ES2353268T3 - Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est. - Google Patents
Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para generar un elemento de unión específica a un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST) que comprende: a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende aa) un elemento de fusión de (poli)péptido/proteína que se deposita en cuerpos de inclusión cuando se expresa en dicha célula hospedadora en dichas condiciones y que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso y ab) dicho (poli)péptido, en el que dicha célula hospedadora es E. coli; b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y c) generar una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que se une específicamente a dicho (poli)péptido seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuesto en la superficie de un fago filamentoso que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III, en el que la proteína del gen III se expone en la superficie de dicho fago filamentoso.
Description
La presente invención se refiere a la generación de elementos de unión específica que se unen a (poli)péptidos codificados por fragmentos de ADN genómico o EST. Los (poli)péptidos se expresan como parte de proteínas de fusión que forman cuerpos de inclusión en la expresión en células hospedadoras. Los cuerpos de inclusión se usan para generar elementos de unión que se unen específicamente a dichos (poli)péptidos. Los elementos de unión específica, en particular inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, son útiles para el análisis y la caracterización funcional de proteínas codificadas por secuencias de ácido nucleico que comprenden los correspondientes fragmentos de ADN genómico o EST. La invención se refiere adicionalmente a moléculas de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras para usar en los procedimientos de la presente invención.
La invención se refiere adicionalmente al uso de proteínas de fusión que comprenden el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso como elemento de fusión para la expresión de un (poli)péptido/proteína fusionado con dicho elemento de fusión, y a procedimientos para la expresión de (poli)péptidos/proteínas.
Desde hace varios años, se están realizando grandes esfuerzos por secuenciar el genoma humano, y por identificar y caracterizar la estructura y función de las proteínas codificadas en el mismo. Finalmente, esto conducirá a dianas novedosas para la prevención, diagnóstico y terapia de enfermedades. (Collins y Galas, 1993; Adams y col., 1995).
Actualmente, se están siguiendo dos enfoques diferentes para identificar y caracterizar los genes distribuidos a lo largo del genoma humano. En un enfoque, se aíslan, clonan y secuencian fragmentos grandes de ADN genómico. Se identifican los marcos abiertos de lectura potenciales en estas secuencias genómicas usando software bioinformático. Sin embargo, este enfoque implica secuenciar grandes tramos de ADN humano que no codifican proteínas para encontrar las secuencias de codificación de proteínas dispersadas a lo largo del genoma. Además de requerir una extensa secuenciación, el software bioinformático puede caracterizar erróneamente las secuencias genómicas obtenidas. Por tanto, el software puede producir falsos positivos en los que el ADN no codificante se caracteriza erróneamente como ADN codificante, o falsos negativos en que el ADN codificante se marca erróneamente como ADN no codificante.
En un enfoque alternativo, se sintetizan ADN complementarios (ADNc) a partir de ARN mensajeros aislados (ARNm) que codifican proteínas humanas. Usando este enfoque, la secuenciación se efectúa solo en ADN que deriva de secuencias de codificación de proteína del genoma. A menudo, se secuencian solo tramos cortos de los ADNc para obtener secuencias denominadas marcadores de secuencia expresada (EST) (documento
WO93/00353).
En principio, los EST pueden usarse entonces para aislar o purificar ADNc extendidos que incluyen secuencias adyacentes a las secuencias de EST. Estos ADNc extendidos pueden contener porciones o la secuencia de codificación completa del gen del que derivaba el EST.
Al analizar el ADN genómico o fragmentos del mismo, EST, ADNc extendidos y/o los (poli)péptidos/proteínas codificados por los mismos, en ciertos casos en que puede identificarse la homología, motivos estructurales, etc., puede ser posible asignar una función al (poli)péptido proteína que puede ensayarse o verificarse in vitro o in vivo. Sin embargo, los diversos esfuerzos de secuenciación de EST han conducido a números enormes de EST, y al problema de cómo estructurar esa información y cómo identificar las secuencias interesantes. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de desarrollar y usar herramientas de investigación dirigidas al (poli)péptido/proteína de interés para analizar su localización en la célula y los tipos de tejido, su regulación positiva o negativa en ciertas enfermedades o etapas de desarrollo o su papel en la activación o el bloqueo de ciertas interacciones o rutas de señalización.
Es un enfoque usar anticuerpos o fragmentos de los mismos como dichas herramientas de investigación. En el documento WO93/00353, se sugería expresar los EST y generar anticuerpos inmunizando animales con los correspondientes (poli)péptidos. En un enfoque similar, se han inyectado constructos de ADN que comprenden secuencias de EST en animales para generar una respuesta inmunitaria frente al (poli)péptido expresado in vivo (Sykes y Johnston, 1999). Sin embargo, estos enfoques no son factibles para una generación de anticuerpos de alto rendimiento.
Como alternativa, se generan anticuerpos contra series de péptidos superpuestos que cubren la secuencia de EST (Persic y col., 1999). En combinación con el cribado de colecciones de anticuerpos recombinantes, este enfoque puede desarrollarse en principio para generar fragmentos de anticuerpo como herramientas de investigación de alto rendimiento. Sin embargo, a menudo es difícil obtener anticuerpos anti-péptido con afinidades suficientemente altas.
Por tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar un procedimiento aplicable en general para la generación de elementos de unión específica que se unan a (poli)péptidos codificados por fragmentos de ADN genómico o por EST, especialmente de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, para el análisis y la caracterización funcional de las proteínas correspondientes al ADN genómico o EST. Se consigue la solución al problema técnico anterior proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. El enfoque técnico de la presente invención, proporcionar (poli)péptidos codificados por fragmentos de ADN genómico o EST para la generación de elementos de unión específica, tales como anticuerpos o productos derivados de anticuerpo, expresando los (poli)péptidos como fusiones con elementos de fusión de (poli)péptido/proteína que conducen a la formación de cuerpos de inclusión en la expresión en células hospedadoras tales como E. coli, y a generar elementos de unión específica frente a los cuerpos de inclusión y proteínas de fusión obtenidas a partir de los mismos, ni se proporciona ni se sugiere por la técnica anterior.
Un problema adicional relacionado con la presente invención era idear un procedimiento para la expresión de (poli)péptidos/proteínas que no se expresen fácilmente en forma libre, por ejemplo, porque son tóxicos para la célula hospedadora. La solución a ese problema técnico se consigue también proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. El enfoque técnico de la presente invención, expresar (poli)péptidos/proteínas como proteínas de fusión que comprenden el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso, conduciendo a la formación de cuerpos de exclusión, no se proporciona ni sugiere por la técnica anterior.
Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para generar un elemento de unión específica a un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST) que comprende:
a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende
aa) un elemento de fusión de (poli)péptido/proteína que se deposita en
cuerpos de inclusión cuando se expresa en dicha célula hospedadora en
dichas condiciones y que comprende el primer dominio N-terminal de la
proteína del gen III de fago filamentoso y
ab) dicho (poli)péptido;
b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y
c) generar un elemento de unión específica que se une específicamente a dicho (poli)péptido, seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuesto en la superficie de un fago filamentoso, que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III, en el que la proteína del gen III se expone en la superficie de dicho fago filamentoso.
En el contexto de la presente invención, un “elemento de unión específica” es una molécula que es capaz de unirse específicamente a un (poli)péptido de interés. Dicho elemento de unión específica puede ser un péptido, un péptido limitado, una inmunoglobulina o fragmento de la misma o un elemento de unión afín de una proteína de origen natural, por ejemplo, un ligando de un receptor que comprende el (poli)péptido de interés. Dicho ligando afín puede ser obtenible cribando en una colección de expresión de ADNc la unión a la proteína de fusión de la presente invención. El elemento de unión específica puede ser también un elemento de unión específica no proteico tal como una molécula pequeña, por ejemplo obtenible cribando una colección combinatoria de moléculas pequeñas. Un elemento de unión específica puede modificarse adicionalmente para posibilitar la detección de la interacción de un elemento de unión específica y el correspondiente (poli)péptido. Dicha modificación puede ser un marcador de detección y/o purificación (Hochuli y col., 1988; Lindner y col., 1992; Hopp y col., 1988; Prickett y col., 1989; Knappik y Plückthun, 1994), o una enzima (Blake y col., 1984) o una molécula informadora fusionada o acoplada con el elemento de unión específica.
En el contexto de la presente invención, el término “(poli)péptido” se refiere a moléculas consistentes en una o más cadenas de múltiples aminoácidos, concretamente dos o más, ligados mediante enlaces peptídicos.
El término “proteína” designa (poli)péptidos en que al menos parte de los (poli)péptidos tiene o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida formando estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias en y/o entre su cadena o cadenas (poli)peptídicas. Esta definición comprende proteínas tales como proteínas de origen natural o al menos parcialmente artificiales, así como fragmentos o dominios de proteínas enteras, a condición de que estos fragmentos o dominios tengan una disposición tridimensional definida como se describe anteriormente.
El término “fragmento de ADN genómico” designa una secuencia de ácido nucleico contigua que forma parte del genoma de un organismo y que se obtiene o es obtenible a partir del mismo.
El término “marcadores de secuencia expresada (EST)” son secuencias de ADN contiguas obtenidas secuenciando tramos de ADNc.
Según la presente invención, dicho fragmento de ADN genómico o EST comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un (poli)péptido o consiste en un presunto marco abierto de lectura (ORF).
Las bases de datos de EST (Eckmann y col., 1998; Bouck y col., 1999) contienen a menudo secuencias de baja calidad de secuencia (Aaronson y col., 1996). Un experto en la técnica será capaz de identificar al menos un presunto ORF en un fragmento de ADN genómico o secuencia de EST dado, y no constituirá un problema significativo para el experto en la técnica clonar todos los ORF identificados de este modo para la expresión del correspondiente conjunto de dichas proteínas de fusión, y usarlos según la presente invención.
La longitud del fragmento de ADN genómico o EST es preferiblemente de entre 100 y
2.000 pares de bases, más preferiblemente de entre 200 y 1.500 pares de bases.
La molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según la presente invención, o un vector apropiado que comprende dicha molécula de ácido nucleico, comprende adicionalmente secuencias de ADN no codificantes que son necesarias para causar o permitir la expresión de la proteína de fusión. Son bien conocidos en la técnica procedimientos para la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión usada según la presente invención, para la construcción de vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, para la introducción de dichos vectores en células hospedadoras elegidas apropiadamente o para causar o conseguir la expresión de dichas proteínas de fusión (véanse, por ejemplo, Sambrook y col., 1989; Ausubel y col., 1994).
La formación de cuerpos de inclusión puede observarse en varios sistemas hospedadores en el transcurso de la expresión de un (poli)péptido/proteína. Los cuerpos de inclusión son agregados insolubles de (poli)péptido/proteína depositados en una célula hospedadora. Son partículas muy densas que exhiben una estructura amorfa o paracristalina independiente de su localización subcelular. En condiciones apropiadas, el (poli)péptido/proteína recombinante depositado en los cuerpos de inclusión asciende a aproximadamente un 50% o más de la proteína celular total. La formación de cuerpos de inclusión y sus propiedades y las aplicaciones de los mismos se han investigado con detalle (véanse, por ejemplo, Rudolph, 1996; Rudolph y Lilie, 1996; Rudolph y col., 1997; Lilie y col., 1998). Los procedimientos de purificación de cuerpos de inclusión se han descrito también en los mismos y son bien conocidos por el experto en la técnica.
Se ha descrito el uso de la formación de cuerpos de inclusión formados por la expresión de proteínas de fusión que comprenden un elemento de fusión y un (poli)péptido/proteína como medio general de expresar dicho (poli)péptido/proteína (documento WO 98/30684).
Puede ser un elemento de fusión adecuado para un procedimiento según la presente invención cualquier (poli)péptido/proteína que pueda encontrarse en cuerpos de inclusión cuando se expresa en una célula hospedadora. En la mayoría de casos, la formación de cuerpos de inclusión es una consecuencia de las altas tasas de expresión, independientemente del sistema o proteína usados. No parece haber correlación entre la tendencia a la formación de cuerpos de inclusión de una proteína dada y sus propiedades intrínsecas, tales como peso molecular, hidrofobicidad, rutas de plegamiento y demás. Los (poli)péptidos/proteínas en que se ha observado formación de cuerpos de inclusión y que, por lo tanto, son candidatos adecuados para usar como elementos de fusión según la presente invención, incluyen, pero sin limitación, proteínas de E. coli tales como proteína de unión a maltosa (Betton y Hofnung, 1996), ARNasa II (Coburn y Mackie, 1996), fosfatasa alcalina (Derman y Beckwith, 1995), fosfolipasa A (Dekker y col., 1995), β-lactamasa (Rinas y Bailey, 1993), tiorredoxina (Hoog, y col., 1984; WO 98/30684) y proteínas no de E. coli tales como procatepsina B humana (Kuhelj y col., 1995), interferón porcino γ (Vandenbroeck y col., 1993), o ADN polimerasa T5 (Chatterjee y col., 1991).
El hospedador designado anteriormente puede ser cualquiera de la serie usada habitualmente en la producción de proteínas incluyendo, pero sin limitación, bacterias tales como E. coli (véase, por ejemplo, Ge y col., 1995) o Bacillus subtilis (Wu y col., 1993); hongos tales como levaduras (Horwitz y col., 1988; Ridder y col., 1995) u hongos filamentosos (Nyyssönen y col., 1993); células vegetales (Hiatt, 1990, Hiatt y Ma, 1993; Whitelam y col., 1994); células de insecto (Potter y col., 1993; Ward y col., 1995), o células de mamífero (Trill y col., 1995).
La generación y opcionalmente identificación de “un elemento de unión que se une específicamente a dicho (poli)péptido” puede conseguirse usando una variedad de procedimientos, dependiendo del tipo de elemento de unión específica, que son bien conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, pueden cribarse y/o seleccionarse colecciones combinatorias de compuestos químicos, péptidos o biomoléculas, tales como inmunoglobulinas, frente al cuerpo de inclusión aislado como diana, preferiblemente después de purificación, o más preferiblemente, frente a la proteína de fusión obtenida a partir de dichos cuerpos de inclusión, en forma solubilizada o en forma replegada, o frente al (poli)péptido libre como diana (véanse, por ejemplo: http://www.5z.com/divinfo/reviews.html; Pinilla y col., 1999; Woodbury y Venton, 1999; Borman, 1999; Eisele y col., 1999; Lebl, 1999).
En una realización preferida del procedimiento de la invención, dicha proteína de fusión comprende dicho elemento de fusión como porción N-terminal y dicho (poli)péptido como porción C-terminal.
Se prefiere adicionalmente un procedimiento en el que dicha proteína de fusión comprende adicionalmente un ligante (poli)peptídico que liga dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido.
El ligante puede consistir en aproximadamente 1 a aproximadamente 30, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, aminoácidos.
Se prefiere particularmente un procedimiento en el que dicho ligante comprende una señal de escisión.
En el contexto de la presente invención, el término “señal de escisión” designa secuencias aminoacídicas que permiten escindir, por ejemplo mediante reacciones químicas o enzimáticas, la proteína de fusión entre dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido para
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poder obtener dicho (poli)péptido en forma libre. Dicha señal de escisión es preferiblemente una secuencia de reconocimiento específica de una proteasa bien conocida por un experto en la técnica, tal como enterocinasa o trombina. Como alternativa, la proteína de fusión podría escindirse mediante escisión química con un producto químico tal como bromuro de cianógeno.
Dicha proteína de fusión puede comprender adicionalmente secuencias (poli)peptídicas adiconales en el extremo N y/o C, y/o en dicho ligante (poli)peptídico. Esto comprende, por ejemplo, (poli)péptidos que permiten identificar y/o purificar dicha proteína de fusión. Son ejemplos de dicho (poli)péptido Hisn (Hochuli y col., 1988; Lindner y col., 1992), myc, FLAG (Hopp y col., 1988; Prickett y col., 1989; Knappik y Plückthun, 1994) o un marcador Strep (Schmidt y Skerra, 1993; Schmidt y Skerra, 1994; Schmidt y col., 1996). Estos marcadores son todos bien conocidos en la técnica y están completamente disponibles para el experto en la técnica.
En una realización preferida más del procedimiento de la invención, dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de un organismo procariótico o de un virus.
Lo más preferido es un procedimiento en el que dicho organismo procariótico o virus sea un patógeno.
Al secuenciar el genoma de organismos patógenos de seres humanos o patógenos de animales o plantas, se buscan nuevas dianas proteicas para prevención, diagnóstico y/o intervención terapéutica.
Se prefiere adicionalmente un procedimiento en el que dicho ácido nucleico se expresa en condiciones que permiten la sobreexpresión de dicha proteína de fusión.
En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un procedimiento en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de un organismo eucariótico.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de una especie no de mamífero.
Se prefiere adicionalmente un procedimiento en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de una especie de mamífero.
La realización más preferida de la presente invención se refiere a un procedimiento en el que dicha especie de mamífero es la humana.
En la realización más preferida del procedimiento de la invención, dicha célula hospedadora es una célula de E. coli.
Una realización preferida adicional de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha proteína de fusión se expresa en el citosol de una célula hospedadora bacteriana.
Se prefiere particularmente la expresión citosólica de proteínas de fusión según la presente invención, en la que dicho elemento de fusión contiene al menos un enlace disulfuro.
Se ha encontrado que puede preverse la formación de cuerpos de inclusión si se produce un (poli)péptido/proteína unido por disulfuro en el citosol bacteriano, ya que la formación de enlaces disulfuro no ocurre habitualmente en este compartimento celular reductor. La consecuencia es un plegamiento indebido que da como resultado agregación (Lilie y col., 1998).
Se prefiere adicionalmente un procedimiento en el que dicho elemento de fusión es una proteína secretada, y en el que dicho ácido nucleico no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal para el transporte de la proteína de fusión al periplasma.
Se ha observado que la expresión citosólica de (poli)péptido/proteína secretado conduce a la formación de cuerpos de inclusión (Lilie y col., 1998).
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento en el que dicho elemento de fusión es un (poli)péptido/proteína endógeno de dicha célula hospedadora.
Lo más preferido es un procedimiento en el que dicho elemento de fusión es un (poli)péptido/proteína extraño a dicha célula hospedadora.
En una realización más preferida adicional del procedimiento de la invención, dicha célula hospedadora es E. coli y dicho elemento de fusión comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso.
Preferiblemente, dicho elemento de fusión consiste en los dos dominios N-terminales de la proteína del gen III, más preferiblemente el primer dominio N-terminal de la proteína del gen
III. Lo más preferiblemente, dicho elemento de fusión consiste en los aminoácidos 1 a 82 de la proteína del gen III.
La infección de E. coli por los fagos filamentosos Ff f1, fd y M13 se inicia mediante la interacción de la proteína del gen III (g3p) localizada en un extremo de la partícula de fago con la punta de la pilosidad conjugativa con F (Model y Russel, 1988). La g3p madura (406 aminoácidos) consiste en 3 dominios separados por secuencias ligantes (Stengele y col., 1990; Krebber y col., 1997). Podrían asignarse los siguientes papeles a los dominios individuales: el dominio N-terminal de g3p (N1) es responsable de la penetración de membrana (Riechmann y Holliger, 1997), el dominio medio (N2) de la unión de la pilosidad con F bacteriana (Stengele y col., 1990) y el dominio C-terminal (CT) desempeña un papel en la morfogénesis de fago y tapa un extremo de la partícula de fago (Crissman y Smith, 1984). Se ha resuelto la estructura cristalina de los dos dominios N-terminales de g3p (N1-N2) y la estructura en disolución de N1 (Lubkowski y col., 1998; Holliger y Riechmann, 1997). Se mostró que el N1 purificado es altamente soluble y monomérico a concentraciones de mM (Holliger y Riechmann, 1997). Sin embargo, la expresión de N1 o N1-N2 en el citoplasma de E. coli conduce a la formación de cuerpos de inclusión a partir de los cuales pueden replegarse las proteínas (C. Krebber, 1996; Krebber y col., 1997). Puesto que la expresión de N1 y proteínas de fusión N1-N2 es tóxica para las células (C. Krebber, 1996), se prefiere una estrecha regulación de la transcripción de los genes de fusión usando, por ejemplo, el sistema de expresión pET (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) o pBAD (Invitrogen BV, Groningen, Holanda). El uso de estos vectores es aplicable en todos los casos en que se esperan, suponen u observan efectos tóxicos de los productos génicos, y es una de las primeras etapas bien conocidas por un experto en la técnica para ajustar las condiciones de expresión.
Los elementos de fusión que comprenden el primer dominio N-terminal de gIIIp son particularmente útiles, puesto que las proteínas de fusión que comprenden estos elementos de fusión forman fácilmente cuerpos de inclusión en la expresión citosólica, pero se solubilizan fácilmente (Krebber y col., 1997).
El elemento de fusión puede ser también una variante o mutante de un elemento de fusión original designado anteriormente en la presente memoria (tal como un (poli)péptido/proteína que comprende el primer dominio N-terminal de gIIIp), a condición de que dicha variante o mutante esté depositada en cuerpos de inclusión también cuando se expresa en células hospedadoras en condiciones en que el elemento de fusión original se deposita en cuerpos de inclusión. Dicha variante o mutante puede resultar del elemento de fusión original, por ejemplo, mediante adición, sustitución y/o deleción de uno o más residuos aminoacídicos. Puesto que la formación de cuerpos de inclusión en la expresión es una propiedad que puede controlarse fácilmente por un experto en la técnica, no requiere una dificultad significativa de experimentación para identificar variantes o mutantes con propiedades adecuadas para los procedimientos de la presente invención.
En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un procedimiento en el que la etapa b) comprende adicionalmente la etapa de (i) solubilizar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.
En una realización preferida adicional más, la presente invención se refiere a un procedimiento en el que la etapa b) comprende adicionalmente la etapa de (ii) replegar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.
Los procedimientos para solubilizar y/o replegar (poli)péptidos/proteínas encontrados
depositados en cuerpos de inclusión se han investigado concienzudamente y son bien conocidos por el facultativo experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Rudolph, 1996; Rudolph y Lilie, 1996; Rudolph y col., 1997; Lilie y col., 1998).
En otra realización preferida, la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha proteína de fusión comprende adicionalmente un ligante (poli)peptídico que liga dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido, en el que dicho ligante comprende una señal de escisión y en el que dicha etapa b) comprende adicionalmente las etapas de (iii) escindir dicha proteína de fusión entre dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido, y (iv) aislar dicho (poli)péptido en forma libre.
Se prefiere adicionalmente un procedimiento que comprende adicionalmente la etapa de purificar dicha proteína de fusión o dicho (poli)péptido en forma libre.
La construcción de proteínas de fusión que comprenden una señal de escisión que permite escindir la proteína de fusión entre dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido se han descrito anteriormente en la presente memoria.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, dicho elemento de unión específica es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
En este contexto, “inmunoglobulina” se usa como sinónimo de “anticuerpo”. Los fragmentos de inmunoglobulina según la presente invención pueden ser fragmentos Fv (Skerra y Plückthun, 1988), scFv (Bird y col., 1988; Huston y col., 1988), Fv ligado por disulfuro (Glockshuber y col., 1992; Brinkmann y col., 1993), Fab, (Fab’)2 u otros fragmentos bien conocidos por el facultativo experto en la técnica, que comprenden el dominio variable de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina.
Se prefiere particularmente el formato de fragmento scFv.
En la realización más preferida del procedimiento de la invención, dicha inmunoglobulina o fragmento de la misma se genera mediante (i) inmunización de un animal con dichos cuerpos de inclusión, dicha proteína de fusión o dicho (poli)péptido, y (ii) seleccionando una inmunoglobulina producida por dicho animal que se une específicamente a dichos cuerpos de inclusión, dicha proteína de fusión o dicho (poli)péptido.
Los procedimientos para inmunizar animales y para cribar y/o seleccionar inmunoglobulinas específicas son bien conocidos por el experto en la técnica.
En una realización más preferida adicional del procedimiento de la invención, dicha inmunoglobulina o fragmento de la misma se genera seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas que se une específicamente a dichos cuerpos de inclusión, dicha proteína de fusión o dicho (poli)péptido.
Se han descrito en diversas publicaciones colecciones recombinantes de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (véanse, por ejemplo, Vaughan y col., 1996; Knappik y col., 2000; WO 97/08320), y son bien conocidas por el experto en la técnica.
Se prefiere particularmente un procedimiento en el que dicha colección se expone en la superficie de un paquete genético replicable.
El término “paquete genético replicable” designa una entidad que combina el fenotipo y genotipo de miembros de una colección de (poli)péptidos/proteínas ligando la información genética que codifica el miembro de colección y el (poli)péptido/proteína expresado a partir del mismo. En la colección, puede cribarse y/o seleccionarse una propiedad deseada, y el (poli)péptido/proteína que se está cribando y/o seleccionando puede identificarse mediante la información genética asociada al mismo. Los ejemplos de “paquetes genéticos replicables” comprenden células tales como bacterias (documento WO 90/02809; Georgiou y col., 1993; Francisco y Georgiou, 1994; Daugherty y col., 1998), levaduras (Boder y Wittrup, 1997; Kieke y col., 1997; Cho y col., 1998; Kieke y col., 1999) células de insecto (Ernst y col., 1998), virus tales como bacteriófagos (documento WO 90/02809; Kay y col., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996), retrovirus (Russell y col., 1993), esporas (documento WO 90/02809) o complejos de moléculas de ácido nucleico y (poli)péptidos/proteínas expresados a partir de los mismos, tales como en complejos ribosómicos (Hanes y Plückthun, 1997; Hanes y col., 1998; Hanes y col., 1999) o en complejos conectados no covalentemente (Cull y col., 1992; Schatz, 1993; Schatz y col., 1996; Gates y col., 1996) o covalentemente (Nemoto y col., 1997).
Se prefiere adicionalmente un procedimiento en el que dicho paquete genético replicable es un fago filamentoso.
En el contexto de la presente invención, el término “fago filamentoso” designa una clase de bacteriófagos que son capaces de infectar una variedad de bacterias gramnegativas. Tienen un genoma de ADN monocatenario cerrado covalentemente que se empaqueta en una cubierta proteica formando un cilindro largo. Los mejores caracterizados de estos fagos son M13, fd y f1 y derivados de los mismos. El fago filamentoso se ha usado extensamente para la exposición de (poli)péptidos/proteínas extraños y colecciones de los mismos y se han revisado diversos enfoques y aplicaciones en varias publicaciones (por ejemplo, Kay y col., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996).
Se prefiere particularmente el uso de una proteína de fusión que comprende el dominio N-terminal de la proteína del gen III (g3p) de fago filamentoso como elemento de fusión para bioselección por afinidad de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuestos en la superficie de fago filamentoso.
Las siguientes propiedades de N1 lo hacen un candidato especialmente adecuado para usarse en la bioselección por afinidad de colecciones de exposición en fago:
- -
- N1 (aminoácidos 1 -82 de g3p madura) es pequeño y tiene un bajo pI de 4,14, que es
- ventajoso para el recubrimiento de placas de microvaloración convencionales usadas
- para bioselección por afinidad, que se realiza rutinariamente a pH fisiológico,
- -
- la mayoría de los fagos que exponen scFv de unión a N1 en su superficie deberían
- eliminarse automáticamente, puesto que deberían unirse a otros fagos que portan 3-5
- copias de g3p que comprende N1 en su superficie.
- En otra realización, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico
que codifica una proteína de fusión que comprende aa) el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso y ab) un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST), en la que dicha molécula de ácido nucleico no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal para el transporte de la proteína de fusión al periplasma de una célula hospedadora bacteriana.
En una realización adicional, la invención se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención.
Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión.
En otra realización, la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector según la presente invención.
Se prefiere particularmente una célula hospedadora que es una célula de E. coli.
Adicionalmente, la invención se refiere al uso de una proteína de fusión que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso como elemento de fusión para la expresión de un (poli)péptido/proteína fusionado con dicho elemento de fusión, en la que dicha proteína de fusión se obtiene en forma de cuerpos de inclusión.
Se ha descrito el procedimiento general de uso de la formación de cuerpos de inclusión formados mediante la expresión de proteínas de fusión que comprenden un elemento de fusión y un (poli)péptido/proteína como medio para expresar dicho (poli)péptido/proteína (documento WO 98/30684).
La proteína de fusión puede comprender adicionalmente una secuencia ligante que liga dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido/proteína. El ligante puede consistir en aproximadamente 1 a aproximadamente 30, preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 aminoácidos. El ligante puede comprender una señal de escisión que permite escindir la proteína de fusión entre el elemento de fusión y el (poli)péptido/proteína para poder obtener dicho (poli)péptido/proteína en forma libre. Dicha señal de escisión es preferiblemente una secuencia de reconocimiento específica de proteasas bien conocidas por el experto en la técnica, tales como enterocinasa o trombina. Como alternativa, la proteína de fusión podría escindirse mediante escisión química con un producto químico tal como bromuro de cianógeno.
Dichas proteínas de fusión, después de replegar, pueden usarse en SIP in vitro también (Krebber y col., 1997).
Krebber y col. notifican una metodología para minimizar la adsorción no específica de fagos en el procedimiento de unión utilizando fagos de colección que no son infecciosos al reemplazar su dominio N-terminal de gIIIp por la entidad de unión y restaurar la infectividad añadiendo una proteína de fusión consistente en el dominio N-terminal de gIIIp junto con la diana.
La invención se refiere además a un procedimiento para la expresión de un (poli)péptido/proteína que comprende:
a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende
aa) el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago
filamentoso y
ab) dicho (poli)péptido/proteína.
Se prefiere particularmente un procedimiento que comprende adicionalmente las etapas de
b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y
c) solubilizar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.
Los elementos de unión específica generados según la presente invención pueden usarse para la identificación y/o caracterización de un (poli)péptido/proteína de origen natural que comprenda dicho (poli)péptido.
Dichos usos incluyen, pero sin limitación, el uso de elementos de unión específica tales como inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas en inmunoensayos tales como ELISA, en análisis de transferencia Western de extractos celulares, inmunohistoquímica o inmunocitoquímica en tejidos o células, inmunoprecipitaciones, inmunocoprecipitación usando extractos celulares y demás. El uso de elementos de unión específica tales como inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas en dichos ensayos de unión, o en procedimientos similares, y en el aislamiento de material diana, es bien conocido por el experto en la técnica.
Al usar el elemento de unión específica generado según la presente invención, será posible identificar y/o caracterizar (poli)péptidos/proteínas de origen natural que comprendan dicho (poli)péptido.
Los procedimientos para aislar (poli)péptidos/proteínas de origen natural de fuentes naturales, y los procedimientos para la identificación de estos (poli)péptidos/proteínas, directamente o mediante la información genética que codifican estos (poli)péptidos/proteínas, son bien conocidos por el experto en la técnica. Leyendas de las figuras Figura 1:
- (A)
- Mapa vectorial del vector de expresión pTFT74-N1-MCS-H.
- (B)
- Secuencia del vector de expresión pTFT74-N1-MCS-H.
(A) Mapa vectorial del vector de expresión pTFT74-HN1-MCS.
(B) Secuencia del vector de expresión pTFT74-HN1-MCS. Figura 3: Expresión de los constructos de proteína de fusión
Después de la expresión, se procesaron lisados de célula entera en un gel PAA Ready con 12% de SDS (Bio-Rad) en condiciones reductoras. Se tiñó el gel usando azul de Coomasie.
Carril 1, marcador Rainbow de alto peso molecular (Amersham), se indican los pesos moleculares de las proteínas;
carril 2, N1 fusionado con un fragmento de una cadena β de MHC de clase II (peso calculado de la proteína de fusión: 33,4 kDa);
carril 3, N1 fusionado con un fragmento de una cadena α de MHC de clase II (peso calculado de la proteína de fusión: 32,2 kDa);
carril 4, N1 fusionado con los mismos 280 aminoácidos C-terminales de p100 de NF-κB humana amplificados por PCR para clonar en pTFT74-N1-MCS-H desde el clon IMAGE 434322 (peso calculado de la proteína de fusión: 39,9 kDa);
carril 5, N1 fusionado con ICAM-1 humana madura (peso calculado de la proteína de fusión: 65,7 kDa); carril 6, N1 fusionado con un fragmento de ICAM-1 humana (aminoácidos 401-480 de la proteína no procesada, peso calculado de la proteína de fusión: 19,3 kDa); carril 7, N1 fusionado con un fragmento de ICAM-1 humana (aminoácidos 151-532 de la proteína no procesada, peso calculado de la proteína de fusión: 52,2 kDa); carril 8, N1 fusionado con un fragmento de UL84 de citomegalovirus humano (aminoácidos 68-586, peso calculado de la proteína de fusión: 68,4 kDa); carril 9, N1 fusionado con un fragmenot de UL84 de citomegalovirus humano (aminoácidos 200-586, peso calculado de la proteína de fusión: 53,2 kDa); y
carril 10, N1 fusionado con un fragmento de IL-84 de citomegalovirus humano
(aminoácidos 300-586, peso calculado de la proteína de fusión: 42,2 kDa)
Figura 4: ELISA de especificidad de 3 svFv diferentes (clones 1-3) seleccionados frente a
N1MacI.
La preparación de la fracción periplásmica de células JM83 que contienen los clones 13 de scFv en un vector de expresión fue como se ha descrito (Knappik y col., 1993). Se recubrió con 1 µg de N1-MacI, MacI, N1-hag, N1 y BSA, respectivamente, en PBS durante 12 h a 4ºC, una placa de microvaloración Nunc Maxisorb (nº 442404), que se bloqueó entonces durante 2 h a temperatura ambiente usando PBS que contenía 5% de leche desnatada en polvo. Se mezclaron las fracciones periplásmicas 1:1 con PBS que contenía 5% de leche desnatada en polvo y 0,05% de Tween 20 y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente antes de añadir a los pocillos bloqueados de la placa de microvaloración. La incubación fue de 1 h a temperatura ambiente. Puesto que todos los scFv de HuCAL portan un M1 FLAG C-terminal (Knappik y Plückthun, 1994), se aplicó un anticuerpo M1 anti-FLAG (Sigma nº F-3040) a los pocillos y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente (2º anticuerpo). Se detectaron los anticuerpos M1 anti-FLAG unidos con un conjugado de IgG-HRP anti-ratón (Sigma nº A6782; 3º anticuerpo) y azul de BM soluble (Boehringer Mannheim nº 1484281) como sustrato. Después de bloquear e incubar con las fracciones periplásmicas, el anticuerpo M1 anti-FLAG y el conjugado IgG-HRP anti-ratón, se lavó la placa ELISA 5 veces usando tampón TBS que contenía 0,05% de Tween 20 y CaCl2 1 mM. Se midió la absorbancia a 370 nm después de la adición de sustrato. Figura 5:
(A) Mapa vectorial del vector de expresión pBAD-N1-MCS-H.
(B) Secuencia del vector de expresión pBAD-N1-MCS-H. Figura 6: Expresión de constructos de proteína de fusión y purificación por afinidad de una etapa.
Se procesaron las muestras en un gel de poliacrilamida con 12% de SDS (Bio-Rad) en condiciones reductoras. Se tiñó el gel usando azul de Coomasie.
Carril 1, proteínas marcadoras con los pesos moleculares relativos indicados (para multiplicar por 103);
carril 2, lisado bruto de BL21(DE3)pLysS de E. coli que alberga el vector pTFT74-N1
MacI después de 3 h de inducción con IPTG 1 mM; carril 3, cuerpos de inclusión replegados a partir de la expresión de N1-MacI; carril 4, N1-MacI replegado purificado por afinidad; carril 5, lisado bruto de BL21(DE3)(pLysS) de E. coli que alberga el vector pTFT74-N1
U2 después de 3 h de inducción con IPTG 1 mM;
carril 6, N1-U2 replegado purificado por afinidad;
carril 7, lisado bruto de BL21(DE3)(pLysS) de E. coli que alberga el vector pTFT74-N1I3 después de 3 h de inducción con IPTG 1 mM;
carril 8, N1-I3 replegado purificado por afinidad;
carril 9, lisado bruto de BL21(DE3)(pLysS) de E. coli que alberga el vector pTFT74-N1B1 después de 3 h de inducción con IPTG 1 mM;
carril 10, N1-B1 replegado purificado por afinidad. Figura 7: Pureza de proteínas de fusión de N1 replegadas purificadas por afinidad.
Se procesaron las muestras en un gel de poliacrilamida con 12% de SDS (Bio-Rad) en condiciones reductoras. Se tiñó el gel usando azul de Coomasie. Se da el peso molecular calculado de la proteína de fusión entre corchetes.
Carril 1, proteínas marcadoras con los pesos moleculares relativos indicados (para multiplicar por 103); carril 2, N1-U1f1 (75,6 kDa); carril 3, N1-U2 (68,4 kDa); carril 4, N1-U4 (42,2 kDa); carril 5, N1-I1f1 (65,7 kDa); carril 6, N1-I3 (19,3 kDa); carril 7, N1-I4 (52,2 kDa); carril 8, N1-B1 (33,4 kDa); carril 9, N1-A14 (32,2 kDa); carril 10, N1-Np50 (51,3 kDa).
El ejemplo ilustra la invención.
En la siguiente descripción, todos los experimentos biológicos se efectúan según protocolos estándar (Ausubel y col., 1995). Ejemplo 1: Genómica funcional con fagos: sobreexpresión de proteínas de fusión de N1, purificación a partir de cuerpos de inclusión y bioselección por afinidad de colecciones de exposición en fago frente a las proteínas de fusión replegadas Generación de vectores de expresión
Todos los vectores usados son derivados del vector de expresión pTFT74 (Freund y col., 1993). Se ha insertado en este vector la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos 1-82 de g3p madura del fago fd que contiene un residuo de metionina adicional en el extremo N, un sitio de clonación múltiple y una secuencia de ADN que codifica un marcador de purificación 6xHis entre los sitios NcoI e HindIII únicos, generando el vector pTFT74-N1-MCS-H (Figura 1, secuencia completa del vector dada en el apéndice). Los primeros 82 aminoácidos de la g3p madura contienen el dominio N1 (aminoácidos 1-67) y los primeros 15 aminoácidos del ligante entre N1 y N2 (Lubkowski y col., 1998). Se generó un segundo vector, pTFT74-HN1-MCS, que contiene entre los sitios NcoI e HindIII únicos una secuencia de ADN que codifica Met-Ala, un marcador de purificación 6xHis y los aminoácidos 2-82 de g3p del fago fd fusionada con un sitio de clonación múltiple y tres codones de terminación para los tres marcos de lectura (Figura 2, secuencia completa del vector dada en el apéndice).
En comparación con la secuencia publicada, se ha encontrado un intercambio nucleotídico de G a T en la posición 57 del vector pTFT74.
Se han clonado en el vector pTFT74-N1-MCS-H fragmentos de ADN generados por PCR, o se han preparado como módulo oligonucleotídico que codifica las secuencias aminoacídicas dadas a continuación y en la leyenda de la Figura 3, entre los sitios BsiWI e HindIII únicos o entre los sitios XbaI y EcoRI únicos.
El vector pTFT74-H-N1-MCS se usará para clonación de alto rendimiento de EST amplificados por PCR de forma similar al procedimiento descrito por Hua y col. (1998), pero introduciendo sitios de restricción apropiados en el extremo 5’ y 3’ durante la PCR. De este modo, para ADNc clonados direccionalmente cebados con oligo dT, son necesarios solo 4 cebadores para la amplificación del inserto de cada vector de clonación de ADNc (3 cebadores de codificación para la amplificación de insertos de EST en tres marcos abiertos de lectura y un cebador inverso correspondiente a la secuencia cadena abajo del vector de clonación de ADNc). Son necesarios 8 cebadores para cada vector de clonación de ADNc para la generación de 6 productos de PCR que cubran los 6 marcos de lectura posible del inserto.
Se ha realizado la expresión, purificación y replegamiento como se ha descrito (C. Krebber, 1996; Krebber y col., 1997). Brevemente, se transformaron células BL21(DE3)pLysS (Studier y col., 1990) con el vector pTFT74 respectivo (véase a continuación) y se cultivaron a una DO550 de 0,9-1,2. La inducción de la expresión de proteína de fusión de N1 fue durante 3 h con IPTG 1 mM a 37ºC. Se aislaron las proteínas de fusión de N1 mediante cromatografía de Ni-NTA a partir de cuerpos de inclusión solubilizados y se replegaron. La concentración de proteína durante el replegamiento era habitualmente <1 mg/ml.
Se han usado los siguientes constructos:
-N1-hag: N1 (aminoácidos 1-82 de g3p madura del fago fd que contienen un residuo de metionina adicional en el extremo N) fusionado con la secuencia aminoacídica PYDVPDYASLRSHHHHHH que incluye el epítopo DVPDYAS de hemaglutinina reconocido por el anticuerpo 17/9 (Schulze-Gahmen y col., 1993; Krebber y col., 1995). Obtenible mediante clonación de un módulo oligonucleotídico (preparado a partir de los dos siguientes oliogonucleótidos: 5’GTACGACGTTCCAGACTACGCTTCCCTGCGTTCCCATCACCATCACCATCACTA-3 y 5’-GCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGGAACGCAGGGAAGCGTAGTCTGGAACGTC3’) entre los sitios BsiWI e Hindi del vector pTFT74-N1-MCS-H.
-N1-MacI: N1 (aminoácidos 1-82 de g3p madura del fago fd que contienen un residuo de metionina adicional en el extremo N) fusionado con la secuencia aminoacídica PYGGGSGGGSGSDIAFLIDGSGSIIPHDFRRMKEFVSTVMEQLKKSKTLFSLMQYSEEF RIHFTFKEFQNNPNPRSLVKPITQLLGRTHTATGIRKVVRELFNITNGARKNAFKILVVITD GEKFGDPLGYEDVIPEADREGVIRYVIGVGDAFRSEKSRQELNTIASKPPRDHVFQVNN FEALKTIQNQLREKIFAIEGTQTGSSSSFEHEMSQE (que contiene los aminoácidos 149-353 de la cadena α de CR-3 humana (entrada P11215 de SWISS-PROT)) y una secuencia C-terminal que contiene el marcador 6xHis. Obtenible mediante PCR usando ADNc de células HL-60 como molde y los oligonucleótidos CR-3for (5’GTACGTACGGGGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTAGTGACATTGCCTTCTTGAT TGATGGC-3’) y CR-3rev (5’GTAAAGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATTTCCTGAGACATCTCAT GCTCAAAGGAGC-3’), digestión del producto de PCR con las enzimas de restricción BsiWI e Hindi y clonación del fragmento entre los sitios BsiWI e HindIII del vector pTFT74-N1-MCS-H, generando el vector pTFT74-N1-MacI-H.
-N1 (Krebber y col., 1997)
-Para las fusiones de N1 mostradas en la Figura 3, se han amplificado fragmentos de ADN por PCR a partir de clones de ADNc o de ADN genómico y se han clonado entre los sitios XbaI y EcoRI del vector pTFT74-N1-MCS-H. Para el cribado de ligantes de N1-MacI, se usó un fragmento purificado (MacI) de
cadena α de CR-3 humana (entrada P11215 de SWISSPROT) que contiene los aminoácidos 149-353 de CR-3 α humana fusionado con una secuencia C-terminal que contiene un marcador 6xHis. Obtenible mediante PCR a partir del clon pTFT74-N1-MacI-H. Se añadió un codón ATG al extremo 5’ del gen durante la clonación. Se efectuó la expresión y purificación usando procedimientos estándar (“The QIA expressionist™” 3ª edición: “A handbook for highlevel expression and purification of 6xHis tagged proteins” (julio de 1998). QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania).
Se efectuó la selección por afinidad frente a N1-MacI y N1 y la caracterización de scFv seleccionados usando procedimientos estándar (Kay y col., 1996) y la colección HuCAL de scFv (documento WO 97/08320). Se recubrieron con N1-MacI y N1 durante 12 h a 4ºC a una concentración de 10 µg/ml en PBS placas de microvaloración Nunc Maxisorb (nº 442404). En el caso de N1-MacI, se mezclaron los fagos 1:1 antes de la selección por afinidad con PBS que contiene 5% de leche desnatada en polvo y 0,1% de Tween 20 (selección por afinidad de NMa)
o PBS que contiene 5% de leche desnatada en polvo, 0,1% de Tween 20 y 0,5 mg/ml de N1hag (selección por afinidad de NMb). En el caso de N1, se mezclaron los fagos 1:1 antes de la selección por afinidad con PBS que contiene 5% de leche desnatada en polvo y 0,1% de Tween 20 (selección por afinidad de Na) o PBS que contiene 5% de leche desnatada en polvo, 0,1% de Tween 20 y 0,5 mg/ml de N1 (selección por afinidad de Nb). Se incubaron los fagos en estos tampones durante 2 h a temperatura ambiente antes de aplicarse al pocillo de ELISA recubierto con antígeno.
Después de tres rondas de selección por afinidad, se analizaron 92 clones de cada selección por afinidad en ELISA. En las selecciones por afinidad de Na y Nb, no se obtuvieron ligantes frente a N1, mientras que en las selecciones por afinidad de NMa y NMb se seleccionaron varios ligantes frente a N1-MacI. Se ensayó también en estos ligantes la unión a MacI. Los clones que mostraron una señal al menos 3 veces superior al fondo en ELISA se consideraron positivos.
- 1.
- NMa Positivos frente a N1-MacI: 77 Positivos frente a MacI: 37
- 2.
- NMb Positivos frente a N1-MacI: 85 Positivos frente a MacI: 80 Todos los ligantes de MacI reconocen también N1-MacI. Las cantidades relativamente
pequeñas de N1-hag usadas para bloquear conducen a un 100% de aumento del número de ligantes de MacI. Sin embargo, hay residuos de ligante N-terminal adicionales en N1-MacI, así que no es posible un bloqueo completo de los no ligantes de MacI usando N1-hag.
Para algunos ligantes, se efectuó un ELISA de especificidad que muestra que los scFV seleccionados se unen fuerte y específicamente a MacI (Figura 4). Ejemplo 2: Construcción y propiedades del vector de expresión pBAD-N1-MCS-H
El vector pBAD-N1-MSC-H está basado en el vector de expresión pBAD/Myc-His A (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) y permite la expresión de proteínas bajo el control del promotor araBAD estrechamente regulado.
El vector pBAD-N1-MSC-H se construyó mediante la inserción de un módulo de expresión (311 pb, fragmento Nco I / Hind III) que comprende una región de codificación que codifica el dominio N1 seguida de un sitio de clonación múltiple (MCS) y una región de codificación que codifica un marcador Hisx6 en pBAD/Myc-His A digerido con Nco I / Hind III (4046 pb). Se muestran en la Figura 5 el mapa vectorial y la secuencia de pBAD-N1-MCS-H.
La ventaja de este vector en comparación con los vectores pTFT (véanse los ejemplos 1 y 2) es un control más estrecho de la expresión de la proteína de fusión, que permite la clonación de constructos potencialmente tóxicos. Además, no es necesaria ninguna etapa de clonación adicional para la transferencia desde una cepa de clonación a una cepa de expresión. Es una desventaja que los rendimientos de expresión sean a veces menores en comparación con los vectores pTFT.
Ejemplo 3: Expresión de proteínas de fusión que comprenden el dominio N1 de la proteína del gen III Clonación de vectores de expresión
El vector usado para la expresión de proteínas de fusión de N1 es el vector pTFT74-N1MCS-H (Figura 1, secuencia de vector completa dada en el apéndice) como se describe en el ejemplo 1. En el vector pTFT74-N1-MCS-H, se han clonado fragmentos de ADN generados por PCR, o preparados como módulo oligonucleotídico que codifica los (poli)péptidos y proteínas dados entre corchetes a continuación, entre los sitios BsiWI e HindIII únicos o entre los sitios XbaI y EcoRI únicos, generando los vectores pTFT74-N1-hag (véase el ejemplo 1), pTFT74N1-MacI (véase el ejemplo 1), pTFT74-N1-U1f1 (N1 fusionado con UL84 completa de hCMV), pTFT74-N1-U2 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 68-586 de UL84 de hCMV), pTFT74-N1-U4 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 300-586 de UL84 de hCMV), pTFT74-N1-I1f1 (N1 fusionado con ICAM-1 humana completa madura), pTFT74-N1-I3 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 401-480 de ICAM-1 humana), pTFT74-N1-I4 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 151-532 de ICAM-1 humana), pTFT74-N1-B1 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 1-198 de la cadena β de MHC de clase II humano maduro), pTFT74-N1-A14 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 1192 de la cadena α de MHC de clase II humano maduro) y pTFT74-N1-Np50 (N1 fusionado con un polipéptido que contiene los aminoácidos 2-366 de p50 de NF-κB humano). Todos los constructos contienen un marcador de hexahistidina C-terminal para purificación por afinidad. Expresión a alto nivel de proteínas de fusión de N1
El dominio N1 de g3p del bacteriófago filamentoso M13 puede sobreexpresarse en E. coli, purificarse a partir de los cuerpos de inclusión y replegarse a proteína activa (Krebber y col., 1997). Se fusionaron diferentes polipéptidos de forma C-terminal con N1 y se expresaron en E. coli, conduciendo a una producción a alto nivel y a la formación de cuerpos de inclusión (Figura 6). En el caso de N1-MacI, no pudo conseguirse una purificación adicional mediante cromatografía de Ni-NTA, ya que los cuerpos de inclusión contenían ya casi exclusivamente N1-MacI (Figura 6). Sorprendentemente, todas las proteínas de fusión de N1 (10/10) eran solubles después de replegamiento a concentraciones de ~0,3-1,0 mg/ml usando las mismas condiciones de replegamiento y la pureza era de al menos un 90% (Figura 7). Los rendimientos de proteína eran del orden de 100 mg/l de cultivo de expresión en el caso de N1-MacI y estaban habitualmente en el intervalo entre 1 mg y 10 mg/l de cultivo de expresión.
Aaronson, J.S., Eckman, B., Blevins, R.A., Borkowski, J.A., Myerson, J., Imran,S. y Elliston, K.O. (1996) “Toward the development of a gene index to the human genome: an assessment of the nature of high-throughput EST sequence data”. Genome Res., 6, 829-845.
Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fleischmann, R.D., Fuldner, R.A., Bult, C.J., Lee,N.H., Kirkness, E.F., Weinstock, K.G., Gocayne, J.D. y White, O. (1995) “Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence”. Nature, 377, 3-174.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). “Current Protocols in Molecular Biology”. New York: John Wiley and Sons.
Betton, J. & Hofnung, M. (1996). “Folding of a mutant maltose-binding protein of Escherichia coli which forms inclusion bodies”. J. Biol. Chem., 271, 8046-8052.
Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S., & Whitlow M. (1988). “Single-chain antigen-binding proteins” [por errata de publicación aparece en (1989). Science 244, 409]. Science 242, 423-6.
Blake, M.S., Johnston, K.H., Russel-Jones, G.J. y Gotschlich, E.C. (1984). “A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots”. Anal. Biochem. 136, 175-179.
Boder, E.T. y Wittrup, K.D. (1997). “Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol., 15, 553-557.
Borman, S. (1999) “Reducing time to drug discovery. Recent advances in solid-phase synthesis, informatics, and high-throughput screening suggest combinatorial chemistry is coming of age”. C&EN, 77, 33-48.
Bouck, J., Yu, W., Gibbs,R., y Worley,K. (1999) “Comparison of gene indexing databases”. Trends Genet., 15, 159-162.
Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, S., Lee, B. y Pastan, I. (1993). “A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv fragment”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7538-7542.
Chatterjee, D.K., Fujimura, R.K., Campbell, J.H., y Gerard, G.F. (1991). “Cloning and overexpression of the gene encoding bacteriophage T5 DNA polymerase”. Gene, 97, 13-19.
Cho, B.K., Kieke, M.C., Boder, E.T., Wittrup, K.D. y Kranz, D.M. (1998). “A yeast surface display system for the discovery of ligands that trigger cell activation”. J. Immunol. Methods, 220, 179-188.
Coburn, G.A. y Mackie, G.A. (1996). “Overexpression, purification, and properties of
Escherichia coli ribonuclease II”. J. Biol. Chem., 271, 1048-1053.
Collins, F. y Galas, D. (1993) “A new five-year plan for the U.S. Human Genome Project [véanse los comentarios]. Science, 262,43-46.
Crissman, J. W. & Smith, G. P. (1984). “Gene-III protein of filamentous phages: evidence for a carboxyterminal domain with a role in morphogenesis”. Virology 132, 445-455.
Cull, M.G., Miller, J.F., & Schatz, P.J. (1992). “Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the C terminus of the lac repressor”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 89, 1865-1869.
Daugherty, P.S., Chen, G., Olsen, M.J., Iverson, B.L. y Georgiou, G. (1998). “Antibody affinity maturation using bacterial surface display”. Protein Eng., 11, 825-832.
Dekker, N., Merck, K., Tommassen, J. y Verheij, H.M. (1995). “In vitro folding of Escherichia coli outermembrane phospholipase A”. Eur. J. Biochem., 232, 214-219.
Derman, A.I. y Beckwith, J. (1995). “Escherichia coli alkaline phosphatase localized to the cytoplasm slowly acquires enzymatic activity in cells whose growth has been suspended: a caution for gene fusion studies”. J. Bacteriol., 177, 3764-3770.
Dunn, I. S. 1996. “Phage display of proteins”. Curr. Opin. Biotechnol. 7:547-553.
Eckman, B.A., Aaronson, J.S., Borkowski, J.A., Bailey, W.J., Elliston, K.O., Williamson,
A.R. y Blevins,R.A. (1998) “The Merck Gene Index browser: an extensible data integration system for gene finding, gene characterization and EST data mining”. Bioinformatics., 14, 2-13. Eisele, F., Owen, D.J. y Waldmann, H. (1999) “Peptide conjugates as tools for the study of biological signal transduction”. Bioorg. Med. Chem., 7, 193-224.
Ernst, W., Grabherr, R., Wegner, D., Borth, N., Grassauer, A. y Katinger, H. (1998). “Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library”. Nucleic Acids Res., 26, 1718-1723.
Ernst, W., Grabherr, R., Wegner, D., Borth, N., Grassauer, A. y Katinger, H. (1998). “Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library”. Nucleic Acids Res., 26, 1718-1723.
Francisco, J.A. y Georgiou, G. (1994). “The expression of recombinant proteins on the external surface of Escherichia coli. Biotechnological applications”. Ann.N.Y.Acad.Sci., 745, 372-382.
Freund, C., Ross, A., Guth, B., Plückthun, A. y Holak, T. A. (1993). “Characterization of the linker peptide of the single-chain Fv fragment of an antibody by NMR spectroscopy”. FEBS Lett. 320, 97-100.
Gates, C.M., Stemmer, W.P., Kaptein, R. y Schatz, P.J. (1996). “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor "headpiece dimer"”.
J. Mol. Biol., 255, 373-386.
Ge, L., Knappik, A., Pack, P., Freund, C. y Plückthun, A. (1995). “Expressing antibodies in Escherichia coli. Antibody Engineering. A Practical Approach” (Ed. C.A.K. Borrebaeck). IRL Press, Oxford, pág. 229-266.
Georgiou, G., Poetschke, H.L., Stathopoulos, C. y Francisco, J.A. (1993). “Practical applications of engineering gram-negative bacterial cell surfaces”. Trends Biotechnol., 11, 6-10.
Glockshuber, R., Malia, M., Pfitzinger, I. y Plückthun, A. (1992). “A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments”. Biochemistry 29, 1362-1366.
Hanes, J. y Pluckthun, A. (1997). “In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 94, 4937-4942.
Hanes, J., Jermutus, L., Schaffitzel, C. y Pluckthun, A. (1999). “Comparison of Escherichia coli and rabbit reticulocyte ribosome display systems”. FEBS Lett., 450, 105-110.
Hanes, J., Jermutus, L., Weber-Bornhauser, S., Bosshard, H.R. y Pluckthun, A. (1998). “Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 95, 14130-14135.
Hiatt, A. & Ma, J. K. (1993). “Characterization and applications of antibodies produced in plants”. Int. Rev. Immunol. 10, 139-152.
Hiatt, A. (1990). “Antibodies produced in plants”. Nature 344, 469-470.
Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R. y Stüber, D. (1988). “Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent”. Bio/Technology 6, 1321-1325.
Holliger, P. & Riechmann, L. (1997). “A conserved infection pathway for filamentous bacteriophages is suggested by the structure of the membrane penetration domain of the minor coat protein g3p from phage fd”. Structure 5, 265-275.
Hoog, J.O., Bahr-Lindstrom, H., Josephson, S., Wallace, B.J., Kushner, S.R., Jomvall,
H. y Holmgren, A. (1984). “Nucleotide sequence of the thioredoxin gene from Escherichia coli”. Biosci.Rep., 4, 917-923.
Hopp, T.P., Prickett, K.S., Price, V.L., Libby, R.T., March, C.J., Cerretti, D.P., Urdal, D.L. y Conlon, P.J. (1988). “A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification”. Bio/Technology 6, 1204-1210.
Horwitz, A. H., Chang, C. P., Better, M., Hellstrom, K. E. y Robinson, R. R. (1988). “Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells”. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85, 8678-8682.
Hua, S., Luo, Y., Qiu, M., Chan, E., Zhou, H. y Zhu, L. (1998). “Construction of a modular yeast two-hybrid cDNA library from human EST clones for the human genome protein
linkage map”. Gene 215, 143-152.
Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotny, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E. & Crea, R. (1988). “Protein engineering of antibody binding sites, recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5879-83.
Kay, B. K., Winter, J. & McCafferty, J., eds. (1996). “Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual”. Academic Press, Inc., San Diego.
Kieke, M.C., Cho, B.K., Boder, E.T., Kranz, D.M., y Wittrup, K.D. (1997). “Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display”. Protein Eng., 10, 1303-1310.
Kieke, M.C., Shusta, E.V., Boder, E.T., Teyton, L., Wittrup, K.D. y Kranz, D.M. (1999). “Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5651-5656.
Knappik, A., Ge, L., Honegger, A., Pack, P., Fischer, M., Wellnhofer, G., Hoess, A., Wölle, J., Plückthun, A. y Virnekäs, B. (2000). “Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides”. J. Mol. Biol. 296, 57-86.
Knappik, A. y Plückthun, A. (1994). “An improved affinity tag based on the FLAG peptide for detection and purification of recombinant antibody fragments”. BioTechniques 17, 754-761.
Knappik, A., Krebber, C. y Plückthun, A. (1993). “The effect of folding catalysts on the in vivo folding of different antibody fragments expressed in Escherichia coli”. Bio/Technology 11, 77-83.
Krebber, C. (1996). “Selektiv infektiöse Phagen: In vivo Selektion auf Interaktionen zwischen Protein und Ligand”. Tesis en la Universidad de Zurich.
Krebber, C., Spada, S., Desplancq, D. y Plückthun, A. (1995). “Co-selection of cognate antibody-antigen pairs by selectively-infective phages”. FEBS Lett. 377, 227-231.
Krebber, C., Spada, S., Desplancq, D., Krebber, A., Ge, L. y Plückthun, A. (1997). “Selectively-infective phage (SIP): A mechanistic dissection of a novel in vivo selection for protein-ligand interactions”. J. Mol. Biol. 268, 607-618.
Kuhelj, R., Dolinar, M., Pungercar, J. y Turk, V. (1995). “The preparation of catalytically active human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies”. Eur. J. Biochem., 229, 533-539.
Lebl, M. (1999) “Parallel personal comments on "classical" papers in combinatorial chemistry”. Journal of Combinatorial Chemistry, 1, 3-24.
Lilie, H., Schwarz, E. y Rudolph, R. (1998). “Advances in refolding of proteins produced
in E. coli”. Curr. Opin. Biotechnol., 9, 497-501.
Lindner, P., Guth, B., Wülfing, C., Krebber, C., Steipe, B., Müller, F. y Plückthun, A. (1992). “Purification of native proteins from the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli using IMAC and histidina tails: a comparison of proteins and protocols”. Methods: A Companion to Methods Enzymol. 4, 41-56.
Lubkowski, J., Hennecke, F., Plückthun, A. y Wlodawer, A. (1998). “The structural basis of phage display elucidated by the crystal structure of the N-terminal domains of g3p”. Nature Struct. Biol. 5, 140-147.
McGregor, D. 1996. “Selection of proteins and peptides from libraries displayed on filamentous bacteriophage”. Mol. Biotechnol. 6:155-162.
Model, P. y Russel, M. (1988). “Filamentous bacteriophage”. pág. 375-456. en R. Calendar (ed.), “The bacteriophages”, vol. 2, Plenum, Nueva York, N.Y.
Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E., Husimi, Y. y Yanagawa, H. (1997). “In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3’-terminal end to the Cterminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro”. FEBS Lett., 414, 405-408.
Nyyssönen, E., Penttila, M., Harkki, A., Saloheimo, A., Knowles, J. K. y Keranen, S. (1993). “Efficient production of antibody fragments by the filamentous fungus Trichoderma reesei”. Bio/Technology 11, 591-595.
Persic,L., Hom,I.R., Rybak,S., Cattaneo,A., Hoogenboom, H.R. y Bradbury, A. (1999) “Single-chain variable fragments selected on the 57-76 p21Ras neutralising epitope from phage antibody libraries recognise the parental protein”. FEBS Lett., 443, 112-116.
Pinilla, C., Martin, R., Gran, B., Appel, J.R., Boggiano, C., Wilson, D.B. y Houghten,
R.A. (1999) “Exploring immunological specificity using synthetic peptide combinatorial libraries”. Curr. Opin. Immunol., 11, 193-202. Potter, K. N., Li, Y. y Capra, J. D. (1993). “Antibody production in the baculovirus expression system”. Int. Rev. Immunol. 10, 103-112.
Ridder, R., Schmitz, R., Legay, F. y Gram, H. (1995). “Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris”. Bio/Technology 13, 255-260.
Riechmann, L. y Holliger, P. (1997). “The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E. coli”. Cell 90, 351-360.
Rinas, U. y Bailey, J.E. (1993). “Overexpression of bacterial hemoglobin causes incorporation of prebeta-lactamase into cytoplasmic inclusion bodies”. Appl. Environ. Microbiol., 59, 561-566.
Rudolph, R. (1996). “Successful Protein Folding on an Industrial Scale. Protein Engineering. Principles and Practice” (Eds. Cleland, J. L., Craik, C. S.). Wiley-Liss, Nueva York,
pág. 283-298.
Rudolph, R. y Lilie, H. (1996). “In vitro folding of inclusion body proteins”. FASEB J., 10, 49-56.
Rudolph, R., Böhm, G., Lilie, H. y Jaenicke, R. (1997). “Folding Proteins. Protein Folding. A Practical Approach”, edn (Ed. Creighton, T. E.). IRL Press, Oxford, pág. 57-99.
Russell, S.J., Hawkins, R.E. y Winter, G. (1993). “Retroviral vectors displaying functional antibody fragments”. Nucleic Acids Res., 21, 1081-1085.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) “Molecular Cloning: A laboratory manual2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU.
Schatz, P.J. (1993). “Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli”. Biotechnology (N.Y.), 11, 1138-1143.
Schatz, P.J., Cull, M.G., Martin, E.L. y Gates, C.M. (1996). “Screening of peptide libraries linked to lac repressor”. Methods Enzymol., 267, 171-191.
Schmidt, T.G. y Skerra, A. (1993). “The random peptide library-assisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment”. Protein Eng., 6, 109-122.
Schmidt, T.G. y Skerra, A. (1994). “One-step affinity purification of bacterially produced proteins by means of the "Strep tag" and immobilized recombinant core streptavidin”. J. Chromatogr. A., 676, 337-345.
Schmidt, T.G., Koepke, J., Frank, R. y Skerra, A. (1996). “Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin”. J. Mol. Biol., 255, 753-766.
Schulze-Gahmen, U., Rini, J.M. y Wilson, I.A. (1993). “Detailed analysis of the free and bound conformations of an antibody: X-ray structures of Fab 17/9 and three different Fabpeptide complexes”. J. Mol. Biol. 234, 1098-1118.
Skerra, A. y Plückthun (1988). “Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli”. Science 240, 1038-1041.
Stengele, I., Bross, P., Garcés, X., Giray, J. y Rasched, I. (1990). “Dissection of functional domains in phage fd adsorption protein”. J. Mol. Biol. 212, 143-149.
Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. y Dubendorff, J.W. (1990). 2Use of T7 RNA polymerase to direct the expression of cloned genes”. Meth. Enzymol. 185, 60-89.
Sykes, K.F. y Johnston, S.A. (1999) “Linear expresión elements: a rapid, in vivo, method to screen for gene functions”. Nat. Biotechnol., 17, 355-359.
Trill, J. J., Shatzman, A. R. y Ganguly, S. (1995). “Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells”. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 553-560.
Vandenbroeck, K., Martens, E., D’Andrea, S. y Billiau, A. (1993). “Refolding and single
step purification of porcine interferon-gamma from Escherichia coli inclusion bodies. Conditions
for reconstitution of dimeric IFN-gamma”. Eur. J. Biochem., 215, 481-486.
Vaughan, T. J., Williams, A. J., Pritchard, K., Osborn, J. K., Pope, A. R., Earnshaw, J.
5 C., McCafferty, J., Hodits, R. A., Wilton, J. y Johnson, K. S. 1996. “Human antibodies with subnanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library”. Nature Biotechnology 14: 309-314.
Ward, V. K., Kreissig, S. B., Hammock, B. D. y Choudary, P. V. (1995). “Generation of an expression library in the baculovirus expression vector system”. J. Virol. Methods 53, 26310 272. Whitelam, G. C., Cockburn, W. & Owen, M. R. (1994). “Antibody production in transgenic plants”. Biochem. Soc. Trans. 22, 940-944. Woodbury, C.P. y Venton, D.L. (1999) “Methods of screening combinatorial libraries using immobilized or restrained receptors”. Journal of Chromatography B, 725, 113-137.
15 Wu, X. C., Ng, S. C., Near, R. I. & Wong, S. L. (1993). “Efficient production of a functional single-chain antidigoxin antibody via an engineered Bacillus subtilis expressionsecretion system”. Bio/Technology 11, 71-76.
28
Claims (19)
1. Un procedimiento para generar un elemento de unión específica a un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST) que comprende:
a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende
aa) un elemento de fusión de (poli)péptido/proteína que se deposita en cuerpos de inclusión cuando se expresa en dicha célula hospedadora en dichas condiciones y que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso y
ab) dicho (poli)péptido, en el que dicha célula hospedadora es E. coli; b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y c) generar una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que se une
específicamente a dicho (poli)péptido seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuesto en la superficie de un fago filamentoso que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III, en el que la proteína del gen III se expone en la superficie de dicho fago filamentoso.
- 2.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de fusión comprende dicho elemento de fusión como porción N-terminal y dicho (poli)péptido como porción C-terminal.
- 3.
- El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha proteína de fusión comprende un ligante (poli)peptídico que liga dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido.
- 4.
- El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho ligante comprende una señal de escisión.
- 5.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de un organismo procariótico o de un virus.
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho organismo procariótico o virus es un patógeno.
- 7.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de un organismo eucariótico.
- 8.
- El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho fragmento de ADN o EST se obtiene a partir de una especie no de mamífero.
- 9.
- El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho fragmento de ADN genómico o EST se obtiene a partir de una especie de mamífero.
- 10.
- El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha especie de mamífero es humana.
- 11.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho ácido nucleico se expresa en condiciones que permiten la sobreexpresión de dicha proteína de fusión.
- 12.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha proteína de fusión se expresa en el citosol.
- 13.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho elemento de fusión consiste en los aminoácidos 1 a 82 de la proteína del gen III.
- 14.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de ADN genómico o EST es de entre 100 y 2.000 pares de bases de longitud.
- 15.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de ADN genómico o EST comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un (poli)péptido o consiste en un presunto marco abierto de lectura.
- 16.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (b) comprende adicionalmente la etapa de (i) solubilizar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.
- 17.
- El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la etapa (b) comprende adicionalmente la etapa de (ii) replegar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.
- 18.
- El procedimiento de la reivindicación 16 o 17, que comprende adicionalmente la etapa de purificar dicha proteína de fusión en forma libre.
- 19.
- El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de inmunoglobulina es Fv, scFv, Fv ligado por disulfuro, Fab o (Fab’)2.
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| US8832581B2 (en) * | 2009-03-05 | 2014-09-09 | Ming Zhang | Gene expression browser for web-based search and visualization of characteristics of gene expression |
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| EP2731625B1 (en) | 2011-07-15 | 2018-04-18 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Rspo binding agents and uses thereof |
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| EP3485903B1 (en) | 2011-09-23 | 2022-11-16 | Mereo BioPharma 5, Inc. | Vegf/dll4 binding agents and uses thereof |
| WO2013071233A1 (en) | 2011-11-10 | 2013-05-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Methods for detecting infectious agents and a novel virus detected thereby |
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| EP2978440B1 (en) | 2013-03-27 | 2019-10-02 | Cedars-Sinai Medical Center | Treating fibrosis by inhibiting tl1a and diagnosing fibrosis by detecting il31ra |
| DE102013106462B3 (de) * | 2013-06-20 | 2014-10-09 | Airbus Defence and Space GmbH | Detektionsverfahren zur Detektion von Bakterien, Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen und Fusionsprotein |
| WO2015010108A1 (en) | 2013-07-19 | 2015-01-22 | Cedars-Sinai Medical Center | Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway |
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