WO2005053741A1 - ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬 - Google Patents

ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬 Download PDF

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Kenya Shitara
Rinpei Niwa
So Ohta
Yuka Sasaki
Junji Kanazawa
Toshihiko Ishii
Shiro Akinaga
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Definitions

  • the present invention relates to a medicine comprising a recombinant antibody specifically binding to human CC chemokine receptor 4 (CCR4) or an antibody fragment thereof, and at least one drug.
  • CCR4 human CC chemokine receptor 4
  • CCR4 Human CC chemokine receptor 4
  • Th2-type CD4 P-helper T cells is a member of the chemokine receptor family [Int. Immunol., 11, 81 (1999)]
  • CCR4 specifically binds to ligands TARC (thymus and activation-regulated chemokine) or MDC (macrophage-derived chemokine).
  • Th2-type CD4-positive helper T cells are regulatory cells in humoral immunity and are thought to play an important role in allergic diseases and autoimmune diseases.
  • T cell lineage leukemia / lymphoma cells express various chemokine receptors and there is a relationship between the T cell leukemia / lymphoma subtype and the type of receptor expressed on the cell. It has been reported that CCR4 is frequently expressed in leukemia / lymphoma cells [Blood, 96, 685 (2 000)]. CCR4 is highly expressed in ALK-positive anaplastic large-cell lymphoma (ALK-positive anaplastic large cell lymphoma) and mycosis fungoides, so it is very specific in certain cancer types. Has been suggested to be a highly selective tumor marker [Blood, 96, 685 (2000), Mod. Pathol., 15, 838 (2002), J. Invest.
  • CTL adult T-cell leukemia
  • human T-cell leukemia virus type 1 human T-cell leukemia virus type 1
  • CTL chronic ⁇ -cell leukemia
  • Anti-HER2 / neu humanized antibody rhuMAb HER2 (Herceptin / trastuzumab, Roche) showed a remarkable effect on breast cancer by combination therapy with taxane-based anti-lj [Clinical Therapeutics, 21, 309 (1999)] .
  • the anti-CD20 human chimeric antibody IDEC-C2B8 (Rituxan / rituximab, IDEC) showed a remarkable effect on B-cell lymphoma when combined with multidrug therapy [J. Clin.
  • Cytokine is a general term for various humoral factors that govern cell-cell interactions in the immune response.
  • Antibody-dependent cytotoxicity (ADCC activity) one of the cytotoxic activities, is caused by the binding of antibodies to effector cells such as monocytes, macrophages, and NK cells. , 138, 1992 (1987)].
  • ADCC activity Antibody-dependent cytotoxicity
  • IL interleukin
  • the anti-CCR4 antibody KM2760 is known as a therapeutic agent that selectively reduces tumor cells via ADCC activity (TO03 / 18635). So far, it has not been known about the combination of anti-CCR4 antibodies with chemotherapeutic agents or cytodynamics.
  • An object of the present invention is to provide a medicine comprising a combination of a recombinant antibody against CCR4 or an antibody fragment thereof and at least one drug.
  • the present invention relates to the following (1) to (26).
  • a pharmaceutical comprising a recombinant antibody or a fragment thereof that specifically binds to human CC chemokine receptor 4 (CCR4), and at least one drug.
  • CCR4 human CC chemokine receptor 4
  • a recombinant antibody or an antibody fragment that specifically binds to the extracellular region of CCR4 is a TCR (thymus and activation—reguated chemokine), a CCR4 peptide, which has fi MDC (macrophag e-derived).
  • TCR thymus and activation—reguated chemokine
  • CCR4 peptide which has fi MDC (macrophag e-derived).
  • the extracellular region is an extracellular region selected from the group consisting of amino acids 1 to 39, 98 to 112, 176 to 206 and 271 to 284 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the medicament according to 8). (10) The medicament according to any one of the above (7) to (9), wherein the extracellular region is an epitope present at positions 2 to 29 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant antibody or the antibody fragment that specifically binds to CCR4 is a peptide comprising the amino acids 13 to 25 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Is characterized in that at least one tyrosine residue has a lower binding ability to a sulfated peptide than to the peptide containing amino acids 13 to 25 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the medicament according to the above (12). is a peptide comprising the amino acids 13 to 25 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Is characterized in that at least one tyrosine residue has a lower binding ability to a sulfated peptide than to the peptide containing amino acids 13 to 25 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • L chain The medicament according to any one of the above (15) to (17), which comprises a V region.
  • a human CDR-grafted antibody comprising a heavy chain (H chain) variable region (V region) and a Z or SEQ ID NO: 18 of an antibody molecule comprising an amino acid sequence represented by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 17;
  • the form of the medicament of the present invention includes a recombinant antibody specifically reacting with CCR or a medicament obtained by combining the antibody fragment and at least one drug; a recombinant antibody specifically reacting with CCR4 Or a drug for administering the antibody fragment in combination with at least one drug, a recombinant antibody specifically reacting with CCR4 or the antibody fragment and at least one drug simultaneously or sequentially. And medicaments for the purpose of administration.
  • the combined medicine refers to separately preparing a recombinant antibody that specifically binds to CCR4 and its antibody fragment and at least one drug, and combining these drugs simultaneously or sequentially. It may be a medicament to be administered in a controlled manner, or may be a mixture in which respective drug components are mixed. The mixture obtained by mixing the respective drug components also includes a recombinant antibody specifically binding to CCR4 and a fusion antibody in which at least one drug is bound to an antibody fragment thereof.
  • the recombinant antibody specifically binding to CCR4 or an antibody fragment thereof (hereinafter sometimes collectively referred to as the antibody of the present invention) in the present invention includes the extracellular region of human CCR4. Recombinant antibodies and antibody fragments thereof that specifically react with the above are mentioned.Recombinant antibodies or antibody fragments that do not show reactivity with human platelets, recombinant antibodies with high ADCC activity or antibodies thereof Fragments and the like are preferred.
  • the expression that the antibody does not show reactivity with human platelets means that the antibody does not substantially react with human platelets, and specifically, that it shows no reactivity as measured by a flow cytometer.
  • the 13th to 25th include antibodies that react specifically.
  • Antibodies of the present invention binding against the peptide containing 13-2 5 th Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, among the peptide comprising 13 to 25 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, ] _ Antibodies with low binding to peptides in which at least one or more tyrosine residues at positions 6, 19, 20 and 22 are sulfated are preferred.
  • the antibody of the present invention is a lectin-resistant cell (W02 / 31140, W003 / 85118, W003 / 85107).
  • transgenic antibody in the present invention examples include a human antibody and a human antibody.
  • humanized antibody examples include a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
  • Human chimeric antibodies are derived from non-human animal ⁇ chain V regions (hereinafter also referred to as HV or VH) and antibody L chain V regions (hereinafter also referred to as LV or VL) and human antibody CH and human antibody CH.
  • An antibody comprising an L chain C region hereinafter, also referred to as CL.
  • any animal can be used as long as a hybridoma can be produced, such as a mouse, a rat, a hamster, and a rabbit.
  • the human chimeric antibody in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody of a non-human animal that specifically reacts with CCR4, and obtaining human antibody CH and human antibody CL.
  • any CH can be used as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg), but IgG of the IgG class is suitable, and ⁇ 1, 72, and Any of subclasses such as ⁇ 3 and ⁇ 4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody those of the ⁇ class or the ⁇ class can be used.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of VH are respectively controlled IJ No. 5
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of VL are respectively SEQ ID No. 8 and Rooster S row.
  • a human chimeric antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, more specifically, the amino acid sequence of VH and VL is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively.
  • the amino acid sequence of the VH is SEQ ID NO: 11
  • the H chain C region is the amino acid sequence of a human antibody IgGl subclass
  • the amino acid sequence of the L chain V region is represented by SEQ ID NO: 12
  • a human chimeric antibody whose sequence and L chain C region are composed of a human antibody ⁇ class amino acid sequence is exemplified.
  • An example is the anti-CCR4 human chimeric antibody KM2760 disclosed in W001 / 64754.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequence of the CDR of VH and VL of an antibody of a non-human animal to an appropriate position of VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention comprises a V region obtained by grafting the amino acid sequence of CDRs of VH and VL of an antibody of a non-human animal that specifically binds to CCR4 to VH of any human antibody and FR of VL.
  • the cDNA encoding the human-type CDR-grafted antibody expression vector was constructed by inserting cDNAs into animal cell expression vectors having DNAs encoding the CH and H chain C regions (hereinafter referred to as CL) of the human antibody. Can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • any method can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • human antibody VH and VL FR amino acids registered in databases such as Puma 'and rotein Data Bank.
  • a common amino acid sequence of each subgroup of FRs of human antibody VH and VL (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
  • the CH of the antibody in the present invention may be any one as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg), but IgG of the IgG class is preferable, and ⁇ 1, ⁇ 2 of the IgG class any of the subclasses such ⁇ ⁇ / 3, y 4 can be used.
  • hlg human immunoglobulin
  • CL of the human CDR-grafted antibody a K-class or CL-class CL can be used as the CL of the human CDR-grafted antibody.
  • the human CDR-grafted antibodies in the present invention include CDR1, CDR2, CDR3 and / or SEQ ID NOs: 8, 9, and 10 of antibody VH comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NOS: 5 , 6, and 7, respectively.
  • CDR1 of VL consisting of the amino acid sequence, CDR2, such as a human CDR-grafted antibody or the antibody fragment comprises a CDR 3 and the like.
  • a human-type CDR-grafted antibody in which the VH of the antibody contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14 and / or the VL of which is represented by SEQ ID NO: 15, and the like. '
  • the VH of the antibody is selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 from Ala at position 40, Gly at position 42, Lys at position 43, Gly at position 44, 'Lys at position 76, and Ala at position 97.
  • a human CDR-grafted antibody comprising an amino acid sequence in which at least one or more amino acid residues are replaced with another amino acid residue;
  • VH1 of an antibody Human-type CDR graft containing an amino acid sequence in which at least one amino acid residue is replaced with at least one of Thr at position 28 and Ala at position 97 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 f geometry,
  • VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, Ala at position 40, Gly at position 42, Lys at position 43, Gly at position 44, Lys at position 76, and Ala at position 97, and the antibody Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 has at least one amino acid residue selected from the second Ile, the third Val, the 50th Gln, and the 88th Val
  • a human CDR-grafted antibody comprising an amino acid sequence substituted with an amino acid residue of
  • VH force of antibody Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, Thr at position 28 and Ala at position 97, and VL of the antibody are the second Ile and third A human CDR-grafted antibody comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Val, Gln at position 50, and Val at position 88 has been replaced with another amino acid residue;
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) force of the antibody contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 17, and the light chain (L chain) V region of the antibody molecule is SEQ ID NO: 18 And a human CDR-grafted antibody containing an amino acid sequence represented by
  • amino acid sequences antibodies or antibody fragments in which one or more amino acids are deleted, forced, substituted or inserted, and which specifically reacts with CCR4 are also included in the scope of the present invention.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence according to the present invention means that one or more amino acids at any and one or more positions in the same amino acid sequence in the same sequence
  • Deletion, substitution, insertion or addition of a residue means that deletion, substitution, insertion or addition may occur at the same time, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added may be natural or non-natural. Regardless of the type.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-asparaginic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-pheninolealanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A leucine, isoleucine, nonorleucine, / phosphorus, nonorenoline, alanine, 2-aminoptanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-ptynoreglysine, t-ptynoleranine,, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, gnoretamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ortin, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G pheninoleanine, tyrosine.
  • human CDR-grafted antibody examples include a human CDR-grafted antibody described in 003/18635, and a human-type CDR prepared from the monoclonal antibody 1G1, 2B10 or 10E4 described in W000 / 42074.
  • Human antibody originally means an antibody naturally occurring in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody phage library produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Antibodies obtained from antibody-producing transgenic animals are also included.
  • Antibodies that are naturally present in the human body can be cultured, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting them with an EB virus, etc., immortalizing them, and cloning the cells to produce the antibody-producing lymphocytes.
  • the antibody can be purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene.
  • a library into which mutations have been artificially introduced can be used.
  • phages having the desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted to a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by a protein engineering technique.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse produced by introducing a mouse antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and then developing the mouse can be mentioned.
  • Human antibodies are produced from transgenic animals producing human antibodies.Hybridoma producing human antibodies is obtained by the usual method for producing hybridomas by cell fusion, and human antibodies are produced in culture by culturing. Can be accumulated.
  • transgenic non-human animals examples include porcupines, sheep, goats, stags, pomas, mice, rats, birds, monkeys, and egrets.
  • Antibody fragments in the present invention include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, Diabody, dsFv, and peptides containing CDRs.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with the protease, papain (which is cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain). About half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfides. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, which is bound by bonding (SS bond).
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating the human CDR-grafted antibody specifically reacting with CCR4 of the present invention with proteolytic enzyme papain.
  • DNA encoding the antibody Fab is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and the vector is expressed by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce a Fab. be able to.
  • F (ab ') 2 is a fragment obtained by processing IgG with protein enzyme pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of H chain). It is an antibody fragment having a molecular weight of about 100,000 and having an antigen-binding activity, which is slightly larger than that bound through the chain.
  • the F (ab ') 2 in this effort can be obtained by treating the human CDR-grafted antibody specifically reacting with CCR4 of the present invention with the protease pepsin. Alternatively, it can be prepared by bonding the following Fab ′ to a thioether bond or an SS bond.
  • Fab ' is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, in which the SS bond of the hinge region of F (ab') 2 is cleaved.
  • Fab ′ in the present invention can be obtained by treating F (a) 2 that specifically binds to CCR4 of the present invention with a dithiothreitol reducing agent.
  • a DM coding for Fab ′ of a human CDR-grafted antibody that specifically reacts with CCR4 is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and the vector is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector. It can be expressed and produced by introduction into living organisms.
  • the scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polysaccharide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (P) having 12 or more residues.
  • a peptide is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • the scFv of the present invention is obtained by obtaining a cDNA encoding VH and VL of a human CDR-grafted antibody that specifically binds to CCR4, constructing a DNA encoding the scFv, and converting the DNA into a prokaryotic expression vector. Alternatively, it can be produced by inserting it into a eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote to express.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFvs having the same or different antigen-binding specificities form a dimer, and have a bivalent antigen-binding activity for the same antigen or a bispecific antigen-binding activity for a different antigen.
  • the Diabody of the present invention is, for example, a bivalent Diabody that specifically binds to CCR4.A cDNA encoding VH and VL of a human CDR-grafted antibody that specifically binds to CCR4 of the present invention is obtained.
  • a DNA encoding a scFv having a 10-residue polypeptide linker is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the protruding vector is converted to a prokaryotic or Diabodies can be generated and produced by introducing them into eukaryotes.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue, and the polypeptide is linked via an SS bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
  • the dsFv of the present invention is obtained by obtaining a cDNA encoding VH and VL of a human CDR-grafted antibody that specifically binds to CCR4, constructing a dsFv-encoding DNA, and using the DNA as a prokaryotic expression vector.
  • it can be produced by introducing it into a eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote.
  • the peptide containing the CDR comprises at least one region of CDR of VH or VL.
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be produced directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing the CDR according to the present invention is constructed by constructing cDNA encoding the CDRs of VH and VL of a human CDR-grafted antibody that specifically binds to CCR4, and expressing the cDNA in a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector.
  • the expression vector can be expressed and produced by inserting the vector into a prokaryote or eukaryote.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (full-year reninolemethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and the like.
  • Examples of the drug used in the present invention include a protein and a low-molecular drug.
  • proteins include cytodynamics and antibodies. '
  • cytokine examples include cytokines that activate effector cells such as NK cells, macrophages, monocytes, and granulocytes, which are immunocompetent cells, and derivatives of the cytokines.
  • Specific sites include interleukin-2 (IL-2), IFN-a, IFN_y, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, fractalkine, M-CSF, GM — CSF, G_CSF, TNF—a, TNF-] 3, IL-1a, IL-1 and the like.
  • the antibody examples include an antibody specifically reacting with a T cell surface marker, an antibody fragment or a fusion antibody.
  • Specific antibodies anti-CD 3 antibody (Orthoclone, Inc.), anti-CD4 antibody, anti-CD5 antibody, anti-CD8 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD25 antibody (Zenapax, Hoffmann La Roche, Inc.), anti CD52 antibody (Campath, Ilex Oncology) and the like.
  • the low-molecular-weight drugs used in the present invention include amifostine (ethiol), cisplatin, cisplatin, dacarbazine (DTIC), dacarbazine (DTIC), dactinomycin, metalloletamine (nitrotro).
  • Gen mustard [tnechlore thamine U itrogen mustard)], streptozocin; cyclophosphamide, carmustine (BCNU) [carmustine (BCU)], oral mucin (CCNU) [lomustine (CCNU) ], Doxorubicin (adriamycin), PT / JP2004 / 018430 Doxorubicin lipo (doxil) [doxorubicin lipo (doxil)], gemcitabine (gemza-in-no-re) [gemcitabine (gemzar)], tauno-no-rubicin, dauno-no-rub [in] , Daunoxome saw, procananol procarbazine, mitomacin (mitomycin), cytarabine (cytarabine), etoposide, etoposide, methotrexate, 5-fluorouracil, vinblastine vinblastin e), vincristine (vincristine), ble
  • Testolactone thioguaninej, thiotepa, uracil mustard, uracil mustard, vinorelbine, chlorambucil, prednisolone, prednisolone Musfitin (n imstine), semustin (semustin), capecitabine (capecitabine), tomtex (tomud ex), azacitidine (azacytidine), UFT, oxaloplatin (oxaloplatin), gefitinib (Iresa) [gefitinib (Isa) STI571) [iraatinib (STI571)], amsacrine, all-trans retinoic acid, saji K-thalidomide, bexarotene (targretin), dexamethasone (Dexamethasone), anasto mouth sol (alimidex) [anastnizole ( Alimidex)], leuplin or combinations thereof, preferably vincristine, o
  • the above drugs may cause side effects when administered alone in a single dose in vivo.
  • the above-mentioned drugs can be used at low doses by combining with a recombinant gene, an antibody or an antibody fragment thereof that specifically binds to CCR4. Therefore, side effects can be reduced in addition to a sufficient therapeutic effect.
  • tumor cells are preferred.
  • tumors include hematopoietic tumors.
  • Hematopoietic tumors include acute leukemia, chronic leukemia, Hodgkin's disease, and non-Hodgkin's disease.
  • - Acute leukemia includes acute lymphocytic leukemia, etc.
  • Acute lymphocytic leukemia includes precursor T-cell acute lymphocytic leukemia.
  • Chronic leukemia includes chronic lymphocytic leukemia.
  • Chronic lymphocytic leukemia includes T-cell type chronic lymphocytic leukemia, T-cell prolymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia lymphoma (ATL), Sezary's syndrome And so on.
  • Non-Hodgkin's disease includes T / NK cell lymphoma, and T / NK cell lymphoma includes precursor T lymphoblastic lymphoma / leukemia and mature T cell tumor. '
  • Mature T-cell tumors include T-cell prolymphocytic leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, Sezari's syndrome, mycosis fungoides, primary undifferentiated large cell lymphoma of the skin, subcutaneous cellulitis-like T Cell lymphoma, Enteropathic intestinal T-cell lymphoma, Hepatosplenic y-cell lymphoma, Angioimmunoblast-type ⁇ -cell lymphoma, Peripheral ⁇ -cell lymphoma, Undifferentiated large-cell lymphoma, Adult ⁇ Cell leukemia / lymphoma And so on.
  • the effect of the medicament of the present invention can be examined by an in vitro cytotoxicity assay system.
  • An example of an in vitro cytotoxicity assay system is an ADCC activity assay system.
  • ADCC activity is measured in the presence of the antibody by targeting target cells expressing the antigen CCR4 and effector cells such as peripheral blood mononuclear cells, monocytes, macrophages, and granulocytes collected from humans or other animals. It can be measured by contacting, detecting the degree of the target cell that has been damaged, and quantifying it.
  • the degree of damaged target cells can be detected by a 51 Cr release method, a method of detecting the enzyme activity of the target cells, a detection method using a flow cytometer, or the like.
  • the effect of the drug of the present invention on the ADCC activity measurement system is determined by the ability to add the drug to the ADCC activity measurement system or the exposure of these drugs to target cells, efata cells, or both in advance for a certain period of time, to ADCC activity. It can be measured by observing the effect.
  • the effect of the medicament of the present invention can also be examined by measuring in vivo antitumor activity using an animal model.
  • xenograft models in which cultured cell lines derived from human cancer tissues are transplanted into immunodeficient mice such as nude mice, and syngeneic transplant models in which cultured mouse cancer cell lines are transplanted into wild-type mice having a normal immune system And so on.
  • Xenograft models can be prepared by implanting human cancer cell lines into various sites such as subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, and intravenous sites of immunodeficient mice such as nude mice.
  • the syngeneic transplant model for the evaluation of the drug of the present invention is a method for producing a CCR4-positive transformant by introducing a CCR44 gene into a mouse cell line such as an EL4 cell, and transforming the transformant into a normal immune cell line. It can be produced by transplanting the wild type mouse having the strain into various sites.
  • the effect of the pharmaceutical of the present invention can be evaluated by comparing the effects of the single administration of the antibody and the pharmaceutical alone with the effect of the pharmaceutical of the present invention using the above animal model.
  • the medicament of the present invention can be administered alone, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and any of the well-known drugs well known in the technical field of pharmaceutics is used. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by the method. It is desirable to use the most effective route for treatment, including oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous administration. In the case of a protein preparation, intravenous administration can be preferably used.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-hydroxybenzoate. It can be manufactured using preservatives such as acid esters, strawberry flavor, and flavors such as ⁇ ⁇ permint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, Polyviel It can be produced using a binder such as alcohol, hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the complex is prepared using a salt solution, a pudose solution, or a carrier comprising a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as lactic acid, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the medicament itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and that disperses the medicament as fine particles to facilitate absorption. '
  • carrier examples include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders can be made depending on the nature of the drug and the carrier used. In these parenteral preparations, the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 0.1 to 20 mg / kg as the amount of antibody per adult dose.
  • the drug used in combination with the antibody will be at or below the dose used in clinical practice alone.
  • FIG. 1 shows the effect of cytokines on the cytotoxic activity of anti-CCR4 antibody.
  • the vertical axis represents cytotoxic activity.
  • Gardens show cytotoxicity when cytokines are not added, mouth shows cytotoxicity when IL-2 is added, and hatched lines show cytotoxicity when IL-15 is added. Bars indicate standard deviation.
  • FIG. 2 shows the combined effect of anti-CCR4 antibody and pinklistin on CCRF-CEM cells transplanted into nude mice.
  • the vertical axis represents the value of V / V0.
  • the mouth indicates the V / V0 value of the negative control group
  • the shaded line indicates the KM2760 administration group
  • the gray indicates the vincristine administration group
  • the garden indicates the V / V0 value of the KM2760 and vincristine combination administration group. Bars indicate standard deviation.
  • FIG. 3 shows the combined effect of an anti-CCR4 antibody and cyclophosphamide on CCRF-CEM cells transplanted into nude mice.
  • the vertical axis represents the value of V / V0.
  • Mouth is negative control group
  • hatched area is thigh 27eo administration group
  • gray 04 018430 shows cyclophosphamide off ami de administration group, ⁇ the KM2 7 60 and cyclophosphamide off ami de of the value of (V / V0) for the combination arm, respectively.
  • Bars * represent standard deviation.
  • FIG. 4 shows the combined effect of an anti-CCR4 antibody and etoposide on CCRF-CEM cells transplanted into nude mice.
  • the vertical axis represents the value of V / V0.
  • Mouth shows the negative control group, hatching KM2 7 60 administration group, gray Etoposhi de administration group, ⁇ is the value of (V / V0) for the combination arm of KM2760 and etoposide, respectively. Bars indicate standard deviation. ⁇
  • FIG. 5 shows the combined effect of an anti-CCR4 antibody and methotrexate on CCRF-CEM cells transplanted into nude mice.
  • the vertical axis represents the value of V / V0.
  • the mouth indicates the negative control group
  • the shaded lines indicate the KM2760 administration group
  • the gray indicates the methotrexate administration group
  • the country indicates the V / V0 value of the KM2760 and methotrexate combination administration group. Bars indicate standard deviation.
  • FIG. 6 shows the combined effect of an anti-CCR4 antibody and G-CSF on CCR4 / EL4 cells transplanted into C57BL / 6 mice.
  • the horizontal axis represents the number of days after tumor implantation, and the vertical axis represents the tumor volume.
  • X indicates the negative control group
  • ⁇ indicates the KM 2760 alone group
  • Hata indicates the G-CSF alone
  • the mouth indicates the combination group. Par indicates standard deviation.
  • FIG. 7 shows the combined effect of an anti-CCR4 antibody and IFN-a on CCR4 / EL4 cells transplanted into C57BL / 6 mice.
  • the vertical axis represents the liver weight ratio. Bars indicate standard deviation.
  • the effecta single cell solution obtained in the above (a) was dispensed at 50 / i L into a 96-well U-bottom plate (Falcon).
  • a 2 ng / mL IL-2 ( ⁇ Protech) solution diluted with RPMIIMO-FCS (5) medium, a 2ng / mL IL-15 ( ⁇ Protech) solution, and a negative control without cytokine 50 RPMI 1640-FCS (5) was added to another sample, and left to stand in a 5% CO 2 incubator for 3 days.
  • G418 were cultured in (Nacalai Tesque) was 0. 5 mg / mL comprising at RPMI 1640-FCS (10) medium [a FCS containing 10% R PMI1640 medium (manufactured GIBC0 BR and Co.), a mouse thymoma cell line Centrifugation and suspension of CCR4 / EL4 cells (W001 / 64754), tumor cells, which are transformants with the human CCR4 gene introduced into EL4 After washing with RPMI1640-FCS (5) medium, the concentration was adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / mL with RPMIIMO-FCS (5) medium to obtain a target cell solution.
  • RPMI 1640-FCS (10) medium a FCS containing 10% R PMI1640 medium (manufactured GIBC0 BR and Co.), a mouse thymoma cell line Centrifugation and suspension of CCR4 / EL4 cells (W001 / 64754), tumor cells
  • the results are shown in FIG.
  • the cytotoxic activity of KM2760 increased in a concentration-dependent manner. In addition, it increased further due to the addition of site force-in. This result indicates that the cytotoxic activity of the anti-CCR4 antibody is enhanced by cytokines that activate effecta cells.
  • CCRF - CEM cells human T cell leukemia cell line
  • RPMI1640 medium Gibco BRL
  • the suspension 100 M L Balb / c nude mice CLA Japan, male
  • the diameter of the tumor was measured with a caliper, and the tumor volume was calculated by the following formula.
  • Tumor volume minor axis X minor axis X major axis X 0.5
  • the experiment was performed with 5 animals in each group. Each drug was diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) and administered via the tail vein. The tumor volume was measured on DaylO, and the antitumor effect was determined by comparing the average value of the change in tumor volume (V / V0) of DaylO when the tumor volume of DayO in each group was V0.
  • V / V0 in each group is shown in FIG.
  • the combined administration of KM2760 and VCR showed a higher level of growth inhibition effect than VCR alone or antibody alone.
  • Table 1 shows the value (T / C) obtained by dividing V / V0 of each group by V / V0 of the negative control group. Compared to the theoretical value of T / C when the efficacy of both KM2760 and VCR was simply added, that is, the value obtained by multiplying the T / C of each drug alone group, the T / C of the actual combination group (Table In C), the value (0.11) was lower than the theoretical value of 0.21 in DaylO. Part 1:
  • CCRF-CEM cells human T-cell leukemia cell line
  • RPMI1640 medium Gibco BRL
  • mice mice were implanted intradermally on the ventral side.
  • the diameter of the tumor was measured with calipers, and the tumor volume was calculated by the formula 2 in Example 2.
  • Tumor volume were selected individuals within the 116 ⁇ 349 mm 3 (average 219 mm 3), after divided into groups such that the average tumor volume became homogeneous, was administered each agent A ⁇ D below to mice .
  • the day of grouping was designated as DayO.
  • KM2760 + CPA combination group CPA was administered to DayO at 65 mg / kg per animal and KM2760 was administered to DayO and Day4 at 800 ⁇ g per animal.
  • the experiment was performed with 5 animals in each group. Each drug was diluted with physiological saline '(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) and administered through the tail vein. The tumor volume was measured on Day 4, and the antitumor effect was determined by comparing the average value of tumor volume change (V / V0) on each measurement day when the tumor volume on Day O of each group was V0. I got it.
  • Fig. 3 shows the daily changes in the average value of V / V0 in each group.
  • Table 2 shows the value (T / C) obtained by dividing the V / VO of each group by the V / VO of the negative control group. Thigh 2 ⁇ 6 0, CPA theoretical value of T / C when the drug efficacy is simply added in both drugs, i.e. as compared with the value obtained by multiplying the T / C of each drug alone group, the actual combination group T
  • the value of / C (the value of D in the table) was lower (0.35) than the theoretical value of 0.39.
  • CCRF-CEM cells human T cell leukemia cell line
  • RPMI1640 ′ medium Gibco BRL
  • 100 / x L of the suspension was transferred to Balb / c nude mice (CLEA Japan, Inc.). (Male).
  • the diameter of the tumor was measured with calipers, and the tumor volume was calculated by the formula 2 in Example 2.
  • Tumor volume were selected individuals within the 121-348 negation 3 (average 195 mm 3), after divided into groups such that the average tumor volume became homogeneous, was administered each agent A ⁇ D below to mice .
  • the day of grouping was designated as DayO. ,
  • Etoposide (hereinafter VP-16; Lastet Injection, Nippon Kayaku Co., Ltd.) Single group: 10 mg / kg per animal for 5 days from DayO to Day4.
  • KM2760 + VP-16 combination group VP-16 was administered at 10 mg / kg per animal for 5 days from DayO to Day4, and KM2760 was administered at 800 g per animal for DayO and Day4.
  • the experiment was performed with 5 animals in each group. Each drug was diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) and administered via the tail vein. The tumor volume was measured on Day 7, and the antitumor effect was determined by comparing the average value of the tumor volume change (V / V0) on Day 7 when the tumor volume on Day O of each group was V0.
  • V / V0 in each group is shown in FIG.
  • the combined administration of KM2760 and VP-16 showed a higher growth inhibitory effect than VP-16 alone or the antibody alone.
  • Table 3 shows the value (T / C) obtained by dividing V / V0 of each group by V / V0 of the negative control group. Compared to the theoretical value of T / C when the efficacy of both KM2760 and VP-16 drugs are simply added, that is, the value obtained by multiplying the T / C of each drug alone group, the T / C of the actual combination group (Value of D in the table) was lower (0.38) than the theoretical value of 0.46. Table 3 '''
  • CCRF-CEM cells human T-cell leukemia cell line
  • RPMI1640 medium Gibco BRL
  • 100 / z L of the suspension was added to Balb / c nude mice (CLEA Japan, Inc.). (Male).
  • the diameter of the tumor was measured with a caliper, and the tumor volume was calculated by the formula 2.
  • Individuals with a tumor volume in the range of 121 to 348 mm 3 were selected, grouped so that the average tumor volume was uniform, and then the following drugs A to D were administered to mice .
  • the day of grouping was designated as DayO.
  • KM2760 alone group DayO and Day4 were administered 800 per animal.
  • C. methotrexate (hereinafter referred to as MTX; Methotrexate II solution, Nippon Weis Ledery Co., Ltd.)
  • MTX methotrexate II solution, Nippon Weis Ledery Co., Ltd.
  • Single group Administered 15 mg / kg per animal for 5 days from DayO to Day4.
  • KM2760 + MTX combination group MTX was administered at 15 mg / kg N KM2760 per animal for 5 days from DayO to Day4, 800 ⁇ g per animal for DayO and Day4, respectively.
  • the experiment was performed with 5 animals in each group. Each drug was diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) and administered via the tail vein. The tumor volume was measured on Day 7, and the antitumor effect was determined by comparing the average value of the change in tumor volume (V / V0) when the tumor volume of DayO in each group was V0.
  • physiological saline Otsuka Pharmaceutical
  • Fig. 5 shows the change over time in the average value of V / V0 in each group. As shown in FIG. 5, the combined administration of KM2760 and MTX showed a higher growth inhibitory effect than MTX alone or the antibody alone.
  • Table 4 shows the value (T / C) obtained by dividing V / V0 of each group by V / V0 of the negative control group. Compared to the theoretical value of T / C when the efficacy of both KM2760 and MTX drugs were simply added, that is, the value obtained by multiplying the T / C of each drug alone group, the T / C of the actual combination group (No. the value of D in table 4) were shown a lower value than the theoretical value 0.0 4 (0.01).
  • CCR4 / EL4 cells (W001 / 6 47 5 4) were suspended in RPMI1640 medium (Gibco BRL) at 1 X 10 e number / mL, the suspension was ⁇ ⁇ ⁇ C 5 7BL / 6 mice (CLEA Japan, male , 8 weeks old). further After grouping into A to D, each drug was administered to each mouse. The day when the tumor was implanted was designated as Day0.
  • G-CSF alone group G-CSF (Noup 100, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) was administered once daily for 10 days from 4 days before tumor implantation (hereinafter referred to as Day-4) to Day 5 .
  • 10 g was subcutaneously administered per animal. The administration site is near the hind limb on the right flank, which does not overlap with the tumor implantation site.
  • KM2760 + G-CSF combination group KM2760 is administered intravenously once daily on DayO and Day4 at 100 g per animal, and G-CSF is administered once daily for 10 days from Day-4 to Day5 Each animal was subcutaneously administered at 10 / g. The administration site is near the hind limb on the right flank, which does not overlap with the tumor implantation site.
  • the experiment was performed with 10 mice in group A and 7 mice in each of groups B, C and D.
  • KM2760 was diluted with citrate buffer (10 mM citrate, 150 mM sodium chloride, pH 6), and G-CSF was diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) and administered at 100 / L each.
  • Tumor diameter was measured with a vernier caliper from Day O of each group, and the tumor volume was calculated by the formula shown in Formula 2 of Example 2.
  • FIG. 6 shows the change over time in the average value of the tumor volume in each group. As shown in FIG. 6, although weak antitumor effects were observed in untreated group A in groups B and C, marked antitumor effects were observed in group D.
  • Table 5 shows the T / C values on the last day of the evaluation.
  • T / C value the ratio of the average value of the tumor volume of each group to the average value of the tumor volume of the group A on the last day of the evaluation (Dayl4). In order to perform the calculation, it was calculated according to the following Equation 3.
  • T / C value (Average tumor volume of each group on Day 4 ) / (Average tumor volume of A group on Day 4 )
  • T / C value 1. 0 0.48 0.63 0.10 0.30
  • CCR4 / EL4 cells were suspended at 5 ⁇ 10 5 cells / mL in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco BRL), and 100 ⁇ l of the suspension was injected into the tail vein of a C57BL / 6 mouse (CLEA Japan, male, 8 weeks old). Transplanted within. After further dividing the mice into groups A to D, each mouse is assigned a group A to! ) Were administered. The day on which the tumor was transplanted was designated as Day 0.
  • Negative control group not administered
  • IFN-o single group: IFN- ⁇ (Universal type I interferon, manufactured by PBL Biomedical Laboratories) was intravenously administered 5x10 4 units per animal once a day for 5 days from Dayl to Day5 Was administered internally.
  • the so-called 2760 alone group The thigh 2760 was intravenously administered once daily on Day 1 and Day 5 at 0.5 / z g per animal.
  • KM2760 + IFN- ⁇ combination group KM2760 is intravenously administered once daily to Dayl and Day5 at 0.5 g per animal, and IFN-a is administered once daily for 5 days from Dayl to Day5 Each animal was intravenously administered at 5 ⁇ 10 units.
  • mice were weighed, anesthetized with ether and exsanguinated, euthanized by cervical dislocation, the liver was excised, the liver was weighed, and the ratio of liver weight to body weight of each individual , Liver weight ratio) was calculated as a percentage.
  • FIG. 7 shows the liver weight ratio of each group. As shown in FIG. 7, although a weak antitumor effect was observed in the untreated group ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in the group ⁇ ⁇ ⁇ and the group C, a remarkable antitumor effect was observed in the group D.
  • T / C (average of liver weight ratio of each group-average of untreated mouse liver weight ratio) I (average of liver weight ratio of negative control group-average of untreated mouse liver weight ratio)
  • Table 6 shows the T / C values. Compared to the theoretical value of the T / C value when the efficacy of both KM2760 and IFN- ⁇ drugs were simply added, that is, the value obtained by multiplying the T / C value of each drug alone group, / C value (C in the table) showed lower values than 0.25 which is the theoretical value (0.0 88).
  • T / C value 1.0.0 0.48 0.52 0.088 0.25
  • CCR4 / EL4 cells (W001 / 64754) were suspended at 1 ⁇ 10 5 cells / mL in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco BRL), and 200 / zL of the suspension was transferred to C57BL / 6 mice (Clear Japan, male, 8 (Week-old). After further grouping into the following A to D, each of the drugs A to D was administered to each mouse. The day when the sever was transplanted was designated as DayO. '
  • M-CSF alone group M-CSF (leukoprol, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) twice daily from Day_3 to Day-1, twice daily for DayO, 7 times in total, 100 ⁇ / animal g was administered intraperitoneally.
  • T / JP2004 / 018430 M-CSF (leukoprol, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) twice daily from Day_3 to Day-1, twice daily for DayO, 7 times in total, 100 ⁇ / animal g was administered intraperitoneally.
  • KM2760 alone group KM2760 was intraperitoneally administered to DayO once a day at 50 ⁇ g per animal.
  • KM2760 + M-CSF combination group Administer KM2760 intraperitoneally once daily on DayO, 50 g per animal twice daily from Day-3 to Day-1 twice daily on DayO A total of seven doses were administered intraperitoneally at 100 ⁇ g per animal.
  • Each agent KM27 6 0 is Kuen acid buffer (10 mM Kuen acid, l mM sodium chloride, pH 6), M-CSF was diluted prepared with saline (Otsuka Pharmaceutical) was administered by 100 L.
  • the evaluation of the antitumor effect was performed by the ratio of the average value of the survival days of the mice in each group to the average value of the survival days of the negative control group (hereinafter referred to as the survival rate).
  • Table 7 shows the survival days of each mouse and the survival rate of each group.
  • a medicine comprising a combination of a recombinant antibody or a fragment thereof specifically binding to human CC chemokine receptor 4 (CCR4) and at least one drug.
  • CCR4 human CC chemokine receptor 4

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Abstract

ヒトCCケモカイン受容体４に対する遺伝子組換え抗体あるいはその抗体断片、または薬剤のいずれかの単独投与よりも高い治療効果を与える医薬を提供する。

Description

,
明細書
ケモカイン受容体 CCR4に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬 技術分野
本発明は、 ヒ ト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または 該抗体断片と、 少なく とも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬に関する。
背景技術
ケモカイン受容体にリガンドが結合すると、 白血球の遊走が誘導される。 正常組織において 主として Th2型の CD4 P易性ヘルパー T細胞上に発現しているヒト CCケモカイン受容体 4 (以下 CCR4と称する）はケモカイン受容体ファミリーの一種である [Int. Immunol. , 11, 81 (1999) ] , CCR4はリガンドである TARC (thymus and activation-regulated chemokine) または MDC (mac rophage- derived chemokine) と特異的に結合する。 Th2型の CD4陽性ヘルパー T細胞は液性免 疫における制御細胞であり、 ァレルギ一や自己免疫疾患において重要な役割を果たしていると 考えられている。
T細胞系統の白血病/リンパ腫細胞では、 種々のケモカイン受容体が発現しており、 T細胞白 血病/リンパ腫のサプタイプと細胞で発現される受容体の種類との間には関連がある。 白血病/ リンパ腫細胞において CCR4は高い頻度で発現していることが報告された [Blood, 96, 685 (2 000) ] 。 CCR4は ALK-陽性異型性大細胞リンパ腫 （ALK-positive anaplastic large-cell lymp homa) 、菌状息肉症細胞 （mycosis fungoides) で高頻度に発現しているので、特定の癌種にお いては非常に選択性の高い腫瘍マーカーとなりうる可能性が示唆された [Blood, 96, 685 (20 00)、 Mod. Pathol. , 15, 838 (2002)、 J. Invest. Dermatol. , 119， 1405 (2002) ]。 またヒト T細胞性白血病ウイノレス 1型（human T - cell leukemiavirus type 1) の感染が原因である成人 T細胞性白血病（以下 ATLと称す； adult T-cell leukemia)でも、 CCR4が非常に高い頻度で発 現していることが報告された [Blood, 99, 1505 (2002) ] 。 また、 ATLにおける CCR4発現に関 しては、 CCR4の発現は予後不良と有意に相関する [Clin. Cancer Res. , 9, 3625 (2003) ] 。 さらに慢性 Τ細胞性白血病 （以下 CTLと称す； cutaneous T cell lymphoma) の細胞でも CCR4 は選択的に発現している [J. Invest. Dermatol. , 119， 1405 (2002) ] 。
白血病/リンノ、。腫に対する主な治療法は、複数の低分子抗癌剤の組み合わせを中心とした化学 療法である。 しかしながら、 これまでに充分な治療効果が得られる化学療法は知られていない [癌と化学療法、 26， Supplement I, 165-172， （1999) ] 。
上記の CCR4陽性.の白血病/リンパ腫の中でも、 特に ATLの予後が不良である。 通常行われて いる CHOP療法 (cyclophosphamide^ vincristine^ doxorubicin^ prednisoneの併用療法) 行なった ATL全体の 7割以上を占める急性型あるいはリンパ腫型患者のうち、 4年生存率は 5 % 程度である [British J. Haematol. , 79, 428-437 (1991) ] 。
通常の化学療法では、 薬剤耐性腫瘍細胞の出現などにより寛解を導入することが難し Vヽ場合 があるが、化学療法と抗体との併用により優れた治療成績が得られる場合がある。抗 HER2/neu ヒト化抗体 rhuMAb HER2 (Herceptin/trastuzumab, Roche社） は taxane系抗癀斉 ljとの併用療法 により乳癌に対して顕著な効果を示した [Clinical Therapeutics, 21, 309 (1999) ]。 また、 抗 CD20ヒト型キメラ抗体 IDEC- C2B8 (Rituxan/rituximab, IDEC社） は多剤療法との併用療法 により B細胞リンパ腫に対して顕著な効果を示した [J. Clin. Oncol. , 17, 268 (1999) ] 。 抗体とサイトカインとを用いる併用療法も腫瘍に対する新たな免疫療法として期待されてい る。 サイト力インは免疫反応における細胞間相互作用を司る種々の液性因子の総称である。 細 胞障害活性の一つである抗体依存性細胞障害活性（以下 ADCC活性と称す） は、 単核球、 マクロ ファージ、 NK細胞などのエフェクター細胞に抗体が結合することにより引き起こされる LJ. I mmunol. , 138, 1992 (1987) ]。サイト力インはエフェクター細胞を活性ィ匕する目的で、抗体と サイトカインを組み合わせて用いる併用療法が試みられている。 B細胞系の白血病/リンパ腫に 対しては、 IDEC-C2B8とインターロイキン （IL) _2 [British J. Haematol. , 117， 828—834 (2 002) ] 、 あるいは IDEC- (2Β8と顆粒球コロニー刺激因子 [Leukemia, 17, 1658-1664 (2003) ] との併用投与の臨床試験が行われているが、 抗体を単独で使用した場合と比較して顕著な治療 効果は認められていない。
上記の CCR4 P易性の.白血病/リンパ腫に対し、抗 CCR4抗体 KM2760は、 ADCC活性を介して選択 的に腫瘍細胞を減少させる治療薬として知られている （TO03/18635)。 これまでに抗 CCR4抗体 と化学療法剤またはサイト力インとの併用については知られていなレ、。
癌、 特に白血病 · リンパ腫の治療において、 十分な効果を奏する治療方法はこれまでに知ら れていない。
発明の開示
本発明の目的は、 CCR4に対する遺伝子組換え抗体またはその抗体断片と、少なくとも 1種類 の薬剤とを組み合わせてなる医薬を提供することにある。
本発明は以下の （1 ) 〜 （2 6 ) に関する。
( 1 ) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該 抗体断片と、 少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬。
( 2 ) CCR に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、 少なくとも 1種類 の薬剤とを併用して投与するための医薬。 '
( 3 ) CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、 少なくとも 1種類 の薬剤とを同時に又は逐次的に投与するための医薬。
( 4 ) 医薬が、 抗腫瘍剤であることを特徴とする上記 ( 1 ) 〜 （3 ) のいずれか 1項に記 載の医薬。
( 5 ) 腫瘍が CCR4を発現している B重瘍である上記 （4 ) に記載の医薬。
( 6 ) CCR4が発現している腫瘍が造血器腫瘍である上記 ( 5 ) に記載の医薬。
( 7 ) CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片力 CCR4の細胞外領域 に特異的に結合し、 ヒト血小板に反応性を示さない抗体である上記 （1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載の医薬。
( 8 ) CCR4の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、 CCR4 リ刀ンドである TARC (thymus and activation—regu丄 ated chemokine) 7こ fi MDC (macrophag e - derived chemokine) の CCR4への結合を阻害する活' I生を有さない上記 （7 ) に記載の医薬。
( 9 ) 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176-206 および 271〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である上記（7 ) または （8 ) に記載 の医薬。 (10) 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 2〜29番目に存在するェピ トープである上記 （7) 〜 （9) のいずれか 1項に記載の医薬。
(11) 細胞外領域力 配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 13〜29番目に存在するェピ ト一プである上記 (7) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の医薬。
(1 2) 細胞外領域が、配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 13〜25番目に存在するェピ トープである上記 （7) 〜 （11) のいずれか 1項に記載の医薬。
(1 3) CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、 配列番号 1で示 されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むペプチドの'うち、 16、 19、 20および 22番目の少なく とも 1つのチロシン残基が硫酸化されたぺプチドへの結合性が配列番号 1で示されるアミソ酸 配列の 13〜25番目を含むぺプチドへの結合性よりも低いことを特徴とする上記（ 1 2) に記載 の医薬。 ，
(14) CCR4の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ハ ィプリドーマ KM2160 (FERM BP- 10090) が生産するモノクローナル抗体が認識するェピトープ に特異的に反応する抗体または該抗体断片である、 上記 （1) 〜 (13) のいずれか 1項に記 載の医薬。
(15) ヒト型遺伝子組換え抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である上 記 （1) 〜 （14) のいずれか 1項に記載の医薬。
(16) ヒト型キメラ抗体が CCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） ' 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR)を含む、 上記 （1 5) に 記載の医薬。
(17) ヒト型キメラ抗体が配列番号.5、 6、 7で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重 鎖 (H鎖）可変領域 （V領域）の CDR1、 CDR2、 CDR3および Zまたはそれぞれ配列番号 8、 9、 10で 表されるアミノ酸配列からなる軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3を含む上記 (1 5) ま たは （16) に記載の医薬。
(18) ヒト型キメラ抗体が配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） および Zまたば配列番号 12で表される抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領 域を含む上記 （15) 〜 （1 7) のいずれか 1項に記載の医薬。
(19) ヒト型 CDK移植抗体が CCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR)を含む、 上記 （1 5) に 記載の医薬。
(20) ヒト型 CDR移植抗体が配列番号 5、 6、 7で表されるァミノ酸配列からなる抗体の 重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域）の CDR1、 CDR2、 CDR3および //またはそれぞれ配列番号 8、 9、 10 で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3を含む上記 （1 5) または （19) に記載の医薬。 .
(21) ヒト型 CDR移植抗体が配列番号 16または 17で示されるァミノ酸配列で表される アミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域)および Zまたは配列番号 18で 表される抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域を含む、 上記 （1 5) 、 （18) および （2 O) のいず れか 1項に記載の医薬。 ( 2 2 ) 薬剤が、 蛋白質または低分子の薬剤である上記 ( 1 ) 〜 ( 2 1 ) のいずれか 1項 に記載の医薬。
( 2 3 ) 蛋白質が、 サイト力インまたは抗体である、 上記 （2 2 ) 記載の医薬。
( 2 4 ) サイト力インが、 G- CSF、 M_CSF、 インターフェロン一 、 IL - 2および IL- 15から 選ばれるサイト力インである上記 （2 3 ) 記載の医薬。
( 2 5 ) 低分子の薬剤が、 化学療法剤またはホルモン療法剤である上記 （ 1 ) 〜 （2 4 ) のいずれか 1項に記載の医薬。
( 2 6 ) 化学療法剤が、 ビンクリスチン、 シクロフォスフアミ ド、 エトポシドおよびメ ト ト レキセートから選ばれる薬剤である上記 （2 5 ) に記載の薬剤。 本発明の医薬の形態としては、 CCR に特異的に反応する遺伝子組換え抗体または該抗体断片 と、少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬、 CCR4に特異的に反応する遺伝子組換 え抗体または該抗体断片と、 少なくとも 1種類の薬剤とを併用して投与するための医薬、 CCR4 に特異的に反応する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、 少なくとも 1種類の薬剤とを同時 に又は逐次的に投与するための医薬があげられる。 ' ここで、組み合わせてなる医薬とは、 CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体およびその 抗体断片と少なくとも 1種類の薬剤とを別々に調製し、 これらの薬剤を組み合わせて同時にま たは逐次的に投与する医薬であってもよいし、 それぞれの薬剤成分を混合させた合剤であって もよい。 それぞれの薬剤成分を混合させた合剤には、 CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗 体およびその抗体断片に少なくとも 1種類の薬剤を結合させた融合抗体なども包含する。
本突明における CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体おょぴその抗体断片 （以下、两者 を総称して本発明における抗体と表記することもある） としては、ヒト CCR4の細胞外領域に特 異的に反応する遺伝子組換え抗体およびその抗体断片があげられるが、 ヒト血小板に反応性を 示さない遺伝子組換え抗体またはその抗体断片、高い ADCC活性を有する遺伝子組換え抗体また はその抗体断片などが好ましい。
ここで抗体がヒト血小板に反応性を示さないとは、 抗体がヒト血小板と実質的に反応しない ことをいい、 具体的には、 フローサイトメーターによる測定で反応性を示さないことをいう。 また、本発明における抗体として、 好ましくは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1〜3 9、 98〜112、 176〜206または 271〜284番目を含む領域、 より好ましくは配列番号 1に示され るァミノ酸配列の 2〜29番目 （配列番号 2)、 さらに好ましくは配列番号 1に示されるアミノ酸 配列の 12〜29番目 （配列番号 3)、特に好ましくは配列番号 1に示されるァミノ酸配列の 13〜2 5番目（配列番号 4)に、 特異的に反応する抗体があげられる。 また、 ハイプリドーマ KM2160 (F ERM BP - 10090)が生産する CCR4に結合するモノクロ一ナル抗体が認識するェピトープに特異!^ に反応する抗体もあげられる。ハイプリドーマ KM2160は平成 16年 8月 12日付けで、独立行 ¾： 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に FERM BP - 10090として寄託されている。
本発明における抗体は、配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 13〜25番目を含むぺプチドに 対する結合性が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むペプチドのうち、 ]_ 6、 19、 20および 22番目の少なくとも 1以上のチロシン残基が硫酸化されたペプチドに対する 結合性が低い抗体が好ましい。
また、本発明における抗体は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサ ミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞 （W0 02/31140、 W003/85118, W003/85107) で生産された抗体も包含される。
本発明における遺伝子糸且換え抗体としては、 ヒ トイ匕抗体、 ヒ ト抗体等があげられる。
ヒト化抗体としては、 ヒト型キメラ抗体及ぴヒト型 CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体 Η鎖 V領域 （以下、 HVまたは VHとも称す） お よび抗体 L鎖 V領域 （以下、 LVまたは VLとも称す） とヒト抗体の CHおよびヒト抗体の L鎖 C 領域 （以下、 CLとも称す） とからなる抗体を意味する。 ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラ ット、 ハムスター、 ラビット等、 ハイプリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなるも のも用いることができる。
本突明におけるヒト型キメラ抗体は、 CCR4に特異的に反応するヒト以外の動物のモノクロー ナル抗体を生産するハイブリ ドーマより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し てヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより 発現させ、 製造することができる。
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、 ヒトイムノグロブリン （以下、 hlgと 記する） に属すれ ばいかなるものでもよいが、 IgGクラスのものが好適であり、 更に IgGクラスに属する γ 1、 7 2、 γ 3、 ν 4といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の C Lとしては、 κクラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
本発明におけるヒト型キメラ抗体としては、 VHの CDR1、 CDR2および CDR3がそれぞれ配歹 IJ番 号 5、配列番号 6および配列番号 7、 VLの CDR1、 CDR2および CDR3がそれぞれ配列番号 8、酉 S列 番号 9および配列番号 10で表されたァミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、より具体的には V Hおよび VLのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号 11および配列番号 12で表されたァミノ酸配 列であるヒト型キメラ抗体、 さらに具体的には、 VHのアミノ酸配列が配列番号 11、 H鎖 C領域 がヒ ト抗体 IgGlサブクラズのァミノ酸配列： L鎖 V領域が配列番号 12で表されたァミノ酸配 列、 L鎖 C領域がヒト抗体 κクラスのアミノ酸配列からなるヒト型キメラ抗体があげられる。 例えば W001/64754に開示された抗 CCR4ヒト型キメラ抗体 KM2760があげられる。
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列をヒト 抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明におけるヒト型 CDR移植抗体は、 CCR4に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体の V Hおよび VLの CDRのァミノ酸配列を任意のヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植した V領域を コードする cDNAを構築し、 ヒ ト抗体の CHおよび H鎖 C領域 （以下、 CLと表記する） をコード する DNAを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現べクタ 一を構築し、 動物細胞へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
ヒ ト抗体の VHおよび のフレームワーク （以下.、 FRと表記する） のアミノ酸配列を選択方 法としては、 ヒト抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。例え ίま'、 Ρ rotein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミ ノ酸配列、 またはヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通ァミノ酸配列 （Seque nces of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 199 1) などがあげられる。
本突明における抗体の CHとしては、 ヒトイムノグロブリン （以下、 hlgと表記する） に属す ればいかなるものでもよいが、 IgGクラスのものが好適であり、さらに IgGクラスに属する γ 1、 γ 2Ν τ/ 3、 y 4といったサプクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移植抗 体の CLとしては、 Kクラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
本発明におけるヒト型 CDR移植抗体としては、 それぞれ配列番号5、 6、 7で表されるァミノ 酸配列からなる抗体 VHの CDR1、 CDR2、 CDR3およぴ/ またはそれぞれ配列番号 8、 9、 10で表さ れるアミノ酸配列からなる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3を含むヒト型 CDR移植抗体または該抗体断 片などがあげられる。
好ましくは、抗体の VHが配列番号 13または 14、および/または VLが配列番号 15で示され るァミノ酸配列を含む、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられる。 '
より好ましくは、
抗体の VHが、配列番号 13で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 4 3番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の' Lys、 および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1 つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗 体、
抗体の VH 1 配列番号 14で示されるァミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の A laのうち少なくとも 1つ以上のァミノ酸残基が置換されたァミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植 f几体、
抗体の VLが、 配列番号 15で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50 番目の Gln、および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基が置換され たァミノ酸配列を含む、 ヒト型 CDR移植抗体、
抗体の VHが、配列番号 13で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 42番目の Gly、 4 3番目の Lys、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Ala、 ならびに抗体の VLが、 配 列番号 15で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つ以上のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換され たァミノ酸配列を含む、 ヒト型 CDR移植抗体、
抗体の VH力 配列番号 14で示されるアミノ酸配列のうち、 28番目の Thrおよび 97番目の A la、 ならびに抗体の VLが、配列番号 15で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の Ile、 3番目 の Val、 50番目の Gln、および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基 が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含む、 ヒト型 CDR移植抗体、
さらに好ましくは、 抗体の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） 力 配列番号 16または 17で示さ れるァミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子の軽鎖 (L鎖） V領域が配列番号 18で示されるァミノ 酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体、 などがあげられる。
これらのアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 付力!]、 置換または挿入され、 か つ CCR4と特異的に反応する抗体または抗体断片も本発明の範囲に包含される。 本発明におけるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入または付カロ されたとは、 同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のァミノ酸配列中の位置において、 1また は複数のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入または付加があることを意味し、 欠失、 置換、 挿入 または付加が同時に生じてもよく、 置換、 挿入または付加されるァミノ酸残基は天然型と非天 然型とを問わない。 天然型アミノ酸残基としては、 L -ァラニン、 L -ァスパラギン、 L -ァスパラ ギン酸、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、 グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイ シン、 L-リジン、 L -メチォニン、 L-フエニノレアラニン、 L-プロリン、 L -セリン、 L-スレオニン、 L -トリプトファン、 L-チロシン、 L-バリン、 L-システィンなどがあげられる。
以下に、 相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。 同一群に含まれるアミノ酸残 基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、 イソロイシン、 ノノレロイシン、 / リン、 ノノレノ リン、 ァラニン、 2 -ァミ ノ プタン酸、 メチォニン、 0-メチルセリン、 t -プチノレグリシン、 t -プチノレァラニン、 、ンクロへキ シルァラニン
B群：ァスパラギン酸、 グノレタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソグルタミン酸、 2 -ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジン、 アルギニン、 オル-チン、 2， 4 -ジアミノブタン酸、 2， 3_ジァミノプロピオン 酸
E群：プロリン、 3 -ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン
G群：フエニノレアラニン、 チロシン .
本発明におけるヒト型 CDR移植抗体の具体例としては'、 003/18635に記載のヒト型 CDR移植 抗体、 W000/42074に記載のモノクローナノレ抗体 1G1、 2B10または 10E4から作製されるヒト型 C DR移植抗体、 W099/15666に記載のヒ ト化抗体またはモノクローナル抗体 252Yまたは ¾2Zから 作製されるヒト型 CDR移植抗体、 US6245332に記載のモノクローナル抗体から作製されるヒト 型 CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト抗体は、 元来、 ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、 最近の遺伝子工学的、 細 胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒ ト抗体産生トランスジヱニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えばヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィルスなどを 感染させ不死化、 クローニングすることにより、 該抗体を産生するリンパ球を培養でき、 培養 物中より、 該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライプラリーは、 ヒ ト B細^から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に 挿入することにより、 Fab、 scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライプラリーで ある。 該ライプラリーはレパートリーを増やすために、 人為的に変異を導入したライブラリー を用いることもできる。 該ライブラリーより、 抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標 として所望の抗原結合活性を有するファージを回収できる。 該抗体断片は、 さらに蛋白質工学 的手法により、 二本の完全な H鎖およぴニ本の完全 ¾ L鎖からなるヒト抗体分子へ変換するこ ともできる。 ヒト抗体産生トランスジヱニック動物は、 ヒト抗体遺伝子が細胞内に組み込まれた動物を意 味する。 具体的には、 マウス ES細胞ヘヒ ト抗体遺伝子を導入し、 該 ES細胞をマウスの初期胚 に移植後、 発生させることにより作製されたヒト抗体産生トランスジエニックマウスなどがあ げられる。 ヒ ト抗体産生トランスジヱニック動物からのヒト抗体の作製方法は、 通常の細胞融 合法によるハイプリ ドーマ作製方法により、 ヒト抗体産生ハイプリドーマを得、 培養すること で培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
トランスジエニック非ヒト動物は、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 二 ヮトリ、 サル又はゥサギ等があげられる。
本発明における抗体断片としては、 Fab、 Fab'、 F (ab' ) 2、 scFv、 Diabody、 dsFv、 CDRを含む ペプチドなどがあげられる。
Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち （H鎖の 224番目のァ ミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフィド結合 （S- S結合） で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明における Fabは、本発明の CCR4に特異的に反応するヒト型 CDR移植抗体を蛋白質分解 酵素パパィンで処理して得ることができる。 または、 該抗体の Fabをコードする DNAを原核生 物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該べクターを原核生物あるいは 真核生物へ導入することにより発現させ、 Fabを製造することができる。
F (ab' ) 2は、 IgGを蛋白質^ »酵素ペプシンで, 理して得られる断片のうち （H鎖の 234番目 のァミノ酸残基で切断される）、 Fabがヒンジ領域の S-S結合を介して結合されたものよりやや 大きい、 分子量約 10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本努明における F (ab' )2は、本発明の CCR4に特異的に反応するヒト型 CDR移植抗体を蛋白質 分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。 または、 下記の Fab'をチォエーテル結合ある いは S-S結合させ、 作製することができる。
Fab'は、 上記 F (ab' )2のヒンジ領域の S-S結合を切断した分子量約 5万の抗原結合活性を有 する抗体断片である。
本発明における Fab'は、本発明の CCR4に特異的に結合する F (a )2を還元剤ジチォスレイト ール処理して得ることができる。 または、 CCR4に特異的に反応するヒト型 CDR移植抗体の Fab 'をコードする DMを原核生物用発現べクタ一あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該べ クタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 製造することができる。 scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを 12残基以上の適当なぺプチドリンカ一 （P) を用いて連 結した、 VH-P-VLな 、しは VL - P-VHポリぺプチドで、 抗原結合活性を有する抗体断片である。 本発明における scFvは、 CCR4に特異的に結合するヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコ 一ドする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現べクター あるいは真核生物用発現べクタ一に挿入し、 該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導 入することにより発現させ、 製造することができる。
Diabodyは、抗原結合特異性の同じまたは異なる scFvが 2量体を形成した抗体断片で、 同じ 抗原に対する 2価の抗原結合活性または異なる抗原に対する 2特異的な抗原結合活性を有する 抗体断片である。 本発明における Diabodyは、 例えば、 CCR4に特異的に結合する 2価の Diabodyは、本発明の CCR4に特異的に結合するヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 3〜 10残基のポリぺプチドリンカーを有する scFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物 用発現べクタ一あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該突現べクターを原核生物あるい は真核生物へ導入することにより Diabodyを発 ξ させ、 製造することができる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリべプチ ドを該システィン残基間の S- S結合を介して結合させたものをいう。 システィン残基に置換す るアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 （Protein Engineering, 7, 697 (1994) ) に 従って、 抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明における dsFvは、 CCR4に特異的に結合するヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコ 一ドする cDNAを取得し、 dsFvをコードする D通を構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクター あるいは真核生物用発現べクタ一に揷入し、 該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導 入することにより発現させ、 製造することができる。
CDRを含むぺプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構成される。 複数の CDRを含むぺプチドは、 直接または適当なぺプチドリンカーを介して結合させることに より製造することができる。
本発明における CDRを含むぺプチドは、 CCR4に特異的に結合するヒト型 CDR移植抗体の VH および VLの CDRをコードする cDNAを構築し、該 cDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核 生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することに より発現させ、 製造することができる。 また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法 (フル才レニノレ メチルォキシカルボニル法）、 tBoc法 （t -プチルォキシカルボニル法） などの化学合成法によ つて製造することもできる。
本発明に用いられる薬剤としては、 蛋白質、 低分子の薬剤などがあげられる。
蛋白質としては、 サイト力イン、 抗体などがあげられる。 . '
サイトカインとしては、免疫担当細胞である NK細胞、マクロファージ、 単球、顆粒球などの エフェクター細胞を活性化するサイトカイン、 または当該サイトカインの誘導体などがあげら れる。 具体的なサイト力インとしては、 インターロイキン- 2 (IL-2) 、 IFN- a、 IFN_ y、 IL-1 2、 IL-15、 IL— 18、 IL— 21、 fractalkine, M- CSF、 GM— CSF、 G_CSF、 TNF— a、 TNF - ]3、 IL-1 a , I L - 1 等があげられる。
抗体としては、 T細胞表面マーカーに特異的に反応する抗体、 抗体断片または融合抗体など があげられる。 具体的な抗体としては、 抗 CD3抗体 （Orthoclone社） 、 抗 CD4抗体、 抗 CD5抗 体、抗 CD8抗体、抗 CD30抗体、抗 CD2抗体、抗 CD25抗体 (Zenapax, Hoffmann La Roche社）、 抗 CD52抗体 （Campath, Ilex Oncology社） などがあげられる。
本発明に用いられる低分子の薬剤としては、 アミフォスチン （ェチオール） [amifostine (e thyol) ] 、 シスプラチン （cisplatin) 、 ダカルバジン （DTIC) [dacarbazine (DTIC) ] 、 ダ クチノマイシン （dactinomycin) 、 メタロレタミン （ナイ トロジェンマスタード） [tnechlore thamine U itrogen mustard) ] 、 ス卜レプ ゾシン (streptozocin; 、 シクロフォスファミ ド (cyclophosphamide) 、 カルムスチン （BCNU) [carmustine (BC U) ] 、 口ムスチン （CCNU) [lomustine (CCNU) ] 、 ドキソルビシン （アドリアマイシン） [doxorubicin (adriamycin) ]、 P T/JP2004/018430 ドキソルビシンリポ （ドキシル） [doxorubicin lipo (doxil) ] 、 ゲムシタビン （ゲムザ一ノレ） [gemcitabine (gemzar) ] 、 タウノノレビシン （daunorubicin) 、 ダウノノレビシンリポ （ダウノ ン ' "ムリ [daunorubicin lipo 、daunoxomeノコ、プロカノレノヽンン procarbazine) 、 マづ トマィ シン (mitomycin) 、 シタラビン (cytarabine) 、 エトポシド (etoposide) 、 メ トトレキセー ト (methotrexate)、 5-フノレオロウラシノレ (5-fluorouracil) 、 ビンブラスチン (vinblastin e) 、 ビンクリスチン (vincristine) 、'ブレオマイシン (bleomycin) 、 パクリタキセル （タキ ソール） [paclitaxel (taxol) ] 、 ドセタキセル （タキソテア） [docetaxel (taxotere) ]、 ァノレデスロイキン (aldesleukin) 、 ァスパラギナーゼ (asparaginase) 、 ブスノレファン (bus ulfan) 、 カルボプラチン (carboplatin) 、 クラドリビン (cladribine) 、 カンプトテシン (c amptothecin) 、 CPT-11、 10-ヒドロキシ- 7-ェチル-カンプトテシン （SN38) [lO-hydroxy-7-e thyl-caraptothecin (SN38) ] 、 フロクスゥリジン （floxuridine) 、 'フルダラビン （fludarabi ne) 、 ヒ ドロキシクレア （hydroxyurea) 、 ィホスフアミ ド （ifosfamide) 、 イダノレビシン （i darubicin) 、 メスナ (mesna) 、 イリノテカン (irinotecan) 、 ミトキサントロン (mitoxant rone) 、 卜ポテカン (topotecan) 、 ロイプロ] ド (leuprolide) 、 メケス卜ローノレ (megestr ol) 、 メノレファラン (melpharan) 、 メノレカプトプリ.ン (mercaptopurine) 、 プリカマイシン (p licamycin) 、 ミトタン 、mitotane) 、 へガスノ フガ■— IT (pegaspargase) 、 ヘントスタチン {p entostatin) 、 ピポプロマン (pipobroman) 、 ストレフ。トゾシン (streptozocin) 、 タモキシ フェン (tamoxifen) 、 ァニポシ Ueniposide
) 、 テストラクトン (testolactone 、 チォクァニン (thioguaninej 、 チォテノ (thiotepa)、 ゥラシノレマスタード (uracil mustard) 、 ビノレノレビン (vinorelbine) 、 ク口ラムブシノレ (c hlorambucil) .、 プレドニゾロン （prednisolone) 、 ビンデシン （vindesine) 、 二ムスチン （n imstine) 、 セムスチン (semustin) 、 カぺシタビン (capecitabine) 、 トムテックス (tomud ex) 、 ァザシチジン （azacytidine)、 UFT、 ォキザロプラチン （oxaloplatin) 、 ゲフイチニプ (ィレッサ） [gefitinib (Iressa) ] 、 イマチニプ （STI571) [iraatinib (STI571) ] 、 アムサ クリン (amsacrine) 、 才ーノレ一卜ランスレチノイン酸 (all-trans retinoic acid) 、 サジ K マイド （thalidomide) 、 ベキサロテン （ターグレチン） [bexarotene (targretin) ] 、 デキサ メタゾン（dexamethasone)、ァナスト口ゾール（ァリミデックス） [anastnizole (Alimidex) ]、 ロイプリン （leuplin) あるいはこれらの組み合わせがあげられる。望ましくは、 ビンクリスチ ン、 シクロフォスフアミ ド、 エトポシド、 メトトレキセートあるいはこれらの組み合わせがあ げられる。
上記の薬剤は、 単独で髙用量を生体内に投与した場合には副作用が懸念される。 しかしなが ら、本努明においては CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え,抗体おょぴその抗体断片と組み合 わせることにより、 上述の薬剤を低用量で用いることができる。 したがって、 十分な治療効果 に加えて、 副作用を軽減することができる。
本発明の医薬は、 CCR4を発現している細胞に対して用いることができるが腫瘍細胞が好まし い。 腫瘍の具体例としては、 造血器腫瘍があげられる。
造血器腫瘍としては、 急性白血病、 慢性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン病などがあげられ る。 ， - 急性白血病としては、 急性リンパ性白血病などがあげられ、 急性リンパ性白血病には前駆 T 細胞系急性リンパ性白血病などがあげられる。
慢性白血病としては、 慢性リンパ性白血病があげられ、 慢性リンパ性白血病には、 T細胞型 慢性リンパ性白血病、 T細胞型前リンパ性白血病、 成人 T細胞性白血病リンパ腫 （ATL) 、 セザ リ一症候群などがあげられる。
非ホジキン病としては、 T/NK細胞性リンパ腫があげられ、 T/NK細胞性リンパ腫には前駆 T リンパ芽球型リンパ腫/白血病、 成熟 T細胞腫瘍などがあげられる。 '
成熟 T細胞腫瘍としては、 T細胞前リンパ球性白血病、 T細胞大顆粒リンパ球性白血病、セザ リ一症候群、 菌状息肉腫、 原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、 皮下蜂窩織炎様 T細胞リンパ 腫、 腸管症型腸 T細胞リンパ腫、 肝脾 y Τ細胞リンパ腫、 血管免疫芽球型 Τ細胞リンパ腫、 末梢性 Τ細胞性リンパ腫、未分化型大細胞型リンパ腫、成人 Τ細胞性白血病/リンパ腫などがあ げられる。
本発明の医薬の効果は、 in vitroの細胞障害活性測定系によつて調べることができる。 in v itroの細胞障害活性測定系の例としては、 ADCC活性の測定系が挙げられる。 ADCC活性は、 抗 体の存在下で、抗原である CCR4を発現する標的細胞と、 ヒ トあるいはその他の動物より採取し た末梢血単核球、 単球、 マクロファージ、 顆粒球等のエフェクター細胞を接触させ、 障害され た標的細胞の度合いを検出し、 これを定量することにより測定することができる。 障害された 標的細胞の度合いは、 51Cr遊離法、 標的細胞の酵素活性を検出する方法、 フローサイトメータ 一による検出法などによつて検出することができる。 ADCC活性測定系における本発明の医薬の 効果は、 ADCC活性測定系中に薬剤を添加する力 あるいは標的細胞、またはエフエタタ一細胞、 またはその両者にあらかじめこれらの薬剤を一定期間曝露して ADCC活性に与える影響を観察' することにより、 測定することができる。
また本発明の医薬の効果は、 動物モデルを用いた in vivo抗腫瘍活性を測定することによつ ても調べることができる。
動物モデルとしては、 ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移 植した異種移植モデル、 培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した 同系移植モデルなどがあげられる。
異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、 皮内、 腹腔内、 静脈内等様々な 部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。
本発明の医薬の評価用の同系移植モデルは、 EL4細胞などのマウス培養細胞株に、 CCR4遗伝 子を導入することにより、 CCR4陽性の形質転換株を作製し、該形質転 を正常な免疫系を有 する野生型マウスの様々な部位へ移植することにより作製することができる。
上記動物モデルを用いて抗体の単独投与、 薬剤の単独投与の効果と、 本宪明の医薬の効果と を比較することにより、 本発明の医薬の効果を評価することができる。
本発明の医薬は、 単独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つ あるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法 により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 または口 腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋 内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、 蛋白 質製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、 シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。 . 経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等が あげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 オリープ油、 大 豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ぺ パーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、マン-トール等の賦形剤、 デンプン、アルギン酸ナトリゥム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、 ポリビエルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステ ル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
¾¾斉リは、 塩溶液、 プドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製され る。
座剤は力力ォ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、 噴霧剤は該医薬そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該 医薬を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用!、て調製される。'
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該医薬および用いる担体の†生質に より、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤において も経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により 異なるが、通常成人 1回当たり抗体量として 0. l〜20mg/kgである。抗体と併用する薬剤は、単 独で臨床に用いられる場合の投与量と同用量またはそれより少ない用量である。 図面の簡単な説明
第 1図は抗 CCR4抗体の細胞障害活性に対するサイトカインの増強効果を示す。縦軸は細胞障 害活性を表す。 園はサイトカイン非添加時、 口は IL- 2添加時、斜線は IL- 15添加時の細胞障害 活性をそれぞれ示す。 バーは標準偏差を示す。
第 2図はヌードマウスに移植した CCRF - CEM細胞に対する抗 CCR4抗体とピンクリスチンの併 用効果を示す。 縦軸は V/V0の値を表す。 口は陰性対照群、 斜線は KM2760投与群、 灰色はビン クリスチン投与群、 園は KM2760とビンクリスチンの併用投与群の V/V0の値をそれぞれ示す。 バーは標準偏差を示す。
第 3図はヌードマウスに移植した CCRF-CEM細胞に対する抗 CCR4抗体とシクロフォスフアミ ドの併用効果を示す。 縦軸は V/V0の値を表す。 口は陰性対照群、 斜線は腿 27eo投与群、 灰色 04 018430 はシクロフォスフアミ ド投与群、 酾は KM2760とシクロフォスフアミ ドの併用投与群の V/V0の 値をそれぞれ示す。 バーは標準偏差を *す。
第 4図はヌードマウスに移植した CCRF-CEM細胞に対する抗 CCR4抗体とェトポシドの併用効 果を示す。 縦軸は V/V0の値を表す。 口は陰性対照群、 斜線は KM2760投与群、 灰色はエトポシ ド投与群、 讕は KM2760とエトポシドの併用投与群の V/V0の値をそれぞれ示す。 バーは標準偏 差を示す。 ·
第 5図はヌードマウスに移植した CCRF- CEM細胞に対する抗 CCR4抗体とメトトレキセートの 併用効果を示す。 縦軸は V/V0の値を表す。 口は陰性対照群、 斜線は KM2760投与群、 灰色はメ トトレキセ一ト投与群、 國は KM2760とメトトレキセ一トの併用投与群の V/V0の値をそれぞれ 示す。 バーは標準偏差を示す。
第 6図は C57BL/6マウスに移植した CCR4/EL4細胞に対する抗 CCR4抗体と G- CSFの併用効果 を示す。 横軸は腫瘍移植後の日数、 縦軸は腫瘍体積をそれぞれ表す。 Xは陰性対照群、 ▲は KM 2760単独群、 秦は G- CSF単独 、 口は併用群をそれぞれ示す。 パーは標準偏差を示す。
第 7図は C57BL/6マウスに移植した CCR4/EL4細胞に対する抗 CCR4抗体と IFN- aの併用効果 を示す。 縦軸は肝臓重量比率を表す。 バーは標準偏差を示す。
以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2003年 12月 4日および 2004年 5月 25日に出願 された日本国特許出願 2003-406590号および 2004- 155141の優先権を主張するものであり、 当 該特許出願の明細書及び/または図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 in vitro細胞障害活性における抗 CCR4抗体とサイト力インとの併用効果
in vitro細胞障害活性における抗 CCR4ヒト型キメラ抗体 KM2760 (FERM BP-7054, W001/647 54) とサイトカインとの併用効果を以下の方法により測定した。
(a) エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mLを採取し、へパリンナトリウム （淸水製薬社製） 0. 5mLを加え穏やかに混 合した。これを MONO- P0LY分離溶液 （大日本製薬株式会社製） を用いて添付の説明書に従って、 単核球層を分離した。 RPMI1640-FCS (5) 培地 [FCSを 5%含む RPMI1640培地（GIBC0 BRL社）] で 3回遠心分離して洗浄後、 同培地を用いて 3 Χ 10δ細胞/ mLの濃度になるように再懸濁し、 ェ フエクタ一細胞溶液とした。
(b) エフェクター細胞のサイト力インによる刺激
上記 (a)で得られたェフエクタ一細胞溶液を 50 /i Lずつ、 96穴 U底プレート（Falcon社製）に 分注した。 さらに RPMIIMO-FCS (5)培地で希釈した 2ng/mLの IL - 2 (ぺプロテック社製） 溶液、 2ng/mLの IL-15 (ぺプロテック社製）溶液およびサイトカイン非添加の陰性対照である RPMI 16 40- FCS (5)を各々 50 しずつ別のサンプノレに添加し、 5%C02インキュベーター内にて 3日間静置 した。
(c) 標的細胞溶液の調製
G418 (ナカライテスク社製) を 0. 5mg/mLで含む RPMI 1640-FCS (10) 培地 [FCSを 10%含む R PMI1640培地 (GIBC0 BRし社製) ] で培養した、 マウス胸腺腫細胞株 EL4にヒト CCR4遺伝子を導 入した形質転換株である腫瘍細胞である CCR4/EL4細胞（W001/64754)を遠心分離操作及び懸濁 により RPMI1640- FCS (5)培地で洗浄した後、 RPMIIMO- FCS (5) 培地で 2 X 105細胞/ mLの濃度に 調整し、 標的細胞溶液とした。
(d) 細胞障害活十生の測定
上記 (b)でサイトカインによる刺激を与えたエフェクター細胞を含む96ゥエル U字底プレー トの各ゥェルに （c) で調製した標的細胞溶液を 1 X 104細胞/ゥエルになるように 50 μ Lを添加 した。 このときェフエクタ一細胞と標的細胞の比は 15： 1となる。 更に、 Κ 2760を最終濃度が それぞれ 1あるいは lOOng/mLとなるように添加して、 37°Cで 4時間反応させた。反応後、プレ ートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、 LDHと称す)活性を、 CytoTox96 Non -Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社製） を用いて、 添付の説明書に従って吸光度デ ータを取得することで測定した。 標的細胞自然遊離の,吸光度データは、 エフヱクタ一細胞溶液 および抗体溶液の代わりにそれぞれ同容量の RPMI1640-FCS (5)培地を用いて、 また、 エフェク タ一細胞自然遊離の吸光度データは、 標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにそれぞれ同容量 の RPMI1640 - FCS (5)培地を用いて、 上記と同様の操作を行うことで取得した。 標的細胞全遊離 の吸光度データは、抗体溶液およびェフエクタ一細胞溶液の代わりにそれぞれ同容量の RPMI16 40-FCS (5)培地を用いて反応を行い、反応終了 45分前に 15 ;i Lめ 9% Triton X- 100溶液を添加 し、 上記と同様の操作を行うことで、 上清の LDH活性を測定した。 ADCC活性は次式により求め た。
(式 1 )
細胞障害活性 (°/。） = [ (検体の吸光度） 一 （エフェクター細胞自然遊離の吸光度） 一 （標的 細胞自然遊離の吸光度） ] ノ [ (標的細胞全遊離の吸光度） 一 （標的細胞自然遊離の吸光度）.] X 100 第 1図に結果を示した。 KM2760の細胞障害活性は濃度依存的に増加していた。 また、 サイト 力インの添加により、 より増加した。 この結果は、抗 CCR4抗体の細胞障害活性が、ェフエクタ 一細胞を活性化するサイトカインによって増強されることを示している。
実施例 2 抗 CCR4抗体とビンクリスチンとの併用投与による抗腫瘍効果
CCRF - CEM細胞（ヒト T細胞白血病細胞株）を 2 X 108個/ mLで RPMI1640培地 （Gibco BRL) に懸 濁し、 該懸濁液 100 M Lを Balb/cヌードマウス （日本クレア、 雄） の腹側部皮内に移植した。 細胞移植後 15日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、 次式より腫瘍体積を算出した。
(式 2 )
腫瘍体積 =短径 X短径 X長径 X 0. 5
腫瘍体積が 140〜342 mm3 (平均 260 mm3) の範囲内の腫瘍を有する個体を選抜し、 平均腫瘍 体積が均一になるように群分けした後に、下記の A〜Dの各薬剤をマウスへ投与した。 なお、群 分けした日を DayOとした。
A. 陰性対照群 ： 非投与
B. KM2760単独群 ： DayOと Day4に 1匹あたり 800 g投与した。
C ビンクリスチン （以下 VCR ; オンコビン注射用、 日本ィーライリリー株式会社） 単独群 ： DayOに 1匹あたり 0. 55 mg/kg投与した。 D. KM2760 + VCR併用群 ： VCRを、 DayOに 1匹あたり 0. 55 mg/kg, KM2760を、 DayOと Day4 に 1匹あたり 800 gそれぞれ投与した。
実験は各群 5匹で行った。 各薬剤は生理食塩水 （大塚製薬） で希釈調製し、 尾静脈内より投 与した。. DaylOに腫瘍体積の測定を行い、 抗腫瘍効果の判定は、 各群の DayOの腫瘍体積を V0 としたときの DaylOの腫瘍体積変化 （V/V0)の平均値の比較で行った。
各群の V/V0の平均値を第 2図に示す。 第 2図に示したように、 KM2760と VCRとの併用投与 は、 VCR単独あるいは抗体単独よりも高レ、増殖抑制効果を示した。
各群の V/V0を陰性対照群の V/V0で除した値 (T/C) を第 1表に示す。 KM2760、 VCR両薬剤の 薬効が単純に加算された時の T/Cの理論値、 すなわち各薬剤単独群の T/Cを掛け合わせた値と 比べると、 実際の併用群の T/C (表中の C) は、 DaylOにおいて理論値である 0. 21よりも低い 値 （0. 11) を示した。 第 1 ¾：
各群の T/C
A陰性対照 B KM2760 C VCR D KM2760+VCR 理論値 (B X C)
1 0. 43 0. 49 0. 11 0. 21 以上より、 KM2760と VCRの併用投与は、 それぞれ単独投与より、 高い抗腫瘍効果を有し、 相 乗効果を示すことが明らかとなった。
実施例 3 抗 CCR4抗体とシクロフォスフアミドとの併用投与による抗腫瘍効果
CCRF - CEM細胞（ヒト T細胞白血病細胞株）を 2 X 10S個/ mLで RPMI1640培地 （Gibco BRL) に懸 濁し、 該懸濁液 100 /i Lを Balbんヌードマウス （Θ本クレア、 雄） の腹側部皮内に移植した。 細胞移植後 18日目にノギスによる腫瘍径の測定を行レ、、実施例 2の式 2により腫瘍体積を算出 した。
腫瘍体積が 116〜349 mm3 (平均 219 mm3) の範囲内の個体を選抜し、 平均腫瘍体積が均一に なるように群分けした後に、 下記の A〜Dの各薬剤をマウスへ投与した。 群分けした日を DayO とした。
A. 陰性対照群 ： 非投与
B. KM2760単独群 ： DayOと Day4に 1匹あたり 800 μ g投与した。
C. シクロフォスフアミ ド （以下 CPA ; 注射用エンドキサン、 バクスター社）
単独群 ： DayOに 1匹あたり 65 mg/kg投与した。
D. KM2760 + CPA併用群 ： CPAを、 DayOに 1匹あたり 65 mg/kg, KM2760を、 DayOと Day4に 1匹あたり 800 μ gそれぞれ投与した。
実験は各群 5匹で行った。 各薬剤は生理食塩水'（大塚製薬） で希釈調製し、 尾静脈内より投 与した。 Day4に腫瘍体積の測定を行い、抗腫瘍効果の判定は、 各群の DayOの腫瘍体積を V0と したときの各測定日の腫瘍体積変ィ匕 （V/V0)の平均値の比較で行つた。
各群の V/V0の平均値の経日的推移を第 3図に示す。 第 3図に示したように、 KM2760と CPA との併用投与は、 CPA単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。 各群の V/VOを陰性対照群の V/VOで除した値 （T/C) を第 2表に示す。 腿2ァ60、 CPA両薬剤の 薬効が単純に加算された時の T/Cの理論値、 すなわち各薬剤単独群の T/Cを掛け合わせた値と 比べると、 実際の併用群の T/C (表中の Dの値） は理論値である 0. 39よりも低い値 （0. 35) を 示した。 第 2 表
各群の T/C
A 陰性対照 B KM2760 C CPA D KM2760+CPA 理論値 （B X C)
1. 00 0. 80 0. 48 0. 35 0. 39 以上より、 KM2760と CPAとの併用投与は、 それぞれ単独投与より、 高い抗腫瘍効果を有し、 相乗効果を示すことが明らかとなった。
実施例 4 抗 CCR4抗体とエトポシドの併用投与による抗腫瘍効果
CCRF-CEM細胞（ヒト T細胞白血病細胞株）を 2 X 108個/ mLで RPMI1640'培地 （Gibco BRL) に懸 濁し、 該懸濁液 100 /x Lを Balb/cヌードマウス （日本クレア、 雄） の腹側部皮内に移植した。 細胞移植後 17日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、実施例 2の式 2により腫瘍体積を算出 した。
腫瘍体積が 121〜348 匪3 (平均 195 mm3) の範囲内の個体を選抜し、 平均腫瘍体積が均一に なるように群分けした後、 下記の A〜Dの各薬剤をマウスへ投与した。 なお、 群分けした日を D ayOとした。 ，
A. 陰性対照群 ： 非投与
B. KM2760単独群 ： DayOと Day4に 1匹あたり 800 μ g投与した。
C. エトポシド （以下 VP- 16 ; ラステツト注、 日本化薬株式会社） 単独群 ： DayOから Day4の 5日間、 1匹あたり 10 mg/kg投与した。
D. KM2760 + VP - 16併用群 ： VP - 16を、 DayOから Day4の 5日間、 1匹あたり 10 mg/kg、 KM27 60を、 DayOと Day4に 1匹あたり 800 g投与した。
実験は各群 5匹で行った。 各薬剤は生理食塩水 （大塚製薬） で希釈調製し、 尾静脈内より投 与した。 Day7に腫瘍体積の測定を行い、 抗腫瘍効果の判定は、 各群の DayOの腫瘍体積を V0と したときの Day7の腫瘍体積変ィ匕 （V/V0)の平均値の比較で行つた。
各群の V/V0の平均値を第 4図に示す。 第 4図に示したように、 KM2760と VP-16との併用投 与は、 VP-16単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
各群の V/V0を陰性対照群の V/V0で除した値 (T/C) を第 3表に示す。 KM2760、 VP- 16両薬剤 の薬効が単純に加算された時の T/Cの理論値、 すなわち各薬剤単独群の T/Cを掛け合わせた値 と比べると、 実際の併用群の T/C (表中の Dの値） は理論値である 0. 46よりも低い値 （0. 38) を示した。 第 3 表 '
各群の T/C
A 陰性対照 B KM2760 C VP- 16 D KM2760+VP-16 理論値 (B X C) 1. 00 0. 65 0. 71 0. 38 0. 46 以上より、 KM2760と VP-16との併用投与は、それぞれ単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、 相乗効果を示すことが明らかとなつた。
実施例 5 抗 CCR4抗体とメトトレキセートの併用投与による抗腫瘍効果
CCRF-CEM細胞（ヒ ト T細胞白血病細胞株）を 2 X 108個/ mLで RPMI1640培地 （Gibco BRL) に懸 濁し、 該懸濁液 100 /z Lを Balb/cヌードマウス （日本クレア、 雄） の腹側部皮内に移植した。 細胞移植後 17日目にノギスによる腫瘍径の測定を行い、 式 2により腫瘍体積を算出した。 腫瘍体積が 121〜348 mm3 (平均 195 mm3) の範囲内の個体を選抜し、 平均腫瘍体積が均一に なるように群分けした後に、 下記の A〜Dの各薬剤をマウスへ投与した。 群分けした日を DayO とした。
A. 陰性対照群 ： 非投与
B. KM2760単独群 ： DayOと Day4に 1匹あたり 800 投与した。
C. methotrexate (以下 MTX ; メソトレキセート ¾ 液、 日本ワイスレダリー株式会社） 単独群 ： DayOから Day4の 5日間、 1匹あたり 15 mg/kg投与した。
D. KM2760 + MTX併用群 ： MTXを、 DayOから Day4の 5日間、 1匹あたり 15 mg/kgN KM2760 を、 DayOと Day4に 1匹あたり 800 μ gそれぞれ投与した。
実験は各群 5匹で行った。 各薬剤は生理食塩水 （大塚製薬） で希釈調製し、 尾静脈内より投 与した。 Day7に腫瘍体積の測定を行い、 抗腫瘍効果の判定は、 各群の DayOの腫瘍体積を V0と したときの腫瘍体積変化 （V/V0)の平均値の比較で行つた。
各群の V/V0の平均値の経 B的推移を第 5図に示す。 第 5図に示したように、 KM2760と MTX との併用投与は、 MTX単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。
各群の V/V0を陰性対照群の V/V0で除した値 （T/C) を第 4表に示す。 KM2760、 MTX両薬剤の 薬効が単純に加算ざれた時の T/Cの理論値、 すなわち各薬剤単独群の T/Cを掛け合わせた値と 比べると、 実際の併用群の T/C (第 4表中の Dの値） は理論値 0. 04よりも低い値 （0. 01) を示 した。
第 4 表
各群の T/C
A 陰性対照 B KM2760 C MTX D KM2760+MTX 理論値 （B X C)
1. 00 0. 65 0. 06 0. 01 0. 04 以上より、 KM2760と MTXとの併用投与は、 それぞれ単独投与より、 高い抗腫瘍効果を有し、 相乗効果を示すことが明らかとなった。 .
実施例 6 抗 CCR4ヒ ト型キメラ抗体 KM2760と G-CSFの併用投与による抗腫瘍効果
CCR4/EL4細胞（W001/64754)を 1 X 10e個/ mLで RPMI1640培地 （Gibco BRL) に懸濁し、 該懸濁 液 ΙΟΟ μ Ιを C57BL/6マウス （日本クレア、 雄、 8週齢） の右側腹側部皮内に移植した。 さらに A〜Dまで群分けした後、 各マウスに A〜Dの各薬剤を投与した。 なお、 腫瘍を移植した日を Da y0とした。
A. 陰性対照群 ：非投与
B. KM2760単独群： DayOと Day4に 1匹あたり 100 μ gを静脈内投与した。
C. G- CSF単独群： 腫瘍移植日 4日前 （以下、 Day - 4と記す） から Day5までの 10日間、 G-CSF (ノィアップ注 100、 協和発酵工業社製） を 1日 1回、 1匹あたり 10 gを皮下投与した。 投与部位は腫瘍移植部位と重ならない右側腹側部の後肢付近である。
D. KM2760 + G-CSF併用群： KM2760を DayOと Day4に 1日 1回、 1匹あたり 100 gで静脈内 投与し、 G - CSFを Day- 4から Day5までの 10日間、 1日 1回、 1匹あたり 10 / gを皮下投与した。 投与部位は腫瘍移植部位と重ならない右側腹側部の後肢付近である。
実験は A群 10匹、 B、 C、 D群は各 7匹で行った。 KM2760はクェン酸緩衝液（10mMクェン酸、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 pH6) 、 G-CSFは生理食塩水 （大塚製薬） で希釈調製し、 それぞれ 100 / Lずつ投与した。各群の DayOより経 B的にノギスによる腫瘍径の測定を行い、 実施例 2の式 2に示す式により、 腫瘍体積を算出した。
Dayl7以降に A群ではマウスの腫瘍死が始まったため、腫瘍体積の評価は Day で終了した。 各群の腫瘍体積の平均値の経日的推移を第 6図に示す。第 6図に示したように、 B群および C 群においては未処理の A群に対して弱い抗腫瘍効果しか見られないものの、 D群においては顕 著な抗腫瘍効果が観察された。
さらに評価最終日における T/C値を第 5表に示す。各群における抗腫瘍効果の判定（T/C値） は、評価最終日 （Dayl4) における A群の腫瘍体積の平均値に対する各群の腫瘍体積の平均値の 比 （T/C値） の比較を行うため、 以下の式 3に従い算出した。
(式 3 )
(T/C値） = (Dayl4の各群の腫瘍体積の平均値） / (Dayl4の A群の腫瘍体積の平均値） KM2760、 G- CSF両薬剤の薬効が単純に加算された時の T/C値の理論値、 すなわち各薬剤単独 群の T/C値を掛け合わせど比べると、 実際の併用群の T/C値 （表中の C) は、 理論値である 0. 30よりも低い値 （0. 10) を示した。
第 5 表
ϋ A B C D 理論値 (B X C)
T/C値 1. 0 0. 48 0. 63 0. 10 0. 30 以上より、 KM2760と G - CSFとの併用投与は、 それぞれの単独投与より、 高い抗腫瘍効果を示 し、 相乗効果を示すことが明らかとなった。
実施例 7 抗 CCR4ヒト型キメラ抗体 KM2760と IFN - aの併用投与による抗腫瘍効果
CCR4/EL4細胞を 5 X 105個/ mLで RPMI1640培地 （Gibco BRL社製） に懸濁し、 該懸濁液 100 μ 1を C57BL/6マウス （日本クレア、雄、 8週齢） の尾静脈内に移植した。 さらにマウスを下記 A 〜Dまで群分けした後、 各マウスに A〜！）の各薬剤を投与した。 なお、 腫瘍を移植した日を Day 0とした。
A. 陰性対照群:非投与 B. IFN- o;単独群： IFN- α (Universal type I interferon, PBLパイオメディカルラボラトリ ーズ社製） を Daylから Day5の 5日間、 1日 1回、 1匹あたり 5 X 104unitsを静脈内投与した。
C. 謂 2760単独群： 腿 2760を Daylと Day5に 1日 1回、 1匹あたり 0. 5 /z gで静脈内投与した。
D. KM2760 + IFN - α併用群： KM2760を Daylと Day5に 1日 1回、 1匹あたり 0. 5 gで静脈内投 与し、 IFN- aを Daylから Day5の 5日間、 1日 1回、 1匹あたり 5 X 10 unitsで静脈内投与し た。
実験は A群 7匹、 B、 C、 D群は各 6匹で行った。腿2760はクェン酸緩衝液（lOmMクェン酸、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 pH6) 、 IFN- aは 0. 1%ゥシ血清アルブミンを含む PBSで希釈調製し、 それぞれ 100 ずつ投与した。 Dayl4に全てのマウスの体重を測定し、エーテル麻酔と放血を 行った後に頸椎脱臼して安楽死させて、 肝臓を摘出したのち肝臓重量を測定し、 各個体の体重 に対する肝臓重量の割合 （以降、 肝臓重量比率と称する） を百分率で算出した。
抗腫瘍効果の評価は、 同時に測定した未処理の健康なマウスの肝臓重量 ϋヒ率（6匹の平均値） に対し、 腫瘍細胞の転移によって増加した各群の肝臓重量比率を比較することにより行った。 各群の肝臓重量比率を第 7図に示す。 第 7図に示したように、 Β群および C群においては未 処理の Α群に対して弱い抗腫瘍効果しか見られないものの、 D群においては顕著な抗腫瘍効果 が観察された。
さらに各群における肝臓中の腫瘍細胞の残存の程度を、 T/C値として下式に従い算出した。 (式 4 )
T/C= (各群の肝臓重量比率の平均値-未処理マウス肝臓重量比率の平均値） I (陰性対照群の 肝臓重量比率の平均値 -未処理マウス肝臓重量比率の平均値） 得られた T/C値を表 6に示す。 KM2760、 IFN- α両薬剤の薬効が単純に加算された時の T/C値 の理論値、 すなわち各薬剤単独群の T/C値を掛け合わせた値と比べると、 実際の併用群の T/C 値 （表中の C) は、 理論値である 0. 25よりも低い値 （0. 088) を示した。
第 6 表
H A B C D 理論値 (B X C)
T/C値 1. 0 0. 48 0. 52 0. 088 0. 25 以上より、腿 2760と IFN- o;の併用投与は、それぞれの単独投与より、高い抗腫瘍効果を有し、 相乗効果を示すことが明らかとなった。
実施例 8 抗 CCR4ヒト型キメラ抗体 KM2760と M- CSFの併用投与による抗腫瘍効果
CCR4/EL4細胞（W001/64754)を 1 X 105個/ mLで RPMI1640培地（Gibco BRL社製） に懸濁し、該 懸濁液 200 /z Lを C57BL/6マウス （日本クレア、雄、 8週齢） の腹腔内に移植した。 さらに下記 の A〜Dに群分けした後、各マウスに A〜Dの各薬剤を投与した。 重瘍を移植した日を DayOとし た。 '
A. 陰性対照群:非投与
B. M- CSF単独群： M-CSF (ロイコプロール、 協和醱酵工業社製） を Day_3から Day- 1まで 1日 2回、 DayOは 1日 1回、 計 7回、 1匹あたり 100 μ gで腹腔内投与した。 T/JP2004/018430
C. KM2760単独群: KM2760を DayOに 1日 1回、 1匹あたり 50 μ gで腹腔内投与した。
D. KM2760 + M-CSF併用群： KM2760を DayOに 1日.1回、 1匹あたり 50 gで腹腔内投与し、 D ay - 3から Day-1まで 1日 2回、 DayOは 1日 1回、 計 7回、 1匹あたり 100 μ gで腹腔内投与し た。
実験は各群 8匹で行った。各薬剤は KM2760はクェン酸緩衝液（10mMクェン酸、 l mM塩化 ナトリウム、 pH6) 、 M-CSFは生理食塩水 （大塚製薬） で希釈調製し、 100 Lずつ投与した。 抗 腫瘍効果の評価は、 各群におけるマウスの生存日数の平均値の、 陰性対照群の生存日数の平均 値に対する割合 （以降、 延命率と称する） で行った。 各マウスの生存日数おょぴ各群の延命率 を第 7表に示す。
第 7 ('表 群 生存日数 平均生存日数 延命率
A 17， 18, 18, 19, 19, 20 20, 22 19. 3 1. 00
B 17, 17, 18, 18, 18, 19: 19， 22 18. 8 0. 974
C 19, 21， 21, 21, 22, 24 26, 27 22. 9 1. 19
D 25.一 25.— 25.— 26._ 26.— 26. 27^_>50 _ _ >28. 8 ― —〉1. 49 (理論 Jt 1. 16) 第 7表に示したとおり、 B群では未処理の A群と比較して抗腫瘍効果が現れず、 C群では弱い 抗腫瘍効果しか見られないものの、 D群においては顕著な抗腫瘍効果が観察された。 K 760、 M -CSF両薬剤の薬効が単純に加算された時の延命率の理論値、すなわち各薬剤単独群の延命率を 掛け合わせた値と比べると、 実際の併用群の延命率 （表中の D) は理論値である 1. 16より高い 値 （> 1. 49) を示した。 なお、 D群中の 1匹は、 観察期間 （Day ) を超えてもなお生存してい た。
以上より、 KM2760と M- CSFの併用投与は、 それぞれの単独投与により、 高い抗腫瘍効果を有 し、 相乗効果を示すことが明らかとなった。
産業上の利用可能性
ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片 と、 少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬が提供される。
配列番号 13-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 14-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 15-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域ァミノ酸配列
配列番号 16-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 17-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 18-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域ァミノ酸配列

Claims

請求の範囲
1 . ヒ ト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断 片と、 少なくとも 1種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬。
2 . CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも.1種類の薬剤 とを併用して投与するための医薬。
3 . CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片と、少なくとも 1種類の薬剤 とを同時に又は逐次的に投与するための医薬。 '
4 . 医薬が、 抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬。
5 . 腫瘍が CCR4を発現している腫瘍である請求項 4に記載の医薬。
6 . CCR4が発現している腫瘍が造血器腫瘍である請求項 5に記載の医薬。
7 . CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、 CCR の細胞外領域に特異 ¾に結合し、 ヒト血小板に反応性を示さない抗体である請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の 医薬。
8 . CCR4の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片力 CCR4リガン ドでめる TARC (thymus and activation-regulated cheraokine) 7こ fま MDC i,macrophage-deri ved chemokine) の CCR4への結合を阻害する活性を有さない請求項 7に記載の医薬。
9 . 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176~206および 2 71〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である請求項 7または 8に記載の医薬。
1 0 . 細胞外領域が、 配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 2〜29番目に存在するェピトープ である請求項 7〜 9のいずれか 1項に記載の医薬。
1 1 .細胞外領域が、配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 13〜29番目に存在するェピトープ である請求項 7〜1 0のいずれか 1項に記載の医薬。 '
1 2 .細胞外領域が、配列番号 1で示されるァミノ酸配列の 13〜25番目に存在するェピトープ である請求項 7〜1 1のいずれか 1項に記載の医薬。
1 3 . CCR4に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、配列番号 1で示される アミノ酸配列の 13〜25番目を含むペプチドのうち、 16、 19、 20および 22番目の少なくとも 1 つのチロシン残基が硫酸化されたぺプチドへの結合性が配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むペプチドへの結合性よりも低いことを特徴とする請求項 1 2に記載の医薬。
1 4 . CCR4の細胞外領域に特異的に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片が、ハイプリ ドーマ KM2160 (FERM BP-10090) が生産するモノクローナル抗体が認識するェピトープに特異 的に反応する抗体または該抗体断片である、 請求項 1〜1 3のいずれか 1項に記載の医薬。
1 5 . ヒト型遺伝子組換え抗体がヒト型キメラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である請求項 1 〜1 4のいずれか 1項に記載の医薬。
1 6 . ヒト型キメラ抗体が CCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領 域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR)を含む、 請求項 1 5に記載の医 薬。
1 7 . ヒト型キメラ抗体が配列番号 5、 6、 7で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域）の CDR1、 CDR2、 CDR3および Zまたはそれぞれ配列番号 8、 9、 10で表される アミノ酸配列からなる軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3を含む請求項 1 5または 1 6に 記載の医薬。
1 8 . ヒト型キメラ抗体が配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる抗体分子の重鎖 (H鎖） 可弯領域 （V領域） および Zまたは配列番号 12で表される抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域を含 む請求項 1 5〜1 7のいずれか 1項に記載の医薬。
1 9 . ヒト型 CDR移植抗体が CCR4に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変 領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR)を含む、 請求項 1 5に記載の 医薬。
2 0 . ヒト型 CDR移植抗体が配列番号5、 6、 7で表されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖 (H 鎖） 可変領域 （V領域）の CDR1、 CDR2、 CDR3および Zまたはそれぞれ配列番号 8、 9、 10で表さ れるアミノ酸配列からなる軽鎖 （L鎖） V領域の CDR1、 CDR2、 CDR3を含む請求項 1 5または 1 9に記載の医薬。
2 1 . ヒト型 CDR移植抗体が配列番号 16または 17で示されるァミノ酸配列で表されるァミノ 酸配列からなる抗体分子の重鎖 (H鎖） 可変領域 (V領域)および Zまたは配列番号 18で表され る抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域を含む、請求項 1 5、 1 8および 2 0のいずれか 1項に記載の 医薬。
2 2 .薬剤が、蛋白質または低分子の薬剤である請求項 1〜 2 1のいずれか 1項に記載の医薬。
2 3 . 蛋白質が、 サイトカインまたは抗体である、 請求項 2 2記載の医薬。
2 4 . サイトカインが、 G- CSF、 M- CSF、 インターフェロン一な、 IL - 2および IL- 15から選ばれ るサイトカインである請求項 2 3記載の医薬。
2 5 . 低分子の薬剤が、 化学療法剤またはホルモン療法剤である請求項 1 ~ 2 4のいずれか 1 項に記載の医薬。
2 6 . 化学療法剤が、 ビンクリスチン、 シクロフォスフアミ ド、 エトポシドおよぴメ ト トレキ セートから選ばれる薬剤である請求項 2 5に記載の薬剤。
PCT/JP2004/018430 2003-12-04 2004-12-03 ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬 WO2005053741A1 (ja)

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