JPS63293470A - 補体価測定用試薬およびこれを用いた補体価測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析用試薬およびそれを用いた分析方法に
関し、更に詳しくは試料中に存在する補体の補体価を測
定するための補体価測定用試薬およびそれを用いた補体
価測定方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕補体価の
測定は、従来Ｍａｙｅｒらの５０％溶血法による方法お
よびこれを改変した方法が用いられている（Ｍａｙｅｒ
＋　Ｍ、　Ｍ、　：　Ｅｘｐｅｒｌｓ＋ｅｎｔａｌ　Ｉ
ｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｃｈａｐｔｅｒ
　　４．　２ｎｄ　　ｅｄ、、　　ＳｐｒｉｎｇｆＬｅ
ｌｄ。

Ｌ　　Ｃｈａｒｌｅｓ　　Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ　　Ｐｕｂ
、、　　１９６１）　　＊この方法は至適濃度の溶血素
で感作したヒツジ赤血球５Ｘ１０８個の５０％を、７．
５１の反応液の中で３７℃で溶血させるのに必要な補体
の量を１単位と定義している。同一検体につき何種類か
の希釈度に希釈した試料を本測定系に加えて反応を行い
、５０％の溶血が起こる量をグラフより求めて検体の補
体価を求める。

この方法は補体価（ＣＨｓｏ）の定義そのものであり基
本的な方法であるが現実的には簡便化のためにたとえば
反応液を７．５ｍｌから３ａ＋１にするとかの改変がな
されており、すでに至適濃度の溶血素で感作されたヒツ
ジ赤血球が市販されて、測定者の便が図られている。

しかし、感作血球の安定性が悪く、通常製造後２週間程
度の使用期限がある。

また、溶血の程度を測定するために遠心分離によって非
溶血血球を除去して上澄のヘモグロビン量を測定する必
要がある。

この操作は多数検体を測定する際には煩雑である。

また上述のように一つのサンプルについて数種類の希釈
度で反応を行う必要があることも従来法の問題点といえ
る。

ところで、Ｄｏｎａｌｄ　Ｌ　Ｂｏｗｄｅｎらは内部に
アルカリホスファターゼを封入したリポソームを用いて
補体価を測定する方法を発表した（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅ
■。

３２／　２　、２７５−２７８　（１９８６））　。

この方法はリポソーム表面上に形成された抗原・抗体結
合物が補体古典的経路を活性化しリポソーム膜の破壊を
引き起こす現象（Ｋｉｎｓｋｙ　ＳＣ，Ｎ１ｃｏｌ−ｏ
ｔｔｉ　　ＲＡ、　　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　
　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　　ｏｆ　　ｍｏｄｅ１ｍｅ＋
ｍｂｒａｎｅ、　　Ａｎｎ　　Ｒｅｖ　　ＢＩｏｃｈｃ
ｖ＋　　１９７７　　；　　４６：　　４９−６７）を
利用したものである。

この目的のために彼らはまず抗原としてのＤＮＰをリポ
ソームに組み込むために、リポソーム構成脂質の一つに
２．４−ジニトロフェノール−ε−マミノカブロイルフ
ォスファチジルエタノールアミンを用いた。

しかしこの方法においては抗ＤＮＰ抗体を用意する必要
があり、実際の測定時に抗ＤＮＰ抗体を添加する操作が
入ることになる。従って、測定の操作が煩雑であるとい
う問題点を有する。

本発明は、測定操作が簡便で、かつ製造コストも安価な
補体価測定試薬および方法を提供することを目的とする
。

ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明者は、上記目的を達成するべく研究を重ねた結果
、リポソーム上に免疫グロブリンを結合させることによ
り抗原の非存在下でも補体をよく活性化し、リポソーム
の破壊が起きることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、 （１）免疫グロブリンが固定化され、かつ標識物質が封
入されてなるリポソームからなる補体価測定用試薬。

（２）上記（１１記戦の補体価測定用試薬と補体活性を
有する検体を混合して反応させ、次いでリポソーム青か
ら遊出した標識物質を定量することにより検体の補体価
を測定することを特徴とする補体価測定方法。

に関する。

本補体価測定法により測定が可能な補体価はヒト、モル
モット等の補体価であり、前述のｈａｙｅｒ法において
はＣＨｓｏ値として表現されているものであるが、単位
の設定はＣＨｓｏに限定されるものではない。

本発明の補体価測定用試薬におけるリポソームは本発明
の目的を達成しうる限りいかなる組成よりなるものであ
ってもよく、特にリン脂質または糖脂質とコレステロー
ルから構成されるものが好ましい、たとえば、リン脂質
とコレステロールよりなるリポソームにおいては、両成
分の比が１：１前後であることが好ましく、この場合リ
ポソームは安定性に優れている。また、リン脂質中の脂
肪酸残基は、その炭素原子数が１２〜１８であることが
好ましく、特に偶数であることが好ましい。

リポソームの粒径には特に制限はないが、好適には約１
μｍより小さいものが好ましい。

リポソームは自体既知の方法によって製造される。

本発明で使用される免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、
ＩｇＭなどが望ましい、当該免疫グロブリンの由来には
特に制限はなく、たとえばウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ
、マウス由来のものなどが例示されるが通常ウサギが用
いられる。免疫グロブリンは、リボゾームを構成する脂
質１μモルあたり２０μｇ以上の割合で固定化される。

免疫グロブリンは通常架橋剤または脂質の活性化剤を使
用することによってリポソーム上に共有結合で固定化さ
れる。

リポソーム内に封入される標識物質は、本発明の目的を
達成出来る限り特に制限はなく、たとえばリポソーム外
に溶出された際に定量可能な物質、特に親水性の物質が
使用される。かかる物質としては、たとえば次の如きも
のが例示される。即ち、高濃度では自己消光により蛍光
は示さないが、低濃度（たとえば、１０″３Ｍ以下）で
強い螢光を発する螢光性化合物（例、カルボキシフルオ
レセイン）、リポソーム外において酸化されて発光する
発光性化合物（例、ルミノール、ルシフェリン）、可視
部または紫外部に特異的な吸収帯を有する吸光性化合物
（水溶性色素等）、酸化酵素の作用により分解されて酸
素消費、過酸化水素生成等生起物質（例、グルコース、
シュークロース等のＩｕｆｆ）、比較的大きなイオン性
化合物（例、テトラペンチルアンモニウム）、補酵素類
〔例、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
））　、ラジカル化合物（例、メチルビオロゲン）等が
例示される。これらの物質は、検出方法、感度及びリポ
ソームの安定性等の要素を勘案して適宜に選択すればよ
い。

本発明の補体価測定用試薬は、たとえば、次の如き方法
で製造される。

まず、意図する免疫グロブリンと結合し得る官能基を脂
質分子に導入する。その手段としては、たとえば所望の
脂質と架橋剤（これを用いる場合を架橋法という）また
は脂質の活性化剤（これを用いる場合を活性脂質法とい
う）とを、溶媒の存在下または不存在下にて反応せしめ
て、意図する免疫グロブリンと結合し得る官能基を脂質
分子に導入する手段が例示される０次いで、官能基の導
入された脂質とコレステロール、および必要に応じて他
の脂質とをフラスコ等の容器に入れ、溶媒を加えて反応
させた後、溶媒を留去し、吸引等の手段で乾燥してフラ
スコ壁面に薄膜を形成させる。

このフラスコ内に所定の標識物質溶液（通常、水溶液）
を加え、振とうして標識物質の内包されたリポソームの
懸濁液を得る。

別に、修飾免疫グロブリンを製造する。即ち、たとえば
免疫グロブリンと架橋剤とを、たとえば緩衝液中で、反
応させて架橋基を導入し、必要に応じて、該架橋基を還
元する試薬（例えばジチオトレイトール；　ＤＴＴ）と
更に反応させてることによって修飾免疫グロブリンを製
造する。この、工程は前記工程で架橋法を使用した場合
に必要な工程である。

次に、リポソームと修飾免疫グロブリン（または免疫グ
ロブリン）とを反応させる。当該反応は、通常緩衝液中
で行われる。その際、修飾免疫グロブリン（または免疫
グロブリン）の緩衝溶液中の濃度は、通常１０μｇ／ｅ
ｉ１以上が好ましい。

か（して本発明の補体価測定用試薬が製造される。

当該試薬は、通常標識物質を内包し、表面に固定化され
た免疫グロブリンを担持したりボゾームとして得られる
。

また、本発明の補体価測定用試薬は、脂質と免疫グロブ
リンとを上記手段等によって結合せしめ、当該結合体を
界面活性剤とともに水中に加えてミセルを形成させ、し
かる後、透析、ゲル濾過等の手段にて界面活性剤を除去
することにより製造することも出来る。

上記製造法に関して架橋剤としては、たとえば、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マ
レイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）　、Ｎ−ス
クシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテ
ート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マ
レイミドフェニル）プロピオネ−）　（ＳＭＰＰ）　、
Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
（ＧＭＢＳ）　、Ｎ−＜Ｒ−マレイミドカプロイルオキ
シ）スクシンイミド（ＥＭＣ３）等が挙げられる。

上記製造法に関して、脂質の活性化剤としては、たとえ
ばシアノーゲンブロミド（ＣＮＢｒ）　、シアヌリンク
クロリド（ＣＣ）、エビクロロヒＦＩＪン（ＥＨ）、Ｏ
−ブロモアセチル−Ｎ−ヒドロオキシスクシンイミド、
１．４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタン（
Ｂ　Ｅ　Ｐ　Ｂ）等が挙げられる。このうち、ＣＮＢｒ
、ＣＣ，ＥＨ，ＢＥＰＢは、糖残基を有する化合物を活
性化して、それを第一アミノ基を有する化合物と結合せ
しめる化合物である。従って、リポソーム上に糖残基が
存在する場合にはこれら化合物が使用できる。また、抗
原自身が糖タンパク賞であり、リポソーム上に第一アミ
ノ基が存在するような場合にも有効である。

本発明の試薬を使用する補体価測定方法は、たとえば次
のようにして行われる。

即ち、まず、前記の補体価測定用試薬を補体を含む試料
と適当な緩衝液中で混合し補体を活性化させる。これに
よりリポソーム青から試料中の補体量に応じて、標識物
質が放出されてくる。次にこの標識物質に応じた分析方
法により定量を行い、予め作成した検量線より試料中の
補体価を求めることが出来る。

〔作用・効果〕

本発明の試薬は、リポソーム上に免疫グロブリンを結合
させた構成をその一要素とするものであり、かくして抗
原の非存在下でも補体をよく活性化し、リポソームの破
壊を生起させ、そこに内包される標識物質の定量を容易
に行いうるちのである。

従って、本発明の試薬を使用した補体価測定においては
、たとえば抗原を固定化した構成とする試薬に見られる
如く抗ＤＮＰ抗体などを添加する操作をとる必要がない
。

よって、本発明は測定操作が簡便で、かつ製造コストも
安価な補体価測定試薬および方法を提供しえるものであ
る。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
これらの実施例は本発明を何ら制限するものではない。

実施例１ ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を感作したリポソー
ムを用いるモルモット血清中補体価の測定。

（Ａ）試薬および感作リポソームの調製（１）　　試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コ
レステロールは、日本錆化■製のものを用いた。ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）は牛丼化学より購入した。

Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（ＳＰＤＰ）およびセファデックスＧ−２５
フアインはファルマシア社より購入した。

（２）感作リポソームの調製 ｆａ）ジチオピリジルーフォスファチジルエタノールア
ミン（ＤＴＰ−ＰＥ）の調製 試験管に１０ｍＭ　　フォスファチジルエタノールアミ
ン（ＰＲ）のクロロホルム溶液５ｍｌと５０℃１ｇの５
ＰＤＰを加え窒素ガスで置換した後、密栓して室温で２
時間反応させた０反応後、５倍量の生理食塩水で３回抽
出し、残ったクロロホルム相を減圧乾燥し、その後５ｍ
ｌのクロロホルムを加えて密封保存した（−２０℃）。

（ｂｌリポソームの調製 使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１）に溶解した。

ＤＰＰＣ，コレステロール、ＤＴＰ−ＰＲをそれぞれ４
０μｌ１ｏ１．４．Ｏμｍｏｌ　、　２．４μｎ＋ｏｌ
のナス型フラスコに入れよく混合した。水浴中（約５０
℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した
。再び２閣ｌのクロロホルムを添加し、十分攪拌後、再
度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させると
フラスコ内面に薄膜が形成された。デシケータ−中にフ
ラスコを移し、真空ポンプによりフラスコ内の溶媒を完
全に除去した。

次に４■ｌの０．２Ｍカルボキシフルオレセイン（イー
ストマン・コダック社製、ｐＨ７，４）を添加し、湯浴
中（５０℃、１分）で加温後、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを
用いフラスコ内壁の脂質薄膜が完全に消失するまでフラ
スコを振とうした。この操作によりリポソーム懸濁液が
調製された。

次にこれに０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４
，０，１５Ｍ　　ＮａＣｊ＋を含む）を少量添加し、１
５．　ＯＯＯｒｐｍ（４℃、２０分間）で遠心し、上澄
の遊離カルボキシフルオレセインを除去した。沈澱に同
緩衝液を加えて洗い、再度遠心するという操作を４回繰
り返し、最後に２ｎ＋１の０．ＯＩＭ　　ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　　ＮａＣＡを含む）に
懸濁した。

（ＣＩ　Ｉ　ｇ　Ｇの修飾 １■ｌの０．１Ｍ　　ＮａＣＪに溶解した７、１ｆｉｇ
のウサギＩｇＧ（協和メディックスより購入）に１０．
１の２０ｍＭ　　５ＰＤＰ　（エタノール溶液）を加え
、室温で３０分間反応させた０反応後、反応液を０．１
　Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，５（０，１Ｍ　　ＮａＣｊ！を
含む）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１
ａｓＸ３６ｃｍ）で同一緩衝液で展開した。最初のピー
クフラクション（７，５■ｌ）を３■ｌに濃縮しくＡｍ
ｌｃｏｎ社、限外濾過膜ＰＭ−１０）、これに５０ｍＭ
になるようにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加えて室
温で２０分間反応させた０反応後５ｍＭベロナール緩衝
液、ｐＨ７，５（ＶＢ−と略記する）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５カラム（１ａｍＸ２Ｂａｍ）で展開
し、最初のピークフラクション（９，２ｍ１）を集め約
３ｍｌに濃縮した。

（ｄｉ　Ｉ　ｇ　Ｇ感作リポソームの調製前述のように
して調製したリポソームＱ濁液と修ｔ！ｔａ１ｇＧを混
合し、室温でゆっくりと回転混和しながら１晩反応させ
た０反応条件を表１に示した。この後４０００ｒｐｍ３
０分（４℃）で遠心し沈渣にゼラチン・ベロナール緩衝
液（ＧＶＢ−）１０−１を加えて洗浄した。この遠心、
洗浄を５回繰り返した後、沈渣を０．５ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ２および０．１５ｍＭ　　ＣａＣｌ２含有のゼラチン
・ベロナール緩衝液（以下、ＧＶＢ”＋と略記）１■ｌ
に懸濁した。保存は０．１％にＮ　ａ　Ｎ　３を添加し
て冷蔵庫中で行った。

＋３１１ｇＧ感作リポソームの補体に対する反応住友ベ
ークライト■製のＵ型マイクロプレート（９６穴）のウ
ェルに５０Ｐ１のＧＶＢ”　　（水冷）、２５Ｐ４のＧ
ＶＢ“１希釈モルモット血清（水冷）を加え、次いで上
記感作リポソームをＧＶＢ＋１で１０倍希釈したもの（
水冷）を５Ｐｊずつ加え、シェーカーで攪拌する。この
マイクロプレートを３７℃のエアーパス中で１時間イン
キュベートし、次いで各ウェルに１００μの０．ＯＩＭ
　　ＥＤＴＡ・ベロナール緩衝液を加えて反応を停止し
、プレート用螢光分光光度計（コロナ電子製）で各ウェ
ルの螢光強度を測定した（フィルター二エミフシッン側
４９０ｎｍ、エフサイチーシラン側５２０ｎ霧）その測
定結果を第１図に示した。

高濃度のＩｇＧを反応させたリポソームはど補体測定の
感度が高く、低濃度のＩｇＧと反応させたリポソームは
感度が低くなる傾向がある。

実施例２ ＩｇＧ惑作リポソームを用いるヒト補体価の測定 実施例２で使用されるウサギＩｇＧ感作リポソームの作
成に用いる０、　２　Ｍカルボキシフルオレセインを内
封したリポソーム（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／コレステロール／
ＤＴＰ−ＰＥ−１／１１０．０６）懸濁液は日本錆化側
より提供されたものである。このリポソームはフレンチ
プレス法により作成されたものであり、粒径は３００〜
５００ｎｍに分布している。

鳳１）感作リポソームの調製 ｔａｒ　Ｉ　ｇ　Ｇの修飾 ウサギＩｇＧの修飾は実施例１とほぼ同様に行った。

（ｂ）　Ｉ　ｇ　Ｃ感作リポソームの調製上記の修飾Ｉ
ｇＧとリポソーム懸濁液の反応は反応液量１．６＋ｉｌ
中のＩｇＧｔｌ１度２．４ｃｍｇ／ｍｌ、リポソーム由
来のリン濃度０．６４８μ５ｏｌｅ／＋ｗｌの混合比で
行った。室温で一晩反応させた後、反応液をベロナール
緩衝液で平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ｌ
Ｘ３４．５ｃｍ）で展開しリポソームに結合していない
修飾１ｇＧと感作リポソームを分離した。得られたリポ
ソームフラクションに終濃度０．１％にゼラチンおよび
Ｎ　ａ　Ｎ　３を添加してＩｇＧ感作リポソーム懸濁液
とした。

（２）　　ヒト血清補体価の測定 実施例１と同様の測定手順、方法でヒト血清の補体価を
測定した。この際、補体価（ＣＨ５＋］値）既知のヒト
直情を同様の手順で測定して補体価と螢光強度の関係を
示す検量線を作成した。第２図に検量線の一例を示す。

この感作リポソームを用いてヒト血清の補体価を測定し
、その値とＭａｙｏｒ法での値の相関を見た結果を第３
図に示すｅ　Ｍａｙｅｒ法とリポソームを用いたＣＨｓ
ｏ値はよく一致した。

表１：リポソームへの抗体感作条件

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明試薬の補体に対するレスポンスを表すグ
ラフ、第２図はヒト血清補体価（ＣＨｓｏ　）測定用検
量線を表すグラフ、第３図はＣＨｓｏ値−Ｍａｙｅｒ法
と本発明試薬を使用した場合との相関を表すグラフであ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫グロブリンが固定化され、かつ標識物質が内
   包されてなるリポソームからなる補体価測定用試薬。
2. （２）特許請求の範囲第（１）項記載の補体価測定用試
   薬と補体活性を有する検体を混合して反応させ、次いで
   リポソーム青から遊出した標識物質を定量することによ
   り検体の補体価を測定することを特徴とする補体価測定
   方法。