CN109964127A - 用于评估重组蛋白表达或报告基因表达的侧向流动检测 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及侧向流动测试装置及其用途，用于评估样品中的重组蛋白(多肽)表达或报告基因表达。在一些方面，本公开涉及侧向流动免疫测定法用于快速检测重组蛋白质表达的用途。在一些方面，侧向流动免疫测定可用于重组蛋白表达的定性和/或定量分析。

Description

用于评估重组蛋白表达或报告基因表达的侧向流动检测
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月23日提交的美国临时申请号62/378,538的优先权，其具标题为“用于评估重组蛋白质表达或报告基因表达的侧向流动测定”，为所有的目的该申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及侧向流动测试装置及其用途，用于评估样品中的重组蛋白(多肽)表达或报告基因表达。在一些方面，本公开涉及侧向流动免疫测定法用于快速检测重组蛋白质表达的用途。在一些方面，侧向流动免疫测定可用于重组蛋白表达的定性和/或定量分析。
背景技术
重组蛋白质表达是广泛使用的用于蛋白质生产方法。产生大量重组蛋白的能力使得研究天然非高丰度蛋白质成为可能。重组蛋白质表达还广泛用于生物技术和制药工业中的目标蛋白质的放大生产。通常需要在表达和纯化过程中快速检查预期蛋白质的表达水平。目前，实现该目标的最常用方法包括SDS-PAGE、蛋白质印迹分析、ELISA等。完成测试所需的时间通常需要数小时或更长时间。能够在几分钟内确定重组蛋白表达水平的系统或装置将是重组蛋白表达期间非常有价值的工具。
相对于其他检测方法相比，侧向流动免疫测定(LFIA)具有若干优点。侧向流动免疫测定装置在几分钟内检测样品中的抗原或抗体。它相对便宜并且在宽泛的气候条件下保持长期稳定性。它使用简单且几乎不要求样品/试剂准备。无需额外的处理设备。
LFIA已经用于即时护理或即时诊断和检测超过二十年。最著名的LFIA设备是家庭妊娠测试。LFIA已被广泛用于快速检测诊断、食品污染物检测和药物滥用筛查。例如，1994年3月30日提交的美国专利No.5,714,341A公开了LFIA在唾液样品中用于HIV特异性抗体的用途。2003年11月19日提交的美国专利申请公开No.US 2004/0184954 A1公开了LFIA用于对唾液样品中药物滥用测试的用途。美国专利No.7,749,772 B1，优先权日为2006年6月29日，公开了LFIA用于药物滥用筛选检测体液(包括唾液)中的Δ9-四氢大麻酚的用途。与LFIA有关的其他专利包括美国专利No.5,073,464,5,073,484和5,559,041。
有必要改进用于评估样品中重组蛋白(多肽)表达或报告基因表达的测定法，例如耗时较少的测定法。本公开解决了该需求以及相关需求。
发明内容
在一个方面，本公开内容提供了用于评估样品中重组蛋白(多肽)表达或报告基因表达的侧向流动测试装置，该装置包含多孔基质，所述多孔基质包含在所述多孔基质上的测试位置，所述测试位置包含结合分析物的测试试剂或结合所述分析物的另一种结合试剂，或者所述测试试剂是与所述样品中的分析物竞争结合所述分析物的结合试剂的分析物或分析物类似物，其中所述分析物是重组蛋白(多肽)表达产物或报告基因表达产物，并且其中液体样品沿着所述测试装置横向流动并通过所述测试位置以形成可检测信号以确定所述样品中的所述重组蛋白(多肽)表达产物或所述报告基因表达产物的存在，不存在和/或量。
在一些实施方案中，本公开涉及侧向流动免疫测定(LFIA)装置用于快速检测重组蛋白的表达的用途。在优选的实施方案中，LFIA装置(测试条)包含连续安装在固体背衬上的四个元件(样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜，吸收垫)或由其组成。与蛋白质或表位标签特异性抗体结合的彩色胶体金纳米颗粒沉积在所述结合物垫上，其与样品中表达蛋白质或表位标签的重组蛋白质形成免疫复合物。将对蛋白质或表位标签特异的第二抗体固定在所述硝酸纤维素膜上。所述第二抗体捕获第一种免疫复合物。免疫复合物的彩色胶体金纳米颗粒的累积允许重组蛋白表达的检测。
任何合适的基质都可用于本装置中。例如，所述基质可包括硝化纤维素、玻璃纤维、聚丙烯、聚乙烯(优选具有非常高分子量的)、聚偏二氟乙烯、乙烯醋酸乙烯酯、丙烯腈和/或聚四氟乙烯。
任何合适的测试试剂都可用于本装置中。例如，所述测试试剂可以与所述分析物结合。在一些实施方案中，所述测试试剂特异性结合所述分析物。在另一个实例中，所述测试试剂可以结合另一种结合所述分析物的结合试剂。在又一个实例中，所述测试试剂可以是分析物或分析物类似物，其与样品中的分析物竞争结合所述分析物的结合试剂。
所述测试试剂可以是任何合适的物质。例如，所述测试试剂可以是肽或蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质可以是抗原或抗体，例如特异性结合重组蛋白(多肽)表达产物或报告基因表达产物的抗体。
所述基质可以是任何合适的形式。例如，所述基质可以是条状或圆形。所述基质可以是单个元件或可以包含多个元件。
所述测试装置可进一步包括在所述基质上游并与所述基质流体连通的样品施加元件。所述测试装置还可包括在所述基质下游并与所述基质流体连通的样品吸收元件。所述测试装置还可以包括对照位置。
至少所述基质的一部分可由固体背衬支撑。在一些实施方案中，整个所述基质可由固体背衬支撑。
在测试位置上游处，所述基质的一部分可包含干燥的标记试剂，所述标记试剂能够被液体样品和/或另外的液体移动到所述测试位置和/或对照位置以产生可检测信号。所述干燥的标记试剂可位于任何合适的位置。例如，所述干燥的标记试剂可以位于所述测试装置上的样品施加位置的下游。在另一个实例中，所述干燥的标记试剂可以位于所述测试装置上的样品施加位置的上游。
本测试装置还可以在所述测试位置的上游包括结合元件，所述结合元件包括干燥的标记试剂，所述标记试剂能够通过液体样品和/或另外的液体移动到所述测试位置和/或对照位置以产生可检测信号。所述结合元件，例如结合垫，可位于任何合适的位置。例如，所述结合元件可位于所述测试装置上的样品施加位置的下游。在另一个实例中，所述结合元件可位于所述测试装置上的样品施加位置的上游。
本测试装置可包含任何合适的标记试剂。例如，所述标记试剂可以结合，且优选特异性结合所述样品中的分析物。
任何合适的标记都可以采用。例如，所述标签可以是可溶性标记，例如比色的、放射性的、酶促的，发光的或荧光的标记。在另一个实例中，所述标记可以是颗粒或颗粒的标记，例如颗粒直接标记或有色颗粒标记。示例性颗粒或颗粒标记包括彩色胶体金标记、乳胶颗粒标记、纳米颗粒标记和量子点标记。
所述标记试剂可以在存在a)稳定所述标记试剂；b)促进所述标记试剂在液体中的溶解或再悬浮；和/或c)促进所述标记试剂的移动性的材料时干燥。可以使用任何合适的材料。例如，所述材料可以是蛋白质，例如酪蛋白或BSA、肽、多糖、糖、聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)、明胶或去污剂，例如吐温-20。
可以通过任何合适的方式将所述分析物和/或所述标记试剂运输到所述测试位置。例如，单独用样品液体将所述分析物和/或所述标记试剂输送到所述测试位置。在另一个实例中，可用显影液将所述分析物和/或所述标记试剂输送到所述测试位置。
所述测试装置还可包括覆盖所述测试装置的至少一部分的壳体，其中所述壳体包括样品施加口以允许在所述测试位置的上游施加样品以及在所述测试位置的视窗以允许在所述测试位置进行信号检测。在一些实施例中，所述壳体覆盖整个测试装置。在其他实施方案中，至少所述基质的样品接收部分或所述样品施加元件的一部分未被所述壳体覆盖，并且样品被施加到所述壳体外的所述基质的样品接收部分或所述样品施加元件的一部分上,然后被运送到所述测试位置。
所述壳体可包括任何合适的材料。例如，所述壳体可包括塑料材料。
所述测试装置可以配置用于夹心测定。在一些实施方案中，所述测试试剂和所述标记试剂结合所述分析物，并且至少一种所述测试试剂和所述标记试剂特异性结合所述分析物。在一些实例中，所述测试试剂和所述标记试剂特异性结合所述分析物。
所述测试装置还可以配置用于竞争性检测。在一些实施方案中，所述测试试剂是分析物或分析物类似物，其与样品中的分析物竞争结合所述分析物的标记试剂。在一些实例中，所述标记试剂特异性结合所述分析物。在其他实施方案中，所述测试试剂结合所述分析物，并且所述标记试剂包括分析物或分析物类似物，其与样品中的分析物竞争结合所述测试试剂。在一些实例中，所述测试试剂特异性结合所述分析物。
所述测试装置可以配置用于评估样品中的重组蛋白表达。所述测试装置可以配置为夹心测定法用于评估样品中的重组蛋白表达。在一些实施方案中，所述测试试剂和所述标记试剂结合重组蛋白表达产物，并且所述测试试剂和标记试剂中的至少一种特异性结合所述重组蛋白表达产物。待评估的所述重组蛋白表达产物可包含靶蛋白部分和标签部分。在一些实例中，所述测试试剂和标记试剂中的至少一种，结合或特异性结合所述靶蛋白质部分。在其他实例中，所述测试试剂和标记试剂中的至少一种，结合或特异性结合所述标签部分。
所述测试装置还可以配置为竞争性检测，用于评估样品中的重组蛋白表达。在一些实施方案中，所述测试试剂是重组蛋白表达产物或其部分，其与样品中的所述重组蛋白表达产物竞争结合所述重组蛋白表达产物结合或特异性结合的标记试剂。待评估的重组蛋白表达产物可包含靶蛋白部分和标签部分。在一些实例中，所述测试试剂包含所述重组蛋白表达产物的靶蛋白部分或其部分，并且所述标记试剂，结合或特异性结合，所述重组蛋白表达产物的靶蛋白部分。在其他实例中，所述测试试剂包含所述重组蛋白表达产物的标签部分或其部分，并且所述标记试剂结合或特异性结合所述标签部分。
本测试装置可以配置用于评估样品中的报告基因表达。本测试装置可以配置为夹心测定法，用于评估样品中的报告基因表达。在一些实施方案中，所述测试试剂和所述标记试剂结合所述报告基因表达产物，并且所述测试试剂和标记试剂中的至少一种特异性结合所述报告基因表达产物。所述报告基因表达产物可包含报告蛋白部分和标签部分。在一些实例中，所述测试试剂和标记试剂中的至少一种，结合或特异性结合所述报告蛋白部分。在其他实例中，所述测试试剂和标记试剂中的至少一种结合或特异性结合所述标签部分。
本测试装置还可以配置为竞争测定，用于评估样品中的报告基因表达。在一些实施方案中，所述测试试剂是所述报告基因表达产物或其部分，其与所述样品中的所述报告基因表达产物竞争结合所述报告基因表达产物结合或特异性结合的标记试剂。所述报告基因表达产物可包含报告蛋白部分和标签部分。在一些实例中，所述测试试剂包含所述报告基因表达产物的报告蛋白部分或其部分，并且所述标记试剂结合或特异性结合所述报告基因表达产物的报告蛋白部分。在其他实例中，所述测试试剂包含所述报告基因表达产物的标签部分或其部分，并且所述标记试剂结合或特异性结合所述报告基因表达产物的所述标签部分。
本测试设备可以配置用于任何合适的用途或应用。例如，本测试装置可以配置用于：1)评估样品中的多种重组蛋白表达产物或多种报告基因表达产物；2)确定具有预期产量的重组蛋白表达的候选物；3)评估重组蛋白表达或报告基因表达时程；4)优化用于重组蛋白表达或报告基因表达的诱导条件；和/或5)在蛋白质纯化过程例如色谱法中确定具有预期重组蛋白质的馏分。
在另一个方面，本公开提供了用于评估样品中重组蛋白表达或报告基因表达的方法，该方法包括：a)使液体样品与上述测试装置接触，其中所述液体样品被施加于所述测试位置的上游的所述测试装置的位置上；b)所述分析物，如果存在于液体样品中，和标记试剂被运输到所述测试位置；c)评估所述测试位置的可检测信号，以确定所述样品中所述重组蛋白表达产物或所述报告基因表达产物的存在，不存在和/或量。
本方法可以以任何合适的形式使用。在一些实施方案中，可以将所述液体样品和所述标记试剂预混合以形成混合物，并将所述混合物施加到所述测试装置上。本方法可以进一步包括在将所述混合物施加到测试装置之后的洗涤步骤。所述洗涤步骤可以以任何合适方式进行。例如，所述洗涤步骤可包括在将混合物施加到测试装置之后添加洗涤液。在另一个实例中，所述测试装置可包括含有洗涤液的液体容器并且所述洗涤步骤包括从液体容器中释放洗涤液。
在一些实施方案中，本测试装置可包含使用前的干燥的标记试剂，并且所述干燥的标记试剂可被溶解或重悬，并可被所述液体样品运输至所述测试位置。所述干燥的标记试剂可位于任何合适的位置。例如，所述干燥的标记试剂可以位于样品施加部位的下游，并且所述干燥的标记试剂可以溶解或重悬，并被所述液体样品运输到所述测试位置。在另一个实例中，所述干燥的标记试剂可以位于所述样品施加部位的上游，并且所述干燥的标记试剂可以溶解或重悬，并被另一种液体运输到所述测试位置。
所述分析物和/或标记试剂可被溶解或重悬，并被任何合适的方式运输到所述测试位置。例如，所述标记试剂可以溶解或重悬，并且通过所述液体样品单独运输到所述测试位置。在另一个实例中，所述分析物和/或标记试剂可以溶解或重悬，并通过另一种液体运输到测试位置。
本方法可用于评估任何合适样品中的重组蛋白表达或报告基因表达。例如，本方法可用于评估液体样品中的重组蛋白表达或报告基因表达，所述液体样品包含细胞裂解物、细胞培养基、体外转录产物、体外翻译产物、多肽纯化组分、和/或从受试者分离或衍生的样品。在一些实施方案中，本方法可用于评估从体外转录、体外翻译、细胞或细胞系获得的重组蛋白表达产物或报告基因表达产物。在其他实施方案中，本方法可用于评估从体内表达获得的重组蛋白表达产物或报告基因表达产物，例如受试者中的重组蛋白表达产物或报告基因表达产物。示例性的受试者可以是人或非人受试者，例如实验动物、宠物或农场动物。例如，本方法可用于评估分离或衍生自受试者的样品中的重组蛋白表达产物或报告基因表达产物。本方法可用于任何合适的目的，例如，监测受试者或患者中的药物代谢，或作为药物筛选或发现过程的一部分。
可通过任何合适的手段评估所述可检测信号。例如，可通过用户的视觉检查来评估所述可检测信号。在另一个例子中，所述可检测信号可以由读数器评估。可以使用任何合适的读数器。在一些实施方案中，所述可检测信号是荧光信号，所述荧光信号由荧光读数器评估。可以使用任何合适的荧光读数器。例如，所述荧光读数器可以是基于激光的或基于发光二极管(LED)的荧光读数器。所述读数器包括单个或多个光电探测器。
可以针对任何合适的用途或应用进行本方法。在一些实施方案中，可以进行本方法用于评估样品中的重组蛋白表达。例如，可以进行本方法以确定样品中重组蛋白表达产物的存在或不存在。在另一个实例中，可以进行本方法以确定样品中重组蛋白表达产物的量。在其他实施方案中，可以进行本方法用于评估样品中的报告基因表达。例如，可以进行本方法以确定样品中报告基因表达产物的存在或不存在。在另一个实例中，可以进行本方法以确定样品中报告基因表达产物的量。在其他实施方案中，本方法可以用于：1)评估样品中的多种重组蛋白表达产物或多种报告基因表达产物；2)确定具有预期产量的重组蛋白表达的候选物；3)评估重组蛋白表达或报告基因表达时程；4)优化用于重组蛋白表达或报告基因表达的诱导条件；和/或5)在蛋白质纯化例如色谱法，过程中确定具有预期重组蛋白质的组分。
本方法可以进行任何合适的时长。例如，本方法可以进行约1小时或在约1小时内，例如，进行约50分钟，40分钟，30分钟，20分钟，10分钟，9分钟，8分钟，7分钟，6分钟，5分钟，4分钟，3分钟，2分钟，1分钟或不到1分钟。
在另一个方面，本公开提供了用于评估样品中重组蛋白表达或报告基因表达的系统，该系统包括：a)上述测试装置；b)包括光源和光检测器的读数器，用于检测可检测信号。本系统还可包括条形码检测器和/或RFID检测器。例如,本系统中的读数器还可包括条形码检测器和/或RFID检测器。
本测试装置，试剂盒，系统和方法的原理可以应用于或可以适用于本领域已知的侧向流动测试装置和测定。例如，本测试装置，试剂盒，系统和方法的原理可以应用于或可以适用于侧向流动测试装置和在以下专利和申请中公开和/或要求保护的测定：5,073,484,5,654,162,6,020,147,4,695,554,4,703,017,4,743,560,5,591,645,RE 38,430 E,5,602,040,5,633,871,5,656,503,6,187,598,6,228,660,6,818,455,7,109,042,6,352,862,7,238,537,7,384,796,7,407,813,5,714,389,5,989,921,6,485,982,5,120,643,5,578,577,6,534,320,4,956,302,RE 39,664 E,5,252,496,5,559,041,5,728,587,6,027,943,6,506,612,6,541,277,6,737,277,7,175,992 B2,7,691,595 B2,6,770,487 B2,7,247,500 B2,7,662,643 B2,5,712,170,5,965,458,7,371,582 B2,7,476,549 B2,7,633,620 B2,7,815,853 B2,6,267,722 B1,6,394,952 B1,6,867,051 B1,6,936,476 B1,7,270,970 B2,7,239,394 B2,7,315,378 B2,7,317,532 B2,7,616,315 B2,7,521,259 B2,7,521,260 B2,US 2005/0221504 A1,US 2005/0221505 A1,US 2006/0240541 A1,US2007/0143035 A1,US 2007/0185679 A1,US 2008/0028261 A1,US 2009/0180925 A1,US2009/0180926 A1,US 2009/0180927 A1,US 2009/0180928 A1,US 2009/0180929 A1,US2009/0214383 A1,US 2009/0269858A1,6,777,198,US 2009/0311724 A1,US 2009/0117006 A1,7,256,053,6,916,666,6,812,038,5,710,005,6,140,134,US 2010/0143941A1,6,140,048,6,756,202,7,205,553,7,679,745,US 2010/0165338 A1,US 2010/0015611A1,5,422,726,5,596,414,7,178,416,7,784,678 B2,US 2010/094564 A1,US 2010/0173423 A1,US 2009/0157023 A1,7,785,899,7,763,454 B2,US 2010/0239460 A1,US2010/0240149 A1,7,796,266 B2,7,815,854 B2,US 2005/0244953 A1,US 2007/0121113A1,US 2003/0119202 A1,US 2010/0311181 A1,6,707,554 B1,6,194,222 B1,7,713,703,EP 0,149,168 A1,EP 0,323,605 A1,EP 0,250,137 A2,GB 1,526,708和WO99/40438.
附图说明
该专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。
图1是基于侧向流动免疫测定的测试条的示意图。
图2示出了示例性测试结果的可能结果。C：控制线。T：测试线。当出现C和T线时，测试为阳性，样品中有表达的蛋白质标签。当仅出现C线时，无蛋白质表达。如果没有出现C线，那么测试可能出现了问题并且尚无定论。
图3示出了竞争LFIA的测试结果的可能结果。C：控制线。T：测试线。当出现C和T线时，测试结果为阴性，样品中没有可检测量的蛋白质表达。当仅出现C线时，样品中存在蛋白质。如果没有出现C线，那么测试可能出现了问题并且尚无定论。
图4示出了用于转染的示例性载体的图谱。将173H6VHH克隆到pcDNA 3.1载体中的人IgG1Fc的上游。
图5示出了示例性测试结果。人IgG在PBS中从3ng/ml稀释至100μg/ml并被施加在测试条上。条带#1至8：0,3ng/ml，6ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml。
图6示出了示例性测试结果。用人Fc测试与小鼠IgG和兔IgG的交叉反应试纸。条带1,小鼠IgG；条带2,兔IgG；条带3，人IgG。用人Fc测试条测试100ng/ml的每种抗体。
图7示出了用测试条检测在转染CHO-S细胞后来自培养基的人Fc。转染后每个测试条的时间：1：14小时；2：24小时；3：3天；4：5天；5：7天；6：7天；7：8天。
图8示出了测试条检测来自G418中选择的CHO-S细胞的人Fc。G418加入后的时间：1.2天；2.4天；3.5天。
图9示出了用于检测His标记的蛋白质的竞争LFIA。C：对照线，T1：试验线1，最高浓度；T2：试验线2，中等浓度；T3：最低浓度。测试条1至6用不同浓度的MBP-His测试：1,空白；2,0.05ng/ul；3,0.1ng/ul；4,0.2ng/ul；5,0.5ng/ul；6,1ng/ul。
图10显示了在反应后用Qiagen ESEquant读数器扫描的胶体金标记的人Fc测试条。5个条带与不同浓度的人IgG(0,3.125ng/ml，12.5ng/ml，50ng/ml和200ng/ml)反应。在每个条带上，最左边的峰值是对照线的密度，右边的峰值是测试线的密度。
详细说明
以下提供所要求保护的主题的一个或多个实施例的详细描述以及说明所要求保护的主题的原理的附图。结合这些实施例描述了所要求保护的主题，但是不限于任何特定实施例。应理解，所要求保护的主题可以以各种形式体现，并且包含许多替换，修改和等同物。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制，而是作为权利要求的基础，并且作为教导本领域技术人员在任何适当详细的系统，结构或实际上采用所要求保护的主题的代表性基础方式。在以下描述中阐述了许多具体细节，以便提供对本公开的透彻理解。提供这些细节是出于示例的目的，并且可以根据权利要求来实践所要求保护的主题，而没有这些具体细节中的一些或全部。应当理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其他实施例并且可以进行结构改变。应当理解，在一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不限于它们对描述它们的特定实施例的适用性。相反，它们可以单独或以某种组合应用于本公开的一个或多个其他实施例，无论是否描述了这样的实施例，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施例的一部分。为了清楚起见，没有详细描述与所要求保护的主题相关的技术领域中已知的技术材料，使得所要求保护的主题不会被不必要地模糊。
除非另外定义，否则本文使用的所有术语，符号和其他技术和科学术语或术语旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本领域技术人员使用常规方法很好地理解并且通常采用本文描述或引用的许多技术和程序。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文献，科学文章和数据库，出于所有目而通过引用整体并入本文，等同于每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利，专利申请，公开申请或其他出版物中阐述的定义相反或不一致，则本文所述的定义优先于本文通过引用的定义。对出版物或文献的引用并非旨在承认它们中的任何一个是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。
除非另有说明，否则所有标题都是为了方便读者而不应用于限制标题后面的文本的含义。
除非另有说明，否则所提供的实施方案的实践将采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、和测序技术的常规技术和描述，其属于本领域普通技术人员的技能范围。此类常规技术包括多肽和蛋白质合成和修饰、多核苷酸合成和修饰、聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接，以及使用标记的杂交检测。通过参考本文的实施例可以获得合适技术的具体说明。但是，当然也可以使用其他等同的传统程序。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如Green,et al.,Eds.,GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)(1999)；Weiner,Gabriel,Stephens,Eds.,Genetic Variation:A Laboratory Manual(2007)；Dieffenbach,Dveksler,Eds.,PCR Primer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell and Sambrook,DNA Microarrays:AMolecular Cloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and GenomeAnalysis(2004)；Sambrook and Russell,Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual(2006)；和Sambrook and Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2002)(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubelet al.eds.,Current Protocols in Molecular Biology(1987)；T.Brown ed.,EssentialMolecular Biology(1991),IRL Press；Goeddel ed.,Gene Expression Technology(1991),Academic Press；A.Bothwell et al.eds.,Methods for Cloning and Analysisof Eukaryotic Genes(1990),Bartlett Publ.；M.Kriegler,Gene Transfer andExpression(1990),Stockton Press；R.Wu et al.eds.,Recombinant DNA Methodology(1989),Academic Press；M.McPherson et al.,PCR:A Practical Approach(1991),IRLPress at Oxford University Press；Stryer,Biochemistry(4th Ed.)(1995),W.H.Freeman,New York N.Y.；Gait,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(2002),IRL Press,London；Nelson and Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry(2000)3rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg,et al.,Biochemistry(2002)5th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；D.Weir&C.Blackwell,eds.,Handbook ofExperimental Immunology(1996),Wiley-Blackwell；Cellular and MolecularImmunology(A.Abbas et al.,W.B.Saunders Co.1991,1994)；Current Protocols inImmunology(J.Coligan et al.eds.1991)，在此所有文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
贯穿本公开内容，所要求保护的主题的很多方面以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对要求保护的主题的范围的不可调整的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供一个数值范围时，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及其他陈述范围或在所陈述范围内的中间值都包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且还包括在要求保护的主题内，受所述范围内的任何特别排除的限制。当所陈述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的所述限制中的一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题中。无论范围的宽度如何，这都适用。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述具有特别公开的子范围，例如1至3,1至4,1至5,2至4,2至6，从3到6等，以及该范围内的个别数字，例如，1,2,3,4,5和6。
I.定义
如本文所用，单数形式“一”，“一个”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。例如，“一个”或“一个”表示“至少一个”或“一个或多个”。应当理解，本文描述的方面和变化包括“包含”方面和变化和/或“基本上由方面和变化组成”。
本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。这里对“约”值或参数的引用包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、膏剂、水、非水或其任何组合。
本文的术语“抗体”以最广义使用，包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段，Fv片段，重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语包括基因工程和/或其他修饰形式的免疫球蛋白，例如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人源抗体、人源化抗体和异源偶联抗体、多特异性例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二联ScFv、串联三联cFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包括完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类，IgM，IgE，IgA和IgD。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类型的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。
本领域已知术语“互补决定区”和“CDR”与“高变异区”或“HVR”同义，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，每个重链可变区(CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3)中有三个CDR，每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中是已知的，指的是所述重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，每个全长重链可变区(FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4)中有四个FR，每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以采用许多熟知的方案中的任何一种容易地确定，包括采用Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”numbering scheme),Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”numbering scheme),MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”numbering scheme),Lefranc MP et al.,“IMGTunique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”numbering scheme),and Honegger A and Plückthun A,“Yet another numberingscheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysistool,”J Mol Biol,2001Jun 8；309(3):657-70,(“Aho”numbering scheme)等描述的方案。
给定CDR或FR的边界可以基于采用的识别方案而变化。例如，所述Kabat方案是基于结构对齐，而Chothia方案基于结构信息。Kabat方案和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区序列长度,具有被插入字母调节的插入，例如“30a”以及在一些抗体中出现的缺失。这两种方案在不同位置放置某些插入和删除(“插入”)，导致差异编号。所述Contact方案基于对复杂晶体结构的分析并且在许多方面与Chothia编号方案类似。
因此，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(例如可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如“CDR-H1，CDR-H2)”应理解为包括由任何上述方案定义的(或特定的)互补决定区。例如，当陈述特定CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列时，应理解这样的CDR具有如任何上述方案所定义的可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列。
同样地，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(例如其可变区)的FR或个体特定FR(例如，FR-H1，FR-H2)应理解为包括由任何已知方案定义的(或特定的)框架区域。在一些情况下，用于鉴定特定CDR，FR或FR或CDR的所述方案是指定的，例如所述CDR由所述Kabat，Chothia或Contact方法定义。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其参与所述抗体和抗原的结合。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。参见，例如Kindt et al.,KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)。单个VH和VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH和VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以筛选分别与VH或VL结构域互补的文库。参见，例如，Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有至少一部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述。
所提供的抗体是抗体片段。“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体的抗原结合部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，所述抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，例如scFv。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是骆驼科动物单结构域抗体。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于通过完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞的生产。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，例如包含非天然产生的排列的片段，例如通过合成接头，如肽接头，连接的具有两个或更多个抗体区域或链的片段，和/或不可以通过酶消化天然存在的完整抗体来产生的片段。
“人源化”抗体是其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基衍生自人FR的抗体。术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种的抗体，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种。
所提供的抗体是单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中或在群体内获得的抗体，即，包含群体的各个抗体是相同的，除了包含天然存在的突变或在单克隆抗体产生期间产生的可能变体。抗体制备，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。该术语不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用于指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽，包括提供的抗体和抗体链和其他肽，可包括含天然和/或非天然氨基酸残基的氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可以含有天然或自然序列的修饰，只要该蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可能是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增引起的错误。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用,“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过包括本文所述的那些本领域已知常规方法测量。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述如下。
“亲和力成熟的”抗体是指在其一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这种改变的母本抗体相比，这种改变导致所述抗体对抗原的亲和力改善。
如本文所用，术语“特异性结合”是指结合物，例如抗体的特异性，使得其优先结合靶标，例如多肽抗原。当提及结合配体，例如蛋白质、核酸、抗体或其他亲和捕获剂等时，“特异性结合”可以包括具有高亲和力和/或互补性的两个或更多个结合配体的结合反应，以确保在指定的测定条件下的选择性杂交。通常，特异性结合会是背景信号标准偏差的至少三倍。因此，在指定条件下，结合配体与其特定靶分子结合，并且不与样品中存在的显著量的其他分子发生的结合。在存在其他潜在干扰物质的情况下通过结合物或特定靶标的抗体来识别是这种结合的一个特征。优选地，特异于靶标或与靶标特异性结合的结合物、抗体或抗体片段以比与其他非靶标物质结合更高的亲和力结合靶标。还优选地，特异于靶标或与靶标特异性结合的结合物、抗体或抗体片段避免结合显著百分比含量的非靶标物质，例如测试样品中存在的非靶标物质。在一些实施方案中，本公开的结合物、抗体或抗体片段避免结合约90％以上的非靶标物质，虽然更高的百分比是明确考虑和优选的。例如，本公开的结合物，抗体或抗体片段避免结合约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，以及约99％或更多的非目标物质。在其他实施方案中，本公开的结合物，抗体或抗体片段避免结合约10％，20％，30％，40％，50％，60％，或70％以上，或超过约75％，或超过约80％，或超过约85％的非靶标物质。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛，绵羊，猫，狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，例如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。“个体”或“受试者”可包括鸟类诸如鸡、脊椎动物诸如鱼和哺乳动物诸如小鼠，大鼠，兔子，猫，狗，猪，牛，牛，绵羊，山羊，马，猴子和其他非哺乳动物。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
如本文所用，术语“样品”是指任何可能含有分析物的物质，其需要进行分析物测定。如本文所用，“样品”可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。样品可以是生物样品，例如生物流体或生物组织。生物流体的实例包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊髓液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是细胞的聚集体，通常是的特定种类的细胞和细胞间质，其形成人、动物，植物，细菌，真菌或病毒结构，包括结缔组织、上皮细胞，肌肉和神经组织的材料之一。生物组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个体细胞。
在一些实施方案中，所述样品是生物样品。本公开的生物样品包括溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状、含水样或非含水样品形式的样品。如本文所用，“生物样品”包括从活或病毒(或朊病毒)来源的或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包括受试者的任何类型的组织，从其中可以获得细胞核酸、蛋白质和/或其他大分子。生物样品可以是直接从生物来源或被处理过的样品获得的样品。例如，扩增的分离的核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液，来自动物和植物的组织和器官样品以及由其衍生的加工样品。在一些实施方案中，样品可以衍生自组织或体液，例如结缔组织、上皮细胞、肌肉或神经组织；选自脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠的组织、神经系统、腺体和内部血管；或选自血液、尿液、唾液、骨髓、精子、腹水及其亚组分的体液，例如血清或血浆。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参考，例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含于细胞中的核酸分子，该细胞通常中含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体的位置上。
关于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”是指候选序列中的氨基酸与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，如果需要，在比对所述序列和引入缺口后，以实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
II.示例性实施例
在一些实施方案中，本公开涉及侧向流动免疫测定(LFIA)装置用于快速检测重组蛋白表达的用途。在本公开的优选实施方案中，LFIA装置(测试条)包含连续安装在固体背衬上的四个元件(样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫)或由其组成。与蛋白质或表位标签特异性抗体结合的胶体金纳米颗粒沉积在所述结合物垫上，其与样品中重组表达蛋白或表位标签形成免疫复合物。将对蛋白质或表位标签特异的第二抗体固定在所述硝酸纤维素膜上。所述第二抗体捕获第一种免疫复合物。免疫复合物的彩色胶体金纳米颗粒的累积允许重组蛋白表达的检测。
在一些实施方案中，本公开使用LFIA通过蛋白质或表位标签快速检测重组蛋白质的表达。蛋白质标签和表位标签通常为了各种目的例如亲和纯化、免疫沉淀、表达追踪而作为所述重组蛋白质的一部分。许多蛋白质标签也改善了表达蛋白质的可溶性并提高了产量。蛋白质和表位标签通常用于所有的体内重组表达系统，例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和植物等。体外翻译系统也使用这些标签。常用的蛋白质标签包括：IgG的Fc结构域(人，兔，小鼠)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等。常用的表位标签包括：聚组氨酸、FLAG、HA，c-myc、V5、Avi Tag、Strep II标签等[1-6]。
在一些实施方案中，本公开的目的是设计用于快速检测重组蛋白表达的简单、灵敏、经济有效的装置。通过使用侧向流动免疫测定(LFIA)装置可能实现这些目标。
在一些实施方案中,本公开内容涉及应用示例性侧向流动免疫测定装置检测重组蛋白表达。检测蛋白质/表位标签的LFIA装置能够在任何表达系统中快速确定重组蛋白质表达水平，如果蛋白质用标签表达的话。这些装置可用于直接从样品裂解物中中快速检测蛋白质表达。所述LFIA设备可以是定性的,半定量的或定量的。
在一些实施方案中，示例性侧向流动免疫测定装置包含四种元素或由四种元素组成：样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸收垫。它基本上是一系列四个能够通过毛细作用自发地输送流体样品的毛细血管垫。第一个元素是样品垫，即样品加载于其上的多孔膜。在第二元件(结合垫)中，沉积有结合了对蛋白质或表位标签特异的抗体的胶体金纳米颗粒(图1)。当所述结合物垫从样品垫接收样品时，与所述胶体金纳米颗粒结合的抗体再水化并结合特定蛋白质或表位标签，形成第一免疫复合物。样品连同所述第一免疫复合物继续向所述硝酸纤维素膜(第三元件)迁移，其中对蛋白质或表位标签特异的第二抗体沉积并固定在形成测试线的硝酸纤维素膜上的窄带内。随着越来越多的免疫复合物通过并被第二抗体捕获，由于免疫复合物的彩色纳米金颗粒的积累，所述测试线的颜色变深(图2)。这允许快速检测重组蛋白表达。所述第四元件(吸收垫)用作废物贮存器并引导毛细管流动。
在一些实施方案中，我们的LFIA重组蛋白检测装置的潜在应用包括：1)快速高通量筛选(HTS)大量样品(例如不同克隆)以确定具有更高产量的最佳候选物；2)蛋白质表达时程测定；3)蛋白质表达诱导条件优化；以及4)在蛋白质纯化/色谱分析过程中快速确定具有预期蛋白质的组分。
在优选的实施方案中，所述抗体标记可以是任何彩色材料，例如胶体金纳米颗粒、量子点、有色酶或荧光颗粒。
在优选的实施方案中，所述第一抗体可以对所述的重组蛋白的第一表位或第一标签具有特异性；及所述所述第二抗体可以对所述重组蛋白的第一或第二表位或标签具有特异性。两种抗体都可以是多克隆或单克隆抗体的组合。
在一些实施方案中，所述侧向流动也可以是竞争类型的测定，其中所述表位标签特异性抗体与所述胶体金纳米颗粒结合，并且固相上的测试线是具有相同检测表位的竞争蛋白。当样品中不存在预期的蛋白质/标签时，所述抗体-金纳米颗粒复合物将迁移至固相上的测试线并结合在测试线上，其中将出现彩色线以指示阴性结果。当样品中存在预期的蛋白质存在时，例如表位标签，样品将结合金纳米颗粒上的抗体并迁移至测试线。测试线上的表位标签将与金纳米粒子竞争，因此不会出现测试线，表明阳性结果。图3显示了竞争LFIA的典型结果。可以打印具有不同浓度的竞争物的多个测试线以促进信号检测(半定量)。
以下参考附图详细描述其他示例性实施例。图1是LFIA装置的示意图。所述LFIA装置(测试条)包括四个元件或由四个元件组成：样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸收垫。这四个元件连续安装在固体背衬上。所述LFIA装置的第一个元素是样品垫。它位于所述LFIA测试条的一端。它是一种多孔膜，可以加载样品。一旦样品分配在样品垫上，所述样品由于毛细作用向所述LFIA测试条的另一端迁移。
所述第二元素是结合垫。具有蛋白质或表位标签的重组蛋白质的存在通过对所述蛋白质或表位标签特异的抗体进行检测。与抗体结合的胶体金纳米颗粒用作检测的色度信号。单分散胶体金纳米粒子因其灵敏度和可调节的鲜艳色彩而成为检测的有吸引力的选择。胶体金纳米粒子的颜色很大程度上取决于其环境和物理尺寸。在本发明的示例性实施方案中，将与蛋白质或表位标签特异性抗体结合的胶体金纳米颗粒沉积到结合垫中。当结合物垫从所述样品垫接收样品时，与胶体金纳米颗粒结合的所述抗体再水化并结合特定蛋白质或表位标签，形成第一免疫复合物。
样品连同第一免疫复合物继续向硝酸纤维素膜(第三元件)迁移。将对蛋白质或表位标签特异性的第二抗体沉积并固定在形成测试线的硝酸纤维素膜上的窄带内。还可以将额外的对照线添加到硝酸纤维素膜上以进行质量控制。随着更多的免疫复合物通过第二抗体并被第二抗体捕获，由于免疫复合物的彩色纳米金颗粒的积累，测试线的颜色变深。这允许快速检测重组蛋白表达。第四元件(吸收垫)用作废物贮存器。它还可以防止样品在继续吸取样品时回流。
图2显示了LFIA装置的可能测试结果的解释。所述控制线指示LFIA是否正常运行。测试线表明具有蛋白质/表位标签的重组蛋白质的存在或不存在。可以用图像处理程序确定测试线的强度，提供重组蛋白表达的定量分析。图3显示了竞争LFIA的可能测试结果的解释。
其他示例性应用。测试条可用于许多其他应用，包括但不限于：选择在转染或转化后表达预期蛋白质的阳性克隆，确定蛋白质表达的时间进程，蛋白质表达的诱导条件优化，或从色谱中收集的馏分中确定含有所需蛋白质的馏分。如果有条带阅读器，例如QiagenESEquant阅读器，也可以进行定量分析(图10)。该实施例显示了胶体金标记的测试条的定量图。其他标记如不同的荧光染料也可用于定量。
当在LFIA中使用报告特异性抗体时，所述测试条也可用于检测报告基因表达，例如荧光素酶或碱性磷酸酶。
在一些实施方案中，本公开内容提供了侧向流动免疫测定装置，其用于使用蛋白质或表位标签对重组蛋白质表达进行定性或定量分析。所述公开内容适用于检测来自所有重组蛋白表达系统的蛋白质样品，包括：细菌，酵母，昆虫，哺乳动物和植物等。它也适用于体外重组蛋白表达系统。
示例
示例1：在中国仓鼠卵巢细胞中快速检测人Fc融合蛋白表达
结合物的制备。
胶体金纳米颗粒的制备。通过氯金酸还原制备胶体金纳米颗粒，类似于Turkevich(J.Turkevich,P.C.Stevenson,J.Hillier,"A study of the nucleation and growthprocesses in the synthesis of colloidal gold",Discuss.Faraday.Soc.1951,11,55–75)和Frens(G.Frens,"Particle size and sol stability in metal colloids",Colloid&Polymer Science 1972,250,736–741)[7]的方法。
抗体-胶体金纳米颗粒结合物的制备。抗体-胶体纳米金偶联物通过类似于Bailes(Bailes,J.,et al.,Effect of gold nanoparticle conjugation on the activity andstability of functional proteins.Methods Mol Biol,2012.906:p.89-99；和Bailes,J.,et al.,Gold nanoparticle antibody conjugates for use in competitivelateral flow assays.Methods Mol Biol,2012.906:p.45-55)[8,9]的方法制备。
测试条的组装
通过将四个LFIA元件(样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸收垫)连续地安装在固体背衬上来组装LFIA测试条。将山羊抗人IgG与胶体金结合并印在结合物垫上。用山羊抗人IgG印刷测试线。对照线用驴抗山羊IgG印刷。
测试样品
在该实施例中，来自美洲驼的单结构域抗体的编码区克隆在pcDNA3.1载体中的人IgG1Fc结构域的上游(图4)。纯化质粒DNA并转染到125ml摇瓶中活跃生长的FreestyleCHO-S细胞(Thermofisher cat#R80007)。在转染后的不同时间点收集细胞培养基。用对人Fc特异的测试条检测每种培养基馏分中人Fc的存在。
分析结果
灵敏度。人IgG用作阳性对照，培养基用作阴性对照。将人IgG稀释至3ng/ml至1ug/ml的各种浓度。用测试条测试每个样品(图5)。检测限远低于3ng/ml，远低于正常生产的表达系统，其将产生以μg/ml范围或更高的特定蛋白质。
特异性。用人Fc测试条测试与小鼠IgG和兔IgG的交叉反应(图6)。与100ng/ml浓度的小鼠或兔IgG没有交叉反应。
用测试条测试在转染的CHO-S细胞的不同时间点收集的培养基样品。早在转染后14小时就可检测到蛋白质的表达(Fc的存在)(图7)。转染后两天以5×10e5/ml CHO-S细胞起始，转染的CHO-S细胞也在600ug/ml G418存在下培养以选择稳定的抗药性细胞。在G418选定的池中每两天更换一次培养基。用测试条检测人Fc的存在(图8)。在转染后第8天，瞬时转染的细胞(非药物选择的)已达到8×10e6/ml的密度。G418选择的细胞达到1.2×10e6/ml。然而，药物选择的细胞中表达的蛋白质的量达到与具有较低细胞密度的瞬时转染细胞中的表达蛋白质相似的水平时指示具有人Fc表达的细胞群的富集。所述测试条可用于监测重组蛋白表达的稳定细胞选择。
示例2：在中国仓鼠卵巢细胞中快速检测人Fc融合蛋白表达
结合物的制备
胶体金纳米颗粒的制备。与实施例1类似，通过还原氯金酸制备胶体金纳米颗粒，类似于Turkevich和Frens的方法[7]。
抗体-胶体金纳米颗粒结合物的制备。与实施例1类似，通过类似于Bailes[8,9]的方法制备抗体-胶体纳米金偶联物。
测试条的组装
通过将四个LFIA元件(样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸收垫)连续地安装在固体背衬上来组装LFIA测试条。将单克隆小鼠抗His标签抗体与胶体金结合并印刷在结合物垫上。用不同浓度的聚-His肽结合的BSA印刷三条测试线。对照线用山羊抗小鼠抗体印刷。
测试样品
在该实施例中，在pET22b载体中表达在蛋白质C末端具有poly-His标签的麦芽糖结合蛋白(MBP)。将纯化的带His标签的MBP稀释至不同浓度，并用His标签测试条进行测试(图9)。在0.05ng/ul时，T3线开始消失。随着His标记的蛋白质增加，所有测试线逐渐消退，并且在10ng/ul时，所有测试线消失。
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Claims (81)

1.一种用于评估样品中重组蛋白(多肽)表达或报告基因表达的侧向流动测试装置，其包括多孔基质，所述多孔基质包括在所述多孔基质上的测试位置，所述测试位置包含结合分析物的测试试剂或另一种与所述分析物结合的结合试剂，或者所述测试试剂是与所述样品中的分析物竞争结合所述分析物的结合试剂的分析物或分析物类似物，
其中所述分析物是重组蛋白(多肽)表达产物或报告基因表达产物，且
其中液体样品沿着所述测试装置侧向流动并流经所述测试位置形成可检测信号，从而确定在所述样品中所述重组蛋白(多肽)表达产物或所述报告基因表达产物的存在，不存在和/或量。
2.权利要求1的测试装置，其中所述基质包括硝化纤维素、玻璃纤维、聚丙烯，聚乙烯(优选具有非常高分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯醋酸乙烯酯、丙烯腈和/或聚四氟乙烯。
3.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述测试试剂结合到所述分析物。
4.根据权利要求3所述的测试装置，其中所述测试试剂特异性结合所述分析物。
5.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述测试试剂结合另一种结合所述分析物的结合试剂。
6.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述测试试剂是分析物或分析物类似物，其与所述样品中的分析物竞争结合所述分析物的结合试剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的测试装置，其中所述测试试剂是肽或蛋白质。
8.如权利要求7所述的测试装置，其中所述蛋白质是抗原或抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的测试装置，其中所述基质呈条带或圆形。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的测试装置，其中所述基质是单个元素或包含多个元素。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的测试装置，其进一步包括在所述基质上游并与所述基质流体连通的样品施加元件。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的测试装置，其进一步包括在所述基质下游并与所述基质流体连通的液体吸收元件。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的测试设备，还包括对照位置。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的测试装置，其中所述基质的至少一部分由固体背衬支撑。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的测试装置，其中所述基质的一部分，在所述测试位置的上游，包括干燥的标记试剂，所述标记试剂能够被液体样品和/或另外的液体移动到所述测试位置和/或对照位置以产生可检测信号。
16.根据权利要求15所述的测试装置，其中所述干燥的标记试剂位于所述测试装置上的所述样品施加位置的下游。
17.根据权利要求15所述的测试装置，其中所述干燥的标记试剂位于所述测试装置上的所述样品施加位置的上游。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的测试装置，其在所述测试位置的上游还包括结合元件，所述结合元件包含干燥的标记试剂，所述标记试剂能够通过液体样品和/或额外的液体移动到测试位置和/或对照位置以产生可检测信号。
19.根据权利要求18所述的测试装置，其中所述结合元件位于所述测试装置上的样品施加位置的下游。
20.根据权利要求18所述的测试装置，其中所述结合元件位于所述测试装置上的样品施加位置的上游。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的测试装置，其中所述标记试剂与所述样品中的分析物结合，并且优选地特异性结合。
22.如权利要求15-21中任一项所述的测试装置，其中所述标记是可溶性标记，例如荧光标记。
23.根据权利要求15-21中任一项所述的测试装置，其中所述标记是颗粒标记，例如金或乳胶颗粒标记。
24.根据权利要求15-23中任一项所述的测试装置，其中所述标记试剂在存在：a)稳定所述标记试剂；b)促进所述标记试剂在液体中的溶解或再悬浮；和/或c)促进所述标记试剂的移动性，的材料条件下干燥。
25.根据权利要求24所述的测试装置，其中所述材料选自蛋白质例如酪蛋白或BSA、肽、多糖、糖、聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)、明胶和洗涤剂例如吐温-20。
26.如权利要求1-25中任一项所述的测试装置，其中单独用样品液体将分析物和/或标记的试剂输送到测试位置。
27.如权利要求1-26中任一项所述的测试装置，其中使用显影液将分析物和/或标记的试剂输送到测试位置。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的测试装置，还包括覆盖所述测试装置的至少一部分的壳体，其中所述壳体包括样品施加口，以允许在所述测试位置上游或到所述测试位置施加样品，和在测试位置周围的视窗，以允许在所述测试位置处进行信号检测。
29.根据权利要求28所述的测试装置，其中所述壳体覆盖整个测试装置。
30.根据权利要求28所述的测试装置，其中所述基质或所述样品施加元件的所述样品接收部分的至少一部分未被所述壳体覆盖，并且样品被施加到所述基质的所述样品接收部分的所述部分或样品施加元件在壳体外部然后被运输到测试位置并且样品被施加到所述壳体外的所述基质的样品接收部分或所述样品施加元件的一部分上,然后被运送到所述测试位置。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的测试装置，其中所述壳体包含塑料材料。
32.如权利要求15-31中任一项所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂与所述分析物结合，并且所述测试试剂和所述标记试剂中的至少一种特异性结合所述分析物。
33.根据权利要求32所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂特异性结合所述分析物。
34.根据权利要求15-31中任一项所述的测试装置，其中所述测试试剂是分析物或分析物类似物，其与所述样品中的分析物竞争结合与所述分析物结合的所述标记试剂。
35.根据权利要求34所述的测试装置，其中所述标记的试剂特异性结合所述分析物。
36.根据权利要求15-31中任一项所述的测试装置，其中所述测试试剂结合到所述分析物，并且所述标记的试剂包括分析物或分析物类似物，所述分析物或分析物类似物与所述样品中的分析物竞争结合所述测试试剂。
37.根据权利要求36所述的测试装置，其中所述测试试剂特异性结合所述分析物。
38.权利要求1-37中任一项的测试装置，其配置用于评估样品中的重组蛋白表达。
39.权利要求38的测试装置，其中测试试剂和标记试剂结合重组蛋白表达产物，并且测试试剂和标记试剂中的至少一种特异性结合重组蛋白表达产物。
40.如权利要求39所述的测试装置，其中所述重组蛋白表达产物包含靶蛋白部分和标签部分。
41.根据权利要求40所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂中的至少一种与所述靶蛋白质部分结合或特异性结合。
42.根据权利要求40所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂中的至少一种与所述标签部分结合或特异性结合。
43.根据权利要求38所述的测试装置，其中所述测试试剂是重组蛋白表达产物或其部分，其与样品中的重组蛋白表达产物竞争性结合或特异性结合那些结合所述重组蛋白表达产物的标记试剂。
44.如权利要求43所述的测试装置，其中所述重组蛋白表达产物包含靶蛋白部分和标签部分。
45.权利要求44的测试装置，其中测试试剂包含重组蛋白表达产物的靶蛋白部分或其部分，并且标记的试剂与重组蛋白表达产物的靶蛋白部分结合或特异性结合。
46.如权利要求44所述的测试装置，其中所述测试试剂包括所述重组蛋白表达产物的标签部分或其部分，并且所述标记试剂与所述标签部分结合或特异性结合。
47.权利要求1-37中任一项的测试装置，其配置用于评估样品中的报告基因表达。
48.如权利要求47所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂结合所述报告基因表达产物，并且所述测试试剂和所述标记试剂中的至少一种特异性结合所述报告基因表达产物。
49.如权利要求48所述的测试装置，其中所述报告基因表达产物包含报告蛋白部分和标签部分。
50.如权利要求49所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂中的至少一种与所述报告蛋白部分结合或特异性结合。
51.如权利要求49所述的测试装置，其中所述测试试剂和所述标记试剂中的至少一种与所述标签部分结合或特异性结合。
52.如权利要求47所述的测试装置，其中所述测试试剂是报告基因表达产物，或它们的部分，其与样品中的报道基因表达产物竞争结合或特异性结合那些结合所述报告基因表达产物的标记试剂。
53.如权利要求52所述的测试装置，其中所述报告基因表达产物包含报告蛋白部分和标签部分。
54.权利要求53的测试装置，其中测试试剂包含报告基因表达产物的报告蛋白部分或其部分，并且所述标记试剂结合或特异性结合所述报告基因表达产物的的报告蛋白部分。
55.如权利要求53所述的测试装置，其中所述测试试剂包括所述报告基因表达产物的标签部分或其部分，并且所述标记试剂与所述报告基因表达产物的标签部分结合或特异性结合。
56.如权利要求1-55中任一项所述的测试设备，其被配置用于：
1)评估样品中的多种重组蛋白表达产物或多种报告基因表达产物；
2)确定具有预期产量的重组蛋白表达的候选物；
3)评估重组蛋白表达或报告基因表达时程；
4)优化用于重组蛋白表达或报告基因表达诱导条件；和/或
5)在蛋白质纯化过程例如色谱法中确定具有预期的重组蛋白质的馏分。
57.一种评估样品中重组蛋白表达或报告基因表达的方法，该方法包括：
a)使液体样品与权利要求1-56中任一项的测试装置接触，其中将液体样品施加到所述测试位置上游的测试装置的位点上；
b)将分析物，如果存在于液体样品中，和标记试剂运输到所述测试位置；和
c)评估所述测试位置处的可检测信号以确定所述样品中所述重组蛋白表达产物或所述报告基因表达产物的存在，不存在和/或量。
58.如权利要求57所述的方法，其中将所述液体样品和所述标记试剂预混合以形成混合物并将所述混合物施加到所述测试装置上。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于,还包括在将混合物施加到测试装置上之后的洗涤步骤。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述洗涤步骤包括在将所述混合物施加到所述测试装置之后添加洗涤液。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述测试装置包括含有洗涤液的液体容器，并且所述洗涤步骤包括从所述液体容器释放所述洗涤液。
62.如权利要求57所述的方法，其中所述测试装置在使用前包含干燥的标记试剂，并且所述干燥的标记试剂被溶解或重悬浮，并通过所述液体样品运输到所述测试位置。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述干燥的标记试剂位于所述样品施加部位的下游，并且所述干燥的标记试剂被溶解或重悬浮，并通过所述液体样品运输至所述测试位置。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述干燥的标记试剂位于所述样品施用部位的上游，并且所述干燥的标记试剂被溶解或再悬浮，并通过另一种液体运输到所述测试位置。
65.权利要求62的方法，其中将标记试剂溶解或重悬，并仅通过液体样品运输到测试位置。
66.如权利要求62所述的方法，其中所述分析物和/或标记试剂被溶解或重悬浮，并通过另一种液体运输到所述测试位置。
67.权利要求57-66中任一项的方法，其中所述液体样品包含细胞裂解物、细胞培养基、体外转录产物、体外翻译产物、多肽纯化馏分和/或从受试者分离或衍生的样品。
68.权利要求57-67中任一项的方法，其中所述可检测信号由读数器评估。
69.权利要求68的方法，其中可检测信号是荧光信号，荧光信号由荧光读数器评估。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述荧光读取器是基于激光的或基于发光二极管(LED)的荧光读取器。
71.如权利要求68-70中任一项所述的方法，其中所述读取器包括单个或多个光电探测器。
72.权利要求57-71中任一项的方法，其用于评估样品中的重组蛋白表达。
73.权利要求72的方法，其用于确定样品中重组蛋白表达产物的存在或不存在。
74.权利要求72的方法，其用于测定样品中重组蛋白表达产物的量。
75.权利要求57-71中任一项的方法，其用于评估样品中的报告基因表达。
76.权利要求75的方法，其用于确定样品中报告基因表达产物的存在或不存在。
77.权利要求75的方法，其用于测定样品中报告基因表达产物的量。
78.如权利要求57-77中任一项所述的方法，其用于：
1)评估样品中的多种重组蛋白表达产物或多种报告基因表达产物；
2)确定具有预期产量的重组蛋白表达的候选物；
3)评估重组蛋白表达或报告基因表达时程；
4)优化用于重组蛋白表达或报告基因表达诱导条件；和/或
5)在蛋白质纯化过程例如色谱法中确定具有预期的重组蛋白质的馏分。
79.如权利要求57-78中任一项所述的方法，其在进行约一小时或在约一小时内完成。
80.一种用于评估样品中重组蛋白表达或报告基因表达的系统，该系统包括：
a)如权利要求1-56中任一项所述的测试装置；和
b)包括光源和光电检测器的读取器，用于检测可检测信号。
81.如权利要求80所述的系统，其中所述读取器还包括条形码检测器和/或RFID检测器。
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