JPH02162259A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、標識物質を封入したリポソームを用いる免疫
分析方法の改良方法に関する。

〔従来の技術〕

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、各種内分泌疾患
の臨床診断等において欠くべからざる程に重要なものと
なっており、この方法は標識法と非標識法とに大別する
ことができる。

これらの内、感度の点で優れている標識免疫測定法會冥
施するためには、各種の標識物質（マーカー）、例えば
ラジオアイソトープ、螢光物質、酵素又は酵素関連物質
等が用いられて来た。標識物質としては、感度の点から
ラジオアイソトープが従来汎用されて来たが、ラジオア
イソトープ試薬はその半減期がるる上に不安定でｌ）、
放射能障害や高価な施設の使用に問題点がめるために、
螢光物質や酵素全標識とする測定法かその感度向上に関
する研究と相俟って一層注目を集めるに至っている。

螢光物質又は酵素を標識物質とする免疫測定法には、現
在、標識物質のうち抗原抗体反応で結合したものと結合
しなかったものとを分離する工程を必要とするヘテロゾ
ニアスな系を使用する方法と、このような分離工程を必
要としないホモゾニアスな系を使用する方法とカめる。

ヘテロシニアスな系を使用する免疫測定法としては、ラ
ジオアイソトープ標識免疫測定法においても利用されて
いる２抗体法や固相法かめるが、これら方法は未反応物
と既反応物とを分離することを必須とするものでるり、
この分離工程の実施が繁雑で、ｆｌ、従って定量の迅速
化が困難であると謂う欠陥を有している。一方、ホモゾ
ニアスな系を使用する免疫測定法は、分離工程の必要性
を廃することによる定量の簡便化、迅速化全目的として
提案されたものであるが、実際には感度が低く且つ測定
範囲が狭いために、抗原又は抗体の定量用として実用比
されるに至っていないのが実情である。

斯かる問題点を克服する方法として、近年、マーカーを
封入させたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体を
感作させ、この感作リポソームを検体と共存させて、リ
ポソームに共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗
体又は抗原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この
複合体ｆｔ特異的に破壊させてリポソームから流出する
マーカーを測定し、一方上記と同様の感作す、ｊｅソー
ムを檀種既知童の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と
同様に流出マーカーｔ″６＆１１足して標準検量線を予
め作成しておき、検体に関する上記測定結果全上記標準
検量線と照合させて、抗体又は抗原を足型する方法が提
供された。

〔発明が解決しようとする課題〕

この免疫分析方法によれば、従来存在した問題点を解消
して、均−系で４＆検物質を関便に足型することができ
るが、用いるリポソームの保存安定性、測定時の相対螢
光！！１１度等の点で禾だ満足のできるものではなかっ
た。

〔課題をＳ決するための手段」 かかる実情において本発明者らは鋭意研究を重ねた結果
、す昶ソームの粒径のバラツキが上記問題点の一因であ
ることを見出した。ナなわら、従来測定に用いられてい
たリポソームは、製造時に粒径に関して特別留意を払わ
れておらず、また特別な操作も加えられていないため粒
度分布が広く、粒径０．１μｍ程度の微小なものから粒
径数十μｍ程度の巨大なものまで種々の粒径のものから
成る、平均粒径８〜１２μｍ程度のものであった。本発
明者らは、これらのうち粒径の大きいリポソームが、浸
透圧の変化等の外液の影響を受けやすく、保存安定性や
相対螢光強度を悪くするものであることを見出し、この
粒径の大きなリポソームを除去することにより上記問題
点を解決できると考え、本発明を完成した。

すなわち本発明は、リン脂質及びコレステロールを主要
構成成分とし、その内部に親水性標識物質が封入され、
その表面に架橋剤を介して被検物質に対する抗原又は抗
体が固定化されているリポソームを含有するリポソーム
試薬と、被検物質を含有する被検試料と、補体とを反応
させてリポソームを破壊し、ＩＪ　ｙｊｅソーム中から
遊離する標識物質を検出することにニジ被検試料中の被
検物質量を測定する免疫分析方法において、９０個数％
以上が粒径１０μｍ以下でめシ、かつ平均粒径が５μｍ
以下でらるリポソーム全用いること全特徴とする免疫分
析方法を提供するものである。

本発明において、リポソームの粒度分布及び平均粒径を
制御する方法としては特に限定されず、いずれの方法を
用いてもよいが、ヌクレ解ア膜を用イるエクストルーダ
ーによる押し出し法に工り粒径の大きな粒子を除去する
方法が特に好ましい。

なお、す、ｔＰソームの平均粒径の下限はないが、収量
か低くなるため、１μｍ以上とするのが効率的である。

本発明において、リポソームはリン脂質及びコレステロ
ールを主要構成成分とするものでめれは、従来使用され
ている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロー
ルの比が１−１前後であるとき、特に安定なリポソーム
が得られる。

またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が１２〜１
８でるることが好ましく、更には偶数であることがニジ
好ましい。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により螢光は示さないが、低濃度（１（＋−
３Ｍ以下）で非常に強い螢光ｔＲするカルポキンルフル
オレセインのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化
反応により発光ｆ　ル／Ｌ＝ミノールやルシフェリンの
Ｌつな発光性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な
吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵
素の作用により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生
成をもたらすグルコース及びシェークロースなどの糖類
；テトラペンチルアンモニウムのような比較的大きなイ
オン性化合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）のような補酵素類；メチルビオロゲンを初め
とするラジカル化合物などが望ましい。

ＩＪ　、ｔｅソーム試薬は、例えば次の方法で製造され
る。まずリン脂質とコレステロールをフラスコに入れ、
溶媒を加えて反応さ、せた後、溶媒を留去し、吸引乾燥
する。しかる後、壁面に薄膜が形成され次フラスコ内に
所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、
標識物質封入リポソームを得る。次いでこれを前記粒径
制御処理に付し、目的の粒度分布及び平均粒径を有する
リポソームを得る。

一方、被検物質に対する抗原又は抗体と架橋剤とを緩衝
液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要であ
れば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオスレイト
ール；　ＤＴＴ　）と更に反応させて、修飾抗体又は抗
原を得る。

最後に、標識物質封入＋７　ｙｊｅソームと修飾抗体又
は抗原とを緩衝液中で反応せしめることにより、抗体又
は抗原結合リポソームが得られる。かかるリポソームは
、通常、標識物質を内包し、表面に固定比された抗体又
は抗原を担持し九マイクロカプセルとして得られる。

上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−スク
シンイミジル３−（２−ビリゾルジチオ）プａピオネ−
）　（ＳＰＤＰ　）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｐ−
マレイミドフェニル）フチレート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−ス
クシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテ
ート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マ
レイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰＰ　）、Ｎ
　−（７−−ｒ　ｖイミドブチリルオキシ）スクシンイ
ミド（ＧＭＢＳ）及ｒｊＮ−Ｃｍ−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ８）が挙げられる。

このＬうにして調製したり一ンーム試薬を用いて、被検
体中の抗原るるいは抗体である被検物質を測定するには
、被検体に１７１？ソーム試薬及び補体を加え、リポソ
ーム上で抗原−抗体複合体を形成せしめ、次いで、補体
依存性リポソーム膜損傷反応を引き起こさせる。すると
、かかる反応量に比例して、ＩＪ　献ソーム内から標識
物質が放出され、最後に、放出された標識物質に応じた
分析方法（例えば、標識物質が螢光物質であれば、螢光
分析法）により定ｉａ：ｔｌ−行い、例えば、予め作成
した検ｉ線にエリ、試料中の被検物質の１に全測定する
ことができる。

この測定操作において使用する補体は、格別限定されな
いが、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウ
サギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。

〔発明の効果及び作用〕

本発明方法によれば、従来保存安定性、相対螢光強度等
圧悪影響を与えていた粒径の大きなリポソームを除去し
たり献ソームを用いて測定を行なうため、試薬の保存安
定性が良好であり、高感度に被検体中の抗体ま之は抗原
の量を測定することが可能となる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

実施例１ （１）　　リボソームの調製 ＩＱｍＭゾ、Ｑルミトイルホスファチゾルコリン（ＤＰ
ＰＣ）りｏｏホルｌｈ？Ｉ液１００μｌ（１ｔｔｍｏｌ
　’）、１０ｍＭコレステロール（Ｃｈｏｌ、）クロロ
ホルム溶液１００ｐｌ（１ｐｌｍｏｌ　）及び１ｍＭゾ
チオピリゾル化ゾ／ｉｉルミトイルホスファチゾルエタ
ノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ’ｌクロロホルム溶液
４ｏｐｌ　（０．０４μｍｏｌ）ｖｉ−１〇−容量のナ
シ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２ａｌｆ加えて
工〈混合し九。

次いでクロロホルムを約４０℃の水浴上でロータリーエ
バ？レータ−により留去し、フラスコ内壁に脂質薄膜を
形成し次。これを真空デシケータ−に移し、１時間アス
ピレータ−で吸引して溶媒を完全に除去した。このフラ
スコに０．１ＭカルボキシフルオレセインＣＣＦ）２０
０μｌｆｒ加、ｔ、密栓して約６０℃の水浴上で約２分
間加温し友。続いてポルテックスミキサーで１０分間激
しく振とうし、フラスコ内面の脂質薄膜を完全にはがし
てＣＦ封入り解ソームを調製し友。０．０１Ｍヘペス緩
衡液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１含有、　ｐＨ７，４５）を
加えて遠心チューブに移し、１２，００１で１５分間遠
心する操作を３回繰り返すことにより未封入のＯＦ’を
分離し、洗浄されたリポソームペレットｆ　ｌ　ｒｎｌ
のヘペス緩衝液に懸濁させた。得られたリポソーム（以
下、ｌａｒｇｅ　ＭＬＶという）をマイク０トラツク（
日機装社製）にてレーザー回折法にＪ：＃）粒径を測定
し次ところ、粒径１〜３０μｍの不均一サイズを有し、
平均粒径９，２６μｍ、累積値９０％における粒径１８
．７２μｍでめった。この粒度分布を第１図に示す。

（２）　　り献ソームのサイジング （１）で得られたリポソーム懸濁液を、ヌクレーア膜（
膜孔５μｔｎ’）２枚をスリットにはさんだエクストル
ーダー（８油リポソーム社ｌ！りに入れ、窒素ガスで強
制的に押し出す操作ｔ−５回繰り返した後、遠心洗浄ｔ
−３回行なった。得られたオリボラｌ　５　＋７）　Ｕ
　ｄｅ　７−　Ａ　（以下、ｍｅｄｉｕｍＭＬＶという
）ヲ（１）と同様にして粒径測定を行なったところ、平
均粒径４．８６μ慣、累積値９０％における粒径８４２
μｍでめった。この粒度分布を第２図に示す。

更に膜孔３ｐｍのヌクレーア膜を用いて同様に上記ｍｅ
ｄｉｕｍ　Ｍ　Ｌ　Ｖをエクストルート、遠心洗浄に付
した。得られたリポソーム（以下、ｓｍａｌｌ　ＭＬＶ
という）をＢＩ−９０（日機装社製）にて動的散乱法に
より粒径を測定したところ、平均粒径ｌ、１５μｍ、累
積値９０％における粒径ｌ、３４μｍでめった。この粒
度分布を第３図に示す。

上記３種のリポソームの収量をリン定１−により測定し
、その収率（ｌａｒｇｅ　Ｍ　Ｌ　Ｖ基準）と共に第１
衣に示す。

第１表 （３１１Ｊ、）ｅンームへの抗体（ヤギＩｇＧ　）感作
０．０１Ｍヘベス緩衝液に透析したヤギＩｇＧ　Ｊ液（
２ｍＱ／ｍ１）２　ＩＩＬ７！に、３（１ｍＭ　　５Ｐ
ＤＰ　エタノール溶液１（）μｌを添加し、攪拌後室温
で３（１分間反応させた。引き続き過剰の５ＰＤＩ除去
するために、０．１Ｍ酢酸緩衝液（０，１５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ７！含ｉ　、　、）１４．５　）で平衡化し九セファ
デックスＧ−２５でゲル濾過した。ゲル濾過に工り得ら
れ次タン／Ｑり分画２　ｍｌにジチオスレイトール（Ｄ
Ｔ’ｒ）　１０　＋１１９を添加し、室温で３００分間
反応せた後、０．０１Ｍへベス緩衝液で平衡化しておい
たセファデックスＧ−２５でゲル濾過し、過剰のＤＤＴ
とタン、Ｑりを分離した。こうして得られたタン、Ｑり
分画ｌｒａｇずつを（１）〜（２）で調製し７？−３種
類のリポソームベレットに加え、４℃で１６〜２０時間
ゆっくり攪拌しながら反応した。その後、す４？ソーム
懸濁液をゼラチンベロナール緩衝液（０，１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１含Ｗ　、　ｐＨ７，４、ＧＶＢ−）で遠心洗浄を３
回りり返して未反応のタン／ｌｉり全会離し、ＧＶＢ”
１ｍｌに再懸濁した。

（４）　　リリースアッセイ ９６大のマイクロプレート（住友ベークライト製）１！
ｅ用いて測定した。

（３）で調製した３種類のＩｇＧ感作り献ソームをＧＶ
Ｂ”　（ＧＶＢ−に０．１５ｍＭ　Ｃａ（Ｊ、と０．５
ｍＭＭｇＣ６ｆヲ添加したもの）で４００倍希釈したも
のそれぞれ２５μｌに、抗ヤギＩｇＧ’ｉｌＯ”希釈か
ら１０’希釈したもの′ｊｆｔ２５μｌ、モルモット補
体（５ＣＨ，０）２５μｌｋ加えて、３７℃１時間イン
キュベートした。その後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液１０
０　ｐ　１１を加えて補体活性を停止し、リリースさｎ
たＣＦｔ１＆：マイクロブレート用螢光光度計ＭＴＰ−
３２（コロナ社製）を用いて励起光４９Ｑｎｍ、螢光５
３０ｎｍで測定した。

また、相対螢光強度は次式のように計算した。

Ｆｃ：実測した螢光強度　１’９：１Ｊｙｊｅソ一ム補
体のブランク値　ＦＡ：　１０％トリトンＸ−０１０に
工りリポソームを崩壊したときの螢光強度この結果金策
４図に示す。この図から明らかなように、本発明方法（
ｓｍａｌｌ　ＭＬ　Ｖ及びｍｅｄｉｕｍＭＬＶ）は従来
方法（ｌａｒｇｅ　Ｍ　Ｌ　Ｖ　）に比べて高感度に測
定できる。

（５）保存安定性 （１１及び１２＋と同様にしてＤＰＰＣ１，ｕｍｏｌ、
　Ｃｈｏｅ。

１　ｐｍｏｌ及びＤＴＰ−ＤＰＰＥ　Ｏ，０４１１ｍｏ
ｌ　ｋ含有するりｙｌｅ７−ム３種を調製し、ＧＶＢ−
１ｍｌに懸濁し、６〜１０℃で６力月間保存したときの
経時変化を、（４）と同様に螢光強度を測定することに
エリ調べた。

ここでリポソームの崩壊度は、トリｆトンＸ−１００に
より崩壊したときの螢光強度を１００、ＧＶＢ−のみの
値全Ｏとする螢光強度で表わした。この結果を第５図に
示す。この図から明らかなように、本発明方法で用いる
リポソーム（ｓｍａｌｌ　Ｍ　Ｌ　Ｖ及びｍｅｄｉｕｍ
　Ｍ　Ｌ　Ｖ　）は従来のり’　７　　Ａ　（ｌａｒｇ
ｅＭＬｔｌに比べて保存安定性に優れている。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は、実施例で得られたリポソームの粒度分布
を示す図であり、第４図はこれらのリポソームを用いて
免疫分析を行なったときの相対螢光強度を示す図であり
、第５図はこれらのリポソームの保存安定性を示す図で
ある。 以　　上 粒径（μｒ１１） 粒径（μｒ１１） リリース（％）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、リン脂質及びコレステロールを主要構成成分とし、
   その内部に親水性標識物質が封入され、その表面に架橋
   剤を介して被検物質に対する抗原又は抗体が固定化され
   ているリポソームを含有するリポソーム試薬と、被検物
   質を含有する被検試料と、補体とを反応させてリポソー
   ムを破壊し、リポソーム中から遊離する標識物質を検出
   することにより被検試料中の被検物質量を測定する免疫
   分析方法において、９０個数％以上が粒径１０μｍ以下
   であり、かつ平均粒径が５μｍ以下であるリポソームを
   用いることを特徴とする免疫分析方法。