CN109563154A - 抗帕多瓦因子ix抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了抗帕多瓦因子IX的结合构建体，例如抗体及其抗原结合片段。还提供了相关多肽、偶联物及试剂盒。本发明可以用于检测样品中的帕多瓦因子IX的方法中。

Description

抗帕多瓦因子IX抗体
相关申请的交叉引用
本专利申请依据35U.S.C.§119(e)要求2016年5月16日提交的美国临时专利申请第62/337,118号和2016年5月24日提交的第62/340,834号的优先权，两案的全文特此以引用的方式并入。
以引用的方式并入以电子版提交的材料
与本申请同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表以全文引用的方式并入，且标识如下：命名为“50573_SeqListing.txt”的28,804字节ACII(Text)文件；创建于2016年5月16日。
背景技术
基因疗法作为将来血友病的治疗选择具有极大的发展前景。在一项临床试验中，用编码帕多瓦(Padua)因子IX(FIX)的腺相关病毒(AAV)载体治疗患有重度B型血友病的受试者，该帕多瓦因子IX(FIX)是在成熟肽序列338位(或在前原蛋白序列384位)处的Arg经历单氨基酸取代变为Leu的FIX的高功能性变体。转基因产物(帕多瓦FIX)的特异性检测可用于评估因子替代的成功性。然而，受治疗患者体内帕多瓦FIX的特异性检测仍是一大挑战，因为一些患者具有因子IX交叉反应性物质(cross-reactive material，CRM)。一些CRM阳性(CRM+)患者表达例如野生型(WT)因子IX，该因子与当前可用的帕多瓦FIX结合剂交叉反应，由此使得很难确定此类CRM+患者是否能表达帕多瓦FIX。
发明内容
本文提供了特异性识别帕多瓦FIX(FIXp)且不与野生型FIX交叉反应的结合构建体。在例示性实施方式中，所述结合构建体是结合含氨基酸序列SEQ ID NO:1的帕多瓦FIX并且不结合至含氨基酸序列SEQ ID NO:2的WT因子IX的一种抗体或其抗原结合片段。在例示性实施方式中，所述结合构建体是包括含SEQ ID NO:6-11中的每一个的氨基酸序列的多肽，任选地，其中(i)在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸，和/或(ii)所述多肽任选地还包括含DYKDDDDK(SEQ ID NO:12)的FLAG标签和/或含HHHHHH(SEQ IDNO:13)的六聚组氨酸标签，任选地，其中所述FLAG标签和/或所述六聚组氨酸标签位于所述多肽的C末端。在例示性实施方式中，所述结合构建体是一种偶联物，所述偶联物包括如本文所描述的抗原结合片段偶联至(i)免疫球蛋白重链的恒定区、(ii)免疫球蛋白轻链的恒定区或(iii)免疫球蛋白重链的恒定区和免疫球蛋白轻链的恒定区。在例示性实施方式中，所述结合构建体是包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段连接或偶联至异源部分的偶联物。在例示性方面中，所述偶联物包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段偶联至聚合物、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质或检测剂。
另外提供了核酸，所述核酸包括编码如本文所描述的抗体、抗原结合片段、多肽、偶联物或其片段的核苷酸序列。还提供了包括所述核酸的载体以及包括所述核酸或载体的宿主细胞。
本文还提供了相关试剂盒。在例示性实施方式中，所述试剂盒包括如本文所描述的抗体、抗原结合片段、多肽、偶联物、核酸、载体、宿主细胞或其组合，以及任选地，使用说明书。在例示性方面中，所述试剂盒还包括固体载体并且任选地，所述抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物被预先涂覆于所述固体载体上。在例示性方面中，所述试剂盒还包括次级抗体，所述次级抗体结合至所述试剂盒中所提供的抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物。
本发明还提供了组合物，所述组合物包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物与生物样品的混合物，所述生物样品是例如从人获得的生物样品。在例示性方面中，所述生物样品包括人血浆或其稀释级分，和/或人体组织或其细胞。在例示性方面中，所述生物样品包括人血浆蛋白质，其中所述人血浆蛋白质中的至少一种选自下组：因子IX、因子II和因子X，及其变体。任选地，所述组合物包括检测剂。
本文所提供的此类结合构建体可用于例如这样一些检测方法中：它们允许明确地或特异性地检测样品中的帕多瓦FIX，例如包括例如野生型FIX的临床或临床前样品。因此，本文提供了检测从受试者获得的样品中含氨基酸序列SEQ ID NO:1的帕多瓦因子IX的方法。在例示性实施方式中，所述方法包括(i)使所述样品与结合构建体(例如，如本文所描述的抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物)接触以形成包括所述FIXp和所述结合构建体的复合物，例如免疫复合物；和(ii)检测所述样品中的所述复合物。
附图简要说明
图1呈现了WT因子IX和帕多瓦FIX的氨基酸序列的示意图。
图2呈现了帕多瓦FIX(左图)或WT因子IX(右图)与涂有5μg/ml BC1(最接近于Z轴(即，向左)的蓝色条柱)、1μg/ml BC1(蓝色条柱右侧的红色条柱)、0.2μg/ml BC1(邻近红色条柱的绿色条柱)或0.04μg/ml BC1的Ni2+板的结合信号的图。
图3呈现了涂在MaxiSorp板上的BC1(三角形)、BC2(菱形)或BC3(正方形)与指定浓度的帕多瓦FIX的结合信号的图。
图4呈现了BC1与含有5μg/ml WT因子IX且不含苯甲脒的5％人血浆溶液中指定浓度的帕多瓦FIX的结合信号的图。
图5呈现了BC1与2％BSA/PBS(菱形)、含有50mM苯甲脒的5％血浆溶液(正方形)、含有50mM苯甲脒的10％血浆溶液(三角形)或含有50mM苯甲脒的20％血浆溶液(X)中指定浓度的帕多瓦FIX的结合信号的图。
图6呈现了BC1(正方形)、BC2(三角形)、BC4(菱形)或阴性对照(X)与含WT因子IX和50mM苯甲脒的20％(v/v)血浆溶液中指定浓度的帕多瓦FIX的结合信号的图。
图7呈现了BC1(左图)和BC4(右图)与指定浓度的以下凝血因子的结合信号的两个图：帕多瓦FIX(菱形)；因子II(正方形)；和因子X(三角形)。
图8呈现了BC5(左图)和BC6(右图)与指定浓度(μg/ml)的WT因子IX(菱形)或帕多瓦FIX(正方形)的结合信号的两个图。
图9呈现了实施例2中所描述的ELISA的组分的示意图。
图10呈现了实施例1中所描述的ELISA的组分的示意图。
图11呈现了使用含有帕多瓦FIX的样品(圆形)或参考人血浆样品(菱形)进行的帕多瓦FIX ELISA的浓度-反应曲线图。
图12呈现了使用具有指定量帕多瓦FIX的六个标准品(标准品D1至D6)进行的帕多瓦FIX ELISA的校准曲线图。
图13呈现了使用含帕多瓦FIX的缓冲液或正常血浆或者缺乏FIX的血浆进行的帕多瓦FIX ELISA的稀释度-反应曲线图。
图14呈现了使用柠檬酸化猴血浆样品进行的帕多瓦FIX ELISA的稀释度-反应曲线图。
图15呈现了在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗之后，具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的受试者的样品中的凝血活性和蛋白质测量值的图。
图16呈现了在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗之后，具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的另一受试者的样品中的凝血活性和蛋白质测量值的图。
图17呈现了在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗之后，不具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的受试者的样品中的凝血活性和蛋白质测量值的图。
图18呈现了信号随FIX浓度变化的图，其中信号是通过帕多瓦FIX特异性显色活性分析产生。
图19呈现了用于产生帕多瓦FIX特异性Fab的策略的示意图和所使用的淘选和阻断肽的序列(帕多瓦FIX中的L338以红色并且加框指示，野生型FIX中的R338以绿色并且加框指示)。
图20呈现了纯化的微型抗体(二价Fab)的示意性结构。
图21呈现(图21A)猪科动物FIXa的X射线结构并且展示Arg338位于猪科动物FIXa重链的表面上以及(图21B)人帕多瓦FIX的示意图并且展示Leu338。
图22呈现的图展示纯化的Fab特异性结合至帕多瓦FIX并且不结合至野生型FIX抗原。图22呈现了由针对野生型和帕多瓦抗原的纯化的二价Fab进行的ELISA的图。测试从不同淘选策略获得的二价Fab针对野生型和帕多瓦肽和蛋白质的特异性。结果表示为相对于背景的增加倍数(图22A)，并且(图22B)显示了ELISA设置的方案。条柱的次序与图例中相同(即，Ab42柱在左侧)。有关详情，参见实施例5中的方法说明。
图23呈现的图展示纯化的二价Fab显示与20％人血浆基质中的野生型FIX无交叉反应性。图23呈现了在20％血浆存在下纯化的二价Fab的ELISA图。(图23A)涂覆纯化的二价Fab并将其与含有5μg/mL野生型FIX和指定浓度帕多瓦FIX的20％人血浆一起培育。用HRP标记的多克隆山羊抗FIX抗体(100ng/ml)进行检测。(图23B)ELISA设置的方案。每条线的次序与图例相同。
图24呈现的图展示了所选候选物Ab42的表面等离子体共振(SPR)分析。(图24A)His标记的微型抗体Ab42以KD＝59nM(ka：4.3×104 1/Ms；kd：0.002531 1/s)结合帕多瓦FIX，(图24B)但不结合NTA-BIAcore传感器芯片上的FIX wt。虚线表示原始数据，而实线指示拟合的数据。每条线的次序与图例相同。
图25呈现免疫分析的图解说明。
图26呈现的图展示了分析选择性，如由所获得的纯化的FIXp样品和具有5μg/mL正常FIX浓度的新鲜冷冻的参考血浆制剂的浓度-反应曲线所表示，展示了所述分析的选择性。人血浆显示基本上无反应。
图27呈现了范围从0.85至27.1ng FIXp/mL的6点校准曲线图，具有适当线性。其准确度是由相关性系数r、低相对总误差(relative total error，RTE)和回溯拟合方法的结果展示。
图28呈现的一组图展示了在正常和缺乏FIX的血浆中进行的平行研究。掺加FIXp的血浆的稀释度-反应曲线的斜率与关于缓冲液稀释系列获得的稀释度-反应曲线的斜率相差<5％，指示血浆基质对分析性能无影响。
图29呈现的图展示了Ca2+对ELISA灵敏度的影响。显示了由Ca2+引起的灵敏度的明显增加，这极可能是由多克隆检测抗体和FIX的Ca依赖性EGF结构域引起。
图30呈现的一组图展示在1/2期试验中关于来自用AAV2/8病毒载体治疗的第一位患者的柠檬酸化血浆样品的分析。从第一位患者获得的血浆样品是FIX交叉反应性物质阳性(CRM+)。
图31呈现的一组图展示在1/2期试验中关于来自用AAV2/8病毒载体治疗的第二位患者的柠檬酸化血浆样品的分析。从第二位患者获得的血浆样品是FIX交叉反应性物质阳性(CRM+)。
图32呈现的一组图展示在1/2期试验中关于来自用AAV2/8病毒载体治疗的第三位患者的柠檬酸化血浆样品的分析。从第三位患者获得的血浆样品不是FIX交叉反应性物质阳性(CRM+)。
实施方式
本文提供了特异性识别帕多瓦FIX并且与野生型FIX具有极小交叉反应或无交叉反应性的结合构建体。在例示性方面中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX并且不结合至野生型(WT)因子IX。在例示性方面中，所述结合构建体在WT因子IX存在下结合至帕多瓦FIX(并且不结合至WT因子IX)。在例示性方面中，所述结合构建体在类似或相同条件下结合至帕多瓦FIX并且不结合至一个WT因子IX以及因子II和因子X中的一个或两个，或其任何其它突变或修饰形式(帕多瓦FIX除外)。在例示性方面中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX并且既不结合至因子II，也不结合至因子X。在例示性方面中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX并且不结合至WT因子IX、因子II和因子X当中任何一个。在例示性方面中，所述结合构建体在WT因子IX、因子II和因子X存在下结合至帕多瓦FIX并且(不结合至WT因子IX、因子II和因子X)。在例示性实施方式中，所述结合构建体即使是在溶液中时也结合帕多瓦FIX(SEQID NO:1)的表位，所述溶液包括存在于人血浆中存在的水平的WT因子IX、因子II和因子X。
表位
如本文所使用，“表位”意思指结合构建体所结合的帕多瓦FIX的区域或帕多瓦FIX内的区域。在一些实施方式中，所述表位是线性表位。如本文所使用，“线性表位”是指结合构建体所结合的帕多瓦FIX的区域或帕多瓦FIX内的区域，并且所述区域是由帕多瓦FIX的氨基酸序列中的邻接氨基酸构成。线性表位的氨基酸在帕多瓦因子IX的一级结构中彼此相邻。因此，线性表位是所述抗原(即，帕多瓦FIX)的氨基酸序列的片段或一部分。
在其它例示性实施方式中，所述表位是构象或结构表位。“构象表位”或“结构表位”意思指当帕多瓦因子IX处于其适当折叠状态时由位置彼此紧密邻近的氨基酸构成的表位。与线性表位不同，构象或结构表位的氨基酸不必在帕多瓦FIX的一级结构(即，氨基酸序列)中彼此相邻。构象或结构表位不必由所述抗原(FIXp)的氨基酸序列中的邻接氨基酸构成。
在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至含氨基酸序列SEQ ID NO:1的帕多瓦FIX的表位，其中所述表位是在氨基酸序列SEQ ID NO:1内的线性表位。在例示性方面中，所述线性表位是在氨基酸序列DRATCLLSTKFT(SEQ ID NO:3)内。在例示性方面中，所述线性表位至少包括SEQ ID NO:3中的L-L。在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX的线性表位，即使是在WT因子IX、因子II和/或因子X存在下。在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX的表位，即使是在5μg/mL WT因子IX存在下。在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX的表位，即使是在5μg/mLWT因子IX存在下以及在20％人血浆基质中。
在例示性方面中，所述结合构建体不结合至WT FIX的表位。在例示性方面中，所述结合构建体不结合至SEQ ID NO:2内或DRATCLRSTKFT(SEQ ID NO:14)内或LVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:15)内的表位。在例示性方面中，在与所述结合构建体结合至帕多瓦FIX时类似或相同的条件下，所述结合构建体不结合至WT FIX的表位。在例示性方面中，当在含正常血浆含量的WT FIX的溶液中时，所述结合构建体不结合至WTFIX的表位。在例示性方面中，当在含5μg/mL WT FIX的溶液(例如缓冲液)(例如含约5μg/mLWT FIX的人血浆基质)中时，所述结合构建体不结合至WT FIX的表位。
在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX(SEQ ID NO:1)的表位，其中所述表位是氨基酸序列LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:5)的折叠结构的构象表位。在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX(SEQ ID NO:1)的表位，其中所述表位是氨基酸序列LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:5)的折叠结构的构象表位，其中所述折叠结构包括二硫桥。在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX的构象表位，即使是在WT因子IX、因子II和/或因子X存在下。在例示性实施方式中，所述结合构建体结合至帕多瓦FIX的表位，即使是在5μg/mLWT因子IX存在下。
亲和力和亲合力
本文提供的结合构建体以非共价且可逆的方式结合至帕多瓦FIX。在例示性实施方式中，所述结合构建体与帕多瓦FIX的结合强度可以通过其亲和力描述，亲和力是结合构建体的结合位点与表位之间相互作用的强度的量度。在例示性方面中，本文提供的结合构建体对帕多瓦FIX具有高亲和力并因此相较于低亲和力结合构建体，将在较短时间段内结合较大量的帕多瓦FIX。在例示性方面中，所述结合构建体具有平衡缔合常数KA，KA是至少105mol-1、至少106mol-1、至少107mol-1、至少108mol-1、至少109mol-1或至少1010mol-1。在例示性方面中，本文提供的结合构建体对于人血浆中的帕多瓦FIX展现高亲和力。在例示性方面中，在含人血浆的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX。在例示性方面中，在含至少或约5％人血浆(例如5％人血浆基质)的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX。在例示性方面中，在含至少或约10％人血浆(例如10％人血浆基质)的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX。在例示性方面中，在含至少或约20％人血浆(例如20％人血浆基质)的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX。在例示性方面中，在含至少或约5％至约40％、约10％至约30％、或约15％至约20％人血浆的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX。在例示性方面中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX，即使是当样品中存在大量的WT因子IX时。在例示性方面中，在含一定量人血浆(例如至少或约5％人血浆、至少或约10％人血浆、至少或约20％人血浆)和至少或约1μg/mL WT因子IX、或至少或约2.5μg/mL WT因子IX、或至少或约5μg/mL WT因子IX、或至少或约10μg/mL WT因子IX的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX。在例示性方面中，在含其它凝血因子的样品中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX，所述其他凝血因子包含但不限于因子II、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII。在例示性方面中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX且也不结合至因子II或因子X。在例示性方面中，所述结合构建体结合至帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX且另外，既不结合至因子II，也不结合至因子X。
在例示性实施方式中，所述结合构建体与帕多瓦FIX的结合强度可以通过其敏感性描述。KD是所述结合构建体与帕多瓦FIX之间的平衡解离常数，即koff/kon的比率。KD与KA呈逆相关。KD值与所述结合构建体的浓度(特定实验所需的结合构建体的量)相关并因此KD值越低(浓度越低)，则所述结合构建体的亲和力越高。在例示性方面中，所述结合构建体与帕多瓦FIX的结合强度可以通过KD描述。在例示性方面中，本文提供的结合构建体对于FIXp的KD是约1.0×10-6或更小、约1.0×10-7或更小、约1.0×10-8或更小、约1.0×10-9或更小、约1.0×10-10或更小。在例示性方面中，本文提供的结合构建体的KD是微摩尔浓度、纳摩尔浓度、皮摩尔浓度或飞摩尔浓度。在例示性方面中，本文提供的结合构建体的KD在约10-4至10-6、或10-7至10-9、或10-10至10-12、或10-13至10-15范围内。在例示性方面中，本文提供的结合构建体的KD是约100nM或更小。在某些方面，本文提供的结合构建体的KD是约20nM至约100nM、约25nM至约95nM、约30nM至约90nM、约35nM至约85nM、约40nM至约80nM、约45nM至约75nM、约50nM至约70nM、或约55nM至约65nM。在例示性方面中，所述结合构建体的KD在约25nM至约75nM的范围内。在例示性方面中，所述结合构建体的KD在约50nM至约60nM的范围内。在例示性方面中，所述结合构建体的KD是约56nM。
亲合力是对抗体-抗原复合物的总体强度的量度。它取决于三个主要参数：所述结合构建体对表位的亲和力、所述结合构建体和帕多瓦FIX的价数以及相互作用各部分的结构布置。结合构建体的价数(抗原结合位点的数量)越高，它能结合的抗原(帕多瓦FIX)量越高。在例示性方面中，所述结合构建体对于FIXp具有较强亲合力。在例示性方面中，所述结合构建体是多价的。在例示性方面中，所述结合构建体是二价的。
结构
本文所描述的结合构建体可以被工程改造成众多结构当中的一种。在例示性方面中，本文提供的结合构建体具有抗体或其抗原结合片段的结构。在例示性方面中，本文提供的结合构建体具有基于或衍生自抗体的结构。在例示性方面中，本文提供的结合构建体具有合成抗体模拟物、工程改造的蛋白质或适体的结构，如本文以及McEnaney等人,“具有抗体的靶向和效应功能的以化学方式合成的分子(Chemically Synthesized Moleculeswith the Targeting and Effector Functions of Antibodies)”,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,136(52):18034-18043(2014)；Binz和Pluckthun,“作为特异性结合试剂的工程改造的蛋白质(Engineered proteins as specific binding reagents)”,《生物技术当前述评(Curr Opin Biotechnol.)》16(4):459-69(2005)；以及Roque等人,“抗体和基因工程改造的相关分子：制造和纯化(Antibodies and genetically engineeredrelated molecules:production and purification)”,《生物技术进展(BiotechnolProg.)》20(3):639-54(2004)中所描述的那些。
抗体和抗原结合片段
在例示性实施方式中，所述结合构建体是一种抗体。所述抗体可以是本领域中已知的任何类型的抗体，即免疫球蛋白。在例示性实施方式中，所述抗体是属于种类或同型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体。在例示性实施方式中，本文所描述的抗体包括一条或多条α、δ、ε、γ和/或μ重链。在例示性实施方式中，本文所描述的抗体包括一条或多条κ轻链。在例示性方面中，所述抗体是IgG抗体并且任选地是四个人亚类之一：lgG1、lgG2、lgG3和lgG4。
另外，在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在其它实施方式中，所述抗体是多克隆抗体。
在一些实施方式中，所述抗体在结构上类似于或衍生自天然存在的抗体，例如从哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等分离和/或纯化的抗体。就这一点而言，所述抗体可以被认为是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。在例示性方面中，所述抗体仅包括哺乳动物抗体的序列。制造此类抗体的方法是本领域中已知的，其中有一些在本文题为“抗体制造方法”的章节下进一步描述。在例示性方面中，所述结合构建体是完全人抗体，或不包括非人抗体的序列。
在一些实施方式中，所述抗体是经过基因工程改造的抗体并且不存在于自然界中。在例示性实施方式中，所述抗体是单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人工程化(humaneered)抗体、双特异性抗体、三特异性抗体等。基因工程技术还提供由非人来源制备完全人抗体的能力。
在一些方面，经过基因工程改造的抗体是对帕多瓦FIX具有特异性的单链抗体(SCA)。制备SCA的方法是本领域中已知的。参见例如Davis等人,《自然·生物技术(NatureBiotechnology)》9:165-169(1991)。
在一些方面，所述抗体是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用以指含有来自一个物种的恒定结构域和来自另一物种的可变结构域，或更概括地，含有来自至少两个物种的氨基酸序列连续片段的抗体。在特定方面，所述嵌合抗体结合至帕多瓦FIX。
在一些方面中，所述抗体是人源化抗体。当关于抗体使用时，术语“人源化”是指抗体具有来自非人来源的至少CDR区，这些抗体被工程改造成具有更类似于真实人抗体的结构和免疫功能而不是初始源抗体。例如，人源化可以涉及将来自非人抗体，如小鼠抗体的CDR移植至人抗体中。人源化还可以涉及选择氨基酸取代以使非人序列看起来更像人序列。
本文中使用术语“嵌合或人源化”不含有相互排斥的用意，而是表示涵盖嵌合抗体、人源化抗体和进一步人源化的嵌合抗体。除非上下文另外指示，否则关于嵌合抗体的陈述(嵌合抗体的特性、用途、测试等)适用于人源化抗体，并且关于人源化抗体的陈述也是关于嵌合抗体。同样，除非上下文规定，否则这类陈述也应理解为适用于抗体和这类抗体的抗原结合片段。
在一些方面，所述抗体是人工程化(humaneeredTM)抗体。人工程改造(Humaneering)技术是KaloBios Pharmaceuticals,Inc.(加利福尼亚州南旧金山(SouthSan Francisco,California))专有的用于将非人抗体转化成工程改造的人抗体的方法。人工程化(HumaneeredTM)抗体具有高亲和力，并且与人生殖系抗体序列高度类似。参见例如Tomasevic等人,《生长因子(Growth Factors)》32:223-235(2014)。
在一些方面，所述抗体是对帕多瓦FIX具有特异性的CDR移植的抗体。CDR移植的抗体的制备方法是本领域中已知的。参见例如Lo,Benny,《抗体工程：方法和实验方案(Antibody Engineering:Methods andProtocols)》第248卷(2004)，以全文引用的方式并入。
在例示性实施方式中，所述抗体被工程改造成双特异性、三特异性或多特异性的，并且所述抗体包括两个或更多个不同的抗原结合区。在一些方面，所述抗体是对帕多瓦FIX具有特异性的双特异性或三特异性抗体。制备双特异性或三特异性抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Marvin和Zhu,《中国药理学报(Acta Pharmacologica Sinica)》26:649-658(2005)和美国专利6,551,592。在例示性方面中，所述结合构建体是对帕多瓦FIX的第一个表位和帕多瓦FIX的第二个表位具有特异性的双特异性抗原结合构建体。在例示性实施方式中，所述抗体是四源杂交瘤、异二聚双特异性抗体、双特异性抗体融合物、双特异性抗体片段、双特异性T细胞接合蛋白(bispecific T-cell engager，BiTE)或多特异性抗体。在例示性实施方式中，所述抗体被工程改造成二价、三价或多价的。参见例如Cuesta等人,“多价抗体：当设计超越进化时(Multivalent antibodies:when design surpassesevolution)”,《生物技术趋势(Trends in Biotechnology)》28,355-362(2010)；Holliger等人,“工程改造的抗体片段及单结构域的产生(Engineered antibody fragments andthe rise of single domains)”,《自然·生物技术》23,1126-1136(2005)；Chan等人,“针对自体免疫和炎症的治疗抗体(Therapeutic antibodies for autoimmunity andinflammation)”,《自然·免疫学综述(Nat Rev Immunol)》10,301-SI 6(2010)；Byrne等人,“两种特异性的记述：用于治疗和诊断应用的双特异性抗体(Atale of twospecificities:bispecific antibodies for therapeutic and diagnosticapplications)”,《生物技术趋势》31,621-632(2013)。在一些实施方式中，所述抗体是呈单体形式，而在其它实施方式中，所述抗体偶联至一种或多种抗体(例如其各自识别与第一抗体相同的表位)。因此，在一些方面，所述抗体呈二聚、聚合、寡聚或多聚形式。
在例示性方面中，所述结合构建体是抗体的抗原结合片段或包括抗体的抗原结合片段。抗原结合片段(在本文中又称为“抗原结合部分”)可以是任一种本文所述抗体的抗原结合片段。所述抗原结合片段可以是抗体中具有至少一个抗原结合位点的任何部分，包含但不限于Fab、F(ab')2、单特异性或双特异性Fab2、三特异性Fab3、单价IgG、scFv、dsFv、scFv-Fc、双特异性双功能抗体、三特异性三功能抗体、微型抗体，或IgNAR的片段(例如V-NAR)，或hcIgG的片段(例如VhH)，或双scFv、Fab表达文库表达的片段等。在例示性方面中，所述抗原结合片段是结构域抗体、VhH结构域、V-NAR结构域、VH结构域、VL结构域等。然而，本公开的抗体片段不限于这些例示性类型的抗体片段。在例示性方面中，所述结合构建体包括Fab片段。在例示性方面中，所述结合构建体包括两个Fab片段。在例示性方面中，所述结合构建体包括通过连接子连接的两个Fab片段。在例示性方面中，所述结合构建体包括或是含两个Fab片段的微型抗体。在例示性方面中，所述结合构建体包括或是含通过连接子接合的两个Fab片段的微型抗体。微型抗体是本领域中已知的。参见例如Hu等人,《癌症研究(Cancer Res)》56:3055-3061(1996)。在例示性方面中，所述结合构建体包括或是含通过连接子接合的两个Fab片段的微型抗体，任选地含碱性磷酸酶结构域的微型抗体。
结构域抗体包括抗体的有功能的结合单元，并且可以对应于抗体重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体的分子量可以是约13kDa，或是完整抗体的约十分之一。结构域抗体可以来源于完整抗体，如本文所描述的那些。
在一些实施方式中，所述结合构建体是单体或聚合物、双特异性或三特异性、二价或三价的。在例示性方面中，本文提供的结合构建体是单特异性的。在例示性方面中，本文提供的结合构建体是双特异性的。在例示性方面中，本文提供的结合构建体是完全人源的。在例示性方面中，所述结合构建体包括两个Fab片段并且是二价的。在例示性方面中，所述结合构建体是结构相同的两个Fab片段形成的同源二聚体。因此，在例示性方面中，所述结合构建体是二价的，但对帕多瓦FIX具有单特异性。在例示性方面中，所述同源二聚体通过螺旋-转角-螺旋基序二聚化。在例示性方面中，所述结合构建体是结构相同的两个Fab微型抗体形成的同源二聚体。因此，在例示性方面中，所述结合构建体是二价的，但对帕多瓦FIX具有单特异性。在例示性方面中，两个Fab微型抗体形成的同源二聚体是通过碱性磷酸酶结构域二聚化。
抗体分子中含有抗原结合或独特型的抗体片段可以通过本领域中已知的技术产生。例如，此类片段包含但不限于，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段；可以通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的Fab'片段；以及可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的两个Fab'片段。
可以使用常规重组DNA技术(参见例如Janeway等人,前述)产生单链可变区片段(sFv)抗体片段，所述sFv抗体片段由包括抗体重链可变(V)结构域通过合成肽连接至抗体轻链V结构域的截短的Fab片段组成。类似地，二硫键稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见例如Reiter等人,《蛋白质工程(Protein Engineering)》,7,697-704(1994))。
重组抗体片段，例如scFv，也可以经过工程改造以组装成对不同靶抗原具有高结合亲合力和特异性的稳定多聚体寡聚物。这类双功能抗体(二聚体)、三功能抗体(三聚体)或四功能抗体(四聚体)是本领域中众所周知的，参见例如Kortt等人,《生物分子工程(Biomol Eng.)》2001,18:95-108,(2001)和Todorovska等人，《免疫学方法杂志(J ImmunolMethods.)》248:47-66,(2001)。
双特异性抗体(bscAb)是包括使用重组方法通过甘氨酸-丝氨酸连接子接合的两个单链Fv片段的分子。在例示性实施方式中，所关注的两个抗体的V轻链(VL)和V重链(VH)结构域是使用标准PCR方法分离。然后，在两步融合PCR中，将从每一杂交瘤获得的VL和VH cDNA接合形成单链片段。双特异性融合蛋白是以类似方式制备。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白是包含在本公开范围内的抗体物质。例示性双特异性抗体的教导参见公开号为2005-0282233A1的美国专利申请和公开号为WO 2005/087812国际专利申请，其均以全文引用的方式并入本文中。
在例示性实施方式中，所述结合构建体是能够结合同一靶抗原分子上两个不同的不重叠表位的双互补位抗体或其双互补位抗原结合片段。通过同时结合至相同的细胞表面靶位，双互补位抗体和其双互补位抗原结合片段可能引起结合亲合力增强，使得仅优先(强)结合至表达靶位的细胞，由此微调抗体选择性。已有资料显示，双互补位抗体或其双互补位抗原结合片段通过同时结合至同一靶分子上的两个不同表位，甚至可能获得亲本抗体(或抗原结合片段)在单独或组合使用时无法实现的新功能。在例示性方面中，本文提供的结合构建体对于帕多瓦FIX是双互补位的。
在例示性实施方式中，所述抗原结合片段被工程改造成双特异性、三特异性或多特异性的。在例示性方面中，所述抗原结合片段包括两个或更多个不同的抗原结合区。在一些方面，所述抗原结合片段是对帕多瓦FIX和至少一种其它抗原具有特异性的双特异性或三特异性抗体。在例示性方面中，所述结合构建体是对帕多瓦FIX的第一个表位和帕多瓦FIX的第二个表位具有特异性的双特异性抗原结合片段。在例示性实施方式中，所述抗原结合片段被工程改造成二价、三价或多价的。在例示性实施方式中，所述结合构建体是对帕多瓦FIX具有单特异性的二价Fab片段。在一些实施方式中，所述抗原结合片段呈单体形式，而在其它实施方式中，所述抗原结合片段偶联至一个或多个抗原结合片段(例如其各自识别第一抗原结合片段的同一表位)。因此，在一些方面，所述抗原结合片段是二聚化的、聚合的、寡聚的或多聚的。在例示性方面中，所述结合构建体是二聚化Fab片段。在例示性方面中，所述结合构建体是完全人二聚化Fab片段。在例示性方面中，所述结合构建体是通过螺旋-转角-螺旋基序二聚化。在例示性实施方式中，所述抗原结合片段被工程改造成二价、三价或多价的。在例示性实施方式中，所述结合构建体是对帕多瓦FIX具有单特异性的二聚化二价Fab片段，其中所述结合构建体通过螺旋-转角-螺旋基序二聚化。
在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括以下氨基酸序列：SSYAIS(SEQ ID NO:6)；GIVPAFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:7)；SWGVISFAY(SEQ ID NO:8)；RASQDISSYLN(SEQ ID NO:9)；AASNLQS(SEQ ID NO:10)；以及MQYDSLPFTF(SEQ ID NO:11)。在例示性方面中，在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:24和25的序列。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:26和27的序列。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列还包括例如连接子、表达标签(例如His标签、FLAG标签、myc标签、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、增强绿色荧光蛋白等))的序列。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括His标签和/或FLAG标签的序列。在例示性方面中，FLAG标签包括SEQ ID NO:12的序列。在例示性方面中，His标签包括SEQ ID NO:13的序列。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括连接子。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括合成双螺旋环螺旋基序，如Haylock等人,《国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)》48(2):461-470(2016)或Wang等人,《分析化学(Anal.Chem.)》78:997-1004(2006)中描述的基序。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括恒定抗体结构域。此类抗体结构域描述于Hu等人,《癌症研究(Cancer Res)》56:3055-3061(1996)和McGregor等人,《分子免疫学(Mol Immuno)》31:219-226(1994)中。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括细菌碱性磷酸酶结构域，如Wang等人(2006),前述中所描述的碱性磷酸酶结构域。在例示性方面中，所述结合构建体，例如抗体或其抗原结合片段，包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28和27的序列。
适体
在一些实施方式中，所述结合构建体是抗体类似物。在一些方面，所述结合构建体是适体。组合科学领域中的最新进展已鉴别出对给定靶位具有高亲和力和特异性的短聚合物序列(例如寡核酸或肽分子)。例如，已使用SELEX技术来鉴别能匹敌哺乳动物抗体的具有结合特性的DNA和RNA适体，免疫学领域已产生并且分离出结合至大量化合物的抗体或抗体片段，并且已经利用噬菌体展示来发现具有极有利结合特性的新肽序列。基于这些分子进化技术的成功，可以确定地产生出结合至任何靶分子的分子。如在以下情况下，环结构通常参与提供所希望的结合属性：适体，其通常利用由无互补碱基配对的短区域所产生的发夹环；和天然来源的抗体，其利用环形高变区的组合布置；以及利用环肽的新噬菌体展示文库，其显示的结果相较于线性肽噬菌体展示结果有所改善。关于适体的更多详情，概述参见Gold,L.,Singer,B.,He,Y.Y.,Brody.E.,“作为治疗剂和诊断剂的适体(Aptamers AsTherapeutic And Diagnostic Agents)”,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》74:5-13(2000)。用于产生适体的相关技术可以见于美国专利第6,699,843号，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
产生抗体或抗原结合片段的方法
制备抗体的适合方法是本领域中已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于下列书目中，例如Harlow和Lane(编),《抗体技术实验指南(Antibodies:ALaboratory Manual)》,CSHPress(1988)，以及CA.Janeway等人(编),《免疫生物学(Immunobiology)》,第5编,Garland Publishing,纽约州纽约(New York,NY)(2001))。
简要地，多克隆抗体是通过用包括本公开多肽的免疫原对动物进行免疫并从该经过免疫的动物收集抗血清来制备。众多动物物种可以用于产生抗血清。在一些方面，用于产生抗-抗血清的动物是非人动物，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、猪或马。由于兔的血量相对较大，故兔是产生多克隆抗体的较佳选择。在用于产生对所选帕多瓦FIX表位具有免疫反应性的多克隆抗血清的例示性方法中，在弗氏完全佐剂(Freund's CompleteAdjuvant)中使50μg帕多瓦FIX抗原乳化，用于对兔进行免疫。间隔例如21天，在弗氏不完全佐剂中使50μg表位乳化，用于追加免疫。在给出一定时间供抗体产生后，可以简单地通过对动物取血并由全血制备血清样品来获得多克隆抗血清。
用于本公开方法中的单克隆抗体可以使用能够在培养物中由连续细胞系产生抗体分子的任何技术制备。这些技术包含但不限于最初由Koehler和Milstein(《自然(Nature)》256:495-497,1975)描述的杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人,《今日免疫学(Immunol Today)》4:72,1983；Cote等人，《美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadSci)》80:2026-2030,1983)；和EBV杂交瘤技术(Cole等人,《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》,Alan R Liss Inc,纽约州纽约,第77-96页,(1985)。
简要地，在例示性实施方式中，为产生单克隆抗体，对小鼠定期注射重组帕多瓦FIX(例如10-20μg在弗氏完全佐剂中乳化)，所述抗体是针对重组帕多瓦FIX而产生。给与小鼠含帕多瓦FIX的PBS进行最终融合前追加免疫，并且在四天后处死小鼠，并取出其脾。将脾放入10ml无血清RPMI 1640中，并且通过在浸没于无血清RPMI 1640中的两个玻璃显微镜载玻片的磨砂端之间研磨脾，形成单细胞悬浮液，所述无血清RPMI 1640补充有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(加拿大(Canada)的Gibco)。通过无菌70目Nitex细胞过滤器(新泽西州派西派尼市(Parsippany,N.J.)的Becton Dickinson)过滤细胞悬浮液，并且通过以200g离心5分钟并将沉淀物再悬浮于20ml无血清RPMI中洗涤两次。以类似方式制备从三只未处理的Balb/c小鼠取得的脾细胞并用作对照。融合前在含11％胎牛血清(FBS)(犹他州洛根(Logan,Utah)的HycloneLaboratories,Inc.)的RPMI中将NS-1骨髓瘤细胞在对数期保持三天，以200g离心5分钟，并洗涤沉淀物两次。
将脾细胞(1×108)与2.0×107个NS-1细胞组合并离心，并且抽吸出上清液。通过轻敲试管移出细胞团，并在搅拌下，经1分钟过程添加1ml的37℃PEG 1500(50％于75mM Hepes中，pH 8.0)(Boehringer Mannheim)，随后经7分钟添加7ml无血清RPMI。再添加8ml RPMI并以200g离心细胞10分钟。丢弃上清液后，将沉淀物再悬浮于200ml含有15％FBS、100μM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷(HAT)(Gibco)、25单位/毫升IL-6(BoehringerMannheim)和1.5×106个脾细胞/毫升的RPMI中，并涂铺于10个Corning平底96孔组织培养板(纽约州康宁(Corning N.Y.)的Corning)中。
在融合后第2、4和6天，从融合板各孔中去除100μl培养基并更换为新鲜培养基。第8天，通过ELISA筛选融合物，测试结合至帕多瓦FIX的小鼠IgG的存在。方法如下：在37℃下，用每孔100ng在25mM Tris(pH 7.5)中稀释的EGFR涂布Immulon 4板(马萨诸塞州剑桥市(Cambridge,Mass.)的Dynatech)，保持2小时。抽吸出涂覆溶液并添加200微升/孔阻断溶液(在CMF-PBS中稀释的0.5％鱼皮明胶(Sigma))，并且在37℃下培育30分钟。用含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤板三次，并添加50μl培养物上清液。在37℃下培育30分钟并如上所述洗涤后，添加50μl以1:3500稀释于PBST中的辣根过氧化酶偶联的山羊抗小鼠IgG(fc)(宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove,Pa.)的JacksonImmunoResearch)。如上所述培育板，用PBST洗涤四次并添加100μl底物，所述底物由含1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml30％H2O2的100mM柠檬酸盐(pH 4.5)组成。5分钟后，添加50μl的15％H2SO4停止颜色反应。在读板仪(Dynatech)上读取A490。
通过稀释于96孔板中将所选融合物孔克隆两次，并在5天后对每孔的集落数进行目测评分。使用Isostrip系统(印第安纳州的印第安纳波利斯(Indianapolis,Ind.)的BoehringerMannheim)对杂交瘤产生的单克隆抗体进行同型化。
当采用杂交瘤技术时，可以使用骨髓瘤细胞系。此类适合用于产生杂交瘤的融合程序中的细胞系优选地不产生抗体，具有高融合效率，并且具有酶缺陷，使其不能在仅支持所希望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。例如，在经过免疫的动物是小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/15XX0Bul；对于大鼠，可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可与细胞融合物结合使用。
取决于宿主物种，可以使用各种佐剂来增加免疫反应。这类佐剂包含但不限于弗氏佐剂；矿物凝胶，如氢氧化铝；和表面活性物质，如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔螺血氰蛋白和二硝基苯酚。卡介苗(bacilli Calmette-Guerin，BCG)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是可能有用的人用佐剂。
作为替代方案，也可以采用本领域中已知的其它方法，如EBV杂交瘤方法(Haskard和Archer,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,74(2),361-67(1984)，和Roderetal.,《酶学方法(Methods Enzymol.)》,121,140-67(1986))，以及噬菌体载体表达系统(参见例如Huse等人,《科学(Science)》,246,1275-81(1989))。另外，在非人动物中产生抗体的方法描述于例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352，以及公开号为2002/0197266Al的美国专利申请中。
如Orlandi等人(《美国国家科学院院刊》86:3833-3837；1989)以及Winter和Milstein C(《自然》349:293-299,1991)中所公开，还可以通过在体内诱导淋巴细胞群产生或通过筛选重组免疫球蛋白文库或高特异性结合试剂组产生抗体。如果已知抗体或抗原结合片段的完整序列，则可以采用制造重组蛋白的方法。参见例如，“蛋白质制造和纯化(Protein production and purification)”,《自然·方法(Nat Methods)》5(2):135-146(2008)。
噬菌体展示也可以用于产生本公开的抗体。就这一点而言，可以使用标准分子生物学和重组DNA技术产生编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库(参见例如，Sambrook等人(编),《分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,纽约(2001))。选出特异性结合至所期望抗原的编码具有所希望特异性的可变区的噬菌体，并且重构完整或部分抗体，使其包括所选可变结构域。将编码重构的抗体的核酸序列引入适合细胞系，如用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞中，使得细胞分泌具有单克隆抗体特征的抗体(参见例如Janeway等人,前述；Huse等人,前述和美国专利6,265,150)。相关方法在美国专利第5,403,484号；美国专利第5,571,698号；美国专利第5,837,500号；美国专利第5,702,892号中也有描述。这些技术描述于美国专利第5,780,279号；美国专利第5,821,047号；美国专利第5,824,520号；美国专利第5,855,885号；美国专利第5,858,657号；美国专利第5,871,907号；美国专利第5,969,108号；美国专利第6,057,098号；以及美国专利第6,225,447号中。
可以由具有特定重链和轻链免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生抗体。此类方法是本领域中已知的并且描述于例如前述的美国专利第5,545,806号和第5,569,825号以及Janeway等人。
用于产生人源化抗体的方法是本领域众所周知的并且详细地描述于例如Janeway等人,前述；美国专利第5,225,539号、第5,585,089号和第5,693,761号；欧洲专利第0239400Bl号；以及英国专利第2188638号中。人源化抗体也可以使用美国专利第5,639,641号和Pedersen等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,235,959-973(1994)中所描述的抗体表面重塑技术产生。优选的嵌合或人源化抗体具有人恒定区，而抗体的可变区或至少一个CDR来源于非人物种。用于使非人抗体人源化的方法是本领域中众所周知的。(参见美国专利第5,585,089号和第5,693,762号。)一般来说，人源化抗体具有一个或多个氨基酸残基引入其来自非人来源的构架区中。人源化可以例如使用Jones等人(《自然》321:522-525,1986)、Riechmann等人(《自然》332:323-327,1988)和Verhoeyen等人(《科学》239:1534-1536,1988)中所描述的方法，通过将啮齿动物互补决定区(CDR)的至少一部分取代成人抗体的相应区域进行。用于制备工程改造的抗体的多种技术描述于例如Owens和Young,《免疫学方法杂志》,168:149-165(1994)中。然后，可以将其它变化引入抗体构架中以调节亲和力或免疫原性。
可以使用为产生“嵌合抗体”而开发的技术，即，将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有适当抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等人,《美国国家科学院院刊》81:6851-6855(1984)；Neuberger等人,《自然》312:604-608(1984)；和Takeda等人,《自然》314:452-454(1985))。或者，所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)可以适当调整以产生EGFR或HSP90特异性单链抗体。
同样，使用本领域中已知的技术分离CDR，产生包括CDR的组合物。互补决定区是以六个多肽环为特征，重链或轻链可变区各三个环。CDR中的氨基酸位置是根据Kabat等人所定义,“免疫相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”,美国卫生与公众服务部(U.S.of Health and Human Services),(1983)(以引用的方式并入本文中)。例如，人抗体的高变区大致限定于重链和轻链可变区的残基28至35、49-59和残基92-103处(Janeway和Travers,《免疫生物学》,第2版,Garland Publishing,纽约(1996))。鼠类CDR也大致在这些氨基酸残基处。在本领域中，应理解，CDR区可以见于上文所阐述的这些预计残基的若干氨基酸内。免疫球蛋白可变区也由包围CDR的四个“构架”区(FR1-4)组成。不同轻链或重链的构架区的序列在一个物种内高度保守，而且也在人与鼠类序列之间保守。
产生包括单克隆抗体重链可变区或轻链可变区的一个、两个和/或三个CDR的组合物。本领域中用于克隆并表达核苷酸和多肽序列的技术已经充分建立(参见例如Sambrook等人,《分子克隆实验指南》,第2版,Cold Spring Harbor,纽约(1989))。将扩增的CDR序列连接至适当表达载体中。包括一、二、三、四、五和/或六个克隆的CDR的载体任选地另外含有连接至CDR的多肽编码区。
鼠类抗体的构架区(FR)通过取代相容的人构架区进行人源化，所述人构架区选自人抗体可变序列的大型数据库，包含超过一千二百个人VH序列和超过一千个VL序列。用于比较的抗体序列的数据库是从Andrew C.R.Martin's KabatMan网页(http://www.rubic.rdg.ac.uk/abs/)下载。用于鉴别CDR的Kabat法提供了描绘来自任何人抗体的大致CDR和构架区并比较与鼠类抗体序列的相似性以确定CDR和FR的手段。最匹配的人VH和VL序列是基于较高的总体构架匹配、类似CDR长度以及经典和VH/VL接触残基的最小错配进行选择。最类似于鼠类序列的人类构架区被插入鼠类CDR之间。或者，可以通过对更接近地类似人类抗体构架区的全部或部分天然构架区进行氨基酸取代来修饰鼠类构架区。
此外，产生用于本公开中的抗体的另一有用技术可以是使用合理设计型方法的技术。合理设计的目标是制造与其相互作用的生物活性多肽或化合物的结构类似物(激动剂、拮抗剂、抑制剂、肽模拟物、结合搭配物等)。在一种方法中，将产生抗体或其表位结合片段的三维结构。这可以通过x射线结晶学、计算机建模或通过两种方法的组合实现。一种替代方法，即“丙氨酸扫描”，涉及用丙氨酸随机置换整个分子内的残基，并确定由此对功能引起的影响。
以化学方式构建的双特异性抗体可以通过用化学试剂如异双官能试剂琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)-丙酸酯(SPDP；伊利诺斯州罗克福德(Rockford,Ill)的PierceChemicals)化学交联异源Fab或F(ab')2片段来制备。Fab和F(ab')2片段可以由完整抗体，通过分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化来获得(Karpovsky等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》160:1686-701(1984)；Titus等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,138:4018-22(1987))。
不管抗体是如何产生的，测试抗体结合至帕多瓦FIX的表位的能力的方法是本领域中已知的并且包括任何抗体-抗原结合分析，例如放射免疫分析(RIA)、ELISA、蛋白质印迹(Western blot)、免疫沉淀、表面等离子体共振和竞争抑制分析(参见例如Janeway等人,下文，和美国专利申请公开第2002/0197266号)。
多肽
本文还提供了包括含SEQ ID NO:6-11中的每一个的氨基酸序列的多肽。所述多肽结合至FIXp并且不结合至WT FIX，例如所述多肽仅结合至FIXp，即使是在WT FIX存在下，任选地，即使是在其它凝血因子例如因子II和因子X的存在下也是如此。在例示性方面中，所述多肽结合至含至少5％、至少10％或至少20％人血浆的样品中的FIXp。在例示性方面中，在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸。在例示性方面中，所述多肽包括SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的序列或SEQ ID NO:24和25的序列。在例示性方面中，所述多肽包括SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的序列或SEQ ID NO:26和27的序列。在例示性方面中，所述多肽的氨基酸序列还包括例如连接子、表达标签(例如His标签、FLAG标签、myc标签、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白等)的序列。在例示性方面中，所述多肽包括His标签和/或FLAG标签的序列。在例示性方面中，FLAG标签包括SEQ ID NO:12的序列。在例示性方面中，His标签包括SEQ ID NO:13的序列。在例示性方面中，所述多肽包括连接子。在例示性方面中，所述多肽包括合成的双螺旋环螺旋基序序列，如Haylock等人,《国际肿瘤学杂志》48(2):461-470(2016)或Wang等人,《分析化学(Anal.Chem.)》78:997-1004(2006)中描述的序列。在例示性方面中，所述多肽包括恒定抗体结构域的序列。此类抗体结构域描述于Hu等人,《癌症研究》56:3055-3061(1996)和McGregor等人,《分子免疫学》31:219-226(1994)中。在例示性方面中，所述多肽包括细菌碱性磷酸酶结构域，如Wang等人(2006),前述中所描述的碱性磷酸酶结构域。在例示性方面中，所述多肽包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:27的序列或SEQID NO:28和27的序列。
偶联物
本文所描述的结合构建体可以例如通过糖基化、酰胺化、羧基化或磷酸化，或通过产生酸加成盐、酰胺、酯(特别是C末端酯)和N-酰基衍生物进行修饰。所述结合构建体还可以通过与其它部分形成共价或非共价复合物(即偶联物)进行修饰以产生衍生物。共价结合的复合物可以通过将化学部分连接至在构成所述结合构建体的氨基酸的侧链上，或在N末端或C末端处的官能团制备。
在一些实施方式中，本公开的结合构建体被附接至、连接至、接合至或偶联至第二部分(例如异源部分)并且由此得到的产物是偶联物。因此，本文提供了包括本文所描述的结合构建体(共价或非共价)连接至异源部分的偶联物。如本文所使用，术语“异源部分”是指不同于本发明的结合构建体的任何分子(化学或生物化学、天然存在或非编码的分子)。例示性异源部分包含但不限于聚合物、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、DNA或RNA、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、治疗剂(例如细胞毒性剂、细胞因子)、诊断剂或检测剂。
在一些实施方式中，用各种异源部分对所述结合构建体进行化学修饰。在一些实施方式中，所述化学修饰赋予另外的如本文所论述的所希望的特征。在一些方面，化学修饰呈许多不同的形式，如异源肽、多糖、脂质、放射性同位素、非标准氨基酸残基和核酸、金属螯合剂以及各种细胞毒性剂。
在一些实施方式中，使所述结合构建体与异源肽融合以赋予各种特性，例如增加溶解性和/或稳定性和/或半衰期、对蛋白水解裂解的抗性、清除率调节、靶向特定细胞或组织类型。在一些实施方式中，所述结合构建体连接至IgG或其它免疫球蛋白的Fc结构域。在一些实施方式中，使所述结合构建体与碱性磷酸酶(AP)融合。用于制备Fc或AP融合构建体的方法见于国际专利公开第WO 02/060950号中。通过将所述结合构建体与具有特定特性(例如半衰期、生物利用率)的蛋白质结构域融合，可赋予本发明的结合构建体这些特性。
所述结合构建体可以偶联至检测剂(例如可检测标记或报告基团)，包含但不限于放射性标记、荧光标记、酶(例如催化热量或荧光反应的酶)、底物、固体基质或载体(例如生物素或抗生物素蛋白)。在例示性方面中，荧光标记包括罗丹明(rhodamine)染料、荧光素染料和/或花青染料。在例示性实施方式中，荧光标记包括一组染料，例如罗丹明染料、TAMRA和荧光素染料FAM。在另一个实施例中，荧光标记包括通过从下组选出两种或更多种染料而形成的一组荧光染料：俄勒冈绿(Oregon Green)488、Flitorescein-EX、异硫氰酸荧光素、罗丹明Red-X、丽丝胺(Lissamine)罗丹明B、钙黄绿素(Calcein)、荧光素、罗丹明、一种或多种BODIPY染料、德克萨斯红(Texas Red)、俄勒冈绿514以及一种或多种Alexa Fhiors。代表性BODIPY染料包括BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPYTMR、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665。代表性Alexa Fluor包括Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790。在例示性方面中，荧光标记包括以下一种或多种：俄勒冈绿488、荧光素-EX、FITC、罗丹明Red-X、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、BODIPYS和德克萨斯红，例如这些公开于《分子探针手册(MolecularProbes Handbook)》,第11版(2010)中。在例示性方面中，可检测标记选自放射性同位素、发色团、荧光团、荧光染料、酶(例如辣根过氧化酶)、连接子分子或者发射可检测信号(例如放射性、荧光、有色信号)或在标记暴露于其底物之后发射可检测信号的其它部分或化合物。多种可检测标记/底物对(例如辣根过氧化酶/二氨基联苯胺、生物素/抗生蛋白链菌素、荧光素酶/荧光素)、用于标记抗体的方法以及使用标记的次级抗体检测抗原的方法是本领域中众所周知的。参见例如Harlow和Lane编辑,(《使用抗体实验指南(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.))。
在一些实施方式中，所述结合构建体在无连接子存在下直接地接合至异源部分。在替代方面中，所述结合构建体通过一个或多个连接子间接地连接至异源部分。无论是直接地接合在一起还是通过连接子间接地接合在一起，所述结合构建体可以通过共价键(例如肽、酯、酰胺或硫氢键)或非共价键(例如通过疏水相互作用、氢键、范德华键(van derWaals bond)、静电或离子相互作用)或其组合连接。本发明的结合构建体和异源部分可以通过本领域中已知的任何手段，包含但不限于通过本发明的任何连接子连接。
本文所描述的结合构建体的特定残基表示异源部分所能附接的例示性位置。例如，Cys、His、Lys和N末端残基、Arg、Tyr、Asp、Glu、Ser、Thr、Pro表示异源部分所能附接的位置。在一些方面，所述残基(或其一部分)在附接异源异源之前，用一种或多种试剂和/或化学试剂活化。
双官能试剂衍生化可用于使所述结合构建体与不溶于水的载体基质交联。此类衍生化还可以提供能够连接结合构建体中的相邻结合元件，或将结合元件连接至异源肽，例如Fc片段的连接子。常用交联剂包含例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯、同型双官能亚氨酸酯，包含二琥珀酰亚胺基酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)；和双官能顺丁烯二酰亚胺，如双-N-顺丁烯二酰亚胺基-1,8-辛烷。衍生化剂如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫基]丙酰亚胺酸酯产生能够在光存在下形成交联的光活化中间物。或者，对于蛋白质固定，采用不溶于水的反应性基质如溴化氰活化的碳水化合物以及以引用的方式并入本文中的美国专利第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号和第4,330,440号中描述的反应性底物。
一般而言，化学衍生化可以在任何适合于使蛋白质与异源部分反应的条件下进行，所述异源部分是例如活化的聚合物分子。用于制备多肽的化学衍生物的方法一般将包括以下步骤：(a)使所述结合构建体与异源部分，例如活化的聚合物分子(如聚合物分子的反应性酯或醛衍生物)在使所述结合构建体附接至一个或多个聚合物分子的条件下反应，和(b)获得反应产物。理想的反应条件将基于已知参数和所希望的结果确定。例如，聚合物分子:蛋白质的比率越大，则附接的聚合物分子的量越大。在一些实施方式中，所述化合物可以在氨基末端处具有单一聚合物分子部分。(参见例如美国专利第5,234,784号)。
相较于未衍生化的分子，本文所公开的衍生化结合构建体可以具有另外的活性，即增强或减弱的生物活性，或其它特征，如增加或缩短的半衰期。
偶联物:Fc融合物
对于可取代部分，如人IgG的Fc区，融合可以是与本发明的结合构建体直接融合或通过插入序列融合。例如，人IgG铰链、CH2和CH3区可以在结合构建体的N末端或C末端处融合以附接Fc区。由此得到的Fc-融合构建体能够通过蛋白质A亲和柱(伊利诺斯州罗克福德的Pierce)纯化。与Fc区融合的肽和蛋白质在体内展现的半衰期可以大体上大于未融合的对应物。与Fc区融合能够使融合多肽二聚化/多聚化。Fc区可以是天然存在的Fc区，或为获得优良特征而经过修饰的Fc区，所述特性例如治疗或诊断质量、循环时间、减少聚集。如上所述，在一些实施方式中，所述结合构建体与免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)偶联，例如融合。已知的免疫球蛋白(Ig)类型包含IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C末端区域，其负责与Fc受体结合以实现如再循环(使半衰期延长)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)之类活性。
例如，根据一些定义，人IgG重链Fc区从重链的Cys226延伸至C末端。“铰链区”一般从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(通过对准半胱胺酸键结所涉及的半胱胺酸，可以比对其它IgG同型的铰链区与IgG1序列)。IgG的Fc区包含两个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至447。提到的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，或区域的氨基酸编号都是基于Kabat等人,1991,《免疫相关蛋白质的序列》,马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md)的美国公共卫生部(U.S.Department of Public Health)。在相关实施方式中，Fc区可以包括除CH1以外的一个或多个来自免疫球蛋白重链的天然或修饰过的恒定区，例如IgG和IgA的CH2和CH3区，或IgE的CH3和CH4区。
适合的异源部分包含免疫球蛋白序列中包含FcRn结合位点的部分。救助受体FcRn负责使免疫球蛋白再循环并且使其返回到血液循环中。已基于X射线结晶学描述IgG Fc部分中结合至FcRn受体的区域(Burmeister等人,1994,《自然》,372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2结构域与CH3结构域的接合处。Fc-FcRn接触都在单一Ig重链内。主要接触位点包含CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314，以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
可以对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这些可变Fc区包括在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中的至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)中的至少一个氨基酸修饰。被认为会增加对FcRn的亲和力的突变包含T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人,2001,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276:6591)。其它突变可以减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合，而不会明显降低对FcRn的亲和力。例如，Fc区297位的Asn被Ala或另一氨基酸取代将去除高度保守的N-糖基化位点并且可以降低Fc区的免疫原性，同时延长其半衰期，并减少与FcγR的结合(Routledge等人,1995,《移植(Transplantation)》60:847；Friend等人,1999,《移植》68:1632；Shields等人,1995,《生物化学杂志》276:6591)。在IgG1的位置233-236处进行氨基酸修饰可减少与FcγR的结合(Ward和Ghetie,1995,《治疗免疫学(Therapeutic Immunology)》2:77；和Armour等人,1999,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》29:2613)。一些例示性氨基酸取代描述于美国专利7,355,008和7,381,408中，这些专利各自以全文引用的方式并入本文中。
异源部分：聚合物、碳水化合物和脂质
在例示性实施方式中，所述异源部分是聚合物。所述聚合物可以是分支或不分支的。所述聚合物可以具有任何分子量。在一些实施方式中，所述聚合物具有在约2kDa至约100kDa之间的平均分子量(术语“约”指示在制备水溶性聚合物时，一些分子将高于、低于所规定的分子量)。在一些方面，所述聚合物的平均分子量在约5kDa与约50kDa之间、在约12kDa至约40kDa之间或在约20kDa至约35kDa之间。
在一些实施方式中，所述聚合物被修饰成具有单个反应性基团，如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，由此可以控制聚合度。在一些实施方式中，所述聚合物是水溶性的，使得其所附接的蛋白质不会在水性环境，如生理环境中沉淀。在一些实施方式中，当例如将组合物用于治疗用途时，所述聚合物是药学上可接受的。此外，在一些方面，所述聚合物是是聚合物混合物，例如共聚物、嵌段共聚物。
在一些实施方式中，所述聚合物选自下组：聚酰胺；聚碳酸酯；聚亚烷基(polyalkylene)和其衍生物，包含聚烷二醇、聚氧化烯、聚对苯二甲酸烷二酯；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包含聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)及聚(丙烯酸十八烷酯)；聚乙烯基聚合物，包含聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮；聚乙交酯；聚硅氧烷；聚氨基甲酸酯和其共聚物；纤维素，包含烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素及硫酸纤维素钠盐；聚丙烯；聚乙烯，包含聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)和聚(对苯二甲酸乙二酯)；以及聚苯乙烯。
在一些方面，所述聚合物是可生物降解聚合物，包含合成可生物降解聚合物(例如乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(原)酸酯、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯))，以及天然可生物降解聚合物(例如藻酸盐和其它多糖，包含葡聚糖和纤维素，胶原蛋白、其化学衍生物(取代、添加例如烷基、亚烷基等化学基团、羟基化、氧化以及本领域的技术人员通常进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水性蛋白质(例如玉米蛋白(zein)以及其它醇溶谷蛋白(prolamine)和疏水性蛋白质))，以及其任何共聚物或混合物。一般来说，这些材料在体内通过酶水解或暴露于水、通过表面或整体侵蚀而降解。
在一些方面，所述聚合物是生物粘附聚合物，如H.S.Sawhney,C.P.Pathak和J.A.Hubbell于《大分子(Macromolecules)》,1993,26,581-587(其教示内容并入本文中)中所描述的可生物蚀解水凝胶、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白(glutin)、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)及聚(丙烯酸十八烷酯)。
在一些实施方式中，聚合物是水溶性聚合物或亲水性聚合物。适合水溶性聚合物是本领域中已知的并且包含例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/丁烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟基烷酯、甲基丙烯酸羟基甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、顺丁烯二酸酐/甲基乙烯醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯醚-共-顺丁烯二酸酐、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧基乙二醇、聚氧化乙烯，以及其衍生物、盐和组合。在一些方面，水溶性聚合物或其混合物包含但不限于，N连接或O连接的碳水化合物、糖、磷酸酯、碳水化合物；糖；磷酸酯；聚乙二醇(PEG)(包含用于使蛋白质衍生化的PEG形式，包含单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇)；单甲氧基聚乙二醇；葡聚糖(如例如约6kD的低分子量葡聚糖)、纤维素；纤维素；其它碳水化合物类聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。本发明还涵盖可以用于制备共价附接的多聚体的双官能交联分子。
本文中使用的特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。如本文所使用，聚乙二醇意图涵盖可以用于使其它蛋白质衍生化的PEG形式中的任一种，如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇。PEG是线性或分枝的中性聚醚，以广泛范围的分子量获得，并且可溶于水和大多数有机溶剂中。当存在于水中时，PEG主要通过其高动态链运动性和疏水性有效地排除其它聚合物或肽，由此在附接至其它蛋白质或聚合物表面时产生水壳或水合球面。PEG是无毒、非免疫原性的，并且被食品和药物管理局(Food and DrugAdministration)批准用于内部消费。
用于制备聚乙二醇化的化合物的方法可以包括以下步骤：(a)使所述化合物与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使得所述化合物附接至一个或多个PEG基团的条件下反应，和(b)获得反应产物。一般来说，酰化反应的理想反应条件将基于已知参数和所期望的结果来确定。例如，PEG:蛋白质的比率越大，多聚乙二醇化产物的百分含量越大。在一些实施方式中，所述结合构建体将在N末端具有单一PEG部分。参见美国专利第8,234,784号，以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，所述异源部分是碳水化合物。在一些实施方式中，碳水化合物是单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、双糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉籽糖、水苏糖)、多糖(例如淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、几丁质、愈创葡聚糖(callose)、昆布糖(laminarin)、木聚糖、甘露聚糖、褐藻糖胶、半乳甘露聚糖)。
在一些实施方式中，所述异源部分是脂质。在一些实施方式中，脂质是脂肪酸、类二十烷酸(eicosanoid)、前列腺素、白三烯、血栓素、N-酰基乙醇胺、甘油脂质(例如单取代的甘油、双取代的甘油、三取代的甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、神经鞘脂(例如神经鞘胺醇、神经酰胺)、固醇脂质(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂质(prenol lipid)、糖脂或聚酮化合物(polyketide)、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
异源部分：治疗剂
在一些实施方式中，所述异源部分是治疗剂。所述治疗剂可以是本领域中已知的治疗剂中的任一种。本文所涵盖的治疗剂的实例包含但不限于天然酶、源自于天然来源的蛋白质、重组蛋白、天然肽、合成肽、环肽、抗体、受体激动剂、细胞毒性剂、免疫球蛋白、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、冠状动脉血管扩张剂、强心甙、抗心律失常药、心脏拟交感神经药、血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂、利尿剂、强心剂、胆固醇和甘油三酯降低剂、胆酸螯合剂、贝特类药(fibrates)、3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)辅酶A还原酶抑制剂、烟酸衍生物、抗肾上腺素能药、α-肾上腺素能阻断剂、中枢作用的抗肾上腺素能剂、血管扩张剂、保钾剂、噻嗪类药(thiazides)和相关药剂、血管紧张素II受体拮抗剂、外周血管扩张剂、抗雄激素、雌激素、抗生素、类视黄素、胰岛素和类似物、α-葡糖苷酶抑制剂、双胍、美格替耐(meglitinides)、磺酰脲(sulfonylureas)、噻唑烷二酮类、雄激素、孕激素、骨代谢调控剂、垂体前叶激素、下丘脑激素、脑垂体后叶激素、促性腺激素、促性腺激素释放激素拮抗剂、促排卵药、选择性雌激素受体调节剂、抗甲状腺剂、甲状腺激素、大便成形剂(bulk formingagent)、轻泻剂、抗蠕动药、菌群调节剂、肠道吸附剂、肠道抗感染药、抗厌食药、抗营养不良药(anticachexic)、抗贪食症药(antibulimics)、食欲抑制剂、抗肥胖剂、解酸剂、上消化道剂、抗胆碱能剂、氨基水杨酸衍生物、生物反应调节剂、皮质类固醇、镇痉剂、5-HT4部分激动剂、抗组胺剂、大麻素、多巴胺拮抗剂、血清素拮抗剂、细胞保护剂、组胺H2受体拮抗剂、黏膜保护剂、质子泵抑制剂、幽门螺杆菌(H.pylori)根除疗法、红细胞生成刺激剂、造血剂、贫血剂、肝素、抗纤维蛋白溶解药、止血药、凝血因子、腺苷二磷酸抑制剂、糖蛋白受体抑制剂、血纤维蛋白原-血小板结合抑制剂、血栓素-A2抑制剂、纤维蛋白溶酶原活化剂、抗血栓形成剂、糖皮质激素、盐皮质激素、皮质类固醇、选择性免疫抑制剂、抗真菌剂、预防疗法中所涉及的药物、AIDS相关感染、巨细胞病毒、非核苷逆转录酶抑制剂、核苷类似物逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、贫血、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类(lincosamides)、大环内酯类、噁唑烷酮类、青霉素类、链阳霉素类(streptogramins)、磺酰胺类、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)和衍生物、四环素类、驱虫剂、抗阿米巴药(amebicides)、双胍类、金鸡纳生物碱(cinchona alkaloid)、叶酸拮抗剂、喹啉衍生物、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)疗法、酰肼类、咪唑类、三唑类、硝基咪唑类、环胺类、神经氨酸酶抑制剂、核苷类、磷酸盐结合剂、胆碱酯酶抑制剂、辅助疗法、巴比妥酸盐和衍生物、苯并二氮杂卓类、γ氨基丁酸衍生物、乙内酰脲衍生物、亚氨基芪衍生物、琥珀酰亚胺衍生物、抗惊厥剂、麦角类生物碱、抗偏头痛制剂、生物反应调节剂、氨基甲酸酯、三环衍生物、去极化剂、非去极化剂、神经肌肉麻醉剂、CNS刺激剂、多巴胺能试剂、单胺氧化酶抑制剂、COMT抑制剂、烷基磺酸酯类、乙烯亚胺类、咪唑四嗪类、氮芥类似物、亚硝基脲、含铂化合物、抗代谢物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、脲衍生物、蒽环类药、放线菌素、喜树碱衍生物、表鬼臼毒素、紫杉烷、长春花生物碱和类似物、抗雄激素、抗雌激素、非类固醇芳香酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂抗肿瘤药、氮杂螺癸二酮衍生物、抗焦虑剂、刺激剂、单胺再吸收抑制剂、选择性血清素再吸收抑制剂、抗抑郁剂、苯并异噁唑衍生物、丁酰苯衍生物、二苯并二氮杂卓衍生物、二苯并硫氮杂卓衍生物、二苯基丁基哌啶衍生物、吩噻嗪、噻吩并苯并二氮杂卓衍生物、噻吨(thioxanthene)衍生物、过敏原提取物(allergenic extracts)、非类固醇剂、白三烯受体拮抗剂、黄嘌呤、内皮素受体拮抗剂、前列腺素、肺部表面活性剂、黏液溶解剂、抗有丝分裂剂、排尿酸剂、黄嘌呤氧化酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、六亚甲基四胺盐(methenamine salts)、硝基呋喃衍生物、喹诺酮类、平滑肌松弛剂、副交感神经拟似药、卤代烃、氨基苯甲酸酯、酰胺(例如利多卡因(lidocaine)、盐酸阿替卡因(articainehydrochloride)、盐酸布比卡因(bupivacaine hydrochloride))、退热剂、安眠药和镇静剂、环吡咯酮类、吡唑并嘧啶类、非类固醇消炎药、阿片类药物、对氨基苯酚衍生物、醇脱氢酶抑制剂、肝素拮抗剂、吸附剂、催吐剂、阿片类拮抗剂、胆碱酯酶再活化剂、烟碱替代疗法、维生素A类似物和拮抗剂、维生素B类似物和拮抗剂、维生素C类似物和拮抗剂、维生素D类似物和拮抗剂、维生素E类似物和拮抗剂、维生素K类似物和拮抗剂。
偶联物：检测剂
在例示性实施方式中，所述结合构建体偶联至检测剂。在例示性实施方式中，所述检测剂能够基于酶活性、放射性、显色活性和/或结合活性发出可检测(可测量)的信号。在例示性实施方式中，所述信号是放射性、显色、比色、荧光、化学发光、增强的化学发光、直接荧光、时间分辨荧光、直接化学发光、磷光、酶或基于微米粒子或纳米粒子、抗生蛋白链菌素/抗生物素蛋白-生物素与蛋白质A的结合的信号。在例示性实施方式中，所述检测剂包括酶、放射性同位素、DNA报告基因、显色或荧光报告子，或电化学发光标签。在例示性方面中，所述酶是辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。在例示性方面中，所述酶当暴露于某些试剂时会引起化学发光或光产生。在例示性方面中，所述放射性同位素是I125。在例示性方面中，所述DNA报告基因是DNA探针。在例示性方面中，所述荧光报告子是藻红蛋白(PE)，例如B-PE、R-PE，或别藻蓝蛋白(APC)。
偶联物：二聚体和多聚体
在一些实施方式中，提供的结合构建体呈二聚体或多聚体形式，其中本发明所述的一种或多种结合构建体连接在一起。在一些方面，所述二聚体是包括相同类型(例如相同结构)的两个结合构建体连接在一起的同源二聚体。在替代方面中，二聚体是包括两个本发明的结合构建体的异源二聚体，其中这两个结合构建体的结构彼此不同。在一些方面，多聚体是包括超过一种本发明的结合构建体的同源多聚体并且每个结合构建体属于相同类型(例如相同结构)。在替代方面中，多聚体是包括超过一种本发明的结合构建体的异源多聚体并且其中所述异源多聚体中至少两个结合构建体的结构彼此不同。在例示性方面中，所述结合构建体包括两个Fab片段的二聚体，例如同源二聚体，其中每个Fab片段结合至FIXp并且不结合至WT FIX，例如结合至FIXp，即使是在WT FIX存在下或在含人血浆的样品中。在例示性方面中，包括两个Fab片段的同源二聚体是二价的，对于FIXp来说又是单特异性的。在例示性方面中，所述同源二聚体中的每个Fab片段包括SEQ ID NO:6-11的氨基酸序列。在例示性方面中，在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸。在例示性方面中，所述同源二聚体中的每个Fab片段包括SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:24和25的序列。在例示性方面中，所述同源二聚体中的每个Fab片段包括SEQ ID NO:26或SEQID NO:27或SEQ ID NO:26和27的序列。
两个或更多个结合构建体可以使用本领域技术人员已知的标准连接剂和程序连接在一起。在某些实施例中，连接两个(或更多个)结合构建体的连接子是本领域中已知的连接子。在一些实施方式中，连接子是二硫键。例如，所述二聚体中的每个单体可以包括巯基并且每个单体中的巯基硫原子参与二硫键的形成。在一些实施方式中，连接子是螺旋-转角-螺旋基序。在例示性方面中，二聚体中的每个单体是通过螺旋-转角-螺旋基序连接。在例示性方面中，所述二聚体中的每个单体是通过碱性磷酸酶结构域连接。
在例示性方面中，包括两个Fab片段的同源二聚体包括连接该两个Fab片段的连接子。在例示性方面中，所述同源二聚体包括合成双螺旋环螺旋基序，如Haylock等人,《国际肿瘤学杂志》48(2):461-470(2016)或Wang等人,《分析化学》78:997-1004(2006)中描述的基序。在例示性方面中，所述同源二聚体包括恒定抗体结构域。此类抗体结构域描述于Hu等人,《癌症研究》56:3055-3061(1996)和McGregor等人,《分子免疫学》31:219-226(1994)中。在例示性方面中，所述同源二聚体包括细菌碱性磷酸酶结构域，如Wang等人(2006),前述中所描述的碱性磷酸酶结构域。在例示性方面中，所述同源二聚体包括SEQ ID NO:28或SEQID NO:27或SEQ ID NO:28和27的序列。
核酸
本文还提供了核酸，所述核酸包括编码本文所描述的结合构建体(例如抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物)中的任一个的核苷酸序列。本文所使用的“核酸”包含“聚核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且一般意思指DNA或RNA的聚合物，所述DNA或RNA可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(例如分离和/或纯化)的，可以含有天然、非天然或改变的核苷酸，并且可以含有天然、非天然或改变的核苷酸间键联，如氨基磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联，代替在未修饰的寡核苷酸中各核苷酸之间的磷酸二酯。一般优选的是，核酸不包括任何插入、缺失、倒置和/或取代。然而，在一些情况下，如本文所论述，核酸包括一个或多个插入、缺失、倒置和/或取代可能是适合的。
优选地，本发明的核酸是重组核酸。本文所使用的术语“重组”是指(i)在活细胞外部通过将天然或合成核酸区段接合至能够在活细胞中复制的核酸分子而构建的分子，或(ii)由以上(i)中所描述的分子复制得到的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
核酸可以基于本领域中已知的程序进行化学合成和/或酶连接反应构建。参见例如前述Sambrook等人,和前述Ausubel等人。例如，可以使用天然存在的核苷酸或不同地修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)，以化学方式合成核酸，所述不同地修饰的核苷酸被设计用于增加分子的生物稳定性或增加杂交时所形成的双链体的物理稳定性。可以用于产生核酸的经过修饰的核苷酸的实例包含但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。或者，一个或多个本公开的核酸可以购自如MacromolecularResources(科罗拉多州柯林斯堡(Fort Collins,CO))和Synthegen(德克萨斯州休斯顿(Houston,TX))等公司。
在一些方面，所述核酸仅编码抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物的一部分。例如，当偶联物包括不含氨基酸且因此不是核酸所编码的聚合物时，所述核酸仅编码偶联物中可以由核酸编码的部分。在例示性实施方式中，所述核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包括含SEQ ID NO:6-11中的每一个的氨基酸序列的多肽。在例示性方面中，所述核酸编码包括含SEQ ID NO:6-11中的每一个的氨基酸序列的多肽，其中在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸。在例示性方面中，所述核酸编码的多肽还包括表达标签，例如含DYKDDDDK(SEQ ID NO:12)的FLAG标签和/或含HHHHHH(SEQ ID NO:13)的六聚组氨酸标签。
所述核酸可用于例如重组制造本发明的结合构建体的方法中。
重组表达载体
本发明的核酸可以被并入重组表达载体或“载体”中。就这一点而言，本发明提供了包括本发明核酸中的任一种的重组表达载体或“载体”。出于本文的目的，术语“重组表达载体”或“载体”意思指基因修饰的寡核苷酸或聚核苷酸构建体，当所述构建体包括编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且所述载体在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下与宿主细胞接触时，所述构建体使得由宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本发明的载体作为一个整体不是天然存在的。不过，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包括任何类型的核苷酸，包含但不限于DNA和RNA，所述DNA和RNA可以是单链或双链的、合成或部分地从天然来源中获得的，并且可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包括天然存在或非天然存在的核苷酸间键联，或这两种类型的键联。优选地，改变的核苷酸或非天然存在的核苷酸间键联不妨碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可以是任何适合的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何适合的宿主。适合的载体包括被设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自下组：pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(加利福尼亚州拉荷亚(LaJolla,CA)的Stratagene)、pET系列(威斯康星州麦迪逊(Madison,WI)的Novagen)、pGEX系列(瑞典乌普萨拉(Uppsala,Sweden)的PharmaciaBiotech)和pEX系列(加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto)的Clontech)。还可以使用噬菌体载体，如λGTIO、λGTl 1、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNMl 149。植物表达载体的实例包含pBIOl、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包含pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如反转录病毒载体。
本发明的重组表达载体可以使用例如前述Sambrook等人,和前述Ausubel等人中描述的标准重组DNA技术制备。呈环形或线性的表达载体构建体可以被制备成含有在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以来源于例如CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
理想地，所述重组表达载体包括对欲引入的宿主类型(例如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性的调控序列，如转录与翻译起始和终止密码子，并且适当时考虑载体是基于DNA还是RNA。
所述重组表达载体可以包括天然或标准化启动子可操作地连接至编码多肽(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列，或可操作地连接至与编码多肽的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性，在从业者的普通技能以内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在从业者的技能内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠类干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
本发明的重组表达载体可以被设计用于短暂表达、稳定表达或这两种。同样，重组表达载体可以被制备用于组成型表达或诱导型表达。此外，重组表达载体可以被制备成包含自杀基因。
宿主细胞
本发明还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包括本文所描述的核酸或重组表达载体中的任一个。本文所使用的术语“宿主细胞”是指可以含有并且表达本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。所述宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类细胞，或可以是原核细胞，例如细菌或原虫细胞。所述宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即从生物体，例如人直接分离的细胞。所述宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮的细胞，即悬浮生长的细胞。适合的宿主细胞是本领域中已知的并且包括例如DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，所述宿主细胞优选是原核细胞，例如DH5α细胞。出于产生重组多肽的目的，所述宿主细胞优选是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
试剂盒
本文提供了包括本公开的结合构建体中的任一种或多种的试剂盒。在例示性实施方式中，所述试剂盒包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物或核酸或载体或宿主细胞，或任何前述的组合。在例示性方面中，所述结合构建体是以预定量或浓度提供于试剂盒中。例如，试剂盒可以是用于检测样品中的帕多瓦FIX的检测试剂盒，其包括预定量的结合构建体。在例示性实施方式中，本公开的结合构建体中的一个或多个是以水溶液形式提供于试剂盒中。在例示性方面中，所述水溶液是在干冰上被提供给终端用户。在一些方面，所述水溶液与试剂盒中的其它组分是分开地提供给终端用户。在例示性实施方式中，本公开的结合构建体是以冻干或其它冷冻干燥形式提供于试剂盒中。在例示性方面中，本公开的结合构建体是以冷冻或低温保存形式提供于试剂盒中。在例示性方面中，提供于试剂盒中的所述抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的浓度是约1-10μg/mL或约1-5μg/mL。在例示性方面中，提供于试剂盒中的所述抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的浓度是约1.5μg/mL至约2.0μg/mL。
在例示性方面中，所述试剂盒包括固体载体，并且在例示性方面中，所述抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物被预先涂覆于所述固体载体上。在例示性方面中，所述试剂盒包括选自下组的固体载体：管、盘、烧瓶、袋子、板(例如微量滴定板)、膜、过滤器、珠粒、纤维、探针等。在例示性方面中，所述固体载体是由聚合物制造。在例示性方面中，所述固体载体是由琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶或受控微孔玻璃制造。在例示性方面中，所述固体载体是由琼脂糖制造。在例示性方面中，所述固体载体是由聚二氟乙烯(PVDF)、硝化纤维素、尼龙66、protran硝化纤维素或纸制造。在例示性方面中，膜是、、、、或膜(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO)的Sigma-Aldrich)之一。在例示性方面中，所述固体载体是聚合物珠粒、微量滴定板、膜或过滤器。在例示性方面中，所述试剂盒包括用含100ng或更多、约150ng或更多、约200ng或更多、约500ng或更多的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的溶液预先涂覆的固体载体。在某些方面，所述试剂盒包括用含约50ng至约550ng、约100ng至约500ng、约125ng至约400ng、约150ng至约350ng、约175ng至约300ng或约200ng至约250ng的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的溶液预先涂覆的固体载体。在某些方面，所述试剂盒包括用含约100ng至约150ng、约150ng至约200ng、约200ng至约500ng的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的溶液预先涂覆的固体载体。在例示性方面中，所述试剂盒包括含预先等分的量的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的固体载体。在例示性方面中，所述试剂盒包括微量滴定板，其中微量滴定板的每个孔包括溶液，所述溶液包括约100μL至约500μL的含约1-10μg/mL或约1-5μg/mL抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的溶液。在例示性方面中，所述试剂盒包括微量滴定板，其中微量滴定板的每个孔包括溶液，所述溶液包括约100μL至约500μL的含约2.5μg/mL抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物的溶液。
在例示性方面中，所述试剂盒包括本文所描述的检测方法中使用的另外的试剂、底物、溶剂、缓冲剂、稀释剂等。在例示性方面中，所述另外的组分中的任一种或多种是以预定量，例如检测分析必需和适合的量提供于试剂盒中。在例示性方面中，所述试剂盒包括结合至帕多瓦FIX结合抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物的次级抗体。在例示性方面中，所述次级抗体包括检测剂。在例示性实施方式中，所述检测剂包括酶、放射性同位素、DNA报告基因、显色或荧光报告子，或电化学发光标签。所述检测剂可以是本文所描述的检测剂中的任一种。在例示性方面中，所述帕多瓦FIX结合抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物的次级抗体附接至检测剂。
组合物
本文提供了包括本公开的结合构建体中的任一种或多种的组合物。在例示性方面中，所述组合物包括如本文所描述的结合构建体与检测剂的混合物。在例示性方面中，所述检测剂是本文所描述的任何检测剂。参见题为“偶联物：检测剂”的章节。
在例示性方面中，所述组合物包括如本文所描述的结合构建体与从受试者获得的生物样品的混合物。在例示性方面中，生物样品是本文所描述的任何生物样品。参见题为“样品”的章节。在例示性方面中，所述组合物包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物与包括人血浆或其稀释级分的生物样品的混合物。在例示性方面中，所述组合物包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物与包括人组织或其细胞的生物样品的混合物。在例示性方面中，生物样品包括肝脏组织。在例示性方面中，所述组合物还包括检测剂。
本文还提供了包括本公开的结合构建体中的任一种或多种的组合物与包括人血浆蛋白质的样品(例如生物样品)的混合物。在例示性方面中，所述组合物包括如本文所描述的抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物与至少一种人血浆蛋白质的混合物，所述人血浆蛋白质选自下组：因子IX、因子II和因子X，及其变体。在例示性方面中，所述组合物还包括检测剂。
检测方法
本文所提供的结合构建体可用于例如能够明确且特异性地检测样品中帕多瓦FIX的检测方法中，所述样品是例如临床样品，所述临床样品中包含例如帕多瓦FIX和WT FIX。所述结合构建体可以用于任何基于抗体的分析或技术或本领域中已知的任何免疫分析中，例如但不限于放射免疫分析(RIA)、磁性免疫分析(MIA)、免疫细胞化学(ICC)分析、免疫组织化学(IHC)分析、免疫荧光分析、ELISA、EIA、ELISPOT、酶放大免疫分析、放射结合分析、蛋白质印迹法、免疫沉淀、点印迹法、流式细胞术、实时免疫定量PCR、蛋白质微阵列等。参见例如《免疫分析手册(The Immunoassay Handbook)》(第四版)；配体结合、ELISA和相关技术的理论和应用(Theory and Applications of Ligand Binding,ELISAand RelatedTechniques),Wild,Elsevier Ltd.编(英国牛津(Oxford,UK))2013；Green和Sambrook,《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第4版,ColdSpringHarbor Laboratory Press(纽约州冷泉港)2012；和《免疫分析(Immunoassay)》,Diamandis和Christopolous,Academic Press,1996。
因此，本文提供了本文所描述的结合构建体(例如抗体或抗原结合片段、多肽或偶联物)、核酸、载体、宿主细胞和/或试剂盒的用途，其用于检测样品中的帕多瓦因子IX。在例示性方面中，所述样品是从受试者获得的生物样品，所述受试者已被施用含编码帕多瓦FIX的核酸的表达载体。例如，在各种实施例中，受试者罹患出血性疾病并且正经历因子IX替代疗法，所述疗法任选地通过含编码异源帕多瓦因子IX的核苷酸序列的核酸的表达实现。
本文还提供了检测从受试者获得的样品中的帕多瓦因子IX的方法。在例示性实施方式中，所述方法包括(i)使样品与如本文所描述的结合构建体(例如抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物)接触以形成包括帕多瓦FIX和结合构建体(例如抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物)的复合物(例如免疫复合物)，和(ii)检测所述复合物。
在例示性实施方式中，帕多瓦FIX包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。
在例示性实施方式中，检测所述复合物包括对检测剂的信号进行检测。在例示性实施方式中，所述信号是基于酶活性、放射性、显色活性和/或结合活性。在例示性实施方式中，所述信号是放射性、显色、比色、荧光、化学发光、增强的化学发光、直接荧光、时间分辨荧光、直接化学发光、磷光、酶或基于微米粒子或纳米粒子、抗生蛋白链菌素/抗生物素蛋白-生物素与蛋白质A的结合的信号。在例示性实施方式中，所述检测剂包括酶、放射性同位素、DNA报告基因、显色或荧光报告子、电化学发光标签。在例示性实施方式中，检测所述复合物包括进行表面等离子体共振以检测所述复合物或测量电极上电阻的变化(因为帕多瓦FIX结合至抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物)。参见González-Díaz等人,“具有增强的磁光活性的等离子体Au/Co/Au纳米夹心(Plasmonic Au/Co/Au nanosandwiches withEnhanced Magneto-Optical Activity)”Small 4(2):202-5(2008)；和Tsekenis(2008).“基于ac阻抗方案的针对髓磷脂碱性蛋白的非标记免疫传感器分析(Label-lessimmunosensor assay for myelin basic protein based upon an ac impedanceprotocol.”,《分析化学(Analytical Chemistry)》80(6):2058-62(2008)。在例示性方面中，所述酶是辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。在例示性方面中，所述酶暴露于使其化学发光或产生光的试剂。在例示性方面中，所述放射性同位素是I125。在例示性方面中，所述DNA报告基因是DNA探针。参见例如Rajkovic,“用于检测和定量食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫定量实时PCR(Immunoquantitative real-time PCR for detection and quantification of Staphylococcus aureusenterotoxin B in foods.)”,《应用与环境微生物学(Applied and EnvironmentalMicrobiology)》72(10):6593-9(2006)；以及Gofflot,“用于检测和定量朊病毒蛋白质的免疫定量聚合酶链反应(Immuno-quantitative polymerase chain reaction fordetection and quantitation of prion protein.)”,《免疫分析与免疫化学杂志(Journal of Immunoassay and Immunochemistry)》25(3):241-58(2004)。在例示性方面中，所述荧光报告子是藻红蛋白(PE)，例如B-PE、R-PE，或别藻蓝蛋白(APC)。
在例示性实施方式中，所述抗体或抗原结合片段或多肽被偶联至检测剂。在例示性实施方式中，所述偶联物包括检测剂。在例示性实施方式中，所述抗体或抗原结合片段或多肽未偶联至检测剂，或所述偶联物不包括检测剂。在此类例示性实施方式中，所述方法包括使样品与含检测剂的次级抗体接触，其中所述次级抗体结合至所述抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物。所述次级抗体可以是任何同型或种类的任何抗体，只要所述次级抗体将结合至抗帕多瓦FIX抗体、其抗原结合片段、多肽或偶联物。
在例示性实施方式中，所述抗体或抗原结合片段或多肽被偶联至固体载体。在例示性实施方式中，所述偶联物包括固体载体。例如，所述固体载体选自下组：管、盘、烧瓶、袋子、板(例如微量滴定板)、膜、过滤器、珠粒、纤维、探针等。在例示性方面中，所述固体载体是由聚合物制造。在例示性方面中，所述固体载体是由琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶或受控微孔玻璃制造。在例示性方面中，所述固体载体是由琼脂糖制造。在例示性方面中，所述固体载体是由聚二氟乙烯(PVDF)、硝化纤维素、尼龙66、protran硝化纤维素或纸制造。在例示性方面中，所述膜是、、、、或膜(密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich)之一。在例示性方面中，所述固体载体是聚合物珠粒、磁性或顺磁性珠粒、微量滴定板、膜或过滤器。
受试者
在例示性实施方式中，本文中提到的受试者是哺乳动物，包含但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，如小鼠和仓鼠；和兔形目(Lagomorpha)的哺乳动物，如兔；来自食肉目(Carnivora)的哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)；来自偶蹄目(Artiodactyla)的哺乳动物，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目(Perissodactyla)的哺乳动物，包括马科动物(马)。在一些方面，哺乳动物属于灵长目(Primate)、类猴目(Ceboids)或类猿目(Simioids)(猴)或属于类人猿目(Anthropoids)(人和猿)。在例示性方面中，哺乳动物是人类。在例示性方面中，人类受试者是成年人，例如18岁或更大年龄，或是青少年。在例示性方面中，受试者已被施用表达载体，所述表达载体包括编码含氨基酸序列SEQ ID NO:1的帕多瓦FIX的核苷酸序列。在例示性方面中，所述受试者患有出血性疾病。在例示性方面中，所述受试者患有出血性疾病，其中受试者的血液无法适当地凝结。在例示性方面中，所述受试者不表达因子IX，例如WT因子IX，或具有较低的因子IX表达量。在例示性方面中，所述受试者在编码因子IX的基因中具有突变。在例示性方面中，所述受试者罹患血友病，例如B型血友病(又称为克里斯马斯病(Christmas Disease))。在例示性方面中，所述受试者展现高于正常的凝血活性。在例示性方面中，所述受试者具有天然存在的帕多瓦FIX，例如具有引起帕多瓦FIX表达的基因突变。
样品
在例示性实施方式中，本文提到的样品是包括一种或多种体液，例如人体液的生物样品。在例示性方面中，所述样品包括体液，包含但不限于从受试者获得血液、血浆、血清、淋巴、母乳、唾液、黏液、精液、阴道分泌物、细胞提取物、炎症流体、脑脊髓液、粪便、玻璃体液或尿液。在例示性方面中，所述样品包括血液、血浆或血清。在例示性方面中，所述样品是由血液、血浆或血清制备。在例示性方面中，所述样品是血液、血浆或血清级分。在例示性方面中，所述样品是血液样品、血浆样品或血清样品。在例示性方面中，所述样品包括血液或其级分(例如血浆、血清)。在例示性方面中，所述样品包括或是血浆。
在例示性方面中，所述样品是人体组织样品。在例示性方面中，所述人体组织样品包括肌肉组织、上皮组织、结缔组织或神经组织。在例示性方面中，所述人体组织样品包括骨组织。在例示性方面中，所述人体组织样品包括心脏组织、脾组织、淋巴结组织、脑组织、脊髓组织、神经组织、耳、鼻或眼睛组织、乳房组织、皮下组织、乳腺组织、骨髓组织、淋巴组织、鼻咽组织、喉组织、气管组织、支气管组织、肺组织、皮肤组织、唾液腺组织、来自舌或口的组织、口咽组织、喉咽组织、食道组织、胃组织、小肠组织、阑尾组织、结肠组织、直肠组织、肛门组织、肝脏组织、胆道组织、胰腺组织、胆囊组织、肾脏组织、输尿管组织、膀胱组织、尿道组织、子宫组织、阴道组织、外阴组织、卵巢组织、胎盘组织、阴囊组织、阴茎组织、前列腺组织、睾丸组织、精囊组织、垂体组织、松果体组织、甲状腺组织、副甲状腺组织、肾上腺组织或胰岛组织。在例示性方面中，所述人体组织样品包括肝脏组织或脾组织或肾脏组织。在例示性方面中，所述人体组织样品包括肝脏组织。
提供以下实例仅为说明本发明且其不以任何方式限制本发明之范畴。
实施例
实施例1
本实例展示了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法。
使用噬菌体展示方法选择候选特异性帕多瓦FIX结合构建体。使用在338位包含单氨基酸取代的线性肽、在338位包含单氨基酸取代的结构肽或捕捉候选物的全长重组帕多瓦FIX筛选噬菌体文库。在利用和不利用与野生型FIX序列竞争情况下进行三轮淘选，由此鉴别出若干候选结合构建体。执行BIACORE和ELISA实验以测定所得候选物的特异性和亲和力。
利用含序列DRATCLLSTKFT的线性肽获得一个候选物(称为BC1)并且利用含序列LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH的结构肽获得两个候选物(称为BC2和BC3)。利用包括线性肽或结构肽的肽与帕多瓦FIX交替获得又一候选物(BC4)。
筛选分析展示，这些候选物结合至帕多瓦FIX。对于BC2和BC3，与野生型FIX的结合信号(相对于背景的倍数)小于11，而与帕多瓦FIX的结合信号(相对于背景的倍数)超过71。对于BC1，与野生型FIX的结合信号(相对于背景的倍数)是1，而与帕多瓦FIX的结合信号接近200。在第二组筛选分析中，BC1、BC2和BC3各自与野生型FIX的结合信号是1或更小，而BC1、BC2和BC3与帕多瓦FIX的结合信号分别是70、30和10。BC4展示与帕多瓦FIX的结合信号超过36，而与野生型FIX的信号是约1。
在Ni2+板上通过ELISA测试BC1与帕多瓦FIX的结合，在所述板上，BC1的涂覆浓度以及帕多瓦FIX的浓度是变化的。BC1和帕多瓦FIX的测试浓度是0.04μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml和5μg/ml。将BC1与帕多瓦FIX的结合信号同wt FIX对照相比较。在每种测试浓度下，帕多瓦FIX与BC1的结合强于WT FIX与BC1的结合(图2)。
通过ELISA测试在野生型FIX存在下BC1、BC2和BC3与帕多瓦FIX的结合(如图10中所示)。用5μg/mL BC1、BC2或BC3以及含有不同浓度帕多瓦FIX的溶液涂覆MaxiSorp板并将5μg/mL野生型FIX添加至涂覆过的板上。测试的帕多瓦FIX浓度是0μg/mL、0.156μg/mL、0.313μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL。如图3中所示，BC1对于帕多瓦FIX展示出较强亲和力，即使是在WT因子IX存在下也是如此。在5μg/mL WT因子IX存在下，BC1展示出最高敏感性。
在5％人血浆和5μg/mL WT因子IX存在下，通过ELISA测试BC1与不同浓度帕多瓦FIX的结合(如图10中所示)。如图4中所示，BC1与帕多瓦FIX的结合随帕多瓦FIX浓度的增加而增加，即使是在WT因子IX和其它血浆蛋白质存在下也是如此。帕多瓦FIX在25ng/ml至1000ng/ml间变化。
通过ELISA测试在含有50mM苯甲脒的百分含量变化的血浆溶液中BC1与帕多瓦FIX的结合(如图10中所示)。所述溶液是5％、10％或20％(v/v)血浆。如图5所示，BC1可以检测20％血浆溶液中在3.13ng/ml至200ng/ml范围内的帕多瓦FIX。
通过ELISA测试在含有5μg/mL WT因子IX的20％人血浆存在下，BC1、BC2和BC4与帕多瓦FIX的结合。本分析中使用的帕多瓦FIX的浓度是0、3.13、6.25、12.5、25、50、100和200ng/ml。如图6中所示，BC1展现最高敏感性，而BC2展现最低敏感性且无法结合至含有5μg/mL WT因子IX的20％人血浆样品中的帕多瓦FIX。BC4展示的与帕多瓦FIX的结合能力低于BC1的结合能力(图6)。与BC2相同，BC3无法用作含20％人血浆的样品中的帕多瓦FIX特异性检测抗体(数据未示出)。
通过ELISA测试BC1和BC4与其它凝血因子的结合。确切地说，测试BC1或BC4与因子II和因子X的结合。如图7中所示，BC1对帕多瓦FIX具有高度结合特异性，针对因子II或因子X未显示交叉反应性，而相比之下，BC4与因子II展示微小交叉反应性。
BC1对帕多瓦FIX具有结合特异性。相比之下，另外两个结合构建体(BC5和BC6)是通过使用结构肽进行的噬菌体展示而制备的。如图8中所示，BC5和BC6对帕多瓦FIX不具有结合特异性，因为经展示，其明显结合至WT FIX。
通过Biacore表面等离子体共振测定BC1的KD值。BC1的KD是56nM。相较于其它候选物，BC1对帕多瓦FIX展示出最高亲和力。该值类似于(如果不高于)商业抗体的KD(M)值。例如，可商购的抗人野生型FIX抗体的KD(M)值是3.11×10-9。
通过PCR和序列翻译测定BC1重链和轻链CDR的序列，并且这些序列如下：
重链CDR1 SSYAIS SEQ ID NO:6
重链CDR2 GIVPAFGTANYAQKFQG SEQ ID NO:7
重链CDR3 SWGVISFAY SEQ ID NO:8
轻链CDR1 RASQDISSYLN SEQ ID NO:9
轻链CDR2 AASNLQS SEQ ID NO:10
轻链CDR3 MQYDSLPFTF SEQ ID NO:11
利用所述线性肽获得的BC1提供独特且特异性的帕多瓦FIX结合并且此活性得到证实。BC1展现约3ng/mL血浆的检测限并且即使是在明显较高(>5μg/mL)浓度下也未显示与野生型FIX的交叉反应性，。
这些数据证实，产生了高特异性抗帕多瓦FIX抗体。这一抗体结合至人血浆样品中的帕多瓦FIX并且不结合至WT因子IX、因子II和因子X中的任一种。这些数据证实，这一抗体可以用于例如开展临床分析以选择性区分野生型FIX与帕多瓦FIX抗原水平。
实施例2
本实施例展示了使用本发明的抗体或其抗原结合片段的方法。
使用标准条件，将2μg/mL新开发的帕多瓦因子IX(FlXp)特异性结合抗体(BC1)的Fab片段涂覆于96孔微孔板上。使用可商购的生物素化多克隆绵羊抗人FIX IgG和抗生蛋白链菌素过氧化酶作为检测系统。分析组分的示意图显示于图9中。
通过用FIXp制剂生成六点校准曲线，覆盖从27.1-0.85ng/mL的FIXp浓度范围，实现分析校准。用含有5mg/mL牛血清白蛋白、10mM苯甲脒、10mM CaCl2和0.05％Tween 20的HEPES/NaCl缓冲液稀释患者的样品。
正常人血浆或纯化的人FIX在FIXp特异性ELISA中未显示信号。获得准确的校准曲线。掺加有FIXp的1/10稀释的正常人血浆显示可接受的回收率，并且稀释度反应曲线平行于所获得的含分析标准品的缓冲液的稀释度反应曲线。重要的是，用编码FIXp的表达载体治疗的六位患者的样品分析展示出随时间高度类似的FIXp蛋白质和FIX活性曲线，并且相较于CRM-患者，呈交叉反应性物质阳性(CRM+)的患者的样品对于FIXp蛋白质未显示信号增加，显示了分析的特异性。
FIXp特异性ELISA还能够通过测量FIXp蛋白质监测治疗结果。
实施例3
本实施例展示针对帕多瓦FIX的选择性ELISA以及ELISA用于测试人血浆样品的用途。
BC1制剂(0.94mg/mL)用0.1M NaHCO3-Na2CO3(pH 9.5)以1/500稀释并且通过在0至+10℃下以每孔100μL培育过夜，使其结合至Maxisorp F96板各孔。用于稀释样品和试剂以及用于阻断板的稀释缓冲液(DB)是含有5mg/mL不含生物素的牛血清白蛋白(BSA)、10mMCa2+、0.05％Tween 20(Bio-Rad，EIA级)和10mM苯甲脒的0.1M Hepes、0.1M NaCl(pH 7.2)。涂覆之后，用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水洗涤板并且通过在室温(RT，18至26℃)下与每孔200μL DB一起培育60分钟，阻断各孔。通过洗涤终止阻断步骤。接着，装载标准品/样品的稀释液，在板上直接制备连续1+1稀释系列。在室温下，将稀释液(100微升/孔)与所述板一起培育60分钟。接着，再次洗涤所述板并添加由F9-1030A(CoaChrom)制备的生物素化多克隆绵羊抗人FIX检测抗体(100微升/孔；1/500操作稀释液)。在室温下培育60分钟之后，再次洗涤所述板，添加抗生蛋白链菌素过氧化酶(DakoCytomation)(100微升/孔；1/4,000稀释)并在室温下培育30分钟。在最终的充分洗涤程序之后，用即用型过氧化酶底物SureBlue测量结合的过氧化酶活性，用3N硫酸停止反应。接着，用ELISA读取器在450nm下测量所述板，减去在620nm下获得的结果。
图11显示了所获得的纯化的人帕多瓦FIX制剂和含5μg/mL浓度WT FIX的新鲜冷冻的对照血浆制剂的浓度-反应曲线。
获得的覆盖从29至0.91ng/mL范围的重组人帕多瓦FIX浓度的剂量-反应曲线满足公认的有关准确度、精确度和线性的要求，并因此被视为适合于外推样品。具体地说，log-log回归曲线的相关系数是0.9985，并且平均准确度是101.4％且精确度是7.0％。准确度和精确度是通过回溯拟合所测量的校准曲线中六种浓度的信号来计算。另外，这些数据展示了针对帕多瓦FIX的方法的绝对特异性：含有5μg/mL正常血浆浓度的FIX wt并使用1/10最小稀释度测量的人参考血浆不引起任何信号。
ELISA是如上文所描述进行。使用蛋白质浓度是542.42μg/ml的另一重组人帕多瓦FIX制剂获得校准曲线。具有2310IU/mg蛋白质的比凝血活性将这一制剂明确地归类为高活性帕多瓦FIX变体。连续稀释系列的范围是从1/20,000至1/640,000，其确定FIX浓度范围是从27.1-0.85ng/mL。图12显示以空白校正的平均信号的对数与六种分析标准品的FIX浓度之间的线性回归曲线获得的平均校准曲线。插图显示回溯拟合分析校准物D1至D6与其相应的标称浓度一致。帕多瓦FIX的校准曲线在从27.1至0.85ng/mL的浓度范围内显示良好线性。这是由平均相关系数r＝0.9992(范围：0.9986-0.9996)显示并且通过关于校准曲线中个别点所计算的回溯拟合的浓度得到证实，这些浓度与在完整范围内预期的浓度有不到9％(范围：91.1％至108.6％)的差异。这些回溯拟合数据易于满足EMA指南关于生物分析方法验证所限定的要求，由此鉴别出配体结合分析的适合校准曲线。校准曲线的相对总误差(RTE)较低。具体地说，RTE是通过回溯拟合校准曲线标准品的平均空白校正的光学密度(OD)来计算。所得浓度通过乘以其稀释度归一化。现在RTE可以表示为分析标准品的标称浓度与由回溯拟合方法测定的平均浓度的差的绝对值加上此平均浓度的两倍标准差。此外，斜率的低RSD展示，这些曲线可以在打算用于临床环境的分析所需的再现性下获得。
ELISA是如上文所描述进行。向新鲜冷冻的正常人血浆和缺乏FIX的血浆中掺加帕多瓦FIX。两种经过掺加的血浆制剂的稀释系列的起始稀释度是1/10。图13显示了这两种血浆样品与在缓冲液中获得的样品的稀释度-反应曲线的比较。所获得的掺加帕多瓦FIX的血浆样品的稀释度-反应曲线的斜率与所获得的缓冲液稀释系列的稀释度-反应曲线的斜率有不到5％差异。由此显示，血浆基质对分析性能无影响。
由于人与猴FIX之间具有高序列同源性，常规的多克隆抗人FIX抗体也结合至食蟹猕猴FIX(文件数据)。因此，本文也对帕多瓦FIX ELISA针对柠檬酸化猴血浆基质的选择性做了检验。具体地说，向雌性和雄性柠檬酸化猴血浆样品中掺加帕多瓦FIX并以1/10为稀释系列最低起始稀释度进行测量。图14显示了这两种血浆样品与在缓冲液中获得的样品的稀释度-反应曲线的比较。
所获得的掺加帕多瓦FIX的血浆样品的稀释度-反应曲线的斜率与所获得的缓冲液稀释系列的稀释度-反应曲线的斜率有不到4％差异。由此显示，柠檬酸化猴血浆基质对分析性能无影响。此外，掺加的帕多瓦FIX浓度的回收率对于雌性和雄性血浆样品分别是91.3％和103.1％。
在1/2期临床试验中，在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗之后，测量来自具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的受试者的柠檬酸化血浆样品中的帕多瓦FIX。使用来自受试者的血浆样品，如上文所描述进行帕多瓦FIX ELISA。通过使用标准方法，使用从受试者获得的血浆样品进行FIX凝血活性和FIX抗原测量。图15显示了对从1/2期临床试验中的受试者获得的血浆样品进行FIX活性和FIX蛋白质测量的结果，这些结果始终展示接近1U/mL的FIX抗原浓度，但FIX活性低于定量下限。这一数据证明该受试者展示了CRM+(即，无凝血活性的FIX蛋白质)可用常规FIX ELISA测量。使用分析标准品比活性(2310IU/mg)进行活性变换和5μg/mL正常人FIX浓度进行抗原变换，将获得的以ng/mL为单位的帕多瓦FIX ELISA结果变换成活性和抗原单位。
帕多瓦FIX ELISA数据相似于FIX活性数据，表明了测量的FIX活性取决于帕多瓦FIX的表达。相比之下，利用帕多瓦FIX特异性ELISA测量的FIX抗原浓度明显低于利用标准ELISA获得的抗原浓度，展示了帕多瓦FIX ELISA能够区别CRM+物质与帕多瓦FIX。
在1/2期临床试验中，在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗之后，测量来自另一具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的受试者的柠檬酸化血浆样品中的帕多瓦FIX。使用来自所述另一受试者的血浆样品，如上文所描述进行帕多瓦FIX ELISA。通过使用标准方法，使用从所述另一受试者获得的血浆样品进行FIX凝血活性和FIX抗原测量。图16显示了对从所述另一受试者获得的血浆样品进行FIX活性和FIX蛋白质测量的结果，这些结果始终展示接近0.8U/mL的FIX抗原浓度，但FIX活性低于定量下限。这一数据证明该受试者展示CRM+(即，无凝血活性的FIX蛋白质)可用常规FIX ELISA测量。使用分析标准品比活性(2310IU/mg)进行活性变换和5μg/mL正常人FIX浓度进行抗原变换，将获得的以ng/mL为单位的帕多瓦FIX ELISA结果变换成活性和抗原单位。
帕多瓦FIX ELISA数据相似于FIX活性数据，表明了测量的FIX活性取决于帕多瓦FIX的表达。相比之下，利用帕多瓦FIX特异性ELISA测量的FIX抗原浓度明显低于利用标准ELISA获得的抗原浓度，显示了帕多瓦FIX ELISA能够区别CRM+物质与帕多瓦FIX。
在1/2期临床试验中，在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗后，测量来自不含FIX CRM+的受试者的柠檬酸化血浆样品中的帕多瓦FIX。使用来自不含FIX CRM+的受试者的血浆样品，如上文所描述进行帕多瓦FIX ELISA。通过使用标准方法，使用从不含FIXCRM+的受试者获得的血浆样品进行FIX凝血活性和FIX抗原测量。图17显示了对从始终展示无CRM+的受试者获得的血浆样品进行FIX活性和FIX蛋白质测量的结果。使用分析标准品比活性(2310IU/mg)进行活性变换且5μg/mL正常人FIX浓度进行抗原变换，将获得的以ng/mL为单位的帕多瓦FIX ELISA结果变换成活性和抗原单位。帕多瓦FIX ELISA数据相似于FIX活性和FIX蛋白质数据，表明了测量的FIX活性取决于帕多瓦FIX的表达。
实施例4
本文还使用BC1开发了FIX显色活性分析方法。通过结合至板结合的BC1，从样品基质中选择性纯化出帕多瓦FIX。通过充分洗涤，去除未结合的样品组分，包括人野生型FIX，随后对微孔板各孔进行显色因子IX测试221806(Hyphen Biomed)。用以上描述的稀释缓冲液稀释样品。图18显示了获得的帕多瓦FIX和正常参考血浆制剂的剂量反应曲线。
帕多瓦FIX显示线性浓度-反应曲线，而含浓度约1U/mL的FIX的正常参考血浆浓度未展示任何可测量的信号。这些数据展示了所述方法的可行性，描述了帕多瓦FIX特异性活性分析，同时确定了其特异性。
实施例5
以下描述了区别野生型FIX与帕多瓦FIX变体的抗体的分离。
帕多瓦FIX是具有单氨基酸交换的天然存在的野生型FIX的高功能性变体(FIXR338L)。帕多瓦FIX在B型血友病基因疗法中的有用性已在临床前模型中得到显示并且当前正在临床1/2期程序中进行研究。有关所述疗法成功性的评估在很大程度上依赖于帕多瓦FIX转基因表达量的测定，然而，帕多瓦FIX转基因表达量的测定因缺乏区别野生型FIX与帕多瓦FIX的抗体而受阻。特异性识别帕多瓦FIX但不与野生型FIX交叉反应的抗体使得能够开发出明确地检测临床样品中的帕多瓦FIX的分析方法。噬菌体展示方法用于选择特异性帕多瓦FIX结合物。用在338位包含单氨基酸取代的线性肽和结构肽，以及全长重组帕多瓦FIX筛选噬菌体文库。在利用和不利用与野生型FIX序列的竞争情况下进行的三轮淘选，鉴别出若干结合物。进行BIACORE(表面等离子体共振)和ELISA实验以测定所得抗体的特异性和亲和力。通过不同噬菌体展示淘选途径最初鉴别出了各种抗体。一个由线性肽途径产生的抗体展示独特且特异性的帕多瓦FIX结合。所选抗体具有约3ng/mL血浆的检测限并且显示与野生型FIX无交叉反应性，即使是在明显较高(>50μg/mL)浓度下。上述的高特异性抗帕多瓦FIX抗体可以用来开展临床分析，以选择性区分野生型FIX与帕多瓦FIX抗原水平。
引言：
帕多瓦FIX是天然存在的具有单氨基酸交换的野生型(wt)FIX的高功能性变体(FIXR338L)。这种功能获得性突变使得比凝血活性相较于正常FIX有8至10倍的增加。在体外，重组FIX-R338L的比凝血活性相较于重组野生型FIX的比凝血活性有5至10倍升高[1]。帕多瓦FIX在B型血友病基因疗法中的有用性已在临床前模型中得到显示，并且当前正在临床1/2期试验中进行研究。有关所述疗法成功性的评估在很大程度上依赖于帕多瓦FIX转基因表达量的测定，不过，帕多瓦FIX转基因表达量的测定因缺乏区别野生型FIX与帕多瓦FIX的抗体而受阻。
本研究的目的是产生特异性结合帕多瓦FIX但不与野生型FIX交叉反应的抗体，以允许在野生型FIX存在下检测临床样品中的帕多瓦FIX。
以下描述在本研究期间进行的方法。
抗帕多瓦FIX特异性抗体的产生：基于HuCAL文库和技术，通过噬菌体展示技术产生抗体(二价Fab)。应用四种不同的方法分离对帕多瓦FIX具有特异性的抗体(图19)。其中两种方法用在338位包含单氨基酸取代的肽在固相或液相(珠粒)分析中执行。第三种和第四种策略包含全长活性帕多瓦FIX蛋白质。对每种策略执行三轮淘选，包含适当阴性对照物(野生型肽或野生型FIX)。制备特有阳性克隆的Fab并测试其与帕多瓦FIX抗原的特异性结合。对于ELISA，涂覆抗原[5μg/mL]并将其与Fab片段[2μg/mL]一起培育，随后用抗Fab AP偶联物检测。
血浆ELISA：将Fab涂覆于MaxiSorp ELISA板[5μg/mL]上并将其与在PBS缓冲液加50mM苯甲脒中稀释的20％人血浆一起培育。在血浆中掺加5μg/mL rFIX wt和递增浓度的帕多瓦rFIX(在HEK293中内部产生)。使用HRP标记的多克隆山羊抗FIX抗体(100ng/mL)进行检测。
BiaCore：在25℃下，使用BiacoreTM200仪器和涂镍的生物传感器芯片(NTA-ChipGE Healthcare)执行所有实验。先用HBS-EP操作缓冲液预备仪器三次，并使用流槽1(FC1)作为参考流槽，该流槽未被修饰并且缺乏Fab配体。使用流槽2(FC2)固定约500RU的帕多瓦FIX特异性Ab42。配体浓度范围从100至6.25nM。
以下描述本研究的结果。
猪科动物wt FIX的结构分析披露，单一帕多瓦修饰(R338L)位于蛋白质的表面上[2](图21)，并因此是产生高特异性抗体的适合表位。通过ELISA测试纯化的二价Fab的抗原特异性(图22)以及与20％人血浆中野生型FIX的交叉反应性(图23)。在含有5μg/mL掺加的野生型FIX的20％血浆基质中，四种分离的二价Fab中只有两种(Ab42和Ab76)特异性结合至帕多瓦FIX。仅Ab42针对人FII和人FX不显示任何交叉反应性(数据未示出)。
基于这些数据，可得出结论，使用噬菌体展示技术产生了高特异性抗帕多瓦FIX微型抗体Ab42。所选候选物显示与野生型FIX或其它常见血液因子蛋白质如FII或FX无交叉反应性。在人血浆基质(20％)中并且在常用浓度的野生型FIX存在下显示与帕多瓦FIX的有效结合。当前使用微型抗体Ab42对在从临床1/2期试验期间治疗的患者得到的血浆进行帕多瓦FIX分析(参见下文)。
在以上描述的研究中，引用以下参考文献：(1)Simioni等人,具有突变因子IX(帕多瓦因子IX)的X连锁易栓病(X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX(Factor IX Padua)),《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》2009；361:1671-5；以及(2)Brandstetter等人,凝血因子IXa的X射线结构：与Xase活性和B型血友病有关的活性位点和模块结构(X-ray structure of clotting factor IXa:active site and modulestructure related to Xase activity and hemophilia B.)《美国国家科学院院刊》1995年10月10日；92(21):9796-800。
以下描述了用于监测B型血友病基因疗法的帕多瓦FIX特异性免疫分析的开发和应用。
基因疗法作为将来血友病的治疗选择具有极大的发展前景。在一项临床1/2期试验中，在患有重度B型血友病的受试者中，使用了AAV2/8病毒载体表达帕多瓦FIX(FIXp)，这是具有单氨基酸交换(R338L)的FIX的高功能性变体。转基因产物的特异性检测是评估疗法成功性的关键，但对于具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的患者仍具挑战性。开展FIXp特异性ELISA并应用这一分析测量在用表达帕多瓦FIX的AAV2/8病毒载体治疗之后于B型血友病患者的血浆中表达的FIXp。使用标准条件，将2μg/mL新开发的FIXp特异性结合抗体的Fab片段涂覆至96孔微孔板上。使用生物素化多克隆绵羊抗人FIX IgG和抗生蛋白链菌素过氧化酶作为检测系统。通过用FIXp制剂生成六点校准曲线，覆盖从27.1-0.85ng/mL的FIXp浓度范围，实现分析校准。用含有5mg/mL牛血清白蛋白、10mM苯甲脒、10mM CaCl2和0.05％Tween20的HEPES/NaCl缓冲液稀释患者的样品。正常人血浆或纯化的人FIX在FIXp特异性ELISA中未显示信号。获得准确的校准曲线。掺加有FIXp的1/10稀释的正常人血浆显示了可接受的回收率，并且稀释度反应曲线平行于所获得的含分析标准品的缓冲液的稀释度反应曲线。重要的是，分析用编码FIXp的AAV治疗的六位患者的样品随时间展示极其类似的FIXp蛋白质和FIX活性曲线，并且相较于CRM-患者，CRM+患者的样品对于FIXp蛋白质未显示信号增加，指示所述分析的特异性。FIXp特异性ELISA还能够通过测量FIXp蛋白质监测治疗结果。这代表了第一组显示此方法可行性的数据。
引言：
基因疗法作为将来血友病的治疗选择具有极大的发展前景[1]。在一项临床1/2期试验中，在患有重度B型血友病的受试者中，使用了AAV2/8病毒载体表达帕多瓦FIX(FIXp)[2]，这是具有单氨基酸交换(R338L)的FIX的高功能性变体。转基因产物的特异性检测对于评估疗法成功性至关重要，但对于具有FIX交叉反应性物质(CRM+)的患者仍具挑战性。
图25描绘了本研究中所描述的方法(分析)的原理。将抗帕多瓦FIX Fab涂覆至微孔板各孔上并选择性捕捉样品中的帕多瓦FIX。在用洗涤步骤去除未结合的样品化合物之后，使用内部生物素化多克隆绵羊抗FIX IgG和抗生蛋白链菌素过氧化酶检测结合的帕多瓦FIX。使用即用型HRP底物SureBlue测量结合的HRP活性。
以下描述在本研究期间进行的方法。
ELISA程序：Fab制剂Ab42(0.94mg/mL)用0.1M NaHCO3-Na2CO3(pH 9.5)以1/500稀释并且通过在0至+10℃下以每孔100μL培育过夜，使其结合至Maxisorp F96板各孔。用于稀释样品和试剂以及用于阻断板的稀释缓冲液(DB)含有0.1M HEPES、0.1M NaCl(pH 7.2)、5mg/mL不含生物素的牛血清白蛋白(BSA)、10mM Ca2+、0.05％Tween 20(Bio-Rad，EIA级)及10mM苯甲脒。涂覆之后，用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水洗涤板。接着，通过将这些孔与每孔200μL DB在室温(RT)下一起培育60分钟来将其阻断。通过洗涤终止阻断步骤。接着，装载标准极品/样品的稀释液，在板上直接制备连续1+1稀释系列。在室温下，培育稀释液(100微升/孔)60分钟。再次洗涤板，并添加由F9-1030A(A-Coa)制备的生物素化多克隆绵羊抗人FIX检测抗体(100微升/孔；11500稀释)。在室温下培育60分钟之后，再次洗涤板，并且添加抗生蛋白链菌素过氧化酶(DakoCytomation)(100微升/孔；1/4,000稀释)并在室温下培育30分钟。在最终的洗涤程序之后，用即用型过氧化酶底物SureBlue(KPL)测量结合的过氧化酶活性，用3N硫酸停止反应。接着在450nm下测量板，减去在620nm下获得的结果。用纯化的重组帕多瓦FIX(FIXp)制剂构建校准曲线，展示蛋白质浓度是542.4μg/mL。2,310IU/mg蛋白质的比凝血活性明确显示这一制剂归类为高活性帕多瓦FIX变体。连续稀释系列范围从1/20,000至1/640,000并且确定FIX浓度范围是从27.1至0.85ng/mL。
本研究的结果描述于下文和附图中。应用已确立的标准方法执行FIX凝血活性和FIX抗原测量；另外，用ELISA对柠檬酸化血浆样品中的帕多瓦FIX蛋白质进行特异性测量。所获得的以ng/mL为单位的帕多瓦FIX ELISA的结果被变换成活性和抗原单位。具体地说，使用作为FIXp ELISA的分析标准品施加的重组纯化帕多瓦FIX制剂的比活性2,310IUFIX/mg计算活性单位，而关于抗原血浆单位的变换是基于5μg/mL的正常FIX血浆浓度。图26-29分别展示了在正常和缺乏FIX的血浆中进行的分析选择性、校准曲线、平行研究以及钙对ELISA灵敏度的影响。
血浆样品取自用AAV2/8病毒载体治疗过的患者。图30-32展示了从三位患者获得的样品中帕多瓦FIX的活性和表达。从受试者05-001获得的血浆样品一致地展示接近1U/mL的FIX抗原浓度，但FIX活性低于定量下限。这一数据披露了用常规FIX ELISA可以检测到的FIX交叉反应性物质(CRM+)的存在，即无凝血活性的FIX蛋白质的存在。FIXp ELISA数据与FIX活性数据相似，说明测量的FIX活性取决于帕多瓦FIX的表达。相比之下，利用帕多瓦FIX特异性ELISA测量的FIX抗原浓度明显低于利用标准ELISA获得的抗原浓度，说明帕多瓦FIXELISA能够区别CRM+物质与帕多瓦FIX。类似数据见于来自受试者10-005的样品，不过是在较低CRM+水平下；而来自受试者03-004的样品不含CRM+，使得这两个ELISA系统的时间-浓度曲线平行。
从这些数据可得出结论，基于使用高度特异性Fab片段捕捉FIXp的帕多瓦FIX特异性ELISA能通过测量FIXp来监测治疗结果。这些数据是第一组展示此方法可行性的数据。
在以上描述的研究中，引用了以下参考文献：[1]Simioni P等人(2009):《新英格兰医学杂志》361,1671-1675，具有突变因子IX(帕多瓦因子IX)的X连锁易栓病(X-Linkedthrombophilia with a Mutant Factor IX(Factor IX Padua))；[2]Crudele JM等人(2015),《血液(Blood)》125:1553-1561，帕多瓦FIX的AAV肝表达防止并根除FIX抑制剂，同时不增加B型血友病狗和小鼠的血栓形成(AAV liver expression of FIX-Paduaprevents and eradicates FIX inhibitor without increasing thrombogenicity inhemophilia B dogs and mice)。
本说明书的实施例也可以如下所描述：
1.一种抗体或其抗原结合片段，其结合含氨基酸序列SEQ ID NO:1的帕多瓦因子IX并且不结合至含氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的野生型(WT)因子IX。
2.如实施方式1所述的抗体或抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:1的表位，其中所述表位是在氨基酸序列DRATCLLSTKFT(SEQ ID NO:3)内的线性表位。
3.如实施方式1所述的抗体或抗原结合片段，其结合至SEQ ID NO:1的表位，其中所述表位是氨基酸序列LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:5)的折叠结构的构象表位。
4.如实施方式1或3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述折叠结构包括二硫桥。
5.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其不结合至氨基酸序列DRATCLRSTKFT(SEQ ID NO:14)或LVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:15)。
6.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以约100nM或更低的KD结合至所述帕多瓦因子IX。
7.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以在约25至约75nM范围内的KD结合至所述帕多瓦因子IX。
8.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以在约50nM至约60nM范围内的KD结合至所述帕多瓦因子IX。
9.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以在约20nM至约100nM、约25nM至约95nM、约30nM至约90nM、约35nM至约85nM、约40nM至约80nM、约45nM至约75nM、约50nM至约70nM或约55nM至约65nM范围内的KD结合至所述帕多瓦因子IX。
10.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合至含人血浆的样品中的所述帕多瓦因子IX并且不结合至WT因子IX，任选地，其中所述样品包括至少或约5％、至少或约10％，或者至少或约20％人血浆并且所述样品包括至少或约5μg/mL野生型因子IX。
11.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至因子II多肽或因子X多肽。
12.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段既不结合至因子II，也不结合至因子X。
13.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其是Fab或Fab2'抗体片段。
14.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其是单特异性的。
15.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其是完全人源的。
16.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其是二价的。
17.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其是二价的，但对帕多瓦FIX具有单特异性。
18.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其包括二聚化Fab片段或二聚化Fab微型抗体。
19.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其是通过接头序列连接的二聚化Fab片段。
20.如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段，其包括(i)以下氨基酸序列：SSYAIS(SEQ ID NO:6)；GIVPAFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:7)；SWGVISFAY(SEQ ID NO:8)；RASQDISSYLN(SEQ ID NO:9)；AASNLQS(SEQ ID NO:10)；以及MQYDSLPFTF(SEQ ID NO:11)，或(ii)SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:24和25的氨基酸序列，或(iii)SEQID NO:26或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:26和27的氨基酸序列。
21.一种包括含SEQ ID NO:6-11中的每一个的氨基酸序列的多肽，任选地，其中(i)在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸，和/或(ii)所述多肽任选地还包括含DYKDDDDK(SEQ ID NO:12)的FLAG标签和/或含HHHHHH(SEQ ID NO:13)的六聚组氨酸标签。
22.如实施方式21所述的多肽，其中所述FLAG标签和/或所述六聚组氨酸标签位于所述多肽的C末端。
23.一种偶联物，包括如前述实施方式中任一个所述的抗体或抗原结合片段或多肽偶联至异源部分。
24.如实施方式23所述的偶联物，其中所述异源部分可以选自下组：聚合物、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质和检测剂。
25.如实施方式23或24所述的偶联物，其中所述抗体或抗原结合片段或多肽偶联至琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶或受控微孔玻璃。
26.如实施方式23至25中任一个所述的偶联物，其中所述抗体或抗原结合片段或多肽偶联至荧光团、发色团、放射性同位素、酶标记或生物素。
27.如实施方式23至26中任一个所述的偶联物，包括如实施方式19所述的多肽的同源二聚体。
28.如实施方式27中所述的偶联物，其中所述二聚体中的多肽是通过螺旋-转角-螺旋结构连接。
29.一种核酸，包括编码如前述实施方式中任一个所述的抗体、抗原结合片段、多肽、偶联物或其片段的核苷酸序列。
30.一种载体，包括如实施方式29所述的核酸。
31.一种宿主细胞，包括如实施方式29所述的核酸或如实施方式30所述的载体。
32.一种试剂盒，包括如实施方式1至20中任一个所述的抗体或抗原结合片段、如实施方式21或22所述的多肽、如实施方式23至28中任一个所述的偶联物、如实施方式29所述的核酸、如实施方式30所述的载体和/或如实施方式31所述的宿主细胞。
33.如实施方式32所述的试剂盒，还包括次级抗体，所述次级抗体结合至所述抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物。
34.如实施方式32或33所述的试剂盒，还包括固体载体。
35.如实施方式32至34中任一个所述的试剂盒，其中所述抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物被预先涂覆于固体载体上。
36.如实施方式34或35所述的试剂盒，其中所述固体载体是聚合物珠粒、微量滴定板、膜或过滤器。
37.如实施方式35或36所述的试剂盒，包括用含约100ng或更多、约150ng或更多、约200ng或更多、约500ng或更多的所述抗原结合片段的溶液预先涂覆的固体载体。
38.如实施方式32至37中任一个所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括使用说明书。
39.一种组合物，包括如实施方式1至20中任一个所述的抗体或其抗原结合片段与从人获得的生物样品的混合物，所述生物样品包括人血浆或其稀释级分，和/或人类组织或其细胞，其中任选地，所述组合物包括检测剂。
40.一种组合物，包括如实施方式1至20中任一个所述的抗体或其抗原结合片段与从人获得的含人血浆蛋白质的生物样品的混合物，其中所述人血浆蛋白质中的至少一种选自下组：因子IX、因子IX的变体、因子II、因子II的变体、因子X和因子X的变体。
41.如实施方式40所述的组合物，其中所述组合物包括检测剂。
42.如实施方式1至20中任一个所述的抗体或抗原结合片段、如实施方式21或22所述的多肽、如实施方式23至28中任一个所述的偶联物、如实施方式29所述的核酸、如实施方式30所述的载体、如实施方式31所述的宿主细胞和/或如实施方式32至38中任一个所述的试剂盒的用途，其用于检测样品中的帕多瓦因子IX。
43.一种检测从受试者获得的样品中的帕多瓦因子IX的方法，包括(i)使所述样品与如实施方式1至20中任一个所述的抗体或抗原结合片段、如实施方式21或22所述的多肽或如实施方式23至28中任一个所述的偶联物接触以形成包括所述帕多瓦因子IX和所述抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物的复合物，和(ii)检测所述样品中的所述复合物。
44.如实施方式43所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段或多肽偶联至检测剂和/或固体载体，或其中所述偶联物包括检测剂。
45.如实施方式43或44所述的方法，包括使所述样品与含检测剂的次级抗体接触，其中所述次级抗体结合至所述抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物。
46.如实施方式43至45中任一个所述的方法，其中检测所述复合物包括检测所述检测剂的信号。
47.如实施方式46所述的方法，其中所述信号是酶活性、结合活性和/或显色活性。
48.如实施方式43至47中任一个所述的方法，其中所述样品是血液样品、血清样品或血浆样品。
49.如实施方式43至48中任一个所述的方法，其中所述受试者已用包括编码帕多瓦因子IX的核苷酸序列的载体治疗。
50.一种本文所描述的结合构建体。
本文所引用的所有参考文献，包含出版物、专利申请和专利特此以引用的方式并入，其引用程度就如同单独地并且特定地指示每一参考文献是以引用的方式并入并且整体阐述于本文中一般。
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除非本文另外指示，否则本文对值范围的陈述仅意在用作一种简写方法来逐个地提及在该范围内的每一单独的值和每一端点的值，并且每一单独的值和端点的值被并入本说明书中，如同其在本文中分别地引用一般。
除非本文另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法可以按任何适合次序执行。除非另外要求，否则使用的任何和所有实施例，或本文提供的例示性语言(例如“如”)仅意在更好地说明本公开且并不对本公开的范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为表示任何未要求的要素为实践本公开所必需的。
本文描述了本公开的优选实施方式，包括本发明人已知的实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读了前文描述之后将很容易明白那些优选实施方式的变化形式。本发明人预期熟练的技术人员在适当时会采用这些变化形式，并且本发明人预期本公开会以与本文具体描述的方式不同的方式来实践。因此，本公开包含适用法律所容许的所附权利要求书中所述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外明显与上下文矛盾，否则本公开涵盖上述要素以其所有可能变化形式的任何组合。
序列表
<110> 拜科赛尔塔公司
拜科赛尔塔有限责任公司
<120> 抗帕多瓦因子IX抗体
<130> 31315/50573
<160> 28
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 461
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr
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<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr
1 5 10 15
Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu
20 25
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr
1 5 10 15
Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
20 25
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe Thr Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
His His His His His His
1 5
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr
1 5 10 15
Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
20 25
<210> 16
<211> 622
<212> PRT
<213> 智人
<300>
<308> GenBank / AAH51332.1
<309> 2006-07-15
<313> (1)..(622)
<400> 16
Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln
20 25 30
Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu
35 40 45
Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr
50 55 60
Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr
65 70 75 80
Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro
85 90 95
Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu
100 105 110
Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu
115 120 125
Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser
130 135 140
Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro
145 150 155 160
Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val
165 170 175
Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr
180 185 190
Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro
195 200 205
Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg
210 215 220
Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala
225 230 235 240
Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Ala
260 265 270
Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu
275 280 285
Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp
290 295 300
Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr
305 310 315 320
Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys
325 330 335
Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu
340 345 350
Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser
355 360 365
Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys
370 375 380
Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp
385 390 395 400
Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn
405 410 415
Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr
420 425 430
Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr
435 440 445
Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala
450 455 460
Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro
465 470 475 480
Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly
485 490 495
Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr
500 505 510
Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu
515 520 525
Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile
530 535 540
Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg
545 550 555 560
Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser
565 570 575
Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu
580 585 590
Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg
595 600 605
Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu
610 615 620
<210> 17
<211> 467
<212> PRT
<213> 智人
<300>
<308> PRF / 1205236A
<309> 1996-10-18
<313> (1)..(467)
<400> 17
Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn Asn Ile
1 5 10 15
Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys
20 25 30
Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu
35 40 45
Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn
50 55 60
Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln
65 70 75 80
Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu
85 90 95
Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser
100 105 110
Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser
115 120 125
Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys
130 135 140
Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu
145 150 155 160
Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala
165 170 175
Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro
180 185 190
Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu
195 200 205
Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys
210 215 220
Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu
225 230 235 240
Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala
245 250 255
Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Glu Gly Asp Arg Asn Thr
260 265 270
Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile
275 280 285
Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val
290 295 300
Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala
305 310 315 320
Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys
325 330 335
Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln
340 345 350
Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser
355 360 365
Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala
370 375 380
Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
385 390 395 400
Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val
405 410 415
Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr
420 425 430
Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg
435 440 445
Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser
450 455 460
Pro Leu Lys
465
<210> 18
<400> 18
000
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<400> 21
000
<210> 22
<400> 22
000
<210> 23
<400> 23
000
<210> 24
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105
<210> 26
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ala
210
<210> 28
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Val Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Gly Val Ile Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Pro Lys
210 215 220
Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys
225 230 235 240
His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys Gly Glu Leu Glu Glu
245 250 255
Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ala
260 265 270
Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ala Pro His His His His
275 280 285
His His
290

Claims (39)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其结合含氨基酸序列SEQ ID NO:1的帕多瓦因子IX并且不结合至含氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的野生型(WT)因子IX。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:1的表位，其中所述表位是在氨基酸序列DRATCLLSTKFT(SEQ ID NO:3)内的线性表位。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其结合至SEQ ID NO:1的表位，其中所述表位是氨基酸序列LVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:5)的折叠结构的构象表位，任选地，其中所述折叠结构包括二硫桥。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其不结合至氨基酸序列DRATCLRSTKFT(SEQ ID NO:14)或LVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFH(SEQ ID NO:15)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以约100nM或更低的KD结合至所述帕多瓦因子IX。
6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以在约25至约75nM范围内的KD结合至所述帕多瓦因子IX，任选地，其中所述抗体或抗原结合片段以在约50nM至约60nM范围内的KD结合至所述帕多瓦因子IX。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合至含人血浆的样品中的所述帕多瓦因子IX并且不结合至野生型因子IX，任选地，其中所述样品包括至少或约5％、至少或约10％，或者至少或约20％人血浆并且所述样品包括至少或约5μg/mL野生型因子IX。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不结合至因子II多肽或因子X多肽，任选地，其中所述抗体或抗原结合片段既不结合至因子II，也不结合至因子X。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是Fab或Fab2'抗体片段。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是单特异性的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是完全人源的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是二价的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包括二聚化Fab片段或二聚化Fab微型抗体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是通过连接子连接的二聚化Fab片段。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包括(i)以下氨基酸序列：SSYAIS(SEQ ID NO:6)；GIVPAFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:7)；SWGVISFAY(SEQ ID NO:8)；RASQDISSYLN(SEQ ID NO:9)；AASNLQS(SEQ ID NO:10)；以及MQYDSLPFTF(SEQ ID NO:11)，或(ii)SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列或SEQ ID NO:24和25的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸序列或SEQ ID NO:26和27的氨基酸序列。
16.一种包括含SEQ ID NO:6-11中的每一个的氨基酸序列的多肽，任选地，其中(i)在SEQ ID NO:6-11中的每一个之间存在一个或多个氨基酸，和/或(ii)所述多肽任选地还包括含DYKDDDDK(SEQ ID NO:12)的FLAG标签和/或含HHHHHH(SEQ ID NO:13)的六聚组氨酸标签，任选地，其中所述FLAG标签和/或所述六聚组氨酸标签位于所述多肽的C末端。
17.一种偶联物，包括根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段或多肽偶联至异源部分，所述异源部分任选地选自下组：聚合物、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质和检测剂。
18.根据权利要求17所述的偶联物，其中所述抗体或抗原结合片段或多肽偶联至琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶或受控微孔玻璃。
19.根据权利要求17或18所述的偶联物，其中所述抗体或抗原结合片段或多肽偶联至荧光团、发色团、放射性同位素、酶标记或生物素。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的偶联物，包括根据权利要求14所述的多肽的同二聚体，任选地，其中所述二聚体中的多肽是通过螺旋-转角-螺旋结构连接。
21.一种核酸，包括编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体、抗原结合片段、多肽、偶联物或其片段的核苷酸序列。
22.一种载体，包括根据权利要求21所述的核酸。
23.一种宿主细胞，包括根据权利要求21所述的核酸或根据权利要求22所述的载体。
24.一种试剂盒，包括(i)根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据权利要求16所述的多肽、根据权利要求17至20中任一项所述的偶联物、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22所述的载体和/或根据权利要求23所述的宿主细胞，和任选地使用说明书，以及任选地，(ii)次级抗体，所述次级抗体结合(i)所述的抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，还包括固体载体。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物被预先涂覆于所述固体载体上。
27.根据权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述固体载体是聚合物珠粒、微量滴定板、膜或过滤器。
28.根据权利要求26或27所述的试剂盒，包括用含约100ng或更多、约150ng或更多、约200ng或更多、约500ng或更多的所述抗原结合片段的溶液预先涂覆的固体载体。
29.一种组合物，包括根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与从人获得的生物样品的混合物，所述生物样品包括人血浆或其稀释级分，和/或人体组织或其细胞，其中任选地，所述组合物包括检测剂。
30.一种组合物，包括根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与从人获得的含人血浆蛋白质的生物样品的混合物，其中所述人血浆蛋白质中的至少一种选自下组：因子IX或其变体、因子II和因子X，其中任选地，所述组合物包括检测剂。
31.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据权利要求16所述的多肽、根据权利要求17至20中任一项所述的偶联物、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22所述的载体、根据权利要求23所述的宿主细胞和/或根据权利要求24至27中任一项所述的试剂盒的用途，其用于检测样品中的帕多瓦因子IX。
32.一种检测从受试者获得的样品中的帕多瓦因子IX的方法，包括(i)使所述样品与根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据权利要求16所述的多肽或根据权利要求17至20中任一项所述的偶联物接触以形成包括所述帕多瓦因子IX和所述抗体、抗原结合片段、多肽或偶联物的复合物，和(ii)检测所述样品中的所述复合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段或多肽偶联至检测剂和/或固体载体，或其中所述偶联物包括检测剂。
34.根据权利要求32所述的方法，包括使所述样品与含检测剂的次级抗体接触，其中所述次级抗体结合至所述抗体或抗原结合片段或多肽或偶联物。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中检测所述复合物包括检测所述检测剂的信号。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述信号是酶活性、结合活性和/或显色活性。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品、血清样品或血浆样品。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述受试者已用包括编码帕多瓦因子IX的核苷酸序列的载体治疗。
39.一种本文所描述的结合构建体。
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