CN116997571A - 结合ccr9的治疗性结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合趋化因子受体CCR9的结合分子，诸如抗体。更特别地，本发明涉及CCR9介导的疾病或病症诸如炎性肠病(IBD)的治疗、和用于检测CCR9的方法，该治疗和这些方法利用了本发明的结合分子。

Description

结合CCR9的治疗性结合分子
1技术领域
本发明涉及结合趋化因子受体CCR9的结合分子，诸如抗体。更特别地，本发明涉及CCR9介导的疾病或病症诸如炎性肠病(IBD)的治疗、和用于检测CCR9的方法，该治疗和这些方法利用了本发明的结合分子。
2背景技术
IBD是一组病理上特征为肠炎症和上皮损伤的胃肠道慢性障碍。IBD的两种形式，即克罗恩病和溃疡性结肠炎与显著病态相关并且可能对个体的生命质量及其工作能力具有重大影响[1]。这些病态突出了对于IBD的改善疗法的需要。
调控IBD的治疗性干预以解决症状性应答和随后的干预耐受性。当前疗法包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇和抗体。然而，尽管有这些治疗，但估计在高达三分之二的克罗恩病患者中在其一生内需要手术干预[2]。克罗恩病的临床管理具有历史上采用的阶梯式方法(step-up approach)，该方法以类固醇、免疫抑制剂(硫嘌呤和甲氨蝶呤)和/或氨基水杨酸盐开始，但后者有效力的证据是非常有限的[3]。尚无已获得批准的疗法在大多数患者中实现持久缓解。
靶向抗CCR9抗体已被提出作为一种癌症治疗机制。卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和黑素瘤中的异常CCR9表达与响应于CCL25的体外侵入性相关联。CCL25接合增强细胞存活和对细胞凋亡的抗性。Somovilla-Crespo等人2018[4]和WO 2015075269 A1描述了小鼠抗CCR9抗体91R(小鼠抗人CCR9 IgG2b)和92R(小鼠抗人CCR9IgG2a)。
因此，存在对用于治疗或预防此类障碍的改善药物的需要。本发明解决了上述问题中的一个或多个。
3发明内容
诸位发明人已经发现趋化因子受体CCR9高度表达于患有IBD的患者的结肠和回肠中，在其中它与炎性细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17共表达。诸位发明人已经成功产生结合分子，这些结合分子结合CCR9表达细胞(CCR9-expressing cell)、抑制CCR9与其天然配体CCL25之间的相互作用并且防止CCL25介导的CCR9内化。有利地，结合分子可以诱导它们所结合的CCR9表达细胞的死亡，例如通过介导针对它们所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)进行。开发抑制CCL25与CCR9的结合并且诱导它所结合的CCR9表达细胞的死亡的结合分子对于患有IBD的受试者是特别有利的。
因此，本发明涉及结合CCR9的结合分子。本发明结合分子优选地抑制CCL25与CCR9的结合。本发明结合分子优选地能够诱导它们所结合的CCR9表达细胞的死亡。例如，结合分子可以能够介导针对它们所结合的细胞的ADCC应答。本发明结合分子优选地能够防止或抑制它们所结合的CCR9表达细胞的迁移。例如，这些结合分子可以防止CCR9表达细胞响应于CCL25的迁移，或者这些结合分子可以能够防止CCR9表达细胞从外周迁移至受试者的肠道中。
在一方面，本发明提供了一种结合分子，该结合分子结合CCR9并且包含具有一组CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变(VH)区和具有一组CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变(VL)区，其中(a)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:4(RSSQSLVHX1NX2NTYLH，其中X1和X2是任何氨基酸)的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；(b)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2和SEQ ID NO:9的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQ ID NO:12的LCDR3；或者(c)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:13的HCDR1、SEQ ID NO:14的HCDR2和SEQID NO:15的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:16的LCDR1、SEQ ID NO:17的LCDR2和SEQ ID NO:18的LCDR3；或者其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个氨基酸取代。
本发明结合分子可以包含VH区氨基酸序列，该VH区氨基酸序列含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3；和VL区氨基酸序列，该VL区氨基酸序列含有SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3，以及具有选自以下的氨基酸序列的LCDR1：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:19(RSSQSLVHX1NX2NTYLH，其中SEQ ID NO:19的X1是P或S并且SEQ ID NO:19的X2是R、T或G)、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
本发明结合分子优选地包含免疫球蛋白Fc结构域或其保留结合一种或多种Fc受体的能力的片段。例如，该结合分子可以包含人IgG1Fc结构域或其片段。本发明结合分子优选地是无岩藻糖基化的。例如，结合分子可以在氨基酸位置297处是无岩藻糖基化的。本发明结合分子可以以组合物存在，该组合物包含所述结合分子的多个拷贝，其中该组合物中该结合分子的这些拷贝中的至少50％、75％、90％、95％、98％、99％或100％是无岩藻糖基化的。
在另一方面，本发明提供了一种结合分子，该结合分子结合CCR9，其中该结合分子不与本发明的另一种结合分子竞争结合CCR9，诸如不与如上所述的结合分子竞争结合CCR9，诸如不与如本文描述用于在疗法中使用的结合分子竞争结合CCR9。此方面的结合分子可以用于确定已经与本发明结合分子接触的样品中CCR9+细胞的丰度。
类似地，本发明提供了一种评估本发明结合分子对CCR9表达细胞的耗尽的方法，该方法包括：(i)使所述结合分子在以下条件下与细胞群体接触，其中该细胞群体包含CCR9表达细胞和免疫效应细胞，这些条件适于允许这些效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；(ii)使所述细胞群体与结合CCR9并且不与步骤(i)的该结合分子竞争结合CCR9的结合分子接触；(iii)检测该细胞群体中被(ii)的该结合分子结合的CCR9表达细胞；(iv)将步骤(iii)中检测到的CCR9表达细胞的量与步骤(i)中使用的该原始细胞群体中CCR9表达细胞的量进行比较，并且从而确定在步骤(i)中耗尽的CCR9表达细胞的量。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码任一种本发明结合分子。还提供了一种载体，该载体包含与启动子可操作地缔合的本发明多核苷酸。还提供了一种载体，该载体包含编码本发明结合分子的VH区的多核苷酸和编码本发明结合分子的VL区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。
本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明多核苷酸或本发明载体。还提供了一种产生本发明结合分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达本发明多核苷酸或本发明载体。
本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明结合分子、和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明还涉及在医学中使用本发明结合分子，诸如用于在疗法中使用的本发明结合分子。本发明涉及通过包括以下的方法治疗受试者中的CCR9介导的疾病或病症：向该受试者施用有效量的本发明结合分子或本发明组合物。本发明还涉及通过包括以下的方法治疗受试者中的CCR9介导的疾病或病症：向该受试者施用有效量的结合CCR9的结合分子，其中所述结合分子能够(i)抑制CCL25与CCR9的结合；和(ii)介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
如本文所述的结合分子还可以用于检测CCR9。例如，本发明提供了一种用于检测样品中CCR9多肽的存在的方法，该方法包括：(a)
使样品与结合CCR9的结合分子诸如任一种本发明结合分子或如本文所述的结合分子接触，以提供结合分子-抗原复合物；(b)检测所述结合分子-抗原复合物的存在或不存在；(c)其中该结合分子-抗原复合物的存在确认了CCR9多肽的存在。
本发明涉及改善的抗CCR9抗体和在炎性肠病治疗中的用途。本发明特别地涉及特异性结合C-C基序趋化因子受体9(CCR9)的人源化无岩藻糖基化单克隆抗体。经由其Fc受体功能性，该抗体与该CCR9受体的结合起始ADCC应答，导致CCR9表达细胞群体的耗尽。本发明抗体是人源化的、CDR优化的。这些抗体是无岩藻糖基化的，而没有效力的任何丧失。
4附图说明
图1：各种细胞类型中的CCR9表达。
图1A：CCR9在来自食蟹猴和人细胞血液、肠系膜淋巴结(仅食蟹猴)、结肠、回肠和胸腺的CD4+细胞中的表达；图1B：CCR9在健康和IBD患者的回肠(左)和结肠(右)中的B细胞中的表达；图1C：CCR9在来自健康或IBD患者的结肠或回肠的T效应细胞和Treg中的表达。
图2：在CD4+T细胞中CCR9与促炎细胞因子的关联性。
图2A：CCR9-和CCR9+细胞中的IFN-γ、IL-4和IL-17表达；图2B：在CD4+CCD9-细胞与CD4+CCR9+细胞之间图2A中评估的细胞因子的表达水平的倍数变化。
图3：九种抗CCR9抗体的可变区的比对氨基酸序列
图3A：VH区；图3B：VL区。CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的位置以下划线指示。也指示了框架(FW)区的位置。
图4：抗体AB1020243、该抗体的人源化形式(AB1020243-fgl)和抗体的两种CDR优化形式(243LO0326和243LO0331)的比对VH和VL区
图5：抗CCR9抗体与表达或不表达CCR9的细胞的结合
图5A：与Molt 4细胞系的结合；图5B：与Molt 4和Jurkat细胞系的结合
图6：在HEK细胞中AB1020243与不同形式的CCR9的结合
作为对照，在未用CCR9转染的HEK细胞(亲本HEK)中评估结合，并且然后还在过表达人CCR9A(Hu A HEK)、人CCR9B(Hu B HEK)、食蟹猴CCR9(Cyno HEK)、小鼠CCR9(小鼠HEK)和大鼠CCR9(大鼠HEK)的HEK细胞中评估了结合。
图7：通过与表达CCR9A的HEK细胞(顶部)或Molt 4细胞(底部)一起预孵育的无岩藻糖基化抗CCR9抗体对NK细胞的激活。
图8：用抗CCR9抗体的处理对CCR9+CD4+PBMC的数量的影响。
图9：嵌合抗体AB1020243及其人源化形式与各种配体的结合的比较。
图9A：人CCR9B；图9B：食蟹猴CCR9；图9B：CXCR1；图9D：CXCR2；图9E：CCR5；图9F：CCR8；图9G：未用CCR9转染的HEK细胞。
图10：AB1020243抗体与其人源化形式的比较
图10A：在结合Molt 4细胞系之后的NK细胞激活；图10B：人源化和嵌合AB1020243无岩藻糖基化(afuc)抗体的动力学特性。
图11：抗CCR9抗体与CCL25竞争结合CCR9的能力。
图12：243LO0326和AB1020243与配体的结合
图12A：人CCR9A；图12B：人CCR9B；图12C：食蟹猴CCR9A；图12D：CCR5；图12E：CCR8；图12F：CXCR1；和图12F：CXCR2。
图13：随时间在细胞表面处结合的抗体AB1020243或抗体243LO0326的量
随时间在细胞表面处结合的抗体AB1020243或抗体243LO0326的量(图13A)和随时间抗体或CCL25治疗对细胞表面处的CCR9受体水平的影响(图13B)。
图14：抗CCR9抗体在杀伤Molt 4细胞方面的作用
图14A：PBMC和Jurkat细胞(图14B)；和人或食蟹猴PBMC(图14C)。
图15：岩藻糖基化对效力的影响
图15B：无岩藻糖基化对ADDC的影响。图15A：岩藻糖基化与无岩藻糖基化物质在岩藻糖基化加标研究中的ADCC活性。RP：相对效力。
图16：CCR9+T细胞的靶向体内耗尽
图16A：243LO0326的静脉内注射对食蟹猴的血液中CCR9+记忆CD4+T细胞的数量的影响。图16B：高剂量和低剂量的243LO0326在2天内减少食蟹猴的外周血中的CDR4+CCR9+细胞。图16C：高剂量和低剂量的243LO0326降低食蟹猴的回肠中的CDR4+CCR9+细胞，如通过FACS在第15天测量的。图16D：高剂量和低剂量的243LO0326降低食蟹猴的肠道粘膜中的CDR4+CCR9+细胞，如通过IHC在第15天测量的。
图17：CCR9+肠道淋巴细胞的选择性耗尽
图18：243LO0326对从IBD患者获取的人肠道外植体中的IBD标记物的影响。
图18A：CCR9水平；图18B：IL-6水平；图18C：GM-CSF水平；图18D：IL-22水平。
图19：阻断CCR9内化
243LO0326抑制CCL25诱导的CCR9内化。
图20：CCR9A和CCR9B比对
5具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本披露内容所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第20版,John Wiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本披露内容中所使用的许多术语的通用词典。
本披露内容并不受本文所披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露内容的实施例的实践或测试。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
本文所提供的标题不是对本披露内容的各个方面或实施例的限制。
在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本披露内容和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性实施例之前，应理解本披露内容并不限于所描述的具体实施例，因而这些实施例可以变化。还应理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露内容的范围仅由所附权利要求限定。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有明确规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围被涵盖在本披露内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本披露内容中，但依据所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下，将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本披露内容中。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种药剂”包括多种此类药剂并且提及“该药剂”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种药剂及其等效物，等等。
“约”通常可以意指在给定测量性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值或值范围的20％内、典型地在10％内、更典型地在5％内。优选地，术语“约”在本文中应被理解为使用的数字的数值的正或负(±)5％，优选±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％、±0.1％。
本文描述为“包括/包含(comprising)”一个或多个特征的实施例也可以被认为是“由此类特征组成”或“主要由此类特征组成”的相应实施例的披露内容。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更特别地在人体内使用。
浓度、量、体积、百分比和其他数值可以以范围形式来呈现。还应理解，这种范围形式仅仅是为了方便和简洁而使用，并且应被灵活地解释为不仅包括明确列举为范围的限值的数值而且包括包含在该范围内的所有单独的数值或子范围，就像每个数值和子范围被明确地列举一样。
术语“表位”是指能够结合本发明结合分子(例如，被其结合)的靶蛋白区(例如，多肽)。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所使用的，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持更长时间的结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中的任何方法均可以用于本发明的目的。
结合分子的效力可以表示为IC50值。IC50是结合分子的中位抑制浓度。在功能测定中，IC50是将生物应答降低其最大值的50％的浓度。IC50可以通过本领域已知的任何数目的手段来计算。
结合分子的效力可以表示为EC50值。在功能测定中，EC50是在指定暴露时间后诱导基线与最大值之间的中位应答的浓度。EC50可以通过本领域已知的任何数目的手段来计算。
5.1结合分子
本发明涉及结合CCR9的结合分子。趋化因子受体9CCR9(也称为CDw199和GPR-9-6)是β趋化因子受体家族的成员。CCR9组织化为15个结构域，对应于一个N末端细胞外结构域(Nt)、七个跨膜结构域、三个细胞内结构域、三个细胞外结构域和一个细胞内C末端结构域(Ct)。在人中，CCR9以两种同种型CCR9A和CCR9B存在。同种型A具有另外的12个N末端氨基酸并且与同种型B相比对配体CCL25具有更高亲和力。报道同种型A和B以10:1的比率共表达。先前所述的抗CCR9抗体91R和92R仅结合同种型CCR9A，并且不结合CCR9B[4]。
不受理论的束缚，本发明诸位发明人的观察结果，即与CCR9阴性CD4 T淋巴细胞相比肠道中较高比例的CCR9阳性CD4 T淋巴细胞共表达促炎细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17，表明CCR9可以鉴定造成IBD的发病的CD4 T淋巴细胞。
CCR9的RNA、DNA和氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且可以在许多数据库中(例如，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)和UniProt的数据库中)找到。在UniProt找到的这些序列的实例是人CCR9A的P51686-1和人CCR9B的P51686-2；食蟹猴CCR9的Q0H741；小鼠CCR9的Q9WUT7；以及大鼠CCR9的Q8CH33。
在一些实施例中，本发明结合分子结合人CCR9。在一些实施例中，结合分子结合人CCR9A和/或人CCR9B。在一些实施例中，结合分子结合人CCR9A并且结合人CCR9B。
在一些实施例中，结合分子结合来自非人哺乳动物物种，诸如来自非人灵长类动物的CCR9。在一些实施例中，结合分子结合食蟹猴CCR9。在一些实施例中，结合分子结合人和食蟹猴CCR9，诸如结合人CCR9A和人CCR9B以及食蟹猴CCR9。
在一些实施例中，结合分子不结合小鼠和/或大鼠CCR9。在一些实施例中，结合分子结合人和食蟹猴CCR9，诸如人CCR9A和人CCR9B以及食蟹猴CCR9，但不结合小鼠或大鼠CCR9。
在一些实施例中，结合分子选择性地(在本文中也可互换地称为特异性)结合CCR9。关于选择性结合，应理解结合分子的CDR一起结合CCR9，而与任何其他分子没有显著交叉反应性。具体地，选择性地结合CCR9的结合分子可以与任何其他细胞因子受体具有不显著的交叉反应性。选择性地结合CCR9的结合分子可以与CCR5、CCR8、CXCR1和CXCR2中的任何一种、任何两种、任何三种或全部四种没有显著交叉反应性。例如，在一些实施例中，结合分子不结合CCR5、CCR8、CXCR1或CXCR2。
在一些实施例中，选择性地结合人CCR9，诸如人CCR9A和/或人CCR9B的结合分子可以与来自另一物种的CCR9，诸如与小鼠和/或大鼠CCR9没有显著交叉反应性。在一些实施例中，选择性地结合人CCR9的结合分子可以与亲密相关CCR9分子诸如食蟹猴CCR9具有交叉反应性，但可以与更远相关的CCR9诸如小鼠和/或大鼠CCR9没有显著交叉反应性。
交叉反应性可以通过任何合适的方法来评估。例如，结合可以通过测定结合分子与表达感兴趣的受体的过表达细胞系的结合来测量。结合也可以通过放射免疫测定(RIA)、(使用重组CCR9作为分析物并且结合分子作为配体，或反之亦然)、ForteBio Octet系统或本领域已知的其他结合测定来测量。通过非限制性举例的方式，如果结合分子与它结合CCR9至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％强地结合除CCR9之外的分子，则结合分子与其他分子的交叉反应性可以被认为显著的。选择性地结合CCR9的结合分子可以以它结合CCR9的强度的小于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％结合另一分子，诸如不同的细胞因子受体，诸如CCR5、CCR8、CXCR1和CXCR2中的任何一种、任何两种、任何三种或全部四种。优选地，结合分子以它结合CCR9的强度的小于20％、小于15％、小于10％或小于5％、小于2％或小于1％结合其他分子。在本文中使用的情况下，CCR9优选地是天然存在的CCR9，诸如人CCR9，诸如人CCR9A和/或人CCR9B。
在一些实施例中，结合分子结合表达CCR9的细胞。结合分子可以结合存在于细胞的细胞膜中的CCR9受体。细胞可以是天然表达CCR9的细胞，或者细胞可以经工程化以表达CCR9，诸如通过在允许表达CCR9的条件下引入编码CCR9的核酸进行。细胞可以经工程化以过表达CCR9，使得工程化细胞系与相应的未工程化细胞相比表达较高水平的CCR9。细胞可以表达人CCR9A或人CCR9B。
细胞可以是已经工程化以表达CCR9，诸如人CCR9A和/或人CCR9B的HEK细胞系。
Molt 4细胞系是来自急性成淋巴细胞性白血病的人T淋巴细胞细胞系，该细胞系天然表达高水平的CCR9。Molt 4细胞系可从ATCC，CRL-1582获得。在一些实施例中，结合分子结合Molt 4细胞。在一些实施例中，结合分子通过以下方式结合Molt 4细胞：结合所述Molt4细胞的表面上的CCR9或所述Molt 4细胞的细胞膜中存在的CCR9。
在一些实施例中，结合分子不结合不表达CCR9的细胞，诸如Jurkat细胞。Jurkat细胞系可从ATCC作为Jurkat，克隆E6.1获得。在一些实施例中，结合分子以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.5nM、≤0.1nM或≤10pM的解离常数(KD)与CCR9(例如，人CCR9)结合。在一些实施例中，结合分子以下述KD结合CCR9(例如，Molt 4细胞上存在的CCR9)：在约0.01nM至约0.45nM之间、在约0.025nM至约0.25nM之间或在约0.05nM至约0.1nM之间。在一些实施例中，结合分子以约0.09nM的KD结合CCR9(例如，Molt 4细胞上存在的CCR9)。
在一些实施例中，结合分子以下述KD结合CCR9(例如，Molt 4细胞上存在的CCR9)：在约2nM至约5nM之间、在约2.5nM至约4nM之间或在约3nM至约3.5nM之间。在一些实施例中，结合分子以约3.4nM的KD结合CCR9(例如，Molt 4细胞上存在的CCR9)。
KD测量(结合亲和力)可以通过本领域已知的任何合适的测定进行。合适的测定包括可经由Ligand Tracer系统、KinExA系统(例如，KinExA 3100、KinExA 3200或KinExA4000)(赛必因仪器公司(Sapidyne Instruments)，爱达荷州(Idaho))或ForteBio Octet系统进行的亲和力测定。
在一些实施例中，结合分子是CCR9拮抗剂。例如，结合分子可以防止或抑制CCR9的正常功能。例如，结合分子可以通过拮抗细胞上存在的CCR9来防止或抑制CCR9表达细胞的迁移。
在一些实施例中，结合分子抑制配体与CCR9的结合。例如，在一些实施例中，结合分子结合CCR9并且阻断或抑制配体与CCR9分子的结合。此结合可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)来评估。
结合分子可以是CCR9的竞争性抑制剂。例如，结合分子可以与CCR9配体竞争结合CCR9。竞争性结合可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)来评估。
在一些实施例中，CCR9的配体是CCL25。CCL25(也称为TECK)是属于CC趋化因子家族的细胞因子。CCL25的RNA、DNA和氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且可以在许多数据库中(例如，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)和UniProt的数据库中)找到。在UniProt找到的这些序列的实例是人CCL25的O15444；小鼠CCL25的O35903；大鼠CCL25的Q32PX4以及食蟹猴CCL25的A0A2K5TSD9和A0A2K5TSC0。
在一些实施例中，结合分子阻断或抑制CCL25与CCR9的结合。例如，在本发明结合分子的存在下，CCL25可以具有降低的与CCR9的结合。在一些实施例中，结合分子能够结合细胞的表面或膜上存在的CCR9并抑制CCL25与细胞上的CCR9的结合。
在一些实施例中，结合分子能够防止或抑制它所结合的CCR9表达细胞的迁移。例如，与不被本发明结合分子结合的细胞相比，被本发明结合分子结合的细胞可以不太高效地响应于刺激物。在一些实施例中，结合分子防止或抑制CCR9表达细胞响应于CCL25的迁移。在一些实施例中，结合分子能够防止或抑制CCR9表达细胞从外周迁移至受试者的肠道。
在一些实施例中，本发明结合分子能够诱导它所结合的CCR9表达细胞的死亡。例如，在一些实施例中，结合分子能够介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施例中，结合分子能够介导针对它所结合的CCR9表达淋巴细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所使用的，“介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“介导ADCC”意指结合分子能够诱导ADCC。
ADCC是细胞介导的免疫防御的机制，由此免疫效应细胞被激活以裂解其膜表面抗原已经被结合分子结合的靶细胞。此类免疫效应细胞的实例包括自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。因此，在一些实施例中，结合分子能够诱导这种免疫效应细胞的激活。例如，本发明结合分子可以能够在结合分子与CCR9表达细胞结合时诱导这种免疫效应细胞的激活。
在一些实施例中，本发明结合分子能够耗尽包含CCR9表达细胞和免疫效应细胞的细胞群体中的CCR9表达细胞。
结合分子诱导它所结合的CCR9表达细胞的死亡、耗尽该表达细胞或介导针对该表达细胞的ADCC的能力可以使用本文所述的任一种方法确定。例如，可以将本发明结合分子与PBMC一起孵育，并且使用非竞争性CCR9结合分子确定在孵育期结束时剩下的CD4+CCR9+细胞的百分比。可以使用不同浓度的结合分子来计算结合分子的浓度依赖性杀伤作用。根据此，可以计算结合分子的EC50。如本文所使用的，EC50可以基于在本发明结合分子与CD4+CCR9+细胞的结合之后PBMC对CD4+CCR9+细胞的杀伤来计算。
在一些实施例中，本发明结合分子(例如如本文所述测量的)的EC50小于100nM，诸如小于50nM、小于25nM、小于10nM或小于5nM。EC50可以小于3nM、小于2nM、小于1nM、小于500pM或小于250pM。EC50可以是从约2pM至约200pM，诸如从约3.5pM至约200pM。在一些实施例中，EC50是从约1pM至约5nM，诸如从约4pM至约3nM。在一些实施例中，EC50是从约2nM至约3nM，诸如从约2.5nM至约3nM，诸如约2.6nM。在一些实施例中，EC50是从约0.25nM至约2.5nM，诸如从约0.5nM至约1nM，诸如约0.5nM。在一些实施例中，EC50是从约50pM至约250pM，诸如约150pM至约250pM，诸如约200pM。在一些实施例中，EC50是从约3.5pM至约50pM，诸如从约3.5pM至约25pM。在一些实施例中，EC50是从约3.5pM至约5pM或从约4pM至约10pM。在一些实施例中，EC50是从约6pM至约60pM，诸如从约25pM至约60pM、优选地从约25pM至约35pM诸如约30pM。
在一些实施例中，结合分子与人CCR9结合时的EC50是从约3.5pM至约10pM，诸如从约4pM至约5pM。在一些实施例中，结合分子与食蟹猴CCR9结合情况下的EC50是从约6pM至约60pM，诸如从约25pM至约60pM、优选地从约25pM至约35pM诸如约30pM。
为了起始ADCC，结合分子可以使免疫效应细胞与CCR9表达细胞交联。因此，在一些实施例中，本发明结合分子能够使免疫效应细胞与CCR9表达细胞交联。例如，结合分子可以能够通过结合免疫效应细胞上的Fc受体使免疫效应细胞与CCR9表达细胞交联。存在多种对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。因此，在一些实施例中，结合分子能够结合Fc受体。在一些实施例中，结合分子能够结合FcγR，诸如选自FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb的受体。在一些实施例中，结合分子能够结合FcγRIIIa。在一些实施例中，结合分子能够结合免疫效应细胞上存在的Fc受体。
结合分子可以经由结合分子中存在的Fc结构域而被免疫效应细胞上的Fc受体结合。因此，在一些实施例中，本发明结合分子包含能够结合Fc受体，诸如如上所定义的Fc受体的区。在一些实施例中，结合分子包含免疫球蛋白Fc结构域或其保留结合一种或多种Fc受体诸如如上所定义的一种或多种Fc受体的能力的片段。如本文所使用的，术语“Fc结构域”是指开始于铰链区中并且结束于抗体的C末端的单一免疫球蛋白重链的部分。因此，完全Fc结构域可以包含铰链(例如上部、中间和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域和CH3结构域的至少一部分。在一些实施例中，结合分子包含Fc结构域的同二聚体。在一些实施例中，结合分子包含结合CCR9的区，并且进一步包含这种免疫球蛋白Fc结构域或其片段。在一些实施例中，结合分子是免疫球蛋白分子或其片段，该免疫球蛋白分子或其片段包含结合CCR9的抗原结合区和结合如上所定义的一种或多种Fc受体的Fc结合区。
在一些实施例中，Fc结合区、免疫球蛋白Fc结构域或其片段是IgG Fc结构域或其片段，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域或其片段。在一些实施例中，Fc结合区、免疫球蛋白Fc结构域或其片段是IgG1 Fc结构域或其片段。在一些实施例中，Fc结合区、免疫球蛋白Fc结构域或其片段是人免疫球蛋白Fc结构域或其片段，诸如人IgG1 Fc结构域或其片段。在一些实施例中，结合分子包含具有SEQ ID NO:78中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白Fc结构域。例如，在一些实施例中，Fc结构域包含SEQ ID NO:78的氨基酸111-330。
本发明结合分子与免疫效应细胞上的Fc受体的结合可以使免疫效应细胞与结合分子的抗原结合部分所结合的细胞交联。因此，在一些实施例中，本发明结合分子能够诱导免疫效应细胞激活。在一些实施例中，通过结合分子进行的免疫效应细胞与CCR9表达细胞的交联激活效应细胞的ADCC。
免疫效应细胞激活可以通过本文所述的方法诸如通过体外ADCC生物测定来评估。简而言之，免疫效应细胞可以经修饰以表达报告物，诸如荧光素酶报告物，该报告物充当效应子功能的替代物。将包含这种报告物的免疫效应细胞添加至已经与结合分子一起预孵育的靶细胞。在效应子和靶细胞的孵育之后，定量报告功能(例如发光)。因此，这种方法可以用于鉴定能够激活免疫效应细胞的结合分子。例如，如果测定旨在评估结合分子激活免疫效应细胞的有效性，靶细胞可以是已知表达CCR9的细胞。这种方法可以用于鉴定表达CCR9的靶细胞。例如，如果测定旨在评估靶细胞是否表达CCR9，则结合分子可以是已知结合CCR9的结合分子，诸如本发明结合分子。
在一些实施例中，本发明结合分子具有如使用表达CCR9A的HEK细胞系确定的≤5nM，诸如≤3nM、≤2nM、≤1nM或≤0.5nM的NK细胞激活效力。在一些实施例中，本发明结合分子具有如使用Molt 4细胞系确定的0.8nM的NK细胞激活效力。在一些实施例中，通过效应细胞激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒性引起CCR9表达细胞的裂解。
对于被认为能够介导针对它所结合的CCR9表达细胞的ADCC的结合分子，结合分子应具有{≤20nM(如使用Molt 4细胞系确定的)或≤30nM(如使用表达CCR9A的HEK细胞系确定的)的免疫效应细胞激活效力(诸如NK细胞激活效力)和/或≤3nM的PBMC杀伤EC50。
在一些实施例中，本发明结合分子提供了改变的效应子功能，这些效应子功能进而影响结合分子的生物学概况。例如，免疫球蛋白分子的恒定区结构域的糖基化概况的改变可以增加修饰的结合分子的Fc受体结合。在其他情况下，符合本发明的恒定区修饰可以减弱补体结合。恒定区的又其他修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。类似地，根据本发明对恒定区的修饰可以容易地使用技术人员认知范围内的熟知的生物化学或分子工程技术进行。
因此，在一些实施例中，本发明结合分子可以具有增强的效应子功能，这些效应子功能增加结合分子与免疫效应细胞相互作用的能力，诸如增加结合分子使免疫效应细胞与被结合分子结合的CCR9表达细胞交联的能力、或增加选择结合分子诱导ADCC的能力。在一些实施例中，本文所提供的结合分子的免疫球蛋白Fc结构域与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致对一个或多个Fc受体、优选地一个或多个Fcγ受体的亲和力增加。在一些实施例中，免疫球蛋白Fc结构域与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性应答增强。
结合分子可以被制成具有改变的糖基化类型，诸如岩藻糖基残基量降低的无岩藻糖基化/低岩藻糖基化结合分子或等分GlcNac结构增加的结合分子。已经证明此类改变的糖基化概况增加结合分子的ADCC能力。这些修饰可以通过本领域中的任何已知手段，诸如本文实例部分中所述的那些来实现。
因此，在一些实施例中，本文所提供的结合分子可以是无岩藻糖基化的。结合分子可以不包含岩藻糖。结合分子可以包含缺乏核心岩藻糖糖单元的至少一个N连接聚糖。
在一些实施例中，结合分子在EU位置297(在本文中也称为位置N297)处是无岩藻糖基化的(Edelman等人,1969,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]63(1):78-85)。即，位置N297处的N连接聚糖可以不存在、可以缺乏岩藻糖、或可以缺乏核心岩藻糖糖单元。氨基酸位置N297处的N连接聚糖对应于SEQ ID NO:78中的位置N180。在一些实施例中，结合分子包含SEQ ID NO:78，其中SEQ ID NO:78的N180是无岩藻糖基化的。在一些实施例中，结合分子包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸111-330的Fc结构域，其中SEQ ID NO:78的N180是无岩藻糖基化的。
如本文所述的，结合分子可以包含Fc结构域或其片段，诸如hIgG1 Fc结构域或其片段。在一些实施例中，结合分子包含无岩藻糖基化Fc结构域或其片段，诸如无岩藻糖基化hIgG1 Fc结构域或其片段。如本文所述的任一种Fc结构域或Fc结构域片段可以以无岩藻糖基化形式存在。Fc结构域或片段可以不包含岩藻糖。Fc结构域或片段的至少一个N连接聚糖可以缺乏核心岩藻糖糖单元。Fc结构域或片段可以在EU位置297处是无岩藻糖基化的。在一些实施例中，结合分子包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸111-330的无岩藻糖基化Fc结构域。例如，结合分子可以包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸111-330的无岩藻糖基化Fc结构域，其中SEQ ID NO:78的N180是无岩藻糖基化的。在一些实施例中，结合分子包含无岩藻糖基化Fc结构域和非无岩藻糖基化Fc结构域。例如，结合分子可以包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸111-330的无岩藻糖基化Fc结构域，其中SEQ ID NO:78的N180是无岩藻糖基化；和含有SEQ ID NO:78的氨基酸111-330的非无岩藻糖基化Fc结构域。在一些实施例中，结合分子是完全无岩藻糖基化的。例如，结合分子的全部N连接聚糖可以是无岩藻糖基化的。在一些实施例中，结合分子的Fc结构域是完全无岩藻糖基化的。例如，Fc结构域的全部N连接聚糖可以是无岩藻糖基化的。
在一些实施例中，结合分子以组合物存在，该组合物包含所述结合分子的多个拷贝，其中组合物中结合分子的拷贝中的至少50％、75％、90％、95％、98％、99％或100％是无岩藻糖基化的，例如缺乏岩藻糖、在至少一种N连接聚糖中缺乏核心岩藻糖糖单元、或在如本文所述的EU位置297处无岩藻糖基化。在这种组合物中，结合分子具有如本文所披露的氨基酸序列，但组合物中结合分子的拷贝可以在其糖基化模式上变化，例如一些拷贝可以包含岩藻糖并且一些拷贝可以缺乏岩藻糖，例如在至少一个N连接聚糖中缺乏核心岩藻糖糖单元、或在如本文所述的EU位置297处无岩藻糖基化。
在本文所披露的任一个实施例中，CCR9表达细胞是肠道常驻细胞。在本文所披露的任一个实施例中，CCR9表达细胞是外周血细胞。在本文所披露的任一个实施例中，CCR9表达细胞表达CD4、CD8、CD20、CD19、CD69和/或CD103。在本文所披露的任一个实施例中，CCR9表达细胞表达GM-CSF、IL-22、TNFα、IL-6、IFNγ、IL-4和/或IL-17。例如，CCR9表达细胞可以表达IFNγ、IL-4和/或IL-17。在本文所披露的任一个实施例中，CCR9表达细胞是淋巴细胞，例如肠道常驻淋巴细胞或外周血淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞是T淋巴细胞诸如CD4+T淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞是B淋巴细胞。
在本文所披露的任一个实施例中，免疫效应细胞是NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其组合。在本文所披露的任一个实施例中，免疫效应细胞是NK细胞。
本发明结合分子可以具有以上陈述的功能特征中的任何一种或多种。另外或替代性地，它可以具有下面陈述的结构(例如序列)特征中的任何一种或多种。
图3和图4展示了来自例示性本发明结合分子的序列。图3和图4中展示的结合分子是抗体，其中抗体包含如这些图中展示的可变重结构域(VH)和可变轻结构域(VL)区序列。本发明结合分子可以包含图3或图4中展示的任何抗体的VH和VL。本发明结合分子可以包含图4中展示的任何抗体的VH和VL。
对于示例性本发明结合分子，表3提供了VH和VL区的氨基酸序列，并且表4提供了CDR序列。本发明结合分子可以包含表3中展示的任何结合分子的VH和VL。本发明结合分子可以包含表4中展示的任何结合分子的一组六个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
本发明结合分子可以包含如图3或图4中所示的任一种抗体的CDR序列。例如，结合分子可以包含如针对图3或图4中展示的任一种抗体所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个。本发明结合分子可以包含如图4中所示的任一种抗体的CDR序列。例如，结合分子可以包含如针对图4中展示的任一种抗体所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个。本发明结合分子可以包含如表4中展示的一组六个CDR。例如，结合分子可以包含如针对表4中展示的任一种抗体所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个。
本发明结合分子可以包含具有一组CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变(VH)区和具有一组CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变(VL)区。因此，结合分子可以包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含如针对图3或图4中展示的任一种抗体所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含如针对图3或图4中展示的相同抗体所指示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。结合分子可以包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含如针对图4中展示的任一种抗体所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含如针对图4中展示的相同抗体所指示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。结合分子可以包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含如针对表4中展示的任一种抗体所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含如针对表4中展示的相同抗体所指示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
例如，在一些实施例中，结合分子包含：
a)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3，其中SEQ ID NO:4的X1和X2是任何氨基酸；
b)SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2、SEQ ID NO:9的HCDR3、SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQ ID NO:12的LCDR3；或者
c)SEQ ID NO:13的HCDR1、SEQ ID NO:14的HCDR2、SEQ ID NO:15的HCDR3、SEQ IDNO:16的LCDR1、SEQ ID NO:17的LCDR2和SEQ ID NO:18的LCDR3。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的VL区，其中SEQ ID NO:4的X1和X2是任何氨基酸；
b)含有SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2和SEQ ID NO:9的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQ ID NO:12的LCDR3的VL区；或者
c)含有SEQ ID NO:13的HCDR1、SEQ ID NO:14的HCDR2和SEQ ID NO:15的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:16的LCDR1、SEQ ID NO:17的LCDR2和SEQ ID NO:18的LCDR3的VL区。
结合分子可以包含SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:5的LCDR2、SEQ ID NO:6的LCDR3和具有选自以下的氨基酸序列的LCDR1：(a)SEQ ID NO:4；(b)SEQ ID NO:19；(c)SEQ ID NO:20；(d)SEQ ID NO:21；以及(e)SEQ IDNO:22，其中SEQ ID NO:4的X1和X2是任何氨基酸，并且其中SEQ ID NO:19的X1是P或S且SEQID NO:19的X2是R、T或G。因此，在一些实施例中，结合分子包含：
a)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3，其中SEQ ID NO:4的X1和X2是任何氨基酸；
b)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:19的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3，其中SEQ ID NO:19的X1是P或S并且SEQ ID NO:19的X2是R、T或G；
c)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:20的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
d)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:21的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3；或者
e)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2、SEQ ID NO:3的HCDR3、SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的VL区，其中SEQ ID NO:4的X1和X2是任何氨基酸；
b)含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:19的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的VL区，其中SEQ ID NO:19的X1是P或S并且SEQ ID NO:19的X2是R、T或G；
c)含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:20的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的VL区；
d)含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:21的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的VL区；或者
e)含有SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3的VH区，和含有SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3的VL区。
本发明涵盖本文所定义的结合分子，这些结合分子具有所列举CDR序列(参考结合分子)以及其功能变体。功能变体结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性概况。例如，功能变体可以结合与参考结合分子相同的天然存在的CCR9形式，诸如结合来自以下列表的相同分子亚组：人CCR9A、人CCR9B、食蟹猴CCR9、大鼠CCR9和小鼠CCR9。当与参考结合分子相比时，功能变体对于靶抗原可以具有不同的亲和力，但基本上相同的亲和力是优选的。
在一些实施例中，当与相应的参考CDR序列相比时，参考结合分子的功能变体在一个或多个CDR处显示序列变异。因此，功能结合分子变体可以包含CDR的功能变体。在CDR序列的背景下使用术语“功能变体”时，这意味着当与相应的参考CDR序列相比时，该CDR具有1、2或3个氨基酸差异，并且当与其余5个CDR(或其变体)组合时，使变体结合分子能够结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性概况。
在一些实施例中，结合分子包含：当与相应的参考CDR序列相比时具有1、2或3个氨基酸差异的轻链CDR1；当与相应的参考CDR序列相比时具有1、2或3个氨基酸差异的轻链CDR2；当与相应的参考CDR序列相比时具有1、2或3个氨基酸差异的轻链CDR3；当与相应的参考CDR序列相比时具有1、2或3个氨基酸差异的重链CDR1；当与相应的参考CDR序列相比时具有1、2或3个氨基酸差异的重链CDR2；以及当与相应的参考CDR序列相比时具有1、2或3个氨基酸差异的重链CDR3；其中结合分子结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性。
在一些实施例中，结合分子包含：当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR1；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR2；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR3；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR1；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR2；以及当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的重链CDR3；其中结合分子结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性概况。在一些实施例中，结合分子包含当与相应的参考CDR序列相比时具有最多2个氨基酸差异的轻链CDR1。
结合分子可以包含：当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR1；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR2；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的轻链CDR3；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR1；当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR2；以及当与相应的参考CDR序列相比时具有最多1个氨基酸差异的重链CDR3；其中结合分子结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性概况。
在一些实施例中，当与相应的参考结合分子相比时，变体结合分子可以在其CDR中具有总计最多5、4或3个氨基酸差异，条件是每个CDR存在最多3个、最多2个或最多1个氨基酸差异。优选地，当与相应的参考结合分子相比时，变体结合分子在其CDR中具有总计最多2个(更优选地最多1个)氨基酸差异，条件是每个CDR存在最多2个氨基酸差异。更优选地，当与相应的参考结合分子相比时，变体结合分子在其CDR中具有总计最多2个(更优选地最多1个)氨基酸差异，条件是每个CDR存在最多1个氨基酸差异。
例如，这种结合分子可以包含参考结合分子(诸如图3或图4或表3中展示的任一种抗体)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个，其中与参考结合分子的对应CDR序列相比，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任何一个或多个包含1、2或3个氨基酸变化。结合分子可以包含参考结合分子(诸如图3或图4中展示的任一种抗体)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个，除了在所述CDR序列中的任一个中具有1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以在所述轻链CDR中的任何一个或多个和/或所述重链CDR中的任何一个或多个中包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以在HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任何一个或多个中包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以在LCDR1中包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。
前述内容可以应用于图3或图4或表4中展示的任一种抗体，或本文所述的任一种结合分子，其中氨基酸差异是相对于其CDR序列定义的，并且其中变体结合分子结合与所述结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出相同的抗原交叉反应性。因此，本文中的任一个实施例中的参考结合分子可以是具有图3或图4中展示的任一种抗体或表3的结合分子的VH和VL序列的抗体、或具有图3或图4或表4中展示的任一种抗体的六个CDR组的抗体。
氨基酸差异可以是氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，氨基酸差异是如本文所述的保守氨基酸取代。
在一些实施例中，结合分子包含如针对图3或图4或表4中展示的任一种抗体所指示的或如上所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个或其中任一个的功能变体。例如，这种结合分子可以包含如针对图3或图4或表4中展示的任一种抗体所指示的或如上所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个，其中与如图3或图4或表4或以上中所列举的相应序列相比，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的任何一个或多个包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以包含如针对图3或图4中展示的任一种抗体或表3的结合分子所指示的或如上所指示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中的全部六个，除了在所述CDR序列中的任一个中具有1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以在所述轻链CDR中的任何一个或多个和/或所述重链CDR中的任何一个或多个中包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以在HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任何一个或多个中包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。结合分子可以在LCDR1中包含1、2或3个氨基酸变化，例如取代。
本发明结合分子可以包含如图3或图4中所示的任一种抗体或表3的结合分子的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
例如，在一些实施例中，结合分子包含：
a)含有SEQ ID NO:51的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:52的VL区氨基酸序列；
b)含有SEQ ID NO:51的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:53的VL区氨基酸序列；
c)含有SEQ ID NO:51的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:54的VL区氨基酸序列；
d)含有SEQ ID NO:51的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:55的VL区氨基酸序列(DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVH X1NX2NTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTD FTLKISRVEAEDLGVFFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK，其中(a)X1和X2各自是任何氨基酸(SEQ IDNO:76)；或者(b)X1是P或S并且X2是R、T或G(SEQ ID NO:77))；或者
e)含有SEQ ID NO:56的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:57的VL区氨基酸序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)含有SEQ ID NO:58的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:59的VL区氨基酸序列；或者
b)含有SEQ ID NO:60的VH区氨基酸序列和含有SEQ ID NO:61的VL区氨基酸序列。
本发明涵盖如本文所述的结合分子，这些结合分子包含所列举VH和VL区序列(参考结合分子)以及其功能变体。功能变体结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性。当与参考结合分子相比时，功能变体对于靶抗原可以具有不同的亲和力，但基本上相同的亲和力是优选的。
结合分子的VH区序列可以与参考结合分子的对应VH区序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。结合分子的VL区序列可以与参考结合分子的对应VL区序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。
在一些实施例中，这种结合分子的CDR与参考结合分子的CDR相同，并且差异全部位于这些CDR之外，例如结合分子与参考结合分子之间的差异在VH和/或VL序列的框架区中。
在一些实施例中，这种结合分子的CDR是功能变体，如上所述的。在一些实施例中，与相应的参考结合分子的VH和/或VL序列相比，这种结合分子包含在一个或多个CDR中的氨基酸差异和在一个或多个框架区中的氨基酸差异。
在一些实施例中，结合分子具有与参考结合分子相同的框架序列。在另一个实施例中，结合分子包含具有最多2个、优选地最多1个氨基酸差异的框架区(当与相应的参考框架序列相比时)。因此，每个框架区可以具有最多2个、优选地最多1个氨基酸差异(当与相应的参考框架序列相比时)。
在一些实施例中，当与相应的参考结合分子相比时，结合分子可以在其框架区中具有总计最多5、4或3个氨基酸差异，条件是每个框架区存在最多2个(优选地最多1个)氨基酸差异。当与相应的参考结合分子相比时，这种结合分子可以在其框架区中具有总计最多2个(更优选地最多1个)氨基酸差异，条件是每个框架区存在最多2个氨基酸差异。当与相应的参考结合分子相比时，这种结合分子在其框架区中具有总计最多2个(更优选地最多1个)氨基酸差异，条件是每个框架区存在最多1个氨基酸差异。
因此，结合分子可以包含如本文所述的VH区和VL区，其中：当与本文的参考结合分子的VH区相比时，VH区具有最多14个氨基酸差异(每个CDR中最多2个氨基酸差异，并且每个框架区中最多2个氨基酸差异)；并且当与本文的参考结合分子的VL区相比时，VL区具有最多14个氨基酸差异(每个CDR中最多2个氨基酸差异，并且每个框架区中最多2个氨基酸差异)；其中变体结合分子结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性。
所述变体VH或VL区可以被称为参考VH或VL区的“功能等效物”。
在一些实施例中，结合分子可以包含如本文所述的VH区和VL区，其中：当与本文的参考结合分子的VH区相比时，VH区具有最多7个氨基酸差异(例如每个CDR中最多1个氨基酸差异，并且每个框架区中最多1个氨基酸差异)；并且当与本文的参考结合分子的VL区相比时，VL区具有最多7个氨基酸差异(例如每个CDR中最多1个氨基酸差异，并且每个框架区中最多1个氨基酸差异)；其中变体结合分子结合与参考结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出与参考结合分子相同的抗原交叉反应性。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，其中(i)SEQ ID NO:55的X1和X2各自是任何氨基酸(SEQ ID NO:76)；或者(ii)SEQ ID NO:55的X1是P或S并且SEQ ID NO:55的X2是R、T或G(SEQ ID NO:77)。
例如，在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
例如，在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
c)在一些实施例中，结合分子包含：
d)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
e)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施例中，结合分子包含：
a)VH区，该VH区含有与SEQ ID NO:51、56、58、60的参考氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列或其功能变体；以及
b)VL区，该VL区含有与SEQ ID NO:52、53、54、55、57、59、61的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列或其功能变体，其中(i)SEQ ID NO:55的X1和X2各自是任何氨基酸(SEQ ID NO:76)；或者(ii)SEQ ID NO:55的X1是P或S并且SEQ ID NO:55的X2是R、T或G(SEQ ID NO:77)。
前述内容可以应用于图3或图4中展示的任一种抗体或表3的结合分子，或本文所述的任一种结合分子，其中氨基酸差异是相对于其VH和/或VL序列定义的，并且其中结合分子结合与所述结合分子相同的靶抗原，并且优选地表现出相同的抗原交叉反应性。因此，本文的任一个实施例中的参考结合分子可以是具有图3或图4中展示的任一种抗体或表3的结合分子的VH和VL序列的抗体。
氨基酸差异可以是氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，氨基酸差异是如本文所述的保守氨基酸取代。
本发明结合分子可以以分离的形式提供。
在一些实施例中，本发明结合分子是免疫球蛋白分子。在一些实施例中，结合分子是抗体或其抗原结合片段。
特别地，抗体是包含至少一个或两个重(H)链可变区(本文缩写为VH)以及至少一个或两个轻(L)链可变区(本文缩写为VL)的蛋白质。VH和VL区可以进一步细分为称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区，其间穿插有称为“框架区”(FW)的较保守区。框架区和CDR的范围已经被精确定义(参见，Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学目的的蛋白质序列],第5版,U.S.Department of Health and HumanServices[美国卫生与公众服务部],NIH公开号91-3242,1991；和Chothia,C.等人,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917,1987)。优选地，每个VH和VL区由三个CDR和四个FW构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。
抗体的重链或轻链可以进一步包含重链或轻链恒定区的全部或部分。在一些实施例中，结合分子包含SEQ ID NO:78的重链恒定区的全部或一部分和SEQ ID NO:79的轻链恒定区的全部或一部分。在一些实施例中，结合分子包含如表7中所示的重链恒定区和轻链恒定区。结合分子可以包含如表7中所示的重链恒定区和/或轻链恒定区的功能片段，诸如如本文所述的其中结合分子保留结合一种或多种Fc受体的片段。在一些实施例中，结合分子可以包含如表7中所示的重链恒定区和轻链恒定区，并且可以进一步包含如本文所披露的VH区和VL区，例如图3或图4中展示的任一种抗体或表1的结合分子的VH和VL序列。在一些实施例中，结合分子是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链由例如二硫键相互连接。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。在一些实施例中，结合分子具有SEQ ID NO:78的重链恒定区。轻链恒定区由一个结构域CL构成。在一些实施例中，结合分子具有SEQ ID NO:79的轻链恒定区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
当提及可变区中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用“Kabat编号系统”(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest[免疫学目的的序列],第5版,Public Health Service[公共卫生服务部],National Institutes ofHealth[国立卫生研究院],Bethesda[贝塞斯达],Md.[马里兰州](1991))。
在Kabat中的氨基酸位置编号是指在Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学目的的蛋白质序列],第5版Public Health Service[公共卫生服务部],National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda[贝塞斯达],Md.[马里兰州](1991)中用于汇编抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或向其中的插入的较少或另外氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FW残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。
可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端在利用Kabat编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环端点在32；如果只存在35A，则环端点在33；如果35A和35B都存在，则环端点在34)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被牛津分子公司(Oxford Molecular)的AbM抗体建模软件使用。下表列出了构成每个系统中的抗体可变区的氨基酸的位置。
表1：构成抗体的可变区的氨基酸的位置
区域 Kabat AbM Chothia
LCDR1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
LCDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
LCDR3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
HCDR11 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34
HCDR12 H31-H35 H26-H35 H26-H32
HCDR2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
HCDR3 H95-H102 H95-H102 H95-H102
1Kabat编号
2Chothia编号
免疫遗传学(IMGT)还提供了一种用于免疫球蛋白可变区(包括CDR)的编号系统。参见例如，Lefranc,M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学]27:55-77(2003)。IMGT编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，HCDR1在位置26至35处，HCDR2在位置51至57处，HCDR3在位置93至102处，LCDR1在位置27至32处，LCDR2在位置50至52处，并且LCDR3在位置89至97处。
术语“抗体”包括类型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。本发明结合分子可以是或可以包括全长抗体，或者可以是或可以包括其抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗原结合片段是指结合CCR9的抗体的一部分，例如，其中一个或多个免疫球蛋白链不是全长但结合CCR9的分子。在一些实施例中，抗原结合片段是选自以下中的一种或多种：Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段、sc(Fv)2片段、dAb片段、单链抗体或其组合。例如，在一些实施例中，抗原结合片段是Fab片段。在一些实施例中，结合分子包含Fab结构域。
本发明抗体或其抗原结合片段可以具有任何抗体形式。在一些实施例中，抗体具有以上所述的“常规”形式。替代性地，抗体在一些实施例中可以是Fab片段。根据本发明的抗体或抗原结合片段还可以是Fab′、Fv、scFv、Fd、V NAR结构域、IgNAR、胞内抗体、IgG CH2、微抗体、单结构域抗体、Fcab、scFv-Fc、F(ab′)2、di-scFv、双特异性T细胞衔接器F(ab')3、四抗体、三抗体、、双抗体、DVD-Ig、(scFv)2或mAb2。
在一些实施例中，结合分子是单克隆抗体(mAb)。在一些实施例中，结合分子是多克隆抗体。
“单克隆抗体”(mAb)是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，这些方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、和转基因动物。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是选自以下中的一种或多种：鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全人抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体或其组合。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体。在一些实施例中，本发明抗体不诱导抗人抗体应答，例如鼠抗人抗体应答。
本发明抗体及其抗原结合片段可以通过重组手段衍生自任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可以是小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、骆驼、驴、人或其嵌合形式。对于施用至人的用途，可以将非人衍生的抗体或抗原结合片段进行基因或结构改变以在施用至人患者时具有较低抗原性。
尤其优选的是人或人源化抗体，尤其是作为重组人或人源化抗体。术语“人源化抗体”是指衍生自非人(例如鼠)免疫球蛋白的抗体，该抗体经工程化成含有最小的非人(例如鼠)序列。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的具有所希望特异性、亲和性和能力的残基替换(Jones等人,1986,Nature[自然],321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323-327；Verhoeyen等人,1988,Science[科学],239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区残基被来自非人物种的具有所希望特异性、亲和性和能力的抗体中的相应残基替换。
人源化抗体可以通过在Fv框架区和/或替换的非人残基内的另外残基的取代来进一步修饰，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地是两个或三个)可变结构域，该可变结构域含有对应于非人类免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人类免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分、典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。
在一些实施例中，本发明抗体是人抗体。术语“人抗体”意指在人体中产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的在人体中产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如像包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
在一些实施例中，本发明抗体是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于衍生自具有所希望的特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)物种的抗体的可变区，而恒定区同源于衍生自另一种(通常为人)的抗体中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
存在五种主要类别的重链恒定区，分类为IgA、IgG、IgD、IgE和IgM，每一类具有通过同种型指定的特征性效应子功能。例如，将IgG分成称为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的四个亚类。Ig分子与多个类别的细胞受体相互作用。例如，IgG分子与三类Fcγ受体(FcγR)(即FcγRI、FcγRII和FcγRIII)相互作用，这些Fcγ受体对抗体的IgG类别具有特异性。已报道对于IgG与FcγR受体的结合重要的序列位于CH2和CH3结构域中。本发明抗体或其抗原结合片段可以是任何同种型，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及四链免疫球蛋白(Ig)结构的合成多聚体。在优选的实施例中，抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。抗体或抗原结合片段可以是任何IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在优选的实施例中，抗体或其抗原结合片段是IgG1或IgG2同种型的。
在一些实施例中，抗体包含为IgG同种型的重链恒定区。在一些实施例中，抗体包含为IgG同种型的重链恒定区的一部分。在一些实施例中，IgG恒定区或其一部分是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。优选地，IgG恒定区或其一部分是IgG1或IgG2恒定区。抗体分子还可以具有其他形式，例如具有YTE的lgG1(Dall'Acqua等人(2002)J.Immunology[免疫学杂志],169:5171-5180；Dall'Acqua等人(2006)JBiol.Chem.[生物化学杂志]281(33):23514-24)和/或Fc区中的TM突变(Oganesyan等人(2008)Acta Cryst[晶体学报]D64:700-4)。
本发明抗体或其抗原结合片段可以包含λ轻链或κ轻链。工程化抗体及其抗原结合片段包括其中已经对VH区和/或VL区内的框架残基进行修饰的那些。此类修饰可以改善抗体的特性，例如以降低抗体的免疫原性和/或改善抗体产生和纯化。
本发明结合分子包括本文所披露的结合分子的完整形式和修饰形式两者。例如，本发明结合分子可以功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价关联或其他方式)至一个或多个其他分子实体诸如药剂、检测剂和/或蛋白质或肽，该一个或多个分子实体可以介导本文所披露的结合分子与另一个分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)的缔合。检测剂的非限制性实例包括：酶，诸如碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)；染料；荧光标记或荧光剂，诸如荧光素及其衍生物、荧光染料、若丹明化合物及衍生物、GFP(GFP为“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰基、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺；荧光团，诸如镧系元素穴状化合物和螯合物，例如铕等(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)和CisBiointernational)；化学发光标记或化学发光剂，诸如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷类；生物发光标记，诸如荧光素酶和荧光素；敏化剂；辅酶；酶底物；放射性标记，包括但不限于溴77、碳14、钴57、氟8、镓67、镓68、氢3(氚)、铟111、铟113m、碘123m、碘125、碘126、碘131、碘133、汞107、汞203、磷32、铼99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168和钇199；颗粒，诸如乳胶或碳颗粒、金属溶胶、微晶、脂质体、细胞等，它们可以用染料、催化剂或其他可检测基团来进一步标记；分子，诸如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；毒素部分，例如像选自以下的组的毒素部分：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变型)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变型、肉毒毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素或其细胞毒性片段例如蓖麻毒素A、相思豆毒素或其细胞毒性片段、皂素或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段以及异株腹泻毒蛋白1或其细胞毒性片段。
本发明结合分子还包括衍生物，这些衍生物经修饰(例如，通过将任何类型的分子共价附接至结合分子)，使得共价附接不防止结合分子结合至其靶标(例如表位)或不以其他方式损害结合分子的生物活性。合适的衍生物可以通过包括但不限于以下的方法产生：岩藻糖基化、糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化和酰胺化。
另外的实施例是多特异性结合分子(双特异性、三特异性等)和例如与细胞毒性小分子的其他缀合物。本发明结合分子(包括本发明抗体)可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且它们的效用通过常规结合研究来确认—示例性方法描述于实例3和4中。举例来说，简单的结合测定是用抗体孵育表达抗原的细胞。如果将抗体用荧光团标记，则可以通过FACS分析来检测抗体与抗原的结合。
本发明抗体可以在多种动物中产生，包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猴或马。可以在用单独荚膜多糖或用多种荚膜多糖进行免疫后产生抗体。从这些动物中分离出的血液含有多克隆抗体—与相同抗原结合的多种抗体。也可以将抗原注射至鸡中以在蛋黄中产生多克隆抗体。为了获得对抗原的单一表位具有特异性的单克隆抗体，从动物中分离出分泌抗体的淋巴细胞，并且通过将它们与癌细胞系融合而使其永生化。融合的细胞被称为杂交瘤，并且在培养中会不断生长并分泌抗体。通过稀释克隆法分离单一杂交瘤细胞以生成均产生相同抗体的细胞克隆；这些抗体被称为单克隆抗体。用于产生单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的常规技术(参见例如，Making and Using Antibodies:A PracticalHandbook.[制备和使用抗体：实用手册]GC Howard.CRC Books[CRC书籍].2006.ISBN0849335280)。通常使用蛋白A/G或抗原亲和色谱法纯化多克隆和单克隆抗体。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以制备为单克隆抗CCR9抗体，该抗体可以使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein,Nature[自然]256:495(1975)描述的那些方法。使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生会特异性结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外被免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并且利用例如聚乙二醇与适合骨髓瘤细胞系融合，以形成然后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后可以在体外培养物中使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice[单克隆抗体：原理和实践],AcademicPress[学术出版社],1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤繁殖杂交瘤，这些杂交瘤产生特异性针对选定的抗原的单克隆抗体，如通过免疫沉淀、免疫印迹、或体外结合测定(例如，放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))所确定的。然后可以使用已知的方法从培养基或腹水中纯化单克隆抗体。
替代性地，结合分子(例如，单克隆抗体)还可以使用如在美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法制备。从成熟B细胞或杂交瘤细胞，诸如通过使用寡核苷酸引物(其特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因)的RT-PCR分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且使用常规程序测定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆至合适的表达载体中，这些表达载体在转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)中时，由这些宿主细胞产生单克隆抗体。此外，所希望物种的重组单克隆抗体或其抗原结合片段可以从表达所希望物种的CDR的噬菌体展示文库中分离，如以下文献所述：McCafferty等人,Nature[自然]348:552-554(1990)；Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)；以及Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581-597(1991)。
编码本发明结合分子的一种或多种多核苷酸可以进一步以多种不同的方式使用重组DNA技术修饰以产生替代性结合分子。在一些实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施例中，将恒定区截短或去除以产生所希望的单克隆抗体的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞。参见例如，Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Alan R.Liss[奥兰李斯公司],第77页(1985)；Boemer等人,J.Immunol.[免疫学杂志]147(1):86-95(1991)；美国专利5,750,373。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体，如例如在以下文献中所述的：Vaughan等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]14:309-314(1996)；Sheets等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],95:6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227:381(1991)；以及Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581(1991)。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于以下文献中：美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484、和7,264,963；以及Rothe等人,J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]376:1182-1200(2008)中，将这些文献中的每一篇通过援引以其全文并入。
亲和力成熟策略和链改组策略是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。参见Marks等人,BioTechnology[生物技术]10:779-783(1992)，将其通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域熟知的。人源化、表面重修或类似工程化抗体可以具有来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人类灵长动物或其他哺乳动物。这些非人氨基酸残基被通常称为“输入”残基的残基替换，这些残基典型地取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他合适的特征。合适地，CDR残基可以直接且最实质性地参与影响CCR9结合。因此，优选地保持非人或人CDR序列的一部分或全部，同时可变区和恒定区的非人序列可以被人氨基酸或其他氨基酸替换。
抗体还可以任选地被人源化、表面重修、工程化或人抗体工程化，其中保留针对抗原CCR9的高亲和力和他有利生物特性。为实现这个目标，人源化(或人)或工程化抗CCR9抗体以及表面重修的抗体可以任选地通过利用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化和工程化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。说明并展示所选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原诸如CCR9的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入的序列中选择并且组合FW残基，这样使得所希望的抗体特征(诸如增加对一种或多种靶抗原的亲和力)得以实现。
本发明抗CCR9抗体或其抗原结合片段的人源化、表面重修或工程化可以使用任何已知方法进行，该已知方法诸如但不限于以下文献中所述的那些：Jones等人,Nature[自然]321:522(1986)；Riechmann等人,Nature[自然]332:323(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学]239:1534(1988)；Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901(1987)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2623(1993)；美国专利号5,639,641、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、7,557,189、7,538,195、和7,342,110；国际申请号PCT/U S98/16280、PCT/US 96/18978、PCT/US 91/09630、PCT/US91/05939、PCT/US 94/01234、PCT/GB 89/01334、PCT/GB 91/01134、PCT/GB 92/01755；国际专利申请公开号WO 90/14443；WO 90/14424、WO 90/14430；以及欧洲专利公开号EP229246；将这些文献中的每一篇通过援引整个并入本文，包括其中引用的参考文献。
抗CCR9人源化抗体及其抗原结合片段也可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中产生，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白产生不存在的情况下产生全套人抗体。此方法描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、以及5,661,016中。
在一些实施例中，提供了抗体(例如抗CCR9抗体)的片段(例如抗体片段)。已知各种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解衍生，如例如由Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24:107-117(1993)以及Brennan等人,Science[科学]229:81(1985)所述的。在一些实施例中，抗CCR9抗体片段是重组地产生的。Fab、Fv和scFv抗体片段全部都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且从其分泌，因而允许产生大量的这些片段。此类抗CCR9抗体片段也可以从以上讨论的抗体噬菌体文库分离。抗CCR9抗体片段也可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
根据本发明，技术可以经改编以产生对CCR9具有特异性的单链抗体。参见例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可以经改编以构建Fab表达文库，以允许快速且有效地鉴定针对CCR9或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所希望特异性的单克隆Fab片段。参见例如，Huse等人,Science[科学]246:1275-1281(1989)。通过本领域已知的技术可以生产抗体片段，包括但不限于：由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段；通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；或Fv片段。
修饰的结合分子(例如如本文所提供的抗体或其抗原结合片段)可以包含任何类型的提供结合分子与CCR9的缔合的结合区。在这点上，结合区可以是可变区，该可变区可以构成或衍生自可诱导增加体液应答并产生针对所希望抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。正因如此，抗CCR9抗体或其抗原结合片段的可变区可以是例如人、鼠、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或狼来源的。在一些实施例中，修饰的抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区两者均是人的。在一些实施例中，相容性抗体的可变区(通常衍生自非人来源)可以经工程化或专门定制来改善结合特性或减少分子的免疫原性。在这点上，在本发明中有用的可变区可以经人源化或以其他方式通过纳入输入的氨基酸序列改变。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段的重链和轻链两者中的可变结构域通过至少部分替换一个或多个CDR和/或通过部分框架区替换和序列改变而被改变。虽然CDR可以衍生自与框架区所衍生自的抗体相同的类别或甚至亚类的抗体，但是设想CDR将衍生自不同类别的抗体并且在某些实施例中衍生自不同物种的抗体。不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761、和5,693,762中所阐述的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验获得具有减少的免疫原性的功能抗体。
尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将理解，本发明的修饰的抗体或其抗原结合片段可以包括抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已经被缺失或以其他方式改变，以便提供所希望的生物化学特征，诸如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比时增加的效应子功能，包括改善的诱导ADCC的能力。在一些实施例中，修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。对与本发明相容的恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文所披露的修饰的抗体可以包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施例中，设想了修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失。在一些实施例中，修饰的抗体将包含缺失结构域的构建体或变体，其中整个CH2结构域被移除(ΔCH2构建体)。在一些实施例中，省略的恒定区结构域可以被短氨基酸间隔区(例如，10个残基)替换，该间隔区提供通常由不存在的恒定区所赋予的一定分子灵活性。
可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如像区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开头到结尾比对序列，并通过将单独残基对的评分相加以及施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice[CLUSTAL W：通过序列加权、位置特异性空位罚分和权矩阵选择来改善渐进式多序列比对的灵敏度],22(22)Nucleic Acids Research[核酸研究]4673-4680(1994)；以及迭代细化，参见例如Osamu Gotoh,Significant Improvementin Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinementas Assessed by Reference to Structural Alignments[如通过参考结构比对评估的通过迭代细化显著改善多蛋白序列比对的准确性],264(4)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入的序列共享的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box，参见例如Eric Depiereux和Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment ofSeveral Protein Sequences[Match-Box：用于同时比对若干个蛋白序列的全新算法],8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs抽样，参见例如C.E.Lawrence等人,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment[检测微弱序列信号：用于多比对的Gibbs抽样策略],262(5131)Science[科学]208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe等人,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment ofHighly Divergent Sequences[Align-M-用于高度多样性序列的多比对的新算法],20(9)Bioinformatics[生物信息学]:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.[数学生物学进展]48:603-16,1986和Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915-19,1992。简而言之，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1以及如下所示的Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵比对两个氨基酸序列以优化比对评分(氨基酸由标准的单字母代码表示)。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置数目的函数。因此，％同一性可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数量除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算还可以考虑空位的数量，以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。可以使用技术人员熟悉的特定数学算法(诸如BLAST)进行两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分比确定。
本发明进一步涵盖与本发明结合分子(例如抗体，诸如鼠、嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)基本上同源的变体和等效物。这些可以含有例如保守取代突变，即通过相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用相同通用类别内的另一个氨基酸取代一个氨基酸，例如像，用另一个酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸、用另一个碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸或用另一个中性氨基酸取代一个中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容在本领域是熟知的。
基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改变优选地是较小性质的，即是保守氨基酸取代(参见下面)和不显著影响多肽的折叠或活性的取代；小缺失，典型地1至约30个氨基酸的小缺失；以及小的氨基末端或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基、多达约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。
表2：保守氨基酸取代
除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明结合分子的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明结合分子还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-桥亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中的若干种方法是本领域已知的。例如，可以采用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制型tRNA抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在无细胞系统中进行，该无细胞系统包含大肠杆菌S30提取物以及可商购获得的酶和其他试剂。通过色谱法纯化蛋白质。参见例如，Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]113:2722,1991；Ellman等人,MethodsEnzymol.[酶学方法]202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；以及Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制型tRNA在爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在要替换的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在所需的一个或多个非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下，培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸代替其天然对应物掺入多肽中。参见，Koide等人,Biochem.[生物化学]33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变相结合，以进一步扩大取代范围(Wynn和Richards,Protein Sci.[蛋白质科学]2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明结合分子的氨基酸残基。
本发明结合分子中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定(Cunningham和Wells,Science[科学]244:1081-5,1989)。生物学相互作用位点还可以通过对结构的物理分析来确定，诸如通过以下技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,Science[科学]255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64,1992。必需氨基酸的同一性还可以从与本发明结合分子的相关组分(例如易位组分或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出来。
可以使用已知的诱变和筛选方法来产生和测试多个氨基酸取代，这些方法诸如Reidhaar-Olson和Sauer(Science[科学]241:53-7,1988)或者Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-6,1989)所披露的那些。简而言之，这些作者披露了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置、选择功能性多肽、然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许的取代的范围的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.[生物化学]30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO 92/06204)和定区诱变(Derbyshire等人,Gene[基因]46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。
5.2组合物
本文还提供了组合物，这些组合物包含本发明结合分子。组合物可以包含如本文所述的结合分子。组合物可以包含多于一种如本文所述的结合分子。
在另一方面，提供了组合物，该组合物包含结合CCR9的结合分子，其中所述结合分子能够(i)抑制CCL25与CCR9的结合；和(ii)介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
如本文所述的组合物可以是药物组合物，诸如包含本发明结合分子并进一步包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。术语“药物组合物”是指如下制剂，该制剂处于允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有另外的、对组合物将要施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。这种组合物可以是无菌的并且可以包含药学上可接受的运载体，诸如生理盐水。合适的药物组合物可以包含一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、稳定剂(例如，人白蛋白)、防腐剂(例如，苄醇)、以及增强生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
在一些实施例中，本发明药物组合物可以包含药学上可接受的无毒的无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。在本文所披露的治疗方法中使用的合适配制品描述于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,Lloyd V.Allen,Jr.编辑(2012)中。
在一些实施例中，本发明药物组合物可以包含在一种或多种配制品中，该一种或多种配制品选自胶囊、片剂、水性悬浮液、溶液、鼻气雾剂或其组合。
在一些实施例中，药物组合物包含多于一种类型的本发明结合分子。例如，药物组合物可以包含选自抗体、抗原结合片段或其组合的两种或更多种。
术语结合分子的“药物有效量”意指足以实现与靶标的有效结合并实现益处(例如，改善疾病或病症的症状，或者检测物质或细胞)的量。
在一些实施例中，药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选的稳定剂试剂(例如，人白蛋白)等。
合适地，本发明结合分子以足够的亲和力结合CCR9分子，使得该结合分子可用作靶向CCR9的治疗剂或诊断试剂。
5.3治疗方法
本发明还涉及在治疗方法中使用本发明的结合分子和组合物。本发明提供了一种用于在此类治疗方法中使用的本发明结合分子，例如用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用的本发明结合分子。在本文相对于本发明结合分子描述治疗方法和用途的情况下，还涵盖了其中结合分子以组合物，诸如药物组合物，诸如如本文所述的药物组合物存在的相同方法和用途。
因此，本发明涵盖用于在治疗CCR9介导的疾病或病症的方法中使用的以上定义的结合分子和以上定义的药物组合物。
在一方面，提供了用于在治疗CCR9介导的疾病或病症中使用的本发明结合分子。还提供了用于在治疗CCR9介导的疾病或病症中使用的本发明组合物，例如本发明药物组合物。进一步提供了本发明结合分子在制造用于治疗CCR9介导的疾病或病症的药物中的用途。
在另一方面，提供了一种治疗受试者中的CCR9介导的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明结合分子。
在一方面，提供了一种用于在治疗受试者中的CCR9介导的疾病或病症中使用的结合分子，其中所述结合分子能够(i)抑制CCL25与CCR9的结合，并且(ii)介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
在一方面，提供了一种治疗受试者中的CCR9介导的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的结合CCR9的结合分子，其中所述结合分子能够(i)抑制CCL25与CCR9的结合；和(ii)介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
在任一个治疗方面的一些实施例中，被治疗的CCR9介导的疾病或病症是炎性肠病。
在一些实施例中，结合分子能够耗尽受试者中，例如受试者的肠道中的CCR9表达细胞。不受理论的约束，这可以是由于结合分子防止CCR9表达细胞从外周迁移至受试者的肠道中的能力和/或由于结合分子诱导它所结合的CCR9表达细胞的死亡的能力。
因此，在一方面，提供了一种耗尽有需要的受试者中的CCR9表达细胞的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明结合分子。
在一些实施例中，CCR9多肽包含在CCR9多肽序列或其片段内。
“CCR9多肽”可以包含CCR9的全长多肽序列，或者可以包含CCR9的全长多肽序列的任何长度的CCR9片段(例如，包含CCR9的全长多肽序列的5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％或95％的多肽序列)，该片段包含可以结合本发明结合分子(例如，被其结合)的表位。
结合分子可以有利地在用于检测CCR9表位的方法和相关诊断方法中使用。
如本文所使用的，术语“治疗(treat或treating)”涵盖治愈、减慢已诊断的病理性病症或障碍，减轻已诊断的病理性病症或障碍的症状，和/或停止已诊断的病理性病症或障碍的进展的治疗性措施。因此，需要治疗的人包括已患有障碍的那些人。优选地，如本文所使用的，术语“治疗(treat或treating)”意指矫正性治疗。术语“治疗(treat或treating)”涵盖治疗炎性肠病、以及治疗其症状和与其相关的疾病/障碍。在一些实施例中，术语“治疗(treat或treating)”是指IBD的症状，诸如肠道炎症、腹痛、腹泻、便血。在一些实施例中，如果患者显示例如全部、部分或瞬时减轻或消除与CCR9介导的疾病或障碍(例如，炎性肠病)相关的症状，则根据本文所提供的方法成功地“治疗”了受试者的CCR9介导的疾病或障碍(例如，炎性肠病)。“治疗(treat或treatment)”还包括预防性治疗，例如以预防疾病的发作，诸如预防IBD的发作。
“预防”是指预防和/或减缓靶向性病理性病症或障碍发展的防御性或预防性措施。因此，需要预防的人包括倾向于患有或易患障碍的那些人。在一些实施例中，如果相比于未经受本发明方法的患者，患者瞬时或永久地表现出，例如与疾病或障碍相关的更少或不太严重的症状，或与该疾病或障碍相关的症状的更迟的发作，则根据本文提供的方法成功地预防了疾病或障碍(例如，炎性肠病)。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指哺乳动物受试者。在一些实施例中，“受试者”是人、家畜、农场动物、竞赛动物和动物园动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛等。在一些实施例中，受试者是食蟹猴(cynomolgusmonkey/Macaca fascicularis)。在优选的实施例中，受试者是人。在本发明方法中，受试者先前可能尚未被诊断为患有炎性肠病。替代性地，受试者可能先前已经被诊断为患有炎性肠病。受试者也可以是表现出疾病风险因素的人，或没有炎性肠病症状的人。受试者也可以是罹患炎性肠病或有患炎性肠病的风险的人。因此，在一些实施例中，本发明方法可用于确认受试者中炎性肠病的存在。例如，受试者可能先前已经通过替代性手段被诊断出患有炎性肠病。在一些实施例中，受试者先前已经施用炎性肠病疗法。
在一些实施例中，本发明治疗方法包括一个或多个施用步骤，该一个或多个施用步骤选自口服、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道、吸入、局部或其组合。
在一些实施例中，将结合分子直接递送至有害细胞群体的位点处(例如从而增加患病组织对治疗剂的暴露)。在一些实施例中，直接施用至气道，例如通过吸入或鼻内施用。
在一些实施例中，炎性肠病是克罗恩病，诸如回肠或回肠结肠克罗恩病。在一些实施例中，炎性肠病是溃疡性结肠炎。
5.4检测方法
在另一方面，提供了用于检测CCR9多肽的存在或不存在的方法。本发明结合分子可以用于此类方法中。
在一些实施例中，检测CCR9多肽的存在或不存在的方法包括：
a)使样品与本发明结合分子接触以提供结合分子-抗原复合物；
b)检测所述结合分子-抗原复合物的存在或不存在；
c)其中该结合分子-抗原复合物的存在确认了CCR9多肽的存在。
在一些实施例中，以上步骤(i)-(iii)中的任一个离体或在体外进行。在一些实施例中，以上步骤(i)-(iii)中的全部离体或在体外进行。在一些实施例中，以上步骤(i)-(iii)中的任一个在体内进行。
结合分子可以是本文所述的任何结合分子，例如包含如针对图3或图4或表4中任一种抗体展示的一组六个CDR的结合分子，或包含如针对图3或图4中的任一种抗体或表3的结合分子展示的VH和VL的结合分子。
在一些实施例中，本文所述的检测方法在体外进行。在一些实施例中，本文所述的检测方法离体进行。在一些实施例中，本文所述的检测方法在来自受试者的样品，诸如先前已经从受试者获得的样品上进行。检测方法可以、或可以不包括从受试者获得样品的步骤。合适地，“样品”是从受试者(例如，活检)、细胞系、组织培养物或其他潜在表达CCR9的细胞来源获得的样品。在一些实施例中，样品是来自受试者的活检。所述活检可以来自罹患炎性肠病的受试者的肠道，或来自有罹患炎性肠病的风险的受试者的肠道。样品可以是来自受试者的分离样品。
本发明涵盖本发明结合分子用于检测CCR9多肽(例如，CCR9多肽表位)的相应用途。
在一些实施例中，结合分子-抗原复合物的存在指示炎性肠病的存在，并且结合分子-抗原复合物的不存在指示炎性肠病的不存在。
在一些实施例中，炎性疾病是包含表达CCR9多肽(例如CCR9多肽表位)的细胞的炎性肠病。
因此，本发明涵盖本发明结合分子在诊断患有炎性肠病的受试者的方法中的用途，优选地其中所述炎性肠病包含CCR9表达细胞。
在一些实施例中，检测方法或诊断方法可以包括测量来自受试者的样品中CCR9的表达水平，并且将所测量的CCR9表达水平与参考CCR9水平进行比较，其中所测量的CCR9表达水平相比于参考CCR9水平的增加指示炎性肠病。在一些实施例中，所述参考CCR9水平是相同类型，诸如相同组织类型的非IBD(例如正常)样品中CCR9的表达水平。
“结合分子-抗原复合物”意指包含与其对应结合分子结合的抗原，例如与本发明结合分子结合的CCR9的复合物(例如大分子复合物)。术语“结合分子-抗原复合物”可以与术语“结合的CCR9-结合分子复合物”和“与CCR9结合的结合分子”同义使用。
可以通过本领域技术人员已知的任何手段检测结合分子-抗原复合物。在一些实施例中，将结合分子用可检测标记进行标记。所述标记可以是落射式荧光标记。
在一些实施例中，结合分子-抗原复合物通过结合结合分子和/或结合分子-抗原复合物的第二(例如检测)抗体来检测。
合适地，所述第二抗体包含检测手段，诸如标签/标记以辅助检测。所述检测工具优选地缀合至第二抗体。合适标记的实例包括可检测标记，诸如放射性标记或荧光分子或有色分子、酶标记物或显色标记物(例如，在检测抗体与抗原结合时提供可见颜色变化的染料)。举例来说，标记可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、R-藻红蛋白、Alexa 532、CY3或地高辛。标记可以是报告分子，该报告分子被直接检测，诸如通过检测其荧光信号、或通过将标记暴露于照相胶片或X射线胶片。替代性地，标记不能被直接检测，但可以例如在两相系统中被检测。间接标记检测的一个实例是抗体与标记的结合。
在一些实施例中，所述第二抗体包含荧光标签，并且通过由结合分子-抗原-第二抗体复合物发出的荧光检测结合分子-抗原复合物。“结合分子-抗原-第二抗体复合物”意指包含已经与结合分子结合的抗原(例如，CCR9)的复合物，其中所述复合物进一步被第二抗体结合，该第二抗体结合所述结合分子和/或结合分子-抗原复合物。
合适地，当由检测标记发出的信号(例如，荧光)大于在不包含结合分子(例如，不包含结合CCR9的结合分子)的对照中检测到的信号时，检测到结合分子-抗原复合物。所述对照可以替代性地包含CCR9，但样品不应用于所述对照。
在另一方面，提供了一种第二结合分子，该第二结合分子结合CCR9，其中所述第二结合分子不与第一结合分子竞争结合CCR9。
第一结合分子可以是如本文所披露的结合CCR9的任一种结合分子。合适的第一结合分子可以是如图4中展示的结合分子。合适的第一结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子包含表3中展示的任一种结合分子的VH和VL或包含表4中展示的任一种结合分子的一组六个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。合适的第一结合分子可以是这样的结合分子，该结合分子：
a)包含具有如图4中所示的抗体的一组CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变(VH)区和具有该抗体的一组CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变(VL)区；
b)包含如图4中所示的抗体的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区；
c)包含SEQ ID NO:51的重链可变(VH)区序列和SEQ ID NO:55的轻链可变(VL)区序列，其中(i)SEQ ID NO:55的X1和X2各自是任何氨基酸(SEQ ID NO:76)；或者(ii)SEQ IDNO:55的X1是P或S并且SEQ ID NO:55的X2是R、T或G(SEQ ID NO:77)；或者
d)包含SEQ ID NO:51的重链可变(VH)区序列和SEQ ID NO:52、53或54的轻链可变(VL)区序列；或者
e)包含SEQ ID NO:56的重链可变(VH)区序列和SEQ ID NO:57的轻链可变(VL)区序列。
有利地，本发明涵盖第二结合分子(其不与第一结合分子竞争结合)用于确定已经与第一结合分子接触的样品中CCR9表达细胞的丰度的用途。
因此，提供了一种评估第一结合分子对CCR9表达细胞的耗尽的方法，该方法包括：
a)使所述第一结合分子在以下条件下与细胞群体接触，其中细胞群体包含CCR9表达细胞和免疫效应细胞，这些条件适于允许效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；
b)使所述细胞群体与结合CCR9并且不与步骤(i)的该第一结合分子竞争结合CCR9的第二结合分子接触；
c)检测该细胞群体中被(ii)的该第二结合分子结合的CCR9表达细胞；
d)将步骤(iii)中检测到的CCR9表达细胞的量与步骤(i)中使用的该原始细胞群体中CCR9表达细胞的量进行比较，并且从而确定在步骤(i)中耗尽的CCR9表达细胞的量。
在一些实施例中，第二结合分子包含表6中展示的VH和VL序列或表6中展示的一组六个CDR。例如，第一结合分子可以包含表3中展示的任一种结合分子的VH和VL或包含表4中展示的任一种结合分子的一组六个CDR，并且第二结合分子可以包含表6中展示的VH和VL序列或表6中展示的一组六个CDR。
在一些实施例中，第二结合分子是如本文所述的结合分子，该结合分子结合CCR9并且包含：
a)SEQ ID NO:44的HCDR1或其功能变体；
b)SEQ ID NO:45的HCDR2或其功能变体；
c)SEQ ID NO:46的HCDR3或其功能变体；
d)SEQ ID NO:47的LCDR1或其功能变体；
SEQ ID NO:5的LCDR2或其功能变体；以及
e)SEQ ID NO:48的LCDR3或其功能变体，其中功能变体如本文所定义。
在一些实施例中，第二结合分子是结合分子，该结合分子结合CCR9并且包含具有一组CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变(VH)区和具有一组CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变(VL)区，其中VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:44的HCDR1、SEQ ID NO:45的HCDR2和SEQ ID NO:46的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:47的LCDR1、SEQ IDNO:5的LCDR2和SEQ ID NO:48的LCDR3。
在一些实施例中，第二结合分子是结合分子，该结合分子结合CCR9并且包含：
a)VH区，该VH区含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及
b)VL区，该VL区含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
5.5多核苷酸、载体和宿主细胞
在另一方面，提供了一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码本发明结合分子的核酸序列。
在一些实施例中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
在一些实施例中，在结合分子包含多于一种的多肽链的情况下(例如在结合分子是包含至少一条重链和至少一条轻链的免疫球蛋白分子或其片段的情况下)，多核苷酸编码结合分子的一条、一些或全部多肽链。例如，多核苷酸可以编码结合分子的重链多肽和轻链多肽。在一些实施例中，多核苷酸编码结合分子的VH区。在一些实施例中，本发明的多核苷酸编码结合分子的VL区。在一些实施例中，多核苷酸编码结合分子的VH区和VL区。
在一些实施例中，多核苷酸进一步编码前导序列(例如，其充当控制多肽从细胞的转运的分泌序列)。
本发明涵盖上述多核苷酸的变体。多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施例中，多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失而不改变所编码的多肽的特性或活性的改变。在一些实施例中，多核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体可以因多种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成细菌宿主诸如大肠杆菌优选的那些密码子)。
在另一方面，提供了一种载体，该载体包含与启动子可操作地缔合的本发明多核苷酸；或包含编码本发明结合分子的VH区的多核苷酸和编码本发明结合分子的VL区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。如本文所使用的，术语“启动子”意指通过驱动多核苷酸序列的转录调控多核苷酸序列的表达的任何核酸序列。如本文所使用的，术语“可操作地缔合的”和“可操作地连接的”意指启动子相对于其调控的多核苷酸序列处于正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。在一些实施例中，编码VH区和VL区的核酸序列与相同启动子可操作地缔合。在一些实施例中，编码VH区和VL区的核酸序列各自与单独的启动子可操作地缔合。在一些实施例中，单独的启动子是相同类型的启动子。在一些实施例中，单独的启动子是不同类型的启动子。
载体的实例包括病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(诸如生产细胞)。一旦组装至载体中，本发明多核苷酸可以可操作地连接至适于在所希望宿主中表达多肽的启动子。
载体可以包含控制多核苷酸的表达的另外的一种或多种序列。例如，载体可以包含增强子和阻遏子序列中的一种或多种。如本文所使用的，术语“增强子”意指结合一种或多种蛋白质以增加多核苷酸的激活的核酸序列。如本文所使用的，术语“阻遏子”意指结合一种或多种蛋白质以减少多核苷酸的激活的核酸序列。
本文所提供的另一方面是一种包含本发明多核苷酸或如本文所披露的多核苷酸的宿主细胞或一种包含本发明载体或如本文所披露的载体的宿主细胞，其中宿主细胞能够产生由多核苷酸或载体编码的多肽。
本文所提供的另一方面是一种产生本发明结合分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达本发明多核苷酸或载体。例如，在一些实施例中，该方法包括将宿主细胞在以下条件下培养，这些条件适于产生由宿主细胞中存在的多核苷酸或载体编码的本发明结合分子。
用于表达本发明结合分子的合适宿主细胞包括原核细胞、酵母、昆虫细胞或高等真核细胞(优选地其中多核苷酸处于适当的启动子的控制下)。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如本文所述的哺乳动物来源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。在一些实施例中，宿主细胞是未岩藻糖基化结合分子的Fc区的细胞。在一些实施例中，宿主细胞是表达使岩藻糖途径转向至产生GDP-D-鼠李糖的酶的细胞。
5.6无岩藻糖基化
可以通过产生具有改变的糖基化模式的抗体来修改抗体效应子功能。例如，抗体可以被产生为具有改变的糖基化类型，诸如岩藻糖基残基量降低的无岩藻糖基化/低岩藻糖基化抗体或等分GlcNac结构增加的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体来实现。在本领域中已经描述了具有改变的糖基化机构的细胞，并且这些细胞可以用作宿主细胞(其中表达本发明重组型抗体以由此产生具有改变的糖基化的抗体)。例如，EP1,176,195描述了细胞系，该细胞系中的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上被破坏，以使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，该细胞系具有将海藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物上的降低能力，从而也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低海藻糖基化(也参见[5])。PCT公开WO99/54342描述了这样的细胞系，这些细胞系经工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(也参见[6])。WO 2011/035884A1描述了用于产生在其糖部分上缺乏岩藻糖的分子的方法。WO 2011/035884 A1特别地描述了用于产生分子的细胞，其中细胞包含使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的至少一种酶，其中酶将底物转化为GDP-D-鼠李糖、GDP-D-过骨胺(perosamine)、GDP-脱氧-D-塔洛糖、GDP-6-脱氧-D阿卓糖或GDP-4-酮基-3,6-双脱氧-D-甘露糖。
5.7试剂盒和另外的测定
在一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本发明结合分子。进一步涵盖所述试剂盒在本发明方法中的用途。
在一些实施例中，试剂盒进一步包含分离的(例如纯化的)抗原或表达抗原的细胞。例如，试剂盒可以进一步包含分离的(例如纯化的)CCR9或表达CCR9的细胞。在一些实施例中，试剂盒包含一个或多个容器。在一些实施例中，试剂盒包含进行如本文所述的检测测定的必要和/或足够的所有组件，这些组件包括所有对照、用于进行测定的指导以及用于分析和呈现结果的任何必要的软件。
可以通过本领域已知的任何方法将本发明结合分子用于针对免疫特异性结合的测定中。可以使用的免疫测定包括但不限于使用诸如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、RIA、ELISA、ELISPOT、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白质A免疫测定。
可以在组织学上采用本发明结合分子，如在免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫学测定中，例如用于原位检测CCR9或其保守变体或肽片段。原位检测可以通过以下方式来实现：从患者中取出组织学样本，并向其施用标记的本发明结合分子，例如通过将标记的结合分子覆盖在生物样品上来施加。通过使用这一程序，不仅可确定CCR9或保守变体或肽片段的存在，还可确定其在检查的组织中的分布。使用本发明，普通技术人员将容易地知道，可以修改多种组织学方法中的任一种(诸如染色程序)以实现这种原位检测。
表3：示例性本发明结合分子的VH和VL区的氨基酸序列。
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表4：示例性结合分子的CDR的氨基酸序列
5.8实例1-各种细胞和组织中的CCR9表达从人和食蟹猴中的各种组织分离出细胞。使用流式细胞术确定给定组织和/或给定细胞类型中的表达CCR9的细胞的比例。
如图1A中展示的，表达CCR9和CD4两者的细胞见于人组织和食蟹猴组织两者的结肠、回肠和胸腺中，并且还见于食蟹猴组织中的肠系膜淋巴结中。相比之下，CCR9+CD4+细胞仅以低水平存在于血液中。还发现CCR9 mRNA与食蟹猴回肠的CD3+细胞共表达(数据未示出)。
在人组织中评估CCR9表达。CCR9表达细胞的最大比例见于胸腺的CD4+T细胞中(76％的表达CCR9的细胞)，并且高水平也见于IBD患者的回肠的CD4+T细胞(47％的表达CCR9的细胞)和CD8+T细胞(37％的表达CCR9的细胞)中。一些CCR9表达还见于IBD患者的结肠的细胞中，这些细胞是CD4+T细胞(9％的表达CCR9的细胞)或CD8+T细胞(12％的表达CCR9的细胞)，在IBD患者的血液中的CD4+和CD8+T细胞中仅具有低数量的CCR9表达细胞(<5％)。CCR9表达见于血液中的28％的B细胞中，在结肠和回肠中的B细胞中具有较低水平(分别为11％和16％)。仅非常低数量的单核细胞、树突状细胞(DC)和浆细胞样树突状细胞(pDC)表达CCR9(<5％)。
图1B示出了健康和IBD患者的回肠(左图)和结肠(右图)中表达CCR9的B细胞的百分比。对于每种B细胞类型(初始B细胞、记忆B细胞、浆细胞)，将来自健康受试者的结果提供在左侧并且将IBD患者的结果提供在右侧。发现在IBD中表达CCR9的B细胞的数量减少，其中在记忆B细胞中观察到最大减少。假设这可能是由于驱动IBD中的受体内化的高CCR9配体表达。
图1C示出了来自健康受试者或IBD患者的结肠或回肠的表达CCR9的T效应细胞和Treg。对于所指示的每种组织类型，表达CCR9的T效应细胞的％示出在左侧，并且表达CCR9的Treg的％示出在右侧。发现在健康患者与IBD患者之间任一种组织类型中的T效应/Treg比率没有明显差异。
5.9实例2-CCR9与促炎细胞因子表达的关联性
使用流式细胞术在人CD4+CCR9+和CD4+CCR9-细胞中评估促炎细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17的共表达。将细胞从人结肠或回肠分离出并且用PMA/离子霉素和布雷菲德菌素A(蛋白质转运抑制剂)处理4小时以刺激细胞因子产生。通过基于CD45+、CD3+和CD8-的单活细胞的门控来鉴定CD4+T细胞。发现与CD4+CCR9-细胞相比，CD4+CCR9+细胞表达更高水平的促炎细胞因子(图2A)。CD4+CCR9-细胞与CD4+CCR9+细胞之间对于IL-17的表达的水平差异是最大的(在两倍至六倍增加的范围内)，但对于IL-4和IFN-γ两者的平均差异仍是两倍至三倍左右(图2B)。
5.10实例3-抗CCR9抗体的产生
在用交替的过表达人CCR9和小鼠CCR9的HEK细胞系免疫CD1小鼠后使用杂交瘤技术产生抗CCR9抗体。使用三组小鼠。对于第1组，用交替的过表达hCCR9的CHO和HEK细胞免疫小鼠；用交替的过表达hCCR9的HEK细胞和过表达mCCR9的HEK细胞免疫第2组小鼠；用过表达mCCR9的HEK细胞免疫第3组小鼠。将重组细胞系以稀释于PBS中的1e7个细胞/100μL施用，并且用等体积的弗氏完全佐剂乳化，并注射至小鼠中的两个位点，每个位点100μL。对于后续的三次注射，将细胞在弗氏不完全佐剂中乳化，并且如上述进行注射。最终的加强在第24天通过腹膜内注射在PBS中的200μL细胞进行。
在免疫前、第一次免疫后第13天和第二次免疫后第20天从小鼠获得尾静脉血样。通过血清ELISA确定针对人CCR9、小鼠CCR9以及亲本HEK和CHO细胞的IgG滴度。将具有最高的抗原特异性滴度的动物用于杂交瘤产生。
5.10.1对针对hCCR9和mCCR9的小鼠免疫应答的评估
通过ELISA确定针对hCCR9和mCCR9的单独小鼠血清IgG滴度。将以上所述的hCCR9和mCCR9 HEK以及CHO细胞系连同亲本HEK和CHO细胞以40,000个细胞/孔包被至96孔聚-D-赖氨酸微滴定板上并且在CO2孵育箱中在37℃下培养过夜。在孵育过夜之后，除去上清液并且将细胞在室温下在甲醛/PBS的3.7％溶液中固定5min。随后的所有孵育在室温下进行。在除去甲醛溶液之后，然后通过添加3％marvel/PBS封闭缓冲液封闭孔。1h后，除去封闭缓冲液，并且将孔再次用PBS洗涤并以稀释系列(50μL/孔，从1:200稀释度开始)添加血清样品。孵育1h后，将孔用补充有0.05％(v/v)吐温20的PBS洗涤三次。然后将以1:500在Delfia测定缓冲液(珀金埃尔默公司)中的铕标记的抗小鼠IgG以50μL/孔添加至孔。在如上再孵育1h并洗涤五次后，将增强溶液(珀金埃尔默公司)以50ul/孔添加至孔，并且将板在定轨振荡器上在室温下孵育10min。然后使用珀金埃尔默公司EnVision 2103多标记读板仪读取板。
绘制针对hCCR9、mCCR9以及亲本HEK和CHO细胞的血清滴定曲线，并且计算对应的曲线下面积(AUC)。
5.10.2单克隆小鼠IgG分离
在最后一次加强后四天，无菌地收获淋巴结，并且通过机械破坏分离细胞并且对其计数。将这些细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，并且使用电融合装置融合。将所得融合物与基于甲基纤维素的半固体培养基混合，并且铺板至OmniTray板中。半固体培养基包含CloneMatrix和DMEM，该DMEM补充有20％FCS、10％BM Condimed H1、1mM丙酮酸钠和OPI培养基补充物、2％次黄嘌呤重氮丝氨酸和FITC缀合的山羊抗小鼠IgG。将半固体培养基中的细胞在5％CO2培养箱中在37℃下培养13天。在此孵育期期间，克隆集落从单一祖杂交瘤细胞形成。这些集落分泌IgG，该IgG通过存在于半固体培养基中的FITC缀合的抗IgG截留在集落的附近。当通过ClonePix FL集落采集器(分子装置公司(Molecular Devices))可视化时，在作为荧光‘卤素’的细胞周围可以观察到所得免疫复合物形成。然后，将这些卤素化的集落挑选至96孔微量滴定板中。
在培养3-5天后，收获挑选集落的上清液并且针对CCR9结合进行筛选。
5.10.3DNA测序和小鼠IgG的纯化
使用磁性寡核苷酸(dT)颗粒从杂交瘤细胞中提取信使RNA(mRNA)并反转录成cDNA。使用对所有小鼠IgG亚类具有特异性的聚C和恒定区VH或VL引物进行PCR扩增。
5.10.4小鼠IgG纯化
将细胞在24孔板中增殖，并且在补充有HyperZero和谷氨酰胺的无血清的HL-1培养基中过度生长。10天后，将上清液转移至96孔主封闭液中，并且使用珀金埃尔默公司Minitrack在ProPlus树脂(Phynexus)上将小鼠IgG的全部亚类的(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)从过度生长的细胞培养上清液中纯化。将所捕获的小鼠IgG用75μL100mM HEPES、140mM NaCl pH 3.0洗脱，然后用等体积的200mM HEPES pH 8.0中和。在UV-Star 384孔板中在280nm下使用吸光度读取对纯化的IgG进行定量。
5.10.5对小鼠IgG的重新格式化
对于每种杂交瘤，对小鼠杂交瘤IgG克隆进行分子重新格式化以产生表达小鼠VH和VL结构域和相关小鼠IgG恒定结构域的构建体，基本上如Persi的等人1997[7]所描述且具有以下修改。在表达载体中包括了OriP片段以有利于与CHO瞬态细胞一起使用并且允许游离型复制。将VH结构域克隆至含有小鼠重链恒定结构域和调控元件的相关载体中以在哺乳动物细胞中表达完整IgG1重链。相似地，将VL结构域克隆至用于表达适当小鼠轻链(λ或κ)恒定结构域和调控元件的载体中以在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。为了获得IgG，将哺乳动物悬浮液CHO细胞用重链和轻链IgG载体转染。IgG被表达并且分泌至培养基中。纯化前过滤收获物，然后使用蛋白A色谱法纯化IgG。将培养物上清液上样至陶瓷蛋白A(颇尔公司(Pall)20078-036)的适当大小的柱上，并且用50mM Tris-HCl pH 8.0、250mM NaCl洗涤。将结合的IgG使用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)从柱上洗脱并且通过添加Tris-HCl(pH 9.0)进行中和。将洗脱材料使用Nap10柱(GE医疗生命科学公司(GE Lifesciences)17-0854-02)缓冲液更换至PBS中，并且使用基于IgG的氨基酸序列的消光系数通过分光光度来确定IgG的浓度[8]。使用SDS-PAGE分析纯化的IgG的纯度。针对与HEK细胞上的人CCR9的结合筛选纯化的IgG。
图3示出了针对此筛选中鉴定的九种独特命中物的可变重链(图3A)和可变轻链(图3B)序列的氨基酸序列。AB1020243的cDNA例如由克隆ZY10OI-A02制备，并且确定了VH和VL结构域的序列。FW＝框架区。CDR的位置加下划线，如根据Kabat分配所指示的(Kabat等人,Sequences of Immunological Interest[免疫学目的的序列],第5版Public HealthService[公共卫生服务部],National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda[贝塞斯达],Md.[马里兰州](1991))。人源化AB1020243(AB1020243-fgl)的VH和VL序列展示于图4中，其中将它们与原始嵌合序列比对。
为了进一步改善AB1020243的效力和有效性，进行H和L CDR的定向扫描诱变。通过哺乳动物表达载体的定点诱变使CDR突变，这些哺乳动物表达载体具有低冗余偏向性核苷酸(NNC)密码子混合物，这些密码子混合物被设计以最大化替代性氨基酸(aa)的丰度，同时从文库中消除不希望的氨基酸(Met、Trp)。产生566种CDR变体，并且产生人源化AB1020243的CDR优化形式。将筛选文库在来自24孔深板中的CHO细胞中表达，然后进行变体的蛋白A纯化。在鉴定改善的变体后，通过定点诱变进行CDR内和CDR间重组以将有益变体组合为作为a-fuc huIgG1的最终先导抗体候选物。CDR优化抗体AB243LO0331和AB243LO0326的VH和VL序列展示于图4中，其中将它们与来自AB1020243的亲本序列和AB1020243的人源化形式比对。已经修饰的LCDR1残基以粗体下划线文本示出。
5.11实例4-对CCR9结合和效力的评估
5.11.1细胞结合
使用过表达人CCR9A的HEK细胞或使用Molt4细胞评估抗体与CCR9表达细胞的结合。Molt4细胞系衍生自人T细胞并且已知表达CCR9[9]。将测试抗体在补充有1％胎牛血清的PBS中稀释至10μg/mL的浓度。将抗体使用在8个点上的三倍滴定作为单点滴定在96孔板上，并且将细胞在4℃下染色20min。将细胞洗涤并且用在无菌PBS+1％FBS血清中的第二山羊抗小鼠或人IgG PE(2.5μg/ml)在4C下染色20分钟。
图5A显示至少AB1020243、AB1020229和AB1020011与Molt4细胞结合。将与Molt4细胞的结合和与不表达人CCR9的Jurkat细胞的结合进行比较。如图5B中展示的，与Molt4细胞的结合与图5A中看到的类似，而未检测到与Jurkat细胞的显著结合。
还测试了抗体AB1020243(杂交瘤mIgG)与不同形式的CCR9的结合。简而言之，将测试抗体在含有汉克斯平衡盐溶液(西格玛(Sigma)HB264)加0.1％牛血清白蛋白(西格玛A9576)的测定缓冲液中稀释至60ug/mL的浓度。将抗体使用在24个点上的单倍滴定一式两份滴定在384黑色透明底部的非结合微板(NBSTM3655)上，使得测试抗体的最终体积是10uL/孔。根据制造商的说明书制备第二检测抗体Alexa Fluor 647标记的人IgG(H+L)(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno-Research)；209-665-082)，并且将其在如上所述的测定缓冲液中1:1000稀释。使用Multidrop分配器(赛默科技公司(Thermo Scientific))将第二检测抗体以10uL/孔的体积分配至含有测试抗体的测定板中。
将转染的HEK CCR9过表达细胞系或未转染的亲本对照细胞以1x106个细胞/ml的浓度悬浮于测定缓冲液中，并且使用Multidrop分配器(赛默科技公司)将10uL细胞分配至含有测试抗体和第二抗体的测定板中。将测定板在4℃下孵育过夜，并且使用488nm下的激发和使用FL4通道(667-685nm)的发射在(激光扫描荧光细胞仪；TTP实验室技术公司(TTP-Labtech))上读取。将数据在Windows的GraphPad Prism版8.0.0(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，圣地亚哥，美国加利福尼亚州)中绘制并且表示为Log(mg/mL抗体)相对于荧光(FL4)技术。如图6中展示的，它显示出AB1020243与CCR9的两种人形式(CCR9A和CCR9B)和与食蟹猴CCR9的良好结合。它显示出与小鼠或大鼠CCR9很少或没有结合。
5.11.2体外ADCC生物测定
如下使用NK细胞激活测定评估抗体的效力和效应子功能：全部效力测定以5:1的效应物(NK-92MI CD16a NFAT细胞)与靶标(Molt4；HEK CCR9过表达细胞或Jurkat细胞)比率运行。效应NK-92细胞系不天然表达FcγRIIIa受体(CD16)。使用NK-92的修饰形式，该修饰形式过表达具有与Fc结构域的增加结合的高亲和力(ha)CD16V158 FcγRIIIa受体(Boissel等人Proceedings of the 107th Annual Meeting of the AmericanAssociation for Cancer Research[美国癌症研究协会的第107届年会的论文集]；2016年4月16-20日；New Orleans[新奥尔良],LA.[路易斯安那州]Philadelphia[费城](PA):AACR；Cancer Res[癌症研究]2016；76(14增刊):摘要2302)。此受体经由与靶细胞结合的抗体允许NK细胞交联至靶细胞。使用的NK-92细胞也表达NFAT萤光素酶报告物，该报告物可以用作效应子功能的替代物。靶标结合抗体与NK细胞的结合诱导驱动萤光素酶报告基因的NFAT转录因子的激活。发光信号与ADCC活性成比例。
在含有高级RPMI(GibcoTM；12633)和10％超低IgG FBS(GibcoTM；16250-078)的测定培养基中制备靶细胞和效应细胞两者。将靶细胞以8x 105个细胞/mL的浓度重悬并且将效应细胞以8x 106个细胞/mL的浓度重悬。将测试抗体稀释至60μg/mL的浓度，并且在384孔聚丙烯微板(葛莱娜第一生化国际公司(Greiner Bio-one International)；781280)上在12个点上进行一式两份4倍滴定。
使用Multidrop分配器(赛默科技公司)将靶细胞以12.5μL/孔的体积分配至384孔白色透明底部组织培养处理板(3560)中。然后使用Bravo自动液体处理平台(安捷伦公司(Agilent))将测试抗体(6.25μL/孔)添加至含有靶细胞的板中。将靶细胞和抗体在37℃下在O2/CO2培养箱中预孵育30分钟。然后使用Multidrop分配器(赛默科技公司)以6.25μL/孔的体积添加效应细胞。将含有靶细胞、效应细胞和抗体的测定板再在37℃下在O2/CO2培养箱中再孵育5小时。
在孵育期结束时，根据制造商的说明书(Steady- 萤光素酶测定系统；普洛麦格公司(Promega)E2520)制备萤光素酶检测试剂，并且使用手动移液将25μL分配至每个孔中。将测定板用箔覆盖并且使其在板振荡器上在室温下经历裂解20分钟。在/>2105多模式读板仪(珀金埃尔默公司)上使用超敏发光模式读取测定板。在Windows的GraphPad Prism版8.0.0(GraphPad软件公司，圣地亚哥，美国加利福尼亚州)中使用四参数log(激动剂)与应答逻辑斯谛方程分析数据。将数据表示为Log(摩尔)抗体浓度相对于应答(计数/秒)。
图7示出了(无岩藻糖基化)抗体当与MOLT4/HEK细胞结合时的NK细胞激活。抗体的无岩藻糖基化形式由双重表达盒产生，由此将重链IgG表达与RMD酶共表达以在CHO细胞中产生无岩藻糖基化蛋白。AB1020243afuc抗体在与表达人CCR9A的HEK细胞结合时的效力测量为0.5nM。人源化AB1020243afuc抗体在与Molt4细胞结合时的效力测量为0.8nM。
5.11.3PBMC杀伤测定
将抗体以10μg/mL的起始浓度在8个点上进行系列滴定(10倍)。将抗体添加至在u型底部96孔板中的1x106个人外周血单核细胞(PBMC)中并且孵育过夜。第二天，通过流式细胞术使用非竞争性CCR9抗体测量剩余CCR9表达CD4 T细胞的百分比。非竞争性抗体的VH/VL和CDR序列示出于表5和表6中。如图8中展示的，抗体AB1020243、AB1020229和AB1020011全部显示出对CCR9+PBMC的杀伤。AB1020243afuc的EC50(n＝4)测量为2.6nM。
表5：非竞争性CCR9抗体的VH和VL区的氨基酸序列。
表6：非竞争性CCR9抗体的CDR的氨基酸序列。
表7：重链和轻链恒定区的氨基酸序列
5.12实例5-人源化AB1020243的特性
人源化AB1020243如实例3中那样产生。在此前所述的全部实验中，将人源化AB1020243以无岩藻糖基化形式由双重表达盒产生，由此重链IgG表达与GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)共表达以CHO细胞中产生无岩藻糖基化蛋白。
5.12.1人源化AB1020243的CCR9交叉反应性
基于实例4中所述的方法将亲本AB1020243抗体(嵌合)的结合与人源化形式的结合进行比较。
如图9中展示的，人源化抗体(“人”)对食蟹猴CCR9和表达人CCR9B的HEK细胞(图9A和图9B)保留了与亲本AB1020243(“嵌合”)类似的结合。对不表达CCR9的亲本HEK JI细胞系未看到显著的结合(图9G)。甚至在较高浓度下，人源化AB1020243未显示出与CXCR1(图9C)、CXCR2(图9D)、CCR5(图9E)或CCR8(图9F)的显著脱靶结合。
5.12.2人源化AB1020243保留了高效力
AB1020243的人源化令人惊讶地未导致NK细胞激活测定中效力的显著变化(图10)。AB1020243afuc的嵌合和人源化形式使用MOLT4细胞产生相同程度的上述NK-92细胞系激活。这与在人源化后观察到效力的大降低的基准无岩藻糖基化小鼠抗CCR9 IgG1抗体(3C3，ATCC HB-12653)形成对比。类似地，人源化未改变与过表达食蟹猴CCR9A的HEK细胞结合的AB1020243afuc的效力。
还发现AB1020243afuc抗体的动力学特性未通过人源化显著变化。使用LigandTracer技术，使用荧光标记抗体进行CCR9+活细胞测量。简而言之，在室温(约22℃)下，在LigandTracer仪器(里奇维尤仪器公司(Ridgeview Instruments))上使用633nm荧光检测器测量细胞上亲和力。将呈人IgG1形式的IgG特别地用DyLight 650马来酰亚胺荧光团在IgG的CH2区上的工程化半胱氨酸残基上进行标记。将标记的IgG添加至圆形Nunclon D板中，该板具有CHO K1亲本(对照)和CCR9表达CHO K1细胞的预粘附离散斑点。在仪器上测量IgG结合和离解荧光概况，并且然后在TraceDrawer软件(里奇维尤仪器公司)中用二价(1:2)型拟合模型分析。AB1020243afuc的解离速率(kd)测量为3.85x 10-5s-1，并且这在人源化之后保持类似，测量为4.3x 10-5s1。这与人源化后未观察到效力降低一致(图10B)。
5.12.3与CCL25竞争的能力
在HTRF IP-One Gq测定(Cis-Bio公司；62IPAPEB)中测试人源化AB1020243与CCL25竞争的能力。IP-One测定是使用铽穴状化合物标记的抗IP1 Mab和d2标记的IP1的竞争性免疫测定。IP1是IP级联的下游代谢物并且在Gq受体激活后在细胞中累积并且在LiCl的存在下是稳定的。将LiCl添加至细胞刺激缓冲液，从而在受体激活时引起IP1的累积。
将测试抗体缓冲液交换至IP-One缓冲液(克雷布斯-林格(Krebs Ringer)溶液+LiCl)中，并且从IP-One缓冲液的纯态使用一加一稀释系列在16个点(一式三份)上系列稀释在384孔聚丙烯微板(葛莱娜第一生化国际公司；781280)上，并且使用Bravo自动液体处理平台(安捷伦公司)将3.5mL每种抗体添加至白色384浅板(Costar；4513)中。收获MOLT 4细胞并且将其重悬于IP-One测定缓冲液中至5.4x 106个细胞/mL，并且使用Multidrop分配器(赛默科技公司)将7.5μL细胞分配至含有抗体的板中，使得最终细胞是40,000个细胞/孔。将抗体与细胞一起预孵育30分钟。根据制造者说明书将重组人CCL25/TECK蛋白(R&D系统公司；9046-TK)重构至200nM，并且使用Multidrop分配器(赛默科技公司)将3.5uL分配至含有抗体和细胞的板中，使得最终测定浓度是50nM。将测定板在37C下孵育90分钟，之后根据IP-One HTRF方案使用以试剂盒提供的试剂进行处理。图11显示人源化AB1020243以及CDR优化抗体234LO0331和243LO0326保留与亲本嵌合AB1020243抗体类似的与CCL25竞争的能力。因此本发明抗体与先前所述的小鼠CCR9抗体92R和91R形成对比，这些先前所述抗体例如不抑制CCL25诱导的CCR9+MOLT-4细胞的迁移并且仅与CCL25部分竞争结合MOLT-4细胞[4]。
5.13实例6-CDR优化抗体的特性
如实例3中所陈述，产生了人源化AB1020243的CDR优化形式。在本文所述的所有实验中，CDR优化抗体呈无岩藻糖基化形式。CDR优化抗体经格式化以降低LCDR1中Asn脱酰胺化的风险。
5.13.1CCR9结合
基于实例4中所述的方法，测试CDR优化AB1020243结合不同形式的CCR9和不同细胞类型的能力。如图12中展示的，243LO0326和亲本抗体AB1020243显示出与人同种型CCR9A和CCR9B以及与食蟹猴CCR9A的类似结合。243LO0326和243LO0331两者甚至在高浓度下也未显示出与小鼠或大鼠CCR9的显著结合(数据未示出)。243LO0326和亲本抗体AB1020243也未显示出与CCR5、CCR8、CXCR1或CXCR2的任何脱靶受体结合。
5.13.2亲和力
如图13A中所示，243LO0326在延长的时间段内保持与膜结合，其中大多数抗体在37℃下在5小时之后保持在细胞表面上。相比之下，与细胞表面结合的亲本抗体AB1020243的量在前一小时内显著掉落。使用Ligand Tracer测量亲和力(KD)，对于243LO0326为0.09nM并且对于AB1020243为3.4nM。简而言之，在室温(约22℃)下，在LigandTracer仪器(里奇维尤仪器公司)上使用633nm荧光检测器测量细胞上亲和力。将呈人IgG1形式的IgG特别地用DyLight 650马来酰亚胺荧光团在IgG的CH2区上的工程化半胱氨酸残基上进行标记。将标记的IgG添加至圆形Nunclon D板中，该板具有CHO K1亲本(对照)和CCR9表达CHOK1细胞的预粘附离散斑点。在仪器上测量IgG结合和离解荧光概况，并且然后在TraceDrawer软件(里奇维尤仪器公司)中用二价(1:2)型拟合模型分析。
如图13B中所示，在用抗体处理的膜上仅看到CCR9受体水平的稍微降低。为了比较，CCL25处理诱导膜上CCR9受体的较大减少。进一步显示抗CCR9抗体能够防止CCL25诱导的内化(图19)。
5.13.3效力
如实例4中所述那样测试CDR优化AB1020243诱导NK细胞激活和PBMC杀伤的能力。图14A示出了抗体在NK细胞激活测定中的作用。发现243LO0326比亲本抗体AB1020243更有效力。图14B示出了243LO0326和亲本抗体AB1020243对PBMC的杀伤。243LO0326示出了改善的效力，其EC50为4pM，而AB1020243的EC50为200pM。图14C显示243LO0346具有类似的诱导人和食蟹猴CD4+CCR9+PBMC两者的杀伤的能力，其中使用人PBMC的EC50测量为4-5pM并且使用食蟹猴PBMC的EC50为30pM。
5.13.4无岩藻糖基化
抗CCR9抗体的无岩藻糖基化增强细胞杀伤，如ADCC NK细胞激活测定中所示的(图15A)。在岩藻糖基化(fuc)加标研究中使用体外ADCC生物测定(参见5.11.2部分)评估岩藻糖基化对抗体(243LO0326)的效力的影响。对于高达约10％岩藻糖基化，与100％无岩藻糖基分子相比保留了抗体的ADCC效力。对于高达50％的岩藻糖基化保留了可接受的效力(图15B)。
表8：岩藻糖基化相对于无岩藻糖基化物质的ADCC活性-加标研究
1近似岩藻糖基化水平，Tox fuc水平＝0.8％
2RP(相对效力)％是来自两次独立测定运行的组合值
3NR＝未报告的-样品由于严重效力丧失而不满足适用性标准
5.14实例7-体外和体内作用
5.14.1CCR9+细胞在食蟹猴中的抗体耗尽
向猴静脉内注射单一剂量的同种型对照抗体和10mg/kg243LO0326。在各种时间点评估血液中的CCR9+记忆CD4+T细胞的百分比。图16A显示在第15天血液中存在的CCR9+细胞减少，其中10mg/kg 243LO0326在此时间点完全消除CCR9+细胞。特别地，在高剂量和低剂量(10mg/kg)下，243LO0326耗尽外周血(图16B)、回肠(图16C)和粘膜(图16D)中的CCR9+T细胞。CCR9+T细胞的耗尽是组织和细胞特异性的(图17)。243LO0326选择性地耗尽CCR9+肠道淋巴细胞，而肠外群体相对保留，对胸腺T细胞没有影响。
5.14.2肠道外植体模型
如Vadstrup等人中所述，从健康人受试者和患有炎性肠病的人受试者获取肠道粘膜层的6mm针刺活检[10]。在243LO0326存在或不存在下将外植体组织培养12-84小时。评估CCR9+细胞的百分比以及以下炎症的关键介体：IL-6、GM-CSF和IL-22。图18显示在测试的每个外植体中，用抗体的处理耗尽CCR9+CD4+细胞(图18A)并且降低炎性介体(图18B至图18D)。来自健康受试者之一的外植体组织也显示出高水平的IL-6、GM-CSF和IL-22，它们在抗CCR9处理时降低。
5.15实例7-抗CCR9抗体阻断CCL25诱导的CCR9内化
IHC数据令人惊讶地表明在发炎克罗恩回肠中存在定量上较低的CCR9表达。在发炎克罗恩回肠中以较高水平表达的CCL25的激活后，离体CCR9内化。这表明在发炎肠道中，病原性T细胞上的CCR9在CCL25的激活后被内化。尽管如此，在克罗恩回肠中表达CCR9的细胞显示出促炎性且常驻的记忆表型。
在用于检测CCR9内化的测定中，CDR优化的无岩藻糖基化抗体243LO0326在2nM的浓度下能够防止CCL25诱导的内化(图19)。通过FACS评估CCL25诱导的内化。有利地，阻断CCL25诱导的内化防止受体再循环。本发明抗体因此有利地诱导ADCC、阻断CRR9受体的CCL25连接并且在CCR9表达T细胞上防止CCL25诱导的CCR9受体再循环。
5.16结论
总之，这些数据显示抗CCR9治疗是对于患有IBD的患者可行的治疗选择。表达促炎细胞因子的CRR9+T细胞表达于患有炎性肠病的患者的肠道和血液中(图1和图2)。以上所述的抗CCR9抗体结合CCR9表达T细胞上的人CCR9(图5和图6)。这些抗体的无岩藻糖基化形式激活NK细胞以促进ADCC(图7和图15)，从而导致靶向性细胞杀伤(图8)。抗体克隆之一的人源化令人惊讶地与嵌合亲本抗体相比未降低抗体对人CCR9的亲和力(图9)，保持激活NK细胞的能力(图10A)并且保持与CCL25竞争的能力(图11)。
进行了人源化抗体之一的另外CDR优化。这些CDR优化的无岩藻糖基化抗体(243LO0326和243LO0331)与亲本抗体相比在延长的时间段内结合膜结合CCR9，并且具有0.09至3.4nM的亲和力(KD)(图13)。CDR优化抗体进一步能够诱导NK细胞激活和PBMC杀伤。243LO0326比AB1020243更有效力(图14)。243LO0326进一步能够抑制CCL25诱导的CCR9内化(图19)。243LO0326治疗还减少血液中的CCR9 T细胞(图16)。对来自IBD患者的肠道外植体组织的243LO0326处理耗尽CCR9+CD4+细胞(图16A)并且降低炎性介体(图16B至图16D)。243LO0326由此是高度有效力的，并且对CCR9具有特异性。细胞耗尽经由ADCC发生；然而，在不存在ADCC效应细胞(诸如NK细胞)的情况下，243LO0326也阻断CCR9与其配体CCL25之间的结合。
鉴于本文所披露的CCR9抗体能够结合hCCR9的两种同种型CCR9A和CCRB，并且与CCL25竞争结合CCR9，预期表位位于CCR9B的细胞外N末端内，即CCR9B的氨基酸位置1-36：MADDYGSESTSSMEDYVNFNFTDFYCEKNNVRQFAS(SEQ ID NO:80)，这对应于CCR9A的氨基酸位置13-48(表9、表10、图20)。
表9：抗体表位序列
表10：hCCR9同种型的序列
本文所披露的CCR9靶向抗体能够阻断CCL25与CCR9的结合并且耗尽CCR9+T细胞。在肠道的炎性自身免疫性疾病中，预期本文所披露的抗体均耗尽血液和肠道组织中的CCR9+病原性T细胞并且在病原性T细胞未被完全耗尽的情况下阻断CCL25与CCR9的结合。预期此双重作用机制提供持续性治疗作用。CCR9+肠道向性效应记忆T细胞的特异性耗尽将诱导并维持持久缓解并且实现疾病缓和。
参考文献
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序列表
<110> 免疫医疗有限公司（MEDIMMUNE LIMITED）
<120> 治疗性结合分子
<130> P66338GB
<160> 82
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
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<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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<220>
<223>合成肽
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Gly
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<220>
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
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<220>
<223>合成肽
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<220>
<223>合成肽
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<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Thr Tyr Ala Met Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Arg Ile Arg Ser Lys Ser Ser Asn Phe Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 15
Gly Gly Ser Asp Tyr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 16
Lys Ser Cys Gln Cys Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 17
Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Leu Gln Gly Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221> 变体
<222> 9..9
<223> X1是P或S
<220>
<221> 变体
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Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Xaa Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu His
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 20
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Pro Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 21
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 22
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
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<211> 19
<212> PRT
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<220>
<223>合成肽
<400> 23
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 24
Gly Gly Gly Phe Asp Tyr
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 25
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 26
Leu Gln Gly Thr Tyr Tyr Pro Phe Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 28
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 29
Asp Pro Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 30
Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Gly Gly Leu Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 32
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 33
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Phe Gln Gly Thr His Val Pro His Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 35
Asn Tyr Trp Met Asn
1 5
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<220>
<223>合成肽
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Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 37
Arg Pro Phe Ser Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 38
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 39
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Ser Tyr Val Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 41
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
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Asn Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Met Asp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 43
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 44
Lys Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 45
Gln Ile Lys Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 46
Arg Pro Phe Thr Tyr
1 5
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 47
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 48
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 49
Arg Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成肽
<400> 50
Lys Val Ser Lys Arg Leu Ser
1 5
<210> 51
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Tyr Tyr Ser Asn Tyr Val Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Pro
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变体
<222> 32..32
<220>
<221> 变体
<222> 34..34
<223> X1和X2是 任何氨基酸；或者X1是P或S并且X2是R、T或G
<400> 55
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Xaa
20 25 30
Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Tyr Tyr Ser Asn Tyr Val Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 58
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ala
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Phe Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Gln Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 60
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Ser Asn Phe Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Cys Gln Cys Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Gly Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro His Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Glu Arg Pro Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Gly Gly Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 72
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Val Gln Ile Lys Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Leu Arg Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 73
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Asp Val Leu Met Thr Gln Asn Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Ile His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 74
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Glu Arg Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变体
<222> 32..32
<223> X1 = 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 34..34
<223> X2 = 任何氨基酸
<400> 76
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Xaa
20 25 30
Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 77
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 变体
<222> 32..32
<223> X1是P或S
<220>
<221> 变体
<222> 34..34
<223> X2是R、T或G
<400> 77
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Xaa
20 25 30
Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 78
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 80
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 80
Met Ala Asp Asp Tyr Gly Ser Glu Ser Thr Ser Ser Met Glu Asp Tyr
1 5 10 15
Val Asn Phe Asn Phe Thr Asp Phe Tyr Cys Glu Lys Asn Asn Val Arg
20 25 30
Gln Phe Ala Ser
35
<210> 81
<211> 369
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 81
Met Thr Pro Thr Asp Phe Thr Ser Pro Ile Pro Asn Met Ala Asp Asp
1 5 10 15
Tyr Gly Ser Glu Ser Thr Ser Ser Met Glu Asp Tyr Val Asn Phe Asn
20 25 30
Phe Thr Asp Phe Tyr Cys Glu Lys Asn Asn Val Arg Gln Phe Ala Ser
35 40 45
His Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Trp Leu Val Phe Ile Val Gly Ala Leu
50 55 60
Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Tyr Trp Tyr Cys Thr Arg Val Lys
65 70 75 80
Thr Met Thr Asp Met Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu
85 90 95
Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Gln Trp
100 105 110
Lys Phe Gln Thr Phe Met Cys Lys Val Val Asn Ser Met Tyr Lys Met
115 120 125
Asn Phe Tyr Ser Cys Val Leu Leu Ile Met Cys Ile Ser Val Asp Arg
130 135 140
Tyr Ile Ala Ile Ala Gln Ala Met Arg Ala His Thr Trp Arg Glu Lys
145 150 155 160
Arg Leu Leu Tyr Ser Lys Met Val Cys Phe Thr Ile Trp Val Leu Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Cys Ile Pro Glu Ile Leu Tyr Ser Gln Ile Lys Glu Glu
180 185 190
Ser Gly Ile Ala Ile Cys Thr Met Val Tyr Pro Ser Asp Glu Ser Thr
195 200 205
Lys Leu Lys Ser Ala Val Leu Thr Leu Lys Val Ile Leu Gly Phe Phe
210 215 220
Leu Pro Phe Val Val Met Ala Cys Cys Tyr Thr Ile Ile Ile His Thr
225 230 235 240
Leu Ile Gln Ala Lys Lys Ser Ser Lys His Lys Ala Leu Lys Val Thr
245 250 255
Ile Thr Val Leu Thr Val Phe Val Leu Ser Gln Phe Pro Tyr Asn Cys
260 265 270
Ile Leu Leu Val Gln Thr Ile Asp Ala Tyr Ala Met Phe Ile Ser Asn
275 280 285
Cys Ala Val Ser Thr Asn Ile Asp Ile Cys Phe Gln Val Thr Gln Thr
290 295 300
Ile Ala Phe Phe His Ser Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr Val Phe Val
305 310 315 320
Gly Glu Arg Phe Arg Arg Asp Leu Val Lys Thr Leu Lys Asn Leu Gly
325 330 335
Cys Ile Ser Gln Ala Gln Trp Val Ser Phe Thr Arg Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Lys Leu Ser Ser Met Leu Leu Glu Thr Thr Ser Gly Ala Leu Ser
355 360 365
Leu
<210> 82
<211> 357
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 82
Met Ala Asp Asp Tyr Gly Ser Glu Ser Thr Ser Ser Met Glu Asp Tyr
1 5 10 15
Val Asn Phe Asn Phe Thr Asp Phe Tyr Cys Glu Lys Asn Asn Val Arg
20 25 30
Gln Phe Ala Ser His Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Trp Leu Val Phe Ile
35 40 45
Val Gly Ala Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Tyr Trp Tyr Cys
50 55 60
Thr Arg Val Lys Thr Met Thr Asp Met Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ile
65 70 75 80
Ala Asp Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ala Ile Ala Ala
85 90 95
Ala Asp Gln Trp Lys Phe Gln Thr Phe Met Cys Lys Val Val Asn Ser
100 105 110
Met Tyr Lys Met Asn Phe Tyr Ser Cys Val Leu Leu Ile Met Cys Ile
115 120 125
Ser Val Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Ala Gln Ala Met Arg Ala His Thr
130 135 140
Trp Arg Glu Lys Arg Leu Leu Tyr Ser Lys Met Val Cys Phe Thr Ile
145 150 155 160
Trp Val Leu Ala Ala Ala Leu Cys Ile Pro Glu Ile Leu Tyr Ser Gln
165 170 175
Ile Lys Glu Glu Ser Gly Ile Ala Ile Cys Thr Met Val Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Glu Ser Thr Lys Leu Lys Ser Ala Val Leu Thr Leu Lys Val Ile
195 200 205
Leu Gly Phe Phe Leu Pro Phe Val Val Met Ala Cys Cys Tyr Thr Ile
210 215 220
Ile Ile His Thr Leu Ile Gln Ala Lys Lys Ser Ser Lys His Lys Ala
225 230 235 240
Leu Lys Val Thr Ile Thr Val Leu Thr Val Phe Val Leu Ser Gln Phe
245 250 255
Pro Tyr Asn Cys Ile Leu Leu Val Gln Thr Ile Asp Ala Tyr Ala Met
260 265 270
Phe Ile Ser Asn Cys Ala Val Ser Thr Asn Ile Asp Ile Cys Phe Gln
275 280 285
Val Thr Gln Thr Ile Ala Phe Phe His Ser Cys Leu Asn Pro Val Leu
290 295 300
Tyr Val Phe Val Gly Glu Arg Phe Arg Arg Asp Leu Val Lys Thr Leu
305 310 315 320
Lys Asn Leu Gly Cys Ile Ser Gln Ala Gln Trp Val Ser Phe Thr Arg
325 330 335
Arg Glu Gly Ser Leu Lys Leu Ser Ser Met Leu Leu Glu Thr Thr Ser
340 345 350
Gly Ala Leu Ser Leu
355

Claims (40)

1.一种结合分子，该结合分子结合CCR9并且包含具有一组CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变(VH)区和具有一组CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ IDNO:6的LCDR3；
(b)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2和SEQ ID NO:9的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQID NO:12的LCDR3；或者
(c)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:13的HCDR1、SEQ ID NO:14的HCDR2和SEQ ID NO:15的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:16的LCDR1、SEQ ID NO:17的LCDR2和SEQ ID NO:18的LCDR3
或者其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的结合分子，其中VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR3，并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:6的LCDR3以及具有选自以下的氨基酸序列的LCDR1：
(a)SEQ ID NO:4；
(b)SEQ ID NO:19；
(c)SEQ ID NO:20；
(d)SEQ ID NO:21；以及
(e)SEQ ID NO:22。
3.如权利要求1(a)或权利要求2所述的结合分子，其中
(i)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:51或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列以及；VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:52或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；
(ii)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:51或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列以及；VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:53或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；
(iii)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:51或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列以及；VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:54或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；
(iv)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:51或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；以及VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:55；或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；或者
(v)VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:56或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列以及；VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:57或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
4.如权利要求1所述的结合分子，其中
(i)该结合分子包含如权利要求1(b)中所定义的VH区和VL区，其中VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:58或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；并且其中VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:59或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；或者
(ii)该结合分子包含如权利要求1(c)中所定义的VH区和VL区，其中VH区氨基酸序列包含SEQ ID NO:60或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列；并且VL区氨基酸序列包含SEQ ID NO:61或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
5.如权利要求1-3中任一项所述的结合分子，其中该结合分子抑制CCL25与CCR9的结合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的结合分子，其中该结合分子是抗CCR9抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求6所述的结合分子，其中该抗CCR9抗体或其抗原结合片段是人源化的、嵌合的或全人的。
8.如权利要求6或7所述的结合分子，该结合分子是：
(a)IgG免疫球蛋白或其片段；或者
(b)IgG1免疫球蛋白或其片段。
9.如权利要求1-8中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子包含免疫球蛋白Fc结构域或其保留结合一种或多种Fc受体的能力的片段。
10.如权利要求9所述的结合分子，其中该免疫球蛋白Fc结构域或片段：
(a)是IgG Fc结构域或其片段；
(b)是人IgG Fc结构域或其片段；
(c)是人IgG1 Fc结构域或其片段；
(d)与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致对一种或多种Fcγ受体的亲和力增加；
(e)与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性应答增强；和/或
(f)包含在氨基酸位置297处的无岩藻糖基化N连接聚糖。
11.如权利要求1-10中任一项所述的结合分子，其中该结合分子是：
(a)无岩藻糖基化的；
(b)在氨基酸位置297处无岩藻糖基化的；或者
(c)以组合物存在，该组合物包含所述结合分子的多个拷贝，其中该组合物中该结合分子的这些拷贝中的至少50％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％是无岩藻糖基化的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的结合分子，其中该结合分子：
(a)结合人CCR9；
(b)结合人CCR9A和人CCR9B；
(c)结合食蟹猴CCR9；和/或
(e)不结合CCR5、CCR8、CXCR1或CXCR2。
13.如权利要求1-12中任一项所述的结合分子，其中该结合分子：
(a)能够介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；
(b)能够介导针对它所结合的CCR9表达淋巴细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；
(c)可以被FcγR结合；
(d)可以被FcγRIIIa结合；
(e)能够使免疫效应细胞与CCR9表达细胞交联；
(f)能够使免疫效应细胞与CCR9表达细胞交联并且激活该效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；
(g)能够抑制CCL25诱导的CCR9受体内化；
(h)能够抑制CCL25介导的CCR9表达T细胞向肠道的迁移；
(i)能够使免疫效应细胞与CCR9表达细胞交联并且激活该效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，从而引起该CCR9表达细胞的裂解；和/或
(j)能够耗尽包含CCR9表达细胞和免疫效应细胞的细胞群体中的CCR9表达细胞。
14.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中该结合分子能够以约0.1nM、任选地0.09nM的亲和力(KD)结合人CCR9。
15.一种结合分子，该结合分子结合CCR9，其中该结合分子与如权利要求1-14中任一项所述的结合分子竞争结合CCR9。
16.如权利要求15所述的结合分子，其中该结合分子其中该结合分子是：
(a)无岩藻糖基化的；
(b)在氨基酸位置297处无岩藻糖基化的；或者
(c)以组合物存在，该组合物包含所述结合分子的多个拷贝，其中该组合物中该结合分子的这些拷贝中的至少50％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％是无岩藻糖基化的。
17.如权利要求15所述的结合分子，其中该免疫球蛋白Fc结构域或片段：
(a)是IgG Fc结构域或其片段；
(b)是人IgG Fc结构域或其片段；
(c)是人IgG1 Fc结构域或其片段；
(d)与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致对一种或多种Fcγ受体的亲和力增加；
(e)与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性应答增强；和/或
(f)包含在氨基酸位置297处的无岩藻糖基化N连接聚糖。
18.一种结合分子，该结合分子结合CCR9，其中该结合分子不与如权利要求1-14中任一项所述的结合分子竞争结合CCR9。
19.一种治疗剂，该治疗剂包含作为活性成分的抗CCR9抗体，其中该抗CCR9抗体与CCL25竞争结合人CCR9。
20.如权利要求19所述的治疗剂，其中该抗CCR9抗体抑制CCL25介导的CCR9内化。
21.如权利要求19或20所述的治疗剂，其中该抗CCR9抗体与CCL25竞争结合人CCR9A和CCR9B。
22.如权利要求19至21中任一项所述的治疗剂，其中该抗CCR9抗体特异性结合CCR9中的表位，其中该表位位于包含SEQ ID NO:80的序列内。
23.如权利要求19至21中任一项所述的治疗剂，其中该抗CCR9抗体是：
(a)无岩藻糖基化的；
(b)在氨基酸位置297处无岩藻糖基化的；或者
(c)以组合物存在，该组合物包含所述结合分子的多个拷贝，其中该组合物中该结合分子的这些拷贝中的至少50％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％是无岩藻糖基化的。
24.如权利要求19至21中任一项所述的治疗剂，其中该免疫球蛋白Fc结构域或片段：
(a)是IgG Fc结构域或其片段；
(b)是人IgG Fc结构域或其片段；
(c)是人IgG1 Fc结构域或其片段；
(d)与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致对一种或多种Fcγ受体的亲和力增加；
(e)与相应的野生型Fc结构域相比是修饰的，其中所述修饰导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性应答增强；和/或
(f)包含在氨基酸位置297处的无岩藻糖基化N连接聚糖。
25.如权利要求18所述的结合分子用于确定已经与如权利要求1-14中任一项所述的结合分子接触的样品中CCR9+细胞的丰度的用途。
26.一种评估如权利要求1-17中任一项所述的结合分子对CCR9表达细胞的耗尽的方法，该方法包括：
(i)使所述结合分子在以下条件下与细胞群体接触，其中该细胞群体包含CCR9表达细胞和免疫效应细胞，这些条件适于允许这些效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；
(ii)使所述细胞群体与结合CCR9并且不与步骤(i)的该结合分子竞争结合CCR9的结合分子接触；
(iii)检测该细胞群体中被(ii)的该结合分子结合的CCR9表达细胞；
(iv)将步骤(iii)中检测到的CCR9表达细胞的量与步骤(i)中使用的该原始细胞群体中CCR9表达细胞的量进行比较，并且从而确定在步骤(i)中耗尽的CCR9表达细胞的量。
27.如权利要求18所述的结合分子、如权利要求24所述的用途或如权利要求25所述的方法，其中所述不与如权利要求1-17中任一项所述的结合分子竞争结合CCR9的结合分子包含VH区氨基酸序列，该VH区氨基酸序列含有SEQ ID NO:44的HCDR1、SEQ ID NO:45的HCDR2和SEQ ID NO:46的HCDR3；和VL区氨基酸序列，该VL区氨基酸序列含有SEQ ID NO:47的LCDR1、SEQ ID NO:5的LCDR2和SEQ ID NO:48的LCDR3。
28.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码如权利要求1-17或18中任一项所述的结合分子。
29.一种载体，该载体包含：
(a)与启动子可操作地缔合的如权利要求27所述的多核苷酸；或者
(b)编码如权利要求1-3中任一项所定义的VH区的多核苷酸和编码如权利要求1-3中任一项所定义的VL区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。
30.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求27所述的多核苷酸或如权利要求28所述的载体。
31.一种产生如权利要求1-17或18中任一项所述的结合分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达如权利要求27所述的多核苷酸或如权利要求28所述的载体。
32.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-17中任一项所述的结合分子、和药学上可接受的载体或稀释剂。
33.如权利要求32所述的药物组合物，用于作为药剂使用。
34.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如权利要求1-17中任一项所述的结合分子、如权利要求19至23中任一项所述的治疗剂或如权利要求32所述的组合物。
35.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的结合CCR9的结合分子，其中
(a)所述结合分子能够介导针对它所结合的CCR9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(b)该结合分子与CCR9的结合不诱导CCR9的内化，和/或
(c)该结合分子与CC25竞争结合CCR9、任选地人CCR9、任选地人CCR9A和CCR9B。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中该疾病是CCR9介导的疾病，或者其中该疾病由CCR9表达细胞介导。
37.如权利要求36所述的方法，其中该疾病是炎性肠病。
38.如权利要求33所述的方法，其中该疾病选自下组，该组由以下组成：克罗恩病、回肠/回肠结肠克罗恩病和溃疡性结肠炎。
39.如权利要求33、34或35所述的方法，其中该疾病选自下组，该组由以下组成：T细胞急性成淋巴细胞性白血病、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、来自实体瘤的循环细胞、肝纤维化和急性肝脏炎症。
40.一种用于检测样品中CCR9多肽的存在的方法，该方法包括：
(a)使样品与如权利要求1-17或18中任一项所述的结合分子接触以提供结合分子-抗原复合物；
(b)检测所述结合分子-抗原复合物的存在或不存在；
(c)其中该结合分子-抗原复合物的存在确认了CCR9多肽的存在。
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