ES2353223T3 - Medicamento que contiene un anticuerpo modificado genã‰ticamente contra el receptor de la quimiocina ccr4. - Google Patents

Abstract

Medicamento que comprende una combinación de un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un receptor 4 de quimiocina CC humana (CCR4) y por lo menos un agente, en el que dicho agente se selecciona de entre G-CSF, M-CSF, vincristina, ciclofosfamida, etopósido y metotrexato.

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un medicamento que comprende una combinación de un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un receptor 4 de quimiocina CC humana (CCR4) o un fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Cuando un ligando se une a un receptor de quimiocina se produce una migración de leucocitos. El receptor 4 de quimiocina CC humana (en adelante denominado CCR4) que se expresa principalmente en los linfocitos T colaboradores CD4 positivos tipo Th2 en un tejido normal es un tipo de la familia del receptor de quimiocina [Int. Immunol.; 11, 81 (1999)]. CCR4 se combina específicamente con TARC (quimiocina regulada por el timo y activación) o MDC (quimiocina procedente de macrófagos). Se considera que los linfocitos T colaboradores CD4 positivos tipo Th2 que controlan la inmunidad humoral, desempeñan una función importante en las enfermedades alérgicas o en las enfermedades autoinmunitarias.

En las células de leucemia/linfoma tipo linfocito T descritas anteriormente, se expresan varios receptores de quimiocina, y existe una relación entre los subtipos de leucemia/linfoma de linfocitos T y varios tipos de receptores expresados en las células. Se informó de que CCR4 se expresa con mucha frecuencia en las células de leucemia/linfoma [Blood, 96, 685 (2000)]. Ya que CCR4 se expresa con mucha frecuencia en el linfoma macrocítico anaplásico positivo a ALK y en la micosis fungoide, se sugirió una posibilidad de que CCR4 sea un marcador tumoral con selectividad muy alta en los carcinomas específicos [Blood, 96, 685 (2000), Mod. Pathol., 15, 838, (2002), J. Invest. Dermatol., 119, 1405 (2002)]. Se informó de que CCR4 se expresa completamente con una alta frecuencia también en la leucemia de linfocitos T en el adulto (en adelante denominada ATL) producida por infección con virus de leucemia tipo I de linfocitos T humanos) [Blood, 99, 1505 (2002)]. Con respecto a la expresión de CCR4 en ATL, la expresión de CCR4 se correlaciona significativamente con un mal pronóstico [Clin. Cancer Res., 9, 3625, (2003)]. Además, CCR4 se expresa selectivamente en las células de linfoma crónico de linfocitos T (en adelante denominado CTL) [J. Invest. Dermatol., 119, 1405 (2002)].

El procedimiento para tratar la leucemia/linfoma es principalmente la quimioterapia que utiliza una combinación de varios agentes anticancerosos de bajo peso molecular. Sin embargo, la quimioterapia que proporciona efectos terapéuticos satisfactorios ha sido desconocida hasta ahora [Ganto Kagaku Ryoho, 26, Supplement I, 165-172, (1999)].

Entre la leucemia/linfoma positivas a CCR4 descritos anteriormente, el pronóstico de ATL es escaso en particular. Con respecto a los pacientes que padecen leucemia aguda o linfática que ocupan más del 70% de ATL total y han experimentado terapia CHOP común (terapia que utiliza ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisona combinadas), la tasa de supervivencia en 4 años es aproximadamente del 5% [British J.

Haematol., 79, 428-437 (1991)].

En quimioterapia convencional, a veces es difícil provocar la remisión a causa de la venida de las células tumorales resistentes a fármacos. Sin embargo, a veces se obtienen excelentes resultados terapéuticos mediante combinación de quimioterapia y un anticuerpo. El anticuerpo rhuMAb HER2 humanizado anti-HER2/neu (Herceptina/trastuzumab, Roche) presentó un efecto sobresaliente contra el cáncer de mama en politerapia con un agente anticanceroso taxano [Clinical Therapeutics, 21, 309 (1999)]. El anticuerpo IDEC-C2B8 híbrido humano anti-CD20 (Rituxan/rituximab, IDEC) presentó un efecto sobresaliente contra el linfoma de linfocitos B por politerapia con polifarmacoterapia [J. Clin. Oncol., 17, 268 (1999)].

La politerapia que utiliza un anticuerpo y una citocina es esperada también como nueva inmunoterapia contra tumores. Una citocina es un término general para varios factores humorales que controlan la interacción intracelular en una reacción inmunitaria. Una actividad citotóxica mediada por células dependientes de anticuerpos (en adelante denominada ADCC), una de las actividades citotóxicas, se provoca combinando un anticuerpo a una célula efectora tal como una célula mononuclear, un macrófago o una célula NK [J. Immunol.; 138, 1992 (1987)]. Con objeto de activar una célula efectora, se ha intentado la politerapia que utiliza una combinación de un anticuerpo y una citocina. Con respecto a la leucemia/linfoma de linfocitos B se ha realizado una prueba clínica administrando IDEC-C2B8 e interleucina (IL-2) [British J. Haematol., 117, 828-834 (2002)]

o IDEC-C2B8 y factor estimulante de colonias de granulocitos [Leukemia, 17, 1658-1664, (2003)] combinados. Sin embargo, no se ha observado un efecto terapéutico sobresaliente en comparación con la utilización del anticuerpo solo.

El anticuerpo KM 2760 anti-CCR4 se ha conocido como agente terapéutico contra la leucemia/linfoma positivo a CCR4 que reduce selectivamente las células tumorales mediante ADCC (documento WO 03/18635). La patente EP 1270595 describe un anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo que reacciona específicamente con un dominio extracelular de CCR4 humano. Flieger et al., (HIBRIDOMA, 18, 63-68, 1999) informan de un aumento de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por combinación de citocinas, en el que se diferencia entre citocinas que aumentan ADCC, las que disminuyen ADCC y las que no tienen ningún efecto. La utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 y un agente quimioterapéutico o una citocina se ha desconocido hasta ahora.

En el tratamiento de cánceres, especialmente leucemia y linfoma, un método terapéutico que da lugar a efectos satisfactorios ha sido desconocido hasta ahora.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un medicamento que comprende una combinación de anticuerpo recombinante anti-CCR4 o un fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente seleccionado de entre G-CSF, M-CSF, vincristina, ciclofosfamida, etopósido y metotrexato.

La presente invención se refiere a los apartados (1) a (20) siguientes.

(1)

Un medicamento que comprende una combinación de un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un receptor 4 de quimiocina CC humana (CCR4) y por lo menos un agente, en el que dicho agente se selecciona de entre G-CSF, M-CSF, vincristina, ciclofosfamida, etopósido y metotrexato.

(2)

Medicamento según el apartado (1), en el que dicho anticuerpo y dicho por lo menos un agente deben administrarse simultánea o sucesivamente.

(3)

Medicamento según el apartado (1) o (2), que es un fármaco antitumoral.

(4)

Medicamento según el apartado (3), en el que el tumor es un tumor en el que se expresa CCR4.

(5)

Medicamento según el apartado (4), en el que el tumor en el que se expresa CCR4 es un tumor de órgano hematopoyético.

(6)

Medicamento según cualquiera de los apartados (1) a (5), en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4 es un anticuerpo que se une específicamente a una región extracelular de CCR4 y no presenta reactividad con una plaqueta humana.

(7)

Medicamento según el apartado (6), en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a la región extracelular de CCR4, no tiene una actividad de inhibición del enlace de TARC (quimiocina regulada por el timo y activación) o MDC (quimiocina procedente de macrófagos) como un ligando de CCR4 a CCR4.

(8)

Medicamento según los apartados (6) o (7), en el que la región extracelular es una región extracelular seleccionada de entre el grupo constituido por 1 a 39, 98 a 112, 176 a 206 y 271 a 284 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

(9)

Medicamento según cualquiera de los apartados (6) a (8), en el que la región extracelular es un epítopo existente en las posiciones 2 a 29 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

(10)

Medicamento según cualquiera de los apartados (6) a (9), en el que la región extracelular es un epítopo existente en las posiciones 13 a 29 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

(11)

Medicamento según cualquiera de los apartados (6) a (10), en el que la región extracelular es un epítopo existente en las posiciones 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

(12)

Medicamento según el apartado (11), en el que en el anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4, una actividad de unión a un péptido que comprende 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 1 en la que por lo menos uno de los restos 16, 19, 20 y 22 de tirosina está sulfatado, es menor que una actividad de unión a un péptido que comprende 13 a 25 aminoácidos de la secuencia representada por la SEC. ID. nº 1.

(13)

Medicamento según cualquiera de los apartados (1) a (12), en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a la región extracelular de CCR4 es un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal que produce el hibridoma KM 2160 (FERM BP-10090).

(14)

Medicamento según cualquiera de los apartados (1) a (13), en el que el anticuerpo recombinante humano es un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo injertado con RDC humano.

(15)

Medicamento según el apartado (14), en el que el anticuerpo híbrido humano comprende regiones determinantes de complementariedad (RDC) de una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) y una región V de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CCR4.

(16)

Medicamento según el apartado (14) o (15), en el que el anticuerpo híbrido humano comprende RDC1, RDC2 y RDC3 de una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos representadas por SEC. ID. nº 5, nº 6 y nº 7, respectivamente, y RDC1, RDC2 y RDC3 de una región variable (región V) de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 8, nº 9 y nº 10, respectivamente.

(17)

Medicamento según el apartado (14) o (15), en el que el anticuerpo híbrido humano comprende una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 11y una región variable (región V) de una cadena ligera (cadena L) de una molécula de anticuerpo representada por la SEC. ID. nº 12.

(18)

Medicamento según el apartado (14), en el que el anticuerpo injertado con RDC humano comprende regiones determinantes de complementariedad (RDC) de una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) y de una región V de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CCR4.

(19)

Medicamento según el apartado (14) o (18), en el que el anticuerpo humano injertado con la RDC comprende RDC1, RDC2 y RDC3 de una región

variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos representadas por SEC. ID. nº 5, nº 6 y nº 7, respectivamente, y RDC1, RDC2 y RDC3 de una región variable (región V) de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 8, nº 9 y nº 10, respectivamente.

(20)

Medicamento según el apartado (14) o (18), en el que el anticuerpo injertado con RDC humano comprende una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 16 o nº 17 y una región V de una cadena ligera (cadena L) de una molécula de anticuerpo representada por la SEC. ID. nº 18.

Los ejemplos del medicamento definido anteriormente incluyen un medicamento que comprende una combinación del anticuerpo recombinante que reacciona específicamente con CCR4 o el fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente, un medicamento para administrar al anticuerpo recombinante que reacciona específicamente con CCR4 o el fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente combinados, y un medicamento para administrar el anticuerpo recombinante que reacciona específicamente con CCR4 o el fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente simultánea o sucesivamente.

El medicamento que comprende una combinación se refiere a un medicamento en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4 o el fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente se preparan independientemente y éstos se administran combinados ya sea simultánea o sucesivamente o un medicamento mezclado obtenido mezclando cada ingrediente. El medicamento obtenido mezclando cada ingrediente incluye un anticuerpo de fusión obtenido uniendo por lo menos un agente al anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4 o el fragmento de anticuerpo del mismo.

El anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4 y el fragmento de anticuerpo del mismo en la invención (denominándose ambos a veces anticuerpo de la invención) incluyen un anticuerpo recombinante que reacciona específicamente con una región extracelular de CCR4 humano y un fragmento de anticuerpo del mismo. Resultan preferidos un anticuerpo recombinante que no presenta reactividad a una plaqueta humana o un fragmento de anticuerpo de la misma, un anticuerpo recombinante que tiene ADCC elevado o un fragmento de anticuerpo del mismo.

Que un anticuerpo no presente reactividad a una plaqueta humana tal como se hace referencia en la presente memoria significa que un anticuerpo no reacciona sustancialmente con una plaqueta humana. Específicamente significa que no presenta reactividad en la medición con un citómetro de flujo.

Además, el anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que reacciona específicamente con la región que comprende las posiciones 1 a 39, 98 a 112, 176 a 206 ó 271 a 284 en las secuencias de aminoácidos representados por la SEC. ID. nº 1; resulta preferido un anticuerpo que reacciona específicamente con las posiciones 2 a 29 (SEC. ID. nº 2) en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1, es más preferido un anticuerpo que reacciona específicamente con las posiciones 12 a 29 (SEC. ID. nº 3) en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1 y el más preferido es un anticuerpo que reacciona específicamente con las posiciones 13 a 25 (SEC. ID. nº 4) en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1. El anticuerpo incluye además un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal que se une a CCR4 producido por el hibridoma KM 2160 (FERM BP-10090). El hibridoma KM 2160 se ha depositado en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japon, el 12 de agosto de 2004, con el número de registro FERM BP-10090.

El anticuerpo en la presente invención es preferentemente un anticuerpo con baja actividad de unión a un péptido en el que por lo menos un residuo de tirosina en las posiciones, 16, 19, 20 y 22 está sulfatado en el péptido que comprende las posiciones 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1 que una actividad de unión a un péptido que comprende 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

El anticuerpo en la invención incluye además un anticuerpo producido por células resistentes a la lectina que reconocen una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α, en un complejo tipo cadena de azúcar unida por N-glucosida (documentos WO 02/31140, WO 03/85118 y WO 03/85107).

Un anticuerpo recombinante de la presente invención incluye un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

Los ejemplos del anticuerpo humanizado son un anticuerpo híbrido humano y un anticuerpo injertado con RDC humano.

El anticuerpo híbrido humano se refiere a un anticuerpo que comprende la región V de la cadena H (en adelante denominada también HV o VH) de un anticuerpo de un animal no humano, y la región V de la cadena L (en la presente memoria después denominada también LV o VL) de un anticuerpo, y CH de anticuerpo humano y la región C de la cadena L (en adelante denominada también CL) de un anticuerpo humano. Como animal no humano puede utilizarse cualquier animal siempre que puedan prepararse hibridomas del animal. Animales adecuados incluyen el ratón, la rata, el hámster y el conejo.

El anticuerpo híbrido humano de la presente invención puede producirse obteniendo los ADN que codifican VH y VL de un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal procedente de un animal no humano que reacciona específicamente con CCR4 insertándolos en un vector de expresión para la célula animal que tiene genes que codifican CH del anticuerpo humano y CL del anticuerpo humano, para construir de este modo un vector para la expresión del anticuerpo híbrido humano y a continuación introduciendo el vector en una célula hospedadora para expresar el anticuerpo.

Cualquier CH de un anticuerpo híbrido humano puede utilizarse, con tal que pertenezca a una inmunoglobulina humana (en adelante denominada hIg), pero se prefieren los de la clase IgG y pueden utilizarse cualquiera de las subclases que pertenecen además a IgG tales como γ1, γ2, γ3y γ4. Además, como CL de un anticuerpo híbrido humano pueden utilizarse los de clase κ o de la clase λ.

El anticuerpo híbrido humano de la presente invención es un anticuerpo híbrido humano que comprende RDC1, RDC2 y RDC3 de VH que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 5, nº 6 y nº 7, respectivamente, y RDC1, RDC2 y RDC3 de VL que que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 8, nº 9 y nº 10, respectivamente. Específicamente, incluye un anticuerpo híbrido humano que comprende VH y VL que comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 11 y nº 12, respectivamente. Más específicamente incluye un anticuerpo híbrido humano en el que la VH del anticuerpo consiste en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 11, la región C de la cadena H del anticuerpo humano consiste en la secuencia de aminoácidos de la subclase higG1, la región V de la cadena L consiste en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 12 y la región C de la cadena L del anticuerpo humano consiste en una secuencia de aminoácidos de clase κ. Un ejemplo incluye el anticuerpo híbrido KM 2760 humano anti-CCR4 dado a conocer en el documento WO 01/64754.

El anticuerpo humano injertado con RDC se refiere a un anticuerpo en el que las RDC de VH y VL de un anticuerpo procedentes de un animal no humano que se une específicamente a CCR4 se injertan en puntos apropiados en VH y VL de un anticuerpo humano.

El anticuerpo humano injertado con RDC de la presente invención puede producirse construyendo los ADNc que codifican regiones V en las que las RDC de VH y VL de un anticuerpo procedente de un animal no humano que se une específicamente a CCR4 se injertan en FR o VH o VL de un anticuerpo humano arbitrario, insertando los ADNc resultantes en un vector de expresión para células animales que tiene los ADN que codifican la CH y la región C de la cadena H (en adelante denominada CL) de un anticuerpo humano, respectivamente, para construir un vector de expresión del anticuerpo humano injertado con RDC, e introduciendo el vector de expresión en una célula animal para producir la expresión.

Como procedimiento para seleccionar las secuencias de aminoácidos de los armazones (en adelante denominadas FR) de VH y VL de anticuerpo humano, pueden utilizarse cualquiera de los procedentes de anticuerpos humanos. Las secuencias adecuadas incluyen las secuencias de aminoácidos de los FR de VH y VL de anticuerpos humanos registrados en las bases de datos tales como el Banco de Datos de Proteínas y las secuencias de aminoácidos comunes a cada subgrupo de los FR de VH y VL de anticuerpos humanos (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, US Dept., Health and Human Services, 1991).

Como CH para el anticuerpo de la presente invención, puede utilizarse cualquier CH de anticuerpos, con tal que pertenezca a inmunoglobulina humana (denominada en adelante hIg), pero resultan preferidas las de clase IgG, y puede utilizarse alguna de las subclases más que pertenecen a IgG tales como γ1, γ2, γ3y γ4. Además, como CL de

anticuerpo híbrido humano, pueden utilizarse las de clase κ o de clase λ.

Un ejemplo de anticuerpo humano injertado con la RDC de la presente invención, es un anticuerpo humano injertado con la RDC o un fragmento de anticuerpo que comprende RDC1, RDC2 y RDC3 de VH del anticuerpo constituido por las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 5, nº 6 y nº 7, respectivamente; y/o RDC1, RDC2 y RDC3 de VL del anticuerpo constituido por las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 8, nº 9 y nº 10, respectivamente.

Los ejemplos preferidos incluyen un anticuerpo humano injertado con RDC, en el que el VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 13 o nº 14, y/o VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 15.

Los ejemplos más preferidos incluyen:

un anticuerpo humano injertado con RDC que comprende la VH de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Ala en la posición 40, Gly en la en la posición 42, Lys en la posición 43, Gly en la posición 44, Lys en la posición 76 y Ala en la posición 97 en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 13 están sustituidos por otro resto de aminoácidos;

un anticuerpo humano injertado con RDC que comprende la VH de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Thr en la posición 28, y Ala en la posición 97 en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 14 están sustituidos por otro resto de aminoácidos;

un anticuerpo humano injertado con RDC que comprende la VL de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Ile en la posición 2, Val en la en la posición 3, Gln en la posición 50 y Val en la posición 88 en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 15 están sustituidos por otro resto de aminoácidos;

un anticuerpo humano injertado con RDC que comprende la VH de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Ala en la posición 40, Gly en la en la posición 42, Lys en la posición 43, Gly en la posición 44, Lys en la posición 76 y Ala en la posición 97 está sustituido por otro resto de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 13, y la VL del anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Ile en la posición 2, Val en la en la posición 3, Gln en la posición 50 y Val en la posición 88 en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 15 está sustituido por otro resto de aminoácidos; y

Un anticuerpo humano injertado con RDC que comprende la VH de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Thr en la posición 28 y Ala en la posición 97 en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 14 están sustituidos por otro resto de aminoácidos, y la VL de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos uno o más restos de aminoácidos seleccionados de entre Ile en la posición 2, Val en la en la posición 3, Gln en la posición 50 y Val en la posición 88 en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC. ID. nº 15 están sustituidos por otro resto de aminoácidos.

Los ejemplos más preferidos incluyen un anticuerpo injertado con una RDC que comprende la región variable (región V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 16 o nº 17 y la región V de la cadena ligera (cadena L) de la molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 18.

Además, dentro del alcance de la presente invención están incluidos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que reaccionan específicamente con CCR4 y consisten en secuencias de aminoácidos en las que uno o más restos de aminoácidos se eliminan, añaden, sustituyen o insertan en las secuencias de aminoácidos anteriores.

La expresión “uno o más restos de aminoácidos se eliminan, sustituyen, insertan o añaden en la secuencia de aminoácidos de la presente invención” significa que uno o más aminoácidos se eliminan, sustituyen, insertan o añaden en una sola posición o en varias posiciones arbitrarias en la secuencia de aminoácidos. La eliminación, sustitución, inserción y adición puede producirse en la misma secuencia de aminoácidos simultáneamente y los restos de aminoácidos que han de sustituirse, insertarse o añadirse pueden ser naturales o artificiales. Los ejemplos de restos de aminoácidos naturales son L-alanina, L-asparagina. L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina y L-cisteína.

Los siguientes son los ejemplos preferidos de los restos de aminoácidos capaces de sustitución mutua. Los restos de aminoácidos en el mismo grupo presentados a continuación pueden sustituirse mutuamente.

Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2

amino-butanoico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina y

ciclohexilalanina.

Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico y ácido 2-aminosubérico.

Grupo C: asparagina y glutamina.

Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico y ácido 2,3diamino-propiónico.

Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina y 4-hidroxiprolina.

Grupo F: serina, treonina y homoserina.

Grupo G: fenilalanina y tirosina.

Los ejemplos específicos de anticuerpos humanos injertados con RDC en la invención incluyen un anticuerpo humano injertado con RDC descrito en el documento WO 03/18635, un anticuerpo humano injertado con RDC preparado a partir del anticuerpo monoclonal 1G1, 2B10 o 10E4, tal como se describe en el documento WO 00/42074, un anticuerpo humano injertado con RDC preparado a partir de un anticuerpo humanizado o de un anticuerpo monoclonal 252Y o 252Z tal como se describe en el documento WO 99/15666, un anticuerpo humano injertado con RDC preparado a partir de un anticuerpo monoclonal tal como se describe en la patente US nº 6.245.332.

El anticuerpo humano original significa un anticuerpo existente por naturaleza en el cuerpo humano. Sin embargo, incluye además anticuerpos extraídos de un banco de fagos de anticuerpo humano y de animales transgénicos que producen anticuerpos humanos preparados mediante los avances recientes en ingeniería genética, ingeniería celular y técnicas de desarrollo de ingeniería.

Con respecto al anticuerpo que existe por naturaleza en el cuerpo humano, por ejemplo, se aíslan linfocitos humanos de la sangre periférica, se infectan con virus EB para inmortalización y clonación, con lo que los linfocitos que producen los anticuerpos pueden cultivarse, y el anticuerpo puede purificarse en el cultivo.

El banco de fagos de anticuerpos humanos es un banco en el que un gen del anticuerpo preparado a partir de un linfocito B humano se inserta en un gen del fago para expresar un fragmento de anticuerpo tal como Fab o scFv en la superficie del fago. Un banco en el que la mutación se introduce de forma artificial puede utilizarse para desarrollar el banco. En el banco, un fago que tiene una actividad de unión al antígeno deseada puede recuperarse utilizando una actividad de unión a un sustrato con un antígeno inmovilizado en el mismo como índice. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas por un procedimiento de ingeniería proteica.

El animal transgénico que produce anticuerpos humanos significa un animal en el cual se incorpora un gen de anticuerpo humano a las células. Específicamente, se menciona un ratón transgénico que produce anticuerpos humanos preparado introduciendo un gen de anticuerpo humano en una célula ES de ratón, injertando la célula ES en un embrión inicialmente del ratón y desarrollando el mismo. Con respecto al procedimiento para preparar un anticuerpo humano procedente de un animal transgénico que produce anticuerpos humanos, el anticuerpo humano puede producirse y acumularse en un sobrenadante de cultivo cultivando un hibridoma que produce anticuerpos humanos mediante un procedimiento de preparación de hibridomas llevado a cabo generalmente en un procedimiento de fusión celular.

Los ejemplos de animales transgénicos no humanos incluyen ganado vacuno, ovejas, cabras, cerdos, caballos, ratones, ratas, pollos, monos y conejos.

Un fragmento de anticuerpo de la presente invención incluye Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, Diacuerpo, dsFv, y un péptido que comprende la RDC. Un Fab es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y con actividad de unión al antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado del terminal N de la cadena H y la cadena completa, entre los fragmentos obtenidos tratando una molécula de anticuerpo tipo IgG con una proteasa, papaína (que escinde en el resto de aminoácido en la posición 224 de la cadena H), se unen mediante un enlace disulfuro (enlace S-S).

El Fab de la presente invención puede obtenerse tratando el anticuerpo humano injertado con RDC de la presente invención, que reacciona específicamente con CCR4 humano, con la proteasa, papaína. Alternativamente, el Fab puede producirse insertando el ADN que codifica el Fab del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o eucariotas, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para provocar la expresión.

Un F(ab’)2 es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100.000 y con una actividad de unión al antígeno que es significativamente mayor que el Fab unido mediante un enlace S-S en la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando una molécula de anticuerpo tipo IgG con una proteasa pepsina (que escinde el resto de aminoácidos en la posición 234 de la cadena H).

El F(ab’)2 de la presente invención puede obtenerse tratando el anticuerpo humano injertado con RDC de la presente invención que reacciona específicamente con CCR4 humano con la proteasa pepsina. Alternativamente, el F(ab’)2 puede prepararse uniendo los fragmentos de Fab’ descritos a continuación mediante un enlace tioéter o un enlace S-S.

Un Fab’ es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión al antígeno, que se obtiene escindiendo el enlace S-S en la región bisagra del F(ab’)2 anterior.

El Fab’ de la presente invención puede obtenerse tratando el F(ab’)2 de la presente invención que se une específicamente a CCR4 humano con un agente reductor, ditiotreitol. Alternativamente, el Fab’ puede producirse insertando el ADN que codifica el Fab’ del anticuerpo humano injertado con RDC que reacciona específicamente con CCR4 en un vector de expresión para procariotas o eucariotas, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para producir la expresión.

Un scFv es un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH en el que una cadena VH y una cadena VL se unen utilizando un enlazador peptídico (P) apropiado, de 12 o más restos de aminoácidos y que tiene una actividad de unión al antígeno.

El scFv de la presente invención puede producirse obteniendo los ADNc que codifican el VH y el VL del anticuerpo humano injertado con RDC que se une específicamente a CCR4, construyendo el ADN que codifica el scFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o eucariotas, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para producir la expresión.

Un diacuerpo es un fragmento de anticuerpo en el que scFv que tiene la misma o diferente especificidad de unión al antígeno forma un dímero, y tiene actividad de unión al antígeno divalente al mismo antígeno o a dos antígenos específicos que se unen por actividad a diferentes antígenos.

El diacuerpo de la presente invención, por ejemplo, un diacuerpo bivalente que se une específicamente a CCR4, puede producirse obteniendo los ADN que codifican VH y VL del anticuerpo humano injertado con CCR4 que se une específicamente a CCR4, construyendo el ADN que codifica a scFv que tiene un enlazador polipeptídico de 3 a 10 restos de aminoácidos, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas, y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el diacuerpo.

Un dsFv es un fragmento de anticuerpo que se obtiene uniendo polipéptidos en el que un resto de aminoácido de cada VH y VL se sustituye por un resto de cisteína y los restos de cisteína se unen mediante un enlace S-S entre los restos de cisteína. El resto de aminoácido que está sustituido con un resto de cisteína puede seleccionarse basándose en una estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo según el procedimiento presentado por Reiter et al.(Protein Engineering, 7, 697, (1994)).

El dsFv de la presente invención puede producirse obteniendo los ADNc que codifican VH y VL del anticuerpo humano injertado con CCR4 que se une específicamente a CCR4, construyendo el ADN que codifica a dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas, y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el dsFv.

Un péptido que comprende la RDC comprende una o más regiones de las RDC de VH yVL.

El péptido que comprende varias RDC puede producirse uniendo directamente a un enlazador peptídico apropiado o mediante el mismo. El péptido que comprende la RDC de la presente invención puede producirse construyendo los ADN que codifican la RDC de VH y VL del anticuerpo humano injertado con CCR4 que se une específicamente a CCR4, insertando los ADNc en un vector de expresión para procariota o un vector de expresión para eucariota, y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el péptido. Además, el péptido que comprende la RDC puede producirse por un procedimiento de síntesis química, tal como un procedimiento Fmoc (procedimiento del fluorenilmetoxicarbonilo) o por un procedimiento tBoc (procedimiento del t-butiloxicarbonilo).

Los agentes utilizados en la presente invención son M-CSF, G-CSF, vincristina, ciclofosfamida, etopósido y metotrexato.

Cuando el agente anterior se administra in vivo solamente a dosis alta, puede aumentar el temor de un posible efecto secundario. Sin embargo, en la presente invención, el agente anterior puede utilizarse a baja dosis combinándose con el anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4 o el fragmento de anticuerpo del mismo. Por consiguiente, además del efecto terapéutico satisfactorio, puede reducirse el efecto secundario.

El medicamento de la invención puede utilizarse contra células en las que se expresa CCR4. Las células tumorales resultan preferidos. Específicamente, se menciona como tumor un tumor del órgano hematopoyético.

El tumor de órgano hematopoyético incluye leucemia aguda, leucemia crónica, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no hodgkiniana.

Los ejemplos de leucemia aguda incluyen leucemia linfática aguda y ejemplos de leucemia linfática aguda incluyen la leucemia linfática aguda prelinfocitos T.

La leucemia crónica incluye la leucemia linfática crónica. Los ejemplos de leucemia linfática crónica incluyen la leucemia linfática crónica por linfocitos T, la leucemia prelinfática por linfocitos T, el linfoma leucémico de linfocitos T del adulto (ATL) y el síndrome de Sezary.

La enfermedad no hodgkiniana incluye el linfoma de linfocitos T/NK. Los ejemplos de linfoma de células T/NK incluyen el linfoma/leucemia por linfoblastos pre-T y el tumor de linfocitos T maduros.

Los ejemplos de tumor de linfocitos T maduros incluyen la leucemia prelinfocítica de linfocitos T, la leucemia linfocítica granular de linfocitos T grandes, el síndrome de Sezary, la micosis fungoide, linfoma macrocítico indiferenciado primario de la piel, linfoma de linfocitos T de tipo flemón subcutáneo, linfoma de linfocitos T del intestino tipo enfermedad intestinal, linfoma de linfocitos T γδ del hígado/bazo, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, linfoma periférico de linfocitos T, linfoma macrocítico indiferenciado y leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto.

El efecto del medicamento de la presente invención puede medirse por un procedimiento de medición de la actividad citotóxica in vitro. Como procedimiento de medición de la actividad citotóxica in vitro, se menciona el sistema de medición ADCC. ADCC puede medirse poniendo en contacto las células diana que expresan CCR4 como antígeno con células efectoras tales como las células mononucleares de la sangre periférica, monocitos, macrófagos o granulocitos recogidos de seres humanos o de otros animales, detectando el grado de células diana dañadas y determinando las mismas. El grado de células diana dañadas puede detectarse por un método de liberación de 51Cr, un método para detectar una actividad enzimática de células diana o un método de detección que utiliza un citómetro de flujo. El efecto del medicamento de la presente invención en el sistema de medición ADCC puede medirse añadiendo el agente al sistema de medición ADCC o exponiendo estos agentes a las células diana o a las células efectoras o a ambas durante un período recomendado y observando las influencias ejercidas sobre ADCC.

El efecto del medicamento de la presente invención puede examinarse midiendo una actividad antitumoral in vivo utilizando modelos animales.

Los ejemplos de los modelos animales incluyen los modelos de xenotrasplante obtenidos injertando una estirpe de células de cultivo procedentes de un tejido canceroso humano en ratones inmunodeficientes tales como ratones lampiños, modelos de isotrasplante obtenidos injertando una estirpe de células cancerosas de ratón cultivadas en ratones salvajes con un sistema inmunitario normal.

Los modelos de xenotrasplante pueden prepararse injertando una estirpe de células cancerosas humana, en varios puntos tales como por vía subcutánea, intracutánea, intraperitoneal e intravenosa de ratones inmunodeficientes, tales como ratones lampiños.

Los modelos de isotrasplante para la evaluación del medicamento para la presente invención pueden prepararse introduciendo un gen CCR4 en una estirpe celular de cultivo de ratón tal como la célula EL4 para formar un transformante positivo a CCR4 e insertando este transformado en varios puntos de ratones salvajes que tienen un sistema inmunitario normal.

El efecto del medicamento de la presente invención puede evaluarse comparando un efecto de la administración del anticuerpo solo o un efecto de la administración del agente solo con un efecto del medicamento de la presente invención utilizando los modelos animales.

El medicamento de la presente invención puede administración solo, pero generalmente se prefiere proporcionarlo en forma de preparación farmacéutica producida mezclándolo con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables según cualquier método bien conocido en el campo técnico de productos farmacéuticos.

Resulta preferido seleccionar una vía de administración que sea la más eficaz en el tratamiento. Los ejemplos incluyen la administración oral y la administración parenteral, tales como intraoral, traqueobronquial, intrarrectal, subcutánea, intramuscular e intravenosa. En una preparación de proteínas, resulta preferida la administración intravenosa.

Ejemplos de preparación adecuados para la administración oral son por atomización, en cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabe, emulsión, supositorios, inyección, pomada y esparadrapo.

La preparación líquida tal como emulsión y jarabe puede producirse utilizando agua, sacáridos tales como sacarosa, sorbitol y fructosa, glicoles tales como polietilenglicol y propilenglicol, aceites tales como aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de soja, antisépticos tal como p-hidroxibenzoato, aromatizantes tales como esencia de fresa y esencia de menta como aditivos.

Las cápsulas, comprimidos, polvo diluido, gránulos pueden producirse utilizando como aditivos excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa y manitol, agentes disgregadores tales como almidón y alginato sódico, lubricantes tales como estearato de magnesio y talco, aglutinantes tales como alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa y gelatina, tensioactivos tales como éster de ácido graso, plastificantes tal como glicerol.

Los ejemplos de preparación apropiada para administración parenteral son inyección, supositorio, pulverización con aire.

El supositorio se prepara utilizando un vehículo tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada o ácido carboxílico.

La pulverización con aire se prepara utilizando el medicamento tal cual o utilizando, por ejemplo, un vehículo que no estimula la boca ni la membrana mucosa de las vías respiratorias de una persona que se va a administrar y que dispersa el medicamento en finas partículas y facilita la absorción.

Los ejemplos específicos del vehículo son lactosa y glicerol. Dependiendo de la propiedad del medicamento y del vehículo utilizado, es posible preparar aerosol o nieve carbónica. Además, con frecuencia en la preparación parenteral, pueden añadirse componentes ilustrados como aditivos en la preparación oral.

Una dosis de un programa de administración varía dependiendo del efecto terapéutico deseado, del método de administración, del período terapéutico, de la edad y del peso corporal. La dosis de anticuerpo en una administración está comprendida normalmente entre 0,1 y 20 mg/kg para un adulto. El agente utilizado combinado con el anticuerpo se administra a una dosis igual o inferior a la dosis cuando el agente se utiliza solo en clínica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 muestra un efecto de mejora de una citocina contra una actividad citotóxica de un anticuerpo anti-CCR4. La ordenada muestra una citotoxicidad. ■ indica una actividad citotóxica con adición de citocina. □ indica una actividad citotóxica además de IL-2, y una trama indica actividad citotóxica además de IL-15 respectivamente. Una barra indica una desviación estándar.

La Fig. 2 indica un efecto proporcionado por la utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 y el agente de vincristina contra células CCRF-CEM injertadas en un ratón lampiño. La ordenada muestra los valores V/V0. □ indica un valor V/V0 de un grupo de referencia negativa, unas rayas inclinadas indican un valor VNO de un grupo de administración de KM 2760, un color gris indica un valor V/V0 de un grupo de administración de vincristina y ■ indica un valor V/V0 de un grupo de administración de KM 2760 y vincristina combinados, respectivamente. Una barra indica una desviación estándar.

La Fig. 3 indica un efecto proporcionado por la utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 y ciclofosfamida contra células CCRF-CEM injertadas en un ratón lampiño. La ordenada muestra los valores V/V0. □ indica un valor V/V0 de un grupo de referencia negativa, unas rayas inclinadas indican un valor VNO de un grupo de administración de KM 2760, un color gris indica un valor V/V0 de un grupo de administración de ciclofosfamida y ■ indica un valor V/V0 de un grupo de administración KM 2760 y ciclofosfamida combinados, respectivamente. Una barra indica una desviación estándar.

La Fig. 4 indica un efecto proporcionado por la utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 y etopósido contra células CCRF-CEM injertadas en un ratón lampiño. La ordenada muestra los valores V/V0. □ indica un valor V/V0 de un grupo de referencia negativa, unas rayas inclinadas indican un valor VNO de un grupo de administración de KM 2760, un color gris indica un valor V/V0 de un grupo de administración de etopósido y ■ indica un valor V/V0 de un grupo de administración KM 2760 y etopósido combinados, respectivamente. Una barra indica una desviación estándar.

La Fig. 5 muestra un efecto proporcionado por la utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 y metotrexato contra células CCRF-CEM injertadas en un ratón lampiño. La ordenada muestra los valores V/V0. □ indica un valor V/V0 de un grupo de referencia negativa, unas rayas inclinadas indican un valor VNO de un grupo de administración de KM 2760, un color gris indica un valor V/V0 de un grupo de administración de metotrexato y ■ indica un valor V/V0 de un grupo de administración KM 2760 y metotrexato combinados, respectivamente. Una barra indica una desviación estándar.

La Fig. 6 muestra un efecto proporcionado por la utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 y GCS-F contra células CCR4/EL4 injertadas en un ratón C57BL/6. La abscisa muestra el número de días después de injertar el tumor, la ordenada muestra el volumen del tumor, respectivamente. x indica un grupo de referencia negativo. ▲ indica un grupo que utiliza KM 2760 solo. ● indica un grupo que utiliza G-CSF solo, y □ indica un grupo de utilización combinada, respectivamente. Una barra indica una desviación estándar.

La Fig. 7 muestra un efecto proporcionado por la utilización combinada de un anticuerpo anti-CCR4 e IFN-α contra células CCR4/EL4 injertadas en ratones C57BL/6. La ordenada muestra una relación en peso de un hígado. Una barra indica una desviación estándar.

La presente invención se describe con detalle a continuación. La presente solicitud reivindica la prioridad de la Convención de la solicitud de patente japonesa nº 2003406590 y nº 2004-155141 presentada el 4 de diciembre de 2003 y el 25 de mayo de 2004, incluyendo los contenidos descritos en las memorias y/o dibujos de estas solicitudes.

MEJOR MODO DE PONER EN PRÁCTICA LA INVENCIÓN

Ejemplo 1 de referencia

Efecto de un anticuerpo anti-CCR4 y de una citocina combinados en una actividad citotóxica in vitro.

Se determinó el efecto de utilizar anticuerpo KM 2760 híbrido humano anti-CCR4 (FERM BP-7054, documento WO 01/64754) y una citocina combinados en una actividad citotóxica in vitro por el siguiente método:

(a) Preparación de una suspensión de células efectoras

Se extrajo sangre de una vena (50 ml) de una persona sana, se añadieron 0,5 ml de heparina sódica (fabricada por Shimizu Seyako K.K.) y se mezclaron suavemente. Se separó una capa de células mononucleares procedentes de la utilización de una solución de separación MONOPOLY (preparada por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) según el manual adjunto. Una vez la capa se sometió a centrifugación y se lavó con medio RPMI 1640-FCS (5) [medio RPMI 1640 que contiene FCS al 5% (Gibco BRL)] por tres veces, las células se volvieron a poner en suspensión en el mismo medio a una concentración de 3 x 106 células/ml para dar una suspensión de células efectoras.

(b) Estimulación de células efectoras por una citocina

La suspensión de células efectoras obtenidas en el apartado anterior se distribuyó a razón de 50 µl/pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U (fabricada por Falcon) en una cantidad de 50 µl/pocillo. Además, 50 µl de una solución de 2 nm/ml de IL-2 (fabricada por Peprotech) diluída con RPMI 1640-FCS (5), 50 µl de una solución de 2 ng/ml de IL-15 (fabricada por Peprotech) o 50 µl de RPMI 1640-FCS (5) como referencia negativa sin adición de una citocina se añadieron para separar las muestras y se dejaron en reposo todavía en una incubadora con CO2 al 5% durante 3 días.

(c) Preparación de una suspensión de células diana

Las células CCR4/EL4 (documento WO 01/064754) que son células tumorales transformadas obtenidas introduciendo un gen CCR4 humano en la estirpe celular EL4 de timoma de ratón se cultivaron en medio RPMI 1640-FCS (10) [medio RPMI 1640 que contiene FCS al 10% (fabricado por Gibco BRL)] que contiene 0,5 mg/ml de G418 (fabricado por Nacalai Tesque) se lavaron con medio RPMI 1640-FCS (5) sometido a centrifugación y suspensión, y a continuación se ajustaron a una concentración de 2 x 105 células/ml con medio RPMI 1640-FCS (5) para formar una suspensión de células diana.

(d) Medición de una actividad citotóxica

La suspensión de células diana (50 µl) preparada en el apartado (c) anterior, se añadió a cada pocillo de una placa de fondo con forma de U de 96 pocillos que contenía las células efectoras estimuladas con la citocina en el apartado (b) anterior, de modo que la concentración fue de 1 x 104 células/pocillo. En este momento la relación célula efectora: célula diana es 15:1. Además, se añadió KM 2760 de modo que la concentración final fue de 1 o 100 ng/ml a cada pocillo, de dejó reaccionar, y a 37ºC durante 4 horas. Después de la reacción, la placa se sometió a centrifugación, y se midió una actividad de ácido láctico deshidrogenasa (en adelante denominada LDH) en el sobrenadante obteniendo unos datos de absorbancia con el ensayo de actividad citotóxica no reactivo CytoTox96 (fabricado por Promega) según el manual adjunto. Se obtuvo por el mismo procedimiento un dato de absorbancia de la liberación espontánea de la célula diana, utilizando medio RPMI 1640-FCS(5) en el mismo volumen en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpos, y el dato de absorbancia de la liberación espontánea de la célula efectora se obtuvo por el mismo procedimiento que anteriormente utilizando medio RPMI 1640-FCS(5) en el mismo volumen en lugar de la suspensión de células diana y de la solución del anticuerpo. Con respecto a un dato de absorbancia de la liberación total de la célula diana, se condujo una reacción utilizando medio RPMI 1640FCS(5) en el mismo volumen en lugar de una solución de anticuerpo y de la solución de células efectoras, se añadieron 15 µl de una solución de Triton X-100 al 9% 45 minutos antes de la terminación de la reacción, y se realizó el mismo procedimiento que anteriormente para medir la actividad de LDH del sobrenadante. Se obtuvo ADCC utilizando la fórmula siguiente

(Fórmula 1)

Actividad citotóxica (%) = [(absorbancia de una muestra) -(absorbancia de la liberación espontánea de células efectoras) -(absorbancia de la liberación espontánea de la célula diana)]/[(absorbancia de la liberación total de la célula diana) -(absorbancia de la liberación espontánea de la célula diana)] x 100

Los resultados se muestran en la Fig. 1. La actividad citotóxica de KM 2760 aumentó en función de la concentración. Aumentó más por la adición de la citocina. Los resultados demuestran que la actividad citotóxica del anticuerpo anti-CCR4 mejora por la citocina que activa las células efectoras.

Ejemplo 2

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo anti-CCR4 y vincristina combinados

Las células CCRF-CCM (estirpe celular humana de leucemia de linfocitos T) se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) a una concentración de 2 x 108 células/ml, y se injertaron 100 µl de una suspensión en la piel ventral de ratones Balb/c lampiños (Nippon Crea, macho). El día 15 después del injerto de células, se midió el diámetro de un tumor con calibradores, y se calculó el volumen del tumor utilizando la fórmula siguiente:

(Fórmula 2)

Volumen del tumor = diámetro corto x diámetro corto x diámetro largo x 0,5

Individuos con el volumen del tumor comprendido dentro del intervalo de 140 a 342 mm3 (260 mm3 de media) se seleccionaron, y se agruparon de tal manera que el promedio del volumen del tumor fuera casi el mismo. Cada uno de los siguientes agentes A a D se administraron a los ratones. Dicho sea de paso, el día de la agrupación se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

C. Grupo de administración de vincristina (denominado en adelante VCR; inyección de Oncovin, Eli Lilly Japón K.K.) solo: se administraron 0,55 mg/kg de VCR a cada ratón el día 0.

D. Grupo de administración de KM 2760 y VCR combinados: se administraron 0,55 mg/kg de VCR a cada ratón el día 0, y se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

El experimento se realizó con grupos que constaban cada uno de cinco ratones. Se diluyó cada uno de los agentes con una solución salina fisiológica (Otsuka Seiyaku) y se administró el diluyente en la vena caudal. El día 10, se midió el volumen del tumor, se evaluó el efecto antitumoral comparando los valores medios de un cambio del volumen del tumor (V/V0) el día 10 cuando el volumen del tumor el día 0 en cada grupo se definió como V0.

En la Fig. 2 se muestran los valores medios de V/V0 de cada grupo. Como se muestra en la Fig. 2, la administración de KM 2760 y VCR combinados, presentaba el efecto mayor de crecimiento sorprendente que la administración de VCR o el anticuerpo solo.

Un valor (T/C) obtenido dividiendo V/V0 de cada grupo por VNO del grupo de referencia negativo se presenta en la Tabla 1. En comparación con el valor teórico de T/C añadiendo simplemente los efectos farmacéuticos tanto de KM 2760 como de VCR, es decir, un valor obtenido multiplicando los T/C de los grupos de administración de los respectivos agentes solos, T/C real del grupo de administración combinado (C en la tabla) presentó el valor menor (0,11) que 0,21, el valor teórico el día 10.

Tabla 1

T/C de cada grupo

A. Referencia negativa B. KM 2760 C. VCR D. KM 2760 + VCR Valor teórico (B x C) 1 0,43 0,49 0,11 0,21

A partir de lo expuesto anteriormente, se aprecia que la administración de KM 2760

y VCR combinados presenta efecto antitumoral mayor que la administración de KM 2760 o

VCR solo y presenta el efecto sinérgico.

Ejemplo 3

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo anti-CCR4 y ciclofosfamida combinados

Las células CCRF-CCM (estirpe celular humana de leucemia de linfocitos T) se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) a una concentración de 2 x 108 células/ml, y se injertaron por vía intradérmica 100 µl de la suspensión en el costado derecho de ratones Balb/c lampiños (Nippon Crea, macho). El día 18 después del injerto de células, se midió el diámetro de un tumor con calibradores, y se calculó el volumen del tumor utilizando la fórmula 2 del Ejemplo 2.

Se seleccionaron individuos con el volumen del tumor comprendido dentro del intervalo entre 116 y 349 mm3 (219 mm3 de media), y se agruparon de tal manera que el promedio del volumen del tumor fuera casi el mismo. Se administraron a los ratones cada uno de los agentes A a D siguientes. Dicho sea de paso, el día de la agrupación se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

C. Grupo de administración deciclofosfamida (denominado en adelante CPA; Endoxan inyectable, Baxter) sola: se administraron 65 mg/kg de CPA a cada ratón el día 0.

D. Grupo de administración de KM 2760 y CPA combinados: se administraron 65 mg/kg de CPA a cada ratón el día 0, y se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

El experimento se realizó con grupos que constaban cada uno de cinco ratones. Se diluyó cada uno de los agentes con una solución salina fisiológica (Otsuka Seiyaku) y se administró el diluyente en la vena caudal. El día 4, se midió el volumen del tumor. Se evaluó el efecto antitumoral comparando los valores medios de un cambio del volumen del tumor (V/V0) en cada día de medición cuando el volumen del tumor el día 0 en cada grupo se definió como V0.

En la Fig. 3 se muestra el cambio cronológico en los valores medios de V/V0 de cada grupo. Como se muestra en la Fig. 3, la administración de KM 2760 y VCR combinados, presentaba el mayor efecto de crecimiento sorprendente que la administración de CPA o el anticuerpo solo.

Un valor (T/C) obtenido dividiendo VNO de cada grupo por V/V0 del grupo de referencia negativo se presenta en la Tabla 2. En comparación con el valor teórico de T/C añadiendo simplemente los efectos farmacéuticos tanto de KM 2760 como de CPA, es decir, un valor obtenido multiplicando los T/C de los grupos de administración de los respectivos agentes solos, T/C real del grupo de administración combinado (D en la tabla) presentó el valor menor (0,35) que 0,39, el valor teórico.

Tabla 2

T/C de cada grupo

A. Referencia negativa B. KM 2760 C. CPA D. KM 2760 + CPA Valor teórico (B x C)

1,00 0,80 0,48 0,35 0,39

A partir de lo expuesto anteriormente, se aprecia que la administración de KM 2760 y CPA combinados presenta efecto antitumoral mayor que la administración de KM 2760 o CPA sola y presenta el efecto sinérgico.

Ejemplo 4

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo anti-CCR4 y etopósido combinados

Las células CCRF-CEM (estirpe celular humana de leucemia de linfocitos T) se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) a una concentración de 2 x 108 células/ml, y se injertaron 100 µl de la suspensión en la piel ventral de ratones Balb/c lampiños (Nippon Crea, macho). El día 17 después del injerto de células, se midió el diámetro de un tumor con calibradores, y se calculó el volumen del tumor utilizando la fórmula 2 del Ejemplo 2.

Se seleccionaron individuos con el volumen del tumor comprendido dentro del intervalo entre 121 y 348 mm3 (195 mm3 de media), y se agruparon de tal manera que el promedio del volumen del tumor fuera casi el mismo. Se administraron a los ratones cada uno de los siguientes agentes A a D. Dicho sea de paso, el día de la agrupación se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

C. Grupo de administración de etopósido (denominado en adelante VP-16; Lastet inyectable, Nippon Kayaku Co., Ltd.) solo: se administraron 10 mg/kg de VP-16 a cada ratón durante 5 días desde el día 0 hasta el día 4.

D. Grupo de administración de KM 2760 y VP-16 combinados: se administraron 10 mg/kg de VP-16 a cada ratón durante 5 días desde el día 0 hasta el día 4, y se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

El experimento se realizó con grupos que constaban cada uno de cinco ratones. Se diluyó cada uno de los agentes con una solución salina fisiológica (Otsuka Seiyaku) y se administró el diluyente en la vena caudal. El día 7, se midió el volumen del tumor. Se evaluó el efecto antitumoral comparando los valores medios de un cambio del volumen del tumor (V/V0) el día 7 cuando el volumen del tumor el día 0 en cada grupo se definió como V0.

En la Fig. 4 se muestran los valores medios de VNO en cada grupo. Como se muestra en la Fig. 4, la administración de KM 2760 y VP-16 combinados, presentaba mayor efecto de crecimiento sorprendente que la administración de VP-16 o el anticuerpo solo.

Un valor (T/C) obtenido dividiendo V/V0 de cada grupo por VNO del grupo de referencia negativo se presenta en la Tabla 3. En comparación con el valor teórico de T/C cuando se añaden simplemente los efectos farmacéuticos tanto de KM 2760 como de VP16, es decir, un valor obtenido multiplicando los T/C de los grupos de administración de los respectivos agentes solos, T/C real del grupo de administración combinado (valor D en la tabla) presentó el valor menor (0,38) que 0,46, el valor teórico.

Tabla 3

T/C de cada grupo

A. Referencia negativa B. KM 2760 C. VP-16 D. KM 2760 + VP-16 Valor teórico (B x C) 1,00 0,65 0,71 0,38 0,46

A partir de lo expuesto anteriormente, se aprecia que la administración de KM 2760 y VP-16 combinados presenta efecto antitumoral mayor que la administración de KM 2760

o VP-16 sola y presenta el efecto sinérgico.

Ejemplo 5

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo anti-CCR4 y metotrexato combinados

Las células CCRF-CEM (estirpe celular humana de leucemia de linfocitos T) se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) a una concentración de 2 x 108 células/ml, y se injertaron 100 µl de la suspensión en la piel ventral de ratones Balb/c lampiños (CLEA Japan Inc., macho). El día 17 después del injerto de células, se midió el diámetro de un tumor con calibradores, y se calculó el volumen del tumor utilizando la fórmula 2 del Ejemplo 2.

Se seleccionaron individuos con el volumen del tumor comprendido dentro del intervalo entre 121 y 348 mm3 (195 mm3 de media), y se agruparon de tal manera que el promedio del volumen del tumor fuera casi el mismo. Se administraron a los ratones cada uno de los siguientes agentes A a D. Dicho sea de paso, el día de la agrupación se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

C. Grupo de administración de metotrexato (denominado en adelante MTX; solución inyectable de metotrexato, Nippon Weisledary K.K.) solo: se administraron 15 mg/kg de MTX a cada ratón durante 5 días desde el día 0 hasta el día 4.

D. Grupo de administración de KM 2760 y MTX combinados: se administraron 15 mg/kg de MTX a cada ratón durante 5 días desde el día 0 hasta el día 4, y se administraron 800 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

El experimento se realizó con grupos que constaban cada uno de cinco ratones. Se diluyó cada uno de los agentes con una solución salina fisiológica (Otsuka Seiyaku) y se administró el diluyente en la vena caudal. El día 7, se midió el volumen del tumor. Se evaluó el efecto antitumoral comparando los valores medios de un cambio del volumen del tumor (VNO) cuando el volumen del tumor el día 0 en cada grupo se definió como V0.

En la Fig. 5 se muestra el cambio cronológico en los valores medios de VNO en cada grupo. Como se muestra en la Fig. 5, la administración de KM 2760 y MTX combinados, presentaba mayor efecto de crecimiento sorprendente que la administración de MTX o el anticuerpo solo.

Un valor (T/C) obtenido dividiendo VNO de cada grupo por VNO del grupo de referencia negativo se presenta en la Tabla 4. En comparación con un valor teórico de T/C cuando se añaden simplemente los efectos farmacéuticos tanto de KM 2760 como de MTX, es decir, un valor obtenido multiplicando los T/C de los grupos de administración de los respectivos agentes solos, T/C real del grupo de administración combinado (valor D en la tabla) presentó el valor menor (0,01) que 0,04, el valor teórico.

Tabla 4

T/C de cada grupo

A. Referencia negativa B. KM 2760 C. MTX D. KM 2760 + MTX Valor teórico (B x C) 1,00 0,,65 0,06 0,01 0,04

De lo anterior, se ha aclarado que la administración de KM 2760 y MTX combinados presenta mayor efecto antitumoral que la administración de KM 2760 o MTX solo y presenta el efecto sinérgico.

Ejemplo 6

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo anti-CCR4, KM 2760 y G-CSF combinados

Las células CCRF/EL4 (documento 01/64754) se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) a una concentración de 1 x 108 células/ml, y se injertaron 100 µl de la suspensión en la piel ventral derecha de ratones C57BL/6 (Nippon Crea, machos, 8 semanas de vida). Después, los ratones se agruparon en A a D, se administraron a cada ratón los agentes A a D. Dicho sea de paso, el día en que se injertó el tumor se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron por vía intravenosa 100 µg de KM 2760 a cada ratón el día 0 y el día 4.

C. Grupo de administración de G-CSF solo: se administraron por vía subcutánea 10 µg/kg de G-CSF (Neuup inyectable 100, preparado por Kyowa Hatto Kogyo Co., Ltd.) a cada ratón una vez al día durante 10 días desde 4 días antes del injerto del tumor (en adelante denominado día -4) hasta el día 5.

D. Grupo de administración de KM 2760 y G-CSF combinados: se administraron por vía intravenosa 100 µg de KM 2760 a cada ratón una vez al día el día 0 y el día 4, y 10 µg de G-CSF se administraron por vía intravenosa a cada ratón una vez al día durante 10 días desde el día -4 hasta el día 5. El punto de administración está cerca de la pata trasera en la parte ventral derecha que no está superpuesta con el punto de injerto en el tumor.

El experimento se realizó con el grupo A que consta de 10 ratones y los grupos B, C y D que constan cada uno de 7 ratones. Se diluyó KM 2760 con una solución de tampón citrato (ácido cítrico 10 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 6) y G-CSF se diluyó con una solución salina fisiológica (Otsuka Seiyaku) respectivamente. Cada uno de los diluyentes se administró a razón de 100 µl. Se midió un diámetro de un tumor con calibradores cronológicamente desde el día 0 de cada grupo. Se calculó un volumen de un tumor utilizando la Fórmula 2 en el Ejemplo 2.

Como la muerte del tumor del ratón se inició en el Grupo A del día 17, la evaluación del volumen del tumor se acabó el día 14.

El cambio cronológico en los valores medios del volumen del tumor en cada grupo se muestra en la Fig. 6. Como se muestra en la Fig. 6, el efecto antitumoral fue bajo en los Grupos B y C en comparación con el Grupo A sin tratar, mientras que un efecto antitumoral destacado se observó en el Grupo D.

Los valores T/C al final del día de la evaluación se presentan en la Tabla 5. El efecto antitumoral (valor T/C) en cada grupo se evaluó por cálculo, utilizando la siguiente Fórmula 3 para comparación entre el valor medio del volumen del tumor en el Grupo A y los valores medios del volumen del tumor en cada Grupo en el día de la evaluación final (día 14).

(Fórmula 3)

(Valor T/C) = (Valor medio del volumen del tumor en cada grupo día 14)/(Valor medio del volumen del tumor en el Grupo A el día 14)

En comparación con un valor teórico de T/C al añadir simplemente el efecto farmacéutico tanto de KM 2760 como de G-CSF, es decir, un valor obtenido multiplicando los valores T/C de los grupos de administración de los agentes respectivos solos, el valor T/C real del grupo de administración combinado (C en la tabla) presentó el valor menor (0,10) que 0,30, valor teórico.

Tabla 5

Grupo A B C D Valor teórico (B x C)

Valor T/C 1,0 0,48 0,63 0,10 0,30

A partir de lo expuesto anteriormente, se aprecia que la administración de KM 2760 y G-CSF combinados tiene efecto antitumoral mayor que la administración de KM 2760 o de G-CSF solo, y presenta el efecto sinérgico.

Ejemplo 7 de referencia

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo anti-CCR4, KM 2760 E IFN-α combinados

Las células CCRF/EL4 se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (preparado por Gibco BRL) a una concentración de 5 x 105 células/ml, y se injertaron 100 µl de la suspensión en la vena caudal de ratones C57BL/6 (CLEA Japan Inc., machos, 8 semanas de vida). Después, los ratones se agruparon en A a D, y los agentes A a D se administraron a los ratones. Dicho sea de paso, el día en que se injertó el tumor se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de IFN-α solo: se administraron por vía intravenosa 5 x 104 unidades de IFN-α (interferón universal tipo I, preparado por PBL Biomedical Laboratories) a cada ratón una vez al día durante 5 días del día 1 al día 5.

C. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron por vía intravenosa 0,5 µg de KM 2760 a cada ratón una vez al día el día 1 y el día 5.

D. Grupo de administración de KM 2760 e IFN-α combinados: se administraron por vía intravenosa 0,5 µg de KM 2760 a cada ratón una vez al día el día 1 y el día 5, y 5 x 104 unidades de IFN-α se administraron por vía intravenosa a cada ratón una vez al día durante 5 días del día 1 al día 5.

El experimento se realizó con el grupo A que consta de 7 ratones y los grupos B, C y D que constan cada uno de 6 ratones. Se diluyó KM 2760 con una solución de tampón citrato (ácido cítrico 10 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 6) e IFN-α se diluyó con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 0,1% respectivamente. Se administraron 100 µl de cada uno de los diluyentes. Se midió el peso de todos los ratones el día 14. Tras la eterización y extracción de sangre, se practicó la eutanasia a los ratones por dislocación de la columna cervical. Se extrajo el hígado y se midió a continuación el peso del hígado. Se calculó en porcentaje la relación del peso del hígado al peso de cada individuo (denominada en adelante relación en peso del hígado).

Se evaluó el efecto antitumoral comparando la relación en peso del hígado (valor medio de seis ratones) de los ratones sanos sin tratar medida simultáneamente y la relación en peso del hígado de cada grupo aumentada por metástasis de las células tumorales.

La relación en peso del hígado de cada grupo se muestra en la Fig. 7. Como se muestra en la Fig. 7, el efecto antitumoral fue bajo en los Grupos B y C en comparación con el Grupo A sin tratar, mientras que un efecto antitumoral destacado se observó en el Grupo D.

Por otra parte, se calculó la cantidad residual de células tumorales en el hígado en cada grupo como valor T/C utilizando la fórmula siguiente:

(Fórmula 4)

T/C = (valores medios de una relación en peso de un hígado de cada grupo -valor medio de una relación en peso de un hígado de un ratón sin tratar)/(valor medio de una relación en peso de un hígado de un grupo de referencia negativa -valor medio de una relación en peso de un hígado de un ratón sin tratar)

En la Tabla 6 se presentan los valores T/C resultantes. En comparación con un valor teórico de T/C al añadir simplemente el efecto farmacéutico tanto de KM 2760 como de IFN-α, es decir, un valor obtenido multiplicando los valores T/C de los grupos de administración de los agentes respectivos solos, el valor T/C real del grupo de administración combinado (C en la tabla) presentó el valor menor (0,088) que 0,25, valor teórico.

Tabla 6

Grupo A B C D Valor teórico (B x C)

Valor T/C 1,0 0,48 0,52 0,088 0,25

A partir de lo expuesto anteriormente, se ha aclarado que la administración de KM 2760 e IFN-α combinados tiene efecto antitumoral mayor que la administración de KM 2760 o de IFN-α solo, y presenta el efecto sinérgico.

Ejemplo 8

Efecto antitumoral proporcionado al administrar un anticuerpo híbrido humano antiCCR4, KM 2760 y M-CSF combinados

Se pusieron células CCRF/EL4 (documento 01/64754) en suspensión en un medio RPMI 1640 (preparado por Gibco BRL) a una concentración de 1 x 105 células/ml, y se injertaron 200 µl de la suspensión en la cavidad peritoneal de ratones C57BL/6 (CLEA Japan Inc., machos, 8 semanas de vida). Después, los ratones se agruparon en A a D, se administraron a cada ratón los agentes A a D. El día en que se injertó el tumor se definió como día 0.

A. Grupo de referencia negativo: sin administración.

B. Grupo de administración de M-CSF solo: se administraron por vía intravenosa 100 µg de M-CSF(Leucoprol, preparado por Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) a cada ratón dos veces al día desde el día -3 al día -1 y una vez al día el día 0, siete veces en total.

C. Grupo de administración de KM 2760 solo: se administraron por vía intraperitoneal 50 µg de KM 2760 se administraron por vía intraperitoneal a cada ratón una vez al día el día 0.

D. Grupo de administración de KM 2760 y M-CSF combinados: se administraron por vía intraperitoneal 50 µg de KM 2760 a cada ratón una vez al día el día 0, y 100 µg de M-CSF se administraron por vía intraperitoneal a cada ratón dos veces al día desde el día -3 al día -1 y una vez al día el día 1, siete veces en total.

El experimento se realizó con grupos que constaban cada uno de 8 ratones. Con respecto a los agentes, se diluyó KM 2760 con un tampón de citrato (ácido cítrico 10 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 6) y M-CSF se diluyó con solución salina fisiológica (Otsuka Seiyaku) respectivamente. Se administraron 100 µl de cada uno de los diluyentes. Se evaluó el efecto antitumoral mediante una relación de valores medios del número de días de supervivencia de los ratones en cada grupo hasta un valor medio del número de días de supervivencia de ratones en el grupo de referencia negativa (denominado en adelante

relación de prolongación de la vida). El número de días de supervivencia de cada ratón y la relación de programación de la vida de cada grupo son representados en la Tabla 7. Tabla 7

Grupo

Número de días de supervivencia Número medio de días de supervivencia Relación de prolongación de la vida

A

17 18 18 19 19 20 20 22 19,3 1,00

B

17 17 18 18 18 19 19 22 18,8 0,974

C

19 21 21 21 22 24 26 27 22,9 1,19

D

25 25 25 26 26 26 27 > 50 > 28,8 >1,49 (valor teórico 1,16)

Como se muestra en la Tabla 7, en comparación con el grupo A no tratado, no se

presentó ningún efecto antitumoral en el grupo B, y el efecto antitumoral fue bajo en el

grupo C, mientras que en el grupo D se observó un efecto antitumoral destacado. En

10 comparación con el valor teórico de la relación de prolongación de la vida, cuando se añade simplemente los efectos farmacéuticos tanto de KM 2760 como de M-CSF, es decir, un valor obtenido multiplicando las relaciones de prolongación de la vida de los grupos de administración de los agentes respectivos solos, la relación de prolongación de la vida real del grupo de administración combinado (D en la Tabla) presentó el valor mayor

15 (> 1,49) que el valor teórico, 1,16. Dicho sea de paso, un ratón en el grupo D estaba todavía vivo aún después de un período de observación (día 50).

A partir de lo expuesto anteriormente se aprecia que la administración de KM 2760 y M-CSF combinados presenta un efecto antitumoral mayor que la administración de KM 20 2760 o M-CSF solo, y presenta el efecto sinérgico.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

25 Se proporciona un medicamento como el definido en las reivindicaciones que comprende una combinación de un anticuerpo recombinante que se une específicamente al receptor 4 de quimiocina CC humana (CCR4) o un fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos un agente.

30 SEC. ID. nº 13 – Descripción de una secuencia artificial:

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo.

35 SEC. ID. nº 14 – Descripción de una secuencia artificial:

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo.

40 SEC. ID. nº 15 – Descripción de una secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo.

SEC. ID. nº 16 – Descripción de una secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo.

SEC. ID. nº 17 – Descripción de una secuencia artificial:

Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo. SEC. ID. nº 18 – Descripción de una secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del

anticuerpo.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.

<120> Composición farmacéutica que comprende anticuerpos recombinantes contra CCR4

<130> 11638W01

<150> JP2003-406590 JP2004-155141

<151> 2003-12-04 2004-05-25

<160> 18

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

imagen1

imagen1

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

imagen1

5

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<400> 3

imagen1

Pro Cys

15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20

<400> 4

imagen1

<210>

5 25 <211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210>

8 15 <211> 16

imagen2

imagen1

Gly

5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

10

<400> 7

imagen1

<212> PRT

<213> Mus musculus

imagen3

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

imagen1

30 <210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 10

imagen1

<210> 11

<211> 138

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 21 <210> 13

imagen1

5

<210> 12

<211> 132

<212> PRT

<213> Mus musculus

10

<400> 12

imagen1

<211> 119

<212>

PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<210> 14

<211> 119

<212>

PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<210> 15

<211> 112

<212>

PRT 5 <213> Secuencia artificial

10 <400> 13 10 <400> 14 <220>

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imagen1

<223> Péptido sintético

10 <400> 15 <210> 16

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<211> 119 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Péptido sintético 10

<400> 16

<210> 17

<211> 119 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Péptido sintético 10

imagen1

<400> 17

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<210> 18 5 <211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Péptido sintético

<400> 18

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-41

Claims (20)

1.

Medicamento que comprende una combinación de un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un receptor 4 de quimiocina CC humana (CCR4) y por lo menos un agente, en el que dicho agente se selecciona de entre G-CSF, M-CSF, vincristina, ciclofosfamida, etopósido y metotrexato.

2.

Medicamento según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo y dicho por lo menos un agente deben administrarse simultánea o sucesivamente.

3. Medicamento según la reivindicación 1 ó 2, que es un fármaco antitumoral.

4.

Medicamento según la reivindicación 3, en el que el tumor es un tumor en el que se expresa CCR4.

5.

Medicamento según la reivindicación 4, en el que el tumor en el que se expresa CCR4 es un tumor de un órgano hematopoyético.

6.

Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4 es un anticuerpo que se une específicamente a una región extracelular de CCR4 y no presenta reactividad a una plaqueta humana.

7.

Medicamento según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a la región extracelular de CCR4, no presenta una actividad de inhibición de la unión de TARC (quimiocina regulada por el timo y activación) o MDC (quimiocina procedente de macrófagos) como un ligando de CCR4 a CCR4.

8.

Medicamento según la reivindicación 6 ó 7, en el que la región extracelular es una región extracelular seleccionada de entre el grupo constituido por 1 a 39, 98 a 112, 176 a 206 y 271 a 284 de una secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº

1.

9.

Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la región extracelular es un epítopo existente en las posiciones 2 a 29 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

10.

Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la región extracelular es un epítopo existente en las posiciones 13 a 29 de la secuencia de

aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

11.

Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la región extracelular es un epítopo existente en las posiciones 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 1.

12.

Medicamento según la reivindicación 11, en el que en el anticuerpo recombinante que se une específicamente a CCR4, una actividad de unión a un péptido que comprende 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 1 en la que por lo menos uno de los restos 16, 19, 20 y 22 de tirosina está sulfatado es inferior a una actividad de unión a un péptido que comprende 13 a 25 de la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 1.

13.

Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el anticuerpo recombinante que se une específicamente a la región extracelular de CCR4 es un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal que produce el hibridoma KM 2160 (FERM BP-10090).

14.

Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el anticuerpo recombinante humano es un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo injertado con RDC humano.

15.

Medicamento según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo híbrido humano comprende las regiones determinantes de complementariedad (RDC) de una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) y una región V de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CCR4.

16.

Medicamento según la reivindicación 14 ó 15, en el que el anticuerpo híbrido humano comprende RDC1, RDC2 y RDC3 de una región variable (región V) de cadena pesada (cadena H) de un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 5, nº 6 y nº 7, respectivamente, y RDC1, RDC2 y RDC3 de una región variable (región V) de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo que comprende unas secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 8, nº 9 y nº 10, respectivamente.

17.

Medicamento según la reivindicación 14 ó 15, en el que el anticuerpo híbrido humano comprende una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 11 y una región V de una cadena ligera (cadena L) de una molécula de anticuerpo representada por la SEC. ID. nº 12.

18.

Medicamento según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo injertado con RDC humano comprende las regiones determinantes de complementariedad (RDC) de una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) y de una región V de una cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CCR4.

19.

Medicamento según la reivindicación 14 ó 18, en el que el anticuerpo injertado con la RDC humano comprende RDC1, RDC2 y RDC3 de una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 5, nº 6 y nº 7, respectivamente, y RDC1, RDC2 y RDC3 de una región V de una cadena ligera (cadena L) que comprende secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº 8, nº 9 y nº 10, respectivamente.

20.

Medicamento según la reivindicación 14 ó 18, en el que el anticuerpo injertado con RDC humano comprende una región variable (región V) de una cadena pesada (cadena H) de una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 16 o nº 17 y una región V de una cadena ligera (cadena L) de una molécula de anticuerpo representada por la SEC. ID. nº 18.