NO334858B1 - Humane CDR-podede antistoffer og antistoffragmenter derav,DNA,rekombinant vektor,transformant og fremgangsmåte for fremstilling derav,samt terapeutisk og diagnostisk middel, medikament og fremgangsmåte for immunologisk påvisning - Google Patents

Humane CDR-podede antistoffer og antistoffragmenter derav,DNA,rekombinant vektor,transformant og fremgangsmåte for fremstilling derav,samt terapeutisk og diagnostisk middel, medikament og fremgangsmåte for immunologisk påvisning Download PDF

Info

Publication number
NO334858B1
NO334858B1 NO20040976A NO20040976A NO334858B1 NO 334858 B1 NO334858 B1 NO 334858B1 NO 20040976 A NO20040976 A NO 20040976A NO 20040976 A NO20040976 A NO 20040976A NO 334858 B1 NO334858 B1 NO 334858B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
amino acid
region
chain
seq
Prior art date
Application number
NO20040976A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20040976L (no
Inventor
Kenya Shitara
Kazuyasu Nakamura
Emi Hosaka
Akiko Shimizu
Masamichi Koike
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of NO20040976L publication Critical patent/NO20040976L/no
Publication of NO334858B1 publication Critical patent/NO334858B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4719—G-proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7158—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

SAMMENDRAG Et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med den ekstracellulære region av human CC kjemokinreseptor 4 (CCR4) men som ikke utviser noen reaktivitet med humane blodplater eller dets antistoffragment; et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med den ekstracellulære region av human CC kjemokinreseptor 4 (CCR4) og som utviser cytotoksisitet på celler som uttrykker CCR4 eller dets antistofffragment; og medikamenter, terapeutiske midler og diagnostiske midler inneholdende minst ett element valgt fra disse antistoffer og antistoffragmenter som aktiv bestanddel.

Description

Teknisk område
Den foreliggende oppfinnelse vedrører et humant CDR-podet antistoff eller antistoff fragment derav som spesifikt reagerer med den ekstracellulære region av human CC kjemokinreseptor 4 (i det etterfølgende referert til som "CCR4") men reagerer ikke med en blodplate og antistoffragementet derav. Det humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med den ekstracellulære region av CCR4, har en cytotoksisk aktivitet og en inhiberende aktivitet av cytokinproduksjon ved Th2 celler, og omfatter et spesifikt hypervariabelt område (complementarity determining region) (i det etterfølgende referert til som "CDR"), og antistoffragmentet derav. Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et DNA som koder for antistoffet eller antistoffragmentet derav. Den foreliggende oppfinnelse ved-rører videre en vektor omfattende DNA-et. Den foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet eller antistoffragmentet derav ved anvendelse av transformanten. Den foreliggende oppfinnelse vedrører i tillegg et medikament,terapeutisk middel og et diagnostisk middel for behandling av CCR4-relaterte sykdommer,for cancertyper slik som blodcancertyper, f.eks. levkemi og lymfomatose.
B akgrunns t ekni kk
Forskjellige faktorer slik som eosinofiler, mastceller, IgE og lignende spiller en rolle i allergiske sykdommer slik som bronkialastma. Eosinofiler infiltrerer inn i et inflammatorisk sete og frigjør cytotoksiske basiske proteiner slik som MBP (major basic protein) eller lignende ved degranulering og de omgivende vev skades av slike cytotoksiske basiske proteiner. Mastceller bindes til et antigen immunkompleks med IgE som produseres av B-celler og frigjør histamin slik at en umiddelbar allergisk reaksjon induseres. Den allergiske reaksjonen kontrolleres ved biologisk funksjonelle molekyler slik som cytokiner, kjemokiner og lignende, som tar del i signaltransduksjon mellom celler. IL-5 induserer diffe-rensiering, overlevelse og degranulering av eosinofiler. IL- 4 induserer B-celle-aktivering og produksjon av IgE. Produsert IgE danner et immunkompleks med antigenet og bevirker degranulering av mastceller. Det er blitt funnet at IL-4, IL-13 og lignende også produseres av mastceller og bidrar til produksjonen av IgE ved B-celler ( Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152, 2059 (1995), Immunol. Today, 15, 19 (1994)). Et elaborert cytokin-kjemokin nettverk er således tilstede blant inflammatoriske celler og ivaretar kompliserte balanser.
Cytokinene og kjemokinene produseres av hjelper-T-celler som uttrykker CD4 på celleoverflaten (i det etterfølgende referert til som "CD4+Th celler"). Det er faktisk blitt funnet at infiltrering av hjelper-T-celler er funnet i luftveis-inflammasjonssetet hos pasienter med bronkial astma, hvori et betydelig stort av T-cellene er aktivert og at alvorligheten og luftveis-hypersensitiviteten hos en astmapasient korrelerer med antallet aktiverte T-celler, såvel som at de aktiverte T-celler også er økt i det perifere blod ( Am. Rev. Respir. Dis., 145, S22 (1992)).
Hjelper-T-cellene er klassifisert i Thl celler og Th2 celler, avhengig av typen cytokin som skal produseres derved ( Annu. Rev. Immunol., !_ > 145 (1989)). Th2 celler produserer IL-4, IL-5, IL-13 og lignende. Cytokinene produsert av Th2 celler er Th2 cytokiner.
Det er blitt funnet at en antigen-spesifikk T-celle-klon isolert fra en pasient med atopisk sykdom frigjør Th2 cytokiner når stimulert in vitro ( Proe. Nati, Acad. Sei., U. S. A., 88., 4538 (1991)), og Th2 celler er tilstede i bronkoalveolært lavage fluid (i det etterfølgende referert til som "BAL") og luftveisslimhinnen hos astmapasienter ( N. Engl. J. Med., 326, 298 (1992), Sur. J". Immunol., 23., 1445 (1993)). Ekspresjons-nivåer av IL-4 og IL-5 mRNA-er av Th2 cytokiner økes når mRNA ekspresjoner av forskjellige cytokiner i celler i BAL under-søkes ved anvendelse av en allergisk inflammasjon-dyremodell ( Clin. Immunol. Immunophathol., 75, 75 (1995)). Også når Th2 celler administreres intravenøst eller intranasalt til mus, induseres astmatisk informasjon i lungene på antigen-spesifikk måte (J". Exp. Med., 186, 1737 (1997), J". Immunol., 160, 1378 (1998)) og eosinofili observeres (J\ Immunol., 161, 3128
(1998)). Ekspresjon av IL-5 observeres i luftveisslimet til astmapasienter og hudlesjonene til pasienter med atopisk dermatitt (J". Clin. Invest. , 87., 1541 (1991), J. Exp. Med., 173, 775 (1991)) og ekspresjonsnivået av IL-5 i slimet ved kronisk allergisk rhinitt korrelerer med ekspresjonsnivået av IL-13, og mengdene av totalt serum IgE og antigen-spesifikt IgE ( Therapeutics, 32., 19 (1988)).
Kjemokin er en generell betegnelse for basiske heparin-bindende proteiner som induserer kjemotoksis og aktivering av leukocytt, og klassifiseres i underfamilier av CXC, CC, C og CX3C avhengig av posisjonen av cysteinrestene i den primære struktur. 16 kjemokinreseptorer er blitt identifisert så langt ( Curr, Opi. Immunol., H, 626 (1999)), og det er blitt vist av ekspresjon av hver kjemokinreseptor er forskjellig blant leukocyttene slik som Thl celle, Th2 celle eller lignende ( Cell Engineering, 17., 1022 (1998) ) .
Human CCR 4 er en G protein-koblet syv-transmembran-reseptor klonet som K5-5 fra en human immatur basofil cellelinje KU-812. Transmembranregionene av CCR4 vurderes til å være posisjoner 40 til 67, posisjoner 78 til 97, posisjoner 113 til 133, posisjoner 151 til 175, posisjoner 207 til 226, posisjoner 243 til 270 og posisjoner 285 til 308 i aminosyresekvensen, de ekstracellulære regioner er vurdert til å være posisjoner 1 til 39, posisjoner 98 til 112, posisjoner 176 til 206 og posisjoner 271 til 284 i aminosyresekvensen, og de intracellulære regioner er posisjoner 68 til 77, posisjoner 134 til 150, posisjoner 227 til 242 og posisjoner 309 til 360 i aminosyresekvensen (J". Biol. Chem. , 270, 19495
(1995)). Først ble det rapportert at liganden av CCR4 er MIP-la (macrophage inflammatory protein-la) RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and secreted) eller MCP-1 (monocyte chemotactic protein) ( Biochem. Biophys, Res. Commun., 218, 337 (1996), WO 96/23068). Det er imidlertid funnet at TARC (thymus and activation-regulated chemokine) produsert fra stimulerte mononukleære celler fra humant perifert blod (i det etterfølgende referert til som "PBMC") og thymusceller ( J. Biol. Chem., 2 71, 21514 (1996)) spesifikt binder til CCR4 ( J. Biol. Chem., 272, 15036 (1997)). Det er også blitt rapportert at MDC (macrophage-derived chemokine) isolert fra makrofag (J\ Exp. Med., 185, 1595 (1997)), også kjent som STCP-1 (stimulated T cell chemotactic protein-1) ( J. Biol. Chem., 272, 25229 (1997)), binder til CCR4 sterkere enn TARC ( J. Biol. Chem., 273, 1764 (1998)).
Det er blitt vist av CCR4 uttrykkes på CD4+Th celler som produserer cytokin og/eller kjemokin (J". Biol. Chem., 272, 15036 (1997)), og det er blitt rapportert at CCR4 uttrykkes selektivt på Th2 celler blant CD4+Th celler (J\ Exp. Med., 187, 129 (1998), J. Immunol., 161, 5111 (1998)). I tillegg er CCR4+ celler blitt funnet i effektor/hukommelses-T-celler (CD4+/CD45R0+),og når CCR4+ celler ble stimulert ble IL-4 og IL-5 produsert men IFN-y ble ikke produsert ( Int. Immunol., 11, 81 (1999)). Det er også blitt rapportert at CCR4+ celler tilhører en CLA (cutaneous lymphocyte antigen)-positiv og a4(38 integrin-negativ gruppe blant hukommelses-T-celler, og CCR4 uttrykkes på hukommelses-T-celler relatert ikke til tarmimmunitet men til systemisk immunitet av huden og lignende (Nature, 400, 776 (1999)). Disse resultatene an-tyder sterkt at når inflammasjon induseres, aktiveres hukommelses-T-cellene til å uttrykke CCR4 og migreres inn i det inflammatoriske sete ved MDC og TARC av ligander av CCR4, og akselererer aktivering av andre inflammatoriske celler.
Det er nylig blitt funnet at CCR4 også uttrykkes i naturlige dreperceller ( Journal of Immunology, 164, 4048-4054 (200), Blood, 97., 367-375 (2001)) og blodplater ( Thrombosis Research, 101, 279-289 (2001), Blood, 96, 4046-4054 (2000), Blood, 97., 937-945 (2001)) i mennesker.
Det er kjent at en antagonist i TARC eller MDC som en ligand av CCR4, nemlig en CCR4 antagonist, inhiberer blodplateaggre- gasjon (WO 99/15666). Det er kjent at et slikt middel som modulerer funksjonen av CCR4 også innvirker på blodplate-funksj oner.
Ekspresjon av CCR4 er funnet i blodplater. Adrian et al.
( Blood, 97., 937-945 (2001)) og Abi-Younes et al. ( Thrombosis Research, 101, 279-289 (2001), WO 00/42074, WO 00/41724) har f.eks. påvist ekspresjon av CCR4 i humane blodplater ved anvendelse av anti-CCR4 antistoffer. Et antistoff som har reaktivitet med CCR4 men som ikke er i stand til å binde til humane blodplater har hittil ikke vært kjent.
Det er også kjent at når et autoantistoff som er i stand til å binde til blodplater produseres, induseres autoimmun trombopeni ( Blood, 70., 428-431 (1987) , Transfusion Science, 19, 245-251 (1998)). Midler som har innvirkninger på trombo-cytopeni og blodplatefunksjoner er generelt ikke ønskelig som medikamenter fordi de ofte forårsaker alvorlige bivirkninger slik som blødning og trombedannelse. Siden antistoffer har lang blod-halveringstid, er et antistoff som innvirker på blodplatefunksjoner særlig vanskelig å utvikles som et medikament. Utvikling av anti-CD40 ligand-antistoffer som er blitt utviklet som midler for behandling av autoimmune sykdommer er f.eks. blitt suspendert på grunn frembringelsen av bivirkninger som vurderes og skyldes gjenkjennelse av antigen uttrykt på aktiverte blodplater (Nature Medicine, 6_, 114
(2000), BioCentury, A8 of 18 (2002.06.20)).
Det er kjent at proteiner underkastes forskjellige modifi-ser ingsreaks joner etter translasjon. En av de kjente modifi-seringreaksjonene er en sulfatert reaksjon av tyrosinrester.
Det er blitt rapportert at mange proteiner sulfateres i tyrosinrester ( Chemistry and Biology, ZrR57-R61 (2000)). Tyrosinresten som sulfateres har det kjennetegn at mange sure aminosyrerester er tilstede i dens nærhet, og et protein som har en mulighet til å sulfateres og dets region er blitt foreslått ( Cell, 96., 667-676 (1999)). Hva angår CCR4, er 4 tyrosinrester tilstede nær N-enden, men der er ingen rapporter som viser at tyrosinrestene er sulfatert.
Som den aktuelle metode for behandling av Th2-medierte immunsykdommer, er de følgende blitt utviklet: (1) antagonister for cytokiner og kjemokiner slik som et humanisert anti-IL-5 antistoff (SB-240563: Smith Kline Beecham, Sch-55700 (CDP-835): Shehling Plough/Celltech), et humanisert IL-4 antistoff (US patent 5 914 110), en oppløselig kjemokinreseptor (J". Immunol., 160, 624 (1998)), etc:; (2) cytokin/ kjemokin produksjon-inhibitorer slik som en IL-5 produksjon-inhibitor (Japansk publisert ikke-gransket patentsøknad nr. 53355/96), en retinoid antagonist (WO 99/24024), splatast tosilat (IPD-1151T, produsert av Taiho Pharmaceutical), etc:, (3) midler som virker på eosinofil, mastcelle og lignende som endelige inflammatoriske celler, slik som et humanisert IL-5 reseptor antistoff (WO 97/10354), en CC kjemokinreseptor 3 (CCR3) antagonist (Japansk publisert ikke-gransket patent-søknad nr. 147872/99), etc.; (4) inflammatorisk molekyl-inhibitorer slik som et humanisert anti-IgE antistoff ( Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157, 1429 (1998)), etc.; og lignende. Men de inhiberer kun en del av det elaborate nettverk blant cytokin, kjemokin og inflammatoriske celler. Th2-medierte immunsykdommer bør ikke helbredes ved hjelp av disse midlene. Anti-CD4 antistoffer har en aktivitet til å kon-trollere T-celler, og har effekter på steroid-avhengig alvor-lig astma. Siden CD4 molekylet generelt uttrykkes i forskjellige immunceller, mangler de imidlertid spesifisitet og har en ulempe med å ledsage sterk immunsuppresiv effekt (Int. Arch. Aller. Immunol., 118, 133 (1999)).
For å inhibere alle disse, er det således påkrevet å kontrol-lere spesielt oppstrøms av den problematiske allergiske reaksjon, nemlig Th2 celler.
Den for tiden anvendte alminnelige metode for behandling av pasienter med alvorlige Th2-medierte immunsykdommer er steroidadministrering, men bivirkninger ved steroider kan ikke unngås. Der er også ulemper ved at tilstandene til hver pasient returnerer til den tidligere tilstand når steroid-administreringen innstilles, og ved at legemiddelresistens oppnås når steroidet administreres i lang tid.
Intet humant CDR-podet antistoff og antistoffragmentet derav som kan påvise CCR4-uttrykkende celler og også har cytotoksisitet mot CCR4-uttrykkende celler er frem til nå blitt etablert. Intet terapeutisk middel som kan inhibere produksjon av Th2 cytokin har i tillegg vært kjent frem til nå.
Selv om det er blitt rapportert at CCR4 også uttrykkes på cancercellene hos levkemipasienter ( Blood, 96_, 685 (2000)), har intet terapeutisk middel som utmatter levkemiceller vært kjent.
Det er generelt kjent at når et antistoff avledet fra et ikke-humant dyr, f.eks. et muse-antistoff, administreres til et menneske, gjenkjennes det som en fremmed substans og induserer et humant antistoff mot muse-antistoffet (humant-anti-muse-antistoff: i det etterfølgende referert til som "HAMA") i menneskekroppen. Det er kjent at HAMA reagerer med det administrerte muse-antistoff til å forårsake bivirkninger (J\ Clin. Oncol., 2, 881 (1984), Blood, 65_, 1349 (1985), J. Nati. Cancer Inst., 80., 932 (1988), Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., 82., 1242 (1985) ) , til å akselerere forsvinning av det administrerte muse-antistof f fra kroppen (J\ Nucl. Med., 26., 1011 (1985), Blood, 65_, 1349 (1985), J. Nati. Cancer Inst., 80, 837 (1988)), og til å redusere terapeutiske effekter av muse-antistof f et (J". Immunol., 135, 1530 (1985), Cancer Res., 46, 6489 (1986)).
For å løse disse problemene, er det blitt gjort forsøk på å omdanne et antistoff avledet fra et ikke-humant dyr til et humant CDR-podet antistoff ved anvendelse av genteknologisk teknikk.
Det humane CDR-podede antistoff er et antistoff hvori aminosyresekvensen av CDR i den variable region (i det etter-følgende referert til "V region") avledet fra et ikke-humant dyre-antistoff podes inn i en passende posisjon av et humant antistoff (Nature, 321, 522 (1986)). Sammenlignet med antistoffer avledet fra ikke-humane dyr slik som muse-antistoffer og lignende, har disse humane CDR-podede antistoffer forskjellige fordeler for kliniske anvendelser hos mennesker. Det er f.eks. blitt rapportert at dets immunogenisitet ble redusert og dets blod-halveringstid ble lang sammenlignet med et muse-antistof f ved anvendelse av en ape ( Cancer Res., 56., 1118 (1996), Immunol., 85, 668 (1995)). Det er således forventet at de humane CDR-podede antistoffer har mindre bivirkninger i mennesker og deres terapeutiske effekter fortsetter i lengre tid enn antistoffer avledet fra ikke-humane dyr.
Siden det humane CDR-podede antistoff fremstilles ved anvendelse av genteknologisk teknikk, kan dessuten molekyler i forskjellige former fremstilles. Når f.eks. yl underklasse anvendes som en tung kjede (i det etterfølgende referert til som "H kjede") konstant region (i det etterfølgende referert til som "C region") (H kjede C region refereres til som "CH") av et humant antistoff, kan et humanisert antistoff som har en høy effektorfunksjon slik som antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisk (i det etterfølgende referert til som "ADCC") aktivitet fremstilles ( Cancer Res., 56., 1118 (1996)) og en forlenget blod-halveringstid sammenlignet med et muse-antistoff forventes ( Immunol., 85_, 668 (1995)). I behandling særlig for å redusere antallet CCR4-uttrykkende celler, er også høyere cytotoksiske aktiviteter slik som komplement-avhengig cytotoksisk aktivitet (i det etterfølgende referert til som "CDC aktivitet") og ADCC aktivitet via Fc regionen (regionen i og etter hengselregionen av et antistoff tung kjede) av et antistoff viktige for de terapeutiske effekter. Disse resultatene viser derfor klart at humane CDR-podede antistoffer er foretrukne fremfor antistoffer avledet fra ikke-humane dyr slik som muse-antistoffer.
I samsvar med de nylige fremskritt i proteinteknikk og genteknikk, kan dessuten et enkel kjede antistoff (i det etter-følgende referert til som "scFv") ( Science, 242, 423 (1998)), et dimerisert V region-fragment (i det etterfølgende referert til som "diabody") (Nature Biotechnol. , 15., 629 (1997)), et disulfid-stabilisert V region-fragment (i det etterfølgende referert som "dsFv") ( Molecular Immunol., 32., 249 (1995)), et peptid inneholdende CDR ( J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996)) og lignende, fremstilles som humane CDR-podede antistoffer. Antistoffragmentene er fremragende med hensyn til overgangs-aktivitet inn i målvev sammenlignet med komplette antistoff-molekyler ( Cancer Res., 52., 3402 (1992)).
Det er vurdert at disse fragmenter avledet fra humane CDR-podede antistoffer og antistoffragmenter derav er mer ønske-lige enn dem avledet fra antistoffer avledet fra ikke-humane dyr slik som muse-antistoffer, når anvendt i kliniske anvendelser for mennesker.
Som beskrevet ovenfor, kan diagnostiske og terapeutiske effekter forventes fra humane CDR-podede antistoffer og antistoffragmenter derav når anvendt alene, men det er også blitt gjort forsøk på ytterligere å forbedre effektene ved anvendelse av andre molekyler i kombinasjon. Cytokin kan f.eks. anvendes som et av slike molekyler. Cytokin er en generell betegnelse for forskjellige oppløselige faktorer som kontrollerer intercellulære gjensidige funksjoner i immun-reaksjoner. CDC aktivitet og ADCC aktivitet er f.eks. kjent som de cytotoksiske aktiviteter av antistoffer, og ADCC aktivitet kontrolleres ved effektorceller som har Fc reseptorer på celleoverflaten slik som monocytter, makrofager, NK celler og lignende ( J. Immunol,. 138, 1992 (1987)). Siden forskjellige cytokiner aktiverer disse effektorceller, kan de administreres i kombinasjon med et antistoff for å forbedre ADCC
aktivitet av antistoffet.
Omtale av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse vedrører de følgende 1 til 59. 1. Et humant CDR-podet antistoff eller antistoff fragment derav som spesifikt reagerer med en ekstracellulær region av human CC kjemokinreseptor 4 (CCR4) men ikke reagerer med en human blodplate,og som omfatter hypervariabelt område (CDR) 1. CDR2 og CDR3 av en antistoff tung kjede (H kjede) variabel region (V region) som har aminosyresekvensene representert ved henholdsvis SEQ ID N0:1, 2 og 3, og CDR 1, CDR2 og CDR3 av en antistoff lett kjede (L kjede) V region som har aminosyresekvensene representert ved henholdsvis SEQ ID NO:5, 6 og 7. 2. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 1, som har en cytotoksisk aktivitet mot en CCR4-uttrykkende celle. 3. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 1 eller 2, som spesifikt reagerer med en ekstracellulær region av CCR4 valgt fra gruppen bestående av posisjoner 1 til 39, 98 til 112, 176 til 206 og 271 til 2 84 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48. 4. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3,som spesifikt reagerer med en epitop tilstede i posisjonene 2 til 2 9 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48. 5. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, som spesifikt reagerer med en epitop tilstede i posisjoner 13 til 2 9 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48. 6. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5, som spesifikt reagerer med en epitop tilstede i posisjoner 13 til 25 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48. 7. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 1 eller 2, som spesifikt reagerer med en CCR4-uttrykkende celle. 8. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 7, som har en høyere cytotoksisk aktivitet mot en CCR4-uttrykkende celle enn et monoklonalt antistoff produsert ved et ikke-humant dyre-hybridom. 9. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 2 til 8, hvori den cytotoksiske aktivitet er en antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisk (ADCC) aktivitet. 10. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 9, hvori ADCC aktiviteten er en aktivitet med indusering av apoptose av en CCR4-uttrykkende celle. 11. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 10, som har en aktivitet med utarming av en CCR4-uttrykkende celle. 12. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 7 til 11, hvori den CCR4-uttrykkende celle er en Th2-celle. 13. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 12, som har en aktivitet med inhibering av cytokinproduksjon av en Th2-celle. 14. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 13, hvori cytokinet er IL-4, IL-5 eller IL-13. 15. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 14, som tilhører et humant IgG antistoff. 16. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 15, som omfatter rammeverkregioner (FR-er) H kjede V region og L kjede V region av et humant antistoff. 17. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 16, som omfatter FR-er av H kjede V region og L kjede V region av et humant antistoff, og H kjede C region og L kjede C region av et humant antistoff. 18. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17, som omfatter (a) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; (b) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (c) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:13; (d) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (e) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:9; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (f) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:9; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (g) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:10; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (h) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:10; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (i) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:11; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (j) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:11; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (k) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; (1) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (m) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:13;
(n) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14;
(o) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:39; og en
antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8;
(p) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:3 9; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12;
(q) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:39; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:13;
(r) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:39; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14;
(s) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:40; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8;
(t) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:40; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14;
(u) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:41; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; eller
(v) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:41; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14. 19. Antistoffragmentet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 18, hvori antistoffragmentet er en antistoffragment valgt fra Fab, Fab<1>, F(ab')2, et enkel kjede antistoff (scFv), et dimerisert V region fragment (Diabody), et disulfid-stabilisert V region fragment (dsFv) og et peptid omfattende CDR. 20. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 27, som er produsert ved en transformant KM8759 (FERM BP-8129) eller KM8760 (FERM BP-8130). 21. Et DNA som koder for det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20. 22. En rekombinant vektor som omfatter DNA-et i samsvar med krav 21. 23. En ikke-human transformant som produserer det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 eller som kan oppnås ved innføring av den rekombinante vektor i samsvar med krav 22 i en vertcelle. 24. Ikke-human transformant som angitt i krav 23, hvori transformanten er KM8759 (FERM BP-8129) eller KM8760 (FERM BP-8130). 25. En fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som er i stand til å produsere det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20, som omfatter dyrking av transformanten i samsvar med krav 23 eller 24 i et medium for å danne og akkumulere det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav i kulturen; og utvinning av antistoffet eller antistoffragmentet fra kulturen. 26. Et humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav hvori det humane CDR-podede antistoff eller antistoff-fragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 er kjemisk eller genetisk konjugert med en radioisotop, et protein eller et middel. 27. Et medikament som omfatter minst ett valgt fra det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26 som en aktiv bestanddel. 28. Et terapeutisk middel for behandling av CCR4-relaterte sykdommer, som omfatter minst ett valgt fra det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26 som en aktiv bestanddel . 29. Det terapeutiske middel som angitt i krav 28, hvori den CCR4-relaterte sykdom er en cancer eller inflammatoriske sykdommer . 30. Det terapeutiske middel som angitt i krav 29, hvori canceren er en blodcancer. 31. Det terapeutiske middel som angitt i krav 30, hvori blodcanceren er levkemi eller lymfomatose. 32. Det terapeutiske middel som angitt i krav 29, hvori den inflammatorisk sykdom er akutt eller kronisk luftveis-over-følsomhet eller bronkialastma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis. 33. Det terapeutiske middel som angitt i krav 28, hvori den Th2-medierte immunsykdom er kronisk luftveis-overfølsomhets-astma, bronkial astma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis. 34. Et diagnostisk middel for CCR4-relaterte sykdommer eller Th2-medierte immunsykdommer, som omfatter minst ett valgt fra det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26 som en aktiv bestanddel. 35. Det diagnostiske middel som angitt i krav 34, hvori den CCR4-relaterte sykdom er en cancer eller en inflammatorisk sykdom. 36. Det diagnostiske middel som angitt i krav 35, hvori canceren er en blodcancer. 37. Det diagnostiske middel som angitt i krav 35, hvori blodcanceren er levkemi eller lymfomatose. 38. Det diagnostiske middel som angitt i krav 35, hvori den inflammatoriske sykdom er kronisk luftveis-overfølsomhets-astma, bronkial astma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis. 39. Det diagnostiske middel som angitt i krav 34, hvori den Th2-medierte immunsykdom er kronisk luftveis-overfølsomhets-astma, bronkial astma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis. 40. En fremgangsmåte for immunologisk påvisning av CCR4 eller en celle som uttrykte CCR4 på celleoverflaten, som anvender det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26.
I den foreliggende oppfinnelse, inkluderer de CCR4-relaterte sykdommer cancertyper, inflammatoriske sykdommer og lignende.
I den foreliggende oppfinnelse, inkluderer cancertypene blodcancertyper, særlig levkemi, lymfomatose og lignende.
I den foreliggende oppfinnelse, inkluderer de inflammatoriske sykdommer akutt eller kronisk luftveis-overfølsomhet eller bronkial astma; atopiske hudsykdommer slik som atopisk dermatitt; allergisk rhinitt; pollinosis; og lignende.
I den foreliggende oppfinnelse, kan de Th2-medierte immunsykdommer være hvilken eller hvilke som helst immunsykdommer som Th2 celle er relatert til, og inkluderer akutt eller kronisk luftveis-overfølsomhet eller bronkial astma; atopiske hudsykdommer slik som atopisk dermatitt; allergisk rhinitt; pollinosis; interstitiell pneumoni; pulmonal fibrose; autoimmune sykdommer slik som systemisk lupus erythematosus; og lignende.
Det humane CDR-podede antistoff som spesifikt reagerer med CCR4 (anti-CCR4 CDR-podet antistoff) og et antistoffragment derav i henhold til den foreliggende oppfinnelse) i det et-terfølgende vil begge generelt refereres som antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse i enkelte tilfeller (er ikke begrenset, så lenge som det er et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med den ekstracellulære region av human CCR4 men reagerer ikke med en human blodplate eller et antistoffragment derav. Betegnelsen "reagerer ikke med en human blodplate" betyr at antistoffet utviser hoved-sakelig ingen bindingsaktivitet overfor en human blodplate. Det betyr spesifikt av bindingsaktiviteten ikke vises når målt ved hjelp av et flow-cytometer.
Videre er antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse et antistoff som spesifikt reagerer med den ekstra cellulære region av human CCR4 og har en cytotoksisk aktivitet for CCR4-uttrykkende celler.
Den cytotoksiske aktivitet inkluderer CDC aktivitet og ADCC aktivitet.
Antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse inkluderer videre antistoffer som spesifikt reagerer med foretrukket en region omfattende posisjoner 1 til 39, 98 til 112, 176 til 206 eller 271 til 284 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48, mer foretrukket en region omfattende posisjoner 2 til 29 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID N0:48 (SEQ ID NO:36), enda mer foretrukket en region omfat tende posisjoner 12 til 2 9 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48 (SEQ ID NO:37), og mest foretrukket en region omfattende posisjoner 12 til 25 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48.
Det humane CDR-podede antistoff representerer et antistoff hvori aminosyresekvenser av CDR av VH og VL i et antistoff avledet fra et ikke-humant dyr er podet til passende posisjoner av VH og VL av et humant antistoff.
Det humane CDR-podede antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan produseres ved konstruering av cDNA-er som koder for V regioner hvori aminosyresekvenser av CDR av VH og VL i et antistoff avledet fra et ikke-humant dyr, som spesifikt reagerer med CCR4, podes til FR av VH og VL i et humant antistoff, å innskyte dem henholdsvis i en ekspresjonsvektor for dyrecelle som har DNA som koder for CH og H kjede C region (i det etterfølgende referert til som "CL") av et humant antistoff for å konstruere en human CDR-podet antistoff ekspresjonsvektor, og deretter å innføre den i en dyrecelle for å uttrykke det humane CDR-podede antistoff.
Som metoden for å velge FR aminosyresekvenser av VH og VL av et humant antistoff, kan det anvendes en hvilken som helst metode så lenge som de er avledet fra humane antistoffer. Eksempler inkluderer FR aminosyresekvenser av VH og VL i humane antistoffer registrert i databaser slik som Protein Data Bank og lignende, eller aminosyresekvenser som er felles i hver undergruppe av FR av VH og VL i humane antistoffer (Seguences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991).
Et hvilket som helst CH i antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan anvendes, så lenge som det tilhører humant immunglobulin (i det etterfølgende referert til som"hig"). En hlgG klasse, og hvilken som helst av yl, y2, y3 ogY4 underklasser som tilhører hlgG klassen kan foretrukket anvendes. En hvilken som helst CL i det humane CDR-podede antistoff kan også anvendes, så lenge som det tilhører hig, og dem i k klasse eller A klasse kan anvendes.
Antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse inkluderer humane CDR-podede antistoffer eller antistoffragmentene derav som omfatter antistoff HV CDR1, CDR2 og CDR3 omfattende aminosyresekvensene representert ved henholdsvis SEQ ID N0:1, 2 og 3, og/eller VL CDR1, CDR2 og CDR3 omfattende aminosyresekvensene representert ved henholdsvis SEQ ID NO:5, 6 og 7.
Foretrukne eksempler inkluderer humane CDR-podede antistoffer hvori VH i antistoffet omfatter aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4 eller 38 og/eller VL omfatter aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8.
Mer foretrukne eksempler inkluderer:
et humant CDR-podet antistoff som omfatter VH av antistoffet omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Ala i posisjon 40, Gly i posisjon 42, Lys i posisjon 43, Gly i posisjon 44, Lys i posisjon 76 og Ala i posisjon 97 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4 er substituert med en annen aminosyrerest,
et humant CDR-podet antistoff som omfatter VH i antistoffet omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Thr i posisjon 28 og Ala i posisjon 97 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38 er substituert med en annen aminosyrerest,
et humant CDR-podet antistoff som omfatter VL i antistoffet omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Ile i posisjon 2, Val i posisjon 3, Gin i posisjon 50 og Val i posisjon 88 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8 er substituert med en aminosyrerest,
et humant CDR-podet antistoff som omfatter VH i antistoffet omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Ala i posisjon 40, Gly i posisjon 42, Lys i posisjon 43, Gly i posisjon 44, Lys i posisjon 76 og Ala i posisjon 97 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4 er
substituert med en annen aminosyrerest; og VL i antistoffet omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Ile i posisjon 2, Val i posisjon 3, Gin i posisjon 50 og Val i posisjon 88 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8 er substituert med en annen aminosyrerest,
et humant CDR-podet antistoff som omfatter VH i antistoffet omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Thr i posisjon 28 og Ala i posisjon 97 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38 er substituert med en annen aminosyrerest; og VL i antistoffet VL omfattende en aminosyresekvens hvori minst en aminosyrerest valgt fra Ile i posisjon 2, Val i posisjon 3, Gin i posisjon 50 og Val i posisjon 8 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8 er substituert med en annen aminosyrerest,
og lignende.
Den foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffer som omfatter aminosyresekvensen hvori en eller flere aminosyrer er delert, substituert, innskutt eller addert og spesifikt reagerer med CCR4 som beskrevet ovenfor, og antistoffragmentene derav.
I den foreliggende oppfinnelse betyr en eller flere aminosyre-delesjoner, -substitusjoner, -insertioner eller -addi-sjoner i aminosyresekvensen at en eller flere aminosyrer er delert, substituert, innskutt og/eller addert til en eller flere posisjoner i aminosyresekvensen. Delesjonen, substitu-sjonen, insertionen og/eller addisjonen kan bevirkes i den samme aminosyresekvens samtidig. Videre kan den substitu-erte, innskutte eller adderte aminosyrerest være naturlig eller ikke-naturlig. Den naturlige aminosyrerest inkluderer L-alanin, L-asparagin, L-asparaginsyre, L-glutamin, L-glutaminsyre, glycin, L-histidin, L-isoleucin, L-leucin, L-lysin. L-metionin, L-fenylalanin, L-prolin, L-serin, L-treonin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-valin, L-cystein og lignende.
I det etterfølgende vises foretrukne eksempler på aminosyrerester som er erstattet med hverandre. Aminosyrerestene i den samme gruppen kan erstattes med hverandre.
Gruppe A:
leucin, isoleucin, norleucin, valin, norvalin, alanin, 2-aminobutansyre, metionin, O-metylserin, t-butylglycin, t-butylalanin, cykloheksylalanin,
gruppe B:
asparaginsyre, glutaminsyre, isoasparaginsyre, isoglutamin-syre, 2-aminoadipinsyre, 2-aminosuberinsyre,
gruppe C:
asparagin, glutamin,
gruppe D:
lysin, arginin, ornitin, 2,4-diaminobutansyre, 2,3-diamino-propinsyre,
gruppe E:
prolin, 3-hydroksyprolin, 4-hydroksyprolin,
gruppe F:
serin, treonin, homoserin,
gruppe G:
fenylalanin, tyrosin.
Antistoffragmentet i henhold til den foreliggende oppfinnelse inkluderer Fab, Fab<1>, F(ab')2, scFc, Diabody, dsFv, et peptid omfattende CDR, og lignende.
Et Fab er et antistoffragment som har en molekylvekt på omtrent 50.000 og antigenbindende aktivitet, hvori omtrent en halvpart av N-ende siden av H kjede og hele L kjeden, blant fragmenter oppnådd ved behandling av IgG med en protease, papain (kuttet ved en aminosyrerest i posisjon 224 av H kjeden), er bundet sammen gjennom en disulfidbinding.
Fab-et i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan oppnås
ved behandling av et humant CDR-podet antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse som spesifikt reagerer med CCR4, med en protease, papain. Fab-et kan videre fremstilles ved å innføre DNA som koder for Fab av antistoffet inn i en ekspresjonsvektor for prokaryot eller en ekspresjonsvektor for
eukaryot, og innføring av vektoren i en prokaryot eller eukaryot for å uttrykke Fab-et.
Et F(ab')2er et antistoffragment som har en molekylvekt på omtrent 100.000 og antigenbindende aktivitet, som er noe større enn det Fab som er bundet via en disulfidbinding i hengselregionen, blant fragmenter oppnådd ved behandling av IgG med en protease, pepsin.
F(ab')2 i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved behandling av et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med CCR4, med en protease, pepsin. Videre kan F(ab')2-et produseres ved binding av Fab<1>beskrevet nedenfor via en tioeterbinding eller en disulfidbinding.
Et Fab<1>er et antistoffragment som har en molekylvekt på omtrent 50.000 og antigenbindende aktivitet, som oppnås ved kutting av en disulfidbinding i hengselregionen av F(ab')2-et.
Fab<1->et i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved å behandle F(ab')2-et som spesifikt reagerer med CCR4, med et reduksjonsmiddel, ditiotreitol. Fab<1->et i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan videre produseres ved å innskyte DNA som koder for et Fab<1>av et humant CDR-podet antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse som spesifikt reagerer med CCR4 i en ekspresjonsvektor for prokaryot eller en ekspresjonsvektor for eukaryot, og å innføre vektoren i en prokaryot eller eukaryot for å uttrykke Fab1 et. Et scFv er et VH-P-V1 eller VL-P-VH polypeptid hvori en kjede VH og en kjede VL er forbundet ved anvendelse av en passende peptid-linker (P) av 12 eller flere rester og som har en antigenbindende aktivitet.
scFv-et i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan produseres ved å oppnå cDNA-er som koder for VH og VL av et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med CCR4 i henhold til den foreliggende oppfinnelse, og konstruere DNA som koder for scFv, å innskyte DNA-et i en ekspresjonsvektor for
prokaryot eller en ekspresjonsvektor for eukaryot, og deretter å innføre ekspresjonsvektoren i en prokaryot eller eukaryot for uttrykke scFv-et.
Et diabody er et antistoffragment hvori scFv-er som har den samme eller forskjellig antigenbindende spesifisitet danner en dimer, og har en divalent antigenbindende aktivitet overfor det samme antigen eller to spesifikke antigenbindende aktiviteter overfor forskjellige antigener.
Diabody-et i henhold til den foreliggende oppfinnelse, f.eks. et divalent diabody som spesfikt reagerer med CCR4, kan produseres ved å oppnå cDNA-er som koder for VH og VL av et antistoff som spesifikt reagerer med CCR4, å konstruere DNA som koder for scFv som har en polypeptid-linker av 3 til 10 rester, å innskyte DNA-et som koder for scFv som har en polypeptid-linker av 3 til 10 rester, å innskyte DNA-et i en ekspresjonsvektor prokaryote eller en ekspresjonvektor for eukaryot, og deretter å innføre ekspresjonsvektoren i en prokaryot eller eukaryot for å uttrykke diabody-et.
En dsFv oppnås ved å binde polypeptider hvori en aminosyrerest av hver av VH og VL er erstattet med en cysteinrest via en disulfidbinding mellom cysteinrestene. Aminosyreresten som er erstattet med en cysteinrest kan velges basert på en vurdering av tredimensjonal struktur til antistoffet i sam svar med metoden vist av Reiter et al. ( Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
dsFv-et i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan produseres ved å oppnå cDNA-er som koder for VH og VL av et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med CCR4 i henhold til den foreliggende oppfinnelse, og konstruere DNA som koder for dsFv, å innskyte DNA-et i en ekspresjonsvektor for
prokaryot eller en ekspresjonvektor for eukaryot, og deretter å innføre ekspresjonsvektoren i en prokaryot eller eukaryot for å uttrykke dsFv-et.
Et peptid omfattende CDR konstitueres ved å inkludere minst en region av H kjede og L kjede CDR-er. Flere CDR-er kan bindes direkte eller via en passende peptid-linker.
Peptidet omfattende CDR i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan produseres ved å oppnå cDNA som koder for CDR av VH og VL av et humant CDR-podet antistoff som spesifikt reagerer med CCR4, å konstruere DNA som koder for CDR, å innskyte DNA-et i en ekspresjonsvektor for prokaryot eller en ekspresjonvektor for eukaryote, og deretter ved å innføre ekspresjonsvektoren i en prokaryot eller eukaryot for å uttrykke peptidet. Videre kan peptidet omfattende CDR også produseres ved en kjemisk syntesemetode slik som en Fmoc-metode (fluorenylmetoksykarbonyl-metode), en tBoc-metode (t-butyloksykarbonyl-metode), eller lignende.
Antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffderivater hvori en radioisotop, et protein, et middel eller lignende er kjemisk eller genetisk konjugert til antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse.
Antistoffderivatene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan produseres ved kjemisk konjugering av en radioisotop, et protein eller et middel til N-ende siden eller C-ende siden av en H kjede eller en L kjede av et antistoff eller antistoffragment som spesifikt reagerer med CCR4, til en passende substituentgruppe eller sidekjede av antistoffet eller antistoffragmentet eller til en sukkerkjede i antistoffet eller antistoffragmentet ( Antibody Engineering Handbook, forfattet av Osamu Kanemitsu, publisert av Chijin Shokan (1994)) .
Det kan videre produseres genetisk ved å forbinde et DNA som koder for antistoffet eller antistoffragmentet i henhold til den foreliggende oppfinnelse som spesifikt reagerer med CCR4 til et annet DNA som koder for et protein som skal bindes, å innskyte DNA-et i en ekspresjonsvektor, og innføre ekspresjonsvektoren i en vertcelle.
Radioisotopen inkluderer 131I,<1>25I og lignende, og den kan være konjugert til antistoffet ved f.eks. en kloramin T-metode.
Middelet er foretrukket en forbindelse med lav molekylvekt. Eksempler inkluderer anticancermidler slik som alkylerings-midler (f.eks. nitrogen "mustard", cyklofosfamid), metabolske antagonister (f.eks. 5-fluorouracil, metotreksat), antibiotika (f.eks. daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, doksorubicin), plante-alkaloider (f.eks. vinkristin, vinblastin, vindesin), hormon-legemidler (f.eks. tamoksifen, deksametason), og lignende ( Clinical Oncology, forfattet av Japanese Society of Clinical Oncology, publisert av Cancer and Chemotherapy (1996)); antiinflammatoriske midler slik som steroidmidler (f.eks. hydrokortison, prednison), ikke-steroide legemidler (f.eks. aspirin, indometacin), immunmodulatorer (f.eks. aurotiomalat, penicillamin), immunsuppresive midler (f.eks. cyklofosfamid, azatioprin) og antihistaminmidler (f.eks. klorfeniramin-maleat, klemastin) ( Inflammation and Anti- inflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)), og lignende. Metoden for å konjugere daunomycin til et antistoff inkluderer en metode hvori daunomycin og en aminogruppe i et antistoff konjugeres via glutaraldehyd, en metode hvori en aminogruppe i daunomycin og en karboksylgruppe i et antistoff konjugeres via et vannoppløselig karbodiimid, og lignende.
Proteinet er foretrukket cytokin som aktiverer immunceller. Eksempler inkluderer humant interlevkin 2 (i det etter-følgende referert til som "hIL-2"), human granulocyttmakro-fagkoloni-stimulerende faktor (i det etterfølgende referert til som "hGM-CSF"), human makrofag koloni-stimulerende faktor (i det etterfølgende referert til som "hM-CSF"), humant interlevkin 12 (i det etterfølgende referert til som "hlL-12"), og lignende. For å inhibere cancerceller direkte kan det også anvendes et toksin slik som ricin, difteriatoksin og lignende. Et fusjonsantistoff med et protein kan f.eks. produseres ved å forbinde et cDNA som koder for et antistoff eller antistoffragment til et annet cDNA som koder for proteinet, å konstruere DNA som koder for fusjonsantistoffet, å innskyte DNA-et i en ekspresjonsvektor for prokaryot eller en ekspresjonsvektor for eukaryot, og deretter å innføre den i en prokaryot eller eukaryot for å uttrykke fusjonsanti-stof f et .
Metoder for å produsere det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmenet derav som spesifikt reagerer med CCR4, metoder for å evaluere aktiviteten derav og metoder for å anvende dem forklares nedenfor.
1. Framstilling av humant CDR-podet antistoff
(1) Konstruksjon av humanisert antistoff-ekspresjonsvektor
En humanisert antistoff-ekspresjonsvektor er en ekspresjonsvektor for dyrecelle som gener som koder for CH og CL av et humant antistoff er blitt innskutt i, og er konstruert ved kloning av hver av CH og Cl av et humant antistoff inn i en ekspresjonsvektor for dyrecelle.
C regionen av et humant antistoff kan være CH og CL av et hvilket som helst humant antistoff. Eksempler inkluderer CH av y underklasse og CL av k klasse av et humant antistoff, og lignende. cDNA kan også anvendes. Som ekspresjonsvektor for dyrecelle kan det anvendes en hvilken som helst ekspresjonsvektor, så lenge som en C region av et humant antistoff kan innskytes og uttrykkes. Eksempler inkluderer pAGE107 ( Cytotechnology, 3., 133 (1990)), pAGE103 (J\ Biochem. , 101, 1307 (1987)), pHSG274 ( Gene, 27, 223 (1984)), pKCR ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 1527 (1981)), pSGI(3d2-4 ( Cytotechnology, 4, 173 (1990)), pSElUKlSedl-3 ( Cytotechnol, 13., 79 1993)) og lignende. En promoter og enhancer anvendt for en ekspresjonsvektor for dyrecelle inkluderer en SV4 0 tidlig promoter og enhancer ( J. Biochem., 101, 1307 (1987)), en Moloney muse-levkemivirus LTR promoter og enhancer ( Biochem. Biophys, Res. Comun., 149, 960 (1987)), en immunglobulin H kjede promoter ( Cell, 4_1, 479 (1985)) og enhancer ( Cell, 33., 717 (1983)), og lignende.
Humanisert antistoff-ekspresjonsvektoren kan være enten av en type hvori et gen som koder for en antistoff H kjede og et gen som koder for en antistoff L kjede eksisterer på separate vektorer eller av en type hvori begge gener eksisterer på den samme vektor (tandem-type). Med hensyn til enkelheten av konstruksjon av en humanisert antistoff-ekspresjonsvektor, enkelhet av innføring i dyreceller, og balanse mellom ekspre-sjonsmengder av antistoff H og L kjeder i dyreceller, er en tandem-type av humanisert antistoff-ekspresjonsvektoren mer foretrukket (J". Immunol. Methods, 167, 271 (1994)). Tandem-typen av humanisert antistoff-ekspresjonsvektoren inkluderer pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 (HYBRIDOMA, 17., 559 (1998)) og lignende.
Den konstruerte humanisert antistoff-ekspresjonsvektor kan anvendes for ekspresjon av et humant CDR-podet antistoff i dyreceller.
(2)Konstruksjon av cDNA som koder for V region av human CDR-podet antistoff cDNA-er som koder for VH og VL av et humant CDR-podet antistoff kan oppnås som følger. Først velges aminosyresekvenser av FR-er i VH og VL av et humant antistoff hvortil aminosyresekvenser av CDR-er i VH og VL av en antistoff avledet fra et ikke-humant dyre-antistoff er podet. Hvilken eller hvilke
som helst aminosyresekvenser av FR-er i VH og VL av et humant antistoff kan anvendes, så lenge som de er avledet fra menneske. Eksempler inkluderer aminosyresekvenser av FR-er i VH og VL av humane antistoffer registrert i databaser slik som Protein Data Bank og lignende, og aminosyresekvenser som er felles for undergrupper av FR-er i VH og VL av humane antistoffer ( Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest, US Dept. Health and Human Sevices (1991)), og lignende. For å produsere et humant CDR-podet antistoff som har potent aktivitet, velges foretrukket aminosyresekvenser som har høy homologi (minst 60% eller mer) med aminosyresekvens av FR-er i VH og VL av et mål-antistoff avledet fra et ikke-humant dyr.
Aminosyresekvenser av CDR-er i VH og VL av antistoffet avledet fra et ikke-humant dyr podes deretter til de valgte aminosyresekvenser av FR-er i VH og VL av et humant antistoff for å designe aminosyresekvenser av VH og VL av et humant CDR-podet antistoff. De designede aminosyresekvenser omdan-nes til DNA-sekvenser ved å vurdere hyppigheten av kodon-bruk funnet i nukleotidsekvenser av gener av antistoffer (Seguence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)), og DNA-sekvensene som koder for aminosyresekvensene av VH og VL av et humant CDR-podet antistoff designes. Flere syntetiske DNA-er som har en lengde på omtrent 100 til 200 nukleotider syntetiseres, og PCR utføres ved anvendelse av disse. I dette tilfelle er det foretrukket i hver av VH og VL at 4 eller 6 syntetiske DNA-er er designet med tanke på reaksjonseffektiviteten av PCR og lengden av DNA-er som kan syntetiseres. Videre kan de enkelt klones inn i humanisert antistoff-ekspresjonsvektoren konstruert i punkt 1(1) ved innføring igjenkjennelsessekvensen av et passende restriksjonsenzym til 5' enden av de syntetiske DNA-er til stede på begge endene. Etter PCR klones et amplifisert produkt inn i et plasmid slik som pBluescript SK (-) (produsert av Stratagene) eller lignende, og nukletidsekvensene bestemmes til å oppnå et plasmid som har DNA-sekvenser som koder VH og VL av et designet humant CDR-podet antistoff.
(3)Modifisering av aminosyresekvens av V region av humant CDR-podet antistoff
Det er kjent at når et humant CDR-podet antistoff produseres ved ganske enkelt å kode kun CDR-er i VH og VL av et antistoff avledet fra et ikke-humant dyr inn i FR-er i VH og VL av et humant antistoff, er dets antigenbindende aktivitet lavere enn den for det opprinnelige antistoff avledet fra et ikke-humant dyr ( BIO/' TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)) . Hva angår årsaken, vurderes det at flere aminosyrerester i ikke bare CDR-er og også FR-er direkte eller indirekte relaterer til antigenbindende aktivitet i VH og VL av de opprinnelige antistoff avledet fra en ikke-humant dyr, og at de er forandret til forskjellige aminosyrerester av forskjellige FR-er i VH og VL av et humant antistoff. For å løse problemet, i humane CDR-podede antistoffer, blant aminosyresekvensene av FR-er i VH og VL av et humant antistoff, blir en aminosyrerest som direkte relaterer til binding til et antigen, eller en aminosyrerest som indirekte relaterer til binding til et antigen ved å interagere med en aminosyrerest i CDR eller ved å opp-rettholde den tredimensjonale struktur av et antistoff identifisert og modifisert til en aminosyrerest som finnes i det opprinnelige ikke-humane dyre-antistoff for derved å øke den antigenbindende aktivitet som er blitt redusert ( BIO/ TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)). I produksjonen av et humant CDR-podet antistoff er det viktigst hvordan man effektivt kan identifisere aminosyrerestene som relaterer til den antigen-bindende aktivitet i FR, slik at den tredimensjonale struktur av et antistoff konstrueres og analyseres ved røntgen kry-stallografi ( J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)), datamaskin-modellering ( Protein Engineering, 1_, 1501 (1994) ) eller lignende. Selv om informasjonen om den tredimensjonale struktur av antistoffer har vært anvendbar i produksjonen av et humant CDR-podet antistoff, er det ennå ikke blitt etablert noen metode for å produsere et humant CDR-podet antistoff som kan appliseres til noen antistoffer. Ulike forsøk må derfor for tiden være nødvendige, idet f.eks. flere modifiserte antistoffer av hvert antistoff produseres og forholdet mellom hvert av de modifiserte antistoffer og dets antistoffbindende aktivitet undersøkes.
Modifiseringen av den valgte aminosyresekvens av FR-er i VH og VL av et humant antistoff kan utføres ved anvendelse av ulike syntetiske DNA for modifisering i samsvar med PCR. Hva angår det amplifiserte produkt oppnådd ved PCR, bestemmes nukleotidsekvensen i overensstemmelse med metoden som er beskrevet i punkt 1(2) slik at hvorvidt den tilsiktede modifisering er blitt utført bekreftes. (4) Konstruksjon av human CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektor
En human CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektor kan konstrueres ved å klone cDNA-er som koder for VH og VL av det humane CDR-podede antistoff konstruert i punktene 1(2) og 1(3) opp-strøms av genene som koder for VH og VL av det humane antistoff i humanisert antistoff-ekspresjonsvektoren som beskrevet i punkt 1(1). Når f.eks. gjenkjennelsesseter for passende restriksjonsenzymer er innført i 5<1->enden av syntetiske DNA-er posisjonert ved begge ender blant syntetiske DNA-er anvendt i konstruksjonen av VH og VL av det humane CDR-podede antistoff i punktene 1(2) og (3), kan kloning utføres slik at de uttrykkes i en passende form oppstrøms av gener som koder for CH og CL av det humane antistoff i humanisert antistoff-ekspresjonsvektoren som er beskrevet i punkt 1(1).
(5) Transient ekspresjon av humant CDR-podet antistoff
For å effektivt evaluere den antigenbindende aktivitet av
forskjellige produserte humane CDR-podede antistoffer, kan de humane CDR-podede antistoffer uttrykkes transient ved anvendelse av human CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektoren som beskrevet i punkt 1(4) eller den modifiserte ekspresjonvektor
derav. En hvilken som helst celle kan anvendes som en vertcelle, så lenge som vertcellen kan uttrykke et humant CDR-podet antistoff. COS-7 celle (ATCC CRL16 51) anvendes generelt i betraktning av dens høye ekspresjonsmengde ( Methods in Nucleic Acids Res., CDV Press, s. 283 (1991)). Metoden for innføring av ekspresjonsvektoren i COS-7 celle inkluderer en DEAE-dekstran-metode ( Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, s. 283 (1991)), en lipofeksjonsmetode ( Proe, Nati. Acad. Sei. USA, 84., 7413 (1987)), og lignende.
Etter innføring av ekspresjonsvektoren, kan ekspresjonsmengden og antigenbindende aktivitet av det humane CDR-podede antistoff i kultur-supernatanten bestemmes ved enzym-immunanalyse (ELISA) ( Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)) og lignende.
(6)Stabil ekspresjon av humant CDR-podet antistoff
En transformant som stabilt produserer et humant CDR-podet antistoff kan oppnås ved å innføre i en passende vertcelle human CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektoren beskrevet i punkt 1(4).
Metoden for innføring av ekspresjonsvektoren i en vertcelle inkluderer elektroporering ( Cytotechnology, 3, 133 (1990)) og lignende.
En hvilken som helst celle kan anvendes som vertcellen som humant CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektoren skal innføres i, så lenge som den kan uttrykke et humant CDR-podet antistoff. Eksempler inkluderer muse SP2/0-Agl4 celle (ATCC CRL1581), muse P3X63-Ag8.653 celle (ATCC CRL1580), CHO celle hvori et dihydrofolatreduktase (defr) gen er påvisbart ( Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., 77, 4116 (1980)), rotte YB2/ 3HL.P2.Gll.16Ag.20 celle (YB2/0 celle; ATCC CRL1662) og lignende.
Etter innføring av ekspresjonsvektoren, velges transformanter som stabilt uttrykker et humant CDR-podet antistoff ved dyrking i et medium for dyrecellekultur inneholdende et middel slik som G418 sulfat (G418; produsert av Sigma) eller lignende (J". Immuol. Methods, 167, 271 (1994)). Mediet for dyrecellekultur inkluderer PRMI1640 medium (produsert av Nissui Pharmaceutical), GIT medium (produsert av Nissui Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (produsert av JRH), IMDM medium (produsert av GIBCO BRL), Hybridoma-SFM medium (produsert av GIBCO BRL), medier oppnådd ved å tilsette forskjellige additiver slik som FBS til disse mediene og lignende. Det humane CDR-podede antistoff kan produseres og akkumuleres i et kulturmedium ved å dyrke de valgte transformanter i et medium. Ekspresjonsmengden og antigenbindende aktivitet av det humaniserte antistoff i kultursupernatanten kan måles ved hjelp av ELISA eller lignende. Også, i transformanten, kan ekspresjonsmengden av det humane SDR-podede antistoff økes ved anvendelse av dhfr ampiifikasjonssystem eller lignende ( J. Immuol. Methods, 167, 271 (1994)).
Det humane CDR-podede antistoff kan renses fra kultursupernatanten av transformanten ved anvendelse av en protein A kolonne ( Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)). Hvilken eller hvilke som helst andre konvensjonelle metoder for proteinrensing kan anvendes. Det humaniserte antistoff kan f.eks. renses ved en kombinasjon av gelfiltrering, ionebytterkromatografi, ultrafiltrering og lignende. Molekyl-vekten til H kjeden eller L kjeden av det rensede humaniserte antistoff eller antistoffmolekylet som helhet betraktet bestemmes ved polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE;
Nature, 227, 680 (197)), Western blotting { Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12
(1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1966)) og lignende.
2.Fremstilling av antistoffragment
Antistoffragmentet kan fremstilles basert på det humaniserte antistoff beskrevet i punkt 1 ved anvendelse av genteknikk eller proteinteknikk. Antistoffragmentet inkluderer Fab, F(ab')2Fab<1>sdFv, diabody, dsFv, et peptid omfattende CDR, og lignende.
(1)Fremstilling av Fab
Fab kan fremstilles ved å behandle IgG med et proteolytisk enzym papain. Etter papainbehandlingen, når de opprinnelige antistoff er en IgG underklasse som har en protein A-bindende aktivitet, kan ensartet Fab utvinnes ved å separere det fra IgG molekyler og Fc fragmenter ved passering gjennom en protein A kolonne ( Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (1995)). Når det opprinnelige antistoff er et antistoff av IgG underklasse som ikke har noen protein A-bindende aktivitet, kan Fab utvinnes ved ionebytterkromatografi i en fraksjon eluert ved en lav saltkonsentrasjon ( Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tredje utgave (1995)). I tillegg kan Fab også fremstilles ved genmanipuleringsteknikker ved anvendelse av Escherichia coli.
En Fab ekspresjonsvektor kan f.eks. fremstilles ved kloning av DNA-et som koder for antistoff V regionen beskrevet i punktene 1(2) og 1(3) inn i en vektor for Fab ekspresjon. Som vektoren for Fab ekspresjon kan en hvilken som helst vektor anvendes, så lenge som et DNA for Fab kan innskytes og uttrykkes. Eksempler inkluderer pIT106 ( Science, 240, 1041
(1988)) og lignende. Fab kan dannes og akkumuleres i et inklusjonslegeme eller periplasmisk rom ved å innføre Fab ekspresjonvektoren i en passende Escherichia coli. Aktiv Fab kan oppnås fra inklusjonslegemet ved hjelp av en refoldings metode generelt anvendt for protein, og når den er uttrykt i det periplasmiske rom lekkes aktiv Fab i kultursupernatanten.
Ensartet Fab kan renses etter refoldingen eller fra kultur-supernatanten ved anvendelse av en antistoff-forbundet kolonne ( Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)).
(2) Fremstilling av F(ab')2
F(ab')2 kan fremstilles ved å behandle IgG med et proteolytisk enzym papain. Etter papainbehandlingen kan den gjen-vinnes som ensartet F(ab')2 ved hjelp av en renseprosedyre som ligner på tilfellet med Fab ( Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tredje utgave, Academic Press
(1995)). I tillegg kan den også fremstilles ved hjelp av metoden beskrevet i punkt 2(3) hvori Fab<1>behandles med maleimid slik som o-PDM, bismaleimidheksan eller lignende til å danne en tioeterbinding, eller en metode hvori den behandles med DTNB til å danne en S-S binding ( Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS (1966)).
(3) Fremstilling av Fab<1>
Fab<1>kan fremstilles ved genmanipuleringsteknikker ved anvendelse av Escherichia coli. En Fab<1>ekspresjonsvektor kan f.eks. konstrueres ved å klone DNA-et som koder for antistoff V regionen beskrevet i punktene 1(2) og (3) inn i en vektor for Fab<1>ekspresjon. Som vektoren for Fab<1>ekspresjon kan en hvilken som helst vektor anvendes, så lenge som et DNA for Fab<1>kan innskytes og uttrykkes. Eksempler inkluderer pAK19 ( Bio/ Techonolgy, 10., 163 (1992)) og lignende. Fab<1>kan dannes og akkumuleres i et inklusjonslegeme eller periplasmisk rom ved innføring av Fab<1>ekspresjonsvektoren i en passende Escherichia coli. Aktiv Fab<1>kan oppnås fra inklusjonslegemet ved hjelp av en refoldingsmetode som generelt anvendes for protein, og når den er uttrykt i det periplasmiske rom kan de utvinnes i ekstracellulær enhet ved å oppbryte cellene med en behandling slik som partiell lysozymnedbryt ning, osmotisk trykksjokk, lydbehandling eller lignende. Ensartet Fab' kan renses etter refoldingen eller fra den oppbrutte cellesuspensjon ved anvendelse av en protein G kolonne eller lignende ( Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS (1966)),
(4) Fremstilling av scFv
scFv kan fremstilles ved anvendelse av en fag eller Escherichia coli ved hjelp genmanipuleringsteknikker. Et DNA som koder for scFv produseres f.eks. ved å ligere DNA-er som koder for antistoff VH og VL beskrevet i punktene 1(2) og (3) via et DNA som koder for en polypeptid-linker omfattende en aminosyresekvens av 12 rester eller mer. En scFv ekspresjonsvektor kan konstrueres ved å klone det resulterende DNA inn i en vektor for scFv ekspresjon. Som vektoren for scFv ekspresjon kan en hvilken som helst vektor anvendes, så lenge som et DNA for scFv kan innskytes og uttrykkes. Eksempler inkluderer pCANTAB5E (produsert av Pharmacia), Phfa (Hum. Antibody Hybridoma, 5, 48 (1994)) og lignende. scFv ekspresjonsvektoren ble innført i en passende Escherichia coli og infisert med en hjelper-fag for derved å oppnå en fag som uttrykker scFv på fag-overflaten i en fusjonert form med fag-overflateproteinet. scFv kan også dannes og akkumuleres i inklusjonslegemet eller det periplasmiske rom av Escherichia coli som scFv ekspresjonsvektor innføres i. Aktiv scFv kan oppnås fra inklusjonslegemet ved hjelp av en refoldingsmetode som generelt anvendes for protein, og når den er uttrykt i det periplasmiske rom kan den utvinnes ekstracellulært ved oppbryting av cellene med en behandling slik som delvis lysozymnedbrytning, osmotisk trykksjokk, lydbehandling eller lignende. Ensartet scFv kan renses etter refoldingen eller fra den oppbrutte cellesuspensjon ved kationbytterkromato-grafi eller lignende ( Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS (1996)).
(5) Fremstilling av diabody
Diabody kan fremstilles ved å forandre størrelsen av polypeptid-linkeren for fremstilling av scFv til omtrent 3 til 10 rester. Et divalent diabody kan fremstilles når VH og VL av en antistoff-species anvendes, og et diabody som har to forskjellige spesifisiteter når VH og VL av to antistoff-species anvendes ( FEBS Letters, 453, 164 (1999), Int. J. Cancer, 77., 763 (1998)).
(6) Fremstilling av dsFv
dsFv kan fremstilles ved anvendelse av Escherichia coli ved hjelp av genmanipuleringsteknikker. Først produseres DNA-er hvori en kodet aminosyrerest er erstattet med en cysteinrest ved innføring av mutering i passende posisjoner av DNA-ene som koder for antistoff VH og VL beskrevet i punktene 1(2) og 1(3). VH og VL ekspresjonsvektorer kan produseres ved å klone hvert av de resulterende DNA-er inn i en vektor for dsFv ekspresjon. Som vektoren for dsFv ekspresjon kan en hvilken som helst vektor anvendes, så lenge som et DNA for dsFv kan innskytes og uttrykkes. Eksempler inkluderer pULI9 ( Protein Engineering, 6 97 (1994) og lignende. VH og VL ekspresjonsvektorene innføres i en passende Escherichia coli for derved å danne og akkumulere VH og VL i inklusjonslegemet eller det periplasmiske rom. VH og VL oppnås fra inklusjonslegemet eller det periplasmiske rom og blandes, og aktiv dsFv kan oppnås ved hjelp av en refoldingsmetode som generelt anvendes for protein. Etter refoldingen kan den ytterligere renses ved ionebytterkromatografi og gelfiltrering eller lignende ( Protein Engineering, !_>6 97 (1994) ) .
(7) Fremstilling av peptid omfattende CDR
Et peptid omfattende CDR kan fremstilles ved en kjemisk syntesemetode slik som Fmoc, tBoc eller lignende. Et DNA som koder for et peptid omfattende CDR fremstilles også, og det resulterende DNA klones inn i en passende vektor for ekspresjon for derved å fremstille peptidet omfattende CDR. Som vektoren for ekspresjon kan en hvilken som helst vektor an vendes, så lenge som et DNA som koder for et peptid omfattende et CDR innskytes og uttrykkes. Eksempler inkluderer pLEX (produsert av Invitrogen), pAX4a+ (produsert av Invitrogen) og lignende. Ekspresjonsvektoren innføres i en passende Escherichia coli slik at peptidet omfattende CDR kan dannes og akkumuleres i inklusjonslegemet eller det periplasmiske rom. Peptidet omfattende CDR kan oppnås fra inklusjonslegemet eller det periplasmiske rom, og det kan renses ved ionebytterkromtografi og gelfiltrering eller lignende { Protein Engineering, 7, 697 (1994)). 3.Evaluering av aktivitet og egenskap til antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse.
(1) Evaluering av bindende aktivitet for antigen
En bindende aktivitet av antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse for et antigen kan måles ved ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), fluorescerende antistof f -teknikk { Cancer Immunol. Immunother., 36., 373 (1993)), overflateplasmon-resonans ved anvendelse av slikt som BIAcore og lignende. Spesifikt produseres et syntetisk peptid omfattende en CCR4 partiell sekvens og et konjugat fremstilles ved å kjemisk forbinde dette til et bærerprotein slik som bovint serumalbumin eller lignende. En CCR4 bindende aktivitet av antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan måles ved immobilisering av konjugatet på en ELISA-plate, å la det reagere med antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, videre å la det reagere med et merket antistoff eller bindende fragment slik som et peroksydase- eller biotin-merket antistoff eller bindende fragment, og deretter å måle et fargestoff ved anvendelse av et absorpsjonsfotometer.
(2) Reaktivitet for CCR4-uttrykkende celler
For å undersøke reaktiviteten for CCR4-uttrykkende celler, er det foretrukket å anvende en metode for effektivt å påvise CCR4 uttrykt på celleoverflaten. Metoden inkluderer flow- cytometri ved anvendelse av fluorescerende antistoff-teknikk og lignende. Når reaktivitet med levende kroppsceller slik som blodplate og lignende undersøkes, er det i tillegg foretrukket å utføre undersøkelsen under betingelser som ligger så nær den levende kroppen som mulig. På grunn av disse år-saker, når reaktivitet av anti-CCR4 antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse undersøkes, er det mest ønskelig å utføre undersøkelsen ved flow-cytometri ved anvendelse av fluorescerende antistoff-teknikk.
Antistoffet anvendt i fluorescerende antistoff-teknikken kan være enten et antistoff merket med et fluorescerende materiale slik som FITC, biotin eller lignende, eller et umerket antistoff. Avhengig av tilstedeværelsen eller fraværet av en merking av det anvendte antistoff og dens type, anvendes fluorescens-merket avidin, et fluorescens-merket anti-humant immunglobulin-antistoff og lignende. Reaktiviteten kan evalueres ved å utføre reaksjonen ved tilsetning av en tilstrekkelig mengde av et anti-CCR4 antistoff (generelt fra 0,1 til 10 ug/ml som den endelige konsentrasjon) til en testet prøve og ved sammenligning av dets reaktivitet med dem for et nega-tivt kontroll-antistoff og en positiv kontroll-antistoff.
(3) Cytotoksisk aktivitet
Den cytotoksiske aktivitet for CCR4-uttrykkende celler kan evalueres ved å måle CDC aktivitet, ADCC aktivitet og lignende ( Cancer Immunol. Immunother. , 36., 373 (1993)). Forandringer i mengden produsert cytokin kan måles ved hjelp av ELISA-metoden, fluorescerende antistoff-teknikk og lignende ved anvendelse av et antistoff for cytokin.
(4) Aktivitet med inhibering av ligandbinding
En aktivitet med inhibering av ligandbinding av anti-CCR4 antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan undersøkes ved å anvende en merking av TARC eller MDC som en ligand som har en bindende aktivitet til CCR4 og en CCR4-ut- trykkende celle eller en cellemembran fraksjon derav. TARC eller MDC kan merkes ved hjelp av en hvilken som helst teknikk som kan påvises, og eksempler inkluderer fluorescens-merking, enzymmerking, strålingsmerking og lignende. Spesifikke eksempler inkluderer metoden ved å måle den bindings-inhiberende aktivitet ved anvendelse av en strålingsmerking beskrevet i WO 00/42074.
En aktivitet med inhibering av ligandbinding av det anti-CCR4 antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan også undersøkes ved å anvende en cellerespons indusert ved binding av et ligand til CCR4 som en pekepinn. Celleresponsen kan
være en hvilken som helst type så lenge som den induseres ved å bringe et ligand i kontakt med en CCR4-uttrykkende celle, og eksempler inkluderer forandringer i intracellulær kalsium-konsentrasjon, cellemigrasjon og lignende. Spesifikke eksempler inkluderer metoden som måler migrasjonsinhibering av en CCR4-uttrykkende celle indusert ved en CCR4 ligand beskrevet i WO 00/42074.
(5)Undersøkelse av gjenkjennelsessekvens
En aminosyresekvens som kan gjenkjennes av antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan bestemmes ved anvendelse av et syntetisk peptid som er designet basert på den primære sekvens av dets korresponderende antigenprotein.
En primær sekvens av det syntetiske peptid designes basert på den primære sekvens av antigenproteinet. For å fremstille et protein hvori det syntetiske peptid er kryssbundet med et
bærerprotein, kan en cysteinrest tilsettes til karboksy-enden eller amino-enden av det syntetiske peptid. Det resulterende protein kan anvendes i ELISA som vil beskrives i det etter-følgende. Om nødvendig, kan N-enden og C-enden av det syntetiske peptid også henholdsvis være acetylert og amidert.
Et peptid kan syntetiseres ved hjelp av en generell væske-fase- eller fastfase-peptid syntetiseringsmetode, en hvilken som helst kombinert metode derav eller en modifisert metode derav ( International Journal of Peptide Protein Research, 35., 161-214 (1990), "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology, vol 289, forfattet av Gregg B. Fields, Academic Press (1997), "Peptide Synthesis Protocols", Methods in Molecular Biology, vol. 35, forfattet av Michael W. Pennington og Ben M. Dunn, Humana Press (1994)).
I tillegg kan det også anvendes en automatisk peptidsyntetiseringsinnretning. Syntese av et peptid ved hjelp av en peptidsyntetiseringsinnretning kan utføres ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig peptidsyntetiseringsinnretning slik som peptidsyntetiseringsinnretningen produsert av Shimadzu Corp., peptidsyntetiseringsinnretningen produsert av Advanced ChemTech Inc, USA (i det etterfølgende referert til som "ACT") eller lignende, ved anvendelse av f^-Fmoc-aminosyrer, N<01->Boe-aminosyrer eller lignende hvis sidekjeder er passende beskyttet og i overensstemmelse med respektive synteseprogrammer. De beskyttede aminosyrer anvendt som materialet og bærerharpikser kan anskaffes fra ABI Inc., Shimadzu Corp., Kokusan Kagaku K.K.. NovaBiochem, Watanabe Kagaku K.K., ACT, AnaSpec Inc., Peptide Research Institute og lignende.
Som metoden for bestemmelse av en aminosyresekvens som er gjenkjennelig ved hjelp av antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av det syntetiske peptid, kan det anvendes en hvilken som helst teknikk så lenge som den er en metode som kan påvise binding av det syntetiske peptid til antistoffet. Aminosyresekvensen som er
gjenkjennelig ved antistoffet kan f.eks. bestemmes ved å merke det syntetiske peptid med et fluorescerende materiale, et radioaktivt materiale eller lignende og å undersøke bindingsaktiviteten av det resulterende merkede peptid til antistoffet. Den kan også utføres ved kryssbinding av det syntetiske peptid med et protein slik som bovint serumalbumin (BSA) eller lignende og evaluering av reaktiviteten av det
resulterende protein med antistoffet ved hjelp av ELISA eller lignende. I tillegg kan en aminosyresekvens som er gjenkjennelig ved antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse også bestemmes ved å anvende en substans som det allerede er bekreftet at antistoffet binder til, slik som et antistoffprotein, og å undersøke et syntetisk peptid som inhiberer binding av antistoffet til substansen.
(4)Metode for påvisning og kvantifisering av CCR4 ved anvendelse av anti-CCR-antistoff
Den foreliggende oppfinnelse tilhører en metode for immunologisk påvisning og bestemmelse av CCR4 eller en celle som uttrykker CCR4 på overflaten derav ved anvendelse av antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse.
Metodene for immunologisk påvisning og bestemmelse av CCR4 eller en celle som uttrykker CCR4 på overflaten derav ved anvendelse av antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse inkluderer en immunfluorescerende metode, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), en radioaktivt materiale-merket immunanalyse (RIA), en immunhitsokjemisk fargemetode slik som en immunocytt-fargemetode, en immunvev-fargemetode eller lignende (ABC metode, CSA metode etc.), den ovennevnte enzym immunanalyse, en sandwich ELISA ( Monoclonal Antibody Experiment Manual (publisert av Kodansha Scientific, 1987), Second Series Biochemical Experiment Course, Vol. 5, Immunobiochemistry Research Method, publisert av Tokyo Kagaku Dojin (1986)).
Den immunfluorescerende metoden omfatter å reagere en separert celle, vev eller lignende med antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, å reagerer reaktanten med et anti-immunglobulin antistoff eller bindingsfragment merket med en fluorescens substans slik som fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller lignende, og deretter å måle fluorescenssub-stansen med et flow-cytometer.
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) omfatter å reagere en separert celle elle cellelysat derav, vev eller vevs-lysatet derav, cellekultur-supernatant, serum, preuralvæske, ascitesvæske, okulærvæske eller lignende med antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, å reagere reaktanten med et anti-immunglobulin antistoff eller bindingsfragment merket med et enzym slik som peroksydase, biotin eller lignende, og deretter å måle den resulterende utviklede farge med et absorpsjonsfotometer.
Den radioaktivt material-merkede immunanalyse (RIA) omfatter å reagere en separert celle eller cellelysat, vev eller vevslysat, cellekultur-supernatant, serum, preuralvæske, ascitesvæske, okulærvæske eller lignende med antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse videre å reagere reaktanten med anti-immunoglobulin antistoff eller bindingsfragment merket med radioisotop, og deretter å måle radioaktiviteten med en scintillasjonsteller eller lignende.
Immunocytt- fargemetoden og immunvev-fargemetoden omfatter å reagere en separert celle, vev eller lignende med antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, å reagere reaktanten med et anti-immunglobulin antistoff eller bindingsfragment merket med en fluorescenssubstans slik som fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller lignende, eller et enzym slik som peroksydase, biotin eller lignende, og deretter å obser-vere cellen, vevet eller lignende med et mikroskop.
Sandwich-ELISA er en metode som omfatter å adsorbere, på en plate, ett av to antistoffer som har en forskjellig epitop blant antistoffene i henhold til den foreliggende oppfinnelse; å merke et annet antistoff med en fluorescenssubstans slik som FITC eller lignende, eller et enzym slik som peroksydase, biotin eller lignende; og reagere en separert celle eller cellelysat, vev eller vevslysat, cellekultur-supernatant, serum, preuralvæske, ascitesvæske, okulærvæske eller lignende med den antistoff-adsorberende plate; og der etter å reagere dette med det merkede antistoff for å utføre en reaksjon i samsvar med den merkede substans.
(5)Metode for anvendelse av humant CDR-podet antistoff eller antistoffragment derav
Siden antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse spesifikt binder til CCR4 som er uttrykt på en dyrket cellelinje og utviser cytotoksisk aktivitet slik som CDC aktivitet, ADCC aktivitet og lignende, vil det være anvendelig ved diagnostisering og behandling av sykdommer som relaterer til CCR4 slik som Th2-medierte sykdommer og lignende. Siden forholdet av aminosyresekvenser avledet fra humant antistoff er høyere enn det i antistoffer av et ikke-humant dyr, er det også forventet at det utviser sterk cytotoksisk aktivitet i menneskekroppen, det ikke utviser immunogenisitet, og dets effekter fortsetter i lang tid.
I tillegg kan produksjonen av Th2 cytokiner som produseres av celler slik som IL-4, IL-5, IL-13 og lignende, inhiberes ved å administrere antistoffet i henhold til foreliggende oppfinnelse til celler eller vev til et forsøksindivid.
Som cellen som uttrykker CCR4 som relaterer til den foreliggende oppfinnelse, eksemplifiseres Th2-celle og lignende. Th2-cellen anvendt i den foreliggende oppfinnelse er foretrukket aktivert Th2-celle eller hukommelses-Th2-celle. Eksempler inkluderer celler som har CD45RA- eller CD45R0+ og CD4+ egenskaper.
De cytotoksiske aktiviteter til antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse frembringes f.eks. når antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse binder til CCR4-ut-trykkende celler slik som en Th2-celle for derved å indusere apoptose i cellen. Cellen kan også obstrueres og utarmes ved indusering av apoptose.
Metoden for diagnostisering av Th2-medierte immunsykdommer eller cancertyper inkluderer også en metode hvori en human CCR4 positiv celle som eksisterer i celler eller vev til et forsøksindivid påvises immunologisk som beskrevet ovenfor.
Antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan videre anvendes som et diagnostisk middel for CCR4-relaterte sykdommer slik som Th2-medierte immunsykdommer eller cancertyper, eller sykdommer hvori de morbide tilstander skrider frem på grunn av abnorm økning eller reduksjon av Th2-celler.
Siden antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan redusere eller utarme CCR4-uttrykkende celler ved dets cytotoksiske aktivitet, kan det videre tilveiebringe en diagnostisk metode eller terapeutisk metode for CCR4-relaterte sykdommer slik som Th2-medierte immunsykdommer eller cancertyper, som anvender antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, og terapeutiske og forebyggende midler for CCR4-relaterte sykdommer slik som Th2-medierte immunsykdommer eller cancertyper som omfatter antistoffet i henhold den foreliggende oppfinnelse som en aktiv bestanddel.
De Th2-medierte immunsykdommer inkluderer, uten hensyn til om de er milde eller alvorlige, inflammatoriske sykdommer slik som akutt eller kronisk luftveis-hypersensitivitet eller bronkialastma, atopiske hudsykdommer inkluderende atopisk dermatitt, allergisk rhinitt, pollinosis og lignende; sykdommer forårsaket av inflammasjonskompetente celler slik som eosinofil, mastcelle og lignende som kan propageres eller aktiveres ved cytokin og kjemokin frigjort fra Th2-celler, biologisk funksjonelle molekyler slik som IgE og lignende som produseres ved cytokin og kjemokin frigjort fra Th2-celler, og lignende; og immunsykdommer hvori de morbide tilstander skrider frem på grunn av abnorme forandringer i Th2-celler.
Antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan administreres alene, men det er generelt foretrukket å tilveiebringe det i form av en farmasøytisk formulering produ sert ved å blande det med minst en farmasøytisk akseptabel bærer i samsvar med en metode som er velkjent på det tekniske området farmasøytika.
Det er foretrukket å velge en administreringsrute som er den mest effektive med hensyn til å utføre den tiltenkte behandling slik som oral administrering eller parenteral administrering, f.eks. intraoral administrering, trakeal administrering, rektal administrering, subkutan injeksjon, intra-muskulær injeksjon, intravenøs injeksjon og lignende. Intra-venøs injeksjon er foretrukket ved en antistoff- eller pep-tidformulering.
Doseringsformen inkluderer sprayer, kapsler, tabletter, granuler, siruper, emulsjoner, stikkpiller, injeksjoner, salver, plastere og lignende.
Formuleringer som er egnet for oral administrering inkluderer emulsjoner, siruper, kapsler, tabletter, pulvere, granuler og lignende.
Flytende fremstillinger slik som emulsjoner og siruper kan fremstilles ved å anvende additiver slik som vann; sakka-rider, f.eks. sukrose, sorbitol, fruktose; glykoler, f.eks. polyetylenglykol, propylenglykol; oljer, f.eks. sesamolje, olivenolje, soyaolje; antiseptika, f.eks. p-hydroksybenzoat; og smaksstoffer, f.eks. jordbærsmak, peppermynte.
Kapsler, tabletter, pulvere, granuler og lignende kan fremstilles ved anvendelse av additiver slik som fyllstoffer, f.eks. laktose, glukose, sukrose, mannitol; desintegrasjons-midler, f.eks. stivelse, natriumalginat; smøremidler, f.eks. magnesiumstearat, talkum; bindemidler, f.eks. polyvinyl-alkohol, hydroksypropylcellulose, gelatin; surfaktanter, f.eks. fettsyreestere; og plastifiseringsmidler, f.eks. glyserin.
Formuleringer som er egnet for parenteral administrering inkluderer injeksjoner, stikkpiller, sprayer og lignende.
Injeksjoner kan fremstilles ved anvendelse av en bærer slik som en saltoppløsning, glukoseoppløsning eller en blanding derav, eller lignende.
Stikkpiller kan fremstilles ved anvendelse av en bærer slik som kakaosmør, hydrogenert fett, en karboksylsyre eller lignende.
Videre kan sprayer fremstilles fra selve antistoffet eller ved anvendelse av en bærer eller lignende som ikke stimulerer slimhinnene i munnen og luftveiene hos pasienter og kan lette absorpsjon av antistoffet eller antistoffragmentet derav ved å dispergere det som svært små partikler.
Bæreren inkluderer laktose, glyserin og lignende. Avhengig av egenskapene til antistoffet eller peptidet og bæreren som skal anvendes, kan det produseres aerosoler, tørre pulvere og lignende. Additivene eksemplifisert i de orale fremstilling-ene kan også tilsettes til de parenterale fremstillinger.
Dosen og hyppigheten ved administrering varierer avhengig av den tiltenkte terapeutiske effekt, administeringsmetode, be-handlingsperiode, alder, kroppsvekt og lignende, men dosen er generelt fra 0,01 mg/kg til 20 mg/kg pr. døgn pr. voksen.
Den foreliggende oppfinnelse beskrives i det etterfølgende basert på eksempler, men den foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til disse.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKM2160GalO. Figur 2 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKM2160Gall. Symbolet<*>viser posisjonen av genetisk muta-sjonskodon som modifiserer en aminosyrerest. Figur 3 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKM2160Gal3. Symbolet<*>viser posisjonen for genetisk muta-sjonskodon som modifiserer en aminosyrerest. Figur 4 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKM2160LV0. Figur 5 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKM2160LVl. Symbolet<*>viser posisjonen for genetisk muta-sjonskodon som modifiserer en aminosyrerest. Figur 6 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKANTEX216 0LV0 og plasmid pKANTEX216 0Gal0LV0. Figur 7 viser reaktivitet av en kultursupernatant oppnådd ved transient uttrykking av en ekspresjonsvektor av hvert anti-CCR4 CDR-podet antistoff i COS-7 celle, med et CCR4 partielt peptid i samsvar med ELISA. Figur 8 viser reaktivitet av en kultursupernatant oppnådd ved transient uttrykking av en ekspresjonsvektor av hvert anti-CCR4 CDR-podet antistoff fremstilt ved anvendelse av andre FR-er i COS-7 celle, med CCR4 partielt peptid i samsvar med
ELISA.
Figur 9 viser reaktivitet av et renset anti-CCR4 CDR-podet antistoff med et CCR4 partielt peptid. Figur 10 viser reaktivitet av et renset anti-CCR4 CDR-podet antistoff med en CCR4 høy-ekspresjonscelle (CCR4/EL-4). Fig 11 viser affinitet av et renset anti-CCR4 CDR-podet antistoff med et CCR4 partielt peptid målt ved anvendelse av en overflateplasmon-resonansføler. Figur 12 viser cytotoksisitet i samsvar med ADCC aktivitet mot CCR4/EL-4 celle. Figur 13 viser effekt på inhibering av produksjon av IL-4, IL-13 og IFN-Y fra humant PBMC. Figur 14 viser bindingsaktivitet av hvert antistoff til en human blodplate. Figur 15 viser trinn for konstruksjon av plasmider pKM2160VH41 og pKM2160VL61. Figur 16 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKANTEX216 0H. Figur 17 viser trinn for konstruksjon av et plasmid pKANTEX216 0.
Beste måte for utførelse av oppfinnelsen
Eksempel 1
Produksjon av humant CDR-podet antistoff for CCR4:
1. Designing av cDNA som koder for VH og VL av humant CDR-podet antistoff for CCR4 (1)Designing av aminosyresekvens av VH av humant CDR-podet antistoff for CCR4 Først ble en aminosyresekvens av VH av et humant CDR-podet antistoff for CCR4 (anti-CCR4 CDR-podet antistoff) designet som følger. En aminosyresekvens av FR av VH av et humant antistoff ble valgt for poding av aminosyresekvenser av CDR1, 2 og 3 av VH representert ved SEQ ID N0:1, 2 og 3 ved anvendelse av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 ( Int. Immunol., 11, 81 (199)) etablert i referanseeksempel 1. Humane antistoffer som har høy homologi med KM216 0 ble hentet fra aminosyresekvens -databaser for eksisterende proteiner ved BLASTP-metoden ( Nucleic Acid Res. , 2_5, 3389 (1997) ) ved anvendelse av GCG Package (produsert av Genetics Computer Group) som et sekvensanalyseringssystem. Når homologien av den aktuelle aminosyresekvens ble sammenlignet med homologi-bedømmelsene, var SWISSPROT database-aksesjonsnummer P01781, lg Heavy chain V-III region Gal ( Hoppe. Seylers. Z. Physiol. Chem., 354, 1505-1509 (1973); i det etterfølgende referert til som "Gal") et humant antistoff som utviser den høyeste homologi på 82,5%, slik at FR aminosyresekvensen av antistoffet ble valgt. Posisjoner hvor aminosyrerestene ikke kan bestemmes unikt (posisjoner 28 og 30 fra N-enden av et sekretorisk antistoff) og en aminosyrerest som har lav frembringelses-frekvens i sekvenser av humane antistoffer (Thr som den endelige rest av V region) ble imidlertid funnet i FR aminosyresekvensen av Gal på databasen. Ile og Ser som rester funnet i muse-KM2160 ble følgelig valgt som posisjoner 28 og 30, og Thr som den endelige rest av V region ble erstattet med Ser. Siden aminosyrerestene finnes i høy forekomst i sekvenser av hvilke som helst humane antistoffer ( Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991), avviker de ikke fra humane antistoffsekvenser.
VH aminosyresekvensen GalO av anti-CCR4 CDR-podet antistoff representert ved SEQ ID NO:4 ble designet ved å pode aminosyresekvenser av CDR1, 2 og 3 av VH av anti-CCR4 muse-antistof fet KM216 0 representert ved henholdsvis SEQ ID N0:1, 2 og 3, til passende posisjoner i den bestemte human antistoff FR aminosyresekvens. En nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen av SEQ ID NO:4 er representert ved SEQ ID NO: 49.
En aminosyresekvens av VH av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff ble også designet basert på de felles sekvenser som er klassifisert av Kabat et al.
Kabat et al. har klassifisert VH av forskjellige allerede kjente humane antistoffer i tre undergrupper (HSG I til III) basert på homologien av deres aminosyresekvenser og rapportert felles sekvenser i hver undergruppe (Seguences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). Der er en mulighet at immunogenisitet av de felles sekvenser vil reduseres hos mennesker. For å fremstille et anti-CCR4 CDR-podet antistoff som har høy aktivitet, blant FR aminosyresekvenser av de felles sekvenser av tre undergrupper av det humane antistoff VH, ble følgelig en FR aminosyresekvens som har den høyeste homologi med FR aminosyresekvensen av VH av KM2160 valgt i designingen. Tabell 1 viser et resultat av gjenopprettingen av homologi mellom FR aminosyresekvensene av de felles sekvenser av hver undergruppe av det humane antistoff VH og FR aminosyresekvensen av VH av KM2160. Som vist i tabell 1, utviste FR aminosyresekvensen av VH regionen av KM216 0 den høyeste homologi med undergruppen III.
Basert på de ovennevnte resultater, ble VH aminosyresekvensen
HVO av anti-CCR4 CDR-podet antistoff representert ved SEQ ID NO:38 designet ved poding av aminosyresekvens av CDR av VH av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 til en passende posisjon av aminosyresekvensen av FR av den felles sekvensen av undergruppe III av det humane antistoff VH. En nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen av SEQ ID NO:38 er representert ved SEQ ID NO:57.
(2)Designing av aminosyresekvens av VL av humant CDR-podet antistoff for CCR4
Deretter ble en aminosyresekvens av VL av et anti-CCR4 CDR-podet antistoff designet som følger. En aminosyresekvens av FR av VL av et humant antistoff ble valgt for poding av aminosyresekvenser av CDR1, 2 og 3 av VL av anti-CCR4 muse-antistof f KM2160 representert ved henholdsvis SEQ ID NO:5, 6 og 7. Kabat et al. har klassifisert VL av forskjellige allerede kjente humane antistoffer i fire undergrupper (HSG I til IV) basert på homologien av deres aminosyresekvenser og rapportert felles sekvenser i hver undergruppe (Seguences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). Blant FR aminosyresekvenser av de felles sekvensene av fire undergrupper av det humane antistoff VL, ble følgelig en FR aminosyresekvens som har den høyeste homologi med FR aminosyresekvensen av VL av KM2160 valgt. Tabell 2 viser et resultat av gjenopprettelsen av homologi mellom FR aminosyresekvensene av den felles sekvensen av hver undergruppe av det humane antistoff VL og FR aminosyresekvensen av VL av KM2160. Som vist i tabell 2, utviste FR aminosyresekvensen av VL av KM2160 den høyeste homologi med undergruppen
II.
Basert på de ovennevnte resultater, ble VL aminosyresekvensen
LVO av anti-CCR4 CDR-podet antistoff representert ved SEQ ID NO:8 designet ved poding av aminosyresekvensene av CDR1, 2 og 3 av VL av anti-CCR4 muse-antistoff KM2160 representert ved henholdsvis SEQ ID NO:5, 6 og 7, til passende posisjoner i aminosyresekvensen av FR av den felles sekvensen av undergruppe II av det humane antistoffet VL. En nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen av SEQ ID NO:8 er representert ved SEQ ID NO:53.
(3)Modifisering av VH og VL av humant CDR-podet antistoff for CCR4
VH aminosyresekvensene GalO og HVO, og VL aminosyresekvensen LVO av anti-CCR4 CDR-podet antistoff designet i det ovennevnte er antistoffer hvori CDR aminosyresekvensen av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 alene er podet til de valgte FR aminosyresekvenser av humant antistoff. Når poding med kun CDR aminosyresekvens av et muse-antistoff utføres, blir imidlertid aktiviteten av et humant CDR-podet antistoff ofte redusert slik at, for å unngå reduksjonen, visse aminosyrerester blant FR aminosyrerestene som er forskjellige mellom et humant antistoff og et muse-antistoff, som anses å ha innvirkninger på aktiviteten, generelt podes sammen med CDR aminosyresekvensen. Følgelig ble det i dette eksempelet ut-ført en undersøkelse for å identifisere FR aminosyrerestene som anses å ha innvirkninger på aktiviteten.
Først ble tredimensjonale strukturer av antistoff V regioner (GalOLVO og HVOLVO) omfattende aminosyresekvenser GalO og HVO av VH og aminosyresekvens LVO av VL i det anti-CCR4 CDR-podede antistoff designet i det ovennevnte konstruert ved anvendelse av en datamaskin-modelleringsteknikk. Koordinatene for den tredimensjonale struktur ble frembrakt ved anvendelse av en AbM programvare (produsert av Oxford Molecular), og fremvisning av de tredimensjonale strukturer ved anvendelse av en Pro-Explore programvare (produsert av Oxford Molecular) eller RasMol (produsert av Glaxo) i samsvar med de respektive vedlagte instruksjoner fra produsenten. Videre ble data-maskinmodeller av de tredimensjonale strukturer av V regioner av anti-CCR4 muse-antistoff KM2160 konstruert på den samme måten. I tillegg ble modeller av tredimensjonale strukturer omfattende modifiserte aminosyresekvenser konstruert på den samme måten, hvori visse rester av FR aminosyresekvensene av VH og VL av GalOLVO eller HVOLVO, som er forskjellige fra det anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160, ble erstattet med andre rester funnet i korresponderende posisjoner i det anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160, og de tredimensjonale strukturene av V regioner av det anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160, GalOLVO eller HVOLVO og de modifiserte produkt ble sammenlignet.
Som et resultat ble den tredimensjonale strukturen av den antigenbindende region endret slik at Ala i posisjon 40, Gly i posisjon 42, Lys i posisjon 43, Gly i posisjon 44 og Lys i posisjon 76 og Ala i posisjon 97 i GalO, Thr i posisjon 28 og Ala i posisjon 97 for HVO og Ile i posisjon 2, Val i posisjon 3, Gin i posisjon 50 og Val i posisjon 88 i LVO ble valgt som rester ansett til å ha innvirkning på aktiviteten av antistoff blant FR aminosyrerestene av GalOLVO eller HVOLVO. Blant disse valgte aminosyrerester, er minst en aminosyre modifisert til en eller flere aminosyrerester funnet i muse-antistoffet KM2160 slik at VH og VL av det humane CDR-podede antistoff som har forskjellige modifikasjoner ble designet.
Først, hva angår VH, ble det designet f.eks. Gall representert ved SEQ ID NO:9 hvori Ala i posisjon 97 av GalO var modifisert, Gal2 representert ved SEQ ID NO:10 hvori Gly i posisjon 42 og Gly i posisjon 44 av GalO var modifisert, Gal3 representert ved SEQ ID NO:11 hvori Ala i posisjon 97, Gly i posisjon 42 og Gly i posisjon 44 av GalO var modifisert, HVI representert ved SEQ ID NO:39 hvori Thr i posisjon 28 av HVO var modifisert, HV2 representert ved SEQ ID NO:40 hvori Ala i posisjon 97 av HVO var modifisert, og HV3 representert ved SEQ ID NO:41 hvori Thr i posisjon 28 og Ala i posisjon 97 av HVO var modifisert. Videre, hva angår VL, ble det designet f.eks. LV1 representert ved SEQ ID NO:12 hvori Ile i posisjon 2 var modifisert, LV2 representert ved SEQ ID NO:13 hvori Val i posisjon 3 var modifisert, og LV3 representert ved SEQ ID NO:14 hvori Ile i posisjon 2 og Val i posisjon 3 var modifisert. Nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvensene representert ved SEQ ID NO:9 til 11, 39 til 41 og 12 til 14 er representert ved henholdsvis SEQ ID NO:50 til 52, 58 til 60 og 54 til 56. 2.Konstruksjon av cDNA som koder for anti-CCR4 CDR-podet antistoff. (1)konstruksjon av cDNA som koder for VH av anti-CCR4 CDR- podet antistoff
cDNA som koder for aminosyresekvensen GalO av VH av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff designet i 1(1) i eksempel 1 ble konstruert ved anvendelse av PCR som følger.
Først, en komplett antistoff-aminosyresekvens ved ligering av den designede aminosyresekvens med den H kjede sekretoriske signalsekvens av anti-CCR4 muse-antistoff KM2160 representert ved SEQ ID NO:15. Deretter ble aminosyresekvensen omdannet til genetiske kodoner. Når to eller flere genetiske kodoner er tilstede for en aminosyrerest, ble et korresponderende genetisk kodon bestemt ved å ta i betraktning bruken av kodon funnet i nukleotidsekvenser av antistoffgener (Seguences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). En nukleotidsekvens av cDNA som koder for aminosyresekvensen av komplett antistoff V region ble designet ved ligering av de bestemte genetiske kodoner, og bindende nukleotidsekvenser av primere for PCR amplifikasjon (inkluderende restriksjonsenzym-gjenkjennelsessekvenser for kloning inn i en vektor for ekspresjon av humanisert antistoff) ble tilsatt til dens 5'-ende og 3'-ende. Den designede nukleotidsekvens ble inndelt i totalt 6 nukleotidsekvenser som hver har omtrent 100 nukleotider idet det telles fra 5'-enden (tilgrensende nukleotidsekvenser er designet slik at de har en komplementær sekvens av omtrent 2 0 nukleotider på deres ende), og 6 syntetiske oligonukleotider av SEQ ID NO:16, 17, 18, 19, 20 og 21 ble syntetisert i reciproke rekkefølger av en sense kjede og en antisense kjede (produsert av GENSET).
PCR ble utført ved å tilsette hvert oligonukleotid til en reaksjonsoppløsning inneholdende 0,2 mM dNTP-er og 1 mM magnesiumklorid til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,1 uM, og å innstille sluttvolumet til 50 yl ved anvendelse av 0,4 uM M13 primer RV (produsert av Takara Shuzo), 0,4 uM M13 primer M3 (produsert av GENSET) og 2,5 enheter KOD polymerase (produsert av T0Y0B0). Reaksjonen ble utført ved 3 0 cykluser, idet hver cyklus består av 94°C i 3 0 sekunder, 55°C i 3 0 sekunder og 74°C i 6 0 sekunder, og deretter 1 cyklus ved 74°C i 10 minutter. Reaksjonsoppløsningen ble renset ved anvendelse av et QIA hurtig PCR rense-kit (produsert av QIAGEN) og til sist oppløst i sterilt vann. Reaksjonsoppløsningen fikk reagere ved 37°C i 1 time ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym Apal (produsert av Takara Shuzo) og 10 enheter av et restriksjonsenzym Noti (produsert av Takara Shuzo). Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Apal-Noti fragment på omtrent 0,47 kb ble utvunnet.
Deretter fikk 3 ug plasmid pBluescript II SK(-) (produsert av Stratagene) reagere med fragmentet ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym Apal (produsert av Takara Shuzo) og 10 enheter av et restriksjonsenzym Noti (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time. Den nevnte reaksjons- oppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Apal- Notl fragment på omtrent 2,95 kb ble utvunnet.
Det resulterende Apal-Noti fragment av PCR produktet av VH av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff og Apal-Notl fragmentet av plasmid pBluescript II SK(-) ble så ligert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i samsvar med produsentens instruksjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA oppløsningen oppnådd på denne måten, hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og nukleotidsekvensene ble analysert ved anvendelse av Big Dye Terminator Kit ver. 2 (produsert av Applied Biosystems). Som et resultat av nukleotidsekvensanalysen, ble det oppnådd et plasmid pKM2160GalO vist i fig. 1 som har mål-nukleotidsekvensen. Escherichia coli transformert med pKM2160GalO, Escherichia coli DH5a/pKM2160GalO, er blitt deponert 22. august 2001 som FERM BP-7709 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
Deretter ble FR aminosyrerestene designet i 1(3) i eksempel 1 modifisert som følger. De genetiske kodoner for aminosyrerester etter modifiseringen ble modifisert til å ha genetiske kodoner funnet i muse-antistoffet KM2160.
I modifisering av Ala i posisjon 97 til Gly, ble PCR utført ved anvendelse av 25 ng av plasmidet pKM2160GalO fremstilt i dette punkt som templatet, først ved oppvarming ved 94°C i 2 minutter og deretter utføring av 35 cykluser av reaksjonen, idet hver cyklus består av 94°C i 15 sekunder, 55° i 3 0 sekunder og 6 8°C i 4 0 sekunder, i 50 yl av et reaksjonssystem fremstilt ved å tilsette hvert av de syntetiske DNA-er for genoverføring omfattende nukleotidsekvensene representert ved SEQ ID 22 og 23 (produsert av GENSET) som primere til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,4 yM og ved anvendelse av 2,5 enheter KOD pluss polymerase (produsert av TOYOBO) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Reaksjonsoppløsningen ble renset ved anvendelse av et QIA hurtig PCR rense-kit (produsert av QIAGEN) og til slutt oppløst i sterilt vann. Det totale volum fikk reagere i 1 time ved 3 7°C ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym Pstl (produsert av Takara Shuzo) og fikk deretter reagere i 1 time ved 3 7°C ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym Dralll (produsert av New England Biolabs). Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Pstl-Dralll fragment på omtrent 0,58 kb ble utvunnet.
Deretter fikk 3 ug av plasmidet pKM2160GalO reagere ved 37°C
i 1 time ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym Pstl (produsert av Takara Shuzo) og deretter undergå reaksjonen ved 37°C i 1 time ved anvendelse av 10 enheter av et
restriksjonsenzym Dralll (produsert av New England Biolabs).
Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Pstl-Dralll fragment på omtrent 2,7 kb ble utvunnet.
Det således oppnådde Pstl-Dralll fragment avledet fra PCR produktet og Pstl-Dralll fragmentet avledet fra plasmidet pKM216 0GalO ble så ligert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA oppløsningen oppnådd på denne måten, hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og nukleotidsekvensene ble analysert ved anvendelse av Big Dye Terminator Kit Ver. 2 (produsert av Applied Biosystems). Som et resultat av nukleotidsekvensanalysen, ble det oppnådd et plasmid pKM2160Gall vist i fig. 2 som har den mål-nukleotidsekvensen. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160Gall, Escherichia coli DH5a/pKM2160Gall, er blitt deponert 22. august 2001 som FERM BP-7710 i International
Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
I modifikasjoner av Gly i posisjon 42 til Asp og Gly i posisjon 44 til Arg, ble det oppnådd et plasmid pKM2160Gal2 ved å utføre metoden stort sett lik den ovennevnte, med unntak av at det syntetiske DNAs for genoverføring omfattende nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:24 (produsert av GENSET) og M13 primer RV (produsert av Takara Shuzo) ble anvendt som PCR primere. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160Gal2, Escherichia coli DH5a/pKM216 0Gal2, er blitt deponert 22. august 2001 som FERM BP-7711 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
Modifisering av alle de ovennevnte tre rester ble videre konstruert som følger. Omtrent 0,5 ug av hver av pKM2160Gall og pKM2160Gal2 oppnådd i det ovennevnte fikk reagere ved 37°C i 1 time ved anvendelse av 10 enheter av Nhel (produsert av Takara Shuzo) og fikk deretter reagere ved 3 7°C i 1 time ved anvendelse av Seal (produert av Takara Shuzo). Reaksjonsopp-løsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Miel-Scal fragment på omtrent 1,3 kb avledet fra pKM2160Gall og et fragment på omtrent 2,0 kb avledet fra pKM2160Gal2 ble utvunnet. De resulterende to fragmenter ble ligert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA oppløsningen oppnådd på denne måten, hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og nukleotidsekvenser ble analysert ved anvendelse av Big Dye Terminator Kit ver. 2 (produsert av Applied Biosystems). Som et resultat av nukleotidsekvensanalysen, ble det oppnådd et plasmid pKM2160Gal3 vist i fig. 3 som har mål-nukleotidsekvensen. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160Gal3, Escherichia coli DH5a/pKM216 0Gal3, er blitt deponert 22. august 2001 som FERM BP-7712 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
Deretter ble et cDNA som koder for aminosyresekvensen HVO av VH av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff designet i 1(1) i eksempel 1 konstruert ved anvendelse av PCR som følger.
Først, en komplett antistoff-aminosyresekvens ved ligering av den designede aminosyresekvens med den H kjede sekretoriske signalsekvens av anti-CCR4 muse-antistoff KM2160 representert ved SEQ ID NO:15. Deretter ble aminosyresekvensen omdannet til genetiske kodoner. Når to eller flere genetiske kodoner er tilstede fore en aminosyrerest, ble et korresponderende genetisk kodon bestemt ved å ta i betraktning bruken av kodon funnet i nukleotidsekvenser av antistoffgener (Seguences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). De bestemte genetiske kodoner ble ligert slik at en nukleotidsekvens av cDNA som koder for aminosyresekvensen av komplett antistoff V region ble designet, og å tilsette nukleotidsekvenser av primere for PCR amplifikasjon (inkluderende restriksjonsenzym-gjenkjennelsessekvenser for kloning inn i en vektor for anvendelse for ekspresjon av humanisert antistoff) ble addert til dens 5<1->ende og 3'-ende.
Den designede nukleotidsekvens ble inndelt i totalt 6 nukleotidsekvenser som hver har omtrent 100 nukleotider idet det telles fra 5'-enden (tilgrensende nukleotidsekvenser er designet slik at de har en dupliseringssekvens av omtrent 20 nukleotider på deres ender) og 6 syntetiske oligonukleotider av SEQ ID NO:16, 42, 43, 44, 45 og 21 ble syntetisert i reciproke rekkefølger av en sense kjede og en antisense kjede (produsert av GENSET), og deretter ble pKM2160HV0 oppnådd ved hjelp av en lignende metode som for pKM2160GalO beskrevet i dette punkt. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160HV0, Escherichia coli DH5a/pKM216 0HV0, er blitt deponert 27. august 2001 som FERM BP-7718 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
I modifikasjon av Thr i posisjon 28 til Ile, ble pKM2160HVl som har mål-nukletidsekvensen oppnådd ved å utføre reaksjonen som ligner på konstruksjonen av det ovennevnte plasmid pKM216 0HV0, ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:69 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:42, og ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukletoidsekvensen representert ved SEQ ID NO:46 i stedet for oligonukleotidet som har nukletidsekvensen representert ved SEQ ID NO:43. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160HVl, Escherichia coli DH5a/pKM216 0HVl, er blitt deponert 27. august 2001 som FERM BP-7719 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukua-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
I modifikasjon av Thr i posisjon 28 til Ile og Ala i posisjon 97 til Gly, ble pKM2160HV3 som har mål-nukleotidsekvensen oppnådd ved reaksjonen som ligner på konstruksjonen av det ovennevnte plasmid pKM2160HV0, ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:69 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:42, ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukletidsekvensen representert ved SEQ ID NO:46 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:43 og ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:47 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:45. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160HV3, Escherichia coli DH5a/pKM216 0HV3, er blitt deponert 27. august 2001 som FERM BP-7721 i international Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
I modifikasjon av Ala i posisjon 97 til Gly, ble plasmidet konstruert som følger. Omtrent 0,5 ug av hvert av de oppnådde pKM2160HV0 og pKM2160HV3 fikk reagere ved 37°C i 1 time ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym Nhel (produsert av Takara Shuzo) og fikk deretter reagere ved 37°C i 1 time ved anvendelse av Seal (produsert av Takara Shuzo).
Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Miel-Scal fragment på omtrent 1,3 kb avledet fra pKM2160HV3 og et fragment fra omtrent 2,0 kb avledet pKM2160HV0 ble utvunnet. De resulterende to fragmenter ble ligert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA oppløsningen oppnådd på denne måten, hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og nukleotidsekvenser ble analysert ved anvendelse av Big Dye Terminator Kit ver. 2 (produsert av Applied Biosystems). Som et resultat av en nukleotidsekvensanalysen, ble det oppnådd et plasmid pKM2160HV2 som har mål-nukleotidsekvensen. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160HV2, Escherichia coli DH5a/pKM216 0HV2, er blitt deponert 27. august 2001 som FERM BP-7720 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
(2)Konstruksjon av cDNA som koder for VL av anti-CCR4 CDR-podet antistoff
Et cDNA som koder for aminosyresekvensen LVO av VL av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff designet i 1(2) i eksempel 1 ble konstruert ved anvendelse av PCR på lignende måte som tilfellet med VH som følger. I dette tilfellet ble L kjede sekvensen av anti-CCR4 muse-antistoff KM2160 som har amino syresekvensen representert ved SEQ ID NO:25 anvendt som den sekretoriske signalsekvens.
Først ble 6 syntetiske oligonukleotider som har nukleotidsekvensene beskrevet i SEQ IDNO:26, 27, 28, 29, 30 og 31 syntetisert (produsert av GENSET). PCR ble utført ved å tilsette hvert oligonukleotid til 50 yl av en reaksjons-oppløsning til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,1 yM, og ved anvendelse av 0,4 yM av M13 primer RV (produsert av Takara Shuzo) og 0,4 yM av M13 primer M4 (produsert av Takara Shuzo) eller M13 primer M3 (produsert av GENSET) representert ved SEQ ID NO:32 og 2,5 enheter av KOD polymerase (produsert av TOYOBO). Reaksjonen ble utført ved 3 0 cykluser, idet hver cyklus består av 94°C i 3 0 sekunder, 55°C i 3 0 sekunder og 74°C i 6 0 sekunder, og deretter 1 cyklus ved 72°C i 10 minutter. Reaksjonsoppløsningen ble renset ved anvendelse av et QIA hurtig PCR rense-kit (produsert av QIAGEN) og til sist oppløst i sterilt vann. Reaksjonsoppløsningen fikk reagere ved anvendelse av 10 enheter av et restriksjonsenzym ScoRI (produsert av Takara Shuzo) og 10 enheter av et restriksjonsenzym Xhol (produsert av Takara Shuzo) ved 3 7°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et EcoRI-Xhol fragment på omtrent 0,44 kb ble utvunnet.
Deretter fikk 3 yg av plasmidet pBluescript II SK(-) (produsert av Stratagene) reagere ved anvendelse av 15 enheter av et restriksjonsenzym EcoRI (produsert av Takara Shuzo) og 15 enheter av et restriksjonsenzym Xhol (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et EcoRI-XhoI fragment på omtrent 2,95 kb ble utvunnet.
Det resulterende EcoRI-XhoI fragment av PCR produktet av VL av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff og EcoRI- XhoI fragmentet av plasmid pBluescript II SK(-) ble således ligert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i overensstemmelse med produsentens instruk sjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA opp-løsningen oppnådd på denne måten, hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og nukleotidsekvenser ble analysert ved anvendelse av Big Dye Terminator Kit ver. 2 (produsert av Applied Biosystems). Som et resultat av nukleotidsekvensanalysen, ble det oppnådd et plasmid pKM216 0LV4 vist i fig. 4 som har mål-nukleotidsekvensen. Escherichia coli transformert med pKM216 0LV0, Escherichia coli DH5a/ pKM2160LV0, er blitt deponert 22. august 2001 som FERM BP-7713 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
Deretter ble FR aminosyrerester designet i 1(3) i eksempel 1 modifisert som følger. De genetiske kodoner for aminosyrerester etter modifiseringen ble modifisert til å ha genetiske kodoner funnet i muse-antistoffet KM2160.
I modifikasjon av Ile i posisjon 2 til Val, ble et plasmid pKM216 0LVl vist i fig. 5 som har mål-nukleotidsekvensen oppnådd ved å utføre reaksjonen som ligner på konstruksjonen av det ovennevnte plasmid pKM2160LV0, ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:33 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:27. Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160LVl, Escherichia coli DH5a/ pKM2160LVl, er blitt deponert 22. august 2001 som FERM BP-7714 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industraial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
På samme måte, ble hvert at mål-plasmidene pKM216 0LV2 og pKM216 0LV3 oppnådd ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:34 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:27 når Val i posisjon 3 var modifisert til Leu, og ved anvendelse av et oligonukleotid som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:35 i stedet for oligonukleotidet som har nukleotidsekvensen representert ved SEQ ID NO:27 når begge av de ovennevnte to rester var modifisert.
Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160LV2, Escherichia coli DH5a/pKM216 0LV2, og Escherichia coli transformert med plasmidet pKM2160LV3, Escherichia coli DH5a/pKM216 0LV3, er blitt deponert 22. august 2001 som henholdsvis FERM BP-7715 og FERM BP-7716 i International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan). (3)Konstruksjon av anti-CCR4 CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektor
En anti-CCR4 CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektor
pKANTEX216 0Gal0LV0 ble konstruert ved anvendelse av en vektor for humanisert antistoff-ekspresjon pKANTEX93 ( Mol. Immunol., 37, 1035 (2000)) og plasmidene pKM2160GalO og pKM2160LV0 oppnådd i 2(1) og (2) i eksempel 1 som følger.
Plasmidet pKM2160LV0 (3 ug) oppnådd i 2(2) i eksempel 1 fikk reagere med 10 enheter av et restriksjonsenzym BsiWI (produsert av New England Biolabs) ved 55°C i 1 time og deretter med 10 enheter av et restriksjonsenzym ScoRI (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et BsiWI-ScoRI fragment på omtrent 0,44 kb ble utvunnet.
3 ug av vektoren for humanisert antistoff-ekspresjon pKANTEX93 fikk deretter reagere med 10 enheter av et restriksjonsenzym BsiWI (produsert av New England Biolabs) ved 55°C
i 1 time og deretter med 10 enheter av et restriksjonsenzym EcoRI (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time. Reak-sjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektro-
forese, og et BsiWI- EcoRI fragment på omtrent 12,75 kb ble utvunnet.
Det resulterende BsiWI-EcoRI fragment avledet fra pKM216 0LV0 og BsiWI-EcoRI fragmentet avledet fra pKANTEX93 ble så legert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA oppløsningen oppnådd på denne måten for derved å oppnå et plasmid pKANTEX216 0LV0 vist i fig. 6. 3 ug av plasmidet pKM2160GalO oppnådd i 2(1) i eksempel 1 fikk deretter reagere med 10 enheter av et restriksjonsenzym Apal (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time og deretter med 10 enheter av et restriksjonsenzym Noti (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Apal-Notl fragment på omtrent 0,47 kb ble utvunnet. 3 ug av plasmidet pKANTEX216 0LV0 oppnådd i den ovennevnte fikk så reagere med 10 enheter av et restriksjonsenzym Apal (produsert av Takara Shuzo) ved 3 7°C i 1 time og deretter med 10 enheter av et restriksjonsenzym Noti (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og et Apal-Noti fragment på omtrent 0,45 kb ble utvunnet.
Det resulterende Apal-Notl fragment avledet fra pKM2160GalO og Apal-Noti fragmentet avledet fra plasmidet pKANTEX216 0LV0 ble deretter ligert ved anvendelse av Solution I i DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Escherichia coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av rekombinant plasmid DNA oppløsningen oppnådd på denne måten, og hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene. Som et resultat av at nukleotidsekvensene av de således oppnådde plasmider ble analysert ved anvendelse av Big Dye Terminator Kit ver. 2 (produsert av Applied Biosystems), ble det bekreftet av det var oppnådd en ekspresjonsvektor pKANTEX216 0Gal0LV0 vist i fig. 6 som mål-DNA-et var blitt klonet inn i.
I tillegg ble ekspresjonsvektorer fremstilt ved anvendelse av den samme metoden på VH og VL hvori aminosyrerester av annen FR ble modifisert, inkluderende HVO.
Spesifikt ble 22 ekspresjonsvektorer pKM2160Gal0LV0, pKM216 0GalOLVl, pKM2160GalOLV2, pKM216 0GalOLV3, pKM216 0GallLVl, pKM2160GallLV3, pKM216 0Gal2LVl, pKM216 0Gal2LV3, pKM2160Gal3LVl, pKM216 0Gal3LV3, pKM216 0HV0LV0, pKM216 0HV0LVl, pKM2160HV0LV2, pKM2160HV0LV3, pKM216 0HV1LVO, pKM216 0HVlLVl, pKM2160HV1LV2, pKM2160HV1LV3, pKM216 0HV2 LVO, pKM216 0HV2LV3, pKM2160HV3LV0 og pKM2160HV3LV3, konstruert ved henholdsvis å kombinere pKM2160GalO, pKM2160Gall, pKM2160Gal2, pKM2160Gal3, pKM2160HV0, pKM2160HVl, pKM2160HV2 og pKM2160HV3 konstruert i 2(1) i eksempel 1 med pKM2160LV0, pKM2160LVl, pKM2160LV2 og pKM216 0LV3 konstruert i 2(2) i eksempel 1.
Eksempel 2
Ekspresjon av anti-CCR4 CDR-podet antistoff i dyreceller: 1.Transient ekspresjon av anti-CCR4 CDR-podet antistoff ved anvendelse av COS-7 celle (ATCC CRL 1651)
(1)Transient ekspresjon i COS-7 celle
I en 6 brønn plate (produsert av Iwaki Glass) ble lxl0<5>celler/ml COS-7 celle dispensert ved 2 ml/brønn ved anvendelse av DMEM nedium (produsert av Bibco) inneholdende 10% FCS og dyrket over natten ved 37°C. Pr. 100 yl OPTI-MEM medium (produsert av Bibco) ble 3 yl Fu-GENETM 6 Transfer Reagent (produsert av Roche) tilsatt og 1 yg av hver av de 22 anti- CCR4 CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektorer oppnådd i punkt 2(3) i eksempel 1 ble videre tilsatt dertil, og blandingen ble hensatt ved romtemperatur i 15 minutter for å danne et DNA-liposom kompleks. Hver av reaksjonsoppløsningene ble tilsatt dråpevis til den ovennevnte COS-7 celle og grundig blandet, etterfulgt av dyrking ved 3 7°C. Etter dyrking i 72 timer ved kultur-supernatantene ble utvunnet og aktiviteten av det anti-CCR4 CDR-podede antistoff i kultur-supernatantene ble evaluert.
(2)Evaluering av reaktivitet av anti-CCR4 CDR-podet antistoff for human CCR4
Aktiviteten av de resulterende kultur-supernatanter av 22 antistoffer ble evaluert som følger.
Forbindelse 1 (SEQ ID NO:37) ble valgt som et humant CCR4 ekstracellulær region peptid som kan reagere med det anti-CCR4 kimære antistoff KM27 6 0 produsert ved transformanten KM2760 (FERM BP-7054) fremstilt i referanseeksempel 2. For å anvende forbindelse 1 i aktivitetsmålingen ved hjelp av ELISA, ble dens konjugat med BSA (bovint serumalbumin) (produsert av Nakalai Tesque) fremstilt og anvendt som antigenet.
Dvs., 100 ml av 25 mg/ml SMCC (4-(N-maleimidometyl)cyklo-heksan-1-karboksylsyre-N-hydroksysuccinimidester) (produsert av Sigma)-DMSO-oppløsning ble tilsatt dråpevis til 900 ml PBS-oppløsning inneholdende 10 mg BSA under vortexblanding og omrørt forsiktig i 30 minutter. Til en gelfiltreringskolon-ne, slik som NAP-10 kolonne eller lignende, ekvilibrert med 25 ml PBS, ble det tilsatt 1 ml av reaksjonsoppløsningen og eluatet eluert med 1,5 ml PBS ble anvendt som en BSA-SMCC-oppløsning (BSA-konsentrasjon ble beregnet ved A2eomåling) . Deretter ble 250 ml PBS tilsatt til 0,5 mg av forbindelse 1 som deretter ble fullstendig oppløst ved tilsetning av 250 ml DMF, og deretter ble den ovennevnte BSA-SMCC-oppløsning (BSA-innhold: 1,25 mg) tilsatt under vortexblanding og forsiktig omrørt i 3 timer. Reaksjonsoppløsningen ble dialysert over natten ved 4°C mot PBS, natriumazid ble tilsatt dertil til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,05% og deretter ble den resulterende blandingen filtrert ved anvendelse av et 0,22 mm filter til å gi en BSA-forbindelse 1-oppløsning.
I en 96-brønns ELISA-plate (produsert av Greiner) ble 0,05 ug/ml av det fremstilte konjugat dispensert inn ved 50 yl/ brønn og ble hensatt ved 4°C over natten for adsorpsjon. Etter vasking med PBS, ble PBS inneholdende 1% BSA (i det etterfølgende referert til som "1% BSA-PBS") tilsatt dertil ved 100 yl/brønn og fikk reagere ved romtemperatur i 1 time for å blokkere de gjenværende aktive grupper. Etter vasking av hver brønn med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (i det etterfølgende referert til "Tween-PBS"), ble en kultur-supernatant av transformanten tilsatt ved 50 yl/brønn og fikk reagere ved romtemperatur i 1 time. Etter reaksjonen og etter-følgende vasking av hver brønn med Tween-PBS, ble en peroksydase -merket geit anti-humant IgG(y) antistoff-oppløsning (produsert av American Qualex) fortynnet 6.000 ganger med 1% BSA-PBS tilsatt som en sekundær antistoffoppløsning i 50 yl/ brønn porsjoner og fikk reagere ved romtemperatur i 1 time. Etter reaksjonen og etterfølgende vasking med Tween-PBS, ble en ABTS-substratoppløsning (en oppløsning fremstilt ved å oppløse 0,55 g 2,2<1->azino-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfon-syre) ammonium i 1 liter 0,1 M citratbuffer (pH 4,2) og å tilsette 1 yl/ml hydrogenperoksyd rett før bruk) tilsatt ved 50 yl/brønn for å utvikle farge, og reaksjonen ble stanset 20 minutter deretter ved tilsetning av 5% SDS-oppløsning ved 50 yl/brønn. Deretter ble absorbans ved 415 nm målt.
Videre, for å sammenligne konsentrasjoner av et produsert humant IgG antistoff i kultur-supernatantene, ble et geit anti-humant IgG(y) antistoff (produsert av American Qualex) fortynnet 2.000 ganger med PBS anvendt som antigenet.
Resultatene er vist i fig. 7 og fig. 8. Hvert humant CCR4 CDR-podet antistoff utviste nesten den samme aktivitet av det humane kimære antistoff KM2760.
2.Stabil ekspresjon av anti-CCR4 CDR-podet antistoff ved anvendelse av dyreceller
Et anti-CCR CDR-podet antistoff ble uttrykt i dyreceller ved anvendelse av anti-CCR4 CDR-podet antistoff-ekspresjonsvektoren oppnådd i 2(3) i eksempel 1 som følger.
(1)Stabil ekspresjon i rotte-myelomcellelinje YB2/0 celle
(ATCC CRL 1581)
Hvert humant CDR-podet antistoff ekspresjonsplasmid ble brakt til en lineær tilstand ved å digerere det med et restriksjonsenzym Aatll (produsert av TOYOBO), 10 ug av det dige-rerte produkt ble innført i 4xl0<6>celler av rotte-myelom-cellelinjen YB2/0 celle (ATCC CRL 1581) ved elektroporering ( Cytotechnology, 3_, 133 (1990) ) , og deretter ble cellene suspendert i 40 ml H-SFM (produsert av GIBCO-BRL) medium (supplert med 5% fetalt bovint serum (FBS)) og dispensert ved 200 ul/brønn inn i en 96-brønns mikrotiterplate (produsert av Sumitomo Bakelite) . Etter dyrking av 37°C i 1 til 3 døgn i en 5% C02inkubator, ble G418 (produsert av Nakalai Tesque) tilsatt dertil til å gi en konsentrasjon på 1 mg/ml og dyrkingen ble fortsatt i 1 til 2 uker for å oppnå G418-resistente transformanter.
Kultur-supernatanter ble utvunnet fra brønner hvori kolonier av transformantene som utviser G418-resistens ble konfluente, og antigen-bindende aktiviteter av anti-CCR4 humane CDR-podede antistoffer i kultur-supernatantene ble målt ved hjelp av ELISA vist i 1(2) i eksempel 2.
For å øke antistoff-ekspresjonsmengden ved anvendelse av et dhfr genamplifikasjonssystem, ble transformantene i brønner hvori ekspresjon av et anti-CCR4 kimært antistoff ble funnet i kultur-supernatantene suspendert til å gi en densitet på 1 til 2xl0<5>celler/ml i H-SFM medium inneholdende 1 mg/ml G418 og 50 nM metotreksat (i det etterfølgende referert som "MTX") som er en inhibitor av et dhfr genprodukt dihydrofolatreduk tase og dispensert i 1 ml porsjoner inn i en 24-brønns plate (produsert av Greiner). Transformanter som utviser 5 0 nM MTX-resistens ble indusert ved dyrking ved 37°C i 1 til 2 uker i en 5% C02inkubator. Når transf ormantene ble konfluente i brønnene, ble antigen-bindende aktiviteter av anti-CCR4 humane CDR-podede antistoffer i kultur-supernatantene målt ved hjelp av ELISA vist i 1(2) i eksempel 2. Med hensyn til transformanter i brønner hvor ekspresjon av anti-CCR4 humane CDR-podede antistoffer ble funnet i kultur-supernatantene, ble MTX-konsentrasjonen økt til 100 nM og deretter til 200 nM ved hjelp av den ovennevnte metoden, og en transformant som er i stand til å vokse i H-SFM medium inneholdende 1 mg/ml G418 og 200 nM MTX og som også er i stand til å i høy grad å uttrykke det anti-CCR4 humane CDR-podede antistoff ble til sist oppnådd. For den således oppnådde transformant ble enkeltcelle-isolering (kloning) utført ved begrensende fortynningsanalyse for å oppnå en transformant-celleklon som utviser den høyeste ekspresjon av det anti-CCR4 humane CDR-podede antistoff. En antistoff-produserende celle KM8760 oppnådd ved genoverføringen av en ekspresjonsvektor pKANTEX216 0GallLV3 og en antistoff-produserende celle KM8759 oppnådd ved genoverføringen av en ekspresjonsvektor pKANTEX2160Gal2LV3 er blitt deponert 30. juli 2002 som henholdsvis FERM BP-8130 og FERM BP8129 i International Depositary Authority hos International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
(2)Rensing av anti-CCR4 CDR-podet antistoff fra kultur-supernatant en
Når en transformant som utviser G418 resistens kom tilsyne og ble konfluent, ble mediet byttet til 300 til 1.100 ml H-SFM medium inneholdende Daigo's GF21 (produsert av Wako Pure Chemical Industries) ved en konsentrasjon på 5%, etterfulgt av dyrking i 3 til 5 døgn. Når den ble konfluent, ble kultur-supernatanten utvunnet. Et renseprotein ble oppnådd ved å rense det anti-CCR4 CDR-podede antistoff fra omtrent 300 til 1.100 ml av kultur-supernatanten ved anvendelse av en Prosep-A kolonne (produsert av Millipore) i overensstemmelse med de vedlagte instruksjoner.
3.Evaluering av aktivitet av renset anti-CCR4 CDR-podet antistoff
Aktiviteten ble evaluert ved anvendelse av anti-CCR4 CDR-podede antistoffer avledet fra antistoff-produserende celler oppnådd ved å innføre ekspresjonsvektorer av GalOLVO, GalOLVl, GalOLV3, GallLVl, GallLV3, Gal2LVl, Gal2LV3, Gal3LVl og Gal3LV3 i YB2/0 (i det etterfølgende ganske enkelt referert til som henholdsvis "GalOLVO", "GalOLVl", "GalOLV3", "GallLVl", "GallLV3", "Gal2LVl", "Gal2LV3", "Gal3LVl" og "Gal3LV3").
(1) Måling av bindingsaktivitet av et anti-CCR4 CDR-podet antistoff for humant CCR4 (ELISA-metode)
Målingen ble utført på samme måte som metoden beskrevet i punkt 1(2) i eksempel 2. Resultatene er vist i fig. 9. Hvert anti-CCR4 CDR-podet antistoff utviste nesten den samme aktivitet som den for det humane kimære antistoff KM2760.
(2) Reaktivitet av et anti-CCE4 CDR-podet antistoff med human CCR4-høyt-uttrykkende celle (fluorescerende antistoff-teknikk
Inn i en 96-brønns plate ble det dispensert 2xl0<5>eller mer av CCR4/EL-4 celler, CCR4-høyt-uttrykkende celler oppnådd i referanseeksempel 3. En antistoffoppløsning ble fremstilt ved å fortynne hvert av de rensede antistoffer og et humant immunglobulin (produsert av Welfide) for å forebygge ikke-spesifikk farging til å gi konsentrasjoner på henholdsvis 10 ug/ml og 3,75 mg/ml, med en buffer for FACS, og antistoff-oppløsningen ble tilsatt ved 100 ul/brønn og fikk reagere i 30 minutter i is. Som en negativ kontroll ble det anvendt 10 ug/ml av et anti-humant IL-5 reseptor a kjede antistoff (WO 97/10354) . Etter vasking to ganger med 200 ul/brønn av bufferen for FACS, ble et PE-merket anti-humant IgG antistoff (produsert av Coulter) fortynnet 100 ganger tilsatt ved 50 ul/brønn. Etter reaksjonen i is under avskjerming og etter-følgende vasking tre ganger med 200 ul/brønn av bufferen for FACS, ble reaksjonsproduktet suspendert i 500 yl av bufferen for FACS og fluorescensintensiteten ble målt ved anvendelse av et flow-cytometer. Resultatene er vist i fig. 10. Alle de anti-CCR4 CDR-podede antistoffer utviste nesten den samme aktivitet som det humane kimære antistoff KM2760.
(3)Måling av aktivitet av anti-CCR4 CDR-podet antistoff til å binde en human CCR4 (BIAcore-metode)
For å måle bindingsaktiviteten mer detaljert, ble bindingsaktiviteten av forskjellige rensede antistoffer målt ved anvendelse av BIAcore 2000 (produsert av BIACORE) som følger. I dette tilfellet ble HBS-EP (produsert av BIACORE) anvendt som bufferen for fortynning av prøver og for målingen. Først ble 5 yl 0,05 yg/ml oppløsning av forbindelse 1 som et biotinylert CCR4 partielt peptid tilsatt til en følerspiss SA (produsert av BIACORE) ved en strømningshastighet på 5 yl/ minutt og immobilisert på følerspissen.
Til den preparerte følerspiss immobilisert med biotinylert forbindelse 1 ble 20 yl 4 yg/ml oppløsning av hvert av de rensede antistoffer tilsatt ved en strømningshastighet på 5 yl/minutt, og etter fullførelse av tilsetningen ble dissosiasjonsreaksjonen overvåkes i 4 minutter og deretter ble føler-spissoverflaten regenerert ved tilsetning av 5 yl 10 mM HC1 to ganger. På denne måten ble det oppnådd en bindingsreak-sjonskurve (sensorgram) for forbindelse 1.
Resultatene er vist i fig. 11. Ordinaten representerer en resonansenhet (RE) som betyr en masseforandring på følerspis-sen. 1.000 RE tilsvarer f.eks. en masseforandring på omtrent 1 ng/mm<2>protein. Det ble vist at KM2760 hadde en markert stabil og høy bindingsaktivitet, fordi den utviste en tidsav-hengig bindingsaktivitet for forbindelse 1 og dissosiasjon av dens binding ble knapt funnet ved dissosiasjonsreaksjonen.
På den annen side, utviste hvert av de anti-CCR4 CDR-podede antistoffer nesten den samme dissosiasjonsreaksjonen som det
humane kimære antistoff KM2760, men en svak reduksjon i aktiviteten ble funnet i bindingsreaksjonen til det CCR4 partielle peptid, forbindelse 1. Det anti-CCR4 CDR-podede antistoff GalOLVO hvori CDR alene var podet utviste den laveste bindingsaktiviteten, og bindingsaktiviteten ble økt ved aminosyrerest-modifiseringen av FR. Resultatene viser at et anti-CCR4 CDR-podet antistoff som opprettholder den antigenbindende aktivitet og bindingsspesifisitet av et muse-antistoff kan fremstilles ved å pode CDR av muse-antistoffet KM2160 til et passende humant antistoff FR, og at et anti-CCR4 CDR-podet antistoff som har høyere bindingsaktivitet kan fremstilles ved å identifisere FR aminosyrerester som er viktige for bindingsaktiviteten basert på den tredimensjonale struktur og lignende av antistoff V regioner og å pode dem sammen med CDR-et. Det er forventet av de anti-CCR4 CDR-podede antistoffer fremstilt i dette eksemplet har høy bindingsaktivitet til CCR4, har redusert immunogenisitet i mennesker sammenlignet med den for muse-antistoffer og også den for humane kimære antistoffer, og har høy sikkerhet og høye terapeutiske effekter.
2. In vitro cytotoksisk aktivitet av anti-CCR4 CDR-podet antistoff (ADCC aktivitet)
For å evaluere in vitro cytotoksisk aktivitet av det rensede anti-CCR4 CDR-podede antistoff oppnådd i 2(2) i eksempel 2, ble dets ADCC aktivitet målt som følger.
(1)Fremstilling av target-celle-suspensjon
Den humane CCR4-høyt-uttrykkende celle CCR4/EL-4 oppnådd i referanseeksempel 3 ble dyrket i 10% FCS-inneholdende RPMI 1640 medium (produsert av GIBCO) inneholdende 0,5 mg/ml G418 til å gi en densitet på lxlO<6>celler/0,5 ml, 1,85 MBq ekviva-lent av radioaktivt natriumkromat (Na251CrOJ (produsert av Daiichi Pure Chemicals) ble tilsatt dertil og blandingen fikk reagere ved 37°C i 1,5 timer til å isotop-merke cellene. Etter reaksjonen ble cellene vasket tre ganger ved deres suspensjon i RPMI 1640 medium og sentrifugering, re-suspendert i mediet og deretter inkubert i is ved 4°C i 3 0 minutter for spontant å frigjøre den radioaktive substans. Etter sentrifugering ble 5 ml 10% FCS-inneholdende RPMI i 1640 medium tilsatt dertil til å gi en densitet på 2xl0<5>celler/ml som targetcelle-suspensjonen.
(2) Fremstilling av effektorcelle-suspensjon
Friskt humant perifert blod (60 ml) ble samlet ved anvendelse av en sprøyte inneholdende 2 00 enheter (2 00 ul) av en heparin natriuminjeksjon (produsert av Takeda Pharmaceutical). Hele mengden ble fylt opp til 120 ml ved å fortynne den to ganger med det samme volum av fysiologisk saltoppløsning (produsert av Otsuka Pharmaceutical). Lymphoprep (produsert av NYCOMED) ble dispensert ved 5 ml inn i 12 rør med 15 ml kapasitets sentrifugeringsrør (produsert av Sumitomo Bakelite), det fortynnede perifere blod ble lagt over dette ved 10 ml, og blandingen ble sentrifugert ved 800 x g i 20 minutter ved romtemperatur. PBMC-fraksjoner mellom blodplasmalaget og Lymphoprep-laget ble samlet fra alle sentrifugeringsrør, suspender i 1% FCS-inneholdende RPMI 164 0 medium (i det etterfølgende referert til som "1% FCS-RPMI"), vasket to ganger ved sentrifugering ved 400 x g og 4°C i 5 minutter og deretter re-suspendert til å gi en densitet på 5xl0<6>celler/ ml for bruk som effektorcellene.
(3) Måling av ADCC aktivitet
Targetcelle-suspensjonen fremstilt i (1) ble dispensert ved
50 yl (lxlO<4>celler/brønn) inn i brønner i en 96-brønns U-bunn-plate (produsert av Falcon). Deretter ble effektorcelle-suspensjonen fremstilt i (2) dispensert ved 100 yl
(5xl0<5>celler/brønn, forholdet av effektorceller til targetceller blir 50 : 1). Hvert anti-CCR4 kimært antistoff ble så tilsatt til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,1 ng/ml til 10 ug/ml og blandingen fikk reagere ved 37°C i 4 timer. Etter reaksjonen ble platen sentrifugert og mengden av<51>Cr i 100 yl av supernatanten i hver brønn ble målt ved hjelp av en Y-teller. Mengden av det spontant dissosierte<51>Cr ble beregnet på samme måte som ovenfor ved anvendelse av mediet alene i stedet for effektorcelle-suspensjonen og antistoff-oppløsning og måling av mengden<51>Cr i supernatanten. Mengden av det totale dissosierte<51>Cr ble beregnet på samme måte som ovenfor ved å tilsette mediet alene i stedet for antistoff-oppløsningen, og 1 N saltsyre i stedet for effektorcelle-suspensjonen, og å måle mengden<51>CR i supernatanten. ADCC aktiviteten ble beregnet ved hjelp av den følgende ligning:
Resultatene er vist i fig. 12. Som vist i fig. 12, hadde det anti-CCR4 CDR-podede antistoff sterk cytotoksisk aktivitet som var antistoffkonsentrasjon-avhengig.
5.Effekt av inhiberende produksjon av cytokin fra human PBMC
En effekt av å inhibere cytokinproduksjon undersøkt ved anvendelse av en anti-CCR4 CDR-podet antistoff GallLV3 og et kimært antistoff KM2760. Et anti-IL-5R antistoff ble anvendt som en negativ kontroll.
PBMC ble separert på samme måte som i 4(2) i eksempel 2 og dispensert ved lxlO<6>celler/brønn i en 96-brønns U-bunn-plate, et evaluerings-antistoff ble tilsatt dertil til å gi en sluttkonsentrasjon på 1 yg/ml, og det totale volum ble innstilt til 200 yl/brønn. ADCC aktiviteten ble indusert ved ko-dyrking ved 3 7°C i 24 timer i en strøm av 5% C02. Etter dyrkingen ble 100 yl av supernatanten fjernet, 100 yl av et medium inneholdende 10 ng/ml PMA (forbolmyristatacetat) og 2 yg/ml ionomycin (produsert av SIGMA) ble tilsatt dertil til å gi sluttkonsentrasjoner på 50 ng/ml PMA og 1 yg/ml ionomycin, og cellene ble stimulert for å indusere cytokinproduksjonen.
Etter innføring av hvert stimulerende middel, ble dyrking utført i 24 timer, kultur-supernatanter ble utvunnet og IL-4, IL-13 og interferon (IFN)-y ble målt ved anvendelse av et cytokin-analysekit (produsert av Biosource). Produksjons-inhiberingsforholdet ble beregnet ved å definere hver cytokinproduksjon i fravær av antistoff som 0% inhiberingsfor-hold, og resultatene er vist i fig. 13. Som vist i fig. 13, på lignende måte som det kimære antistoff KM2760, inhiberte den anti-CCR4 CDR-podet antistoff GallLV3-adderte gruppe signifikant produksjon av Th2 cytokine IL-3 og IL-13 men hadde liten innvirkning på Thl cytokinet IFN-y.
Resultatene viser at hvert anti-CCR4 CDR-podet antistoff kan utarme eller eliminere CCR4-uttrykte Th2-celler ved å akti-vere humane effektorceller effektivt og har, som et resultat, en effekt med hensyn til å inhibere produksjon av Th2 cytokin fra Th2-cellene og er derfor anvendbar i diagnostisering eller behandling av humane Th2-medierte immunsykdommer slik som bronkialastma, atopisk dermatitt og lignende.
6.Analyse av reaktivitet for human blodplate
(1)Separasjon av human blodplate
Et 1/10 volum av 3,2% natriumcitrat ble tilsatt til en blod-prøve samlet fra en frisk person og grundig blandet. Blodet ble dispensert ved 5 ml inn i rør med 15 ml kapasitet (produsert av Greiner) og sentrifugert ved 90 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Supernatantene ble samlet og ytterligere sentrifugert ved 1.950 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Etter at man har kvittet seg med supernatanten ble pelletene suspendert i bufferen for FACS og sentrifugert ved 1.190 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å vaske pelleten. Pellet ene ble igjen suspendert i bufferen for FACS og sentrifugert på samme måte, og deretter ble blodplater i pelletform innstilt til å gi en densitet på omtrent lxlO<7>pelleter/ml ved anvendelse av bufferen for FACS.
(2)Farging av blodplate
Hvert av de rensede anti-CCR4 humane CDR-podede antistoffer oppnådd i 3 i eksempel 2 ble tilsatt til 100 yl av blodplatesuspensjonen oppnådd i punkt 6(1) til å gi en konsentrasjon på 10 yg/100 yl og fikk reagere ved romtemperatur i 3 0 minutter i mørket. Som sammenligningskontroller, fikk hvert av et anti-CCR4 humant kimært antistoff KM2760 og et anti-muse antistoff 1G1 antistoff (produsert av Pharmingen) reagere med 100 ml av blodplatesuspensjonen ved den samme konsentrasjon.
Etter reaksjonen ble 2 ml av bufferen for FACS tilsatt til hvert av rørende med 15 ml kapasitet, og blandingen ble om-rørt og deretter vasket ved sentrifugering ved 840 x g i 5 minutter ved 4°C. Etter at man hadde kvittet seg med supernatanten ble den samme operasjonen utført igjen. Et PE-merket anti-muse IgG antistoff (produsert av Coulter) fortynnet 50 ganger med bufferen for FACS ble tilsatt ved 20 yl til røret inneholdende en prøve reagert med hvert av de humane CDR-podede antistoffer og KM2760 og fikk reagere ved romtemperatur i 3 0 minutter i mørket. Hva angår røret inneholdende prøven reagert med 1G1 antistoffet, ble 20 yl av et 50 ganger fortynnet PE-merket anti-muse IgG antistoff (produsert av DAKO) ytterligere tilsatt og fikk reagere ved romtemperatur i 3 0 minutter i mørket.
Etter reaksjonen ble 2 ml av bufferen for FACS tilsatt til hvert rør, etterfulgt av omrøring, og blandingen ble vasket ved sentrifugering ved 840 x g i 5 minutter ved 4°C. Etter at man hadde kvittet seg med supernatanten ble den samme operasjonen utført igjen. Etter suspendering av resten i 500 yl av bufferen for FACS, ble fluorescensintensiteten målt ved anvendelse av et flow-cytometer EPICS XL-MCL (produsert av Beckman Coulter).
Resultatene er vist i fig. 14. 1G1 antistoffet som en sam-menligningskontroll utviste reaktivitet med blodplater, men alle de anti-CCR4 humane CDR-podede antistoffer utviste ikke spesifikk reaktivitet med humane blodplater på lignende måte som det anti-CCR4 humane kimære antistoff KM2760.
Referanseeksempel 1
Fremstilling av hybridomcelle som produserer muse anti-CCR4 monoklonalt antistoff: Hybridomceller som produserer muse anti-CCR4 monoklonalt antistoff KM2160 (Int. Immunol., 11., 81 (1999)) ble produsert i samsvar med den følgende prosedyre.
(1) Fremstilling av antigen
Aminosyresekvensen (SEQ ID NO:48) av humant CCR4 (i det et-terfølgende referert til som "hCCR4") protein ble analysert ved anvendelse av Genetyx Mac, og forbindelse 2 (SEQ ID NO: 36) ble valgt som en partiell sekvens som anses å være passende som antigenet blant deler som har høy hydrofilisitet, N-ende og C-ende.
(2) Fremstilling av immunogen
Det hCCR4 partielle peptid oppnådd i (1) i referanseeksempel
1 ble anvendt som immunogenet etter fremstilling av dets konjugat med KLH (Calbiochem) ved hjelp av den følgende metode for å øke dets immunogenisitet. Spesifikt ble KLH oppløst i PBS til å gi en konsentrasjon på 10 mg/ml, 1/10 volum av 2 5 mg/ml MBS (produsert av Nakalai Tesque) ble tilsatt dråpevis dertil og blandingen fikk reagere ved omrøring i 3 0 minutter. Fritt MBS ble fjernet ved hjelp av en gel-filtreringskolonne slik som Sephadex G-25 kolonne som var blitt ekvilibrert på forhånd med PBS eller lignende, og 2,5 mg av det resulterende KLH-MB ble blandet med 1 mg av peptidet oppløst i 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0), etter fulgt av omrøring ved romtemperatur i 3 timer. Etter reaksjonen ble blandingen dialysert mot PBS.
(3) Immunisering av dyr og produksjon av antistoff-produserende celler
Til 5 uker gamle hunnmus (Balb/c) ble 100 ug av peptid-KLH konjugatet fremstilt i (2) i referanseeksempel 1 administrert sammen med 2 mg aluminiumgel og 1 xlO<9>celler av pertussis-vaksine (produsert av Chiba Serum Institute), og 2 uker etter dette ble 100 ug av konjugatet administrert en gang pr. uke for totalt 4 ganger. En blodprøve ble tatt fra hvert dyr fra den venøse pleksus i øyebunnen, dens serumtiter ble undersøkt ved hjelp av en enzym immunanalyse beskrevet i det etter-følgende, og milten ble skåret ut 3 døgn etter den endelige immunisering fra en mus som utviste en tilstrekkelig antistof f titer. Milten ble skåret ut fra en mus på den 3. dag etter den endelige administrering og skåret i biter i MEM (produsert av Nissui Pharmaceutical), og cellene ble frigjort ved anvendelse av en pinsett og sentrifugert (1.2 00 opm, 5 minutter), supernatanten ble fjernet, etterfulgt av behandling med 3 ml av en Tris-ammoniumkloridbuffer (pH 7,65) i 1 til 2 minutter for eliminere erytrocytter. De gjenværende cellene ble ytterligere vasket tre ganger med MEM og anvendt for cellefusjon.
(4) Fremstilling av muse-myelomcelle
En 8-azaguanin-resistent muse-myelomcelleline, P3X63Ag8U.l (ATCC CRL-1597, i det etterfølgende referert til som "P3-Ul"), ble dyrket og anvendt som opphavslinjen i cellefusjon.
(5) Fremstilling av hybridomcelle
Miltcellene og myelomcellene oppnådd i (3) og (4) i referanseeksempel 1 ble blandet til et forhold på 10:1, etterfulgt av sentrifugering (1.200 opm, 5 minutter) for å fjerne supernatanten, 0,5 ml av en polyetylenglykoloppløsning (en oppløsning inneholdende 2 g polyetylenglykol-1000, 2 ml MEM og 0,7 ml DMSO) ble tilsatt til de således presipiterte celler pr. 10° miltceller ved 37°C, etterfulgt av grundig suspendering. Deretter ble 1 til 2 ml MEM tilsatt flere ganger ved 1 til 2 minutters intervaller, og sluttvolumet ble innstilt til 50 ml med MEM. Etter fjerning av supernatanten ved sentrifugering (900 opm, 5 minutter) ble presipitatet suspendert i 100 ml HAT medium, dispensert i 100 ul/brønn inn i en 96-brønns mikrotiterplate (produsert av Sumitomo Bakelite), etterfulgt av dyrking i en 5% C02inkubator ved 3 7°C i 10 til 14 døgn. Ved anvendelse av brønner hvori propagering av den fu-sjonerte celle ble observert, ble bindingsaktivitet til det hCCR4 partielle peptid (forbindelse 2) i kultur-supernatanten målt ved hjelp av ELISA (Antijbodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited
(1966), etc.). Hver brønn hvori aktiviteten var bekreftet ble klonet med totalt 2 ganger med begrensende fortynning, en gang ved bytting av mediet til HT mediet og deretter bytting av mediet til det normale medium. På denne måten ble det oppnådd en hybridomcelle KM2160 som produserer muse-antistof fet KM2160. KM2160 reagerte spesifikt med det hCCR4 partielle peptid (forbindelse 2).
Referanseeksempel 2
Fremstilling av anti-CCR4 kimært antistoff:
1.Isolering og analyse av cDNA som koder for V region av anti-CCR4 muse-antistoff: (1)Fremstilling av mRNA fra hybridomcelle som produserer anti-CCR4 muse-antistoff
Et mRNA ble fremstilt fra hybridomcellen KM216 0 beskrevet i referanseeksempel 1. Omtrent 48 ug mRNA ble fremstilt fra 8xl0<7>celler av hybridomcellen KM2160 ved anvendelse av et kit for fremstilling av mRNA, Fast Track mRNA Isolation Kit
(produsert av Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksj oner.
(2) Fremstilling av H kjede og L kjede cDNA bibliotek av anti-CCR4 muse-antistoff
cDNA som har EcoRI- Notl adaptere på begge termini ble syntetisert fra 5 ug av KM2160 mRNA-et oppnådd i 1(1) i referanseeksempel 2 ved anvendelse av cDNA Synthesis kit (produsert av Amersham Pharmacia Biotech) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Det således fremstilte cDNA ble oppløst i 2 0 yl sterilt vann og fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og omtrent 1,5 kb cDNA fragmenter korresponderende til H kjeden av IgG type antistoff og omtrent 1,0 kb cDNA fragmenter korresponderende til svarende til L kjeden av k type ble respektivt utvunnet ved anvendelse av QIAquick Gel Extraction Kit (produsert av QIAGEN). Ved anvendelse av AZAPII Predigested ScoRI/CIAP-Treated Vector Kit (produsert av Stratagene), ble deretter hver av 0,1 yg av de omtrent 1,5 kb cDNA fragmentene og 0,1 yg av de omtrent 1,0 kb cDNA fragmentene koblet til 1 yg av AZAPII vektoren som var blitt digerert med et restriksjonsenzym ScoRI og terminus-defos-forylert med Calf Intestine Alkaline Phosphatase i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Inn i A fag, ble 2,5 yl av hver reaksjonsoppløsning etter ligeringen pakket ved anvendelse av Gigapacklll Gold Packaging Extract (produsert av Stratagene) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner, og deretter ble Escherichia coli XLl-Blue (Bioteahnigues, 5_, 376 (1987)) infisert med en passende mengde av fagen for å oppnå 9,3x10" fag-kloner som H kjede cDNA biblioteket av KM2160 og 7,4xl0<4>fag-kloner som L kjede cDNA biblioteket. Deretter ble hver fag fiksert på et nylon-membranfilter Hybond-N+ (produsert av Amersham Pharmacia Biotech) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner.
(3) Kloning av H kjede og L kjede cDNA-er av anti-CCR4 muse-antistof f
Ved anvendelse av ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System (produsert av Amersham Pharmacia Biotech), i overensstemmelse med produsentens instruksjoner, ble kloner på nylonmembranfiltrene av KM2160 H kjede cDNA biblioteket og L kjede cDNA biblioteket fremstilt i 1(2) i referanseeksempel 2 påvist ved anvendelse av cDNA av C regionen av et muse-antistof f (H kjede er et BamHI-EcoRI fragment av muse Cyl cDNA ( EMBO J., 3, 2047 (1984), L kjede er et Hpal- EcoRI fragment av Ck cDNA (Cell, 22., !97 (1980)) som proben, og fag-kloner sterkt bundet til proben ble oppnådd som 10 kloner for hver av H kjeden og L kjeden. Deretter ble hver fag-klon omdannet til plasmid ved in vivo eksisjonsmetoden ved anvendelse av AZAPII Cloning Kit i overensstemmelse med produsentens instruksjoner (produsert av Stratagene). Ved anvendelse av BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (produsert av PE Biosystems), ble nukleotidsekvensen av cDNA inneholdt i hvert plasmid oppnådd på denne måten analysert ved hjelp av en DNA sekvenseringsinnretning ABI PRISM 3 77 fra den samme produsenten i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Som et resultat ble det oppnådd et plasmid pKM2160H4 inneholdende et full-lengde funk-sjonelt H kjede cDNA og et plasmid pKM2160L6 inneholdende et full-lengde L kjede cDNA, hvori en ATG sekvens ansett for å være initieringskodonet er tilstede i 5'-enden av cDNA.
(4)Analyse av aminosyresekvens av V region av anti-CCR4 muse-antistof f
En full nukleotidsekvens av H kjede V regionen inneholdt i plasmidet pKM216 0H4, en full aminosyresekvens av H kjede V regionen utledet derfra, en full nukleotidsekvens av L kjede V regionen inneholdt i plasmidet pKM2160L6 og en full aminosyresekvens av L kjede V regionen utledet derfra representer-es ved henholdsvis SEQ ID NO:61, 62, 63 og 64. Basert på sammenligningen med sekvensdata for kjente muse-antistoffer ( Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)) og sammenligningen med resultatene fra analyse av H kjede og L kjede N-ende amino syresekvensene av det rensede anti-CCR4 muse-antistoff KM2160 utført ved anvendelse av en protein-sekvenseringsinnretning (PPSQ-10, produsert av Shimadzu), ble det funnet at hvert således isolerte cDNA er et full-lengde cDNA som koder for anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 inneholdende sekretoriske signalsekvenser som er aminosyrer i posisjoner 1-19 i aminosyresekvensen representert i SEQ ID NO:15 i H kjeden og aminosyrer i posisjoner 1-19 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:25 i L kjeden.
Nyheten til aminosyresekvensene av V regionene av H kjede og L kjede av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 ble deretter undersøkt. Ved anvendelse av GCG Package (versjon 9.1, produsert av Genetics Computer Group) som sekvensanalyse-ringssystemet, ble aminosyresekvens-database over kjente proteiner undersøkt ved hjelp av BLAST-metoden ( Nucleic Acids Res., 25., 3389 (1997)). Som et resultat ble det ikke funnet fullstendig sammenfallende sekvenser for både H kjeden og L kjeden, slik at det ble bekreftet at H kjede V regionen og L kjede V regionen av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 er nye aminosyresekvenser.
CDR-er av H kjede V regionen og L kjede V regionen av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 ble også identifisert ved sammenligning med aminosyresekvenser av kjente antistoffer. Aminosyresekvenser av CDR1, CDR2 og CDR3 i H kjede V regionen av anti-CCR4 muse-antistoffet KM2160 er representert ved henholdsvis SEQ ID N0:1, 2 og 3, og aminosyresekvenser av CDR1, CDR2 og CDR3 i L kjede V regionen i henholdsvis SEQ ID NO:5,
6 og 7.
2.Stabil ekspresjon av anti-CCR4 kimært antistoff ved anvendelse av dyrecelle (1)Konstruksjon av anti-CCR4 kimært antistoff ekspresjons vektor pKANTEX216 0
En anti-CCR4 kimært antistoff ekspresjonsvektor pKANTEX2160 ble konstruert som følger, ved anvendelse av en humanisert antistoff ekspresjonsvektor pKANTEX93 som uttrykker et humant IgGl og k type antistoff og plasmidene pKM2160H4 og pKM2160L6 oppnådd i 1(3) i referanseeksempel 2.
Et syntetisk DNA som har nukleotidsekvensene representert ved SEQ ID NO:65 og 6 6 ble designet for å oppnå H kjede V region cDNA av KM216 0 ved PCR, og et annet syntetisk DNA som har nukleotidsekvensene representert ved SEQ ID NO:67 og 68 for oppnåelse av L kjede V region cDNA. Hvert syntetisk DNA inneholder et restriksjonsenzym som gjenkjenner sekvens i sin 5'-ende for dets kloning inn i pKANTEX93, og syntese av DNA-et ble overlatt til Genset Inc. Plasmidet pKM2160H4 (20 ng) oppnådd i 1(3) i referanseeksempel 2 ble tilsatt til en buffer inneholdende 50 yl PCR Buffer nr. 1 festet til KOD DNA Polymerase (produsert av TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1 mM magnesiumklorid og 0,5 yM av det syntetiske DNA som har nukleotidsekvensene representert ved SEQ ID NO:11 og 12, og blandingen ble oppvarmet ved 94°C i 3 minutter. Etter at 2,5 enheter av KOD DNA Polymerase (produsert av TOYOBO) var tilsatt, ble blandingen underkastet 2 5 cykluser av reaksjonen idet hver cyklus består av oppvarming ved 94°C i 3 0 sekunder, ved 58°C i 30 sekunder og ved 74°C i 1 minutt, ved anvendelse av et DNA thermal cycler GeneAmp PCR System 96 00 (produsert av PERKIN ELMER). På samme måte ble 20 ng av plasmidet pKM2160L6 oppnådd i 1(3) i referanseeksempel 6 tilsatt til en buffer inneholdende 50 yl av PCR Buffer nr. 1 festet til KOD DNA Polymerase (produsert av TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1 mM magnesiumklorid og 0,5 yM av det syntetiske DNA som har nukleotidsekvensene representert ved SEQ ID NO:67 og 68, og PCR ble utført på den samme måte som beskrevet ovenfor. Reaksjons-oppløsningen (10 yl) ble underkastet agarose gel elektroforese, og deretter ble et H kjede V region PCR produkt på omtrent 0,46 kb og et L kjede V region PCR produkt på omtrent 0,43 kb hver utvunnet ved anvendelse av QIAquick Gel Extraction Kit (produsert av QIAGEN).
0,1 yg DNA oppnådd ved digerering av et plasmid pBluescript SK(-) (produsert av Stratagene) med et restriksjonsenzym Smal (produsert av Takara Shuzo) og omtrent 0,1 yg av hver av PCR produktene oppnådd ovenfor ble deretter tilsatt til sterilt vann til å gi et sluttvolum på 7,5 yl, og 7,5<y>l av oppløs-ningen I i TAKARA DNA Ligation Kit Ver. 2 (produsert av Takara Shuzo) og 0,3 yl av et restriksjonsenzym Smal ble tilsatt dertil, og blandingen fikk reagere ved 22°C over natten. Det resulterende av den rekombinante plasmid DNA oppløsning ble E. coli DH5a (produsert av TOYOBO) transformert. Hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og underkastet reaksjonen ved anvendelse av BigDye Terminator Cycle
Sequencing FS Ready Reaction Kit (produsert av PE Biosystems) 1 overensstemmelse med produsentens instruksjoner, og nukleotidsekvensen ble analysert ved hjelp av en DNA sekvenseringsinnretning ABI PRISM 377 fra den samme produsenten. Plasmidene pKM216 0VH41 og pKM2160VL61 vist i fig. 15 som har de
ønskede nukleotidsekvenser ble således oppnådd.
3 yg av humanisert antistoff ekspresjonsvektoren pKANTEX93 og 3 yg av pKM2160VH41 oppnådd ovenfor ble deretter tilsatt til en buffer inneholdende 30 yl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM magnesiumklorid og 1 mM DTT, 10 enheter av et restriksjonsenzym Apal (produsert av Takara Shuzo) ble tilsatt dertil, og blandingen fikk reagere ved 37°C i 1 time. Reaksjonsoppløs-ningen ble underkastet etanolpresipitering, og det resulterende presipitat ble tilsatt til en buffer inneholdende 10 yl 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM natriumklorid, 10 mM magnesiumklorid, 1 mM DTT, 100 yg/ml BSA og 0,01% Triton X-100, 10 enheter av et restriksjonsenzym Noti (produsert av Takara Shuzo) ble tilsatt dertil, og blandingen fikk reagere ved 37°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og omtrent 12,75 kb og omtrent 0,44 kb Apal-Noti fragmenter av henholdsvis pKANTEX93 og pKM2160VH41 ble utvunnet. De således oppnådde to fragmenter ble forbundet ved anvendelse av TAKARA DNA Ligation Kit Ver. 2 i overensstemmelse med produsentens instruksjoner, og E. coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvend else av den resulterende rekombinant plasmid DNA oppløsning-en. Hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og bekreftet ved en restriksjonsenzymbehandling for derved å oppnå et plasmid pKANTEX2160H vist i fig. 16, hvori omtrent 0,44 kb av det ønskede Apal-Noti fragment var blitt innskutt. 3 yg av pKANTEX216 0H og 3 yg av pKM216 0VL61 oppnådd ovenfor ble så tilsatt til en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM natriumklorid, 10 mM magnesiumklorid, 1 mM DTT og 100 yg/ml BSA, oppløsningen ble innstilt til å gi et totalvolum på 30 yl, 10 enheter av et restriksjonsenzym BsiWI (produsert av New England Biolabs) ble tilsatt dertil, og blandingen fikk reagere ved 55°C i 1 time. Deretter ble et restriksjonsenzym ScoRI (produsert av Takara Shuzo) tilsatt dertil, og blandingen fikk reagere ved 37°C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved agarose gel elektroforese, og omtrent 13,20 kb og omtrent 0,41 kb ScoRI-BsiWI fragmenter av henholdsvis pKANTEX2160H og pKM2160VL61 ble utvunnet . De således oppnådde to fragmenter ble forbundet ved anvendelse TAKARA DNA Ligation Kit Ver. 2 i overensstemmelse med produsentens instruksjoner og E. coli DH5a (produsert av TOYOBO) ble transformert ved anvendelse av den resulterende rekombinant plasmid DNA oppløsningen. Hvert plasmid DNA ble fremstilt fra transformantklonene og bekreftet ved en restriksjonsenzymbehandling for derved å oppnå et plasmid pKANTEZ216 0 vist i fig. 17, hvori omtrent 0,41 kb av det ønskede ScoRI-BsiWI fragment var blitt innskutt. Når plasmidet ble underkastet reaksjonen ved anvendelse av BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (produsert av PE Biosystems) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner, og nukleotidsekvensen ble analysert ved hjelp av en DNA sekvenseringsinnretning ABI PRISM 377 fra den samme produsenten, ble det bekreftet av det ønskede plasmid inn i hvilket cDNA som koder for KM2160 H kjede og L kjede V regionene var blitt klonet, var oppnådd. (2)Stabil ekspresjon av anti-CCR4 kimært antistoff ved anvendelse av dyrecelle
Det anti-CCR4 kimære antistoff ble uttrykt i dyreceller som beskrevet nedenfor ved anvendelse av anti-CCR4 kimært antistoff ekspresjonsvektoren pKANTEX 2160 oppnådd i 2(1) i referanseeksempel 2.
Plasmidet pKANTEX2160 ble omdannet til en lineær form ved digerering med et restriksjonsenzym Aatll (produsert av TOYOBO) og 10 yg derav ble innført i 4xl0<6>celler av rotte-myelomcellelinje YB2/0 (ATCC CRL1662) ved elektroporering ( Cytotechnology, 3_, 133 (1990) ) , og cellene ble suspendert i 40 ml H-SFM (produsert av GIBCO-BRL) medium (supplert med 5% FCS) og dispensert i 200 yl/brønn inn i en 96-brønns mikrotiterplate (produsert av Sumitomo Bakelite). Tjuefire timer etter inkubering ved 37°C i en 5% C02inkubator, ble G418 tilsatt til å gi en konsentrasjon på 1 mg/ml, etterfulgt av dyrking i 1 til 2 uker. En kultur-supernatant ble utvunnet fra en brønn hvori en koloni av G418-resistent transformant kom til syne og ble konfluent, og antigenbindende aktivitet av det anti-CCR4 kimære antistoff i supernatanten ble målt ved hjelp av ELISA vist i 2(3) i referanseeksempel 2 (et peroksidase-merket geit anti-humant IgG(y) antistoff ble anvendt som det sekundære antistoff).
For å øke den uttrykte mengden av antistoffet ved anvendelse av et dhfr genamplifikasjonssystem, ble transformanten i en brønn hvor ekspresjon av det anti-CCR4 kimære antistoff ble funnet i kultur-supernatanten suspendert til å gi en densitet på 1 til 2xl0<5>celler/ml i H-SFM medium inneholdende 1 mg/ml G418 og 50 nM metotreksat (i det etterfølgende referert til som "MTX": produsert av Sigma) som er inhibitoren av en dhfr genprodukt-dihydrofolatreduktase, og suspensjonen ble dispensert i 1 ml inn i brønner i en 24-brønns plate (produsert av Greiner) . Blandingen ble dyrket ved 37°C i 1 til 2 uker i en 5% C02inkubator, slik at en transformant som utviser resistens overfor 50 nM MTX ble indusert. Når transformanten ble konfluent i en brønn, ble antigenbindende aktivitet av det anti-CCR4 kimære antistoff i kultur-supernatanten målt ved hjelp av ELISA vist i 2(3) i referanseeksempel 2. Hva angår transformantene i brønner hvor ekspresjon av det anti-CCR4 kimære antistoff ble funnet i kultur-supernatanter, ble MTX-konsentrasjonen økt til 100 nM og deretter til 200 nM på den samme måten for til sist å oppnå en transformant som kan vokse i H-SFM medium inneholdende 1 mg/ml G418 og 200 nM MTX og også kan i høy grad uttrykke det anti-CCR4 kimære antistoff. Den således oppnådde transformant ble underkastet enkeltcelle-isolering (kloning) ved to ganger med begrenset fortynningsanalyse, og en transformantklon som har den høy-este anti-CCR4 kimært antistoff ekspresjon ble betegnet KM2760. Den uttrykte mengden av det anti-CCR4 kimære antistoff ved KM2760 var omtrent 5 ug/10<6>celler/24 timer. I tillegg, tilhører antistoff H kjede C regionen av KM2760 human IgGl underklasse. KM2760 er blitt internasjonalt deponert som FERM BP7054 24. februar 2000 i National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (nåværende navn: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba-Shi, Ibaraki Prefecture, Japan (nåværende adresse: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan)).
Referanseeksempel 3
Etablering av hCCR4-høyt-uttrykkende celle:
(1)Konstruksjon av ekspresjonsvektor CAG-pcDNA3 for dyrecelle
En ekspresjonsvektor ble konstruert som beskrevet nedenfor ved å produsere en ekspresjonsvektor (CAG-pcDNA3) hvori promoterregionen av en ekspresjonsvektor for dyrecelle, pcDNA3 (produsert av INVITROGEN), var forandret fra cyto-megalovirus (CMV) promoter til CAG (AG (modifert kylling actin) promoter med CMV-IE enhancer), og å innskyte CCR4 genet i vektoren.
pcDNA3 (5 yg) fikk reagere med et restriksjonsenzym Nrul (produsert av Takara Shuzo) ved 3 7°C i 1 time, og deretter ble DNA fragmenter utvunnet ved etanolpresipitering. De fikk så reagere med et restriksjonsenzym Hindlll (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time og deretter fraksjonert ved agarose gel elektroforese for å utvinne et DNA fragment på omtrent 5,8 kb som ikke inneholder noen CMV promoterregion. Plasmid CAG-pBluescript IIKS(+) (3 yg) som har CAG promoter ( Nuc. Acid. Res. , 23., 3816 (1995) ) region fikk reagere med et restriksjonsenzym Sali (produsert av Takara Shuzo) ved 3 7°C i 1 time og deretter ble DNA fragmenter utvunnet ved etanolpresipitering. De ble gitt butt ende (blunt-ended) med DNA Blunting Kit (produsert av Takara Shuzo), fikk videre reagere med Hindi 11 ved 3 7°C i 1 time, og deretter fraksjonert ved agarose gel elektroforese for å utvinne et DNA fragment på omtrent 1,8 kb inneholdende CAG promoterregionen. De således utvunnede respektive DNA fragmenter ble ligert ved anvendelse av DNA Ligation Kit (produsert av Takara Shuzo), og E. coli DH5a ble transformert ved anvendelse av det resulterende rekombinante plasmidet DNA for å oppnå plasmid CAG-pcDNA3.
(2) Konstruksjon av hCCR4 ekspresjonsvektor
En hCCR4 ekspresjonsvektor ble konstruert som beskrevet nedenfor ved anvendelse av CAG-pcDNA3 oppnådd i 3(1) i referanseeksempel 2 og hCCR4 DNA-innskutt pcDNA3 (CCR4/ pcDNA3). Både CAG-pcDNA3 og CCR4/pcDNA3 fikk reagere med Hindlll ved 37°C i 1 time og DNA fragmenter ble utvunnet ved etanol presipitering. De fikk så reagere med Bglll (produsert av Takara Shuzo) ved 37°C i 1 time og deretter fraksjonert ved agarose gel elektroforese for å utvinne et DNA fragment på omtrent 2,0 kb inneholdende CAG promoterregionen og et DNA fragment på omtrent 5,5 kb inneholdende hCCR4 gen-regionen. Plasmid CAG-CCR4/pcDNA3 ble deretter oppnådd ved anvendelse av begge DNA fragmentene på den sammen måten som i 3(1) i referanseeksempel 2.
(3) Ekspresjon av hCCR4 i dyrecelle
Plasmidet ble innført i dyreceller ved elektroporering på den samme måten som beskrevet i 2(2) i referanseeksempel 2. EL-4 celler (ATCC TIB-39) ble suspendert i PBS(-) (produsert av GIBCO-BRL) til å gi en densitet på lxlO<7>celler/500 yl, 10 yg av CAG-CCR4/pcDNA3 oppnådd i 3(2) i referanseeksempel 2 ble tilsatt dertil, og blandingen ble inkubert i is i 10 minutter og deretter anbrakt i en kyvette for eksklusiv anvendelse (produsert av Bio-Rad) for å bære ut genintroduksjon ved 260 V og 500<y>FD. Etter at blandingen var ytterligere inkubert i is i 10 minutter, ble cellene suspendert i 200 ml 10% FCS-RPMI medium og dispensert ved 200 yl/brønn i en 96-brønns plate for celledyrking. Tjuefire timer etter dyrkingen ble 100 yl av kultur-supernatanten fjernet fra hver brønn, og 10% FCS-RPMI medium inneholdende 1 mg/ml G418 ble dispensert ved 100 yl/brønn til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg/ml. To uker etter dette ble enkeltkloner på mellom 10 og 100 selektert og dyrket igjen.
(4)Seleksjon av hCCR4-høyt-uttrykkende celle
De ble valgt ved hjelp av en immunfluorescerende metode ved anvendelse av KM2160 fremstilt i (5) i referanseeksempel 1. Inn i en 96-brønns U-form-plate ble det dispensert 2xl0<5>celler av selekterte flere titalls av de geninnførte kloner.
KM2160 merket med biotin ved hjelp av en kjent metode ( Enzyme Antibody Method, publisert av Gakusai Kikaku) ble fortynnet til 5 yg/ml med en buffer for FACS (1% BSA-PBS, 0,02% EDTA, 0,05% NaN3, pH 7,4), humant IgG (produsert av Welfide) ble fortynnet til 3,75 mg/ml for å hindre ikke-spesifikk farging, hver av den således fortynnede antistoffoppløsning ble dispensert ved 200 yl/brønn, og blandingen fikk reagere i is i 30 minutter. Som en negativ kontroll ble biotinylert anti-IL-5R antistoff (WO 97/10354) anvendt ved den samme konsentrasjon. Etter vasking to ganger med 200 yl/brønn av bufferen, ble streptoavidin-PE (produsert av Becton Dickinson Japan) dispensert ved 2 0 yl/brønn. Tretti minutter etter reaksjonen i is i mørket, ble cellene vasket tre ganger med 200 ul/brønn og til sist suspendert til 500<y>l, og fluorescensintensiteten ble målt ved hjelp av et flow-cytometer for å selektere en cellelinje som har den høyeste fluorescensintensitet. Cellelinjen som har den høyeste fluorescensintensitet ble anvendt som CCR4/EL-4.
Industriell anvendelighet
Som diskutert ovenfor, tilveiebringes det i samsvar med den foreliggende oppfinnelse et rekombinant antistoff og et antistoffragment derav, som binder spesifikt til human CCR4 og inneholder nye CDR-er for CCR4. Antistoffet i henhold til den foreliggende oppfinnelse er anvendbart for diagnose eller behandling av CCR4-relaterte sykdommer. Spesifikt er det anvendbart for immunologisk påvisning av en human Th2-celle ved immunocytt- farging og for diagnose eller behandling av alle Th2-medierte immunsykdommer inkluderende bronkialastma og atopiske hudsykdommer, sykdommer hvori de morbide tilstander skrider frem på grunn av abnorm balanse av Th2-celler og cancertyper inkluderende blodcancertyper slik som levkemi.

Claims (40)

1. Et humant CDR-podet antistoff eller antistoff fragment derav som spesifikt reagerer med en ekstracellulær region av human CC kjemokinreseptor 4 (CCR4) men ikke reagerer med en human blodplate,og som omfatter hypervariabelt område (CDR) 1. CDR2 og CDR3 av en antistoff tung kjede (H kjede) variabel region (V region) som har aminosyresekvensene representert ved henholdsvis SEQ ID N0:1, 2 og 3, og CDR 1, CDR2 og CDR3 av en antistoff lett kjede (L kjede) V region som har aminosyresekvensene representert ved henholdsvis SEQ ID NO:5, 6 og 7.
2. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 1, som har en cytotoksisk aktivitet mot en CCR4-uttrykkende celle.
3. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 1 eller 2, som spesifikt reagerer med en ekstracellulær region av CCR4 valgt fra gruppen bestående av posisjoner 1 til 39, 98 til 112, 176 til 206 og 271 til 2 84 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48.
4. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3,som spesifikt reagerer med en epitop tilstede i posisjonene 2 til 2 9 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48.
5. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, som spesifikt reagerer med en epitop tilstede i posisjoner 13 til 2 9 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48.
6. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5, som spesifikt reagerer med en epitop tilstede i posisjoner 13 til 25 i aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:48.
7. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 1 eller 2, som spesifikt reagerer med en CCR4-uttrykkende celle.
8. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 7, som har en høyere cytotoksisk aktivitet mot en CCR4-uttrykkende celle enn et monoklonalt antistoff produsert ved et ikke-humant dyre-hybridom.
9. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 2 til 8, hvori den cytotoksiske aktivitet er en antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisk (ADCC) aktivitet.
10. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 9, hvori ADCC aktiviteten er en aktivitet med indusering av apoptose av en CCR4-uttrykkende celle.
11. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 10, som har en aktivitet med utarming av en CCR4-uttrykkende celle.
12. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 7 til 11, hvori den CCR4-uttrykkende celle er en Th2-celle.
13. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 12, som har en aktivitet med inhibering av cytokinproduksjon av en Th2-celle.
14. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 13, hvori cytokinet er IL-4, IL-5 eller IL-13.
15. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 14, som tilhører et humant IgG antistoff.
16. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 15, som omfatter rammeverkregioner (FR-er) H kjede V region og L kjede V region av et humant antistoff.
17. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 16, som omfatter FR-er av H kjede V region og L kjede V region av et humant antistoff, og H kjede C region og L kjede C region av et humant antistoff.
18. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17, som omfatter (a) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; (b) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (c) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:13; (d) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:4; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (e) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:9; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (f) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:9; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (g) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:10; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (h) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:10; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (i) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:11; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (j) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:11; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (k) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8;
(1) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (m) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:13; (n) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:38; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (o) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:39; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; (p) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:3 9; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:12; (q) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:39; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:13; (r) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:39; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (s) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:40; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; (t) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:40; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14; (u) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:41; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:8; eller (v) en antistoff H kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:41; og en antistoff L kjede V region omfattende aminosyresekvensen representert ved SEQ ID NO:14.
19. Antistoffragmentet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 18, hvori antistoffragmentet er en antistoffragment valgt fra Fab, Fab<1>, F(ab')2, et enkel kjede antistoff (scFv), et dimerisert V region fragment (Diabody), et disulfid-stabilisert V region fragment (dsFv) og et peptid omfattende CDR.
20. Det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i krav 27, som er produsert ved en transformant KM8759 (FERM BP-8129) eller KM8760 (FERM BP-8130).
21. Et DNA som koder for det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20.
22. En rekombinant vektor som omfatter DNA-et i samsvar med krav 21.
23. En ikke-human transformant som produserer det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 eller som kan oppnås ved innføring av den rekombinante vektor i samsvar med krav 22 i en vertcelle.
24. Ikke-human transformant som angitt i krav 23, hvori transformanten er KM8759 (FERM BP-8129) eller KM8760 (FERM BP-8130).
25. En fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som er i stand til å produsere det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20, som omfatter dyrking av transformanten i samsvar med krav 23 eller 24 i et medium for å danne og akkumulere det humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav i kulturen; og utvinning av antistoffet eller antistoffragmentet fra kulturen.
26. Et humane CDR-podede antistoff eller antistoffragmentet derav hvori det humane CDR-podede antistoff eller antistoff-fragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 er kjemisk eller genetisk konjugert med en radioisotop, et protein eller et middel.
27. Et medikament som omfatter minst ett valgt fra det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26 som en aktiv bestanddel.
28. Et terapeutisk middel for behandling av CCR4-relaterte sykdommer, som omfatter minst ett valgt fra det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26 som en aktiv bestanddel .
29. Det terapeutiske middel som angitt i krav 28, hvori den CCR4-relaterte sykdom er en cancer eller inflammatoriske sykdommer .
30. Det terapeutiske middel som angitt i krav 29, hvori canceren er en blodcancer.
31. Det terapeutiske middel som angitt i krav 30, hvori blodcanceren er levkemi eller lymfomatose.
32. Det terapeutiske middel som angitt i krav 29, hvori den inflammatorisk sykdom er akutt eller kronisk luftveis-over-følsomhet eller bronkialastma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis.
33. Det terapeutiske middel som angitt i krav 28, hvori den Th2-medierte immunsykdom er kronisk luftveis-overfølsomhets-astma, bronkial astma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis.
34. Et diagnostisk middel for CCR4-relaterte sykdommer eller Th2-medierte immunsykdommer, som omfatter minst ett valgt fra det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26 som en aktiv bestanddel.
35. Det diagnostiske middel som angitt i krav 34, hvori den CCR4-relaterte sykdom er en cancer eller en inflammatorisk sykdom.
36. Det diagnostiske middel som angitt i krav 35, hvori canceren er en blodcancer.
37. Det diagnostiske middel som angitt i krav 35, hvori blodcanceren er levkemi eller lymfomatose.
38. Det diagnostiske middel som angitt i krav 35, hvori den inflammatoriske sykdom er kronisk luftveis-overfølsomhets-astma, bronkial astma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis.
39. Det diagnostiske middel som angitt i krav 34, hvori den Th2-medierte immunsykdom er kronisk luftveis-overfølsomhets-astma, bronkial astma, atopisk hudsykdom, allergisk rhinitt eller pollinosis.
40. En fremgangsmåte for immunologisk påvisning av CCR4 eller en celle som uttrykte CCR4 på celleoverflaten, som anvender det humane CDR-podede antistoff og antistoffragmentet derav som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 20 og 26.
NO20040976A 2001-08-31 2004-03-01 Humane CDR-podede antistoffer og antistoffragmenter derav,DNA,rekombinant vektor,transformant og fremgangsmåte for fremstilling derav,samt terapeutisk og diagnostisk middel, medikament og fremgangsmåte for immunologisk påvisning NO334858B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001265144 2001-08-31
PCT/JP2002/008828 WO2003018635A1 (en) 2001-08-31 2002-08-30 Human cdr-grafted antibodies and antibody fragments thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20040976L NO20040976L (no) 2004-06-01
NO334858B1 true NO334858B1 (no) 2014-06-23

Family

ID=19091652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20040976A NO334858B1 (no) 2001-08-31 2004-03-01 Humane CDR-podede antistoffer og antistoffragmenter derav,DNA,rekombinant vektor,transformant og fremgangsmåte for fremstilling derav,samt terapeutisk og diagnostisk middel, medikament og fremgangsmåte for immunologisk påvisning

Country Status (23)

Country Link
US (8) US7504104B2 (no)
EP (1) EP1449850B9 (no)
JP (1) JP4052515B2 (no)
KR (1) KR100959248B1 (no)
CN (1) CN100430420C (no)
AT (1) ATE490277T1 (no)
AU (1) AU2002338015B8 (no)
BE (1) BE2019C006I2 (no)
BR (1) BRPI0212266B8 (no)
CA (1) CA2458627C (no)
CO (1) CO5560582A2 (no)
CY (2) CY1111193T1 (no)
DE (1) DE60238503D1 (no)
DK (1) DK1449850T3 (no)
ES (1) ES2356190T3 (no)
FR (1) FR19C1028I2 (no)
HK (1) HK1073851A1 (no)
LU (1) LUC00116I2 (no)
MX (1) MXPA04001894A (no)
NL (1) NL300985I2 (no)
NO (1) NO334858B1 (no)
PT (1) PT1449850E (no)
WO (1) WO2003018635A1 (no)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2568899T3 (es) * 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
WO2001064754A1 (fr) * 2000-03-03 2001-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps a recombinaison genique et son fragment
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1491209A4 (en) * 2002-02-28 2006-05-17 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEANS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF INTERSTITIAL PNEUMONIA
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
DK1698640T4 (da) 2003-10-01 2019-09-02 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til stabilisering af antistof og antistofpræparat som stabiliseret opløsning.
AU2004279739A1 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Composition of antibody capable of specifically binding CCR4
WO2005053741A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬
SI1703893T1 (sl) 2003-12-23 2012-07-31 Genentech Inc Nova protitelesa proti il in uporaba le teh
US20060034841A1 (en) * 2004-06-07 2006-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of depleting regulatory T cell
CA2597717C (en) 2005-02-18 2014-10-21 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
WO2007013627A1 (ja) * 2005-07-28 2007-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Bリンパ腫およびホジキンリンパ腫の治療剤
US20080118978A1 (en) 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
GB0718167D0 (en) * 2007-09-18 2007-10-31 Cancer Rec Tech Ltd Cancer marker and therapeutic target
US8962806B2 (en) * 2007-12-28 2015-02-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized monoclonal antibodies and methods of use
JP5552630B2 (ja) * 2008-10-24 2014-07-16 学校法人 聖マリアンナ医科大学 Ｈｔｌｖ−ｉ関連脊髄症を治療または予防するための医薬、およびｈｔｌｖ−ｉ関連脊髄症の患者に対する抗体療法の効果を試験する方法
GB0909906D0 (en) * 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Antibodies
ES2502541T3 (es) 2009-09-10 2014-10-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Medicamento que incluye una composición de anticuerpos unida específicamente al receptor 4 de quimiocina CC humana (CCR4)
CN102863533B (zh) * 2010-06-21 2013-12-11 中国科学技术大学 抗体人源化改造方法
EP2603794A1 (en) 2010-08-10 2013-06-19 Amgen Inc. Dual function in vitro target binding assay for the detection of neutralizing antibodies against target antibodies
GB201020738D0 (en) 2010-12-07 2011-01-19 Affitech Res As Antibodies
US10266599B2 (en) 2010-12-07 2019-04-23 Cancer Research Technology Limited Antibodies which bind to the human CC chemokine receptor 4 and uses thereof
WO2012083132A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
ES2758884T3 (es) 2011-06-24 2020-05-06 Stephen D Gillies Proteínas de fusión de inmunoglobulina a través de cadena ligera y métodos de uso de ellas
BR112015000068A2 (pt) * 2012-07-06 2017-08-08 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd método terapêutico e medicamento para mielopatia associada a htlv-1 (ham)
CA3184564A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising an anti-il13 antibody and residual hamster phospholipase b-like 2
MX2016002799A (es) 2013-09-13 2016-05-26 Genentech Inc Composiciones y metodos para detectar y cuantificar la proteina en la celula hospedera en las lineas de celulas y productos de polipeptidos recombinantes.
KR20170004006A (ko) 2014-05-21 2017-01-10 화이자 인코포레이티드 암을 치료하기 위한 항-ｃｃｒ4 항체 및 4-1ｂｂ 효능제의 조합
AU2016293667A1 (en) 2015-07-14 2018-01-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. A therapeutic agent for a tumor comprising an IDO inhibitor administered in combination with an antibody
AU2017281830B2 (en) 2016-06-20 2023-04-06 Kymab Limited Anti-PD-L1 antibodies
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
CN108250290B (zh) * 2018-02-23 2024-03-12 上海捌加壹医药科技有限公司 Ccr4的n端重组蛋白及其用途
CN116731186B (zh) * 2023-07-07 2023-12-26 武汉爱博泰克生物科技有限公司 抗人IgG-Fc兔单克隆抗体及其制备方法、多核苷酸分子、表达载体和宿主细胞

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042074A1 (en) * 1999-01-15 2000-07-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-ccr4 antibodies and methods of use therefor

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5608039A (en) * 1990-10-12 1997-03-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
US5914110A (en) 1993-09-07 1999-06-22 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders
JPH0853355A (ja) 1994-08-12 1996-02-27 Taisho Pharmaceut Co Ltd Ｉｌ−５産生抑制剤
GB9501683D0 (en) 1995-01-27 1995-03-15 Glaxo Group Ltd Substances and their uses
US6498015B1 (en) 1995-06-07 2002-12-24 Icos Corporation Methods of identifying agents that modulate the binding between MDC and an MDC receptor
CA2205007C (en) 1995-09-11 2010-12-14 Masamichi Koike Antibody against human interleukin-5 receptor .alpha. chain
IL125658A0 (en) 1997-08-18 1999-04-11 Hoffmann La Roche Ccr-3 receptor antagonists
WO1999024024A2 (en) 1997-11-12 1999-05-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of t-helper cell type 2 mediated immune diseases with retinoid antagonists
US6355244B1 (en) 1997-11-17 2002-03-12 University Of Kentucky Research Foundation Methods and compositions for the treatment of psoriasis
MXPA00012770A (es) 1998-06-26 2003-07-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico para crisis hipercalcemica.
US6245332B1 (en) 1999-01-15 2001-06-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of systemic memory T cell trafficking
EP1050307A1 (en) 1999-05-06 2000-11-08 Applied Research Systems ARS Holding N.V. CCR4 antagonists in sepsis
WO2001064754A1 (fr) * 2000-03-03 2001-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps a recombinaison genique et son fragment
WO2005053741A1 (ja) * 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042074A1 (en) * 1999-01-15 2000-07-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-ccr4 antibodies and methods of use therefor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW ET AL., J IMMUNOL 2001, 166:103-111, "C-C chemokine receptor 4 expression defines a major subset of circulating nonintestinal memory T cells of both Th1 and Th2 potential"., Dated: 01.01.0001 *
IMAI ET AL., INT IMMUNOL, 1999, 11:81-88, "Selective recruitment of CCR4-bearing Th2 cells toward antigen-presenting cells by the CC chemokines thymus and activation-regulated chemokine and macrophage-derived chemokine"., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20120177643A1 (en) 2012-07-12
US7842797B2 (en) 2010-11-30
US10131711B2 (en) 2018-11-20
CN100430420C (zh) 2008-11-05
AU2002338015B2 (en) 2008-02-07
AU2002338015B8 (en) 2008-03-20
CY1111193T1 (el) 2015-06-11
US7504104B2 (en) 2009-03-17
CY2019022I1 (el) 2019-11-27
US8143058B2 (en) 2012-03-27
FR19C1028I2 (fr) 2021-02-19
EP1449850B9 (en) 2011-05-11
LUC00116I2 (no) 2019-12-27
WO2003018635A1 (en) 2003-03-06
EP1449850A4 (en) 2005-08-10
US20030175273A1 (en) 2003-09-18
NO20040976L (no) 2004-06-01
ES2356190T3 (es) 2011-04-05
HK1073851A1 (en) 2005-10-21
KR20040044492A (ko) 2004-05-28
US20130273038A1 (en) 2013-10-17
US20180030146A1 (en) 2018-02-01
BR0212266A (pt) 2004-10-19
NL300985I2 (en) 2019-11-21
EP1449850A1 (en) 2004-08-25
BE2019C006I2 (no) 2021-11-22
US20140186349A1 (en) 2014-07-03
JPWO2003018635A1 (ja) 2004-12-09
US20150315285A1 (en) 2015-11-05
US20110059524A1 (en) 2011-03-10
NL300985I1 (en) 2019-05-08
ATE490277T1 (de) 2010-12-15
BRPI0212266B1 (pt) 2020-05-05
CA2458627C (en) 2013-09-10
CY2019022I2 (el) 2019-11-27
US8900584B2 (en) 2014-12-02
CA2458627A1 (en) 2003-03-06
US20090227012A1 (en) 2009-09-10
JP4052515B2 (ja) 2008-02-27
US9051371B2 (en) 2015-06-09
DK1449850T3 (da) 2011-02-14
FR19C1028I1 (no) 2019-05-17
DE60238503D1 (de) 2011-01-13
MXPA04001894A (es) 2005-09-08
EP1449850B1 (en) 2010-12-01
LUC00116I1 (no) 2019-05-02
BRPI0212266B8 (pt) 2021-05-25
CO5560582A2 (es) 2005-09-30
CN1575303A (zh) 2005-02-02
PT1449850E (pt) 2011-02-02
US10590203B2 (en) 2020-03-17
KR100959248B1 (ko) 2010-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10590203B2 (en) Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof
EP3504242B1 (en) Anti-ox40 antibodies and their uses
JP3926153B2 (ja) 遺伝子組換え抗体およびその抗体断片
JP6215707B2 (ja) 抗ｃｃｒ４抗体およびその使用
CN116997571A (zh) 结合ccr9的治疗性结合分子
WO2003072134A1 (fr) Diagnostics et therapeutiques pour la pneumonie interstitielle

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: KYOWA KIRIN CO., JP

MK1K Patent expired