JP2024532167A - 抗flt3抗体、car、car t細胞、及び使用方法 - Google Patents

抗flt3抗体、car、car t細胞、及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、単鎖フラグメントとを含む、抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメント(例えば、ヒト化抗FLT3抗体及びそのフラグメント)を提供する。いくつかの態様において、抗体またはフラグメントは、ヒトFLT3に特異的に結合する。また、本明細書では、このような抗体またはフラグメントを含む組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体(CAR))も提供する。また、本明細書では、このようなCARを含む免疫細胞(例えば、CAR T細胞)も提供する。また、本明細書では、このような抗体またはフラグメント、CAR、及び免疫細胞の使用方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第63/233,530号(2021年8月16日出願)及び米国仮特許出願第63/253,009号(2021年10月6日出願)の利益を主張し、これらの各出願は参照により全体として本明細書に援用される。
電子配列表の参照
電子配列表(HEPH_001_002WO_SeqList_ST26.xml、サイズ:228,845バイト、作成日:2022年8月11日)の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
いくつかの態様において、本発明は、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント、このような抗体またはフラグメントを含むキメラ抗原受容体(CAR)、このようなCARを発現する免疫細胞、ならびにこのような抗体、CAR、及び細胞の使用に関する。
FLT3
FLT3とは、Fms関連受容体チロシンキナーゼ3のことである。FLT3は、胎児肝キナーゼ2(FLK2)の別名でも知られている。FLT3は、クラスIIIチロシンキナーゼ受容体ファミリーのメンバーであり、正常な造血前駆細胞及び白血病芽球内で発現し、細胞の増殖、分化、及び生存に重要な役割を果たしている。FLT3リガンドによるFLT3受容体の活性化は、受容体の二量化及びリン酸化をもたらし、下流のシグナル伝達経路(ヤヌスキナーゼ(JAK)2シグナル伝達因子(JAK2)、シグナル伝達兼転写活性化因子(STAT)5、及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路を含む)を活性化する。AML患者のおよそ40%に認められるFLT3遺伝子の変異は、その自己リン酸化及び構成的活性化を促進し、リガンド非依存性増殖につながると考えられている(Frankfurt O et al.,Current Opinion in Oncology(2007)19(6):635-649)。
正常なFLT3発現は、ほとんどの場合CD34+造血幹細胞(HSC)、初期造血前駆細胞(HP)、及び樹状細胞(DC)に限定される。FLT3リガンド(FLT3L)との結合を通じたFLT3の活性化は、下流の血液系列の正常な分化を促進する。
FLT3は、様々な血液悪性腫瘍(AML患者の大部分を含む)で高発現する。AMLを有する患者における大半のAML芽球はFLT3を発現し、この発現が生存及び増殖を促進すると考えられている。FLT3を特異的に標的とするためにチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)が開発されているが、FLT3に対する耐性をもたらす二次変異が大きな障害としてとどまっている。
造血幹細胞
造血幹細胞は、全ての血液細胞の共通先祖である。多分化能細胞として複数の細胞系列(ただし、三胚葉に由来する全ての細胞系列ではない)に分化することができる。造血幹細胞の分化により、造血の2つの主な分岐であるリンパ系及び骨髄系の細胞系列が生じる(Kondo,M.“Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors,”Immunol.Rev.2010 Nov;238(1):37-46)。リンパ系列細胞としては、T細胞、B細胞、及びナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。骨髄系系列としては、巨核球及び赤血球(MegE)に加えて、骨髄系系列に属する顆粒球(好中球、好酸球、及び好塩基球)、単球、マクロファージ、ならびにマスト細胞(GM)の種々のサブセットが挙げられる(同上、Kondo M,et al.Biology of hematopoietic stem cells and progenitors:implications for clinical application.Ann.Rev Immunol.2003;21:759-806.,Weissman IL.Translating stem and progenitor cell biology to the clinic:barriers and opportunities.Science(New York,NY.2000 Feb 25;287(5457):1442-6を引用;またIwaskaki,H.and Akashi,K.“Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell,”Immunity 26(6)June 2007,726-40も参照)。
HSCは、自己複製能力及び血液系列への分化能力を提示する。すなわち、幹細胞が分裂すると、平均で娘細胞の50%が細胞系列に関与し、一方残りの50%は分化しない。このプロセスは、非対称細胞分裂により同じ数の幹細胞を維持し、分裂する各幹細胞が1つの新たな幹細胞及び1つの分化した細胞を生じるようにする。これに対し、対称分裂の場合、幹細胞は100%の同一の幹細胞を生じる(Gordon,M.Stem cells and haemopoiesis.:Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,5th ed.Blackwell Publishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia,pp.1-12.New York.)。
リンパ系及び骨髄系の系列は、前駆細胞レベルで分離可能である。リンパ系共通前駆細胞(CLP)は、生理的条件下では、際立った骨髄系潜在能力を伴わずに全てのタイプのリンパ球に分化することができ(Kondo M,Scherer DC,Miyamoto T,King AG,Akashi K,Sugamura K.et al.Cell-fate conversion of lymphoid committed progenitors by instructive actions of cytokines.Nature.2000 Sep 21;407(6802):383-6)、実験条件によっては、いくつかの骨髄系関連遺伝子がCLPで検出される場合がある(Delogu A,Schebesta A,Sun Q,Aschenbrenner K,Perlot T,Busslinger M.Gene repression by Pax5 in B cells is essential for blood cell homeostasis and is reversed in plasma cells.Immunity.2006 Mar;24(3):269-81)。
同様に、骨髄系共通前駆細胞(CMP)は、B細胞の潜在能力を伴わずに、または極めて低いレベル潜在能力を伴って、全てのクラスの骨髄系細胞を生じ得る(Akashi K,Traver D,Miyamoto T,Weissman IL.A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.Nature.2000 Mar 9;404(6774):193-7)。もう1つの細胞タイプである樹状細胞(DC)は、CLPからもCMPからも発生し得るため、DCはリンパ系または骨髄系いずれの系列にも明確には分類されない(Manz MG, Traver D,Miyamoto T,Weissman IL,Akashi K.Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.Blood.2001 Jun 1;97(11):3333-41,Traver D,Akashi K,Manz M,Merad M,Miyamoto T,Engleman EG,et al.Development of CD8alpha-positive dendritic cells from a common myeloid progenitor.Science(New York,NY.2000 Dec 15;290(5499):2152-4))。CMPは増殖し、巨核球-赤血球(MegE)前駆細胞及び顆粒球-単球(GM)前駆細胞に分化し、さらに巨核球、赤血球、顆粒球、単球などを生じる(Iwasaki H,Akashi K.Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.Immunity.2007;26:726-740)。
転写因子の発現レベルの違いが、分化細胞の系列所属を決定する可能性がある。転写因子PU.1及びGATA-1は、それぞれ骨髄系及び赤血球/巨核球の系列分化と関連付けられている(Gordon,M.Stem cells and haemopoiesis.:Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,5th ed.Blackwell Publishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia,pp.1-12.New York.)。
HSCの特性評価
HSCは未分化であり、小リンパ球に似ている。HSCの大部分は、細胞周期のG0期における休止状態にあり、これにより細胞周期依存性薬物の作用から保護されている。幹細胞の休止状態は、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)により維持されている。TGF-βの活性はp53により媒介される。これは、細胞増殖を調節し、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤p21を標的とする腫瘍抑制遺伝子である(Gordon, M.Stem cells and haemopoiesis.:Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,5th ed.Blackwell Publishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia,pp.1-12.New York.)。HSCの休止は、幹細胞コンパートメントを保護し、長期間の間幹細胞プールを維持するために不可欠であるだけでなく、複製に関連する変異の蓄積を最小限に抑えるためにも不可欠である。HSCの休止を維持する内因性転写因子の多くは、白血病に関連することが分かっている。例えば、急性骨髄性白血病において、FoxO及び骨髄系/リンパ系または混合系列の白血病の融合をもたらす染色体転座が報告されている(例えば、Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo (Ed.),ISBN:978-953-307-930-1を参照)。
正常なHSCの大半は、CD34+/CD38-/CD90+骨髄細胞分画に存在し、また一部のHSCはCD34-/Lin-細胞にも観察される。
CD34+/CD38+細胞分画は、短期間の再増殖活性が付与されたいくつかのHSCを含む。他の認識されているマーカーとしては、CD4及びCD8などの最終分化マーカーの欠如を伴ったチロシンキナーゼ受容体c-kit(CD117)が挙げられる(Rossi et al.,Methods in Molecular Biology(2011)750(2):47-59)。
HSCの分類
造血幹細胞プールは、3つの主な群に細分することができる:(1)短期HSC:分化細胞のクローンを4~6週間のみ生成可能;(2)中期HSC:分化細胞の後代を6~8か月間保持可能、その後消滅;(3)長期HSC:造血を無期限に維持可能。(Testa U.Annals of Hematology(2011)90(3):245-271)。
造血
造血は、HSCが成熟血球に分化する高度に協調されたプロセスであり、特殊な調節性微小環境によって支持され、この微小環境は、幹細胞及び前駆細胞の運命指定を制御する構成要素からなり、また、必須の因子を供給することによってそれらの発達を維持している(「ニッチ」)。本明細書で使用する場合、「骨髄(BM)ニッチ」という用語は、多様な系列の血液細胞の生存、成長、及び分化に必須な役割を担う要素(例えば、骨芽細胞、破骨細胞、骨髄内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞、細胞外マトリックスタンパク質(ECM))から構成される、十分に組織化された構造を指す。骨髄ニッチは、HSCが増殖し、成熟し、骨髄系及びリンパ系の前駆細胞を生じる上での重要な出生後の微小環境である。
骨髄(BM)は、全ての動物の骨の骨髄腔に存在する。骨髄は、様々な前駆細胞及び成熟細胞タイプからなり、これには造血細胞(成熟した血液細胞の前駆細胞)及び間質細胞(広範囲の結合組織細胞の前駆細胞)が含まれつが、これらはいずれも他の細胞タイプにも分化可能であるように思われる。骨髄の単核分画には、間質細胞、造血前駆細胞、及び内皮前駆細胞が含まれる。
二次リンパ系臓器(例えば、赤脾髄及び白脾髄を含む明確な肉眼的構造を有する脾臓)とは異なり、BMは、骨芽細胞を含む骨内膜以外には明確な構造的特徴を有しない。骨内膜領域は、石灰化した硬質の骨に接触しており、HSCの活性維持に必要な特殊な微小環境を提供する(Kondo M,Immunology Reviews(2010)238(1):37-46;Bydlowski and de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo (Ed.),ISBN:978-953-307-930-1)。
HSCは、ニッチ内で複数の供給源(線維芽細胞、内皮及び細網細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、ならびに間葉幹細胞(MSC)を含む)から生じる支持及び成長シグナルを受け取っていると考えられている。ニッチの主な機能は、栄養、酸素、傍分泌及び自己分泌シグナルにおける局所的変化を統合すること、ならびに全身循環からのシグナルに応答してHSCの休止、輸送、及び/または拡大を変化させることである(Broner,F.& Carson,MC.Topics in bone biology.Springer.2009;4:pp.2-4.New York,USA.)。
真のMSCの性質は依然として誤解されているものの、最近では、CXCケモカインリガンド12(CXCL12)発現CD146 MSCが、類洞表面に存在し、類洞壁構造の構成に寄与する自己複製前駆細胞であり、アンジオポエチン1(Ang-1)を生成し、骨内膜性ニッチを形成する骨芽細胞を生成可能であることが報告された(Konopleva,MY,& Jordan,CT,Biology and Therapeutic Targeting(2011)9(5):591-599)。これらのCXCL12細網細胞は、必須であるが異なる維持シグナルが提供される骨芽細胞及び血管ニッチ間で、HSCを往復させるための通過経路として機能する可能性がある。
骨髄MSCにより生成されるサイトカイン及びケモカインは、様々な局所的生成に伴い、またサイトカイン結合グリコサミノグリカンの効果により、特定のニッチ内で濃縮する。これらのうち、CXCL12/間質細胞由来因子1アルファは、HSCホーミングを正に調節し、一方形質転換成長因子FMS様チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド及びAng-1は、休止因子として作用する(例えば、Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo (Ed.),ISBN:978-953-307-930-1を参照)。CXCL12-CXCR4シグナル伝達は、個体発生時におけるHSCのBMへのホーミングに加えて、コロニー形成前駆細胞の生存及び増殖にも関与する。HSCの末梢血へのCXCR4選択的アンタゴニスト誘導性動員は、HSCを造血器内に保持する上でのCXCL12の役割をさらに示すものである。BM細胞生着は、BMSCに生成される複合細胞外マトリックスによる後続の細胞間相互作用を伴う。したがって、血管細胞接着分子1(VCAM-1)またはフィブロネクチンは、BM由来MSCとの接着に不可欠である。このように、造血幹細胞の増殖動態の制御は、正しい造血細胞生成を調節するために極めて重要である。これらの制御機序は、幹細胞にとって内因性であるか、外因性であるか、または両方の組合せに分類することができる(例えば、Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo (Ed.),ISBN:978-953-307-930-1を参照)。
HSCの自己再生及び分化は、外的要因により制御することができ(外因性制御)、例えば、造血微小環境における細胞間相互作用、またはサイトカイン、例えば、SCF(幹細胞因子)及びその受容体c-kit、Flt-3リガンド、TGF-β、TNF-α
などがある。サイトカインは、様々な造血細胞機能を複数のシグナル伝達経路の活性化により調節する。細胞の増殖及び分化に関連する主な経路としては、ヤヌスキナーゼ(Jak)/シグナル伝達兼転写活性化因子(STAT)、マイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ、及びホスファチジルイノシトール(PI)3-キナーゼの経路がある(Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo(Ed.),ISBN:978-953-307-930-1)。
さらに、他の転写因子、例えば、幹細胞白血病(SCL)造血転写因子;GATA-2;ならびに細胞周期制御に関与する遺伝子産物、例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤(CKI)pl6、p21、及びp27の発現が、最初期段階からの造血細胞発生に必須である(内因性制御)ことが示されている(Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo (Ed.),ISBN:978-953-307-930-1)。
Notch-1-Jagged経路は、
細胞内シグナル伝達及び細胞周期制御により細胞外シグナルと統合する役割を果たすことができる。Notch-1は、造血器幹細胞膜の表面受容体であり、間質細胞上にあるそのリガンドJaggedに結合する。この結果、Notch-1の細胞質部分が切断され、これが今度は転写因子として作用し得る(Gordon,M.Stem cells and haemopoiesis.:Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,5th ed.Blackwell Publishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia,pp.1-12.New York.)。
BM/HSC移植を用いて治療される障害
骨髄(BM)/造血幹細胞
(HSC)移植を用いて治療される障害としては、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、末梢性T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、非悪性遺伝性及び後天性骨髄障害(例えば、鎌状赤血球貧血、ベータ-サラセミアメジャー、難治性ダイヤモンド-ブラックファン貧血、骨髄異形成症候群、特発性重症再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、赤芽球ろう、ファンコーニ貧血、
無巨核球増加(amegakaryocytosis)、または先天性血小板減少症)、多発性骨髄腫、及び重症複合免疫不全(SCID)が挙げられる。
造血器悪性腫瘍
ほとんどの造血器悪性腫瘍は、機能的に不均質な細胞を含み、がん幹細胞として知られるサブセットのみが腫瘍の維持に関与する。がん幹細胞は、自己再生、生存期間延長を含めた正常な組織幹細胞を想起させる性質と、より分化した特性を有する細胞を生じる能力とを有することから、このような名称が与えられている(Jones RJ and Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008 Jan;14(Supplement 1):12-16)。
造血幹細胞における形質転換事象は、腫瘍形成性ヒットに関連する分化の程度に応じて、いくつかの異なる悪性腫瘍(限定されるものではないが、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、及びおそらくは急性リンパ性白血病すらも含む)をもたらす可能性がある(Jones RJ and Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008 Jan;14(Supplement 1):12-16)。
がん幹細胞という概念は、特定の組織の腫瘍がしばしば、起源の組織に認められる細胞不均一性を再現「しようとする」ように見え、したがって、腫瘍内には様々な細胞タイプを生じる幹細胞のような細胞が存在するという考えに基づくものである。この仮説に対する基本的な試験は、腫瘍細胞が、腫瘍を再生する能力を有する細胞と、この能力を有しない細胞とに分けられるかどうかである。この細胞階層は、急性骨髄性白血病において最も明確に実証されており、一部のAMLは、免疫不全マウスにおいて白血病を開始できるユニークな免疫表現型を有する細胞を所持し、一方ほとんどの細胞は白血病発生を開始できない。さらに、白血病を開始する細胞は、腫瘍開始活性を喪失した細胞も生じ、そのため、元の腫瘍に認められる細胞不均一性を再現する(Lapidot T et al.,Nature.1994;367:645-648;Bonnet D et al.,Nat Med.1997;3:730-737)。
急性骨髄性白血病
急性骨髄性白血病(AML)は、骨髄系系列における分化の停止及び骨髄内の未熟な前駆細胞の蓄積を特徴とし、結果として造血不全が生じる、クローン性障害である(Poll yea DA et al.,British Journal of Haematology(2011)152(5):523-542)。白血病芽球の外観は、患者間で幅広い多様性が認められる。急性骨髄性白血病(AML)における白血病開始細胞の発見は、AML芽球の大部分が増殖せず、ごく少数が新しいコロニーを形成可能であるという発見により始まった(Testa U,Annals of Hematology(2011)90(3):245-271)。全てのAML症例に共通する特徴は異常な分化停止であり、これにより骨髄内に20%超の芽球が蓄積する(Gilliland,DG and Tallman MS,Cancer Cell(2002)1(5):417-420)。
骨髄性白血病の80%超は少なくとも1つの染色体細片に関連し(Pandolfi PP,Oncogene(2001)20(40):5726-5735)、100超の異なる染色体転座がクローニングされている(Gilliland,DG and Tallman MS,Cancer Cell(2002)1(5):417-420)。これらの転座にはしばしば、造血系列発生に重要な役割を果たすことが示されている転写因子をコードする遺伝子が関与している。したがって、転写機構の改変は、分化停止につながる共通の機序であるように思われる(Pandolfi PP,Oncogene(2001)20(40):5726-5735;Tenen DG,Nature Reviews of Cancer(2003)3(2):89-101)。
臨床研究及び実験動物モデルからは、急性白血病の臨床的徴候には少なくとも2つの遺伝子改変を要することが示唆される。Gilliland & Tallman(Cancer Cell(2002)1(5):417-420)により提唱されたモデルによると、クラスI活性化変異と分化の終結を誘導するクラスII変異との協同作用によりAMLが生じる。クラスI変異、例えば、受容体チロシンキナーゼ遺伝子FLT3及びKIT、RASファミリーメンバーにおける変異、ニューロフィブロミン1の機能喪失は、典型的にはシグナル伝達経路の異常な活性化の結果として、造血前駆細胞に増殖及び/または生存の利点を付与する。クラスII変異は、転写因子または共活性化物質への干渉により、分化の停止をもたらす(Frankfurt O et al.,Current Opinion in Oncology(2007)19(6):635-649)。白血病幹細胞(LSC)は、過去にHSCについて特定した細胞表面マーカー(例えば、CD34、CD38、HLA-DR、及びCD71)の多くを共有しているように見えるが、いくつかのグループが、2つの集団において発現が異なる表面マーカーを報告している。例えば、CD90またはThy-1は、LSCコンパートメントに対し潜在的に特異的であると説明されている。Thy-1は、最も原始的な幹細胞が前駆細胞の段階に進行するに伴って、正常な造血において下方調節される(Hope KJ et al.,Archives of Medical Research(2003)34(6):507-514)。
白血病前駆細胞におけるCXCL12(間質細胞由来因子1アルファ)とその受容体CXCR4との間の相互作用は、当該細胞の骨髄微小環境へのホーミングに寄与する。AML患者由来の白血病細胞においては、CXCR4レベルが顕著に上昇しており、CXCR4発現は予後不良に関連する(Konopleva MY and Jordan CT,Biology and Therapeutic Targeting(2011)29(5):591-599)。
初代ヒトAML幹細胞における核因子カッパf3(NF-kβ)経路の恒常的活性化により、NF-kβがLSCの全生存に加えてAML細胞タイプ全般の全生存にも重要な役割を担っている証拠が示された(Konopleva MY and Jordan CT,Biology and Therapeutic Targeting(2011)29(5):591-599)。
AML患者の臨床的予後は不良であり、治療選択肢は限られており、骨髄破壊の後に行う造血幹細胞移植(HSCT)が唯一の治癒的治療である。一般的に使用されているコンディショニングレジメンは、全ての増殖性が高い細胞タイプを無差別に殺滅するため、生命を脅かす副作用をもたらし、また休止しているAML亜集団に対して無効である可能性もある。
リンパ系悪性腫瘍
ほとんどの組織における自己複製能力は、細胞が分化の正常な段階により進行するに伴って喪失し、例えば、造血幹細胞のレベルを超えた骨髄系系列血液細胞は、もはや自己複製能力を有しない。分化に付随する自己再生喪失の注目すべき例外はリンパ系であり、リンパ系の場合、自己再生能力は、生涯にわたる免疫記憶を維持するため、メモリーリンパ球段階まで保持される(Fearon DT et al.,Science.2001;293:248-250;Luckey CJ et al.,Proc Natl Acad Sci US A.2006;103:3304-3309)。体細胞超変異は、B細胞悪性腫瘍が生じる分化段階におけるマーカーとして機能する。概して、体細胞超変異の存在により、胚中心または胚中心後のB細胞に生じた腫瘍が識別され、一方、変異がないことで胚中心前B細胞が識別される。骨髄性悪性腫瘍とは対照的であるが、系列の自己再生能力保持と一致して、免疫グロブリン(lg)の変異パターンからは、B細胞悪性腫瘍がB細胞分化段階の全体にわたり細胞から生じ得ることが示唆される(Lapidot T et al.,Nature.1994;367:645-648;Bonnet D and Dick JE,Nat Med.1997;3:730-737;Jones RJ et al.,J Natl Cancer Inst.2004;96:583-585)。
多発性骨髄腫
概して、多発性骨髄腫(MM)は悪性形質細胞の疾患と考えられており、この疾患の臨床的結果の多くが形質細胞バルクに起因している。しかし、正常な形質細胞は最終分化し自己再生能力が欠如しており、30年以上にわたり、クローン原性であるマウス及びヒトのMM由来の細胞は少数にとどまることが明らかであった。これらの希少なクローン原性細胞は「腫瘍幹細胞」と称されている(Park CH et al.,J Natl Cancer Inst.1971;46:411-422;Hamburger AW and Salmon SE,Science.1977;197:461-463)。MM形質細胞は、メモリーB細胞に似ている自己再生がん幹細胞の小さな集団から生じる。これらのクローン型B細胞はほとんどの患者で循環しているだけでなく、多くの標準的抗MM剤に対し抵抗性であるため、ほとんどの疾患再発の原因となっているように思われる(Matsui WH et al.,Blood.2004;103:2332-2336;Kukreja A et al.,J Exp Med.2006;203:1859-1865;Jones RJ and Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008 Jan;14(Supplement 1):12-16)。
ホジキンリンパ腫
ホジキンリンパ腫(HL)の特質であるリード-シュテルンベルグ(RS)細胞は、形質細胞以外でCD138を発現することがある唯一の血液細胞である(Carbone A et al.,Blood.1998;92:2220-2228)。HL細胞株は、残りの細胞には存在するRSマーカーCD15及びCD30が欠如した小さな細胞集団を含み、その一方でメモリーB細胞の表現型と一致するマーカーを発現することが示されている(Newcom SR et al.,Int J Cell Cloning.1988;6:417-431;Jones RJ et al.,Blood.2006;108:470)。この表現型記憶B細胞の小さな亜集団は、HL細胞株内の全てのクローン原性能力を有した。ほとんどのHL患者(初期段階の患者を含む)は、患者のRS細胞と同じクローナルIg遺伝子再構成を伴う循環メモリーB細胞を有する(Jones RJ et al.,Blood.2006;108:470;Jones RJ and Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008 Jan;14(Supplement 1):12-16)。これらのデータは、これらのクローン型メモリーB細胞がHL幹細胞に相当する可能性を示唆している。
血液悪性腫瘍の治療
造血幹細胞(HSC)は、骨髄移植において血液悪性腫瘍の治療に、そして非悪性障害の治療にも使用されている(Warner et al,Oncogene(2004)23(43):7164-7177)。骨髄切除患者におけるドナーの造血系及び免疫系の生着に関与する細胞構成要素が研究者により発見されるまで、骨髄(BM)は、長年にわたり未分画細胞プールとして移植されてきた(例えば、Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development, Advances in Hematopoietic Stem Cell Research, Dr.Rosana Pelayo(Ed.),ISBN:978-953- 307-930-lを参照)。骨髄/造血幹細胞(BM/HSC)移植のための患者の準備及びコンディショニングは、この手順における不可欠な要素である。これは、(1)患者に十分な免疫抑制をもたらし、移植HSCのために骨髄内に十分なニッチスペースを空け、それにより移植細胞がレシピエント内で生着できるようにし、(2)しばしば悪性腫瘍の発生源を根絶するのを助ける、といった2つの主な目的を果たす。
従来、患者のコンディショニングは、放射線照射のありまたはなしで最大耐用量の化学療法剤のカクテルを投与することにより達成されてきた。カクテルの構成要素は、多くの場合、毒性が重複しないように選択される。現在使用されている全ての準備レジメンは毒性を有し、生命を脅かし得る重篤な副作用を有する。これらの副作用に含まれるものとしては、粘膜炎、悪心及び嘔吐、脱毛、下痢、発疹、末梢神経障害、不妊、肺毒性、ならびに肝毒性がある。これらの副作用の多くは、高齢及び病気の患者にとって特に危険であり、多くの場合、患者が移植を受けるかどうかを決める上で決定的な構成要素となる。
したがって、骨髄/造血幹細胞(BM/HSC)移植に適格な患者に対し、これらの毒性を伴わずに準備またはコンディショニングする必要性が存在する。
また、AMLなどの血液悪性腫瘍をこれらの毒性を伴わずに治療する必要性も存在する。
Frankfurt O et al.,Current Opinion in Oncology(2007)19(6):635-649 Kondo,M."Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors,"Immunol.Rev.2010 Nov;238(1):37-46 Kondo M,et al.Biology of hematopoietic stem cells and progenitors:implications for clinical application.Ann.Rev Immunol.2003;21:759-806. Weissman IL.Translating stem and progenitor cell biology to the clinic:barriers and opportunities.Science(New York,NY.2000 Feb 25;287(5457):1442-6 Iwaskaki,H.and Akashi,K."Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell,"Immunity 26(6)June 2007,726-40 Gordon,M.Stem cells and haemopoiesis.:Hoffbrand,V.,Catovsky,D.,Tuddenham,E.G.,5th ed.Blackwell Publishing,(2005):Differential niche and Wnt requirements during acute myeloid leukemia,pp.1-12.New York. Kondo M,Scherer DC,Miyamoto T,King AG,Akashi K,Sugamura K.et al.Cell-fate conversion of lymphoid committed progenitors by instructive actions of cytokines.Nature.2000 Sep 21;407(6802):383-6 Delogu A,Schebesta A,Sun Q,Aschenbrenner K,Perlot T,Busslinger M.Gene repression by Pax5 in B cells is essential for blood cell homeostasis and is reversed in plasma cells.Immunity.2006 Mar;24(3):269-81 Akashi K,Traver D,Miyamoto T,Weissman IL.A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.Nature.2000 Mar 9;404(6774):193-7 Manz MG, Traver D,Miyamoto T,Weissman IL,Akashi K.Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.Blood.2001 Jun 1;97(11):3333-41 Traver D,Akashi K,Manz M,Merad M,Miyamoto T,Engleman EG,et al.Development of CD8alpha-positive dendritic cells from a common myeloid progenitor.Science(New York,NY.2000 Dec 15;290(5499):2152-4) Sergio Paulo Bydlowski and Felipe de Lara Janz(2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr.Rosana Pelayo (Ed.),ISBN:978-953-307-930-1 Rossi et al.,Methods in Molecular Biology(2011)750(2):47-59 Testa U.Annals of Hematology(2011)90(3):245-271 Broner,F.& Carson,MC.Topics in bone biology.Springer.2009;4:pp.2-4.New York,USA. Jones RJ and Armstrong SA,Biol Blood Marrow Transplant.2008 Jan;14(Supplement 1):12-16 Lapidot T et al.,Nature.1994;367:645-648;Bonnet D et al.,Nat Med.1997;3:730-737 Poll yea DA et al.,British Journal of Haematology(2011)152(5):523-542 Gilliland,DG and Tallman MS,Cancer Cell(2002)1(5):417-420 Pandolfi PP,Oncogene(2001)20(40):5726-5735
いくつかの態様において、本開示は、ヒト及びアカゲザルのFLT3に結合する(例えば、特異的に結合する)ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの態様において、本開示は、ヒトFLT3に結合する(例えば、特異的に結合する)ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択される配列のいずれか1つに対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択される配列のいずれか1つに対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(VH)を含む、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
(i)配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択される配列のいずれか1つに対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(VL)、及び/または
(ii)配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択される配列のいずれか1つに対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(VH)を含む、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、VLは配列番号1のアミノ酸配列を含み、VHは配列番号3のアミノ酸配列を含む。前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、VLは配列番号2のアミノ酸配列を含み、VHは配列番号3のアミノ酸配列を含む。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本開示は、VLが、配列番号86のCDR-L1、配列番号87のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3のアミノ酸配列に対し少なくとも97%、98%、99%、または100%の同一性を有する相補性決定領域(CDR)を含む、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CDRは、Kabatにより定められている通りである。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本開示は、VHが、配列番号89のCDR-H1、配列番号90のCDR-H2、及び配列番号91のCDR-L3のアミノ酸配列に対し少なくとも97%、98%、99%、または100%の同一性を有するCDRを含む、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CDRは、Kabatにより定められている通りである。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本開示は、(i)VLが、配列番号86のCDR-L1、配列番号87のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3のアミノ酸配列に対し少なくとも97%、98%、99%または100%の同一性を有する相補性決定領域(CDR)を含み、(ii)VHが、配列番号89のCDR-H1、配列番号90のCDR-H2、及び配列番号91のCDR-L3のアミノ酸配列に対し少なくとも97%、98%、99%、または100%の同一性を有するCDRを含む、抗FLT3ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CDRは、Kabatにより定められている通りである。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本明細書に記載のヒト化抗FLT3抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖可変ドメイン(scFv)(例えば、本明細書に記載のまたは前述の態様及び実施形態で言及されている任意のVH及び任意のVLを含むscFv)である。いくつかの実施形態において、scFvは、配列番号4、配列番号5、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び配列番号49からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、scFvは、配列番号4、配列番号5、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び配列番号49からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、scFvは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、scFvは、配列番号5のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、scFvは、VLとVHとの間にリンカーを含み、リンカーは式(Gly3~4-Ser)1~4を有する。いくつかの実施形態において、scFvはVLとVHとの間にリンカーを含み、リンカーはGGGGSGGGGSGGGSGGGGS(配列番号53)である。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメント(例えば、scFv)は、FLT3との結合に関しFLT3リガンドと競合しない(または実質的に競合しない)。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の抗FLT3抗体及び抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のいずれかをコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の抗FLT3抗体及び抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のいずれかをコードする核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の抗FLT3抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のいずれかを含む組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の抗FLT3抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のいずれかを含む組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)をコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の抗FLT3抗原結合フラグメント(例えば、scFv)のいずれかを含む組換え受容体をコードする核酸を含むベクターを提供する。
いくつかの態様において、本開示は、(i)(a)前述のもしくは関連する任意の態様の抗体もしくはフラグメント、または(b)前述のもしくは関連する任意の態様及び実施形態の抗FLT3 scFvを含む細胞外ドメインと、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)細胞内ドメインとを含む、キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、膜貫通ドメインは、CD3膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、またはCD28膜貫通ドメインである。CARのいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメイン(例えば、CD8アルファ膜貫通ドメイン)である。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、細胞内ドメインは活性化ドメインを含む(例えば、CARがT細胞内で発現したときに、活性化ドメインは、細胞外ドメインがFLT3に結合した後に、活性化シグナルを伝達する)。いくつかの実施形態において、本開示は、(細胞内ドメイン内の)活性化ドメインが、CD3ゼータ、CD3イプシロン、またはFcRガンマの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、CARを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、CD3ゼータ活性化ドメイン/細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARを提供する。CARのいくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、1つ以上の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の共刺激ドメインは、CD28、4-1BB、CD27、OX40、またはICOSのうちの1つ以上である。いくつかの実施形態において、1つ以上の共刺激ドメインは、CD28及び/または4-1BBに由来する。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、CARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサーまたはヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、スペーサーまたはヒンジ領域は、CD8(例えば、CD8アルファ)の細胞外ドメインに由来する。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、細胞外ドメインは、切断性シグナルペプチドをさらに含む。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、細胞外ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むscFvを含み、膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメインを含み、細胞内ドメインは、CD3ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD28及び/または4-1BBの共刺激ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、及び配列番号15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号6のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号9のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号10のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号11のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号12のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号13のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号14のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、配列番号15のアミノ酸配列を含む(またはそれから実質的になる、またはそれからなる)。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、CARは、安全スイッチポリペプチドをさらに含む(例えば、安全スイッチポリペプチドは、自己切断ペプチドによりCARに結合する)。いくつかの実施形態において、安全スイッチポリペプチドは、iCasp9またはEGFRtである。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、T2A、P2A、E2A、F2A、またはIRESである。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドはT2Aである。
CARの前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、CARを発現する免疫細胞(例えば、T細胞)は、細胞外ドメインがFLT3(例えば、がん細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、または樹状細胞の表面)に結合したときに、増殖するように活性化または刺激される。いくつかの実施形態において、CARは、免疫細胞(例えば、T細胞)の表面に発現したときに、免疫細胞に、FLT3を発現する細胞を殺滅するように指示する。
いくつかの態様において、本開示は、前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態のCARを発現する免疫細胞(例えば、T細胞)または免疫細胞(例えば、T細胞)の集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態のCARをコードする核酸を含む免疫細胞(例えば、T細胞)の集団を提供する。前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、免疫細胞は、T細胞、NK細胞、マクロファージ、または単球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はT細胞である。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は核酸を含み、核酸は、配列番号60、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、及び配列番号69からなる群より選択される配列を含む。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、CARまたは核酸を導入する前に、対象(例えば、ヒト)から誘導されている。いくつかの実施形態において、CARを発現するまたは核酸を含む免疫細胞は、免疫細胞の集団を生成するためにさらに拡大される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3 CARは、in vitroでAML細胞に対し細胞傷害性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の免疫細胞は、本明細書に記載の任意の抗FLT3 CARの安定した発現を特徴とする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3 CARを発現する任意の免疫細胞は、高い増殖可能性を特徴とする。
いくつかの態様において、本開示は、(i)前述のまたは関連する態様及び実施形態のいずれか1つのヒト化抗FLT3抗体またはフラグメントと、(ii)医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、(i)前述のまたは関連する態様及び実施形態のいずれか1つのscFvと、(ii)医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、(i)前述のまたは関連する態様及び実施形態のいずれか1つの免疫細胞(例えば、T細胞)と、(ii)医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、(i)前述のまたは関連する態様及び実施形態のいずれか1つの免疫細胞(例えば、T細胞)の集団と、(ii)医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、血液癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、(例えば、治療有効量の)(i)前述のもしくは関連する態様及び実施形態のいずれか1つのヒト化抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、scFv)、または(ii)このようなヒト化抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、scFv)を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、血液癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、(例えば、治療有効量の)(i)前述のもしくは関連する任意の態様及び実施形態の免疫細胞(例えば、T細胞)(例えば、本明細書に記載の任意のCARを発現する細胞)、(ii)前述のもしくは関連する任意の態様及び実施形態の免疫細胞(例えば、T細胞)の集団(例えば、本明細書に記載の任意のCARを発現する細胞)、または(ii)このような免疫細胞もしくは免疫細胞の集団の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、造血細胞移植のための準備またはコンディショニングを、それを必要とする対象に行うための方法であって、対象に、(例えば、治療有効量の)(i)前述のまたは関連する態様及び実施形態のいずれか1つのヒト化抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、scFv)、または(ii)このようなヒト化抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、scFv)を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、造血細胞移植のための準備またはコンディショニングを、それを必要とする対象に行うための方法であって、対象に、(例えば、治療有効量の)(i)前述のもしくは関連する任意の態様及び実施形態の免疫細胞(例えば、T細胞)(例えば、本明細書に記載の任意のCARを発現する細胞)、(ii)前述のもしくは関連する任意の態様及び実施形態の免疫細胞の集団(例えば、本明細書に記載の任意のCARを発現する細胞)、または(ii)このような免疫細胞もしくは免疫細胞の集団の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
コンディショニングの方法の前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、この方法は、投与後に、対象に造血細胞移植を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態において、造血細胞移植は、対象に、造血幹細胞及び/または造血前駆細胞を移植することを含む。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から5日~6週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から約2~3週間後に行われる。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、血液癌は、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、末梢性T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、非悪性遺伝性もしくは後天性骨髄障害、多発性骨髄腫、または樹状細胞新生物である。いくつかの実施形態において、血液癌はAMLである。いくつかの実施形態において、血液癌はALLである。いくつかの実施形態において、血液癌は樹状細胞新生物である。いくつかの実施形態において、血液癌は、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)である。いくつかの実施形態において、血液癌はB系列白血病である。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、それを必要とする対象は、血液癌(例えば、本明細書に記載の任意のがん)を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象におけるFLT3を発現する細胞集団を少なくとも60%(例えば、少なくとも70%、または少なくとも75%)低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象におけるFLT3を発現する細胞集団を少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%)低減する。この低減は、対象の血液、骨髄細胞、及び/またはがん細胞のいずれか1つ以上におけるベースラインに対する低減であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象におけるHSC及び/またはHSPC(例えば、HSC及び初期前駆細胞)を少なくとも60%(例えば、少なくとも70%、少なくとも75%)低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象におけるHSC及び/またはHSPC(例えば、HSC及び初期前駆細胞)を少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%)低減する。この低減は、対象の血液細胞及び/または骨髄細胞におけるベースラインに対する低減であり得る。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、投与は、ヒトCD34造血幹細胞及び/または造血前駆細胞を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象におけるCD34+HSPC(例えば、HSC及び初期前駆細胞)を少なくとも60%(例えば、少なくとも70%、少なくとも75%)低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象におけるCD34+HSPC(例えば、HSC及び初期前駆細胞)を少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%)低減する。この低減は、対象の血液細胞及び/または骨髄細胞におけるベースラインに対する低減であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象における樹状細胞を少なくとも60%(例えば、少なくとも70%、少なくとも75%)低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与(例えば、治療有効量での投与)は、対象における樹状細胞を少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%)低減する。この低減は、対象の血液細胞及び/または骨髄細胞におけるベースラインに対する低減であり得る。
いくつかの実施形態において、投与は、対象における骨髄系列の頻度及び数を低減する(例えば、骨髄系列の頻度及び/または数をベースラインレベルに対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%低減する)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の投与は、対象における循環骨髄系系列を低減する(例えば、循環骨髄系系列をベースラインレベルに対し少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%低減する)。
いくつかの実施形態において、投与は、対象の骨髄単核細胞におけるヒトCD34CD38細胞集団を(例えば、ベースラインレベルに対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、もしくは少なくとも65%)低減し、及び/または対象の骨髄単核細胞におけるヒトCD34CD38細胞集団を(例えば、ベースラインレベルに対し少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、もしくは少なくとも85%)低減する。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のがん(例えば、AML)の治療、及び/またはHSCTのための患者のコンディショニングに有効である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のがん(例えば、AML)の進行の緩徐化に有効である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のがん(例えば、AML)の腫瘍負荷の低減に有効である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のがん(例えば、AML)を有する対象の生存期間の増加に有効である。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞または免疫細胞の集団の治療有効量は、約50,000,000~10,000,000,000細胞の用量である。いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞または免疫細胞の集団の治療有効量は、約100,000,000~2,000,000,000細胞の用量である。いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞または免疫細胞の集団の治療有効量は、約200,000,000~1,000,000,000細胞の用量である。いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞または免疫細胞の集団の治療有効量は、約300,000,000~700,000,000細胞の用量である。
本明細書に記載の方法の前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、投与は静脈内投与である。いくつかの実施形態において、静脈内投与は、対象への注入により行われる。いくつかの実施形態において、静脈内投与は、対象へのボーラス注射により行われる。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、投与は1回行われる。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、投与は3~7日ごとに2~3週間行われる。
本明細書に記載の方法の前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、この方法は、投与ステップの前に、以下のステップ:
(i)対象から血液を採取すること、
(ii)血液から免疫細胞(例えば、T細胞)を単離すること、
(iii)前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態のCARをコードする核酸を、単離免疫細胞に導入すること、ならびに
(iv)ステップ(iii)で得られた単離免疫細胞を拡大することをさらに含み、この拡大は、投与ステップ中に投与された免疫細胞または免疫細胞の集団をもたらす。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、チェックポイント阻害剤をさらに含む。前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、本明細書に記載の方法は、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、PD1、PD-L1、またはCTLA4のアンタゴニスト(例えば、当技術分野で知られている任意のこのようなアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗PD1抗体などのアンタゴニスト抗体)である。
前述のまたは関連する任意の態様及び実施形態において、対象はヒトである(例えば、本明細書に記載の任意の方法を用いて治療される対象)。
定義
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、数値の修飾に使用される場合、数値の上下10%までの偏差が、挙げられた数値の意図された意味の範囲内にとどまることを示す。
本明細書で使用する場合、「VL」という用語は、抗体の軽鎖可変領域を指す。
本明細書で使用する場合、「VH」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指す。
本明細書で使用する場合、参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント」または「配列同一性パーセント」という用語は、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性パーセントは、配列をアラインメントし、必要な場合はギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後に決定される。アミノ酸配列同一性パーセントを定量するためのアラインメントは、当技術分野で知られている様々な方法で達成することができる。例示的なアラインメントツールとしては、限定されるものではないが、BLASTp、BLAST-2、ALIGN(例えば、ALIGN-2)、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアが挙げられる。
FLT3リガンドを伴うまたは伴わないREH細胞における、キメラ抗体1-18BA(マウスVL(配列番号25)及びマウスVH(配列番号27)及びヒトIgGを含む)の結合競合を示している。 ヒト化抗FLT3 IgG(配列番号1のVL及び配列番号3のVHを有する)のREH細胞に対する結合親和性を示している。 ヒト化抗FLT3 scFv(配列番号4、C末端にHisタグをさらに含む)のREH細胞に対する結合親和性を示している。 自己由来CAR-T細胞の生成及び自己由来CAR T療法としての使用を示す概略図である。 FLT3発現細胞(例えば、HSPC、樹状細胞、及び急性骨髄性白血病(AML))を標的とする抗FLT3 scFV CARのCAR構造を示す概略図である。 抗FLT3 CAR T細胞による標的FLT3細胞の殺細胞機序を示す概略図である。標的細胞におけるFLT3によるCARの活性化は、細胞パーフォリン及びグランザイムの発現を誘導して標的細胞におけるアポトーシスを誘導する。 抗FLT3 CAR T細胞を生成し、形質導入効率及び細胞傷害性を評価するための方法の概要である。 抗FLT3 scFvを含む抗FLT3 CAR(配列番号16によりコードされるCAR(以下の方向でドメインをコード:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-GFP))を形質導入したT細胞における、経時的な異なるウイルスMOIの形質導入効率(GFPT細胞%として報告)を示す棒グラフである。 MOI=10で形質導入したCAR T細胞(図2A)の拡大倍数を示すプロットである。 CAR T細胞培養10日目の異なるMOIにおけるGFP発現パーセント(%)(上)、及び抗Fab APC抗体(Jackson ImmunoResearch;no.109-607-003)を用いての抗FLT3 scFv発現vsGFP発現(下)を示すフロープロットである(図2AのCAR T細胞を使用)。 同上。 抗FLT3-CAR T細胞(図3Bに記載)がMOLM-13 AML細胞に対し細胞傷害性を有することを示している。代表的な実験方法を示している。 抗FLT3-CAR T細胞(図3Bに記載)がMOLM-13 AML細胞に対し細胞傷害性を有することを示している。非形質導入または抗FLT3 CAR-T細胞と共培養してから24時間後(上)及び48時間後(下)のE:T比1:1における、死滅MOLM13標的細胞(7-AADCellTrace)の頻度を示す代表的なフロープロットを示している。 抗FLT3-CAR T細胞(図3Bに記載)がMOLM-13 AML細胞に対し細胞傷害性を有することを示している。24時間後(上)及び48時間後(下)の示されたE:T比における標的細胞(MOLM13)殺滅の平均及び標準誤差を表す棒グラフを示している。 抗FLT3 CAR TのMOLM-13 AML細胞に対するin vivo有効性を示している。MOLM-13細胞(AML細胞株)を有するマウスにおける抗FLT3 CAR3a T細胞(図3Bに記載)の生着のタイムラインを示している。 抗FLT3 CAR TのMOLM-13 AML細胞に対するin vivo有効性を示している。対照T細胞または抗FLT3 CAR-T細胞により処置したマウスの73日間の生存曲線である。 抗FLT3 CAR TのMOLM-13 AML細胞に対するin vivo有効性を示している。対照またはCAR-T細胞による処置の前後の末梢血単核分画におけるヒトCD45+ MOLM-13細胞の全体的な頻度を個々のマウスごとに示している。「X」は、28日目までに全てのマウスが死亡したため、対照群でマウスを測定しなかったことを示している。 抗FLT3 CAR TのMOLM-13 AML細胞に対するin vivo有効性を示している。対照またはGFP+ CAR T細胞による処置後の末梢血単核分画における全T細胞及びGFP+抗FLT3 CAR3a-T 細胞の頻度を示している。「X」は、28日目までに全てのマウスが死亡したため、対照群でマウスを測定しなかったことを示している。 抗FLT3 CAR TのMOLM-13 AML細胞に対するin vivo有効性を示している。対照T細胞または抗FLT3 CAR3a-T細胞による処置後の末梢血単核分画におけるMOLM-13細胞の頻度を示している。 (ヒトバンク細胞による生着により「ヒト化」されたマウスの)自己由来CAR T細胞によるコンディショニングの成功を示している。CD123(CD34+)細胞を移植し、対照T細胞または抗FLT3 CAR T細胞を投与したマウス(図3Bに記載)のタイムラインを示している。 (ヒトバンク細胞を用いた生着により「ヒト化」されたマウスの)自己由来CAR T細胞によるコンディショニングの成功を示している。対照T細胞または抗FLT3 CAR-T細胞による処置の前後のMNC分画におけるヒトCD45細胞の全体的な頻度を、2つのコホートにおける個々のマウスについて示している。 (ヒトバンク細胞を用いた生着により「ヒト化」されたマウスの)自己由来CAR T細胞によるコンディショニングの成功を示している。対照T細胞または抗FLT3 CAR-T細胞による処置の前後のT細胞(CD3)、B細胞(CD19)、及び骨髄系細胞(CD33)の系列頻度を、2つのコホートにおける全てのマウスの平均として示している。 (ヒトバンク細胞を用いた生着により「ヒト化」されたマウスの)自己由来CAR T細胞によるコンディショニングの成功を示している。処置前の頻度に対する系列頻度の倍数変化を、対照T細胞及び抗FLT3 CAR Tコホートにおける個々のマウスについて示している。抗FLT3 CAR-T細胞を投与したマウスにおける骨髄系コンパートメントは、対照T細胞を投与したマウスと比較して顕著に低下していることを示している。 抗FLT3-CAR T細胞及び対照T細胞を移植したマウス(図3Bに記載)由来の大腿骨及び脛骨を示している(肉眼的解剖学的差異は観察されなかった)。 対照T細胞移植及び抗FLT3-CAR T細胞移植における、BM由来のMNC(BM-MNC)の総細胞カウント及びフローサイトメトリー解析、ならびにヒトCD45+細胞の頻度を示している。 2つのコホートにおける全てのマウスの平均として示されるBM-MNCにおける系列頻度(T細胞(CD3)、B細胞(CD19)、及び骨髄系細胞(CD33))を示している。 2つのコホートにおける個々のマウスについて、対照または抗FLT3 CAR-T細胞による処置の前後のBMにおける系列細胞カウント(T細胞(CD3)、B細胞(CD19)、及び骨髄系細胞(CD33))を示している。 対照T細胞及び抗FLT3 CAR T(図3Bに記載)処置マウスにおけるmCD45-hCD45+Lin-でゲーティングした代表的な等高線プロット(抗FLT3 CAR T処置マウスにおけるHSPC CD38+CD34+及びCD38-CD34+集団の、対照と比較しての有意な枯渇を示している)を示しており、また、CD38+CD34+及びCD38-CD34+HSPCの要約グラフを、対照T細胞及び抗FLT3 CAR T処置マウスの個々のマウスごとに示す全骨髄単核細胞(BM-MNC)のパーセンテージとして示している。抗FLT3 CAR T細胞処置マウスが有する骨髄内の前駆細胞は、対照マウスと比較して有意に少ない。 造血幹細胞(HSC、CD90+CD45RA-)及び多能性前駆細胞(MPP、CD90-CD45RA-)の頻度を、対照T細胞または抗FLT3 CAR T細胞で処置した個々のマウスごとに示す全BM-MNCのパーセンテージとして示している。抗FLT3 CAR T細胞処置マウスが有する骨髄内の前駆細胞は、対照マウスと比較して有意に少ない。 ヒトT細胞における抗FLT3 scFv表面発現に基づいて自殺CARベクターの形質導入の効率を測定するフローサイトメトリープロットを示しており、抗FLT3 CAR3a-T細胞、抗FLT3-CAR3a-EGFRt(得られるCARは、配列番号7のアミノ酸配列を有し、以下の方向でドメインをコードする:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-EGFRt)、及び抗FLT3-CAR-icasp9(得られるCARは、配列番号8のアミノ酸配列を有し、以下の方向でドメインをコードする:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-iCasp9)細胞の頻度を示している(それぞれ35.3%、27.5%、及び16.9%)。 元のコンストラクトCAR3aと比較しての、自殺スイッチCAR3a-EGFRtまたはCAR3a-icasp9を有する抗CAR T細胞の、様々なエフェクター:標的(E:T)細胞比(10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、及び1:5)における、標的AML NOMO-1細胞(FLT3を発現)に対するin vitro細胞傷害性試験の概略図である。 エフェクター細胞及び標的細胞を24時間共培養した後、デブリを除外した後のフローデータを示す代表的なドットプロットを示している。標的細胞はCellTraceViolet+として、エフェクター細胞はCellTraceViolet-として特定された。この図面は、CellTraceViolet+細胞でゲーティングした後の、死(7AAD+)標的細胞の頻度を示している。 NOMO-1細胞と24時間共培養した抗FLT3 CARについて、様々なT細胞エフェクター:NOMO-1標的細胞比における死(7AAD+)細胞の頻度を示す棒グラフである。全てのFLT3 CAR T細胞が、FLT3+NOMO-1細胞に対し、対照T細胞と比較して有意に高い細胞傷害効果を示している。2つの自殺CAR T細胞のいずれかと元のCARコンストラクトとの間で、細胞傷害効果に有意差は認められない。 CAR3a-T2A-EGFRtレンチウイルスベクター(図9Aに記載)を形質導入したT細胞における抗FLT3 CAR3a(scFvを検出)及びEGFRt(セツキシマブを使用)の表面発現を示すフロープロットを示している。 CAR3a-T2A-EGFRt T細胞のin vitro抗体依存性細胞傷害性(ADCC)試験の概略図である。 様々な用量のセツキシマブで処置した後に残存する抗FLT3 CAR T細胞のパーセント(%)を示すグラフであり、T細胞のみで、全同種異系MNC細胞とともに、またはT細胞が枯渇した同種異系MNC細胞とともに培養した。単独で培養した形質導入T細胞は、セツキシマブによる処置後にCAR3a発現細胞の有意な減少を示さず、一方、全同種異系MNCまたはT細胞が枯渇したこのようなMNCと培養した形質導入細胞は、セツキシマブによる用量依存的なCAR3a発現細胞の枯渇を示した。結果は、in vitroでのEGFRt発現抗FLT CAR T細胞に対するADCCの機能を支持するものである。 CAR3a-T2A-EGFRt-T(図9Aに記載)細胞または対照T細胞で処置した後の、EGFP-MOLM-13細胞を有するマウスの末梢血におけるCAR-T細胞の生存及び頻度を測定したin vivo実験のタイムラインを示している。 対照T細胞または抗FLT3 CAR3a EFGRt-T細胞(セツキシマブあり及びなし)で処置したマウスの生存曲線(AML注射後65日まで作成)を示している。 対照T細胞または抗FLT3 CAR3a-T細胞(セツキシマブありまたはなし)による処置後2週間、4週間、及び6週間における末梢血(PB)中のMOLM-13(mCD45-hCD45+EGFP+)細胞及びT細胞(mCD45-hCD45+CD3+)の頻度を示している。 CAR DNAレベル(ヒトアクチンDNAを基準に正規化)により測定したCAR T細胞の投与後4週間及び6週間における循環抗FLT3 CAR3a EFGRt-T細胞(セツキシマブあり/なし)の相対量を示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号16のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号7のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号8のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号6のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号12のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号11のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号10のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号9のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号13のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号14のCARを発現するプラスミドを示している。 CARのプラスミドコンストラクトを示している。配列番号15のCARを発現するプラスミドを示している。
ある特定の態様において、いかなる作用機序にも束縛されるものではないが、がんを標的とする上での有効性及び抵抗性という課題に対処するため、本明細書では、Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)を発現する細胞を特異的かつ効果的に標的化し殺滅することができる抗体、抗原結合フラグメント、CAR T細胞について記載する。本明細書に記載の抗体、フラグメント、及びCAR T細胞は、がん細胞(例えば、AML芽球などの白血病細胞)の表面に発現するFLT3に加えてHSC/HSPCを標的とし、このような細胞を特異的に除去することができ、それにより、その後のがん治療及び/または造血幹細胞移植が可能になる。本明細書に記載の抗体及び抗原結合フラグメント(例えば、scFv)は、がんの場合に共通して変異する領域以外の細胞外膜近位FLT3ドメインに結合することができ、FLT3との結合に関してFLT3リガンドと競合しない。他の既知の治療法とは異なり、本明細書に記載の抗体、フラグメント、CAR T細胞、組成物、及び方法は、FLT3受容体における一般的に知られている変異に関係なく、FLT3発現細胞を標的とすることができる。
1つの態様において、本明細書では、FLT3またはその抗原結合フラグメント(例えば、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、単鎖フラグメント(例えば、scFV))に特異的に結合するヒト化抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供するヒト化抗FLT3抗体及びその抗原結合フラグメントは、ヒト及びサル(例えば、アカゲザル)のFLT3に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供するヒト化抗FLT3抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトFLT3に特異的に結合する。
別の態様において、本明細書で提供するヒト化抗FLT3抗体及び抗原結合フラグメントをコードする核酸が提供される。また、本明細書では、本明細書で提供するヒト化抗FLT3抗体及び抗原結合フラグメントをコードする核酸を含むベクターも提供する。また、このような抗体及びフラグメントを生成するためのこのような核酸を発現する細胞、ならびにこのような抗体及びフラグメントを作製するための方法も提供する。
1つの態様において、本明細書では、FLT3に特異的に結合するキメラ抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供するキメラ抗FLT3抗体は、ヒト及びサル(例えば、アカゲザル)のFLT3に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供するキメラ抗FLT3抗体は、ヒトFLT3に特異的に結合する。また、本明細書では、本明細書で提供するキメラ抗FLT3抗体をコードする核酸も提供する。また、本明細書で提供するキメラ抗FLT3抗体をコードする核酸を含むベクターも提供する。また、このような抗体を生成するためのこのような核酸を発現する細胞、ならびにこのような抗体及びフラグメントを作製するための方法も提供する。
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組換え受容体を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載のCARを含む免疫細胞(例えば、CAR T細胞)を提供する。
また別の態様において、本明細書では、本明細書に記載のヒト化抗FLT3抗体、その抗原結合フラグメント、CARのような組換え受容体、及び免疫細胞(例えば、CAR T細胞)の使用方法を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、(例えば、ヒトに抗FLT3 CAR T細胞を投与することによる)抗FLT3 CAR免疫細胞を用いた血液悪性腫瘍(例えば、AML)の治療方法を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、(例えば、ヒトに抗FLT3 CAR T細胞を投与することによる)抗FLT3 CAR T細胞を用いたHSC移植コンディショニングの方法を提供する。いくつかの実施形態において、HSC移植のコンディショニングの方法の後に、造血細胞移植を行うことができる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(例えば、ヒトに抗FLT3抗体またはフラグメントを投与することによる)抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた血液悪性腫瘍(例えば、AML)の治療方法を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、(例えば、抗FLT3抗体またはフラグメントをヒトに投与することによる)抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントを用いるHSC移植コンディショニングの方法を提供する。いくつかの実施形態において、HSC移植のコンディショニングの方法の後に、造血細胞移植を行うことができる。
抗FLT3抗体
本明細書では、FLT3に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。本明細書で言及する抗体フラグメントは、記載されている抗体の抗原結合フラグメントを指す。ある特定の実施形態において、本明細書では、ヒト及びアカゲザルのFLT3に特異的に結合する抗体及びそのフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、ヒトFLT3に特異的に結合する抗体及びそのフラグメントを提供する。本明細書に記載の抗体及びフラグメントは、(ヒト及びアカゲザルに加えて)1つ以上の他の種由来のFLT3と交差反応性を示し得る。いくつかの実施形態において、ヒト及び/またはサル(例えば、アカゲザル)FLT3に特異的に結合し、他の種由来のFLT3との交差反応性を示さない抗体及びそのフラグメントも企図されている。ある特定の実施形態において、本明細書では、FLT3に結合するヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、FLT3に結合するキメラ抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、企図されている抗FLT3抗体及びフラグメントは、本明細書に記載の任意のCDRを含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意のCDRを含む単鎖可変フラグメント(scFV)を提供する。いくつかの実施形態において、企図されている抗FLT3抗体及びフラグメントは、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域、及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域を含む、単鎖可変フラグメント(scFV)を提供する。
いくつかの実施形態において、企図されているヒト化抗FLT3抗体及びフラグメントは、本明細書に記載の任意のCDRを含む。いくつかの実施形態において、企図されているヒト化抗FLT3抗体及びフラグメントは、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、記載されている抗FLT3抗体及びフラグメントは、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域、及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列、及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変領域を含む、単鎖可変フラグメント(scFv)を提供する。
いくつかの実施形態において、記載されている抗FLT3抗体及びフラグメントは、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域(CDR領域内で少なくとも97%の同一性を有する)、及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変領域(CDR領域内で少なくとも97%の同一性を有する)を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域(CDR領域内で少なくとも97%の同一性を有する)、及び/または本明細書に記載の任意の重鎖可変領域に対し少なくとも95%の同一性を有する配列を有する重鎖可変領域(CDR領域内で少なくとも97%の同一性を有する)を含む、単鎖可変フラグメント(scFV)を提供する。
相補性決定領域
相補性決定領域(CDR)は、当技術分野において様々な方法で(Kabat、Chothia、AbM、Contact、及びIMGTを含む)定義されている。いくつかの実施形態において、抗体のCDRは、Kabatシステムに従って定義される。Kabatシステムは、配列可変性に基づいている(例えば、Kabat EA etal,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;Kabat EA & Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391を参照)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体のCDRは、Kabatシステムを用いて決定される。
いくつかの実施形態において、抗体のCDRは、Chothia
システムに従って定義される。Chothiaシステムは、免疫グロブリン構造ループ領域の位置に基づいている(例えば、Tramontano A et al,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82;Chothia C & Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917;米国特許第7,709,226号;Al-Lazikani B et al.,(1997)J Mol Biol 273:927-948;及びChothia C et al,(1992)J Mol Biol 227:799-817を参照)。「Chothia CDR」という用語及び同様の用語は当技術分野で認識されており、Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917に従って定められる抗体CDR配列を指す(また、例えば、米国特許第7,709,226号及びMartin,A.,“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”(Antibody Engineering,Kontermann and Diibel,eds.,Chapter 31,pp.422-439,Springer-Verlag,Berlin(2001))も参照)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体のCDRは、Chothiaシステムを用いて決定される。
いくつかの実施形態において、抗体のCDRは、AbMシステムに従って定義される。AbMシステムは、Kabat CDR及びChothia構造ループの妥協点に相当する超可変領域に基づいており、CDRは、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア(Oxford Molecular Group, Inc.)を用いて決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体のCDRは、AbMナンバリングシステムを用いて決定される。
いくつかの実施形態において、抗体のCDRは、IMGTシステムに従って定義される(IMGT(登録商標)(international ImMunoGeneTics information system(登録商標))ウェブサイトimgt.org(設立者兼理事:Marie-Paule Lefranc,Montpellier,France)を参照;例えば、Lefranc,M.-P.et al.,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212及びLefranc,M.-P.,1999,The Immunologist,7:132-136及びLefranc,M.-P.et al.,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212を参照)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体のCDRは、IMGTシステムを用いて決定される。
いくつかの実施形態において、抗体のCDRは、Contactシステムに従って定義される。Contactの定義は、利用可能な複合体結晶構造(bioinf.org.uk/abs)の解析に基づいている(例えば、Martin A.“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”(Antibody Engineering,Kontermann and Diibel,eds.,Chapter 31,pp.422-439,Springer-Verlag,Berlin(2001))及びMacCallum RM et al.,(1996)J Mol Biol 5:732-745を参照)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体のCDRは、Contactシステムを用いて決定される。
Kabat、Chothia、AbM、IMGT、及び/またはContact CDRの位置は抗体に応じて変動する可能性があり、当技術分野で知られている方法に従って決定することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号86のアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-L1)を含む軽鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号87のアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-L2)を含む軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号88のアミノ酸配列を含む相補性決定領域3(CDR-L3)を含む軽鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号86、87、及び88をそれぞれ有するCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3を含む軽鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号89のアミノ酸配列を有する相補性決定領域1(CDR-H1)を含む重鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号90のアミノ酸配列を有する相補性決定領域2(CDR-H2)を含む重鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号91のアミノ酸配列を有する相補性決定領域3(CDR-H3)を含む重鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号89、90、及び91をそれぞれ有するCDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3を含む重鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号86のCDR-L1、配列番号87のCDR-L2、及び/または配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域、及び/または(ii)配列番号89のCDR-H1、配列番号90のCDR-H2、及び/または配列番号91のCDR-L3を含む重鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号86のCDR-L1、配列番号87のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3を含む軽鎖可変領域と、(ii)配列番号89のCDR-H1、配列番号90のCDR-H2、及び配列番号91のCDR-L3を含む重鎖可変領域とを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体のCDRは、Kabatシステムを用いて決定される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、上述のCDR定義系(例えば、Kabat)のいずれかに従って定義される、本明細書に記載の任意の抗体のCDRを含む抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号28の可変領域の1つ、2つ、もしくは3つ全てのCDR、及び/または(ii)配列番号17の可変領域の1つ、2つ、もしくは3つ全てのCDRを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号28の可変領域の3つのCDRと、配列番号17の可変領域の3つのCDRとを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている(例えば、配列番号17を含む重鎖可変領域及び/または配列番号28を含む軽鎖可変領域を有する、抗FLT3抗体のヒト化抗体またはフラグメント)。具体的な実施形態において、CDRは、Kabatにより定められている通りである。
いくつかの実施形態において、本明細書では、米国特許公開第20190127464号に記載の任意のマウス抗FLT3抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全てのCDRを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、米国特許公開第20190389955号に記載の、(米国特許公開第20190389955号の配列番号に基づく)配列番号25のVLと配列番号27のVHとを有するマウス抗FLT3抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全てのCDRを含む抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、米国特許公開20190127464号に記載の任意のマウス抗FLT3抗体の6つ全てのCDRを含む抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)(例えば、米国特許公開20190127464a号に記載の、配列番号5のVLと配列番号7のVHとを有する抗体)を提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。具体的な実施形態において、CDRは、Kabatにより定められている通りである。
また、本明細書では、上述のCDR配列内に置換、欠失、または挿入を伴う抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)も企図されている。ある特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のCDRに対し少なくとも97%のCDR配列同一性を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のCDRに対し少なくとも98%のCDR配列同一性を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のCDRに対し少なくとも99%のCDR配列同一性を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のCDR配列内に1つ、2つ、または3つまでの置換、欠失、または挿入を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のいずれか1つのCDR配列内に1つ、2つ、または2つまでの置換、欠失、または挿入を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗体及びフラグメントの6つのCDR内に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10までの総数の置換、欠失、または挿入を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗体及びフラグメントの6つのCDR内に1つ、2つ、または3つまでの総数の置換、欠失、または挿入を有する、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、抗FLT3抗体またはフラグメントはヒト化されている。
当技術分野で知られているように、CDRは、フレームワーク領域に囲まれている。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体またはフラグメントは、ヒトまたはヒト由来のフレームワーク領域を有する。本明細書に記載の抗FLT3抗体及びフラグメントのいくつかの実施形態において、フレームワーク領域はヒトフレームワーク領域である。本明細書に記載の抗FLT3抗体及びフラグメントのいくつかの実施形態において、フレームワーク領域はヒト由来フレームワーク領域である。
使用することができ、当技術分野で知られているヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、(i)ヒト生殖系列フレームワーク領域、(ii)ヒト成熟(体細胞変異)フレームワーク領域、(iii)「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域、(iv)軽鎖及び重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域、ならびに(v)スクリーニングFRライブラリーに由来するフレームワーク領域が挙げられる。例えば、Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997);Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998);Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta et al.J.Immunol.,151:2623(1993);Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993);Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996);及びAlmagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)を参照。
本明細書に記載のCDRは、既知のDNA組換え技法を用いて、本明細書に記載の任意のフレームワーク領域に挿入することができる。
例示的な抗FLT3抗体:VL及びVH
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)であって、配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)であって、配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(ii)配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(ii)配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(ii)配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3及び17~27のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、(ii)配列番号1、2、及び28~38のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、記載されている任意の軽鎖可変領域と、上に記載されている任意の重鎖可変領域とを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)が企図されている。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)、及び/または(ii)配列番号1のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号1のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号1のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号2のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号3のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号2のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号18のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号29のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号18のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号29のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号18のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号29のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号19のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号30のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号19のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号30のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号19のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号30のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号20のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号31のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号20のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号31のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号20のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号31のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号21のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号32のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号21のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号32のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号21のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号32のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号22のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号33のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号22のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号33のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号22のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号33のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号23のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号34のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号23のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号34のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号23のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号34のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号24のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号35のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号24のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号35のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号24のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号35のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号25のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号36のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号25のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号36のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号25のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号36のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号26のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号37のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号26のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号37のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号26のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号37のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号27のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号38のアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号27のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号38のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号27のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号38のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むヒト化抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号17のアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号28のアミノ酸配列を含むVLを含む、キメラ抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)配列番号17のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号28のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えばscFv)を提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、(i)配列番号17のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVH、及び/または(ii)配列番号28のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有する、アミノ酸配列を含むVLを含む、抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、この段落で指定する配列を含むVH及びVLをともに含むキメラ抗FLT3抗体またはそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。
scFv
ある特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のヒト化抗FLT3抗体のscFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意のVH及び/またはVL(本明細書に記載の任意のVH及びVLの対を含む)を含む、scFvフラグメントを提供する。単鎖可変フラグメント抗体の作製する方法は、当技術分野で知られている。例えば、scFv抗体は、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域を短いペプチドリンカーを介し融合させることにより、作製することができる。好適な短いペプチドリンカーは当技術分野で知られており、例示的なリンカーを本明細書に記載する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号4、5、及び40~49のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号4、5、及び40~49のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号4、5、及び40~49のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号4、5、44~47、及び49のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号4、5、44~47、及び49のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号4、5、44~47、及び49のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号4のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号4のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号4のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号5のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号5のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号5のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号44のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号44のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号44のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号45のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号45のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号45のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号46のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号46のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号46のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号47のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号47のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号47のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号49のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号49のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号49のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号39のアミノ酸配列を含む抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号39のアミノ酸配列に対し少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、これらの配列内の置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(すなわち、フレームワーク領域)内で生じる。ある特定の実施形態において、本明細書では、配列番号39のアミノ酸配列に対し少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、フレームワーク領域内で少なくとも95%(または少なくとも96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の同一性を有し、CDR領域内で少なくとも97%(または少なくとも98%、99%、もしくは100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
scFvsに使用することができるリンカー
いくつかの実施形態において、本開示は、VH及びVLを接続する1つ以上のリンカーを含む、抗FLT3単鎖可変フラグメント(scFv)を提供する。「リンカー」とは、2つ以上のポリペプチドまたは核酸が互いに接続するように共有結合する官能基のことである。リンカーは、当技術分野で知られている任意のリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシン及びセリンを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは式(Gly3~4-Ser)1~4を有する。いくつかの実施形態において、リンカーはGlySerリンカーであり、1~4回繰り返される。いくつかの実施形態において、リンカーはGlySerリンカーであり、1~4回繰り返される。いくつかの実施形態において、リンカーはGlySer及びGlySerを含み、各々1~4回繰り返される。
ある特定の実施形態において、リンカーは4~25アミノ酸長である。ある特定の実施形態において、リンカーは4~21アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは5アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは10アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは15アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは19アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは20アミノ酸長である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号50のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号51のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号52のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号53のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号55のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号56のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号57のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号58のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号59のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の軽鎖可変領域(VL)を本明細書に記載の任意の重鎖可変領域(VH)に結合する本明細書に記載の任意のリンカー(または本明細書に記載の任意のVL/VH対)を含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVLを、配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVHに結合する、本明細書に記載の任意のリンカーを含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVLを、配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVHに結合する、配列番号50のリンカーを含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVLを、配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVHに結合する、配列番号51のリンカーを含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVLを、配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVHに結合する、配列番号52のリンカーを含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVLを、配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVHに結合する、配列番号53のリンカーを含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVLを、配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むVHに結合する、配列番号54のリンカーを含む、抗FLT3 scFvフラグメントを提供する。
さらなる抗FLT3抗体、フラグメント、及び特性
いくつかの実施形態において、本明細書では、抗FLT3抗体であって、抗体が、本明細書に記載の任意のVH及びVL領域を含む免疫グロブリンである、抗FLT3抗体について記載する。使用することができる免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgY、IgA)である。使用することができる免疫グロブリン分子は、任意のクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)である。使用することができる免疫グロブリン分子は、任意のサブクラスである。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンはIgGである。
いくつかの実施形態において、本明細書では、重鎖のみまたは軽鎖のみ(本明細書に記載の任意のVHまたはVLを含む)を有する、単一ドメイン抗FLT3抗体について記載する。いくつかの実施形態において、本明細書では、重鎖(本明細書に記載の任意のVHを含む)のみを有する単一ドメイン抗FLT3抗体について記載する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、抗FLT3抗体の抗原結合フラグメント(限定されるものではないが、Fvフラグメント、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、F(ab’)フラグメント、またはジスルフィド結合Fv(sdFv)を含む)について記載する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、キメラ抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントであって、キメラ抗体が、マウス可変領域と、別の種(例えば、ヒト)の定常領域とを有する、キメラ抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントについて記載する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、多重特異的抗FLT3抗体及びフラグメント(例えば、二重特異的抗体及びフラグメント)であって、(本明細書に記載の抗原結合フラグメントを用いて)FLT3に特異的に結合することに加えて、1つ以上のさらなる抗原(例えば、第2の追加の抗原)に特異的に結合する、多重特異的抗FLT3抗体及びフラグメントについて記載する。1つまたはいくつかのさらなる抗原は、標的細胞(例えば、AML細胞)の表面に露出した抗原であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書では、FLT3タンパク質に対する結合親和性を、約0.1nM~100nM、0.5nM~50nM、または1nM~10nMのEC50で有する、抗FLT3抗体及びそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、FLT3タンパク質に対する結合親和性を、約100nM未満、約75nM未満、約50nM未満、約25nM未満、約10nM未満、約5nM未満、約3nM未満、約2nM未満、または約1nM未満のEC50で有する、抗FLT3抗体及びそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、FLT3タンパク質に対する結合親和性を、15nM未満、10nM未満、5nM未満、または2.5nM未満のEC50で有する、抗FLT3抗体及びそのフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を媒介する、抗FLT3抗体及びそのフラグメントについて記載する。当技術分野で知られているように、ADCCは、細胞表面に結合した抗体がナチュラルキラー(NK)細胞にあるFc受容体と相互作用することにより作動する。NK細胞は、IgG1及びIgG3サブクラスを認識する受容体Fc.ガンマ.RIII(CD16)を発現する。ADCCの殺滅機序は、パーフォリン及びグランザイムを含む細胞質顆粒の放出を伴う。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメント(例えば、scFv)は、FLT3との結合に関してFLT3リガンドと競合しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びフラグメントは、FLT3リガンドの存在下で(または細胞をFLT3リガンドで前処置した後に)、FLT3リガンドの非存在下(または細胞をFLT3リガンドで前処置しない場合)とほぼ同じように、例えばin vitroで(当技術分野で知られているまたは本明細書に記載されている(例えば、実施例1を参照)競合的結合を評価するための任意の方法論を用いて)、FLT3に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びフラグメントのFLT3との結合は、FLT3リガンドの存在下で(またはFLT3リガンドで細胞を前処置した後に)、FLT3リガンドの非存在下(またはFLT3リガンドで細胞を前処置しない場合)と比較して、例えば、in vitroで(当技術分野で知られているまたは本明細書に記載されている(例えば、実施例1を参照)競合的結合を評価するための任意の方法論を用いて)、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、3%未満、または1%未満低減される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びフラグメントのFLT3との結合は、FLT3リガンドの存在下で(または細胞をFLT3リガンドで前処置した後に)、FLT3リガンドの非存在下(または細胞をFLT3リガンドで前処置しない場合)と比較して、例えばin vitroで(当技術分野で知られているまたは本明細書に記載されている(例えば、実施例1を参照)競合的結合を評価するための任意の方法論を用いて)、5%未満、3%未満、または1%未満低減される。
本明細書では、FLT3発現細胞を標的とし、除去または殺滅することができる、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。本明細書では、細胞表面に発現するFLT3を標的とすることができる、抗FLT3抗体及びそのフラグメント(例えば、scFv)を提供する。例えば、本明細書では、がん細胞(例えば、AML芽球などの白血病細胞)の表面に発現するFLT3を標的とすることができる、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントを提供する。また、本明細書では、HSC及び/またはHSPCの表面に発現するFLT3を標的とすることができる、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントも提供する。また、本明細書では、本明細書に記載のまたは当技術分野で知られているFLT3を発現する任意の造血細胞系列の表面に発現するFLT3を標的とすることができる、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントも提供する。いかなる理論または作用機序にも束縛されるものではないが、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメント(例えば、scFv)は、細胞外膜近位FLT3ドメインに結合することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントは、野生型及び変異体FLT3の両方(例えば、がん(例えば、このような抗体/フラグメントを用いて治療されるがん)が変異することが知られている、またはそのように判定されているFLT3)に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントは、がんが変異しない(例えば、がん(例えば、記載されている抗体/フラグメントを用いて治療されるがん)が変異することが知られていない、またはがんが変異しないと判定されている)FLT3の領域に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントは、FLT3発現細胞が野生型FLT3を発現するか変異体FLT3を発現するかにかかわらず、FLT3発現細胞に結合する、またはそれを標的とする(例えば、殺滅する)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントは、野生型及び変異体FLT3を発現するFLT3発現がん細胞に結合する、またはそれを標的とする(例えば、殺滅する)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体及びそのフラグメントは、変異体FLT3を発現するFLT3発現がん細胞(例えば、変異体FLT3を発現することが知られているか、または変異体FLT3を発現すると判定されている(例えば、当技術分野で知られているFLT3の任意の変異を有する))に結合する、またはそれを標的とする(例えば、殺滅する)。
抗体の作製
本明細書に記載の抗FLT3抗体及びその抗原結合フラグメントは、当技術分野で知られている及び/または本明細書に記載の任意の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で知られており、例えば、ハイブリドーマ技術を使用する。例えば、Harlow E and Lane D,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,2nd ed.1988);Hammerling GJ et al.,:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563(Elsevier,NY,1981);Kohler G and Milstein C,1975,Nature 256:495;Goding JW (Ed),Monocolonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986)を参照。ハイブリドーマ技術を使用する際は、マウスまたは別の適切な宿主動物を標的タンパク質(例えば、FLT3)で免疫して、標的タンパク質に特異的に結合する抗体を生成するリンパ球を誘発することができ、次いでリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成する。次いでハイブリドーマ細胞を培養基で成長させ、抗体の生成についてアッセイする。この方法により生成された抗体の結合特異性は、当技術分野で知られている方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫沈降法、またはラジオイムノアッセイ(RIA)により定量することができる。モノクローナル抗体は、さらに精製することができる。
また、モノクローナル抗体は、組換え技術及びファージディスプレイ技術を用いたりヒト化マウスを用いたりして作製することもできる。例えば、Brinkman U et al.,1995,J.Immunol.Methods 182:41-50;Ames RS et al.,1995,J Immunol.Methods 184:177-186;Laffleur et al.,2012,Methods Mol.Biol.901:149-59;Persic L.et al.,1997,Gene 187:9-18を参照。
キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。例えば、Morrison SL,1985,Science 229:1202-7;Gillies SD et al.,1989,J.Immunol.Methods 125:191-202;Oi VT & Morrison SL,1986,BioTechniques 4:214-221を参照。キメラ抗体を作製する場合、ある種(例えばマウス)の可変領域を別の種(例えばヒト)の定常領域と連結する。
ヒト化抗体を作製する方法は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、CDRグラフティングによる方法が挙げられる。例えば、Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5):489-498;Studnicka GM et al,(1994)Prot Engineering 7(6):805-814;及びRoguska MA et al,(1994)PNAS 91:969-973;Tan P et al,(2002)J Immunol 169:1119-25;Caldas C et al,(2000)Protein Eng.13(5):353-60;Morea V et al,(2000),Methods 20(3):267-79;Baca M et al,(1997)J Biol Chem 272(16):10678-84;Roguska MA et al,(1996)Protein Eng 9(10):895 904;Couto JR et al,(1995)Cancer Res.55(23 Supp):5973s-5977s;Couto JR et al,(1995)Cancer Res 55(8):1717-22;Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10;Pedersen JT et al,(1994)J Mol Biol 235(3):959-73)を参照。
ヒト抗体を作製する方法は当技術分野で知られており、このような方法としては、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ法が挙げられる。例えば、国際公開第WO98/46645号、第WO98/50433号、第WO98/24893号、第WO98/16654号、第WO96/34096号、第WO96/33735号、及び第WO91/10741号を参照。
単鎖Fv(scFv)を含む抗体フラグメントを作製する方法も当技術分野で知られている。例えば、Ahmad et al.,2012,Clinical and Developmental Immunology,doi:10.1155/2012/980250;Wang et al.,2006,Anal.Chem.78,997-1004;Pansri et al.,2009,BMC Biotechnology 9:6を参照。例えば、scFvは、(組換え発現技法を用いて)短いポリペプチドリンカーを介し重鎖及び軽鎖可変領域を融合させることにより構築することができ、所望の抗原結合特性を有するscFv抗体は、当技術分野で知られている方法により選択することができる。さらに、Fab及びF(ab’)フラグメントは、それぞれパパイン及びペプシンを用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により生成することができる。
シングルドメイン抗体(例えば、軽鎖なし)を作製する方法も当技術分野で知られている。例えば、Riechmann L & Muyldermans S,1999,J Immunol.231:25-38;Nuttall SD et al.,2000,Curr Pharm Biotechnol.1(3):253-263;Muyldermans S,2001,J Biotecnol 74(4):277-302を参照。
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で周知されている。例えば、Konterman,2012,MAbs 4:182-197;Gramer et al.,2013,MAbs 5:962-973を参照。
マウス抗FLT3抗体を作製する方法は、米国特許公開第20190137464号及び米国特許公開第20190389955号に記載されている(これらの各々は、参照により全体として、具体的にはマウス抗FLT3抗体の作製を記載するものとして、本明細書に援用される)。ヒト化抗FLT3抗体及びキメラ抗FLT3抗体を作製する方法について本出願に記載する(例えば、実施例を参照)。
抗体の組換え生成の方法も当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、抗FLT3抗体(またはその抗原結合フラグメント)の組換え生成のために、抗体(またはその抗原結合フラグメント)をコードする核酸が単離され、宿主細胞内で発現するために1つ以上のベクターに挿入される。いくつかの実施形態において、抗FLT3抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養することと、宿主細胞(または宿主細胞培養基)から抗体を回収することと、任意選択で抗体をさらに精製することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗FLT3抗体の抗原結合フラグメントを作製する方法であって、フラグメントの発現に適した条件下で、前述のフラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、宿主細胞(または宿主細胞培養基)からフラグメントを回収することと、任意選択でフラグメントをさらに精製することとを含む、方法を提供する。
組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)
1つの態様において、本明細書では、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、組換え受容体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体の任意の抗原結合フラグメントを含む、組換え受容体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の抗FLT3 VH及び/またはVLを含む、組換え受容体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の抗FLT3 scFvを含む、組換え受容体を提供する。企図されている組換え受容体に含まれるものとしては、機能的非TCR抗原受容体がある。いくつかの実施形態において、本明細書では、T細胞受容体(TCR)複合体のシグナル伝達ドメインと、FLT3抗原認識ドメイン(例えば、抗FLT3 scFv(例えば、本明細書に記載のいずれか1つ))とのキメラを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供する組換え受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)である。また、本明細書では、本明細書に記載の組換え受容体(例えば、CAR)を発現する細胞(例えば、免疫細胞)も提供する。CARを発現するT細胞は、本明細書ではCAR T細胞と称する。また、本明細書では、療法(例えば、FLT3発現に関連する疾患の治療)における、本明細書に記載の組換え受容体(例えば、CAR)を発現する細胞(例えば、免疫細胞)の使用も提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、がん(例えば、AML、ALL、または樹状細胞新生物)の治療における、本明細書に記載の組換え受容体(例えば、CAR)を発現する細胞(例えば、免疫細胞)の使用を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、造血細胞移植前の対象のコンディショニングにおける、本明細書に記載の組換え受容体(例えば、CAR)を発現する細胞(例えば、免疫細胞)の使用を提供する。
抗原受容体(CARを含む)の例は、当技術分野で周知されている。それらを作製する方法も、当技術分野で周知されている。例えば、Sadelain et al.,Cancer Discov.2013 April;3(4):388-398;Davila et al.,2013,PLOS ONE 8(4):e61338;Turtle et al.,Curr.Opin.Immunol.,2012,24(5):633-39;Wu et al.,Cancer,2012,18(2):160-75を参照。
本明細書で提供するCARは、概して、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメント(例えば、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗原結合フラグメント)を含む細胞外ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本明細書で提供するCARは、膜貫通ドメイン(例えば、本明細書に記載の任意の膜貫通ドメイン)及び細胞内ドメイン(例えば、本明細書に記載の任意の細胞内ドメイン)をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、及び/または膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間のリンカーをさらに含む。本明細書で提供するCARに使用することができる例示的なリンカーを本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、リンカーは親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシン及びセリンを含む。
当技術分野では、4つの世代のキメラ抗原受容体(CAR)が知られている。第一世代CARは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介し、抗体由来scFvをT細胞受容体のCD3ゼータ(ζまたはz)の細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代CARは、追加のドメインを細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD28、4-1BB(41BB)、またはICOS)に組み込んで、共刺激シグナルを供給する。第三世代CARは、2つの共刺激ドメイン(TCR CD3ゼータ鎖と融合)を含む。第三世代の共刺激ドメインは、例えば、CD27、CD28、4-1BB、ICOS、及び0X40のうちの少なくとも2つの任意の組合せを含み得る。第四世代CARは、1つ以上の刺激性サイトカインを含み得る。CARの例としては、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、抗原結合scFvを含むもの)と、リンカーまたはヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、CD3z及び/または共刺激分子に由来する1つ(第1世代)、2つ(第2世代)、または3つ(第3世代)のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含むCARが挙げられる(Maude et al,Blood.2015;125(26):4017-4023;Kakarla and Gottschalk,Cancer J.2014;20(2):151-1 55)。機能的には、T細胞受容体のCD3zシグナル伝達ドメインは、結合すると、T細胞を活性化し増殖を誘導するが、アネルギー(身体の防御機構による反応の欠如(結果的に末梢リンパ球寛容の直接誘導に至る))を引き起こすことがある。リンパ球は、特定の抗原に反応しないとアネルギーとみなされる。第二世代CARにおける共刺激ドメインの追加により、修飾T細胞の複製能力及び持続性が改善し得る。第三世代CARは複数のシグナル伝達ドメイン(共刺激)を組み合わせており、これにより効力が増強し得る。第四世代のCARは刺激性サイトカインを発現し、これにより移植後の拡大及び持続性が改善し得る。本明細書では任意のこのようなCARを提供し、細胞外ドメインは抗FLT3抗原結合フラグメント(例えば、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗原結合フラグメント、例えば、scFv)を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書では第一世代CARを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では第二世代CARを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では第三世代CARを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では第四世代CARを提供する。
いくつかの実施形態において、CARは、抗FLT3抗原結合ドメイン(例えば、scFv)を含む細胞外(ecto)ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内(endo)ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、CARは、抗FLT3抗原結合ドメイン(例えば、scFv)を含む細胞外(外部(ecto))ドメインと、膜貫通ドメインと、活性化ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞内(内部(endo))ドメインとを含む。
細胞外ドメイン/外部ドメイン
ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む(例えば、企図されている抗FLT3抗体及びそのフラグメントについて記載する上述の「抗FLT3抗体」セクションにおける開示内容(使用することができる抗FLT3 VH及び/またはVL領域について記載するサブセクションを含む)を参照)。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、本明細書に記載の任意の抗FLT3単鎖可変フラグメント(scFv)を含む(例えば、上述の「抗FLT3抗体」のセクションにおける開示内容(抗FLT3 scFv、scFvに使用することができるVH及び/またはVL領域、ならびに記載のVH及びVL領域を連結するために使用することができるリンカーについて記載するサブセクションを含む)を参照)。抗FLT3フラグメント(例えば、抗FLT3 CARの細胞外ドメインに使用することができるできるscFvフラグメント)については、本出願の他の箇所に記載しているため、このセクションでは、抗FLT3 scFvの具体的で非限定的な例のみについて具体的に論じる。CARの細胞外ドメイン内のscFvは、CARが、表面にFLT3を発現する標的細胞に結合するのを可能にする(すなわち、CARがその標的抗原に結合するのを可能にする)。
具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号4のアミノ酸配列(または配列番号4に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号5のアミノ酸配列(または配列番号5に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号44のアミノ酸配列(または配列番号44に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号45のアミノ酸配列(または配列番号45に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号46のアミノ酸配列(または配列番号46に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号47のアミノ酸配列(または配列番号47に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。具体的な実施形態において、抗FLT3 scFvは、配列番号49のアミノ酸配列(または配列番号49に対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列)を含む。
いくつかの実施形態において、CARの細胞外ドメインはシグナルペプチドまたはリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、CARの細胞外ドメインは切断性シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、CARの細胞外ドメインは、抗FLT3抗原結合ドメインの前(例えば、抗原結合ドメインに対しN末端側)にシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、当技術分野でCARコンストラクトにおける使用について知られている。いくつかのシグナルペプチドは、CARの新生タンパク質を小胞体に導くのを助ける。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはGM-CSFシグナルペプチドまたはIgk-鎖シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号71のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号71に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号77のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号77に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、シグナルペプチドを抗FLT3抗原結合ドメイン(例えば、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗原結合フラグメント(例えば、scFv))に接続する。いくつかの実施形態において、リンカーは、シグナルペプチドを抗FLT3軽鎖可変領域(例えば、本明細書に記載の任意の抗FT3 VL)に接続する。いくつかの実施形態において、リンカーは、シグナルペプチドを抗FLT3重鎖可変領域(例えば、本明細書に記載の任意の抗FT3 VH)に接続する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドを抗原結合ドメインに接続するリンカーは、1~25個のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、または5個のアミノ酸)を含み、任意選択でグリシン及び/またはセリンを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドを抗原結合ドメインに接続するリンカーは、2アミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドを抗原結合ドメインに接続するリンカーは、グリシンセリン(例えば、GS)リンカーである。
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞外ドメインをスペーサーまたはヒンジ領域に接続する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインをスペーサー領域またはヒンジ領域に接続するリンカーは、1~25個のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、または5個のアミノ酸)を含み、任意選択でグリシン及び/またはセリンを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインをスペーサー領域またはヒンジ領域に接続するリンカーは、2アミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインをスペーサー領域またはヒンジ領域に接続するリンカーは、グリシンセリン(例えば、GS)リンカーである。
スペーサーまたはヒンジ領域
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ヒンジ領域またはスペーサー領域により膜貫通ドメインに接続している。ヒンジ領域は、当技術分野で知られている任意のヒンジ領域とすることができる。ヒンジ領域の例としては、限定されるものではないが、CD8、CD28に由来するもの、またはIgG1、IgG2、もしくはIgG4から誘導されるものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、CD8細胞外ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域はCD8(例えばCD8α)ヒンジである。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域はCD28ヒンジである。いくつかの実施形態において、CD8αヒンジは、配列番号72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD8αヒンジは、配列番号72に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD8αヒンジは、配列番号78のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、CD8αヒンジは、配列番号78に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインとは、細胞膜に広がる疎水性のアルファヘリックスのことである。キメラ抗原受容体(CAR)に関しては、膜貫通ドメインは、CARの細胞膜への挿入を可能にする。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、以下のいずれか1つ以上の膜貫通ドメインである:4-1BB/CD137、活性化NK細胞受容体、免疫グロブリンタンパク質、B7-H3、BALER、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3ゼータ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8アルファ、CD8ベータ、CD96(Tactile)、CDlla、CDllb、CDllc、CDlld、CD5、CD9、CD16、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154、CEACAM1、CRT AM、CTLA4、PD-1、サイトカイン受容体、DAP-10、DNAMl(CD226)、Fcガンマ受容体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-l、Igアルファ(CD79a)、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、誘導性T細胞共刺激分子(ICOS)、mtegrin、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAMJTGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、CD83に特異的に結合するリガンド、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1)、MHCクラス1分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRFl)、OX-40、PAG/Cbp、プログラム死1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、SLAM(SLAMFl)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受容体タンパク質、TNFR2、TNFSF14、Tollリガンド受容体、TRANCE/RANKL、VLA1、及びVLA-6。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの膜貫通ドメインは、CD3膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、または4-1-BB膜貫通ドメインに由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの膜貫通ドメインはCD8(例えば、CD8α)膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの膜貫通ドメインはCD3膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの膜貫通ドメインはCD4膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの膜貫通ドメインは4-1-BB膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、CD8α膜貫通ドメインは、配列番号73のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD8α膜貫通ドメインは、配列番号73に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD8α膜貫通ドメインは、配列番号79の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD8α膜貫通ドメインは、配列番号79に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。
細胞内ドメイン/エンドドメイン
CARの細胞内ドメイン(すなわち、エンドドメイン)は受容体の機能的末端である。抗原認識後に受容体がクラスター形成し、シグナルが細胞に伝達される。細胞内ドメインは、CARを発現する免疫細胞を活性化するための内部シグナルを中継するシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの細胞内ドメインは、CD3ζ細胞内シグナル伝達(または活性化)ドメインを含む。CD3ζシグナル伝達ドメインは、3つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含む。ITAMは、抗原がCARに結合した後に、CARを含む細胞に活性化シグナルを送信する。
いくつかの実施形態において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号76のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号76に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号82の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号82に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの細胞内ドメインは、CD3ε(イプシロン)シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARの細胞内ドメインは、FcγR(FcRガンマ)シグナル伝達ドメインを含む。当技術分野で知られている他の活性化ドメインも使用することができる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメイン/エンドドメインは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、刺激ドメイン(例えば、CD3ζシグナル伝達ドメインまたは別の活性化ドメイン)及び共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、以下のいずれか1つ以上の共刺激ドメインである:CD28、ICOS、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激分子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、SLAMタンパク質、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83に特異的に結合するリガンド、またはこれらの任意の組合せ。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD28共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CD28共刺激ドメインは、配列番号74のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD28共刺激ドメインは、配列番号74に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD28共刺激ドメインは、配列番号80の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CD28共刺激ドメインは、配列番号80に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、4-1BB共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号75のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号75に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号81の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号81に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD28及び4-1BB共刺激ドメインの両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号74及び配列番号75のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD27の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、OX40の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ICOSの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメイン及び4-1BB共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメイン及びCD28共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、及びCD28共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号76のアミノ酸配列を有するCD3ζシグナル伝達ドメイン、配列番号75のアミノ酸配列を有する4-1BB共刺激ドメイン、及び配列番号74のアミノ酸配列を有するCD28共刺激ドメインを含む。
安全スイッチ
いくつかの実施形態において、CARは安全スイッチを含む。いくつかの実施形態において、安全スイッチは、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(hsv-tk)、誘導性カスパーゼ9(icasp9)、及び切断ヒト上皮成長因子受容体(EGFRt)ポリペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、本明細書に記載の任意のCARをコードする核酸を含むベクター内に含まれる。このようにして、安全スイッチを活性化するように設計されたプロドラッグ(例えば、iCasp9を活性化するAP1903)を投与すると、安全スイッチ及び活性化CAR発現細胞においてアポトーシスが作動する。
いくつかの実施形態において、自殺遺伝子/安全スイッチはicasp9である。いくつかの実施形態において、icasp9は、二量体化の化学的誘導物質(例えば、AP1903またはAP20187)が投与された後に免疫細胞(例えば、T細胞)の除去を可能にする。いくつかの実施形態において、icasp9は、配列番号85の核酸配列によりコードされる。いくつかの実施形態において、icasp9遺伝子は、配列番号85に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、icasp9安全スイッチは、配列番号105のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、icasp9安全スイッチは、配列番号105に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、自殺遺伝子/安全スイッチはEGFRtである。いくつかの実施形態において、EGFRtは、抗EGFRモノクローナル抗体(例えばセツキシマブ)が投与された後に免疫細胞(例えば、T細胞)の除去を可能にする。いくつかの実施形態において、EGFRtは、配列番号84の核酸配列によりコードされる。いくつかの実施形態において、EGFRt遺伝子は、配列番号84に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、EGFRt安全スイッチは、配列番号104のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、EGFRt安全スイッチは、配列番号104に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の安全スイッチ含有CARは、安全スイッチをCARに接続する自己切断ペプチドを含む。例示的な自己切断ペプチドとしては、2Aファミリーのペプチド(例えば、T2A、E2A、F2A、及びP2Aペプチド)ならびにIRESが挙げられる。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドはT2Aペプチドである。いくつかの実施形態において、T2Aペプチドは、配列番号83の核酸配列によりコードされる。いくつかの実施形態において、T2Aは、配列番号83に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列によりコードされる。いくつかの実施形態において、T2Aペプチドは、配列番号103のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、T2Aペプチドは、配列番号103に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドはE2Aペプチドである。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドはF2Aペプチドである。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドはP2Aペプチドである。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドはIRESペプチドである。
CARを発現する単離核酸
本明細書では、本明細書で提供するCARのうちの1つ以上をコードする核酸配列(ポリヌクレオチド)を提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫細胞(例えば、T細胞)の形質転換に適した任意のベクター内に含まれる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、合成ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、自己複製プラスミド、ウイルス(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス)を用いて形質転換される。
Tリンパ球の形質転換に適したレンチウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、例えば、米国特許第5,994,136号;同第6,165,782号;同第6,428,953号;同第7,083,981号;及び同第7,250,299号に記載のレンチウイルスベクターが挙げられる(これらの開示内容は、参照により全体として本明細書に援用される)。Tリンパ球の形質転換に適したHIVベクターとしては、限定されるものではないが、例えば、米国特許第5,665,577号に記載のベクターが挙げられる(この開示内容は、参照により全体として本明細書に援用される)。
いくつかの実施形態において、CARは、配列番号60の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号61の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号62の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号63の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号64の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号65の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号66の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号67の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号68の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号69の核酸を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号70の核酸を含む。
いくつかの実施形態において、CARは、配列番号60に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号61に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号62に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号63に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号64に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号65に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号66に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号67に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号68に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号69に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号70に対し少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、CARは、配列番号92のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号93のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号94のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号95のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号96のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号97のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号98のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号99のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号100のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号101のプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号102のプラスミドにより発現する。
CARを作製する方法
CARを作製する方法は、当技術分野で広く知られており、例えば、米国特許第6,410,319号、米国特許第7,446,191号、米国特許公開第2010/065818号、米国特許第8,822,647号、PCT公開第WO2014/031687号、米国特許第7,514,537号、及びBrentjens et al.,2007,Clin.Cancer Res.13:5426に記載されている(これらの各々は、参照により全体として本明細書に援用される)。
本開示のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、本明細書に記載の抗FLT3抗原結合フラグメントまたはscFv)とFLT3との結合は、当技術分野で知られている方法を用いて確認することができる。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、FACS解析、バイオアッセイ(例えば、成長阻害)、またはウェスタンブロットアッセイを使用することができる。これらのアッセイの各々は、概して、目的の複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体またはscFv)を用いることにより、特定のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えば、scFvを放射性標識しラジオイムノアッセイ(RIA)に使用することができる。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段により、またはオートラジオグラフィーにより、検出することができる。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、蛍光マーカーにより標識される。蛍光マーカーの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、及びmKalamal)、シアン蛍光タンパク質(例えば、ECFP、Cerulean、及びCyPet)、ならびに黄色蛍光タンパク質(例えば、YFP、Citrine、Venus、及びYPet)が挙げられる。いくつかの実施形態において、CARは、GFPにより標識される。いくつかの実施形態において、GFP標識CARは、配列番号70の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、GFP標識CARは、配列番号16のアミノ酸配列を含む。
例示的なCARコンストラクト
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、以下のドメインを含む:
シグナルペプチド-リンカー1-VL-リンカー2-VH-リンカー3-ヒンジ-TMドメイン-1つまたは2つの共刺激ドメイン-シグナル伝達/活性化ドメイン。いくつかの実施形態において、ドメインの順序はここで指定する通りである。いくつかの実施形態において、リンカードメインのいずれか1つ以上が存在しない。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、以下のドメインを含む:
シグナルペプチド-リンカー1-VL-リンカー2-VH-リンカー3-ヒンジ-TMドメイン-1つまたは2つの共刺激ドメイン-シグナル伝達/活性化ドメイン-自己切断ペプチド-安全スイッチ。いくつかの実施形態において、ドメインの順序はここで指定する通りである。いくつかの実施形態において、リンカードメインのいずれか1つ以上が存在しない。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、以下のドメインを含む:
シグナルペプチド-リンカー1-VL-リンカー2-VH-リンカー3-CD8ヒンジ-CD8TM-CD28共刺激ドメイン及び/または4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態において、ドメインの順序はここで指定する通りである(ただし、例えば、共刺激ドメインは、両方存在する場合、任意の順序で出現する)。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、以下のドメインを含む:
シグナルペプチド-リンカー1-VL-リンカー2-VH-リンカー3-CD8αヒンジ-CD8αTM-CD28共刺激ドメイン-4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態において、ドメインの順序はここで指定する通りである。
いくつかの実施形態において、このセクションで例示するCARにおいて、
VLは、配列番号1、2、及び28~38のうちの1つを含むアミノ酸配列から選択され、VHは、配列番号3、及び17~27のうちの1つを含むアミノ酸配列から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、以下のドメインを含む:
シグナルペプチド-リンカー1-VL-リンカー2-VH-リンカー3-CD8αヒンジ-CD8αTM-CD28共刺激ドメイン-4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン;ここで、
(i)VLは、配列番号1、2、及び28~38のうちの1つを含むアミノ酸配列から選択され、
(ii)VHは、配列番号3及び17~27のうちの1つを含むアミノ酸配列から選択され、
(iii)リンカー2は配列番号53を含み、
(iv)シグナルペプチドは配列番号71を含み、
(v)CD8αヒンジは配列番号72を含み、
(vi)CD8αTMは配列番号73を含み、
(vii)CD28共刺激ドメインは配列番号74を含み、
(viii)4-1BB共刺激ドメインは配列番号75を含み、
(ix)CD3ζシグナル伝達ドメインは配列番号76を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、(i)配列番号4、5、44、45、46、47、及び49のいずれか1つを含む細胞外ドメインと、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARは、(i)配列番号5のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)CD8α膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(iii)CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインならびにCD28及び/または4-1BBの共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、(i)配列番号5のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)CD8α膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(iii)CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインならびにCD28及び/または4-1BBの共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)CD8α膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(iii)CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインならびにCD28及び/または4-1BBの共刺激ドメインを含む細胞内ドメインと、(iv)安全スイッチポリペプチドとを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、(i)配列番号5のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)CD8α膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと、(iii)CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインならびにCD28及び/または4-1BBの共刺激ドメインを含む細胞内ドメインと、(iv)安全スイッチポリペプチドとを含む。
本明細書では、例示的なCARコンストラクトを提供する。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号60~70のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号60の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号61の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号62の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号63の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号64の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号65の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号66の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号67の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号68の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号69の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号70の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、CARは、配列番号6~16のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号7のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号8のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号9のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号11のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号12のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号13のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号15のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号16のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号16のCAR)は、図12Aに描写されるプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号7のCAR)は、図12Bに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号8のCAR)は、図12Cに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号6のCAR)は、図12Dに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号12のCAR)は、図12Eに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号11のCAR)は、図12Fに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号10のCAR)は、図12Gに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号9のCAR)は、図12Hに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号13のCAR)は、図12Iに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号14のCAR)は、図12Jに示すプラスミドにより発現する。いくつかの実施形態において、CAR(例えば、配列番号15のCAR)は、図12Kに示すプラスミドにより発現する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号28に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号17に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号29に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号18に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号30に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号19に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号31に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号20に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号32に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号21に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号33に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号22に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号34に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号23に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号35に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号24に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号36に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号25に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号37に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号26に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、(a)配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号27に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号44に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号45に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号46に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号47に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号49に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFV)は、(a)配列番号1、配列番号2、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号3、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARの細胞外抗原結合ドメイン(例えばscFV)は、(a)配列番号1のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号3のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えばscFv)は、(a)配列番号2のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、(b)配列番号3のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えばscFv)は、配列番号4、配列番号5、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び配列番号49からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号4のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、配列番号5のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
CAR発現免疫細胞
本明細書では、本明細書に記載のCARを含む(発現する)免疫細胞を提供する。本明細書では、本明細書に記載のCARを含む(発現する)免疫エフェクター細胞(例えば、Tリンパ球)を提供する。1つ以上のエフェクター機能(例えば、細胞傷害性細胞殺滅活性、サイトカインの分泌、抗体指向性細胞傷害(ADCC)の誘導、及び/または補体依存性細胞傷害(CDC))を有する任意の免疫細胞を使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCARは、免疫細胞(例えば、T細胞)に形質導入、形質移入、または感染させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞はリンパ球である。Tリンパ球または「T細胞」としては、限定されるものではないが、胸腺細胞、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球が挙げられる。いくつかの実施形態において、T細胞はTヘルパー(Th)細胞(例えば、Tヘルパー1(Th1)細胞またはTヘルパー2(Th2)細胞)である。T細胞は、ヘルパーT細胞(HTL;CD4T細胞)CD4T細胞、細胞傷害性T細胞(CTL;CD8T細胞)、CD4CD8T細胞、CD4CD8T細胞、または他の任意のT細胞のサブセットとすることができる。いくつかの実施形態における使用に適したT細胞の他の例示的集団としては、ナイーブT細胞及びメモリーT細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、Tリンパ球はナイーブTリンパ球またはMHC制限Tリンパ球である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するTリンパ球は腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞はナチュラルキラー細胞(NK細胞)である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はNKT細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は単球である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞はマクロファージである。
当業者には理解されるであろうように、他の細胞も、本明細書に記載のCARを用いた免疫エフェクター細胞として使用することができる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は同種異系である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は自己由来である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は同種異系T細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は自己由来T細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、CAR発現免疫細胞により治療する対象ではない対象から得られる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、健康なドナーから得られる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、がんまたは腫瘍に罹患した患者から得られる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍生検から単離される、または腫瘍生検から単離された免疫細胞から拡大される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、限定されるものではないが、骨髄、胎児、新生児、成体、または他の造血細胞源、例えば、胎児肝臓、末梢血、リンパ節組織、胸腺組織、脾臓組織、または臍帯血から単離される。
いくつかの実施形態において、Tリンパ球は、健康なドナーから得られる。いくつかの実施形態において、Tリンパ球は、がんまたは腫瘍に罹患した患者から得られる。いくつかの実施形態において、Tリンパ球は、がんまたは腫瘍に罹患した患者から得られる。いくつかの実施形態において、Tリンパ球は、腫瘍生検から単離され、または腫瘍生検から単離されたTリンパ球から拡大される。いくつかの実施形態において、T細胞は、限定されるものではないが、骨髄、胎児、新生児、成体、または他の造血細胞源、例えば胎児肝臓、末梢血、リンパ節組織、胸腺組織、脾臓組織、または臍帯血から単離される。
当技術分野で知られている様々な技法を用いて細胞を分離することができる。モノクローナル抗体は、特定の細胞系列及び/または分化段階に関連するマーカーを、正及び負の選択両方において特定するのに特に有用である。最終分化した細胞の大部分は、比較的粗い分離により最初に除去することができる。例えば、磁気ビーズ分離を最初に使用して、多数の無関係な細胞を除去することができる。分離のための手順としては、限定されるものではないが、密度勾配遠心分離、リセット、細胞密度を修飾する粒子との結合、抗体コーティング磁気ビーズによる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、mAbと連結するまたはそれと組み合わせて使用する細胞傷害性薬剤(限定されるものではないが、補体及び細胞毒素を含む)、ならびに固体マトリックス(例えば、プレート、チップ)に抗体を結合するパニング、水簸、または他の任意の好都合な技法が挙げられる。分離及び解析のためのさらなる技法としては、限定されるものではないが、フローサイトメトリーが挙げられ、これは様々な程度の精巧性(例えば、複数のカラーチャネル、小角及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル)を有し得る。細胞は、死細胞に関連する色素(例えば、ヨウ化プロピジウム(PI))を用いることにより、死細胞に対し選択することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、(例えば、がんの治療または造血移植の前のコンディショニングのための)本明細書に記載のCARを含む(例えば、発現する)免疫細胞の集団を提供する。例えば、免疫細胞の集団は、(例えば、本明細書に記載の任意のがんと診断された)患者の末梢血単核球(PBMC)から得ることができ、本明細書に記載のCARを発現するように修飾することができる。PBMCは、CD4、CD8、またはCD4及びCD8であり得る。
本開示は、本明細書に記載の任意のCARを発現する免疫細胞を作製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、免疫細胞が本明細書に記載の1つ以上のCARを発現するように、個体から単離された免疫細胞を形質移入または形質導入することを含む。形質移入、形質導入、及び感染のための方法は、当技術分野で周知されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、本明細書に記載のCARをコードするポリヌクレオチドにより形質転換される。いくつかの実施形態において、T細胞は、本明細書に記載のCARをコードするポリヌクレオチドにより形質転換される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、本明細書に記載のCARをコードする核酸により形質転換する前及び/または後に拡大される(すなわち、増殖される)。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、個体から単離され、in vitroでさらなる操作なしでCARを発現するように遺伝子修飾され、次いで個体に再投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、最初にin vitroで増殖するように活性化または刺激され、その後にCARを発現するように遺伝子修飾される。免疫細胞は、遺伝子修飾される(すなわち、本明細書で企図されているCARを発現するように形質導入または形質移入される)前及び/または後に、培養または拡大することができる。
いくつかの実施形態において、自己由来CAR療法のための免疫細胞は、対象の白血球を採取し、(例えば、CD3/CD28ビーズを用いて)白血球からT細胞を単離し、T細胞に抗FLT3 CAR(例えば、本明細書に記載の任意のCAR)を形質導入し、抗FLT3 CAR T細胞を拡大して、自己由来CAR T療法に使用することができる抗FLT3 CAR T細胞の集団を生成することにより、調製される。このような細胞は、元の白血球を得た同じ対象に注入することができる。いくつかの実施形態において、T細胞の代わりに他の免疫細胞が対象から単離され、抗FLT3 CARを形質導入され、自己由来療法に使用するために拡大される。
いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、約1~約4、約2~約4、約3~約4、約1~約2、約1~約3、または約2~約3の本明細書に記載のCARのベクターコピー数/細胞を発現する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号60~70のいずれか1つの核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号6~16のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号60~70のいずれか1つに対し少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号6~16のいずれか1つに対し少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むCARを発現する。
いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号60の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号61の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号62の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号63の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号64の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号65の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号66の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号67の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号68の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号69の核酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号70の核酸配列を含むCARを発現する。これらの実施形態のいずれかにおいて、T細胞の代わりに別の免疫細胞(例えば、NK細胞、マクロファージ、または単球)を使用することができる。
いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号6のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号7のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号8のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号9のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号10のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号11のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号12のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号13のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号14のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号15のアミノ酸配列を含むCARを発現する。いくつかの実施形態において、T細胞は、配列番号16のアミノ酸配列を含むCARを発現する。これらの実施形態のいずれかにおいて、T細胞の代わりに別の免疫細胞(例えば、NK細胞、マクロファージ、または単球)を使用することができる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号4、5、44、45、46、48、または49のいずれか1つのアミノ酸配列のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号4のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号5のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号44のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号45のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号46のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号47のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞(例えば、T細胞)は、配列番号49のscFvを含む、本明細書に記載の任意のCARを発現する。
医薬組成物
本明細書では、(i)本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、本明細書に記載の任意のscFv)または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(免疫細胞の集団を含む)と、(ii)医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。適切な医薬的に許容される担体(限定されるものではないが、賦形剤及び安定剤を含む)は、当技術分野で知られている(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PAを参照)。
いくつかの実施形態において、医薬的に許容される担体としては、限定されるものではないが、等張剤、バッファー、懸濁化剤、分散剤、乳化剤、湿潤剤、封鎖剤、キレート剤、pH緩衝剤、溶解性増強剤、酸化防止剤、麻酔剤、及び/または抗微生物剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、担体は、限定されるものではないが、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、デンプン、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、プロピレン、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、及びデキストロース、ならびにこれらの組合せのうちの1つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、医薬的に許容される担体は、結合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を増強する補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、保存剤、またはバッファーをさらに含む。
いくつかの実施形態において、非経口投与される場合、医薬的に許容される担体としては、限定されるものではないが、食塩水またはリン酸緩衝食塩水(PBS)、薬剤(例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、または他の薬剤)を含む溶液が挙げられる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、投与後に活性成分の急速放出、持続放出、または遅延放出をもたらすように製剤化される。投与後に活性成分の急速放出、持続放出、または遅延放出をもたらすための製剤は、当技術分野で知られている(Mishra,M.K.(2016).Handbook of encapsulation and controlled release.Boca Raton,CRC Press,Taylor & Francis Group(CRC PressはInformaの一部門のTaylor & Francis Groupのインプリント)(参照により全体として本明細書に援用される))。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供する医薬組成物は、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、本明細書に記載の任意のscFv)または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(免疫細胞の集団を含む)と、1つ以上の他の治療剤(例えば、抗がん剤)とを医薬的に許容される担体中に含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、対象への任意の投与経路のために製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は注射用に製剤化され、注射前に溶液または懸濁液にするのに適した溶液、懸濁液、エマルション、または固体形態として調製される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物中の本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント(例えば、本明細書に記載の任意のscFv)または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(免疫細胞の集団を含む)は、治療有効量で存在する。治療有効量は、当技術分野で知られている方法により決定される。
治療方法
がん治療
いくつかの実施形態において、本開示は、がんを治療するための方法であって、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、がんを治療する方法は、対象に、細胞の(例えば、標的細胞の)FLT3エピトープに結合する本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、がんを治療する方法は、対象に、がん細胞(例えば、AML細胞)のFLT3エピトープに結合する本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、他のがん療法(単数または複数)(例えば、ワクチン、化学療法、放射線療法、低分子療法、または免疫療法(例えば、別の抗体による治療))に対し抵抗性を有するがんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、がんは化学療法に抵抗性である。いくつかの実施形態において、がんは放射線療法に抵抗性である。いくつかの実施形態において、がんは低分子療法に抵抗性である。いくつかの実施形態において、がんは免疫療法に抵抗性である。
本明細書に記載の方法は、細胞表面にFLT3を発現することが予想される、知られている、または判定されているがんの治療に適している。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従う本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与は、(i)がん細胞の頻度または数の減少、(ii)がん成長またはがん細胞数増加の低減、(iii)がん細胞成長の進行の阻害、(iv)がんの退縮、(v)がん再発の阻害、(vi)がんの根絶、(vii)がんの1つ以上の症状の重症度または期間の低減または緩和、(viii)がんに関連する1つ以上の症状の発生または発症の阻害、(ix)別の抗がん療法の治療効果の増強または改善、(x)対象の余命または生存期間の増加、(xi)対象における入院(例えば、入院期間)の低減、(xii)対象におけるクオリティーオブライフの改善、(xiii)死亡率の低減、(xiv)対象における無再発生存期間または寛解の長さの増加、のうちの1つ以上を達成するため、またはそれをもたらすために行われる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従う本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与は、対象における腫瘍負荷の低減(例えば、治療前の対象における腫瘍負荷と比較して腫瘍負荷の低減に有効である)を達成するため、またはそれをもたらすために行われる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与は、単独で、または別の療法と組み合わせて使用したときに、対象におけるがんの治療(例えば、がん細胞の頻度もしくは数の低減、がん細胞の成長もしくは増殖の低減、余命もしくは生存期間の増加、がんの根絶、またはがんの1つ以上の症状の改善)に有効である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、がん細胞の細胞頻度もしくは数の低減、またはがん細胞の除去に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象におけるがん細胞のレベルに対する)がん細胞の数または頻度の少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象におけるがん細胞のレベルに対する)がん細胞の数または頻度の少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象におけるがん細胞のレベルに対する)がん細胞の数または頻度の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象におけるがん細胞のレベルに対する)がん細胞の数または頻度の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、本明細書に記載の任意のがん(例えば、AML)の治療に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、本明細書に記載の任意のがん(例えば、AML)の進行の緩徐化に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、本明細書に記載の任意のがん(例えば、AML)の腫瘍負荷の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、本明細書に記載の任意のがんを有する対象の生存期間の増加に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与は、治療されていないまたはプラセボで治療された対象との比較における対象の生存期間中央値の増加に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与は、標準治療法で治療された対象との比較における対象の生存期間中央値の増加に有効である。
本明細書に記載の方法を用いて数を低減または除去することができるがん細胞の例としては、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病(AML)の芽細胞、急性リンパ性白血病(ALL)のリンパ芽球または白血病芽球、慢性骨髄性白血病(CML)の骨髄芽球、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、及び慢性リンパ性白血病(CLL)の芽球が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3 CARを発現する免疫細胞は、本明細書に記載の対象を治療する方法に使用される。いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、治療される対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態において、血液(例えば、白血球)が、(例えば、アフェレーシスにより)対象から採取され、次に免疫細胞(例えば、T細胞)が、(例えば、抗CD3/CD28ビーズを用いて)血液から単離され、次に抗FLT3 CARをコードする核酸を単離免疫細胞に導入し(任意選択で、次に抗FLT3 CARを含む単離免疫細胞を拡大してもよい)、次いでこのように得られた抗FLT3 CARを含む免疫細胞を、(例えば、注入により)対象(すなわち、免疫細胞を単離した同じ対象)に投与する。この自己由来CAR T療法を図2Aに示す。他の実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、治療される対象にとって自己由来ではない。
造血細胞コンディショニング
いくつかの実施形態において、本開示は、造血細胞移植のための準備またはコンディショニングを、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。いくつかの実施形態において、それを必要とする対象は、骨髄(BM)造血幹細胞及び/または造血前駆細胞移植を受ける資格がある、受ける予定である、または受けている患者である。いくつかの実施形態において、造血細胞移植を必要とする対象は、がん(例えば、本明細書に記載の任意のがん)を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、造血細胞移植のための準備またはコンディショニングを、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象が、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与される、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象を準備またはコンディショニングする方法は、対象に、造血幹細胞のFLT3エピトープに結合する、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象を準備またはコンディショニングする方法は、対象に、造血前駆細胞のFLT3エピトープに結合する、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象を準備またはコンディショニングする方法は、対象に、樹状細胞のFLT3エピトープに結合する、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象を準備またはコンディショニングする方法は、対象に、骨髄系細胞のFLT3エピトープに結合する、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象を準備またはコンディショニングする方法は、対象に、リンパ系細胞のFLT3エピトープに結合する、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメントまたは本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、造血細胞移植を行う前の対象のコンディショニングに有効である。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3 CARを発現する免疫細胞は、本明細書に記載の対象を治療する方法に使用される。いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、治療される対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態において、血液が対象から採取され、次に免疫細胞(例えばT細胞)が血液から単離され、次に抗FLT3 CARをコードする核酸を単離免疫細胞に導入し(任意選択で、次に抗FLT3 CARを含む単離免疫細胞を拡大してもよい)、次いでこのように得られた抗FLT3 CARを含む自己免疫細胞を対象に投与する。他の実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、治療される対象にとって自己由来ではない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、造血幹細胞(HSC)及び/または造血前駆細胞(HPC)(例えば、初期造血前駆細胞)の細胞の頻度もしくは数の顕著な低減、またはそれらの除去に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)HSC及び/またはHPC(例えば、初期HPC)の数または頻度の少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)HSC及び/またはHPC(例えば、初期HPC)の数または頻度の少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)HSC及び/またはHPC(例えば、初期HPC)の数または頻度の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)HSC及び/またはHPC(例えば、初期HPC)の数または頻度の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。これらの実施形態のいくつかにおいて、HSC及び/またはHPCの低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、多能性前駆細胞(MPP)及び/または共通前駆細胞(CP)の細胞の頻度もしくは数の顕著な低減、またはそれらの除去に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)MPP及び/またはCPの数または頻度の少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)MPP及び/またはCPの数または頻度の少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)MPP及び/またはCPの数または頻度の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対する(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対する)MPP及び/またはCPの数または頻度の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%の低減に有効である。これらの実施形態のいくつかにおいて、MPPまたはCPの低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、骨髄(BM)HSC及び/またはHPC(例えば、早期HPC)移植を受けている患者のコンディショニングに有効である。いくつかの実施形態において、対象はHSC移植を受ける。いくつかの実施形態において、対象はHPC移植を受ける。いくつかの実施形態において、対象はHSC及びHPC(例えば、早期HPC)の両方の移植を受ける。いくつかの実施形態において、対象はMPP及び/またはCPを受ける。いくつかの実施形態において、HSC/HPC移植は、本明細書に記載の任意の血液癌、例えば、特に急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、樹状細胞新生物を治療するために行われる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、骨髄系細胞系列(例えば、循環骨髄系系列細胞または単球)の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、骨髄系系列細胞(例えば、循環骨髄系系列細胞または単球)の数または頻度を少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、骨髄系系列細胞(例えば、循環骨髄系系列細胞または単球)の数または頻度を少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、骨髄系列細胞の数または頻度を顕著に低減しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の免疫細胞を発現する抗FLT3CARの対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、骨髄系列細胞の数または頻度を60%未満、55%未満、50%未満、40%未満、30%未満、または20%未満低減する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、骨髄系列細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、骨髄系列細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、または少なくとも60%低減する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD45、FLT3、CD19、CD38、CD33、及びCD34のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)を発現する細胞集団を低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD45、FLT3、CD19、CD38、CD33、及びCD34のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)を発現する細胞集団の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD45、FLT3、CD19、CD38、CD33、及びCD34のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)を発現する細胞集団の低減は、治療される対象の循環血液細胞内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、FLT3、CD38、CD33、及びCD34のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、または4つ)を発現する細胞集団を低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD45、FLT3、CD19、CD38、CD33、及びCD34のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、または4つ)を発現する細胞集団の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD45、FLT3、CD19、CD38、CD33、及びCD34のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、または4つ)を発現する細胞集団の低減は、治療される対象の循環血液細胞内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、FLT3発現細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、FLT3発現細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、FLT3発現細胞の数または頻度を少なくとも60%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、FLT3発現細胞の数または頻度を少なくとも70%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、FLT3発現細胞の数または頻度を少なくとも80%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、FLT3発現細胞の数または頻度を少なくとも90%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、FLT3発現細胞の数または頻度を少なくとも95%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、FLT3発現細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、FLT3発現細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、FLT3発現細胞の低減は、治療される対象におけるがん細胞の低減である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD34+造血幹細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD34+造血幹細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD34+造血幹細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD34+造血幹細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、初期造血前駆細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、初期造血前駆細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、初期造血前駆細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、初期造血前駆細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、樹状細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、樹状細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、樹状細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、樹状細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD45+CD19+細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD45+CD19+細胞の数または頻度を少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD45+CD19+細胞の数または頻度を少なくとも55%、約50%、約45%、約40%、または約35%(または約30%~55%)低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD45+CD19+細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD45+CD19+細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD34+CD38+細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD34+CD38+細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD34+CD38+細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD34+CD38+細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD34+CD38-細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD34+CD38-細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD34+CD38-細胞の数または頻度を少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD34+CD38-細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD34+CD38-細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD34を発現する細胞集団を少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%低減する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、FLT3を発現する細胞集団を少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%低減する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD33+細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD33+細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD33を発現する細胞集団を少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD33発現細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD33発現細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD1c+骨髄系樹状細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD1c+骨髄系樹状細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD1c+骨髄系樹状細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD1c+骨髄系樹状細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD141+骨髄系樹状細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD141+骨髄系樹状細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD141+骨髄系樹状細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD141+骨髄系樹状細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、CD303形質細胞様樹状細胞の数または頻度を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の対象への投与は、対照またはベースラインに対し(例えば、この療法を投与する前の対象における細胞のレベルに対し)、CD303形質細胞様樹状細胞の数または頻度を少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または約100%低減する。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD303形質細胞様樹状細胞の低減は、治療される対象の骨髄内(例えば、骨髄単核細胞内)で生じる。これらの実施形態のいくつかにおいて、CD303形質細胞様樹状細胞の低減は、治療される対象の循環血液細胞内で生じる。
いくつかの実施形態において、HSC/HPC移植の方法は、ドナーHSC/HPC細胞の移植を含む。いくつかの実施形態において、ドナー細胞は健康な対象に由来する。他の実施形態において、HSC/HPC移植は、自己由来細胞(例えば、治療される疾患が発症する前に得られたもの)の移植を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、対象における造血幹細胞/造血前駆細胞移植の方法であって、
(i)本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を対象に投与することにより、造血幹細胞(HSC)及び/または造血前駆細胞(HPC)の数を低減することと、
(ii)HSC/HPC(例えば、ドナーHSC/HPC)を対象に移植することとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、対象における造血幹細胞/造血前駆細胞移植の方法であって、
(i)配列番号6及び9~15からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCARを発現する免疫細胞の集団を対象に投与することにより、造血幹細胞(HSC)及び/または造血前駆細胞(HPC)の数を低減することと、
(ii)HSC/HPC(例えば、ドナーHSC/HPC)を対象に移植することとを含む、方法を提供する。
治療対象となるがん
がんは、本明細書に記載の方法に従って治療することができる。いくつかの実施形態において、治療対象となるがんは造血器癌または血液癌である。本明細書に記載の方法に従って治療される血液癌の例としては、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、末梢性T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害、多発性骨髄腫、及び樹状細胞新生物が挙げられる。いくつかの実施形態において、がんは血液癌である。いくつかの実施形態において、がんは急性骨髄性白血病(AML)である。いくつかの実施形態において、がんは急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。いくつかの実施形態において、がんは慢性骨髄性白血病(CML)である。いくつかの実施形態において、がんは慢性リンパ性白血病(CLL)である。いくつかの実施形態において、がんは芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)である。いくつかの実施形態において、がんは末梢T細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは濾胞性リンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんはホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは神経芽腫である。いくつかの実施形態において、がんは非悪性遺伝性または後天性骨髄障害である。いくつかの実施形態において、がんは多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、がんは樹状細胞新生物である。
いくつかの実施形態において、がんは非悪性遺伝性または後天性骨髄障害の結果である。本明細書に記載の方法に従って治療される非悪性遺伝性または後天性骨髄障害の例としては、限定されるものではないが、鎌状赤血球貧血、ベータ-サラセミアメジャー、難治性ダイヤモンド-ブラックファン貧血、骨髄異形成症候群、特発性重症再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、赤芽球ろう、ファンコーニ貧血、無巨核球増加(amegakaryocytosis)、及び先天性血小板減少症が挙げられる。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は鎌状赤血球貧血である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害はベータ-サラセミアメジャーである。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は難治性ダイヤモンド-ブラックファン貧血である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は骨髄異形成症候群である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は特発性重症再生不良性貧血である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は発作性夜間ヘモグロビン尿症である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は赤芽球ろうである。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害はファンコーニ貧血である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は無巨核球増加(amegakaryocytosis)である。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性または後天性骨髄障害は先天性血小板減少症である。
投与方法
本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、任意の好適な手段(限定されるものではないが、非経口(例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、脳内、脳室内、髄腔内、皮下)、腹腔内、腫瘍内、肺内、皮内、経皮、経結膜、眼内、鼻内、気管内、経口、及び局所的病巣内投与経路を含む)により、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(免疫細胞に言及した場合、このような免疫細胞の集団も含む)は、静脈内、動脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、(例えば、ボーラスまたは持続注入により)静脈内投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、腹腔内投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、筋肉内投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、皮下投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、腫瘍内投与される(例えば、治療されるがんの腫瘍内への注射により投与される)。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、静脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される。
本明細書に記載の抗FLT3抗体及びフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、及び本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の様々な投与スケジュールが、単回投与または一定期間にわたる複数回投与を含めて企図されている。投与方法としては、限定されるものではないが、ボーラス投与、パルス注入、及び持続注入が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、またはそれ以上投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、1回投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、(例えば、さらなる反復投与なしで)1回静脈内投与されると、本明細書に記載の方法で有効である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、約1~7日ごとに約1~8週間投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、約1~7日ごとに約1~4週間投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、約3~7日ごとに約2~3週間投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、約3日ごとに約2週間~約7日ごとに約3週間投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、約2~4日ごとに約2~3週間(例えば、2週間または3週間)投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、週に1日、2日、3日、4日、5日、6日、または7日(例えば、週に1回、週に2回、2日ごとに、または毎日)投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、6週間未満、5週間未満、4週間未満、3週間未満、または2週間未満投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、2日に1回またはそれより少ない頻度で(例えば、1~3週間に1回)投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、3日に1回またはそれより少ない頻度で(例えば、1~3週間に1回)投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、4日に1回またはそれより少ない頻度で(例えば、1~3週間に1回)投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、5日に1回またはそれより少ない頻度で(例えば、1~3週間に1回)投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、週に1回またはそれより少ない頻度で(例えば、1~3週間に1回)投与される。
いくつかの実施形態において、(本明細書に記載の抗体、フラグメント、組成物、または免疫細胞の)投与は、約3日ごとに約2週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、4日ごとに約2週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、5日ごとに約2週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、7日ごとに約2週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、3日ごとに約3週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、4日ごとに約3週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、5日ごとに約3週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、7日ごとに約3週間行われる。
いくつかの実施形態において、投与は、週に1回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、週に2回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、週に3回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、週に4回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、週に5回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、週に6回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。いくつかの実施形態において、投与は、週に7回、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、または6週間行われる。
いくつかの実施形態において、投与は、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、または6週間に1回行われる。いくつかの実施形態において、投与は、(例えば、治療過程で)1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、または20回行われる。
本明細書に記載の投与は、本明細書に記載の任意の療法の初回用量の後に1回以上の低用量が続くレジメン、または初回用量の後に1回以上の高用量が続くレジメンを含む。いくつかの実施形態において、初回投与の後には1回以上の低用量が続く。いくつかの実施形態において、初回投与の後には1回以上の高用量が続く。
いくつかの実施形態において、最初の治療期間(本明細書に記載の任意の療法が、例えば月に1回、2週間に1回、週に1回、週に2回、または週に3回投与される期間)の後には、療法が投与されない休薬期間(例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、6週間、2か月、3か月、4か月、6か月、または1年間)が続き、その後に第2の治療期間(療法が、例えば月に1回、2週間に1回、週に1回、週に2回、または週に3回投与される期間)が続く。このような最初の治療期間及び第2の治療期間は、例えば、2週間、3週間、4週間、6週間持続し得る(最初の治療期間は、第2の治療期間と同じでも異なってもよい)。この治療過程(最初の治療期間、休薬期間、第2の治療期間を有する)は、2回、3回、4回、5回、6回、10回、または10回より多く繰り返すことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の治療有効量が、対象または患者に投与される。治療有効量は、使用される方法、治療されるがん、治療されるがんの重症度、投与経路、標的部位、患者の状態(例えば、年齢、体重、健康状態)、患者の応答性、患者が使用する他の薬剤、及び治療を実施する医療従事者の裁量で考慮される他の要因に依存する。
いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、T細胞)は、約1×10、約5×10、約1×10、約2×10、約3×10、約4×10、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約1×10、約2×10、約3×10、約4×10、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約1×10、約2×10、約3×10、約4×10、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約1×1010、約2×1010、約3×1010、約4×1010、または約5×1010細胞の量で投与される。
いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、T細胞)は、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約1×10、約2×10、約3×10、約4×10、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約1×10、約2×10、約3×10、約4×10、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、または 1×1010細胞の量で投与される。
いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、T細胞)は、約1×10、約2×10、約3×10、約4×10、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約1×10、約2×10細胞の量で投与される。
いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、T細胞)は、約5×10~約1×1010細胞の量で投与される。いくつかの実施形態において、抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、T細胞)は、約1×10細胞~約2×10細胞の量で投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.01mg/kg~約10mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.01mg/kg~約2mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.05mg/kg~約1mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.1mg/kg~約0.5mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.1mg/kg~約0.3mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体またはフラグメントの用量は、患者の体重に対し約0.01mg/kg、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、または約2mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.1mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.2mg/kgである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3抗体またはフラグメントの投与量は、患者の体重に対し約0.3mg/kgである。
いくつかの実施形態において、造血細胞移植は、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与から5日~5週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞の投与から約2~3週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から約1週間~4週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から約10日~25日後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から約10日~20日後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から約2週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から約3週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から少なくとも5日または1週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から少なくとも2週間後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から3週間未満後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から4週間未満後に行われる。いくつかの実施形態において、造血細胞移植の実施は、投与から5週間未満後に行われる。
患者集団
いくつかの実施形態において、患者または対象は、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞で治療される。いくつかの実施形態において、患者または対象は、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、またはブタである。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、がんを有する(例えば、そのように診断されている)。がん診断のための方法は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、がんは早期がんである。いくつかの実施形態において、がんは進行期がんである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、造血器癌または血液癌を有する(例えば、そのように診断されている)。いくつかの実施形態において、血液癌は、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CLL)、慢性リンパ性白血病(CML)、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、末梢性T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、多発性骨髄腫、非悪性遺伝性もしくは後天性骨髄障害、または樹状細胞新生物である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、急性骨髄性白血病(AML)と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、慢性リンパ性白血病(CLL)と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、慢性骨髄性白血病(CML)と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、末梢性T細胞リンパ腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、濾胞性リンパ腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、ホジキンリンパ腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、非ホジキンリンパ腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、神経芽腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、多発性骨髄腫と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、樹状細胞新生物と診断されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、非悪性遺伝性後天性骨髄障害を有する(例えば、そのように診断されている)。いくつかの実施形態において、非悪性遺伝性後天性骨髄障害は、鎌状赤血球貧血、ベータ-サラセミアメジャー、難治性ダイヤモンド-ブラックファン貧血、骨髄異形成症候群、特発性重症再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、赤芽球ろう、ファンコーニ貧血、無巨核球増加、先天性血小板減少症、または重症複合免疫不全症(SCID)である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、鎌状赤血球貧血と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、ベータ-サラセミアメジャーと診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、難治性ダイヤモンド-ブラックファン貧血と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、骨髄異形成症候群と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、特発性重症再生不良性貧血と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、発作性夜間ヘモグロビン尿症と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、赤芽球ろうと診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、ファンコーニ貧血と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、無巨核球増加と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、先天性血小板減少症と診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、重症複合免疫不全症(SCID)と診断されている。
いくつかの実施形態において、治療される患者または対象は、過去に1つ以上のがん療法(例えば、ワクチン、低分子標的療法、化学療法、放射線療法、または免疫療法)を受けており、過去のがん療法のうちの1つ以上に対する抵抗性を生じている。いくつかの実施形態において、治療される患者または対象は、化学療法に抵抗性である。いくつかの実施形態において、治療される患者または対象は、低分子標的治療に対し抵抗性である。いくつかの実施形態において、治療される患者または対象は、別の免疫療法に抵抗性である。
いくつかの実施形態において、患者または対象は、細胞表面にFLT3を発現することが知られている、またはそのように予想されるタイプのがんを有する。
いくつかの実施形態において、治療される患者または対象は、当技術分野で知られている方法を用いて、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞により標的化することができるその細胞の表面にFLT3を発現すると判定されたがんを有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、造血細胞移植を必要としている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される患者または対象は、造血幹細胞及び/または造血前駆細胞による骨髄移植を必要としている。
併用療法及びキット
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、1つ以上の抗がん療法と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、抗がん療法は、化学療法、手術療法、放射線療法、抗体療法、低分子療法、または当技術分野で知られている他の抗がん療法である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、化学療法と組み合わせて対象に投与される。本明細書に記載の方法に使用することができる化学療法剤のタイプの例としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、抗腫瘍抗生剤、植物に由来するアルカロイド、ホルモンアンタゴニスト、P-糖タンパク質阻害剤、及び白金錯体誘導体が挙げられる。本明細書に記載の方法で使用することができる化学療法薬の具体的な例としては、限定されるものではないが、タキソール、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、5-フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン、ダウノルビシン、コルチシン、ミトキサントロン、タモキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、ブスルファン、ウラムスチン、マスタージェン(mustargen)、イホサミド(ifosamide)、ベンダムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、マイトマイシン、ジアジコン、テトラジン、アルトレタミン、ミトゾロミド、テモゾロミド、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミン、ヘキサレン、トロホスファミド、エストラムスチン、トレオスルファン、マンノスルファン、トリアジコン、カルボコン、ニムスチン、ラニムスチン、アザチオプリン、スルファニルアミド、フルオロピリミジン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、クラドリビン、カペシタビン、ペメトレキセド、フルダラビン、ヒドロキシウレア、ネララビンまたはクロファラビン、シタラビン、デシタビン、プララトレキサート、フロクスウリジン、チオクアニン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、メルカプトプリン、イマチニブ、ダクチノマイシン、セルビジン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、ツルニチニチソウ、ビンカ、タキサン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、テニポシド、ピラルビシン、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、アムサクリン、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、ビカルタミド、メドロキシプロゲステロン、フルオキシメステロン、ジエチルスチルベストロール、エストレイス(estrace)、オクトレオチド、メゲストロール、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、プレドニゾン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、ホルメスタン、ファドロゾール、アンドロステン、レスベラトロール、ミオスミン、カテキン、アピゲニン、エリオジクチオール、イソリキリチゲニン、マンゴスチン、アミオダロン、アジスロマイシン、カプトプリル、クラリスロマイシン、シクロスポリン、ピペリン、ケルセチン、キニジン、キニーネ、レセルピン、リトナビル、タリキダール、ベラパミル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、トランスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチン、及びカルボプラチンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、以下の群:アントラサイクリン(例えば、ダウノマイシン及びドキソルビシン)、アウリスタチン、メトトレキサート(MTX)、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、cis-白金、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、5-フルオロウリジン、メルファラン、リシン及びカリチアマイシン(ドキソルビシン、ブレオマイシン、及びビンブラスチン、及びダカルバジン(ABVD)などの併用化学療法を含む)、BEACOPPまたは漸増BEACOPP(ブレオマイシン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン)、ならびにスタンフォードV(ドキソルビシン、ビンブラスチン、メクロレタミン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、エトポシド、及びプレドニゾン)、から選択される1つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、免疫療法(例えば、抗CD20抗体リツキシマブ)、免疫毒素(例えば、ブレンツキシマブベドチン(SGN-35)(抗チューブリン剤モノメチルアウリスタチンE(MMAE)に結合したCD-30指向性抗体から構成される免疫毒素))、養子免疫療法(細胞傷害性Tリンパ球)、プログラム死1(PD-1)遮断(例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ)のうちの1つ以上と組み合わせて対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、前述のがんに適応される化学療法薬(複数可)と組み合わせて、がんを有する対象に投与され、この化学療法薬は、任意選択で、前述のがん(例えば、AMLまたはALL)に適応される投与量及び/またはレジームで投与することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、免疫療法と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、免疫療法は、チェックポイント阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗PD1アンタゴニスト、抗PD-L1アンタゴニスト、及び抗CTLA4アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は抗PD1アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は抗PD-1抗体(例えば、アンタゴニスト抗PD-1抗体)である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は抗PD-L1アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は抗PD-L1抗体(例えば、アンタゴニスト抗PD-L1抗体)である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は抗CTLA4アンタゴニスト(例えば、アンタゴニスト抗CTLA4抗体)である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤はLag3アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤はTim3アンタゴニストである。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤はTIGITアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤はOX40アンタゴニストである。
いくつかの実施形態において、抗PD1アンタゴニストは、限定されるものではないが、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、PDR001、ペムブロリムマブ(Bio X Cell)、Bio X Cell Clone J116(カタログ番号BE0188)、セミピリマブ、及びピディリズマブからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、抗PD-L1アンタゴニストは、限定されるものではないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105、及びBMS-936559からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、抗CTLA4アンタゴニストは、限定されるものではないが、イピリムマブ及びトレメリムマブから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3 CAR(例えば、以下の配列番号:6及び9~15のいずれか1つのアミノ酸配列を有する抗FLT3 CAR、または以下の核酸配列:60及び63~69のいずれか1つを含む免疫細胞)は、化学療法と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のVH及び/またはVLを有する任意の抗FLT3抗体またはフラグメント、あるいは本明細書に記載の任意のscFvは、化学療法と組み合わせて対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3 CAR(例えば、以下の配列番号:6及び9~15のいずれか1つのアミノ酸配列を有する抗FLT3 CAR、または以下の核酸配列:配列番号60及び63~69のいずれか1つを含む免疫細胞)は、免疫療法(例えば、チェックポイント阻害剤)と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のVH及び/またはVLを有する任意の抗FLT3抗体またはフラグメント、あるいは本明細書に記載の任意のscFvは、免疫療法(例えば、チェックポイント阻害剤)と組み合わせて対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3 CAR(例えば、以下の配列番号:6及び9~15のいずれか1つのアミノ酸配列を有する抗FLT3 CAR、または以下の核酸配列:60及び63~69のいずれか1つを含む免疫細胞)は、抗PD1アンタゴニスト(例えば、抗PD1抗体)と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3 CAR(例えば、以下の配列番号:6及び9~15のいずれか1つのアミノ酸配列を有する抗FLT3 CAR、または以下の核酸配列:配列番号60及び63~69のいずれか1つを含む免疫細胞)は、PD-L1アンタゴニスト(例えば、抗PDL1抗体)と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗FLT3 CAR(例えば、以下の配列番号:6及び9~15のいずれか1つのアミノ酸配列を有する抗FLT3 CAR、または以下の核酸配列:配列番号60及び63~69のいずれか1つを含む免疫細胞)は、CTLA4アンタゴニスト(例えば、抗CTLA4抗体)と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のVH及び/またはVLを有する任意の抗FLT3抗体またはフラグメント、あるいは本明細書に記載の任意のscFvは、本明細書に記載の任意の抗PD-1アンタゴニスト、任意の抗PD-L1アンタゴニスト、または任意の抗CTLA4アンタゴニストと組み合わせて対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、放射線療法(例えば、X線、ガンマ線、電子ビーム)と組み合わせて対象に投与される。
いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与する前に投与される。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞と同時に投与される。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与した後に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、第2の療法の前、最中、または後に対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って治療される対象は、本明細書に記載の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の抗FLT3 CAR発現免疫細胞を投与する前に、抗がん療法を受けていない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、抗体またはフラグメントを投与する前に抗がん治療を受けた対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞は、免疫抑制療法から回復している、または免疫抑制療法を受けている対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞と、1つ以上のさらなる抗がん剤とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、治療有効量のもの)と、(ii)1つ以上の化学療法薬(例えば、治療有効量のもの;抗体、フラグメント、または免疫細胞なしで使用される場合の薬物(単数または複数)の治療量より少なくてもよい)とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、治療有効量のもの)と、(ii)本明細書に記載の1つ以上のチェックポイント阻害剤(例えば、治療有効量のもの;抗体、フラグメント、または免疫細胞なしで使用される場合の薬物(単数または複数)の治療量より少なくてもよい)とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、(i)本明細書に記載の任意の抗FLT3抗体もしくはフラグメント、本明細書に記載の任意の医薬組成物、または本明細書に記載の任意の抗FLT3 CAR発現免疫細胞(例えば、治療有効量のもの)と、(ii)1つ以上の抗PD1抗体、抗PD-l1抗体、または抗CTLA4抗体(例えば、治療有効量のもの;抗体、フラグメント、または免疫細胞なしで使用される場合の薬物(単数または複数)の治療量より少なくてもよい)とを含む、キットを提供する。
以下の実施例は、限定としてではなく、例として提供するものである。本明細書で提供する全般的な説明を考慮すれば、本発明の様々な他の実施形態を実施することができる。
実施例1:ヒト化抗体及び単鎖可変フラグメントの生成。
ヒト化の前に、キメラ抗FLT3抗体を、FLT3リガンド(FLT3L)との競合的結合について評価した。具体的には、REH細胞を10nMの組換えヒトFLT3L(R&D systems)と20分間インキュベートし、PBS+2% BCS+2mM EDTA(フローバッファー)で洗浄した。次いで細胞を、フローバッファー中で調製した様々な濃度のキメラモノクローナル抗体で染色した。細胞をフローバッファーで5回洗浄し、Alexa Fluor 488と結合体化した抗ヒトIgG Fc抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories;109-545-008)で染色した。細胞を7-AAD(7-AAD Viability Staining Solution;Biolegend 420404)で染色し、次にフローサイトメトリー解析を行った。キメラ抗体1-18BA(マウスVL(配列番号28)及びマウスVH(配列番号17)及びヒトIgGを含む)の結合は、図1Aに示すように、FLT3L前処置では低減されず、むしろFLT3L前処置なしの場合とほぼ同じであった。このことから、118BAは、FLT3との結合に関してFLT3Lと競合しないことが示唆される。
本明細書に記載のヒト化抗体及び単鎖可変フラグメントを生成するため、以下の方法を使用した。
材料及び方法
可変ドメイン解析及びCDR特定
CDRを特定し、最も近いマッチング生殖系列配列を解析する目的で、IMGTドメインギャップアラインメントツールを使用した。(http_www_imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)
分子モデリング
過去に発表された抗体結晶構造に対するフーロジー(hoology)に基づき、ソフトウェアを用いてVHドメイン及びVLドメインの分子モデルを構築した。
遺伝子合成及びクローニング
(FLT3の)重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを5’末端及び3’末端の適切な制限部位とともに設計して、Absolute Antibodyクローニング及び発現ベクターへのクローニングを可能にした。可変ドメイン配列を、ヒト細胞内での発現用にコドン最適化した。遺伝子合成後、可変ドメインを適切な種及びタイプのAbsolute Antibodyベクターにクローニングした。正しい配列をサンガーシークエンシングにより検証し、DNASTAR Lasergeneソフトウェアを用いて生データを解析した。確認したら、適切なサイズのプラスミドDNAプレップを実施して、形質移入に用いる十分な量の高品質なDNAを生成した。
発現及び精製
プラスミドを生成したら、HEK293(ヒト胎児由来腎臓293)哺乳類細胞を一過性形質移入に最適な段階まで継代した。細胞に重鎖及び軽鎖発現ベクターを一過性に形質移入し、さらに6日間培養した。培養物を4000rpmで遠心分離することにより収集し、0.22μMフィルターで濾過した。精製の第1ステップをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより実施し、クエン酸塩pH3.0バッファーで溶出し、次に0.5Mのトリス(pH9.0)で中和した。次いで溶出タンパク質を、脱塩カラムを用いてPBSにバッファー交換した。抗体濃度をUV分光法により定量し、必要に応じて抗体を濃縮した。
抗体の解析
抗体の純度をSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)及びHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により定量した。SEC-HPLCをAgilent 1100シリーズの装置で、適切なサイズ排除カラム(SEC)を用いて実施した。抗体発現力価をプロテインA HPLCにより定量した。
ヒト化
配列解析
米国特許公開20190389955号(この内容の全体が本明細書に援用される)に記載の方法を用いて生成した1-18BAにおけるVH及びVLの配列(それぞれ、配列番号17及び配列番号28)を、IGMT Gap Alignツールにかけて、全ての既知の抗体生殖系列配列に対し解析した。IMGTの定義を用いてCDR領域を割り当てた。この配列はmuseに対し最も明確にアラインメントされており、具体的には、VHについてはIGHV8-8ファミリー、VLについてはIGKV9-124に対しアラインメントされている。
分子モデリング
構造誘導ヒト化を可能にするため、1-18BAマウスのVH及びVL配列のためのモデルを構築した。
生殖系列の選択
VH及びVLの配列を、ヒト生殖系列配列のAbsolute Antibodyデータベースによりアラインメントした。表1に、ヒト化のためのフレームワークとして選択された生殖系列配列を示す。
CDRグラフティング
抗体をヒト化するため、VH及びVL配列をCDRグラフティングアルゴリズムにかけて、マウス抗体1-18BA(配列番号17のVH及び配列番号28のVLを有する)由来のCDRを、選択したヒト生殖系列配列に移した。CDRは、主に抗原との結合に関与するものとして定義されているが、これらの領域の外側にあるアミノ酸(フレームワーク領域として知られているもの)が結合に直接関与したり、CDRを正しく方向づける役割を果たしたりする可能性がある。構造誘導アプローチを使用して、結合の完全性を保持するにはどのフレームワークアミノ酸を元のマウスのアミノ酸として残すかを決定した。表2は、生成した配列を要約している。
配列傾向解析
非常に望ましくない配列傾向がヒト化配列に導入されていないことを確認するため、元のマウス配列及びヒト化配列をAbsolute Antibody配列傾向ツールにかけた。最も懸念される配列傾向は、グリコシル化モチーフ及び遊離システインである。元の親VH配列は、N-結合型グリコシル化モチーフを含む。このモチーフはCDR-H2内にあり、結合に影響を及ぼし得る。このモチーフは、cAb1981を除くほとんどのヒト化VH配列に残っていた。
抗体の生成及び解析
抗体クローニング
上述のように、合計4つのヒト化重鎖及び3つのヒト化軽鎖を設計した。これらの各々を別々に合成し、ヒトIgG1及びscFvとしてクローニングした。形質移入の時点で、ヒト化配列の全ての可能な組合せを作製して、合計12種の異なるヒト化IgG及び12種のヒト化scFvを創出した。
抗体の発現及び精製
全ての抗体を小規模に発現し、次いでタンパク質をプロテインAまたはニッケルクロマトグラフィーにより精製した。全ての精製産物は、非還元及び還元SDS-PAGE下で予想通りであるように思われた。cAB1984-10.0を除く全てのIgGが十分に発現した。scFvは混在した発現レベルを示し、6種(cAb1977、cAb1081、cAb1982、cAb1983、及びcAb1988)は完全には発現しなかった。IgG及びscFVの収量を表3及び表4に示す。
凝集の解析
精製したIgGに対し、SEC-HPLCにより凝集及びフラグメント化を解析した。単量体含量を表3に報告する。全ての抗体が95%超の単量体純度を示し、大半が98%超の単量体純度を示している。
実施例2:新たに発見された完全ヒト化抗FLT3 IgGクローン及びそのscFvの結合親和性
この実施例は、ヒト化抗FLT3抗体(例えば、本明細書に記載の抗体)がFLT3に対し高い結合親和性を有することを示している。具体的には、この実施例は、ヒト化抗FLT3 IgG及び抗FLT3 scFvが、FLT3を発現する細胞に対し高い結合親和性を有することを示している。
完全ヒト化抗ヒトFLT3モノクローナルIgG1、クローンhum 1-18BA-v1、クローンID cAb1978-30.11、抗体(配列番号1のVL及び配列番号3のVHを有する)ならびにhisタグ付きscFv、クローンhum 1-18BA-v1、IgG1と同じVH及びVLを有する抗体(配列番号4及びC末端上のHisタグを含む)を上述のように開発した。FLT3を高発現するREH細胞(急性リンパ性白血病細胞株、ATCC;no.CRL-8286)を用いて、scFv分子の結合親和性をIgG1モノクローナル分子と比較した。REH細胞を、100μLの最終体積のFACSバッファー(以下、単に「バッファー」と称する;リン酸緩衝食塩水(PBS)(Caisson Labs;no.PBL06)+2% BCS(GE Healthcare;no.SH30073.04)+1mM EDTA(Invitrogen;no.15575020))で希釈した様々な濃度(10-1~10ng/mL)のIgG1分子またはscFv分子と、三重反復で、4℃で30分間インキュベートした。細胞をバッファーで3回洗浄し、二次抗体とインキュベートした。IgG1を1:200ヤギ抗ヒトFc FITC(Jackson)二次抗体で検出し、scFvを抗His FITC(1:200)二次抗体で検出した。二次抗体を、100μL最終体積において三重反復で、4℃で30分間インキュベートした。細胞をバッファーで1回洗浄し、200uLのバッファー+1:100 7-AAD Viability Staining Solution(Biolegend;no.420404)に再懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーの取得をBeckman Coulter CytoFLEX(Beckman Coulter)により実施し、解析をFlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)により実施した。プロットは、REH細胞の蛍光強度中央値vs使用した一次抗体の濃度を示している。可変勾配(4パラメーター)曲線をデータに適合させ、EC50を使用して結合親和性を比較した。IgG1分子は62.1ng/mL(0.41nM)のEC50を有し、scFv分子は85.45ng/mL(3.42nM)のEC50を有する(図1B~1C)。
実施例3:第三世代抗FLT3キメラ抗原受容体の生成
CARを生成するため、EF-1αプロモーターの転写制御下で第三世代CARをコードするレンチウイルスベクターを使用した(図2B)。このCARは、実施例1に記載の抗FLT3 scFv配列(配列番号4)を含むポリペプチドをコードし、その後にCD28及び4-1BB共刺激ドメインが続き、その後にCD3ζ活性化ドメインが続く。CAR配列の後には、自己切断T2A配列(配列番号16)により結合したCopGFP配列が続く。このベクターは、単一のRNA転写産物からCAR及びCopGFPの二重発現を可能にする。全てのコンストラクトをシークエンシングにより検証した。
FLT3は、造血幹細胞及び前駆細胞(HSPC)ならびに樹状細胞に発現し、また急性骨髄性白血病で発現する。T細胞内でCARを発現させることにより、T細胞がFLT3標的細胞に曝露されたときに、抗FLT3 scFvを介したMHC非依存的一次活性化が可能になる。CAR内の共刺激ドメイン及び活性化ドメインを通じて、この活性化はパーフォリンとグランザイムの発現をもたらし、これらが最終的には標的細胞に対し細胞傷害性を有する(図2C)。
実施例4:T細胞の単離及び形質導入
抗FLT3 CAR T細胞を生成するため、以下のプロトコルを実行した。この実施例は、抗FLT3 CAR T細胞の生成に成功したこと、抗FLT3 CAR T細胞の発現が形質導入から4日後にピークに達したこと、及び抗FLT3 CARを発現するT細胞が18日で約125倍に拡大したことを示している。
1日目に、negative magnetic isolation kit(StemCELL Technologies;no.17951)を用いて成人末梢血(New York Blood Center,NYBCから購入)からT細胞を単離した。T細胞をDynabeads(Human T-Activator CD3/CD28;Gibco;no.111.61D)とともに1:1の細胞:ビーズ比で混合し、200ulの培地(RPMI 1640培地(ATCC;no.30-2001)+10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS)(Biowest;no.S1620)+1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco;no.15140122))が入った無処置の96ウェル平底細胞培養プレートに8×10細胞/ウェルもしくは1.6×10細胞/ウェルの密度で播種し、または1mlの培地が入った24ウェルプレートに10細胞/ウェルの密度で播種した。2日目に、1:1000ポリブレン(5mg/mL)(VectorBuilder)を用いて、T細胞にCAR Tレンチウイルスベクターを複数のMOI(0、2、5、10、及び20)で形質導入した。4日目に、形質導入の効率をフローサイトメトリーにより定量した。GFP陽性細胞の形質導入に成功した。ポリクローナル抗Fab APC抗体(Jackson ImmunoResearch;no.109-607-003)を用いて、scFvの表現発現を確認した。T細胞をscFv検出抗体により4℃で30分間染色した。細胞をバッファーで1回洗浄し、200μLのバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーの取得をBeckman Coulter CytoFLEX(Beckman Coulter)により実施し、解析をFlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)により実施した。T細胞培地を交換し、最終濃度10ng/mlの組換えヒトIL-2(Miltenyi Biotec;no.130097745)を補充した。T細胞を必要に応じて分割して、細胞密度を0.5~1×10細胞/mlに維持した。7日目に、形質導入の効率を、上述のようにフローサイトメトリーにより評価した。10日目に、形質導入の効率を、上述のようにフローサイトメトリーにより評価し、T細胞は機能的細胞傷害性試験を行う準備ができている(図3A)。
CAR T細胞を上述のように生成及び拡大した。具体的には、細胞に配列番号16のアミノ酸配列を有するCAR(以下の方向のドメイン:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-GFP)を形質導入した。形質導入の効率を、10日間にわたり異なるMOIで定量した。具体的には、抗FLT3 CAR3a(配列番号16)を形質導入した細胞におけるGFP発現を測定した。GFP発現は4日目にピークに達し、7日目までは減少し、10日目には全てのMOIで安定化するように思われた(図3B)。抗FLT3 CAR3aを形質導入したところ、T細胞は18日でおよそ125倍に拡大した(図3C)。GFPの発現(すなわち、CARコンストラクトの発現)は、予想されたようにscFvの発現との直線的な相関を示した(図3D)。
実施例5:in vivo及びin vitroの抗FLT3 CAR-TのAML細胞株MOLM-13に対する細胞傷害性
この実施例は、実施例4に記載の抗FLT3 CARが、in vitroでAML細胞株に対し、in vivoで白血病の動物モデルにおいて生存期間の増加に有効であることを示している。
CAR T細胞を上述のように生成及び拡大し、次いで機能的細胞傷害性アッセイに使用した。具体的には、CellTrace(商標)Violet Cell Proliferation Kit(Thermo Fisher Scientific;no.C34571)で標識したMOLM-13 (DSMZ;no.ACC 554)などのFLT3を発現するAML細胞株を用いて、細胞の細胞傷害性を測定した(図4A)。配列番号16によりコードされるCAR(以下の方向でドメインをコード:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-GFP)を発現するCAR T細胞(エフェクター細胞)を標識AML細胞(標的細胞)とともに、様々なエフェクター:標的細胞比(10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、及び1:5)で24時間及び48時間共培養した。細胞を収集し、FACSバッファーで洗浄し、200μLの11:100 7-AAD Viability Staining Solution(Biolegend;no.420404)に再懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーの取得は、Beckman Coulter CytoFLEX(Beckman Coulter)により実施し、解析は、FlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)により実施した。代表的なドットプロットは、デブリ除外後のフローデータを示している。標的細胞はCellTraceViolet、エフェクター細胞はCellTraceVioletとして識別される。CellTraceViolet細胞でゲーティングし、死標的細胞(7AAD)及び生標的細胞(7AAD)の頻度を定量した。MOLM-13に対する細胞傷害性は、in vitroで抗FLT3 CAR3a-T細胞とともに共培養したところ、24時間時及び48時間時に、対照T細胞と比較して有意に高かった(図4B及び4C)。
白血病に対する抗FLT3 CAR3a-T細胞のin vivo有効性を、MOLM-13細胞株(DSMZ;no.ACC 554)(EGFPを発現するように形質導入したAML細胞)を移植した雌のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTacマウス(以下NOGマウスと略記、Taconic;no.NOG-F)において評価した。1日目に、各NOGマウス(n=14)に2×10個のEGFP-MOLM-13細胞を静脈内移植した。5日目及び32日目に、各マウスに4×10個の対照T細胞(n=7)または4×10個の抗FLT3 CAR3a T細胞(33% CAR)(n=7)のいずれかを投与した。一部のマウスに、4×10個のCAR-T細胞(33% CAR)(n=4)を投与して、CAR-T単体(すなわち、MOLM-13細胞を含まない抗FLT3 CAR3a T細胞)がマウスに及ぼす効果を評価した(図5A)。生理的苦痛、カヘキシー、または後肢麻痺の症状を示したマウスを屠殺した。抗FLT3 CAR3a-T細胞処置により、生存期間中央値は、対照T細胞マウスの24日に対し47日に延長した(図5B)。T細胞投与後、2週間ごとにマウスから採血した。末梢血単核球を抗マウスCD45 APC(BioLegend;no.103112)、抗ヒトCD45 APC-eFluor780(Invitrogen;no.47045942)、抗ヒトCD33 BV510(BioLegend;no.366610)、及び抗ヒトCD3 PE-Cy7(BioLegend;no.300420)で染色し、フローサイトメトリーにより、循環するMOLM-13細胞(mCD45hCD45CD33EGFP)及びT細胞(mCD45hCD45CD3)またはCAR-T細胞(mCD45hCD45CD3EGFP)の頻度を測定した。フローサイトメトリーの取得をBeckman Coulter CytoFLEX(Beckman Coulter)により実施し、解析をFlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)により実施した。(全単核球の頻度に対する)T細胞の頻度は、抗FLT3 CAR3a-T細胞処置マウスでは47日目まで維持され、場合によっては72日目まで維持されたが、対照T細胞処置マウスは28日目までに死亡した(図5C~5E)。
実施例6:造血幹細胞移植(HSCT)コンディショニングのためのFLT3-CAR-T細胞によるCD34骨髄HSPCの標的化
この実施例は、本明細書に記載の抗FLT3 CAR T細胞がCD34+HSPCの枯渇の達成に有効であることを示している。これは、抗FLT3 CAR T細胞をHSCTのために使用できる可能性を示している。
ヒトHSCの調製及び移植
新鮮な臍帯血(CB)単位(Carolina Cord Blood Bank)由来の単核細胞(MNC)を、フィコール分離培地(StemCELL Technologies;no.07861)を用いた密度遠心分離により単離した。MNCをさらに精製するため、溶解バッファー(Alfa Aesar;no.J62150-AP)を用いて赤血球を溶解した。次いで、抗ヒトCD34マイクロビーズ(Miltenyi Biotec;no.130-046-703)を用いてCB MNCをヒトCD34細胞について濃縮した。陰性磁気単離(StemCELL Technologies;no.17951)を用いて、MNCのCD34分画に対し、T細胞を濃縮した。
3~4週齢の雌のNOGマウスに、2.4×10個のCD34細胞及び10個のT細胞を注射した。4週間ごとにマウスの顎下静脈から採血して(約100μL)、ヒトキメラ化を評価した(図6A)。PBMCを以下のmAbパネルで染色して、ヒト化のレベル及び系列発生を定量した:抗マウスCD45 APC(BioLegend;no.103112)、抗ヒトCD45 APC-eFluor780(Invitrogen;no.47045942)、抗ヒトCD3 PE-Cy7(BioLegend;no.300420)、抗ヒトCD19 PE(BioLegend;no.302208)、抗ヒトCD33 FITC(BioLegend;no.303304)、抗ヒトCD4 BV605(BioLegend;no.317438)、抗ヒトCD8 BV510(BioLegend;no.344732)、抗ヒトCD45RA BV650(BioLegend;no.304136)、抗ヒトCD45RO Pacific Blue(BioLegend;no.304216)。
自己由来CAR-T細胞によるコンディショニング
上述のマウス(図6A)がロバストなヒト生着(1%以上のヒトCD45)を示したら、移植後27週目に、マウスに5×10個の自己由来対照T細胞(CAR-T細胞と同じ方法で拡大)または5×10個の自己由来CAR-T細胞(実施例3に記載のCARを発現)のいずれかを投与した。T細胞投与後の4日目、14日目、18日目にマウスから採血した。T細胞による処置後18日目にマウスを安楽死させ、末梢血及び骨髄(BM)を単離した。対照T細胞またはCAR-T細胞による処置の前後の末梢血のMNC分画におけるヒトCD45細胞の全体的な頻度を測定し、対照T細胞と抗FLT3 CAR T細胞との間で同様の生着が示された(図6B)。対照またはCAR-T細胞による処置の前後の末梢血における系列頻度(T細胞(CD3)、B細胞(CD19)、及び骨髄系細胞(CD33))を測定し(図6C)、経時的な頻度の変化を測定した(図6D)。骨髄系細胞は、対照T細胞処置マウスと比較して抗FLT3 CAR-T細胞処置マウスにおいて有意な減少を示した。次いで、単離骨髄(BM)における細胞頻度の変化を測定した。マウスからの大腿骨と脛骨について、肉眼的な解剖学的差異を目視で評価したが、対照T細胞と抗FLT3 CAR T細胞処置動物との間の差異は示されなかった(図7A)。BMからのMNC(BM-MNC)の総細胞カウントを記録した。BM-MNCも上述のようにフローサイトメトリーにより解析し、ヒトCD45細胞の頻度を定量した(図7B)。BM-MNCにおける系列頻度(T細胞(CD3)、B細胞(CD19)、骨髄系細胞(CD33))を測定した(図7C)。対照またはCAR-T細胞による処置の前後の系列細胞カウント(T細胞(CD3)、B細胞(CD19)、及び骨髄系細胞(CD33))を、2つのコホートにおける個々のマウスについてに示している(図7D)。CD45+CD19+のB細胞カウントは、CAR-T処置マウスでは低い(対照と比較して54.4%低い)傾向にあった。理論に束縛されるものではないが、HSC、MPP、及びCPの数が低減したためにB細胞カウントが低減した可能性がある。
BM-MNCを以下のmAbsパネルで染色して、HSPCの頻度を定量した:抗マウスCD45 APC(BioLegend;no.103112)、抗ヒトCD45 APC-eFluor780(Invitrogen;no.47045942)、抗ヒト系列カクテルBV510(BioLegend;no.348807)、抗ヒトCD34 PE-Cy7(BioLegend;no.343516)、抗ヒトCD38 FITC(BioLegend;no.356610)、抗ヒトCD90 PE(Invitrogen;no.12090942)、及び抗ヒトCD45RA BV650(BioLegend;no.304136)。FLT3-CAR T処置マウスにおいて、対照と比較して有意な造血幹細胞及び前駆細胞(CD38CD34及びCD38CD34集団)の枯渇が観察された(図8A)。CAR T細胞処置マウスが有する骨髄内の前駆細胞は、対照マウスと比較して有意に少ない。CD38CD34集団のさらなるゲーティングにより、「真の」造血幹細胞(HSC)(CD90CD45RA)、多能性前駆細胞(MPP)(CD90CD45RA)、及び共通前駆細胞(CP)(CD90CD45RA)の有意な枯渇が明らかになった(図8A及び8B)。
実施例7:自殺スイッチを有するCARコンストラクトの生成
自殺安全スイッチを組み込んだCARコンストラクトを生成した。具体的には、上皮成長因子受容体(EGFR)に基づく安全性スイッチであるEGFRt(切断EGFR)を、T2Aペプチド配列の後にCARプラスミドで共発現させた(得られたCARは、配列番号7のアミノ酸配列を有し、以下の方向でドメインを含む:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-EGFRt)。T2Aによるペプチドの自己切断により、EGRFtの表面発現が可能になる。「自殺」は、in vivoでT細胞をオプソニン化の標的とするセツキシマブ(抗EGFR mAb)を用いた処置により、達成される。
第2のコンストラクトである、安全自殺スイッチに基づく誘導性カスパーゼ9(iCasp9)を生成した。iCasp9分子を、T2Aペプチド配列の後にCARプラスミドで共発現させた(得られたCARは、配列番号8のアミノ酸配列を有し、以下の方向でドメインを有する:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-iCasp9)。T2Aによるペプチドの自己切断により、iCasp9の表面発現が可能になる。「自殺」は、iCasp9の二量体化をもたらしアポトーシス経路を誘発するAP1903(リミデュシド)で処置することにより、達成される。
ヒトT細胞における、抗FLT3 scFvの表面発現に基づく自殺-CARベクターの形質導入効率を測定した。ポリクローナル抗Fab APC抗体(Jackson ImmunoResearch;no.109-607-003)を用いてscFvの発現を検出した。T細胞をscFv検出抗体により4℃で30分間染色した。細胞をバッファーで1回洗浄し、200μLのバッファー+1:100 7-AAD Viability Staining Solution(Biolegend;no.420404)に再懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーの取得をBeckman Coulter CytoFLEX(Beckman Coulter)により実施し、解析をFlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)により実施した。CAR-T頻度は、抗FLT3 CAR(配列番号16)、CAR3a-EGFRt(配列番号7)、及びCAR3a-icasp9(配列番号8)試料において、それぞれ35.3%、27.5%、及び16.9%と定量された(図9A)。
自殺CAR3aコンストラクトCAR3a-EGFRt及びCAR3a-icasp9による細胞傷害性の評価
自殺スイッチCAR3a-EGFRt及びCAR3a-icasp9を有するCAR-T細胞のAML細胞株に対するin vitro細胞傷害性を、元のコンストラクト抗FLT3 CAR3aと比較して測定した。NOMO-1細胞(FLT3を発現するAML細胞)をCellTrace(商標)Violet Cell Proliferation Kit(Thermo Fisher Scientific;no.C34571)で標識した。CART細胞(エフェクター細胞)を標識NOMO-1(標的細胞)と様々なエフェクター:標的細胞比(10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、及び1:5)で合わせた。使用する全T細胞の量は、CAR-T頻度の差を考慮せずに同じに保った(図9B)。24時間の共培養後、全ての細胞を採取し、7-AAD Viability Staining Solution(Biolegend;no.420404)で標識し、フローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーの取得は、Beckman Coulter CytoFLEX(Beckman Coulter)により実施し、解析は、FlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)により実施した。代表的なドットプロットは、デブリ除外後のフローデータを示している。標的細胞はCellTraceVioletとして、エフェクター細胞はCellTraceVioletとして特定された。CAR-3a、CAR3a-EGFRt、及びCAR3a-icasp9を発現するT細胞と様々なエフェクター:標的比でインキュベートしたときの7AAD死標的細胞の頻度を測定した。全てのFLT3 CAR T細胞が、FLT3NOMO-1細胞に対し、対照T細胞と比較して有意に高い細胞傷害効果を示している。2つの自殺CAR-T細胞(すなわち、抗FLT3 CAR-EGFRt及び抗FLT3 CAR-icasp9)のいずれかと、元のCARコンストラクト(抗FLT3 CAR3a)との間で、細胞傷害効果における有意差はなかった(図9C)。
実施例8:EGFRt-CART細胞自殺スイッチの機能的試験としてのin vitroでのADCCによるCAR-Tのセツキシマブ媒介性枯渇
この実施例は、EGFRt自殺遺伝子を発現するCAR T細胞が、抗体依存性の細胞傷害性により首尾よく枯渇したことを示している。
EGFRt自殺スイッチの発現を検証するため、ヒトT細胞に、CAR3a-T2A-EGFRt(配列番号7;以下の方向でドメインをコード:シグナルペプチド-リンカー-配列番号4のscFV-リンカー-CD8αヒンジ-CD8α膜貫通ドメイン-CD28-41BB-CD3ζ-T2A-EGFRt)レンチウイルスベクターを発現するプラスミド(図12Bに示す)を形質導入した。ポリクローナル抗Fab APC抗体(Jackson ImmunoResearch;no.109-607-003)を用いて抗FLT3 CAR3aの表面発現を検出した。セツキシマブ(Selleckchem A2000)及びヤギ抗ヒトIgG Fc FITC抗体(Jackson)を二次抗体として用いて、EGFRtの表面発現を確認した(図10A)。
抗体依存性細胞傷害性(ADCC)試験を実施して、ADCCによるCAR3a-T2A-EGFRt T細胞のセツキシマブ媒介性枯渇を測定した。具体的には、CAR3a-T2A-EGFRt-形質導入T細胞を上述のように拡大した。8日目に、同種異系の単核球(MNC)(New York Blood Center(NYBC))(エフェクター細胞)(全T細胞または陰性磁気分離(StemCELL Technologies;no.17951)を用いてT細胞を枯渇させたもの)を前述のようにCellTraceで標識し、10:1のエフェクター:標的比で形質導入T細胞(標的細胞)とともに培養物に加えた。セツキシマブを1~10000ng/mLの範囲の濃度で共培養物に加えた。12日目に、共培養物から全ての細胞を採取し、染色して前述のようにscFvを検出し、フローサイトメトリーにより解析した(図10B)。単独で培養した形質導入T細胞(PBMCなし)は、セツキシマブで処置した後にCAR3a発現細胞の有意な減少を示さない(図10C)。全同種異系MNC(PBMC)とともに培養した形質導入T細胞は、セツキシマブにより用量依存的なCAR3a発現細胞の枯渇を示している。T細胞(PBMC-T細胞)を枯渇させた同種異系MNCとともに培養した形質導入T細胞は、セツキシマブにより用量依存的なCAR3a発現細胞の枯渇を示している。結果は、in vitroにおけるEGFRt発現CART細胞に対する抗体依存性細胞傷害性(ADCC)機能を支持するものである。
実施例9:in vivoでのEGFRt-CAR TのAMLに対する有効性、及びin vivoでのADCCによるセツキシマブ媒介性CAR-T枯渇。
この実施例は、EGFRt自殺遺伝子を発現する抗FLT3 CAR T細胞が、AML(MOLM-13細胞)を有するマウスの生存期間を改善することができ、セツキシマブで処置すると抗体依存性の細胞傷害性により枯渇することを示している。
白血病に対する抗FLT3 EGFRt-CAR-T細胞(実施例8に記載)のin vivo有効性を、EGFPを発現するように形質導入したAML細胞株MOLM-13(DSMZ;no.ACC 554)を移植した雌のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac(以下、NOGマウスと略記;Taconic;no.NOG-F)において評価した。1日目に、各NOGマウス(n=15)に2×10個のEGFP-MOLM-13細胞を静脈内移植した。また、1日目に、各マウスに10×10個の対照T細胞(n=5)または10×10 個のEGFRt-CAR3a T細胞(20% CAR)(n=10)のいずれかも投与した。18日目に、全てのマウス(n=15)に9×10個のエフェクター細胞(T細胞が枯渇したMNC)を投与し、EGFRt-CARTマウスの1群(n=5)には200ugのセツキシマブの腹腔内注射も投与した。マウスの3つの群は、CAR T(-)セツキシマブ(n=5)(セツキシマブなし)、CAR T(+)セツキシマブ(n=5)、及び対照T(-)セツキシマブ(n=5)である(図11A)。AML注射後65日までの生存曲線を作成した。生理的苦痛、カヘキシー、または後肢麻痺の症状を示したマウスを屠殺した。FLT3 CAR-T処置(CART自殺の誘導なし)は、生存期間中央値を、対照T細胞マウスの19日に対し45日まで延長した。CAR T+セツキシマブマウスの生存期間中央値は52日であった(図11B)。マウスから2週間ごとに採血して、AML及びT細胞の生着を判定した。PBMCを、抗マウスCD45 APC(BioLegend;no.103112)、抗ヒトCD45 APC-eFluor780(Invitrogen;no.47045942)、及び抗ヒトCD3 PE-Cy7(BioLegend;no.300420)で染色し、フローサイトメトリーにより解析して、MOLM-13細胞(mCD45hCD45EGFP)及びT細胞(mCD45hCD45CD3)の頻度を定量した。(左)CAR-T細胞処置マウスは、第2週に対照T細胞処置マウスと比較してはるかに少ないMOLM-13の増殖を示している。第4週及び第6週目までに、全ての対照T細胞マウスは死亡が確認された、または安楽死させた。(右)末梢血中のT細胞頻度(mCD45hCD45CD3)を、各群ごとに様々な時点で定量した(図11C)。また、マウスにおける循環CAR-T細胞の相対量も、qPCRによってCAR特異的DNAの相対的レベルを定量化することにより、第4週及び第6週に定量した。セツキシマブ処置は、循環CAR-T細胞の頻度を有効に低減した(図11D)。
参照による援用
本明細書では、特許、特許出願、及び刊行物などの様々な文献を引用しているが、これらの開示内容は、参照により全体として本明細書に援用される。

Claims (65)

  1. ヒトFLT3に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはフラグメントが、
    i.配列番号1、配列番号2、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、及び配列番号38からなる群より選択される配列のいずれか1つに対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(VL)、及び/または
    ii.配列番号3、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27からなる群より選択される配列のいずれか1つに対し少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(VH)を含む、前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. (i)前記VLが、配列番号86のCDR-L1、配列番号87のCDR-L2、及び配列番号88のCDR-L3のアミノ酸配列に対し少なくとも97%、98%、99%、または100%の同一性を有する相補性決定領域(CDR)を含み、(ii)前記VHが、配列番号89のCDR-H1、配列番号90のCDR-H2、及び配列番号91のCDR-L3のアミノ酸配列に対し少なくとも97%、98%、99%、または100%の同一性を有するCDRを含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはフラグメント。
  3. 前記VLが配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記VHが配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはフラグメント。
  4. 前記VLが配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記VHが配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはフラグメント。
  5. 請求項1~4のいずれか1項に記載の抗原結合フラグメントを含む、単鎖可変ドメイン(scFv)。
  6. 前記VLと前記VHとの間にリンカーを含み、前記リンカーが式(Gly3~4-Ser)1~4を有する、請求項5に記載のscFv。
  7. 前記scFvが、配列番号4、配列番号5、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び配列番号49からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のscFv。
  8. 前記scFvが配列番号4のアミノ酸配列を有する、請求項7に記載のscFv。
  9. 前記scFvが配列番号5のアミノ酸配列を有する、請求項7に記載のscFv。
  10. キメラ抗原受容体(CAR)であって、(i)(a)請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体もしくはフラグメントまたは(b)請求項5~9のいずれか1項に記載のscFvを含む細胞外ドメインと、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)細胞内ドメインとを含む、前記CAR。
  11. 前記膜貫通ドメインが、CD3膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、またはCD28膜貫通ドメインである、請求項10に記載のCAR。
  12. 前記細胞内ドメインが活性化ドメインを含み、前記CARがT細胞内で発現したときに、前記活性化ドメインが、前記細胞外ドメインがFLT3に結合した後に、活性化シグナルを伝達する、請求項10または11に記載のCAR。
  13. 前記細胞内ドメインが活性化ドメインを含み、前記活性化ドメインが、CD3ゼータ、CD3イプシロン、またはFcRガンマの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項10または11に記載のCAR。
  14. 前記細胞内ドメインが1つ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項12または13に記載のCAR。
  15. 前記1つ以上の共刺激ドメインが、CD28、4-1BB、CD27、OX40、またはICOSのうちの1つ以上に由来する、請求項14に記載のCAR。
  16. 前記1つ以上の共刺激ドメインが、CD28及び/または4-1BBに由来する、請求項15に記載のCAR。
  17. 前記CARが、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にスペーサー領域またはヒンジ領域を含む、請求項10~16のいずれか1項に記載のCAR。
  18. 前記スペーサーまたは前記ヒンジ領域が、CD8の細胞外ドメインに由来する、請求項17に記載のCAR。
  19. 前記細胞外ドメインが切断性シグナルペプチドをさらに含む、請求項10~18のいずれか1項に記載のCAR。
  20. 前記細胞外ドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含むscFvを含み、前記膜貫通ドメインが、CD8膜貫通ドメインを含み、前記細胞内ドメインが、CD3ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD28及び/または4-1BBの共刺激ドメインとを含む、請求項10に記載のCAR。
  21. 前記CARが、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、及び配列番号15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載のCAR。
  22. 安全スイッチポリペプチドをさらに含み、前記安全スイッチポリペプチドが、自己切断ペプチドにより前記CARに結合する、請求項10~20のいずれか1項に記載のCAR。
  23. 前記安全スイッチポリペプチドがiCasp9またはEGFRtであり、前記自己切断ペプチドがT2A、P2A、E2A、F2A、またはIRESである、請求項22に記載のCAR。
  24. 前記CARを発現するT細胞が、前記細胞外ドメインがFLT3に結合したときに、増殖するように活性化または刺激される、請求項10~23のいずれか1項に記載のCAR。
  25. 前記CARが、T細胞の表面に発現したときに、前記T細胞に、FLT3を発現する細胞を殺滅するように指示する、請求項10~24のいずれか1項に記載のCAR。
  26. 請求項10~25のいずれか1項に記載のCARを発現する、または請求項10~25のいずれか1項に記載のCARをコードする核酸を含む、免疫細胞。
  27. 前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞、マクロファージ、または単球である、請求項26に記載の免疫細胞。
  28. 前記免疫細胞がT細胞である、請求項26または27に記載の免疫細胞。
  29. 前記免疫細胞が核酸を含み、前記核酸が、配列番号60、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、及び配列番号69からなる群より選択される配列を含む、請求項26~28のいずれか1項に記載の免疫細胞。
  30. 前記免疫細胞が、前記CARまたは前記核酸を導入する前に、対象から誘導されている、請求項26~29のいずれか1項に記載の免疫細胞。
  31. 前記対象がヒトである、請求項30に記載の免疫細胞。
  32. 前記CARを発現するまたは前記核酸を含む前記免疫細胞が、細胞の集団を生成するためにさらに拡大される、請求項26~31のいずれか1項に記載の免疫細胞。
  33. 請求項10~25のいずれか1項に記載のCARを発現する、または請求項10~25のいずれか1項に記載のCARをコードする核酸を含む、免疫細胞の集団。
  34. 医薬組成物であって、(i)請求項1~4のいずれか1項に記載のヒト化抗体もしくはフラグメント、請求項5~9のいずれか1項に記載のscFv、請求項26~32のいずれか1項に記載の免疫細胞、または請求項33に記載の免疫細胞の集団と、(ii)医薬的に許容される担体とを含む、前記医薬組成物。
  35. 血液癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、治療有効量の:(i)請求項26~32のいずれか1項に記載の免疫細胞、(ii)請求項33に記載の免疫細胞の集団、または(ii)請求項34に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  36. 前記血液癌が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、末梢性T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、非悪性遺伝性もしくは後天性骨髄障害、多発性骨髄腫、または樹状細胞新生物である、請求項35に記載の方法。
  37. 前記血液癌がAMLである、請求項36に記載の方法。
  38. 前記血液癌がALLである、請求項36に記載の方法。
  39. 前記血液癌が樹状細胞新生物である、請求項36に記載の方法。
  40. 造血細胞移植のための準備またはコンディショニングを、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の:(i)請求項26~32のいずれか1項に記載の免疫細胞、(ii)請求項33に記載の免疫細胞の集団、または(ii)請求項34に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  41. 前記治療有効量が、前記対象内でFLT3を発現する細胞集団を少なくとも90%低減する、請求項40に記載の方法。
  42. それを必要とする前記対象が血液癌を有する、請求項40または41に記載の方法。
  43. 前記血液癌が、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物(BPDCN)、末梢性T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、非悪性遺伝性もしくは後天性骨髄障害、多発性骨髄腫、または樹状細胞新生物である、請求項42に記載の方法。
  44. 前記血液癌がAMLである、請求項43に記載の方法。
  45. 前記血液癌がALLである、請求項43に記載の方法。
  46. 前記血液癌が樹状細胞新生物である、請求項43に記載の方法。
  47. 前記投与が、前記対象における循環骨髄系系列を低減し、任意選択で、前記投与が循環骨髄系系列を、ベースラインレベルに対し少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%低減する、請求項35~46のいずれか1項に記載の方法。
  48. 前記投与が、前記対象における骨髄系列の頻度及び数を低減し、任意選択で、前記投与が、骨髄の頻度及び/または数を、ベースラインレベルに対し少なくとも50%、少なくとも55%または少なくとも60%低減する、請求項35~47のいずれか1項に記載の方法。
  49. 前記投与が、ヒトCD34造血幹細胞及び/または造血前駆細胞を特異的に標的とする、請求項35~48のいずれか1項に記載の方法。
  50. 前記投与が、前記対象の骨髄単核細胞内のヒトD34CD38細胞集団を、ベースラインレベルに対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、もしくは少なくとも65%低減し、及び/または前記対象の骨髄単核細胞内のヒトCD34CD38細胞集団を、ベースラインレベルに対し少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、もしくは少なくとも85%低減する、請求項49に記載の方法。
  51. 前記投与後に、前記対象に造血細胞移植を実施することをさらに含む、請求項35~50のいずれか1項に記載の方法。
  52. 前記造血細胞移植が、前記対象に、造血幹細胞及び/または造血前駆細胞を移植することを含む、請求項51に記載の方法。
  53. 前記造血細胞移植の前記実施が、前記投与から5日~6週間後に行われる、請求項51または52に記載の方法。
  54. 前記造血細胞移植の前記実施が、前記投与から約2~3週間後に行われる、請求項53に記載の方法。
  55. 前記免疫細胞または前記免疫細胞の集団の治療有効量が、約50,000,000~10,000,000,000細胞の用量である、請求項35~54のいずれか1項に記載の方法。
  56. 前記免疫細胞または前記免疫細胞の集団の治療有効量が、約100,000,000~2,000,000,000細胞の用量である、請求項55に記載の方法。
  57. 前記投与が静脈内投与である、請求項35~56のいずれか1項に記載の方法。
  58. 前記静脈内投与が、前記対象への注入により行われる、請求項57に記載の方法。
  59. 前記投与が1回行われる、請求項35~58のいずれか1項に記載の方法。
  60. 前記投与が3~7日ごとに2~3週間行われる、請求項35~58のいずれか1項に記載の方法。
  61. 前記方法が、前記投与ステップの前に、以下のステップ:
    (v)前記対象から血液を採取すること、
    (vi)前記血液から免疫細胞を単離すること、
    (vii)請求項10~25のいずれか1項に記載のCARをコードする核酸を、前記単離免疫細胞に導入すること、及び
    (viii)ステップ(iii)で得られた単離免疫細胞を拡大することを含み、前記拡大が、前記投与ステップ中に投与された前記免疫細胞または前記免疫細胞の集団をもたらす、請求項35~60のいずれか1項に記載の方法。
  62. チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、請求項35~61のいずれか1項に記載の方法。
  63. 前記チェックポイント阻害剤が、PD1、PD-L1、またはCTLA4のアンタゴニストである、請求項62に記載の方法。
  64. 前記アンタゴニストがアンタゴニスト抗体である、請求項63に記載の方法。
  65. 前記対象がヒトである、請求項35~64のいずれか1項に記載の方法。
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