反応し、さらに補体作用によりリポソームの
破壊が引き起こされ、標識物質を遊山せしめるために、
被検物質と検定試薬との抗原抗体反応に伴なって遊山す
る標識物質を精密に定量できないという問題点があった
。

本発明はこのような問題を解決して、非特異因子に由来
する測定誤差が少なく、より精密な免疫分析方法を提供
することを目的としている。

〔発明の構成〕

（課題を解決するための手段及び作用）本発明はリン脂
質及び糖脂質の少なくとも一方からなる第一のリポソー
ムと、前記リポソームに固定剤を介して前記第一のリポ
ソーム上に固定化さ九た、試料中の被検物質との抗原抗
体反応性を有する第一の生理活性物質と、前記第一のリ
ポソーム内に封入された標識物質とからなる検定試薬を
用い、前記検定試薬と補体とを試料に投入し、前記被検
物質と反応させることにより遊山した前記標識物質を測
定することで、前記被検物質を定量する免疫分析方法に
おいて、前記検定試薬と補体とを試料に投入し１．前記
被検物質と反応させる過程の前に、リン脂質及び糖脂質
の少なくとも一方からなる第二のリポソームと、前記第
二のリポソームに導入された、検定試薬中に含まれるも
のと同一の前Ｖ固定剤と、前記第二のリポソーム内に封
入された磁性体粒子とからなる前処理用試薬を前記試料
中に投入して、試料と前記処理用試薬を反応させた後に
磁石等を用いて反応生成物を分離する過程を具備せしめ
た免疫分析方法である。

さらには本発明は前記第一の生理活性物質が抗体の少な
くとも一部からなり、前記前処理用試薬に固定剤を介し
て免疫グロブリンの少なくとも一部からなる第二の生理
活性物質が固定化され、前記第二の生理活性物質が前記
第一の生理活性物質と同一の分子構造を含むことを特徴
とする免疫分析方法である。また本発明は上述したよう
な免疫分析方法において用いられる検定試薬及び前処理
用試薬とからなる免疫分析試薬である。

本発明に係る検定試薬を用いた免疫分析方法では、検定
試薬中に含まれる固定剤が上記したような非特異的反応
に関与することが知られている。

従って、前記固定剤を含んだ前処理用試薬を試料に投入
することにより、あらかじめ試料中に含まれる非特異因
子と反応させることができる。このとき前処理用試薬を
構成するリポソーム内には磁性体粒子を封入しておくこ
とにより、磁石等によって上記反応による反応生成物を
反応系外に分離すれば、試料中の非特異因子を分離する
ことができる。さらにこのとき、過剰の前処理用試薬も
同時に分離される。なお前記前処理用試薬の投入は補体
の投入前になされるため、非特異的反応に伴ない、前記
前処理用試薬を構成するリポソームが破壊され磁性体粒
子が遊山するおそれはない。従って上記したような本発
明の免疫分析方法においては、前述したような測定誤差
をもたらす非特異因子をあらかじめ９眉することができ
る。

本発明において、検定試薬を構成するリポソーム上に固
定化される第一の生理活性物質としては抗原及び抗体の
少なくとも一部を用いることができる。さらに本発明者
らは、第７の生理活性物質として抗体の少なくとも一部
を用いた場合、固定剤に加えて前記抗体の少なくとも一
部が非特異的反応に関与することがあるという知見を得
た。従って検定試薬中の第一の生理活性物質が抗体の少
なくとも一部である場合は、前処理用試薬において、前
記抗体の少なくとも一部と同一の分子構造を含み、試料
中の被検物質とは抗原抗体反応をしない第二の生理活性
物質が、検定試薬で用いられたものと同一の固定剤を介
してリポソーム上に固定化されることがより望ましい。

このような第二の生理活性物質としては免疫グロブリン
の少なくとも一部を用いることができる。すなわち前処
理用試薬を構成する第二のリポソーム上に前記免疫グロ
ブリンの少なくとも一部を固定化することで、より確実
に前述したような非特異因子を分離することができる。

ただし前述したように前記免疫グロブリンの少なくとも
一部は、前記抗体の少なくとも一部と同一の分子構造を
含むが、これは前記抗体及び免疫グロブリンがＩｇＧ等
の同じ免疫グロブリンク、ラスに属することを意味する
。さらに前記抗体及び免疫グロブリンがＩｇＧユ等の同
じ免疫グロブリンクラスに屓することがより望ましい。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームの主要構成
成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともい
ずれか一方が用いられる。本発明で用いられるリン脂質
及び糖脂質は特に限定されジパルミトイルフォスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルフォ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリス
トイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（
ＤＳＰＥ）、糖脂質としてガングリオシド、スフィンゴ
糖脂質、グリセロ糖脂質などが挙げられる。

これらリン脂質、糖脂質の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数が
１２〜１８であることが好ましく、さらに偶数であるこ
とがより好ましい。なお、必要に応じてリン脂質、糖脂
質に対してコレステロールをＩＯ〜することができる。

また検定試薬を構成する第一のリポソームと前処理用試
薬を構成する第二のリポソームとは、必ずしも同一組成
である必要はなく１例えば異なる脂質を用いても構わな
い。

本発明の免疫分析試薬中の検定試薬において。

能な物質が選択される。この様な物質としては。

例えば高濃度では自己消光により蛍光を示さないが、低
濃度（例えば、１０−３Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発
するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質；リ
ポソーム外で酸化反応により発光するルミノールやルシ
フェリンのような発光性物質；可視域又は紫外域に特異
的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸
化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化水素
生成をもたらすグルコース、シュークロース等の糖類；
テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオ
ン性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤ）のような補酵素類；メチルビオロゲンなどのラ
ジカル化合物等が挙げられる。

これらの化合物は、検出方法、感度及びリポソームの安
定性等の因子を考慮したう丸で適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬中の前処理用試薬において、第二
のリポソーム内に封入される磁性体粒子としては、リポ
ソームの粒子径より小さなマグネタイトあるいはフェラ
イト粒子が選択される。例えば、平均粒径が数−程度の
多重層リポソームの場合には、通常１００〜２００ｎｍ
の粒径を持つマグネタイトが用いられる。

本発明に係る検定試薬において、第一のリポソーム上に
固定化、される第一の生理活性物質にｉｔ前述したよう
に被検物質との抗原抗体反応性を有する抗原または抗体
の少な、くとも一部が用いられる。

前記第一の生理活性物質が抗体の少なくとも一部である
ときは、当該抗体はＩ　ｇＧ　、　Ｉ　ｇＥ　ｒ　Ｉ　
ｇＤ　＋ＩｇＡ、ＩｇＭ等いかなる免疫グロブリンクラ
スに属するものであってもよいが、感度向上という点か
らは、モノクローナル抗体を使用することが望ましい。

また抗体の一部を除去して得たＦ（ａｂ’）。

抗体でもよい。さらに本発明に係る前処理用試薬におい
て、第二のリポソーム上に免疫グロブリンの少なくとも
一部を固定化する場合には１．免疫グロブリンはどのよ
うな免疫動物より得られたものであってもよいが、でき
れば第一のリポソーム上に固定化された生理活性物質と
同一起源であることがより望ましい。

以下に、本発明の免疫分析試薬の製造方法について説明
する。

まずリン脂質及び糖脂質の少なくとも一方に固定剤を導
入するために、ハロゲン化酢酸のサクシンイミドエステ
ルを合成し、これをリン脂質または糖脂質中のアミノ基
と反応させ、分取用薄層クロマトグラフィー等の方法に
より精製する。

次いで、前記のようにして得られたハロゲン化アセチル
基を有するリン脂質や糖脂質、及び必要に応じて、コレ
ステロールや他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒
を加えて溶解・混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥
する。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される
。続いてフラスコ内に、検定試薬の場合には標識物質、
また前処理用試薬の場合には磁性体粒子を含有する水溶
液をそれぞれ加え、密栓して浸盪することにより、リポ
ソームの懸濁液をそれぞれ調製する。

一方、検定試薬においてリポソーム上に固定化される第
一の生理活性物質については、ペプシンなどによる酵素
処理若しくは還元処理を施して遊離のＳＨ基を付与する
か、または５ＰＤＰ（Ｎ−サクシンイミジル３−（２−
ピリジルチオ）プロピオネ−トコなどの二官能性試薬と
反応させた後に還元してＳＨ基を導入する。さらに前処
理用試薬において、リポソーム上に免疫グロブリンの少
なくとも一部を固定化する場合には、同様に免疫グロブ
リンの少なくとも一部にＳＨ基を導入するが、このとき
前記第一の生理活性物質と同一の処理を施すことが望ま
しい。

最後に、前記リポソーム懸濁液と前記第一の生理活性物
質とを適当な緩衝液中で反応させ、第一の生理活性物質
をリポソーム上に固定化させる。

また必要に応じて、同様の方法で免疫グロブリンの少な
くとも一部をリポソーム上に固定化させる。

以上のような本発明の免疫分析試薬は、以下のようにし
て使用される。例えば試料中の被４検物質もマ 字壽令抗原である場合、まず試料に前処理用試薬を加え
て一定時間反応させた後、磁石等を用いてだ検定試薬及
び補体を試料に加えて一定時間反応標識物質の量と、試
料中の被検物質の量の間には亀 相関関係があるので、Ｊ出した標識物質を適当な分析方
法、例えば！！！Ａ識物質が蛍光性化合物のときには蛍
光分析によって定量することにより、被検物質を定量す
ることができる。

さらに本発明では、検定試薬及び補体を試料に加えると
き、必要ならば被検物質との抗原抗体反応性を有する第
二の抗体を加え、サンドインチ・く〉 アッセイ法を行なうこともできる。本発明では、いわゆ
るインヒビッション・アッセイ法を行なうこともできる
。この方法では前処理用試薬を投入する前に、試料中に
含まれている特定の物質との抗原抗体反応性を有する生
理活性物質を、一定量過剰に加えて試料と反応させる。

その後過剰の前記生理活性物質を被検物質として、本発
明の免疫分析試薬を利用して定量することにより、試料
中に初めから含まれていた特定の物質も定量できる。

そして、実際の定量分析においては、予め既知の濃度の
被検物質を用いて検量線を作成しておき。

同一条件で未知の濃度の被検物質を含む試料との反応に
より鍵山した標識物質の量を測定し、前記検量線に基い
て被検物質の濃度を定量する。

本発明の免疫分析試薬と被検物質を含む試料との充分な
反応に要する時間は、被検物質の種類、リポソームの特
性、反応条件、更にはリン脂質又は糖脂質に固定化され
た生理活性物質の種類、量、純度などによって異なる。

このため１個々の場合に応じて、前述した検量線の作成
の際に、特定の濃度に調製された被検物質を含む試料を
用いて予備測定を行ない、最適反応時間を設定すること
が望ましい。

本発明の免疫分析試薬によって定量が可能な被検物質と
しては、腫瘍マーカー（ＡＦＰ、、ＢＦＰ。

ＣＥＡ、ＰＯＡなど）、免疫グロブリン（Ｉ　ｇ　Ｇ　
ｅＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなど）、ホルモン（インシュ
リン、Ｔ３など）及び薬物などが挙げられ、その対象は
広範囲にわたる。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

本実施例において用いた試薬のうちジパルミトイルフオ
スファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）、ジパルミトイ
ルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及
びコレステロールはシグマ社製のものを用いた。他の試
薬は市販品（特級）を精製せず、に使用した。なお、水
は全てイオン交換水を用いた。

■、検定試薬の調製 以下に示す過程に従って、リン脂質としてＤＰＰＥ、固
定剤としてブロモアセチル基、生理活性物質としてモノ
クローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体の一部、標識物質として
カルボキシフルオレセインを利用した検定試薬を調製し
た。

■ブロモアセチル（ＢｒＡｃ）　−Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅの合
成ブロモ酢酸１４０−■［１ミリモル］をクロロホルム
３０−に溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ペプ
チド研究新製）１４０■［１，２ミリモル］及びＮ。

Ｎ′−ジシクロへキシルカルボジイミド［ペプチド研究
新製］２５０■［１，２ミリモルコを添加し、室温で３
時間反応させた後、ロータリーエバポレータで溶媒を除
去し、酢酸エチル３０ｄを加えた。生じた白色沈殿を炉
別し、再び溶媒を除去した後、クロロホルム１０ｄに再
溶解させた。

さらニア０．（７）　Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅ　［１００μｍＦ
−／Ｌｚｌを２０ｍＱノクロロホルムに懸濁し、これに
前記ブロモ酢酸サクシンイミドエステル溶液１．５ｄ及
びトリエチルアミン（ＴＥＡ）５０μＱを加えて２０℃
で一晩撹拌した。

反応後、メタノール及び３％クエン酸水溶液を用いてＴ
ＥＡを抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、エバポレ
ータを用いて溶媒を完全に除去した。

次いで、シリ・カゲル°の分取用薄層クロマトグラフィ
ー（＃　５７１７．　Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、クロロ
ホルム／メタノールエフ／３混合溶媒を展開溶媒として
、生成物を精製した。収率は６０％であった。なお、最
終生成物は１ｍＭの濃度になるようにクロロホルムで希
釈した。

■リポソームの調製 使用した脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／ｌ）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃ２００μ４２．１０ｍＭのコレ
ステロールｉｏｏ　ｐ　ａ、・及び■で調製した１ｍＭ
のＢｒＡｃ−ＤＰＰＥ５０μｅを、１０ｍＱ容量のナシ
型フラスコに入れ、更にクロロホルム２ａＱを加えてよ
く混合した０次に、約４０℃の水浴中でロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した。再びクロロホルム２ｄ
を加えて十分に撹拌した後、再度ロータリーエバポレー
タにより溶媒を除去した。この操作を数回繰り返すと、
フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。

続いて、フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで
約１時間吸引して溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマンコダック社製、ｐＨ７，４：以下、ＣＦと記す）
１００μｉを添加し、フラスコ内部を窒素で置換した後
、密栓して約６０℃の水浴中に約１分間浸漬した。続い
て、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、フラスコ壁面の脂質
薄膜が完全に消失するまで（約１゜分間）、　フラスコ
を激しく振盪した。この操作によりリポソーム懸濁液が
調製された。更に、リポソーム懸濁液に、０．０１Ｍの
ＨＥＰＥＳ緩衝液（０，８５％ＮａＣＱ含有、ｐＨ７，
４５：以下、ＨＢＳと記す）を少量添加した後、すべて
遠心チューブに移し、４℃において１５０００ｒｐｍで
２０分間遠心する操作を数回繰り返した。最後に、０．
０１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０，８５％ＮａＣＱ含
有：以下、ＢＢＳと記す）でセラムチューブ（コーニン
グ社製）にリポソームを移し、１度遠心分離して上澄を
除去した後、後述するモノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗
体固定化反応に使用するまで冷蔵庫に保存した。

■モノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体の修飾モノクロー
ナル抗−ヒトＡＦＰ抗体１０ｍｇ＆ｐＨ４，５の酢酸緩
衝液に溶解し、ペプシン（シグマ社製）１００μｇを添
加し、３７℃で１時間反応させた０次に。

高速液体クロマトグラフィーによりＦ　（ａｂ’　）２
分画のみを分取した。このＦ　（ａｂ’　）２分画（ｐ
８６．０．０．１Ｍリン酸緩衝液中）にメルカプトエチ
ルアミン・塩酸塩１０■を加え、３７℃で９０分間反応
させ、ゲル濾過（セファデックスＧ−２５使用、ＢＢＳ
）により遊離のＳＨ基を含有したタンパク質分画（Ｆａ
ｂ’）のみを分取した。このタンパク質分画の溶液につ
いては、分子吸光係数（ＯＤ）２８０ｎｍ　＝　１であ
った。

■モノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体のリポソーム上へ
の固定化 前記リポソーム懸濁液とＦ　ａｂ’　の溶液とを混和し
、２０℃で４４時間撹拌・反応させた６反応後、ゼラチ
ン・ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−と記す）で３回
洗浄した。最後に、得られた検定試薬をＧＶＢ″″２−
に懸濁させて４℃で保存した。

ｎ、ＡＦ、ＰＩＩｌ準液による検定試薬の検量線の作製
ヒトＡＦＰ　（日本バイオテスト研究新製）を予めＧ　
Ｖ　Ｂ”＋（Ｇ　Ｖ　Ｂ−に０．５ｍＭ　ＭｇＣ（１，
を添加したの１０倍希釈溶液１０μＱを加え、３７℃で
１０分間反応させた０次に、ウサギ抗−ヒトＡＦＰ抗体
（Ｄａｋ。

社ｍｌ）の５０倍希釈溶液２５μｅ及び補体（モルモッ
ト血清；補体価＝　２５０）の２０倍希釈溶液２５μＱ
を添加し、３７℃でさらに３０分間反応させた。反応後
、０、ＯＩＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１００μＱ
で反応を停止させ、各濃度のヒトＡＦＰ溶液について、
邂 Ｊ出したＣＦ量を蛍光分光光度計（ＭＴＰ−３２、コロ
ナ電気製）により励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０
ｎ鳳の条件で測定した。

そして１次式に基づいて相対蛍光強度を計算した。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、ＦＯ：ヒトＡＦＰの
代りにＧＶＢ２＋を加えたとき（リポソームが全く破壊
されていないとき）の蛍光強度、Ｆａ：脱イオン水を添
加してリポソームを全て破壊したときの蛍光強度である
。なお、標準値としてｌｏ−７及び１０−’　ＭのＣＦ
温溶液蛍光強度を用いた。

この測定結果を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に、本免疫分析試薬を用いて１〜１１０３ｎ／ｍＱの範
囲でヒトＡＦＰの定量ができることが分かる。

■、前処理用試薬の調製 生理活性物質としてモノクローナル抗−ヒトＡＦＰ抗体
の一部の代わりにマウス免疫グロブリンＧ（カッペル社
製）をリポソーム上に固定化し、ＣＦの代わりに磁性体
粒子（間材製油製、粒径１０１００ｎをリポソーム内に
封入した以外は検定試薬を調製したのと同様の方法で、
前処理用試薬を調製した。

■、検定試薬及び前処理用試薬を用いたヒト血清中のＡ
ＦＰの定量 試料のヒト血清１０μａと■で調製した前処理用上 試薬のｌＯ倍希釈液１０μｍ４混合し、３７℃で１０分
間反応させた。次いで、磁石により反応生成物を分離・
回収し、残存血清に１で調製した検定試薬の１０倍希釈
液１０μａ、　ウサギ抗−ヒトＡＦＰ抗体（Ｄａｋｏ社
製）の５０倍希釈溶液２５μａ及び補体（モルモット血
清、補体価＝　２５０）の２０倍希釈溶液２５μａを添
加し、３７℃でさらに３０分間反応させた。反応後、０
．ＯＩＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１００μＱ迷 で反応を停止させ、改出したＣＦ量を蛍光分光光度計（
ＭＴＰ−３２，コロナ電気製）により励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で測定した。測定結果よ
り■で作製した検量線を用い・て、血清中のＡＦＰ濃度
を決定した。　このようにして２００検体についてＡＦ
Ｐを定量してＲＩＡ　（ラジオイムノアッセイ）で測定
した値と比較したところ、２ＳＤを超えてＲＩＡによる
測定値から事前したものは３検体のみであり、相関係数
は０．９８であった。

一方前処理用試薬による非特異因子の分離を行なわずに
、検定試薬によるＡＦＰの定量を同様に行なったところ
、２ＳＤを超えてＲＩＡによる測定値から事前したもの
が３５検体あり、相関係数も０．８２で、本発明に係る
免疫分析方法においてＡＦＰのより精密な定量を行なう
ことができた。

実施例−２ ■、検定試薬の調製 以下に示す過程に従って、リン脂質としてＤＰＰＥ、固
定剤としてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ
）、生理活性物質としてヒｈＩｇＧ、標識物質としてカ
ルボキシフルオレセインを利用した検定試薬を調製した
。

■ＤＴＰ−ＤＰＰＥの合成 密栓付三角フラスコにＤＰＰＥ７０■を分取し、クロロ
ホルム／メタノール（５／１）混合溶媒２５−に溶解し
た。次に、トリエタノールアミン６０μａ及び５ＰＤＰ
（ファルマシア社製）５０■を添加し、窒素置換した後
、室温で１時間反応させてジチオピリジルプロピオン酸
アミド（ＤＴＰ）を導入した。続いて、ロータリーエバ
ポレータにより溶媒を除去した。次いで、乾燥物をクロ
ロホルム／メタノール（１０／’１）混合溶媒に溶解し
た後、シリカゲルカラムを用いて精製し、ＤＴＰ−ＤＰ
ＰＥの分・画を回収した。更に、ロータリーエバポレー
タにより約５−まで濃縮した。ＤＴＰ−ＤＰＰＥの収率
は８０乃至９５％であった。これを窒素封入して一２０
℃で保存した。

■リポソームの調製 実施例−１と同様の方法により、■で合成したＤＴＰ−
ＤＰＰＥを用いてカルボキシフルオレセインが封入され
たリポソームを調製した。

■ヒトＩｇＧの修飾 ヒトＩｇＧ（ＩＣＮバイオイムノロジカルズ社ＩＢ）　
”ｆ３ｍｇヲｏ、５ｍＱｃ７）ＨＢ　Ｓ４：ｌ解Ｌ、１
０　μＱ（１）　１０ｍＭ５ＰＤＰエタノール溶液を添
加し３７℃で３０分間反応させた。反応後、０．１Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４，５）を用いてゲル濾過し、タンパク
質分画のみを回収した。　このうちの０．５ｄに１０■
のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加して、３７℃で
３０分分間光処理を行なった。さらにＨＢＳでゲル濾過
し、再びタンパク質分画のみ回収した。このタンパク質
分画の溶液については○Ｄ　２８０ｎｍ″：１．５であ
った。

■ヒトＩｇＧのリポソーム上への固定化■で調製したリ
ポソーム懸濁液に■で修飾したヒトＩｇＧ　０．５ｍＱ
を加え、　よく分散後２０℃で２０時間撹拌・反応させ
た。反応後、ＧＶＢ−で２回遠心洗浄操作を行ない、最
後に２ｄのＧＶＢ−及び５０μＱの１０％ＮａＮ、を添
加して充分に撹拌した後、冷蔵庫で保存した。

■、ウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体標準液による検定試薬の
検量線の作製 実施例−１でヒトＡＦＰ＠準液を用いて検量線を作製し
たのと同様の方法により、■で調製した検定試薬の検量
線を作製した。

■、前処理用試薬の調製 ヒトＩｇＧをリポソーム上に固定せず、ＣＦの代わりに
磁性体粒子をリポソーム内に封入した以外は検定試薬を
調製したのと同様の方法で、前処理用試薬を調製した。

■、検定試薬及び前処理用試薬を用いたヒト血清中のヒ
トＩｇＧの定量 ３０人のヒト血清を試料として用い、ヒト血清中に含ま
れるヒトＩｇＧをインヒビッション・アッセイ法によ・
り定量した。すなわちヒト血清中にあらかじめ一定量の
ウサギ抗−ヒト１ｇＧ抗体を過剰に加えて反応させた。

この後、■で作製した検量線に基づき、Ｉ及び■で調製
した検定試薬及び前処理用試薬を用いて過剰のウサギ抗
−ヒトＩｇＧ抗体を定量することにより、　ヒトＩｇＧ
の定量を行なった。得られた測定値をＲＩＡによる測定
値と比較したところ、相関係数は０．９８でありばらつ
きの少ない良好な結果が得られた。

〔発明の効果〕

以上詳述したように本発明は、測定誤差の少なく精密な
被検物質の定量が可能な免疫分析方法及び免疫分析試薬
を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る検定試薬によるＡＦＰ濃度測定の
検量線を示す特性図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方からなる第
   一のリポソームと；前記第一のリポソームに導入された
   固定剤と；前記固定剤を介して前記第一のリポソーム上
   に固定化された、試料中の被検物質との抗原抗体反応性
   を有する第一の生理活性物質と；前記第一のリポソーム
   内に封入された標識物質とからなる検定試薬を用い、前
   記検定試薬と補体と試料とを反応させることにより遊山
   した前記標識物質を測定することで、前記試料中の被検
   物質を定量する免疫分析方法において、リン脂質及び糖
   脂質の少なくとも一方からなる第二のリポソームと；前
   記第二のリポソームに導入され、検定試薬中に含まれる
   ものと同一の固定剤と；前記第二のリポソーム内に封入
   された磁性体粒子とからなる前処理用試薬を用い、前記
   前処理用試薬と試料とを反応させた後に反応生成物を分
   離し、その後前記検定試薬と補体と試料との反応を行な
   うことを特徴とする免疫分析方法。
2. （２）検定試薬中の第一の生理活性物質が、抗体の少な
   くとも一部からなり、前処理用試薬に固定剤を介して免
   疫グロブリンの少なくとも一部からなる第二の生理活性
   物質が固定化され、前記第二の生理活性物質が前記第一
   の生理活性物質と同一の分子構造を含むことを特徴とす
   る請求項１記載の免疫分析方法。
3. （３）請求項１又は２記載の検定試薬と前処理用試薬と
   からなる免疫分析試薬。