JPH0269662A - 免疫分析試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的コ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を特異的
に定量分析するための免疫分析試薬及びその製造方法に
関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）が
用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いるた
め、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが操
作を行わなければならず、しかも廃棄物の処理等にも注
意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫電気泳動が
知られている。しかし、免疫電気泳動ではａｌｌｌ定に
長時間を要するうえ、感度が低く被検物質がごく微量し
か含まれていない場合には適用することができないとい
う問題がある。

そこで、本発明者らは先に特開昭ＧＯ−１１７１５９号
において、内部に親水性の標識物質を封入し、ジスルフ
ィド結合を介して親水性の抗体又は抗原を固定化した免
疫分析試薬を開示した。この試薬を用いた免疫分析方法
は以下のようなものである。

すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に前記免疫分
析試薬を加え、これと別に補体を加えると、抗原−抗体
反応及びそれに伴う補体の作用によってリポソームが破
壊され、封入されていた標識物質（例えば蛍光性化合物
）が流出する。この流出した標識物質の量と、試料中の
被検物質の量との間には相関関係があるので、流出した
標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分析）によって
定量することにより、被検物質を定量することができる
。この試薬を用いれば、ＲＩＡのような問題が生じるこ
とはなく、免疫分析の簡便化が期待できる。

しかし、この免疫分析試薬を用いて血清やタンパク質を
含有する試料の分析を行った場合、抗原抗体反応以外に
非特異反応が起り、これに起因してリポソームが破壊さ
れることがわかってきた。

これは、試料中のタンパク質や微量化学物質とリポソー
ムとの反応によると考えられる。このため、従来は血清
やタンパク質を含有する試料を希釈して分析を行ってい
た。

例えば、リポソームに抗−ヒトα−フェトプロティン抗
体（以下、抗−ヒトＡＦＰ抗体と記す）を固定化した免
疫分析試薬を用いてヒト血〆ｈ中のＡＦＰを分析する場
合、非特異反応の影響を除去するためにヒト血清を１０
０倍希釈していた。ところが、正常人の血清中のＡ　Ｆ
　Ｐ　／ａ度は１０−８ｇ　／　ｍ１以下である。した
がって、正常人の血清を１００倍希釈すると、１０−”
　ｇ　／　ｍｌ以下の濃度のＡＦＰを例えば螢光分析で
測定しなければならず、精密な定量が困難になるという
問題があった。

本発明者の研究によれば、前述した非特異反応が起りや
すいか否かは、リポソームと抗体などとの結合部位の化
学構造に依存すると考えられる。

そこで、リポソームと抗体などとの結合部位の化学構造
を従来のジスルフィド結合とは異なったものとするため
に、抗体などを固定化するための官能基としてハロゲン
化アセチル基を含有する脂質を用いてリポソームを調製
し、これに抗体などを固定化した免疫分析試薬について
測定感度などを検討した。その結果、この免疫分析試薬
は血清に対して安定であり、血清ベースで数ｎｇ／ｍｌ
程度の濃度のＡＦＰを測定できることがわかった。しか
し、このような免疫分析試薬でも、より高感度が要求さ
れる癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカーの微量
ＡＰＩ定は不可能であった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は前記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ簡便な分析が行える免疫分析試薬及びその
製造方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明の免疫分析試薬は、リン脂質及び糖脂質のうち少
なくともいずれか一方を組成とするリポソームに、標識
物質を封入し、抗原又は抗体もしくは抗体の一部を固定
化した免疫分析試薬において、前記リポソームと抗原又
は抗体もしくは抗体の一部とを−ＣＯ（ＣＨ２）　、　
Ｎ　ＨＣＯＣＨ２−結合（ただし、ｍは２又は４）を介
して固定化したことを特徴とするものである。

また、本発明の免疫分析試薬の製造方法は、リン脂質及
び糖脂質のうち少な（ともいずれか一方に、　Ｃｏ　（
ＣＨ２）、ＮＨＣＯＣＨ２Ｘ基（ただし、ｍは２又は４
、Ｘはハロゲン）を導入し、標識物質を添加して、標識
物質が封入されたリポソームを調製する工程と、該リポ
ソームとチオール基を有する抗原又は抗体もしくは抗体
の一部とを反応させる工程とを具備したことを特徴とす
るものである。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームの主要構成
成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくともい
ずれか一方が用いられる。本発明で用いられるリン脂質
及び糖脂質は特に限定されるものではなく、例えばジパ
ルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）　
　　ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（
Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＯＰＥ）　、シミリストイルホスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）　、ジステアロイル
ホスファチジルエタノールアミン（Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｅ）な
どが挙げられる。これらリン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭
素鎖は炭素原子数が１２〜１８であることが好ましく、
更に偶数であることがより好ましい。なお、必要に応じ
てリン脂質、糖脂質に対してコレステロールを１０〜５
００モル％の割合で加えてもよく、これによって安定な
脂質２重層膜を調製することができる。

本発明の免疫性を斤試薬において、リポソーム内に封入
される標識物質としては、親水性でリポソーム外に流出
した際に定量可能な物質が選択される。このような物質
としては、例えば高濃度では自己消光により蛍光を示さ
ないが、低濃度（１０−’Ｍ以下）で非常に強い蛍光を
発するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質；
リポソーム外で酸化反応により発光するルミノールやル
シフェリンのような発光性物質；可視域又は紫外域に特
異的な吸収帯をＨする吸光性化合物（水溶性色素等）；
酸化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化水
素生成をもたらすグルコース、ンユークロース等の糖類
；テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイ
オン性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）のような補酵素類；メチルビオロゲンなどの
ラジカル化合物等が挙げられる。これらの化合物は、検
出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子を考慮し
たうえで適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム上に固定化
される抗原又は抗体もしくは抗体の一部は、ＩｇＧＳ　
ＩｇＥ、ＩｇＤＳ　ＩｇＡ、ＩｇＭなどいかなるタンパ
ク質であってもよい。なお、感度の向上という点からは
、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。また
、抗体の一部を分離して得たＦ（ａｂ“）２抗体でもよ
い。

本発明の免疫分析試薬は、前記リポソームを構成するリ
ン脂質又は糖脂質に、抗原又は抗体もしくは抗体の一部
を、 Ｃｏ　（ＣＨ２）、ＮＨＣＯＣＨ２−結合（ただし、ｍ
は２又は４）を介して固定化した構造を有する。

以下、本発明の免疫分析試薬の製造方法をより詳細に説
明する。

まず、リン脂質、糖脂質に、 Ｃｏ　（ＣＨ２）□ＮＨＣＯＣＨ２Ｘ基を導入するため
には、以下のような反応を利用する。

すなわち、３−アミノプロピオン酸 （ＮＨ２（ＣＨ２）２　Ｃ００Ｈ）又は５−アミノ吉草
酸（ＮＨ２（ＣＨ２）４　Ｃ００Ｈ）のアミノ基側を保
護した後、これをＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＨＳ
Ｉ）及びジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ　ＣＣＤ
）とともにトリエチルアミン（Ｔ　Ｅ　Ａ）存在下でア
ミノ基含有脂質（例えばＤＰＰＥ）と反応させ、保護基
をはずす。なお、３−アミノプロピオン酸又は５−アミ
ノ吉草酸のアミノ基側を保護した後、これとＨＳＩ及び
ＤＣＣＤとをＴＥＡ存在下で反応させてサクシンイミド
エステルを合成し、このサクシンイミドエステルをアミ
ノ基含有脂質と反応させ、保護基をはずしてもよい。次
に、ハロゲン化酢酸をＨＳＩ及びＤＣＣＤとともにＴＥ
Ａの存在下で前記脂質と反応させる。

また、予め３−アミノプロピオン酸又は５−アミノ吉草
酸のカルボキシル基をエステル化して保護し、ハロゲン
化酢酸を結合させた後、脱保護し、これをアミノ基含有
脂質と反応させてもよい。

このようにして合成される脂質の精製には分取用薄層ク
ロマトグラフィーを用いると簡便である。

次いで、前記のようにして得られた 一Ｃｏ　（ＣＨ２）、、ＮＨＣＯＣＨ２Ｘ基を有するリ
ン脂質や糖脂質、及び必要に応じてコレステロールや他
の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解・
混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥する。この結果
、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される。つづいて、フ
ラスコ内に標識物質を含有する水溶液を加え、密栓して
振とうすることにより、リポソームの懸濁液を調製する
。

一方、抗原又は抗体もしくは抗体の一部については、ペ
プシンなどによる酵素処理もしくは還元処理を施して遊
離のＳＨＷを付与するか、又はＳ　ＰＤＰなどの二官能
性試薬と反応させた後に還元してＳＨ基を導入する。

更に、前記リポソーム懸濁液と前記抗原又は抗体もしく
は抗体の一部とを適当な緩衝液中で反応させることによ
り、リポソームにＣＯ（ＣＨ２）　ｍＮ　ＨＣＯＣＨ２
−結合（ただし、ｍは２又は４）を介して抗原又は抗体
もしくは抗体の一部を固定化させる。

以上のような本発明の免疫分析試薬は、以下のようにし
て使用される。すなわち、まず被検物質を含有する試料
に本発明の免疫分析試薬を加えて一定時間反応させた後
、被検物質に対する第２抗体及び補体を加えて一定時間
反応させ、補体作用により破壊されたリポソームから流
出した標識物質（例えば蛍光性化合物）の量をδＰＩ定
する。この流出した標識物質の量と、試料中の被検物質
の量との間にはｔ目間関係があるので、流出した標識物
質を適当な分析方法（例えば蛍光分析）によって定量す
ることにより、被検物質を定量することができる。

そして、実際の定量分ｔＨにおいては、予め既知の濃度
の被検物質を用いて検量線を作成しておき、同一条件で
未知の濃度の被検物質を含む試料との反応により流出し
た標識物質の口を測定し、前記検量線にもとづいて被検
物質の濃度を定量する。

本発明の免疫分析試薬と被検物質を含む試料との充分な
反応に要する時間は、被検物質の種類、リポソームの特
性、反応条件、更にはリン脂質又は糖脂質に化学結合さ
れた抗原又は抗体もしくは抗体の一部の種類、量、純度
などによって異なる。

このため、個々の場合に応じて、前述した検量線の作成
の際に、特定の濃度に調製された被検物質を含む試料を
用いて予備Δｌｌｊ定を行い、最適反応時間を設定する
ことが望ましい。

本発明の免疫分析試薬によって定量か可能な被検物質と
しては、腫瘍マーカー（ＡＦＰＳＢＦＰ。

ＣＥＡＳＰＯＡなど）、免疫グロブリン（ＩｇＧ。

ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）、ホルモン（イ
ンシュリン、Ｔ３など）、及び薬物などが挙げられ、そ
の対象は広範囲にわたる。

（作用） 本発明にかかる免疫分析試薬では、リポソームに抗原又
は抗体もしくはその一部が適当な化学結合を介して固定
化されるので、リポソーム表面から受ける立体障害が軽
減されて抗体などの結合量が増大し、かつＵｌ定に際し
ては補体のリポソームへの作用にとって最適な距離が確
保されることが予想され、高感度に被検物質をｉ’１ｌ
ｌｌ定することができる。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

本実施例において用いた試薬のうちジパルミトイルホス
ファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）　　ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、コレ
ステロールはシグマ社製のものを用いた。他の試薬は市
販品（特級）を精製せずに使用した。なお、水は全てイ
オン交換水を用いた。

実施例１．２及び比較例１　ヒトＩｇＧの固定化実施例
１ ■ＮＨ２，−Ｃ５−ＤＰＰＥの合成 （ａ）　Ｂ　ｏｃ　−５−アミノ吉草酸の合成５−アミ
ノ吉草酸（ＡＩｄｒｉｃｌ＋社製）　１．１７ｇ　［１
０ミリモル］にトリエチルアミン（ＴＥＡ）３ｍｌ　［
約２０ミリモル］及び水１０ｍ１を加えて溶解した。こ
れにアミノ基の保護基となるＢｏｃ−ＯＮ（ペプチド研
究新製）　２．７　ｇ　［ｌｌミリモル］をジオキサン
１０ｍ１に溶解した溶液を添加し、室温で３時間撹拌し
た。反応後、反応液をエバポレータで濃縮し、酢酸エチ
ル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、５％クエン酸水溶
液で抽出精製した。最後に、無水硫酸ナトリウムで脱水
し、低温で結晶化させてＥ３ｏｃ−５−アミノ吉草酸を
得た。収率は７０％であった。

（ｂ）　Ｂ　ｏｃ　−５−アミノ吉草酸サクシンイミド
エステルの合成 前記Ｂｏｃ−５−アミノ吉草酸０．２３ｇ　［１ミリモ
ル］をクロロホルム２０ｍ１に溶解し、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミド（Ｈ５１，ペプチド研究新製）　０．１
３ｇ［１，１ミリモル］及びジシクロへキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣＤ；ペプチド研究新製）　０．２５ｇ［
１，２ミリモルコを添加した後、室温で３時間撹拌した
。反応後、溶媒を除去し、生成物に酢酸エチル３０ｍ１
を加えて溶解し、ろ過して沈殿物を除去した。再び溶媒
を除去し、生成物をクロロホルム５　ｍｌに溶解し、Ｂ
ｏＣ−５−アミノ吉草酸サクシンイミトエステル溶液［
約０．２ミリモル／　ｍｌと仮定コとして以下の反応に
使用した。

（ｃ）ＮＨ２−Ｃｓ　　ＤＰＰＥの合成り　Ｐ　Ｐ　Ｅ
　７０＋ｎｇ　［１００マイクロモル］をクロロホルム
２０ｍ１に懸濁し、ＴＥＡ５０μｌ及び前記Ｂｏｃ−５
−アミノ吉草酸サ吉草酸サクシエイミドエステル溶液約
２００マイクロモルコを加え、２０℃で一晩撹拌・反応
させた。反応後、メタノール及び３％クエン酸水溶液を
用いてＴＥＡを抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、
エバポレータを用いて溶媒を除去した。次に、生成物に
１Ｍ塩酸／酢酸１．５ｍｌを加えて溶解し、３７℃で１
時間放置した。これをエバポレータで濃縮した後、メタ
ノール及びクロロホルムで洗浄し、塩酸及び酢酸を除去
した。次いで、シリカゲルの分取用薄層クロマトグラフ
ィ（＃　５７１７、Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、クロロホ
ルム／メタノール−７／３混合溶媒を展開溶媒として、
生成物を精製した。収率は６０％であった。

■ブロムアセチル（ＢｒＡｃ）−ＮＨ−Ｃ５ＤＰＰＥの
合成 ブロム酢酸１４０　ｍｇ　［１ミリモル］をクロロホル
ム３０ｍ１に溶解し、ＨＳ　Ｉ　１４０　ｍｇ　［１，
２ミリモル］及びＤ　ＣＣＤ　２５０　ｍｇ　［１，２
ミリモル］を添加し、室温で３時間反応させた後、ロー
タリーエバポレータで溶媒を除去し、酢酸エチル３０ｍ
１を加えた。

生じた白色沈殿をろ別し、再び溶媒を除去した後、クロ
ロホルム１０ｍ１に再溶解させた。

次に、■で調製したＮＨ２−Ｃ，−ＤＰＰＥのクロロホ
ルム溶液約１０ｍ１　［５０マイクロモルコに前記溶液
１　ｍｌ及びＴＥＡ５０μｌを加え、室温で１晩反応さ
せた。反応後、溶媒を濃縮し、分取用薄層クロマトグラ
フィーを用い、クロロホルム／メタノール−７／３混合
溶媒を展開溶媒として、生成物を精製した。収率は５０
％であった。なお、最終生成物は１ｍＭの濃度になるよ
うにクロロホルムで希釈した。

■リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５ｍＭのＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃ２００μｍ　、　ｌｏｍ　Ｍの
コレステロール１００μ１１及び■で調製した１ｍＭの
Ｂ　ｒＡｃ−ＮＨ−Ｃｓ−ＤＰＰＥ５０μｍを、１０ｍ
１容量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２　
ｍｌを加えてよく混合した。次に、約４０℃の水浴中で
ロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。再びク
ロロホルム２　ｍｌを加えて充分に撹拌した後、再度ロ
ータリーエバポレータにより溶媒を除去した。この操作
を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成され
た。つづいて、フラスコをデシケータ中に移して真空ポ
ンプで約１時間吸引して溶媒を完全に除去した。

次いで、０．２　Ｍのカルボキシフルオレセイン（イー
ストマンコダック社製、ｐＨ７，４：以下、ＣＦと記す
）１００μｌを添加し、フラスコ内部を窒素で置換した
後、密栓して約６０℃の水浴中に約１分間浸漬した。つ
づいて、Ｖｏｒｔｅｘ　ミキサーを用い、フラスコ壁面
の脂質薄膜が完全に消失するまで、フラスコを激しく振
とうした。この操作によりリポソーム懸濁液が調製され
た。更に、リポソーム懸濁液に、０　、　ＯＩ　ＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（０，８５％ＮａＣｌ含有、ｐ　Ｈ７，
４５：以下、ＨＢＳと記す）を少量添加した後、全て遠
心チューブに移し、４℃において１５０００　ｒｐｍで
２０分間遠心する操作を数回繰り返した。最後に、０．
ＯＩＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０，８５％ＮａＣΩ含
有：以下、ＢＢＳと記す）でセラムチューブ（コーニン
グ社製）にリポソームを移し、１度遠心分離して上澄を
除去した後、後述するヒトＩｇＧ固定化反応に使用する
まで冷蔵庫に保存した。

■ヒトＩｇＧの修飾 ヒトＩ　ｇ　Ｇ　　（Ｉ　ＣＮ　　Ｉ＋＋ｖｕｎｏＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）１０ｍｇをｐＨ４，５の酢酸
緩衝液に溶解し、ベプシン（シグマ社製）１００μｇを
添加し、３７℃で１時間反応させた。次に、高速液体ク
ロマトグラフィーによりＦ　（ａｂ’）２分画のみを分
取した。このＦ　（ａｂｏ）２分画（ｐＨ６，０，１Ｍ
リン酸緩衝液中）にメルカプトエチルアミン・塩酸塩１
１０ｆｆ１を加え、３７°Ｃで９０分間反応させ、ゲル
ろ過（セファデックスＧ−２５使用、ＢＢＳ）により遊
離のＳＨ基を含有したタンパク分画（Ｆａｂ’）のみを
分取した。

このタンパク分画の溶液については、○Ｄ２８０ｎｍ−
１であった。

■ヒトＩ　ｇＧ　（Ｆａｂ’　）のリポソームへの固定
化前記リポソーム懸、４１６液とＦａｂ’の溶液とを混
和し、２０℃で４４時間撹拌・反応させた。反応後、ゼ
ラチン・ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−と記す）で
３回洗浄した。最後に、得られた免疫分析試薬をＧＶＢ
−２ｍｌに懸濁させて４℃で保存した。

実施例２ 実施例１の■の工程で５−アミノ吉草酸の代わりに３−
アミノプロピオン酸を用いてＢｒＡｃ−ＮＨ−Ｃ，−Ｄ
ＰＰＥで表される脂質をＪｊ製し、その他の工程は実施
例１と同様にして免疫分析試薬を調製した。

比較例１ ブロム酢酸とＤＰＰＥとをｌｉＩ　４ｇ反応させてＢｒ
Ａｃ−ＤＰＰＥで表される脂質を１７！ｌ製し、その他
の工程は実施例１と同様にして免疫分析試薬を調製した
。

実施例１．２及び比較例１の免疫分析試薬の計画予めＧ
ＶＢ”（ＧＶＢ−に０．５ｍＭＭｇＣΩ２及びＱ、１５
ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ（１２を添加したもの）でウザギ抗−
ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製）をｌＯ〜１０°倍に希
釈しておいた。これらの溶液１０μｍに、前記免疫分析
試薬の１０倍希釈溶液１０μｍ、及び補体（モルモット
血清：補体価−２３０）の８０倍希釈溶液５０μｌを添
加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、０．０１
ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液　１００μｌで反応を
停止させ、各濃度のウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体溶液につ
いて、流出したＣＦｆｆｉを蛍光分光光度計（ＭＴＰ−
３２、コロナ電気製）により励起波長４９０　ｒ＋ｍ、
蛍光波長５２０　ｎｍの条件で測定した。

そして、次式に基づいてＦ目対蛍光強度を計算した。

ここで、Ｆｅ　　実１４ＦＩ　した蛍光強度、Ｆｏ：ウ
サギ抗−ヒトＩｇＧ抗体を除いた時（リポソームが全く
破壊されていないとき）の蛍光強度、Ｆａ二脱イオン水
を添加してリポソームを全て破壊した時の蛍光強度であ
る。なお、標準値として１０−７及び１０−’ＭのＣＦ
溶液の蛍光強度を用いた。

この測定結果を第１図に示す。なお、第１図において、
各免疫分析試薬の違いは、脂質とブロムアセチル基との
間の結合部位の炭素数、及びこの結合部位を−ＣＯ（Ｃ
Ｈ２）　−Ｎ　ＨＣＯＣＨ２で表した場合のｍの数で表
示する（以下の第２図及び第３図に−おいても同様）。

第１図から明らかなように、実施例１．２の免疫分析試
薬では比較例１の免疫分析試薬よりも相対蛍光強度が大
きいことから、リポソームに固定化されたヒトＩ　ｇＧ
　（Ｆａｂ’　）の量が多いことがわかる。

実施例３及び比較例２　ヒトｃＥＡのａｐ＋定脂質とし
て実施例１て調製したＢｒＡｃ−ＮＨＣ５ＤＰＰＥを用
いてリポソームを調製し、このリポソームに実施例１と
同様の操作で抗−ヒ１−ＣＥＡモノクローナル抗体（Ｆ
　ａｂ“）を固定化し、免疫分析試薬（実施例３）を調
製した。また、これと比較するために、脂質としてＢ　
ｒＡｃＤＰＰＥを用いてリポソームを調製し、このリポ
ソームに実施例１と同様の操作て抗−ヒトＣＥＡモノク
ローナル抗体（Ｆａｂ’）を固定化し、免疫分析試薬（
比較例２）を調製した。

これらの免疫分析試薬について、ヒトＣＥＡに対する応
答性を調べた。この場合、各免疫分析試薬と、０．０１
〜１１０３ｎ／　ｍ＋の各濃度のヒトＣＥＡ溶液とを混
合して１０分間反応させた後、第２抗体としてウサギ抗
−ヒトＣＥＡ抗体（Ｄａｋｏ社製）の１０倍希釈溶液２
５μｌ及び補体の２０倍希釈溶液を添加して３７℃で３
０分間反応させた。その結果を第２図に示す。

第２図から明らかなように、比較例２の免疫分析試薬で
は１　ｎｇ／　ｍ１以上の濃度でないと正確な測定がで
きないのに対し、実施例３の免疫分析試薬では０．ｌｎ
ｇ／ｍ１以上の濃度で正確なｆｌｌｌ＋定が可能となり
、ヒトＣＥＡに対する感度が向上していることがわかる
。

実施例４及び比較例３〜７　ヒトＡＦＰのＤＩ定Ｂ　ｒ
Ａｃ−ＮＨ−Ｃ９−ＤＰＰＥで表される脂質及びＢ　ｒ
Ａｃ−ＤＰＰＥて表される脂質のほかに、Ｂ　ｒＡｃ−
ＮＨ−Ｃ，−ＤＰＰＥ　（ｎ−４，６，８，１２）で表
される脂質を合成し、各脂質を用いてリポソームを１週
製し、このリポソームに実施例１と同様の操作で抗−ヒ
トＡＦＰモノクローナル抗体（Ｆａｂ’）を固定化し、
免疫分析試薬（実施例４及び比較例３〜７）を調製した
。

これらの免疫分析試薬について、ヒトＡＦＰに対する応
答性を調べた。この場合、各免疫分析試薬と、０．１〜
１０’　ｎｇ／　ｍｌの各ａ度のヒトＡＦＰ溶液とを混
合して１０分間反応させた後、第２抗体としてウサギ抗
−ヒトＡＦＰ抗体（Ｄａｋｏ社製）の５０倍希釈溶液２
５μｌ及び補体の２０倍希釈溶液を添加して３７℃で３
０分間反応させた。その結果を第３図に示す。

第３図から明らかなように、実施例４の免疫分析試薬が
最も高感度である。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の免疫分析試薬によれば、精
密かつ簡便な分析を行うことかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１．２及び比較例１の免疫分析試薬と抗
−ヒトＩｇＧ溶液との反応による相対蛍光強度（免疫分
析試薬に固定化されたヒｌ−Ｉ　ｇＧの量に相関する）
を示す特性図、第２図は実施例３及び比較例２の免疫分
析試薬とヒトＣＥＡ溶液との反応による相対蛍光強度（
ヒトｃＥＡに２１する応答性）を示す特性図、第３図は
実施例４及び比較例３〜７の免疫分析試薬とヒトＡＦＰ
溶液との反応による相対蛍光強度（ヒトＡＦＰに対する
応答性）を示す特性図である。 Ｌｙｓｉｓ（”ム） Ｌｙｓｉｓ（％） 第１図 第２図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方を組成とするリポソームに、標識物質を封入し、抗原
   又は抗体もしくは抗体の一部を固定化した免疫分析試薬
   において、前記リポソームと抗原又は抗体もしくは抗体
   の一部とを−ＣＯ（ＣＨ＿２）＿ｍＮＨＣＯＣＨ＿２−
   結合（ただし、ｍは２又は４）を介して固定化したこと
   を特徴とする免疫分析試薬。
2. （２）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方に、 −ＣＯ（ＣＨ＿２）＿ｍＮＨＣＯＣＨ＿２Ｘ基（ただし
   、ｍは２又は４、Ｘはハロゲン）を導入し、標識物質を
   添加して、標識物質が封入されたリポソームを調製する
   工程と、該リポソームとチオール基を有する抗原又は抗
   体もしくは抗体の一部とを反応させる工程とを具備した
   ことを特徴とする免疫分析試薬の製造方法。