JPS61225658A - 検出可能なマーカーを含む小袋およびアツセイにおけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は検出可能なマーカーを含む小袋（ｓａｃ）およ
びこれを被分析体のアッセイに使用することに関する。

さらに本発明はりガントで感作された検出可能なマーカ
ーを含む小袋、およびこれを被分析体のアッセイに使用
することに関する。

（従来技術） 検出可能なマーカーを含む小袋、特に脂質の小のう（嚢
）　（ｖｅｅｉｃｌｅ）がリガンド（被分析体）のアッ
セイに用いられている。代表的なアッセイ法においては
、分析すべきリガンド（被分析体）、およびトレーサー
（被分析体またはその適宜な同族体で感作された検出可
能なマーカーを含む小袋からなる）が被分析体に対する
結合剤上の限られた数の結合部位に対して競合する。結
合剤に結合するトレーサーの量は試料中の被分析体の量
に反比例する。結合トレーサー成分と遊離トレーサー成
分を分離したのち、結合トレーサーおよび／″！！たけ
遊離トレーサーの量は試料の結合トレーサ一部分および
／または遊離トレーサ一部分における検出可能なマーカ
ーを測定することによって確認され、これが試料中の被
分析体の尺度を与える。

しかし多くの場合、検出可能なマーカーを含む小袋は、
検出可能なマーカーがアッセイの前または途中で小袋か
ら６漏出する”という点で十分な安定性をもたず、これ
によりアッセイにおけるこの種の小袋の有効性が制限さ
れる。ここで用いる”漏出する”という語は、材料が無
傷の小袋から散逸すること、または小袋が破損したため
材料が散逸することを意味する。

小袋内の吸光性色素を使用する試みにおいては、色素の
漏出または小袋の破損によシ生じる問題のほかに、吸光
性色素は簡単な計測器で許容できる精度および正確度を
もって読み取るのに十分な信号を与えない。

従って検出可能なマーカーを含む改良された小袋が求め
られている。

（発明の構成） 本発明の一観点によれば、水中で測定して少なくとも１
００，０００である吸光係数をもつ吸光性色素を含む小
袋が提供される。さらにこの色素は水中に少なくとも０
．１Ｍの濃度で溶解しうる。

検出可能なマーカーとして小袋に含まれる色素は、正味
負電荷または正味正電荷である正味電荷、好ましくは正
味負電荷をもつ色素でもある。色素の電荷は、電荷が等
しいことによυ小袋からの漏出が防止されるという点で
小袋を形成する材料の電荷と等しいことが好ましい。さ
らに色素はｐＨ５〜９で完全にイオン化するものである
ことが好ましい。

本発明者は、上記の特色により色素が小袋の内側から漏
出することはないという点で安定性を高めることを見出
した。さらに被分析体のアッセイに用いた場合、この種
の色素を含む小袋はアッセイにおいて改善された感度を
与える。

特に好ましい実施態様によれば、小袋の内側に含まれる
吸光性色素はスルホローダミンＢ染料、特に遊離塩基ま
たは塩（たとえばナトリウム塩、リチウム塩、カリウム
塩、アンモニウム塩など）としてのスルホローダミンで
ある。

一般に色素は少なくとも、００１Ｍ、好ましくは少なく
とも、０５Ｍの濃度で小袋に含まれる。小袋内の色素の
濃度は水中におけるその色素の溶解度を越えない。

本発明の他の観点においては、前記の種類の吸光性色素
を含む小袋をリガンド（抗原、ハプテンまたは抗体であ
る）で感作する。

本発明の他の観点によれば、前記の吸光性色素を含む小
袋を被分析体のアッセイに用いる。吸光性色素を含む小
袋は、個々のアッセイ法に応じてリガンドで感作して、
または感作せずに使用できる。

内側に吸光性色素を含む小袋は、当技術分野で一般に知
られている多種多様な小袋のいずれであってもよく、こ
れにはポリマーマイクロカプセル（たとえばコアセル（
−ジョンまたは界面重合によシ製造されるもの）、また
は多種多様な材料から製造できる小のう、好ましくは脂
質から製造されるものが含まれる。小のうが脂質を含む
場合、これはしばしばリポソームと呼ばれるが、当技術
分野で知られているように、小のうは脂質でない両親媒
性成分から製造することもできる。当技術分野で知られ
ているように、リポソームは多種多様な脂質から製造す
ることができ、これにはリン脂質、糖脂質、ステロイド
９、比較的長鎖のアルキルエステル、たとえばリン醗ア
ルキル、脂肪酸エステル、たとえばレシチン、脂肪アミ
ンなどが含まれる。脂肪質の混合物、たとえば中性ステ
ロイド、帯電した両親媒性物質およびリン脂質も使用で
きる。リン脂質の代表例としては、スフィンゴミエリン
、ジノ（ルミトイル　レシチンなどがあげられる。代表
的なステロイド９としては、コレステロール、コレスタ
ノール、ラノステロールナトカあげられる。帯電した両
親媒性化合物（一般に１２〜３０個の炭素原子を含む）
の代表例としては、リン酸モノ−またはジアルキルエス
テル、第四アンモニウム塩、またはアルキルアミン；た
とえばリン酸ジセチル、ジステアリルアミン、ジステア
リルアミン、リン酸ジラウリル、スルホン酸ジオクタデ
シル、ジドデシルジオクチルアンモ二つムホルミｒなど
があげられる。

小のうけ多種多様な方法のいずれによっても製造できる
。たとえばリポソームはたとえば米国特許第４２３５．
８７１号明細書に記載の反転エマルジョン法によシ製造
できる。この方法では小のうを形成する物質（一般にリ
ン脂質）および小のうに封入すべき色素を含有する油中
水型エマルジョンを調製し、次いで溶剤を蒸発させてゲ
ル様混合物となし、このゲル様混合物を撹拌するかまた
は水に添加することによって小のうに変える。

封入された物質を含む小袋を製造するための他の方法が
米国特許出願第６５０，２００号明細書（１９８４年９
月１３日出願）に記載されておシ、この種の方法も本発
明による吸光性色素を含む小袋の製造に採用できる。

封入されたマーカーを含む小袋を製造するための他の方
法が米国特許第４，３４３，８２６号およびＰＣＴ国際
公開第ＷＯ３０１０１５１５号各明細書にも示されてお
り、これらの方法も本発明に応用できる。

ポリマーマイクロカプセルは当技術分野で知られている
方法により製造される。ただしマイクロカプセルがその
中において形成される溶液は吸光性色素をも含有し、こ
れによシポリマーマイクロカプセル内に色素が含まれる
。この種のマイクロカプセルの製造は、たとえば６マイ
クロカプセル封入法および用途”（イー・ファンデガー
編、プレナム・プレス、１９７４年）に示されている。

前記のように、吸光性色素を含む小袋をリガント９で感
作できる。リガンＰは一般に抗原、抗体またはハプテン
であり、感作した状態でこれらの小袋を被分析体のアッ
セイに使用できる。たとえばリガント９を各種の方法（
共有結合、誘導体化、活性化など）で小袋に結合させる
ことによって、小袋をリガンドで感作できる。小袋を適
宜なカップリング化合物またはスに一す−化合物（リガ
ンドの免疫反応性を破壊しないもの）の使用によってリ
ガント９に結合させることができる。当技術分野で知ら
れているように、カップリング化合物は２個の反応性官
能基をもち、これらの官能基のうち一方はトレーサーの
りガント部分の官能基と反応または結合可能であシ、他
方は小袋の官能基と反応または結合可能である。少なく
とも２個の反応性置換基を含むスペーサー化合物または
カップリング化合物はたとえばカルボキシル基、イソシ
アネート基、イソチオシアネート基、アミノ基、チオー
ル基、水酸基、スルホニル基、カルボニル基などの置換
基を含有する。これは明らかなように相互に結合すべき
リガンドおよび小袋に存在する官能基に依存する。

あるいは小袋をリガンドに直接に結合させることもでき
る。たとえばトレーサーのりガント部分がアミノ置換基
をもち、トレーサーの小袋部分がカルボニルまたはカル
ボキシル置換基をもつ場合、リガンドと小袋を当技術分
野で既知の方法、たとえば活性エステル法によシ相互に
直接に結合させることができる。

リガント“を小袋の形成に用いられる物質のうちの１種
と結合させることによシ、または小袋が形成されたのち
これらにリガント９を結合させることにより小袋をリガ
ンドで感作させることができる。

この種の方法は当技術分野で一般に知られておシ、本発
明を完全に理解するためにこれに関する詳細は不必要で
あると考える。

前記のように、前記の種類の吸光性色素を含む小袋は試
料中の被分析体を測定するためのアッセイに使用できる
。小袋はりガントで誘導体化されていても、いなくても
よい。

小袋を試料中の被分析体の測定に用いるためにリガンド
で誘導体化する場合、誘導体化された小袋は一般に当技
術分野で１トレーサー”と呼ばれる。小袋の誘導体化に
用いられるリガント９は、測定すべき被分析体に依存す
る。たとえばアッセイが抗原またはハプテンの測定のた
めの競合アッセイである場合、トレーサーの製造に用い
られるリガンドは被分析体またはその適宜な同族体であ
る（”適宜な同族体”という語は、被分析体のその同族
体が被分析体に対する結合剤に結合することを意味する
）。

アッセイが１サンビイツチ”型のアッセイである場合、
トレーサーの製造に用いられるリガンドはアッセイすべ
き被分析体に特異的なリガンド、たとえばアッセイすべ
き抗体または抗原に応答して誘発された抗体である。

たとえば、明らかなようにトレーサーの製造に用いられ
るリガンドは抗原、ノ・ブテンまたは抗体のいずれであ
ってもよい。

アッセイに用いられる結合剤も被分析体に依存する。た
とえば被分析体が抗原またはハプテンである場合、結合
剤は被分析体に特異的な抗体または天然物質である。被
分析体が抗体である場合、結合剤は被分析体に特異的な
抗体、抗原または天然物質である。

アッセイに用いられる結合剤は支持された形または支持
されていない形で使用できる。支持されている場合、結
合剤はア」ツセイにおいて結合剤に対する支持体として
適切でおることが一般に知られている多種多様な物質上
に支持させることができる。この種の物質の代表例とし
て、ポリマー、ガラス粒子、細菌細胞などがあげられる
。固体支持体はシート状、管状を含む多種多様な形状、
あるいはカードまたは試験紙などであってもよい。

従って本発明の他の観点によれば、結合剤およびトレー
サーを使用し、その際結合剤は少なくとも被分析体に結
合し、トレーサーには被分析体および結合剤の一方が結
合して、アッセイにおいて遊離および結合トレーサー画
分を与える、試料中における被分析体のアッセイ法が提
供される。このアッセイ法において、前記の種類の吸光
性色素を含む小袋がアッセイにおける検出可能なマーカ
ー源である。

代表的アッセイ法においては、被分析体を含むかまたは
含む疑いのある試料’ｔト１．−？−（検出可能なマー
カーとして吸光性色素、特にスルホローダミンＢｔたは
その塩を含む小袋に結合した被分析体またはその適宜な
同族体）および結合剤（被分析体およびトレーサーの双
方に特異的；結合剤は好ましくは固体支持体に支持され
ている）と共にインキユヘートスる。このインキュベー
ションによって、トレーサーと被分析体の間で結合剤上
の結合部位に対して競合が起こる。結合剤に結合したト
レーサーの量は試料中の被分析体の量に反比例する。

インキュベーションは小袋の早期破裂を防止する条件下
で行われる。アッセイのこの部分は一般に小袋の浸透圧
と等張の適宜緩衝化された水性媒質中で行われる。たと
えば小袋の早期破裂を防ぐために、温度、ｐＨおよびイ
オン濃度などの条件を制御する。たとえば小袋の浸透圧
と等張の水性緩衝媒質を供給する。一般に緩衝液は５〜
９程度のｐＨを備えている。

結合トレーサー画分と遊離トレーサー画分を分離したの
ち、色素を結合画分および／または遊離画分から、当技
術分“野で既知の方法（たとえば小のうの溶解のための
界面活性剤または酵素系溶解剤の使用）で小袋を溶解す
ることによシ放出させることができる。そこで試料中の
被分析体の測定のために、放出された吸光性色素の量を
測定する。

こうして、当技術分野で一般に行われているように、ア
ッセイに関して得られた値を、既知量の被分析体（既知
濃度の標準被分析体；これは試料中の未知量の被分析体
の測定のために使用できる標準曲線の作成のために用い
られる）を用いて等しい方法により得た値と比較する。

前記の種類の吸光性色素（リガンドで感作される）を含
む小袋から形成されるトレーサーも、色素の放出のため
に小袋を溶解することなく試料中の被分析体を測定する
ために使用できる。この種のアッセイは米国特許出願筒
５７へ６６７号明細書（１９８４年２月１４日出願）に
記載されている。この種の方法によれば、被分析体およ
びトレーサーの少なくとも一方に対する結合剤が、固体
支持体表面に位置する試験領域上に支持される。

その際結合剤は、アグセイに用いられるトレーサーが結
合剤または結合剤に結合した被分析体に結合した際それ
以上処理することなくアッセイ条件下で支持体上に見え
る濃度で、固体支持体の試験領域に支持される。同明細
書に記載されるように好ましい固体支持体はセルロース
エステルであシ、ニトロセルロースがきわめて良好な結
果を与える。

上記明細書に記載されるように、固体支持体上に支持さ
れる結合剤は被分析体およびトレーサーの双方に対する
結合剤であるか、または被分析体およびトレーサーの一
方のみに対する結合剤であり、用いられる結合剤の種類
は被分析体の測定のために採用されるアッセイに依存す
る。

この種の方法の一つにおいては、固体支持体上に適宜な
濃度で支持される結合剤をまず被分析体（たとえば抗原
）と接触させる。次いで固体支持体上の結合剤に結合し
た抗原をトレーサーと接触させる。このトレーサーは前
記の型の吸光性色素（特にスルホロイミンＢまたはその
塩）ｔ−含む小袋であシ、小袋は被分析体に対する抗体
で感作されている。固体支持体上の結合剤に被分析体を
介して結合したトレーサーの量は試料中の被分析体の量
と正比例し、試料中に存在する被分析体の存在および／
または量は被分析体を介して支持体に結合したトレーサ
ーの存在および／または量から測定できる。この方法に
よれば、トレーサーの量および／またはトレーサーの存
在は小袋を溶解せずに視覚的に判定できる。

場合によっては、前記の種類の吸光性色素を含む小袋は
、小袋を誘導体化することなく被分析体のアッセイに使
用することができる。たとえばある種のアッセイ法にお
いては、試料中の被分析体を固体支持体上に支持された
、被分析体に対する結合剤、およびトレーサー（被分析
体、または酵素系溶解剤で誘導体化されたその適宜な同
族体）と共にインキュベート・する。トレーサーおよび
被分析体は結合剤上の結合部位に対して競合する。

その結合画分と遊離画分を分離したのち結合部分および
／または遊離部分を前記の種類の吸光性色素を含む小の
うと接触させる。小袋からのマーカーの放出率および／
または小袋から放出されるマーカーの量は、結合画分お
よび／または遊離画分中のトレーサーの食に依存する。

当技術分野で一般に行われているように、既知量の被分
析体を用いてアッセイを反復することによって標準曲線
が作成される。

従って明らかなように前記の種類の吸光性色素を含む小
袋は各種のアッセイに使用でき、この種の小袋をリガン
ドで誘導体化して、または誘導体化せずにアッセイに使
用できる。

アッセイは多種多様な試料中で行うことができる。大部
分の場合、アッセイは体液、たとえば血清、尿、痰など
の試料中で行われる。

このアッセイ法は各種の被分析体の測定に採用できる。

被分析体の種類の代表例としては下記のものがあげられ
る。薬物（治療薬および誤用される薬物を含む）；ホル
モン、ビタミン；蛋白質（あらゆる種類の抗原を含む）
；ペプチド；ステロイド務細菌；菌類；ウィルス；寄生
虫；細菌；菌類、ウィルスまたは寄生虫の成分または産
生物；あらゆる種類のアレルゲン；正常細胞または悪性
細胞の産生物または成分など。個々の例としてはＴ４；
Ｔ３；ジゴキシン；　ＨＣＧ；インシュリン；テオフィ
リン；抗生物質、たとえばゲンタマイシンおよびトブラ
マイシン；抗痙牽薬、たとえばフェノバルビタール、カ
ルバメザピン、バルプロン酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ　ａｃ
ｌｄ）　；抗不整脈薬、たとえばリド９カイン、キニジ
ンなどがあげられる。

以上のように本発明によれば特異性をもつ吸光性色素を
含む小袋、特に小のうまたはリポソームが提供され、そ
の際吸光性色素はスルホローダミンＢま九はその塩であ
シ、この種の小袋はりガント、特に抗原、ハプテンまた
は抗体で誘導体化されていてもいなくてもよい。小袋は
リガンドで誘導体化されている場合特に試料中の被分析
体のアッセイにおいてトレーサーとして有用である。

小袋中に用いられる色素は吸光性色素であるがこれらの
色素は螢光性をも有する。従って本発明の範囲において
この種の吸光性色素を吸光性によるよりもむしろ螢光に
よって検出することもできる。

本発明を下記の例に関して詳述するが、これによって本
発明の範囲が限定されるものではない。

例１゜ リポソームの製造 １．１００ａｌの回転蒸発器用丸底フラスコに下記のも
のを添加した。

α、コレステロール４８■、シグマ＃ＣＨ−８０ｂ、ジ
ステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）１（１
４）■、アバフチ・ポーラ−・リピト９＃８５０３６５
（ＣＨ（Ｊ３中　２０謂省）。

Ｃ０架橋剤（ジステアロイルホスファチジルエタノール
アミン−（ｐ−マレイミド０フエニル）フチレート（Ｄ
ＳＰＩ−ＭＰＢ）　３．７５■、自家製、ＣＨＣＩａ中
２■／ｄ、（例ＩＡＫ記載）。

ｄ、　　イソプロピルエーテル６、０　ｍｌ、フィッシ
ャー＃Ｅ−１４１゜ ｅ、メタノール１．０　ｍＡ！、　７ｆｉｙ　＋”リッ
チ＃１５．４９０−３゜ ２、回転混合した。

３．０．１ＭスルホローダミンＢ５．０ａｕｔ添加した
。

イーストマン＃１４３２１．０．１Ｍ酢酸ナトリウム／
　０．１　Ｍ−ＮａＣＪｌ、ｐＨ４，５の緩衝液中に調
製。

４、回転混合した。

５、容器をＮ２　でフラッジした。

６、乳化するために室温の水浴型超音波発生装置中で１
０分間、超音波処理した。

７、　下記のとおシ調整された回転蒸発器に乗せた。

水浴温度　＝　４４℃ 回転速度　＝　４ ８、発泡が止むま、で徐々に真空度を高めた（約３０〜
４０分）。

９、圧力を低下させ、リポソームを４４℃で３０分間ア
ニールした。

１０、加温された（５０〜５２℃）　０．１　Ｍスルホ
ローダミンＢ１０ｍ１を容器に添加し、混合した。

１１、温すポソーム調裂液ｔ−０，４ミクロン、次いで
０、２ミクロンのバイオ−ラド・ユニポア（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ　Ｕｎｉｐｏｒｅ　）ポリカーボネート膜（それぞ
れバイオ−ラド＄３１３−００５９および＃３１３−５
０５９）を通して押出した。

１２、リポソームｔ”　９０　ｔＩＬｇの超遠心管中で
酢酸ナトリウム／食塩緩衝液（ｐＨ４，５）により約８
０ｒｐｚｌの総容積に希釈した。

１３．７へｏｏｏｘｙ　　で３０分間遠心分離した。

１４、イレット化したリポソームを酢酸ナトリウム／食
塩緩衝液（ｐＨ４，５）で８０次ｌに再懸濁した。

１５、＃１３および＃１４を繰返し１次いで＃１３を再
び繰返した。

１６、バレット状リポソームをトリス緩衝液（ｐＨ８，
０）（５０ｍＭ）リス、１００　ｍＭ−Ｎａ（４゜ｌ　
ｍＭ−ＥＩＤＴＡ、３１０ｍ０ｅ／ｋｇ）に再懸濁した
。

１７蛋白質反応まで４℃に保持した。

例ＩＡ の製造 ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１１
９，２■、０．１５９３ミリモル、アバフチ・ポーラ−
・リビド）をクロロホルム３０ｄに懸濁し、固体がすべ
て溶解するまで窒素雰囲気下で加熱還流した。溶液を室
温にまで放冷したのちトリエチルアミン（２２，２μｆ
ｉ、０．１５９３ミリモル、アルドリツケ）およびスク
シンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）プチレ
ー）（７９，４５■、０．２２３０ミリモル、ピアス）
′ｆ：添加した。反応混合物を室温で窒素雰囲気下に一
夜撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して淡黄色ろう状固
体（２７０，７１１りを得た。

これはＴＬＣ分析（シリカ、６５：２５：４ＣＨ２Ｃ旦
。：ＣＨ３０Ｈ：Ｎ２０）に際し１個の主スポットおよ
び数個や副スポットとして現われた。スポットを紫外線
およびモリブデンブルースプレー試薬（シグマ）で可視
化した。ＲｆＯ，５゜粗生成物を４枚のシリカゲル分取
用原型薄層板（イー・メルク、２．０瓢）上で６５：２
５：４ＣＨ２ＣＩ！２：ＣＨ３ｏＨ：Ｈ２ｏテ展開シナ
カラクロマトグラフィー処理した。２列のモリブデンブ
ルー活性バンドのうち上方のノよンドを単離し、生成物
を５（１４）　ＣＨ２（Ｊ２：　０２Ｈ，ＯＨで抽出し
た。溶剤を蒸発させることによシ生成物を白色固体（６
５，７５■）１７１５（ｓ）、１５１０（Ｉｎ）、１４
６　ｏ（ｍ）、１３９０（ｍ）、１３７０　（ｍｗ）。

１２４２（ｍ）、１２３０（ｍ）、１１００（ｍ）、１
０６０（ｍ）、９ｏダ龜８２０（→、６８５偲−”（！
、） こうして得られたリポソームはローダミン染料を含み、
当技術分野で既知の方法によシリガント９で感作して本
発明に用いるトレーサーを製造することができる。

例２゜ １、　蛋白質ＡＭ展抗体８ｍｇに酢酸ナトリウム／食塩
緩衝液（ｐＨ４，５）中のＩＭ・ジチオスレイトール０
．４ゴを添加した。

２、室温、暗所で磁気撹拌し、３０分間反応させた。

３、反応混合物を、トリスｐＨ８，０緩衝液（５０ｍＭ
　）リス、１００　ｍＭ食塩液、１ｍＭ・ＥＤＴＡ、３
１０　ｍｏｓ／ｋｇ）で平衡化したセファデックスＧ−
２５を媒体とするカラムを通過させることによりジチオ
スレイトールを除去した。

４、　０−Ｄ、　２８０　ｔ−監視し、各画分をプール
した。

５、　この溶液を新たに調製したリポソーム１０ｍ１と
混合した。

６、Ｎ２　でフラッジし、密封した。

Ｌ　室温で一夜反応させた。

８、　これらの蛋白質標識リポソームを標準トリス緩衝
液を用いて遠心分離により２回洗浄した。

９、最後の洗浄ののち、ｋレットヲトリス４０ｍＡ！中
に再懸濁した。

１０．４℃に保存した。

試薬 １、吸着緩衝液５　（ＡＢ５）：　ＢＤ、カタログ＃６
１４３３５゜ ２、ＨＣＧのα鎖に対するＨＣＧ抗体。

３、ニトロセルロース紙ニジユリ−へルーアンド・シュ
イル、ＭＩ２５．細孔０．４５μｍ。

４、　ウシ血清アルブミン：シグマ、カタログ＃Ａ−７
９０６゜ ５、尿対照：　ＢＤＩ、カタログ＃２５５８１５゜６、
トレーサー：例１の方法により製造され、例２の方法に
よりＨＣＧ鎖に対する抗体で感作されたリポソーム。

方法 １、　ニトロセルロース紙の１ｃＷＬのディスクを切取
った。

２、ＨＣＧ抗体の１：５０希釈液（ＡＢＳ中に希釈を行
った）３μ旦をディスクの中央にピにットで移した。

３、室温で１５分間乾燥させた。

４、ＡＢ５中の５チＢＳＡ（使用前に０．４５ミクロン
のフィルターで濾過した）３００μｉを各ディスクにピ
はットで移した。

５、　ディスクを３７℃で１時間インキュイードした。

６、液体をデカントした。

７、　尿対照または尿２００μｌをピはットで移した。

８６　　室温で１時間インキュベートした。

９、対照または尿をデカントした。

１０、ディスクを１．５　ａｔのＡＢ５で２回洗浄した
。

１１、トレーサーの１＝１２希釈液（希釈はＡＢ５中で
行われた）３０・０μｆｔヲ各デイスクにピペットで移
した（貯蔵リポソームは脂質約１マイクロモル／ｄを含
有していた）。

１２、室温で１時間インキュベートした。

１３、トレーサーをデカントした。

１４．１．５ｍＪＯＡＢ５”ｔ’２回洗浄した。

１５、可視スポットは妊娠に関して陽性である。

１　　　１１　週　　　　　　　　陽　　　　　　場２
　１０週　　　陽　　陽 ３　７−１７２週　陽　　陽 ４　　Ｂ−１／２週　陽　　陽 ５　　１１−１／２週　　陽　　陽 ６　　１１−１／２週　　陽　　陽 ７９週　　陽　　陽 ８　８−１７２週　陽　　陽 ９　１０週　　　陽　　陽 １０　　８−１／２−１２週　　陽　　　　陽１１　　
　　　　　　　　　　　　境界線　　　　陰１２　　　
　　　　　　　　　　　　陰　　　　　陰１３　　　　
　　　　　　　　　　　陰　　　　　　陰１４　　　　
　　　　　　　　　　　陰　　　　　　陰Ｒ工ＡはＢＤ
　ＨＣＧ　　エキットによシ行われた。

例４゜ ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンージゴ
キシグニンの製造 ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（４０
０，０■、０．５３４６ミリモル、アバンテ・ポーラ−
・リピド）をＣＨＣｌ３：ＣＨ３０Ｈ（９：　１）　５
０ｒｘｌに懸濁し、固体がすべて溶解するまで窒素雰囲
気下で加熱還流した。溶液を冷却したのち３−ケ混合物
全窒素雰囲気下に６０℃で３時間撹拌し、この時点でナ
トリウムシアノボロヒドリド（３６，９５■、０．５８
８１ミリモル、シグマ）全添加した。混合物を室温で一
夜撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して白
色泡状物（５７ｃ＋、６１１Ｉｇ）を得た。これはＴＬ
Ｃ分析（シリカ、２０チＣＨＯＨ：ＣＨ２Ｃｆ１２）下
で１個の主スポットおよび数個の副スポットとして現わ
れた。このスポットをホスホモリブデン酸スプレー試薬
（シグマ）によシ可視化した。ＲｆＯ，３゜ 粗生成物を低圧カラムクロマトグラフィー（シリカゲル
、１０チＣＨ３０Ｈ−ＣＨ２Ｃ１２）により精製して生
成物を白色固体（１８５゜３■）として得た。生成換金
可変波長ＵＶ検出器セットにより２３０　ｎｍで検出し
た。

例５゜ ジパルミトイルホスファチジルコリン（ａｐｐｃ　）、
コレステロール（ｃｈｏｌ）　、ホスファチジルエタノ
ールアミン、ジステアロイルージゴキシゲニン（ｄｓｐ
ｅ−ｄｉｇ）　（例４）およびジパルミトイルホスファ
チジルグリセロール（ｄｐｐＧ）　ｔクロロホルム／メ
タノール（２０：１）にｃｈｏｌ　５０モルチ、ｄｐｐ
ｃ　４　Ｑモルチ、ａｐｐｇ　１０モルチの比率で溶解
し、痕跡量（たとえば２００μｇ）のｄｓｐｅ−ｄｉｇ
全添加した。これらの脂質を丸底フラスコ内で減圧下に
回転蒸発器により乾燥させたのち、凍結乾燥器に一夜入
れて痕跡量の残存溶剤をすべて除去シタ。水中の０．１
　ＭスルホローダミンＢの溶液をフラスコに添加しく１
０ｍ７り、フラスコを激しく振とうし、または所望によ
シ短時間超音波処理した。この操作を６０℃で行った。

当技術分野で知られているように、リポソームはこの条
件下で自然に生成し、約０．１　Ｍのローダミン染料を
封入含有した。検出可能なジゴキシゲニンをリポソーム
の表面に施した。リポソームを封入された色素と同じ浸
透圧（約３１０　ｍｏｓｍＡりの緩衝液中で数回洗浄し
て浸透圧溶解全防止した。この調製液を０．４または０
．２μのフィルターで濾過して比較的大きなリポソーム
を除去した。このリポソームを緩衝液中に希釈して、リ
ン脂質１マイクロモル／−（緩衝液）を含有させた。

例４゜ １、　ニトロセルロース紙（ＭＥ−２５）小片に、０．
１チＢＳＡ含有トリス緩衝液（トリス塩基６．００５９
、ＥＩ）ＴＡ　）リナトリウム０．３５８９、Ｎａ（Ｊ
　６．８３９、ＮａＮ３０．２　ｇ、ＢＳＡ　１９、適
量のＨＰＬＣ水を加えて１１となし、ＨＣｆｉでｐＨを
８，０にする）中のウサギ抗ジゴキシン抗体５μ党をス
ポットした。

抑制を示す種々の濃度で４　Ｍ−Ｎａ（Ｊ溶液を用いて
３１０　ｍｏｓ／に９に調整した。３０分間風乾した。

２、上記ニトロセルロース紙小片をトリス緩衝液中の３
％ＢＳＡ（）リス塩基６．０５５９、ＥＤＴＡｌ−リナ
トリウＡ０．３５Ｈ１ＮａＣｆｉ　６．８３　ｇ、Ｎ　
ａ　Ｎ　ａ　０．２分、Ｂ５Ａ３０９、適量のＨＰＬＣ
水を加えて１旦となし、ＨＣ，９でｐＨ１８，０にする
）で被覆した。

４　Ｍ　−Ｎａ（Ｊ溶液を用いて３１０　ｍｏｓ／に９
に調整した。小片をＢＳＡ中に３０分ないし１時間、ま
たは小片が完全に飽和されるまで浸漬した。飽和後にデ
カントまたは吸引によ５ＢＳＡＱ除去した。

アッセイ法 ■、前処理した小片をジゴキシン標準品（Ｏｎ９／ｍＡ
’；ｏ、ｓｎｙ廁；１．Ｏｎ峡實；２．５ｎ峡宏）およ
び／または患者血清で被覆した。小片を標準液および／
または血清に１０分間浸漬した。標準液および／または
患者血清をデカントまたは吸引によシ除去した。標準液
および／または患者血清を除去したのち、小片ヲトリス
緩衝液（トリス塩基６．００５ｇ、ＩＴＡ）リナトリウ
ム０．３５８ｇ、ＮａＣ１溶液８３ｇ、ＮａＮａ　Ｏ，
２ｇ、適量のＨＰＬＣ水を加えて１旦となし、ＨＣＩで
ｐＨｙｋ８．０にする）で２回洗浄した。ＮａＣ９溶液
を用いて３１０ｍｏ８／に９に調整した。

２、小片を感作されたリポソーム５００μｆｆ１（例４
のＰＥ−ジゴキシゲニン１００〜４００μｇｔ含有）で
被覆した。リポソームはトリス緩衝液（トリス塩基６．
０５５ｍ９、ＥＤＴＡトリナトリウム０．３５８ｇ、Ｎ
ａＣｆ１６．８３９、ＮａＮ５　Ｑ、　２　ｇ、適量の
ＨＰＬＣ水を用いて１１となし、ＨＣｌ１でｐＨを８．
０にする）中に希釈されていた。４　Ｍ　−ＮａＣ１溶
液を用いて、抑制を示す希釈率で３１０ｍＯ８／に９に
調整した。

小片をリポソームに１５分間浸漬した。リポソームをデ
カンテーションまたは吸引によシ除去した。

リポソーム除去後に小片をトリス緩衝液（トリス塩基６
．０５５９、ＥＤＴＡ）リナトリウム０．３５８ｇ、Ｎ
ａ（Ｊ　６．８３　ｇ、ＮａＮ３０−２　ｇ、適量のＨ
ＰＬＣ水を加えて１皇となし、Ｈ（ＪでｐＨ全８．０に
する）で２回洗浄した。４　Ｍ　−ＮａＣｆ１溶液を用
いて３１０ｍｏｅ／に９に調整した。

アッセイ法の説明： １、　この試験のために採用した抗体希釈度は１：２０
０．１　：　１２００．および１　：　２２００であっ
た。

これらの希釈度は変更できる。結果は下記のとおシであ
った。

１：２００の希釈度ではすべての標準濃度においてピン
ク色の小片が得られた。この希釈度は参考としてのみ用
いた。

１：１２００の希釈度では、Ｏｎ９／ｙｔ１．０．５　
ｎ９／ｍ６および１．　Ｏｎ９／ｍｇの標準濃度におい
てピンク色の小片が得られた。２．５　ｎ　９／ｙｔｌ
の標準濃度においてはピンク色の小片は得られなかった
。これは２．５ｎ９／／！ｔまたはこれ以上のジゴキシ
ンが存在する場合は色の変化が見えないことを示す。

１　：　２２００の希釈度では、Ｑｎ９／ｍＪ、０．５
ｎ９／ｍ７？の標準濃度においてピンク色の小片が得ら
れた。１．　Ｏｎ　９／ｒｕｇおよび２．５　ｎ９／ｍ
ｅの標準濃度においてはピンク色の小片は得られなかっ
た。これは１．　Ｏｎ９／ｍ１以上のジゴキシンが存在
する場合は色の変化が見えないことを示す。

患者血清の測定について： 患者血清１０種を前記のように処理し、結果を下記の表
に従って比較した。

この形式によれば患者血清値の範囲（すなわち２、５　
ｎ　９／ｒｕｔ以上；１．０〜２．５　ｎ　９／’ｙｔ
ｔｌまたは１．Ｏｎ９７ｍｌ以下）１０種のうち９種が
正確に判定された。

例７゜ コレステロール１３２マイクロモル、ジステアロイルホ
スファチジルコリン１１３マイクロモル、ジステアロイ
ルホスファチジルグリセロール１３．２マイクロモル、
およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
ージゴキシゲニン結合体２００μ９をクロロホルム−メ
タノール（９：　１ｖ／ｖ　）　２０ｍＡ’に溶解した
。この混合物を回転蒸発器によシ３７℃で２５０ｍ／容
の丸底フラスコ中で乾燥させた。乾燥した脂質フィルム
をさらに真空中で２５℃において１６時間乾燥させ、ｌ
　ｍＭ・ＥＤＴＡおよび０．０２　％　ＮａＮａ　２含
有する２、７％（ｗ／ｖ）グリセリン溶液（ｐＨ６，７
）中で膨潤させた。

膨潤は６０℃で３分間緩徐に回転させることによシ行わ
れた。混濁したリポソーム懸濁液ｔ−２０００ｒｐｍで
１０分間回転させて大型の多層率のりを沈降させ、上清
を採取して３ＱＯＯＯｒｐｍで３０分間回転させ、大型
の単層小のうを沈降させた。小のうへの装填は、空のリ
ポソームにレットヲスルホローグミ７Ｂの０．１　Ｍ溶
液（ｐＨ６，７）２０−に再懸濁し、この懸濁液を細孔
寸法１．０μ、０．４μおよび０．２μのポリカーボネ
ート膜から順に押出すことによって行われた。トリス２
０　ｍＭ、　ＥＩ）ＴＡ２Ｑ　ｍＭ、グリセリン２％（
ｗ／ｖ　）、ＤＭＳ○０．０５チ、およびＮａＮａ　０
．０２％を含有する緩衝液３〇−を添加し、リポソーム
を３ＱＯＯＯｒｌ）ｍで３０分間回転させた。ベレット
を同じ緩衝、液に２回再懸濁して洗浄し、封入されてい
ない色素を除去し、洗浄された装填済リポソームを同じ
緩衝液にリン脂質リン１フィクロモル／−に希釈した。

ジゴキシンのイムノアッセイにおける非等張トレーサー
としての上記リポソームの有効性を下記によシ試験した
。１２×７５ｒＩＩＲのポリプロピレン製試験管をヒツ
ジ抗ジゴキシン抗血清１　：　２０００希釈液で被柵し
た。試験管に上記リポソーム５０μ息、臨床試料として
既知量のジゴキシンを含有する血清１００μ旦、ならび
にウシ血清アルブミン０、１％、ＦＪＴＡＩ　ｍＭ、ア
ジ化ナトリウム０．０２％をも含有するトリス−食塩緩
衝液（１）Ｈ８，Ｏ）　８５゜μ旦を充填し九。３７℃
で３０分間インキュイードしたのち吸引により試験管を
空にし、トリス−食塩緩衝液で洗浄し、５％トライトン
（Ｔｒｉｔｏｎ　）Ｘ−’１００を１　ｔｘｔ添加して
試験管壁に結合したリポソーム全溶解し、分光計で５６
５　ｎｍによシ吸光を測定した。ジゴキシンＯｎ９にお
ける吸光は０．０８００．Ｄ、であり、ジゴキシンに対
して得られた標準曲線は対数一対数プロット上で直線状
であシ、ジゴキシン２　ｎ　９７ａｔ　（血清）の用量
においてリポソーム結合が５０９６置換された。臨床試
料のアッセイはラジオイムノアッセイにより測定された
水準と良好な相関を示す水準を与えた。

本発明は、吸光性色素を含有する小袋が提供され、これ
によシアツセイが簡単な装置、たとえば比色計または安
価な分光計を用いて行われるという点で特に有利である
。本発明者は意外にも、必要な安定性を得るためには吸
光性色素が一定の特性をもつべきであることを見出した
。特に本発明者は他の色素、たとえばフルオレセインお
よびその誘導体につき試験し、この種の色素は小袋内に
含まれた場合必要な安定性を与えないこと、すなわちこ
れらの色素は貯蔵中に小袋から著しく漏出し、簡単な計
測器を用いて測定するために十分な感度をもたないこと
を見出した。

本発明の小のうの安定性は優れており、色素の漏出は室
温で６か月の保存期間にわたって低いことが認められた
。

本発明によシ製造され是トレーサー（リガンドで増感さ
れたスルホローダミンＢ含有小のう）を用いて得られる
増幅は各トレーサー分子に付着した１個のマーカー残基
により達成されるものよりも１０００〜ＩＱＯＯＯ倍の
範囲にある。アッセイは簡単な分光計による比色測定に
よって効果的に読取ることができる。アッセイの精度お
よび正確度はラジオイムノアッセイの場合に劣らず、手
動式酵素イムノアッセイにより得られる結果よシも優れ
ている。

これらおよび他の利点は本明細書の教示から当業者には
自明であろう。

上記の教示を考慮して本発明を種々に修正および変更す
ることができる。従って本発明は特許請求の範囲に記載
される範囲内において、前記に詳述されたもの以外の形
で実施することができる。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１００，０００の吸光係数をもつ吸光
   性色素を含む小袋（ｓａｃ）からなり、該色素が水に少
   なくとも０．１Ｍの濃度に溶解する組成物。
2. （２）色素が正味電荷をもつ、特許請求の範囲第１項に
   記載の組成物。
3. （３）色素が水中で５〜９のｐＨにおいて完全にイオン
   化する、特許請求の範囲第２項に記載の組成物。
4. （４）小袋が色素を少なくとも０．０１Ｍの濃度で含む
   、特許請求の範囲第２項に記載の組成物。
5. （５）小袋が色素を少なくとも０．０５Ｍの濃度で含む
   、特許請求の範囲第４項に記載の組成物。
6. （６）色素がスルホローダミン系色素である、特許請求
   の範囲第１項に記載の組成物。
7. （７）吸光性色素がスルホローダミンＢおよびその塩よ
   りなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１項に記載の
   組成物。
8. （８）小袋が色素を少なくとも０．０１Ｍの濃度で含み
   、小袋が小嚢（ｖｅｓｉｃｌｅ）である、特許請求の範
   囲第７項に記載の組成物。
9. （９）小袋が色素を少なくとも０．０５Ｍの濃度で含む
   、特許請求の範囲第８項に記載の組成物。
10. （１０）小袋が抗原、抗体およびハプテンよりなる群か
    ら選ばれるリガンドで感作されている、特許請求の範囲
    第１項に記載の組成物。
11. （１１）色素が正味電荷をもち、小袋が小嚢である、特
    許請求の範囲第１０項に記載の組成物。
12. （１２）色素が水中で５〜９のｐＨにおいて完全にイオ
    ン化する、特許請求の範囲第１１項に記載の組成物。
13. （１３）小袋が色素を少なくとも０．０５Ｍの濃度で含
    む、特許請求の範囲第１２項に記載の組成物。
14. （１４）色素がスルホローダミン系色素である、特許請
    求の範囲第１０項に記載の組成物。
15. （１５）吸光性色素がスルホローダミンＢおよびその塩
    よりなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１０項に記
    載の組成物。
16. （１６）小袋が色素を少なくとも０．０５Ｍの濃度で含
    み、小袋が小のう（嚢）である、特許請求の範囲第１５
    項に記載の組成物。
17. （１７）被分析体の尺度として小袋中に存在する色素を
    検出し、該吸光性色素が少なくとも１００，０００の吸
    光係数をもち、該吸光性色素が水に少なくとも０．１Ｍ
    の濃度に溶解することを特徴とする、被分析体の尺度と
    して検出可能なマーカーを含む小袋を使用する、試料中
    の被分析体のアツセイ法。
18. （１８）小袋中に存在する吸光性色素が小袋から放出さ
    れたのちに検出される、特許請求の範囲第１７項に記載
    のアツセイ法。
19. （１９）小袋が抗原、抗体およびハプテンよりなる群か
    ら選ばれるリガンドで感作されている、特許請求の範囲
    第１７項に記載のアツセイ法。
20. （２０）吸光性色素がスルホローダミンＢおよびその塩
    よりなる群から選ばれ、小袋が小嚢である、特許請求の
    範囲第１７項に記載のアツセイ法。