KR20190116420A - Bcma 관련 암 및 자가면역 장애의 치료를 위한 조합 요법 - Google Patents

Bcma 관련 암 및 자가면역 장애의 치료를 위한 조합 요법 Download PDF

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KR20190116420A
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스탠리 알. 리델
다미안 그린
타일러 힐
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프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
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Abstract

본 발명은 B-세포 관련 증식성 질환, 예컨대 암 또는 자가면역 질환 등을 치료 또는 예방하기 위해 동시에 또는 순차적으로 수행할 수 있는 γ-세크레타제 억제제와 조합하여 BCMA 특이적 결합 분자(예컨대 BCMA 특이적 키메라 항원 수용체 또는 항체)를 사용하는 방법에 관한 것이다. γ-세크레타제 억제제와 조합된 BCMA 특이적 결합 분자는 예를 들어 양자 면역요법에 사용될 수 있다.

Description

BCMA 관련 암 및 자가면역 장애의 치료를 위한 조합 요법
정부 투자 관련 진술
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인간의 면역 체계는 일반적으로 이물질 및 병원체 침입으로부터 신체를 보호한다. B-림프구(B-세포 및 면역계의 구성 요소라고도 함)는 이물질 또는 병원체에 결합하고 경우에 따라서는 파괴를 중재하는 항체를 생산한다. 그러나 일부 경우에는 면역 체계를 조절할 수 없고 이는 암, 자가면역 질환 및 염증성 질환과 같은 B-세포의 통제되지 않은 증식과 관련된 질환으로 이어질 수 있다.
성숙한 B-세포 및 그의 분화된 자손은 혈장 세포 및 일부 성숙한 B-세포 상에서 발현되는, B-세포 성숙 항원(BCMA, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17(TNFRSF17), TNFRSF13A 및 CD269라고도 함)과 같은 세포 표면 상의 분자로 확인할 수 있다. BCMA는 B-세포 활성화 인자(BAFF, 또한 TNFSF13B, TALL1 및 CD257로도 알려짐) 및 증식 유도 리간드(APRIL, 또한 TNFSF13, TALL2 및 CD256으로도 알려짐)와 특이적으로 결합하여 NF-κB 활성화를 유도할 수 있는 것으로 입증되었다. BCMA 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 변형된 T 세포, 네이키드 BCMA 특이적 항체의 입양적 전달 또는 치료 부분(항체 약물 접합체, 방사성 표지와 같은 ADC)에 접합된 BCMA 특이적 항체의 투여를 포함하는 BCMA-표적 치료는, 다발성 골수종과 같은 일부 유형의 B-세포 악성 종양을 치료하는데 사용될 수 있지만, 종양 세포 표면에서 발현되는 BCMA 분자의 수 및/또는 순환에서 가용성 BCMA의 존재에 의해 효능이 제한될 수 있다. 암세포 또는 가용성 BCMA 상의 낮은 BCMA 표면 발현은 종양 세포의 표면 상에 존재하는 BCMA에 대한 부적절한 결합으로 인해 치료제의 효능을 제한하고 막을 수 있다. 항체, 항체 약물 접합체 또는 키메라 항원 수용체 T 세포로 표적화된 종양 세포(예: CD19, CD20)에서 다른 표적 분자의 수준이 낮으면 이러한 치료법의 효능을 제한하고 낮은 수준의 표적 분자를 발현하는 암세포의 제거를 피하게할 수 있는 것으로 나타났다. BCMA의 경우, 분자의 짧은 세포 외 부분은 세포 표면에서 절단되고 단백질 절단에 관여하는 막-국소 세포 효소인 감마-세크레타제(γ-세크레타제)의 작용을 통해 제거된다. 이 절단은 분자를 발현하는 골수종 암 세포와 같은 세포에서 BCMA의 밀도를 낮추고 특정 자가면역 질환(예: 전신성 홍반성 루푸스) 및 암(예: 다발성 골수종)을 가진 환자의 혈청에서 가용성 BCMA(sBCMA)의 수준 상승을 초래한다.
현재, 면역요법 분야에서 자가면역 질환 및 암을 보다 효과적으로 치료하기 위한 대안적이거나 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
도 1A-1P는 본 개시의 예시적인 키메라 항원 수용체(CAR) 분자의 설계 및 기능성 시험을 나타낸다.
(A) A7D12.2 항체("A7") 또는 C11D5.3 항체("C11")로부터 유래된 BCMA 특이적 scFv 및 스페이서 영역(IgG4 힌지 영역으로 구성됨)으로 이루어진 세포 외 성분, 소수성 부분(CD28 막관통 도메인으로 구성), 및 CD3ζ 이펙터 도메인과 4-1BB 공-자극 도메인으로 구성된 세포 내 성분을 갖는 전형적인 CAR의 예시. scFv는 VL 영역의 N 말단에 연결된 VH 영역("HL" 배향)("G4S" 가변 영역 링커(서열 번호 30))의 C-말단 또는 VH 영역의 N-말단에 연결된 VL 영역("LH" 배향)의 C-말단으로 구성된다.
(B) BCMA-발현 종양 세포에 반응하여 도 1A에 나타낸 CAR을 발현하는 인간 T 세포 및 CAR을 함유하지 않는 대조 T 세포의 증식을 나타내는 유세포 계측법 데이터(카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE) 염색).
(C) 제시된 BCMA-(K562) 또는 BCMA+(K562 BCMA, U266, MM1.S) 종양 세포주와 시험관 내에서 배양했을 때 도 1B에 도시된 CAR로 형질도입된 T 세포에 의한 사이토카인 생산(IFN-γ).
(D) BCMA CAR-T 세포에 의한 제시된 표적 세포주의 특이적 용해.
(E) 스페이서 영역(스페이서+)이 태그 카세트, 링커 모듈, 힌지, 스페이서 아미노산 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있는, 본 개시의 두 가지 예시적인 CAR의 예. CAR이 스페이서 영역에 하나 이상의 태그를 포함하는 경우, 이는 본원에 설명된 바와 같이 T-ChARM으로 칭해진다. 상부 CAR은 세포 외 성분(BCMA 특이적 scFv 및 임의로 태그 또는 링커와 같은 다른 요소를 함유하는 스페이서 영역으로 구성됨), 소수성 부분(CD28 막관통 영역으로 구성됨) 및 세포 내 성분(CD3ζ 이펙터 도메인 및 4-1BB 공-자극 도메인으로 구성됨)을 함유한다. 하부 CAR은 세포 외 성분(BCMA 특이적 scFv 및 임의로 태그 또는 링커와 같은 다른 요소를 함유하는 스페이서 영역으로 구성됨), 소수성 부분(CD28 막관통 영역으로 구성됨) 및 세포 내 성분(CD3ζ 이펙터 도메인 및 CD28 공-자극 도메인으로 구성됨)을 함유한다. BCMA 특이적 CAR/T-ChARM 구조물은 모두 자가 절단 토세아아시그나(Thoseaasigna) 바이러스 2A(T2A) 펩티드 서열에 의해 BCMA 특이적 CAR/T-ChARM 구조물로부터 분리된 절단된 인간 EGFR(EGFRt)을 포함하는 형질도입 유전자 마커를 함유한다. 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A) 및 구제역 바이러스(FMDV) 2A(F2A)와 같은 다른 자가 절단 펩티드도 사용될 수 있다.
(F) 상이한 길이의 스페이서 영역을 갖는 예시적인 CAR/T-ChARM 구조물. sh = 12 아미노산 짧은 스페이서; 2ST = 두 개의 Strep 태그 카세트를 갖는 48 아미노산 스페이서; 3ST = 세 개의 Strep 태그 카세트를 갖는 66 아미노산 스페이서; 2ST Int = 두 개의 Strep 태그 카세트를 갖는 157 아미노산 중간 길이 스페이서; 및 Lo = 228 아미노산 스페이서 긴 스페이서. 짧은 스페이서 및 긴 스페이서는 Strep 태그와 같은 태그 카세트를 임의로 포함할 수 있다.
(G) C11 또는 A7 HL scFv 및 상이한 스페이서 영역을 가지며 임의로 STII 태그를 포함하는 전형적인 CAR/T-ChARM 구조물의 추가 예시.
(H) BCMA 특이적 CAR로 변형된 인간 T 세포가 BCMA를 인식하고 증식하는 능력이, T 세포를 카복시플루오로세인(CFSE)으로 표지하고, CAR-T 세포 또는 형질도입되지 않은 CFSE로 표지된 대조 T 세포를 전장 BCMA(K562/BCMA)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 K562 세포와 배양한 다음, 유세포 분석을 사용하여 각각의 세포 분열을 갖는 CFSE의 희석을 측정함으로써 측정된다. 스페이서 길이가 다른 상이한 BCMA 특이적 CAR을 함유하는 CFSE 표지된 T 세포, 형질도입되지 않은 대조 T 세포(UT)는 아님 [K562/BCMA 세포와 공-배양 후 희석된 CFSE]. 2 ST 이상의 스페이서를 함유하는 CAR T 세포가 짧은 스페이서를 발현하는 CAR-T 세포보다 더 잘 증식되었다.
(I, J) BCMA-발현 U266 및 8266 골수종 세포에 반응하여 상이한 스페이서 길이를 갖는 항-BCMA CAR T 세포에 의한 사이토카인 방출(IFN-γ, I; IL-2, J).
(K) 단리 및 확장 후 항-BCMA C11 T-ChARM 또는 BCMA-2 CAR 구조물로 형질도입된 CD8+ T 세포상의 세포 표면 EGFRt 및 STII 발현.
(L, M) 41BB 공-자극 도메인 또는 CD28 공-자극 도메인을 포함하는 본 개시의 C11 T-ChARM을 발현하도록 조작된 인간 CD4(상부 패널) 및 CD8(하부 패널) T 세포에 의하거나, 또는 이전에 개시된 항-BCMA CAR("BCMA-2"; Carpenter et al., Clin. Cancer Res. 19:2048, 2013 참조)에 의한 사이토카인 방출(IFNγ, L; IL-2, M).
(N) 제시된 BCMA-발현 세포주와 공-배양된 경우 개시된 C11 T-ChARM 또는 BCMA 2 CAR를 발현하도록 조작된 인간 T 세포의 증식.
(O) 제시된 E:T 비에서 본 개시의 C11 T-ChARM(원 = 41BB 공-자극 도메인, 사각형 = CD28 공-자극 도메인) 또는 BCMA-2 CAR(삼각형)을 발현하도록 조작된 CD8 T 세포에 의한 K562 BCMA-음성 세포의 용해.
(P) 다양한 E:T 비(x-축)에서 도 10에 제시된 조작된 CD8 T 세포에 의한, BCMA를 발현하도록 형질도입된 K562 세포의 용해.
도 2A-2Q는 배양 중 다발성 골수종(MM) 세포에 의한 BCMA 및 PD-L1의 생산, 및 항-BCMA T-ChARM-T 세포가 종양 세포를 인식하고 IFNγ를 생산하는 능력에 대한 가용성 BCMA, 표면 결합된 BCMA 및 표면 결합된 PD-L1의 효과를 나타낸다.
(A) U266 골수종 세포를 세척하고 1, 3, 5 및 24 시간 동안 배양 배지에 플레이팅하였다. 배지 상등액을 수거하고 ELISA에 의해 가용성 BCMA에 대해 분석하였다. 데이터는 상등액에서 가용성 BCMA(sBCMA) 수준의 시간 의존적 증가를 보여준다.
(B) ELISA(검정 = 항-BCMA 항체; 회색 라인 = 이소타입 대조군)에 의해 측정된, 기준 MM 세포(RPMI 8226) 또는 고(Pt.1), 중간(Pt.2) 또는 저/음성 발현(Pt.3)을 갖는 예시적인 환자의 원발성 MM 세포에 의한 BCMA 발현을 나타내는 히스토그램.
(C) MM 세포에서 고, 중간 또는 저/음성 BCMA 발현을 갖는 골수종 환자(n = 19)의 비율을 나타내는 차트.
(D) 고(좌측, n = 5) 또는 저(우측, n = 4) BCMA 발현(2:1 E:T에서 24 시간(ELISA))을 갖는 환자 MM 세포로의 자극에 대한 반응으로 항-BCMA C11 T-ChARM+ CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산. 비쌍 양방 T 검정을 사용하여 유의성을 시험하였고, 막대는 평균 IFN-γ 생산 + SEM을 나타낸다.
(E) ELISA로 측정된(대각선 음영 = 항-PD-L1 항체로 염색, 빈 히스토그램 = 이소타입 대조군), 고, 저/음성 또는 중간 PD-L1 발현을 갖는 3 명의 환자로부터의 RPMI 8226 골수종 세포(제일 좌측의 패널) 및 원발성 MM 세포에 의한 PD-L1 발현을 나타내는 막대 그래프.
(F) MM 세포에서 고, 중간 또는 저/음성 PD-L1 발현을 갖는 환자(n = 19)의 비율을 보여주는 차트.
(G) 고(좌측, n = 4) 또는 저(우측, n = 5) PD-L1 발현(2:1 E:T에서 24 시간(ELISA))을 갖는 환자 MM 세포에 대한 반응으로 본 개시의 항-BCMA C11 T-ChARM+ CD8+ 세포에 의한 IFNγ 생산. 비쌍 양방 T 검정을 사용하여 유의성을 시험하였고, 막대는 평균 IFN-γ 생산 + SEM을 나타낸다.
(H) 외인성 가용성 BCMA 존재하에서의 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포에 의한 IFNγ 생산. sBCMA를 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포 및 전장 BCMA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 K562 세포(K562/BCMA+)의 공-배양물에 첨가하였다. 배지 상등액으로의 IFN-γ 방출로 측정된 것으로, BCMA 특이적 T-ChARM T 세포 이펙터 기능의 용량-의존성 억제가 있었다.
(I) K562/BCMA+ 세포를 인식하는 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포에 의한 IFN-γ 생산에 대한 sBCMA의 효과를 보여주는 또 다른 용량-적정 실험 데이터(sBCMA를 배양물에 다른 더 높은 농도(5000 ng/mL)로 첨가한 것을 포함함).
(J) 시험관 내에서 배양된 제시된 MM 세포에 의한 BCMA의 쉐딩.
(K) 저(<2%의 CD138+ 세포) 또는 고(>2% CD138+ 세포) 질환 부담 환자의 골수(BM) 혈청에서 측정한 sBCMA.
(L) 본 개시의 C113ST-ChARM T 세포에 대한 sBCMA 결합. T 세포를 제시된 수준의 재조합 sBCMA(도면의 우측)와 함께 배양한 다음, APC에 접합시킨 BCMA-Fc 융합물로 염색하였다.
(M) 표면 염색(APC-접합 BCMA-Fc 및 항-EGFLR 항체) 및 C113ST T-ChARM 및 FMC63 CAR-T 세포의 CD4 발현을 나타내는 유세포 계측 데이터.
(N) 표적-발현 K562 세포와 공-배양하고 BCMA-Fc 융합 단백질 투여 시(좌측 패널: 0 ng/ml BCMA-Fc, 우측 패널: 1000 ng/ml BCMA-Fc), 본 개시의 C113ST-ChARM("C113ST") 또는 대조 항-CD19 CAR("FMC632")를 발현하는 T 세포에 의한 IFN-γ 생산(y-축) 및 CD4 발현(x-축)을 나타내는 유세포 계측 데이터.
(O) 외인성 재조합 BCMA(BCMA-Fc 융합)의 존재 또는 부재하에서, 제시된 표적 세포주에 반응하여 CAR T 세포에 의한 IFNγ 방출을 나타내는 용량 적정. FMC63(항-CD19) 대 K562 CD19+(대조군; 하향면 삼각형); C113ST T-ChARM T 세포 대 RPMI 8226(상향면 삼각형), U266(사각형) 및 K562 BCMA+ 세포(원). 데이터는 2 가지 독립적인 실험을 대표한다. 막대는 평균 + SEM을 나타낸다. P-값 = <0.05, 사후 검정을 통한 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 결정됨. MFI = 평균 형광 강도.
(P) 제시된 항원-발현 세포와 공-배양 및 BCMA-Fc(x-축)의 존재 또는 부재시에 도 2O에 나타낸 T 세포에 의한 IFN-γ 생산(정규화된 평균 형광 세기, MFI).
(Q) 10:1의 E:T 비에서 4 시간 CRA에 의해 분석된 것으로, 다양한 농도의 재조합 BCMA에서 K562 BCMA+ 표적 세포에 대한 CD8+ C113ST T-ChARM T 세포 및 K562 CD18+ 표적 세포에 대한 FMC63 CAR-T 세포의 세포 용해 활성. 데이터는 2 가지 독립적인 실험을 대표한다. 막대는 평균 + SEM을 나타낸다. P-값 = <0.05, 사후 검정을 통한 일원 분산 분석에 의해 결정됨. MFI = 평균 형광 강도.
도 3A-3R은 골수종 세포주 또는 원발성 골수종 세포상의 세포 표면 BCMA 및 다른 세포 표면 분자의 수준에 대한 γ-세크레타제 억제제(GSI) RO4929097의 효과를 나타낸다.
(A) 세포 표면 BCMA는 0 μM(DMSO 대조군) 내지 1.0 μM의 농도 범위에서 GSI RO4929097과 함께 골수종 세포주의 배양 전, 및 5 시간 후에(다이아그램 참조), 항-BCMA 모노클로날 항체를 사용하여 유세포 계측에 의해 4 개의 골수종 세포주(8226, U266B1, MM1.R, H929)에서 측정하였다.
(B) 제시된 농도의 RO4929097과 배양된 MM.1R 세포에 의한 표면 BCMA 발현; 이소타입 대조군(회색 라인)에 대해 항-BCMA 항체(검은색 라인)로 염색.
(C) 제시된 농도의 RO4929097과 배양했을 때 MM 세포주에 의한 표면 BCMA 발현의 배수 변화; 동일 라인의 비처리 MM 세포에 대해 표시된 배수 변화.
(D) 1 μm의 RO4929097과 배양 시 제시된 MM 세포에 의한 경시적 표면 BCMA 발현의 배수 변화 키네틱스.
(E) U266 골수종 세포를 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM, 0.1 μM 및 1.0 μM)의 존재하에 1, 3, 5 및 24 시간 동안 배양하고 유세포 계측법에 의해 표면 BCMA 발현을 평가하였다. BCMA 발현은 GSI의 존재하에서 용량 의존적으로 증가하여 노출 5 시간 후에 최대 증가가 관찰되었다.
(F) 1 μM GSI에서 배양한 세포주(MM1R = 삼각형, U266 = 사각형, 8226 = 원형)에서 표면 BCMA 발현의 경시적 배수 변화. GSI는 2 일마다 배지 반 교체로 재투여되었다. BCMA의 배수 변화는 처리군(MFIBCMA-MFIiso)/대조군(MFIBCMA-MFIiso)으로 정의된다. 데이터는 적어도 2 개의 독립적인 실험을 대표한다.
(G, H) 제시된 농도의 RO4929097 존재하에 배양된 MM 세포주 세포에서 sBCMA의 배양 상등액 농도.
(I) U266 골수종 세포를 세척하고 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM, 0.1 μM 및 1.0 μM)의 존재하에 배양 배지에 플레이팅하였다. 배양 상등액을 1, 3, 5 및 24 시간 후에 수거하고 ELISA에 의해 가용성 BCMA(sBCMA)를 분석하였다. 데이터는 GSI가 적어도 약 0.01 μM의 농도로 존재할 때 종양 세포로부터 상등액으로 방출된 BCMA의 양이 경시적으로 감소함을 보여준다.
(J, K) 1 μM GSI가 골수종 세포주 배양물(GSI +/-)에서 제거된 후 다양한 시점에서 지속적으로 존재하는 GSI(GSI +/+)와의 배양과 비교한 BCMA 발현(J) 및 상등액 sBCMA 농도(K)의 배수 변화.
(L) 1 μM GSI에서 배양된 세포주의 요오드화프로피듐 염색법으로 측정한 제시된 MM-발현 세포의 생존성.
(M) 제시된 농도의 R04929097과 배양된 원발성 환자 MM 세포에 의한 표면 BCMA 발현. 염색은 도 3B와 관련하여 기술되었다.
(N) 4 시간 동안 다양한 양의 GSI와 배양된 원발성 골수종 세포(n=7)에서 BCMA의 배수 변화. 원발성 세포주를 0.5×106 세포/mL로 배양하였다. BCMA의 배수 변화는 처리군(MFIBCMA-MFIiso)/대조군(MFIBCMA-MFIiso)으로 정의된다. 데이터는 상이한 공여자로부터 유래된 T 세포를 이용한 3 가지 독립적인 실험을 대표한다.
(O, P) 다양한 농도의 GSI와 원발성 골수종 세포를 4 시간 동안 공-배양해도 CS1, CD86, PD L1, CD80 및 CD38을 포함한 종양 세포의 여러 다른 세포 표면 분자의 수준에는 영향을 미치지 않는다.
(Q) 배양 배지에서 1 μM GSI의 존재(검은색) 또는 부재(회색) 하에 MM1R 세포에서 다양한 표면 마커의 염색. 이소타입 염색은 오픈 플롯으로 표시된다.
(R) CD138+ 원발성 골수종 세포를 환자의 골수 샘플로부터 농축시키고, 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM 내지 10 μM)의 존재하에 3 시간 동안 배양한 후, 유세포 계측법에 의해 표면 BCMA 발현을 평가하였다. 종양 세포에서의 BCMA 평균 형광 강도(MFI)는 RO429097 없이 배양된 종양 세포에서 관찰된 것보다 증가된 배수로 제시된다. BCMA의 용량 의존적 상향 조절이 관찰되었다.
도 4A-4C는 골수종 세포를 GSI로 전처리한 경우 BCMA 특이적 CAR T 세포에 의한 원발성 골수종 세포의 인식 후 사이토카인 방출이 증가함을 보여준다.
(A) 24 시간 동안 단독으로 또는 다양한 농도의 GSI RO429097(0.003 μM 내지 3.0 μM)과 함께 원발성 인간 골수종 종양과 공-배양된 BCMA CAR-T 세포(BCMA 특이적 T-ChARM C11 3ST-CD28 및 BCMA 특이적 T-ChARM C11 3ST-41BB) 또는 대조 CD19sh CAR(짧은 스페이서)-T 세포에 의한 IL-2 생산.
(B) 다양한 농도의 RO429097에서 골수종 세포와 공-배양된 BMCA T-ChARM T 세포에 의한 IFN-γ 생산.
(C) CFSE 표지된 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포의 증식은 단독 배지 또는 제시된 농도로 GSI RO492097을 함유하는 배지에서 원발성 인간 골수종 종양 세포와 3 일간 공-배양 후 용량 의존적으로 증가하였다.
도 5A-5R은 CAR-T 세포 생존성, 성장 및 기능적 활성에 대한 다양한 농도의 GSI의 효과를 나타낸다.
(A) ±12-16 시간 동안 GSI의 존재 또는 부재하에 배양된 K562 CD19+ 및 Raji 세포의 CD19 염색. 이소타입 대조군은 회색 라인으로 표시된다.
(B) 원발성 인간 T 세포를 0.01 μM 내지 100 μM 범위 농도의 GSI RO4929097에서 배양하고, 생존성을 24 시간 후에 트립판 블루 염색 배제에 의해 측정하였다. 어떤 농도에서도 GSI가 T 세포 생존성에 미치는 영향은 없었다.
(C) CD19 CAR-T 세포를 다양한 농도의 RO4929097을 함유하는 배지에서 K562/CD19 표적 세포와 공-배양하였다. RO4929097은 IL-2(상부 패널) 및 IFNγ(하부 패널) 생산을 측정하여 결정하였을 때, 공-배양시 ≥3 μM 농도에서 CD19 CAR-T 세포 이펙터 기능을 억제한다. 박스는 CAR T 세포 이펙터 기능을 억제하지 않는 약물의 관련 치료창을 보여준다.
(D) 증가 농도의 GSI RO4929097의 존재하에 표적 세포와 배양된 CD19 CAR-T 세포에 의한 IL-2 생산.
(E) 증가 농도의 GSI RO4929097의 존재하에서 표적 세포("K562 CD19") 또는 대조 세포("K562 BCMA")와 배양된 CD19 CAR-T 세포에 의한 IL-2 생산. 세포에 제시된 양의 GSI를 투여한 다음 세척하거나(빈 막대) 세척하지 않았다(채워진 막대).
(F) 다양한 농도의 GSI와 예비-배양한 후 K562 BCMA+ 또는 K562 CD19+ 세포와 함께 하룻밤 공-배양한 다음 CD19 CAR-T 세포에 의한 IL-2 생산을 나타내는 또 다른 실험 데이터. 세척 후, GSI를 다시 첨가하거나 (+/+), 공-배양에서 제외시켜 (+/-) 사이토카인 생산의 가역성을 평가하였다.
(G) GSI RO4929097의 존재하에 제시된 표적 또는 대조군 세포의 CD19 CAR-T 세포에 의한 특이적 용해.
(H) GSI의 존재 또는 부재하에 CD19-발현 표적 세포, 또는 GSI 부재하에 대조군 세포와 함께 배양된 CD19 CAR-T 세포의 증식. 세포를 CFSE로 염색하고 유세포 계측법으로 증식을 측정하였다.
(I) 제시된 농도의 GSI RO4929097의 존재하에 CD19 CAR-T 세포의 세포 분열 수를 그래프로 표현. 수평 막대의 폭은 실험 과정 동안 제시된 세대 수(즉, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0 세대)로 분열된 배양시의 CAR-T 세포의 비율을 나타낸다.
(J) GSI 부재(원) 또는 0.5 μM(사각형) 또는 5 μM(삼각형)의 GSI의 존재시 외인성 IL-2 및 CD19+ TM LCL 세포로 CD19 특이적 CAR-T 세포를 확장하는 동안의 세포 수(CD8 염색).
(K) CD19 특이적 CAR-T 세포(CD4:CD8(1:1))의 세포 수는 외인성 IL-2의 첨가없이 제시된 GSI의 부재 또는 존재하에 CD19+ TM LCL 세포로 확장되었다.
(L) K562 세포(항원 없음), K562 CD19+ 세포 또는 Raji 세포로 재자극한 후 GSI-확장된 항-CD19 CAR CD8+ T 세포의 상등액에서 IFN-γ 농도.
(M, N) GSI의 부재 또는 0.5 μM 또는 5 μM GSI의 존재하에 제시된 세포주로 재자극 후 CD4:CD8 항-CD19 CAR-T 세포 혼합물에 의한 IFN-γ(M) 및 IL-2(N)의 생산.
(O) GSI RO4929097의 부재(0 μM, 좌측 패널) 또는 존재(1 μM, 오른쪽 패널) 하에 2 명의 환자로부터 원발성 MM 세포와 배양된 본 개시의 T-ChARM T 세포에 의한 IFN-γ 생산(y-축) 및 CD8 발현(x-축)을 나타내는 세포 내 염색.
(P) 제시된 농도의 RO4929097(x-축)의 존재하에 원발성 MM 세포와 배양된 본 개시의 T-ChARM T 세포에 의한 IFN-γ 생산(기하 평균 형광 강도(gMFI)).
(Q) 제시된 농도의 RO4929097(x-축)의 존재하에 원발성 MM 세포와 배양된 본 개시의 T-ChARM T 세포에 의한 IFN-γ 생산(정규화된 MFI; y-축).
(R) 비처리(회색 음영) 또는 1.0 μM GSI RO4929097로 처리된 원발성 MM 세포의 존재하에서 본 개시의 T-ChARM T 세포의 증식.
도 6A-6C는 다발성 골수종의 전임상 시험관 내 모델에서 BCMA 발현에 대한 GSI RO4929097의 효과를 나타낸다.
(A) 파종된 이종이식 뮤린 골수종 모델에 대한 실험 계획. 종양 이식을 용이하게 하기 위해 NSG 마우스를 조사(275 rad)하고 인간 MM 종양 세포(5×106 MM.1R)를 투여한 후 GSI 처리(30 mg/kg)를 하였다. 이어서, 생체 내에서 GSI가 골수종 세포에 BCMA 발현을 상향조절 하는지를 결정하기 위해 마우스를 안락사시키고 혈액 및 BM 샘플을 채취하였다.
(B) 이차 GSI 투여 후 제시된 시점에서 안락사시킨 마우스에서 골수종 세포에 대한 표면 BCMA 발현의 배수 변화.
(C) RO4929097 투여 후 제시된 시점에서 희생시킨 마우스의 혈청에서 sBCMA의 수준.
도 7A-7E는 전임상 마우스 MM 모델에서 항-BCMA CAR T 세포 요법에 대한 GSI RO4929097의 효과를 나타낸다.
(A) 마우스를 방사선처리한 후 인간 MM 종양 세포(5×106 MM.1R 발현 반딧불이 루시퍼라제)를 투여한 실험 계획. 그 후 20 일째에, 마우스에게 제시된 시점에 GSI(30 ㎎/㎏)를, 그리고 0 일째에 단일 최적 아래량의 항-BCMA T-ChARM T 세포(0.33×106 세포, 1:1 CD4:CD8)를 투여하였다. 생물발광(BLI) 이미징 및 생존성을 전반적으로 모니터링하였다.
(B) C113ST T-ChARM T 세포(0 mg/kg 0.33×106 세포, 1:1 CD4:CD8, 좌측 패널, 30 mg/kg, 중앙 패널) 또는 대조군 FM63 항-CD19 CAR T 세포(0.33×106 세포, 1:1 CD4:CD8, 30 mg/kg, 우측 패널)로 처리한 후 2 일, 17 일 및 16 일에 촬영한 마우스의 BLI 이미지.
(C) 도 8B에 도시된 BLI로부터 정량화된 발광 데이터.
(D) T-ChARM T 세포 투여 후 도 8B에 나타낸 마우스의 생존율 퍼센트.
(E) (좌측) 도 8B에 도시된 BLI로부터 정량화된 발광 데이터; (우측) T-ChARM T 세포의 투여 후 마우스의 생존율 퍼센트.
도 8은 GSI의 존재 또는 부재하에 BCMA에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 융합 분자에 의한 H929 MM 세포에의 결합의 유세포 계측 분석을 도시한다. BCMA를 표적으로 하지 않는 대조 이중특이성 융합 분자도 또한 시험하였다.
상세한 설명
본 개시는 가용성 형태 또는 세포독성 또는 다른 세포 상에 발현되는 B 세포 성숙 항원(BCMA) 특이적 결합 단백질 및 γ-세크레타제 억제제(GSI)의 조합 사용을 통해 자가면역 질환 및 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 BCMA 특이적 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 양자 면역요법에서 사용하기 위한 변형된 숙주 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 생성시키는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본원의 개시는 GSI와 조합하여 치료를 요하는 대상에서 그러한 치료법을 사용하는 것에 관한 것이며, 후자의 치료는 양자 면역요법(즉, 세포 표면상에 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 변형된 면역 세포로의 면역요법)에 앞서, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 또한, 특정 구체예에서 세포독성 약물에 접합되거나 그렇지 않으면 커플링되어 예를 들어 항체-약물 접합체(ADC)를 형성할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 BCMA 특이적 결합 단백질과 함께 GSI를 투여하는 것을 포함하는 면역요법 방법이 제공된다. 유용한 치료 용도로는 BCMA 양성 세포가 병원성인 대상에서 증식성 질환 또는 장애(예: 암), 자가면역 질환 또는 노화 관련 질환 또는 장애의 치료가 포함된다.
본 발명을 보다 상세히 기재하기에 앞서, 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본원의 이해에 유용할 수 있다. 추가 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 기재되어 있다
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값과, 적절하다면 그의 분수(예컨대, 정수의 10분의 1과 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 폴리머 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 "약"이란 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "하나"("a", "an")란 용어는 열거된 성분의 "하나 또는 그 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, " 또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 그의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "구성하다"는 동의적으로 사용되고, 그의 용어 및 변형태는 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
또한, 개별 화합물, 또는 화합물의 군은 본원에 기술된 구조와 치환체의 다양한 조합으로부터 유도되며 본원에 의해 각각의 화합물 또는 화합물의 군이 개별적으로 열거된 것과 동일한 범위로 기술된 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 치환체의 선택은 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "기본적으로 이루어지는"이란 특정된 재료 또는 단계, 또는 청구된 발명의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 청구범위를 제한한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역, 모듈 또는 카세트(예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈, 태그 카세트) 또는 (하나 이상의 도메인들, 영역들, 모듈들 또는 카세트들을 가질 수 있는) 단백질은 도메인, 영역, 모듈, 카세트 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈, 카세트 또는 단백질 길이의 최대 최대 20%(예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들), 카세트(들) 또는 단백질의 활성(예를 들어, 결합 단백질 또는 태그 카세트의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 (즉, 50%를 초과하여 활성을 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 그의 조합(예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "기본적으로 이루어진다".
본원에 사용된 "증식성 장애"는 정상 세포 또는 병에 걸리지 않은 세포와 비교하여 과도하거나, 또 달리는 비정상적인 성장 또는 증식을 지칭한다. 과도하거나 비정상적인 성장은 예를 들어 고유 조직(예: 골수 내 형질세포종 성장) 내에서 빠르게 발생하거나(과다 증식) 또는 시간이 지남에 따라 서서히 또는 점진적으로 발생(예: 다발성 골수종)할 수 있는 무조절 성장 또는 증식뿐만 아니라, 병에 걸린 세포가 아닌 원위 조직 또는 신체 부위 내로 확산/성장을 포함할 수 있다. 예시적인 증식성 질환은 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전 악성 세포뿐만 아니라 비-신생물성 또는 비-악성 증식성 장애(예를 들어, 선종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 혈관종, 섬유증, 재협착), 또는 자가면역 질환(예: 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선, 염증성 장 질환 등)을 포함한다.
본원에서 사용된 "결합 단백질"("결합 도메인", "결합 영역" 또는 "결합 모이어티"라고도 칭함)은 표적 분자(예를 들어, BCMA)와 특이적이고 비공유적으로 연합하거나 통합하거나 조합하는 능력을 갖는 분자, 예컨대 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은 관심 있는 생물학적 분자, 화합물 또는 다른 표적에 대한 자연발생, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생산된 결합 파트너를 포함한다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 기능적 결합 도메인 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 면역글로불린 또는 면역글로불린 유사 분자로부터 유래된 것이다. 예시적인 결합 단백질은 단일 사슬 항체 가변 영역(예: 도메인 항체, sFv, scFv, Fab), BCMA 리간드(예: BAFF, APRIL 및 그의 결합 단편), T 세포 수용체(TCR)의 항원-결합 영역, 예컨대 단일 사슬 TCR(scTCR), 또는 생물학적 분자에 결합하는 특정 능력을 위해 선택된 합성 폴리펩티드를 포함한다.
본 원에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 샘플 내 다른 분자 또는 성분과 의미있게 연합(association) 또는 통합(union) 없이, 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M을 단위로 하는 특정 결합 상호작용의 평형 연합상수)로 결합 도메인 또는 그의 융합 단백질이 표적 분자에 연합 또는 통합하는 것을 지칭한다. 결합 도메인(또는 그의 융합 단백질)은 "고친화도" 결합 도메인(또는 그의 융합 단백질) 또는 "저친화도" 결합 도메인(또는 그의 융합 단백질)으로 분류할 수 있다. "고친화도" 결합 도메인이란 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 또는 적어도 1013 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. "저친화도" 결합 도메인이란 최대 107 M-1, 최대 106 M-1, 최대 105 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 선택적으로, 친화도는 M을 단위로 하는 특정 결합 상호작용의 평형해리상수(Kd)로 정의될 수 있다(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M). 특정 구체예에서, 결합 도메인은 "강화된 친화도"를 가질 수 있으며, 이것은 야생형(또는 모체(parent)) 결합 도메인보다 표적 항원에 더 강한 결합을 갖는 선택 또는 조작된 결합 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 강화된 친화도는 야생형 결합 도메인보다 더 높은 표적 항원에 대한 Ka(평형연합상수), 또는 야생형 결합 도메인보다 더 낮은 표적 항원에 대한 Kd(해리상수), 또는 야생형 결합 도메인의 오프율(off-rate)(Koff) 보다 낮은 표적 항원에 대한 오프율 때문일 수 있다. 결합 도메인 또는 융합 단백질 친화도를 결정하는 것 뿐만 아니라 특이적으로 특정 표적을 결합하는 본 발명의 결합 도메인을 동정하는 다양한 어세이들, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 및 Biacore® 분석이 알려져 있다(예를 들어, Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호, 등 참조).
본원에서 사용된 "이종" 또는 "비내인성(non-endogenous)" 또는 "외인성"이란 숙주 세포 또는 대상에 고유하지 않은 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭하거나, 숙주 또는 숙주 세포에 고유하지만 구조, 활성 또는 둘 다가 원래 분자와 돌연변이된 분자 간에 상이한 정도로 변경되거나 돌연변이된 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성이다. 특정 구체예에서, 이종, 비내인성 또는 외인성 분자(예를 들어, 수용체, 리간드)는 숙주 세포 또는 대상에 대해 내인성이 아닐 수 있으나, 이러한 분자들을 인코딩하는 핵산 대신 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있고, 여기서 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈 내에 통합되거나 염색체외 유전 물질(예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자기복제 벡터)로서 존재할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "동족체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 유도된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 또는 외인성 분자 또는 이 분자를 인코딩하는 유전자는 고유 숙주 또는 숙주 세포 분자 또는 이 분자를 인코딩하는 유전자 각각에 상동성일 수 있으나, 변형된 구조, 서열, 발현 수준 또는 그의 조합을 가질 수 있다. 비내인성 분자는 동일한 종, 상이한 종 또는 그의 조합에서 유래할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "내인성" 또는 "고유한"이란 숙주 또는 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본원에서 사용된 "태그 카세트"란 관심 있는 단백질의 일부이거나, 여기에 부착되거나 융합된 독특한 펩티드 서열을 지칭하며, 여기서 이종 또는 비내인성 동족(cognate) 결합 분자(예를 들어, 수용체, 리간드, 항체, 또는 다른 결합 파트너)는 결합 특성을 사용하여 태그된 단백질 또는 태그된 단백질을 발현하는 세포를 검출, 동정, 단리 또는 정제, 트랙킹, 강화 또는 표적화할 수 있는 경우, 특히 태그된 단백질이 단백질 또는 다른 물질의 이종 집단의 일부일 때, 또는 태그된 단백질을 발현하는 세포가 세포의 이종 집단의 일부일 때(예를 들어, 말초혈액 같은 생물학적 샘플) 그에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 태그된 단백질을 발현하는 세포는 이종 또는 비내인성 동족 결합 분자와 접촉하여 생물학적 반응, 예컨대 세포 활성화 촉진, 세포 증식 또는 세포 사멸을 유도할 수 있다. 제공된 융합 단백질에서, 동족 결합 분자(들)에 의해 특이적으로 결합될 태그 카세트(들)의 능력은 결합 도메인(들)이 표적 분자(들)에 특이적으로 결합하는 능력과 별개의 것이거나 그 능력에 추가된다. 태그 카세트는 일반적으로 항원 결합 분자가 아니며, 예를 들어 항체 또는 TCR 또는 그의 항원 결합 부분이 아니다.
본원에서 사용된 "힌지 영역" 또는 "힌지"란 (a) (예를 들어, 상위 및 코어 영역으로 구성된) 면역글로불린 힌지 서열 또는 그의 기능성 단편 또는 변이체, (b) 타입 II C-렉틴 도메인 간(스토크(stalk)) 영역 또는 그의 기능성 단편 또는 변이체, 또는 (c) 클러스터의 분화 (CD) 분자 스토크 영역 또는 그의 기능성 변이체를 지칭한다. 본원에서 사용된 "야생형 면역글로불린 힌지 영역"이란 항체의 중쇄에서 발견되는 CH1 및 CH3 도메인(IgE 및 IgM의 경우) 사이에 위치하여 연결하거나 CH1과 CH2 도메인(IgG, IgA, 및 IgD의 경우) 사이에 위치하여 연결하는 자연적으로 발생한 상위 및 중간 힌지 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 구체예에서, 힌지 영역은 인간이고, 특정 구체예에서는 인간 IgG 힌지 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 "스페이서 영역"은 융합 단백질에서 2 이상의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 도메인, 영역, 모듈, 카세트, 모티프 또는 이들의 조합을 연결하는 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 도메인, 영역, 모듈, 카세트, 모티프 또는 이들의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 스페이서 영역은 2개의 단일 사슬 융합 단백질의 상호작용 또는 하나 이상의 결합 도메인의 위치결정을 용이하게 하는 분리 또는 스페이싱 작용을 제공하여 생성된 폴리펩티드 구조가 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도를 유지하거나 신호전달 활성(예를 들어, 이펙터 도메인 활성)을 유지하거나 둘 다 가능하게 한다. 특정 구체예에서, 스페이서 영역은 약 2 내지 최대 약 500 아미노산을 갖는 아미노산 서열인 "링커 모듈"을 포함하고, 이것은 링커로 연결된 2개 영역, 도메인, 모티프, 카세트 또는 모듈 사이의 구조적 이동을 위한 융통성과 공간을 제공할 수 있다. 예시적인 링커 모듈은 GlyxSery(서열번호 31)의 1 내지 약 10 반복체(여기서 x 및 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y는 둘 다 0은 아니다)을 갖는 것을 포함한다(예를 들어, (Gly4Ser)2(서열번호 32), (Gly3Ser)2(서열번호 33), Gly2Ser, 또는 이들의 조합, 예컨대 (Gly3Ser)2Gly2Ser(서열번호 34)). 특정한 다른 구체예에서, 스페이서 영역은 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 예컨대 CH3 단독 또는 CH2CH3를 포함하는 링커 모듈을 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 스페이서 영역은 힌지 영역 또는 태그 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 각각의 연결은 상호 배타적이지 않다. 예를 들어, 스페이서 영역은 힌지 및 하나 이상의 링커 모듈을 포함하거나, 스페이서 영역은 힌지, 하나 이상의 링커 모듈, 및 하나 이상의 태그 카세트를 포함할 수 있다. 예시적인 스페이서 영역은 길이로, 예를 들어 약 5 내지 약 500 아미노산, 또는 약 10 내지 약 350 아미노산, 또는 약 15 내지 약 100 아미노산, 또는 약 20 내지 약 75 아미노산, 또는 약 25 내지 약 35 아미노산까지 변화할 수 있다. 예시적인 짧은 스페이서는 약 5 내지 약 100 아미노산(예: 12 아미노산, 15　아미노산, 48 아미노산, 50 아미노산, 66 아미노산, 70 아미노산)의 범위이고, 중간 스페이서는 약 100 내지 약 200 아미노산(예: 110 아미노산, 120 아미노산, 130 아미노산, 140 아미노산, 150 아미노산, 157 아미노산, 175 아미노산)의 범위이며, 긴 스페이서는 약 200 내지 약 500 아미노산(예: 200　아미노산, 210 아미노산, 220 아미노산, 228 아미노산, 230 아미노산, 250 아미노산, 300 아미노산, 350 아미노산, 400 아미노산, 450 아미노산)의 범위이다.
본원에서 사용된 "소수성 부분"은 세포막에서 열역학적으로 안정하고 일반적으로 길이가 약 15 아미노산 내지 약 30 아미노산 범위인 3차원 구조의 임의의 아미노산 서열을 의미한다. 소수성 도메인의 구조는 알파 나선(helix), 베타 통형(barrel), 베타 시트, 베타 나선, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "이펙터 도메인"은 적절한 신호를 수용할 때 세포 내의 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 수용체 또는 융합 단백질의 세포내 부분이다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 결합할 때 신호를 수용하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부이거나, 표적 분자에 직접 결합하며, 이것은 이펙터 도메인으로부터 신호를 촉발한다. 이펙터 도메인이 하나 이상의 신호전달 도메인 또는 모티프, 예컨대 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 경우 이펙터 도메인은 세포 반응을 직접 촉진할 수 있고 이같은 세포의 반응은 공-자극 도메인 또는 그의 기능성 부분으로 보조되거나 향상될 수 있다. 이펙터 도메인을 가지는 예시적인 단백질은 CD3ζ이다. 다른 구체예에서, 이펙터 도메인은 직접적으로 세포 반응을 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 연합하여 세포 반응을 간접적으로 촉진할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "공-자극 도메인"은 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 CD3ζ 사슬에 의해 제공된 일차(이펙터) 신호 외에 활성화, 증식, 분화, 사이토카인 분비 등을 포함하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 T 세포에 제공하는 신호전달 부분을 지칭한다. 특정 구체예에서, 세포 내 성분은 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, 공-자극 도메인 또는 그의 기능성 부분, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
"가변 영역 링커"는 구체적으로 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 경쇄 면역글로불린 가변 영역에 연결하거나, T 세포 수용체 Vα /β 및 Cα /β 사슬(예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ)을 연결하거나 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍 각각을 힌지 또는 소수성 도메인에 연결하는 5 내지 약 35 아미노산 서열을 지칭하며, 이것은 생성된 단일 사슬 폴리펩티드가 항체 또는 T 세포 수용체와 동일한 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 보유하도록 2개 서브-결합 도메인의 상호작용에 충분한 스페이서 작용 및 유연성을 제공한다. 특정 구체예에서, 가변 영역 링커는 약 10 내지 약 30 아미노산 또는 약 15 내지 약 25 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 가변 영역 링커 펩티드는 GlyxSery의 1 내지 10 반복체(여기서 x 및 y는 독립적으로 1 내지 5의 정수이다)을 포함하고(예를 들어, Gly4Ser(서열번호 1), Gly3Ser(서열번호 2), Gly2Ser, 또는 (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(서열번호 3), (Gly3Ser)n(Gly2Ser)n(서열번호 4) 또는 (Gly4Ser)n(서열번호 5), 여기서 n은 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수이다), 연결된 가변 영역은 기능성 면역글로불린 유사 결합 도메인을 형성한다(예를 들어, scFv, scTCR).
"접합(junction) 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 2개의 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이, 예컨대 결합 도메인과 인접 링커 영역 사이 또는 소수성 도메인과 인접 이펙터 도메인 또는 2개의 모티프, 영역 또는 도메인을 연결하는 링커 영역의 하나의 말단 또는 양 말단의 사이(예를 들어, 링커와 인접 결합 도메인 사이 및/또는 링커와 인접 힌지 사이)의 하나 이상(예를 들어, 약 2-20)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질(예를 들어, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위를 사용하여 얻어지는 아미노산 잔기)의 작제 디자인으로부터 얻어질 수 있다.
항체 기술 분야의 업자들에 의해 이해되는 용어는 본원에서 달리 표현하여 정의되지 않는 한, 당 업계에서 도입한 의미가 각각 제공된다. 용어 "항체"란 디설파이드 결합으로 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 포함하는 온전한 항체, 및 표적 분자와 결합하는 능력을 갖거나 유지하는 온전한 항체의 항원 결합 부분을 지칭한다. 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위는 비인간, 키메라, 인간화되거나, 인간, 바람직하게 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로불린 구조 및 기능은, 예를 들어 Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에서 참조할 수 있다.
예를 들어, 용어 "VL" 및 "VH"는 항체 경쇄 및 중쇄 각각에서 유래한 가변 결합 영역을 지칭한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "프레임워크 영역"(FR)으로 알려진 별개의, 잘 규정된 서브영역으로 구성된다. 용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 지칭하며, 이것은 항체 이소타입에 따라 CH1, CH2, 및 CH3(IgA, IgD, IgG), 또는 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인(IgE, IgM)으로 다시 나눌 수 있다. "Fab"(단편 항원 결합)는 항원에 결합하는 항체 일부이고, 사슬간 디설파이드 결합을 통해 경쇄와 연결된 중쇄의 CH1 및 가변 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 "Fc 영역 부분"은 항체에서 유래한 Fc 단편의 중쇄 불변 영역 세그먼트("분획 결정화가능" 영역 또는 Fc 영역)를 지칭하고, 이것은 하나 이상의 불변 도메인, 예컨대 CH2, CH3, CH4, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, Fc 영역 부분은 IgG, IgA, 또는 IgD 항체 또는 이들의 조합의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 IgM 또는 IgE 항체 및 이들의 조합의 CH3 및 CH4 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, CH2CH3 또는 CH3CH4 구조물은 동일한 항체 이소타입으로부터의 서브영역 도메인을 갖고, 인간, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM(예를 들어, 인간 IgG1 유래의 CH2CH3)이다. 이를 배경으로, Fc 영역은 면역글로불린의 이펙터 기능, 예컨대 ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성), CDC(보체-의존성 세포독성) 및 보체 고정, Fc 수용체(예를 들어, CD16, CD32, FcRn)와의 결합, Fc 영역이 없는 폴리펩티드보다 더 큰 생체 내 반감기, 단백질 A 결합, 및 태반 통과(placental transfer)까지 담당한다(Capon et al., Nature 337:525, 1989 참조). 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질에서 발견된 Fc 영역 부분은 하나 이상의 이러한 이펙터 기능을 매개할 수 있거나, 예를 들어 당 업계에서 알려진 하나 이상의 돌연변이에 의해 이러한 활성의 하나 이상 또는 전부가 없을 것이다.
또한, 항체는 (힌지의 하부 섹션이 Fc 영역의 아미노 말단 부분을 포함할 수 있으나) Fab와 Fc 영역 사이에 전형적으로 위치한 힌지 서열을 갖는다. 이를 배경으로, 면역글로불린 힌지는 가요성 스페이서로 작용하여 Fab 부분이 공간 내에서 자유롭게 움직일 수 있다. 불변 영역에 비하여, 힌지는 구조적으로 다양하여 면역글로불린 부류 사이와 서브클래스 중에서도 서열과 길이가 다르다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지 영역은 자유롭게 휘기 쉬워서, Fab 단편이 그의 대칭축 주위를 회전하고 2개 중쇄간 디설파이드 가교의 처음 중심 스피어 내에서 움직일 수 있다. 그에 비해, 인간 IgG2 힌지는 상대적으로 짧고 4개의 중쇄간 디설파이드 가교에 의해 안정화된 견고한 폴리프롤린 이중나선을 함유하여 가요성을 제한한다. 인간 IgG3 힌지는 그의 독특한 연장된 힌지 영역(IgG1 힌지의 약 4배 길이)에 의해 다른 서브클래스와는 구별되며, 62 아미노산을 함유하고(21 프롤린 및 11 시스테인 함유), 비가요성 폴리프롤린 이중나선을 형성하고 Fab 단편이 비교적 Fc 단편과 멀리 떨어져 있기 때문에 더 큰 가요성을 제공한다. 인간 IgG4 힌지는 IgG1 보다는 짧지만 IgG2와 같은 길이를 가지며, 그의 가요성은 IgG1과 IgG2의 중간이다.
"T 세포 수용체(TCR)"는 CD3와 관련하여 일반적으로 주요 조직적합성(histocompatibility) 복합체(MHC) 분자와 결합된 항원 인식을 담당하는 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된 분자를 지칭한다. TCR은 대부분의 T 세포에서 고도의 가변성 α 및 β 사슬(또한 각각 TCRα와 TCRβ로 알려짐)의 디설파이드 연결된 이종다이머를 갖는다. T 세포의 작은 서브세트에서, TCR은 가변성 γ 및 δ 사슬(또한 각각 TCRγ와 TCRδ로 알려짐)의 이종다이머로 구성된다. TCR의 각 사슬은 면역글로불린 상과의 멤버이고, 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 C-말단의 짧은 세포질 꼬리를 갖는다(Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참조). 본 개시에서 사용된 TCR은 다양한 동물 종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 염소, 말 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다. TCR은 세포 결합(즉, 막관통 영역 또는 도메인을 갖는다) 또는 가용성 형태일 수 있다.
"주요 조직적합성 복합체 분자(MHC 분자)"는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 (3개의 α 도메인을 갖는) α 사슬을 스패닝(spanning)하는 막과 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린으로 이루어진 이종다이머이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질 α와 β로 구성되고, 둘 다 막에 걸쳐 이어진다. 각각의 사슬은 2개의 도메인을 갖는다. MHC 클래스 I 분자는 사이토졸에서 기원하는 펩티드를 세포 표면에 전달하고, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템(vesicular system)에서 기원하는 펩티드를 세포 표면에 전달하고, 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 분자는 다양한 동물 종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다.
"벡터"는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지일 수 있다. "발현 벡터"는 적절한 환경 내에 존재하는 경우 벡터가 운반하는 하나 이상의 유전자로 인코딩된 단백질의 발현을 지정할 수 있는 벡터이다.
"레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로비리다에 과의 속을 지칭한다. 예시적인 감마레트로바이러스는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.
"렌티바이러스"는 분화 및 미분화 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇몇 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스: HIV 유형 1 및 HIV 유형 2 포함); 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다.
"T 세포" 또는 "T 세포 계통의 세포"는 다른 림프구 세포로부터의 세포, 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포를 구별하는 T 세포 또는 그의 전구체 또는 선조체(progenitor)의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징은 T 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현, 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능학적 또는 면역학적 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 이어지는 선조체 또는 전구체 세포; CD25+ 미성숙 및 불활성화된 T 세포; CD4 또는 CD8 계통에 이어지는 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선전구세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCRγδ; 또는 성숙 및 기능성 또는 활성화된 T 세포일 수 있다.
"핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다. 핵산 분자는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있고, 단일가닥이면 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스 가닥) 가닥일 수 있다. 코딩 분자는 당 분야에서 공지된 코딩 서열과 동일한 코딩 서열을 가지거나 상이한 코딩 서열을 가질 수 있고, 이는 유전자 코드의 중복 또는 축퇴의 결과로서, 또는 스플라이싱에 의해 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
"치료하다" 또는 "치료" 또는 "개선하다"는 대상(예를 들어, 인간 또는 비인간 포유동물, 예컨대 영장류, 말, 개, 마우스, 래트)의 질환, 장애 또는 증상의 의학적 관리를 지칭한다. 예를 들어, BCMA 특이적 결합 단백질 또는 본 개시의 γ-세크레타제 억제제(GSI)와 조합하여 사용되는 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포 및 임의로 애쥬번트 또는 전처리 요법을 포함하는 적절한 용량 또는 치료 계획이 치료적 또는 예방적 혜택을 유도하도록 투여된다. 치료적 또는 예방적/방지적 이점은 개선된 임상적 성과; 질환과 관련된 증상의 경감 또는 완화; 증상의 재발 감소; 개선된 삶의 질; 장기 무병 상태; 질환 정도의 약화, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 진정; 생존; 생존 연장 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질(BCMA 특이적 또는 BCMA-표적화 면역요법으로도 지칭됨), γ-세크레타제 억제제, BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포, 또는 γ-세크레타제 억제제를 발현하는 숙주 세포(예를 들어, BCMA 특이적 CAR, 항-γ-세크레타제 항체)의 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 치료되는 질환의 하나 이상의 증상을 통계적으로 유의미한 방식으로 개선시키기에 충분한 화합물 또는 세포의 양을 나타낸다. 단독으로 투여되는, 단일 활성 성분을 발현하는 세포 또는 개별 활성 성분을 지칭할 때, 치료적으로 유효한 용량은 그 성분 또는 그 성분 단독을 발현하는 세포의 효과를 지칭한다. 조합을 지칭할 때, 치료적으로 유효한 용량은 연속, 동반 또는 동시 투여 여부와 상관없이 활성 성분 또는 조합된 보조 활성 성분과 치료 효과로 이어지는 활성 성분을 발현하는 세포의 조합된 양을 지칭한다. 또 다른 조합은 복수의 활성 성분, 예를 들어 2 이상의 상이한 BCMA 특이적 결합 단백질 등을 발현하는 세포일 수 있다.
추가적인 정의가 본 개시 내용 전반에 걸쳐 제공된다.
B 세포 성숙 항원(BCMA) 결합 단백질 또는 분자
특정 양태에서, 본 개시는 치료적 유효량의 BCMA 특이적 결합 단백질(또는 BCMA-표적화 면역치료제) 및 치료적 유효량의 γ-세크레타제 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 갖거나, 이로 의심되는 대상에서 증식성 또는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 예시적인 BCMA 특이적 결합 단백질은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 외 성분 및 세포 내 성분을 포함하는 키메라 항원 수용체이며, 여기서 세포 외 성분은 BCMA 특이적 결합 도메인(예를 들어 BCMA 특이적 scFv, BCMA 리간드 또는 그의 결합 부분, 예컨대 BAFF 또는 APRIL) 및 임의로 스페이서 영역 또는 힌지를 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인 및 임의로 공-자극 도메인을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시는 BCMA 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 표지된 키메라 항원 수용체 분자(T-ChARM)를 포함하는, 증식성 또는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위해 γ-세크레타제 억제제와 함께 사용하기 위한 BCMA 표적화 면역치료제를 제공한다. 특정 구체예에서, BCMA 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 또는 인간화된 것이다.
예시적인 BCMA 특이적 항체는 항체 J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372, 및 pSCHLI373, 및 이들의 항원 결합 부분을 포함한다. 인간화된 버전을 포함하는 BCMA 특이적 항체 및 그의 항원 결합 부분의 다양한 구체예는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2002/066516, WO 2007/062090, WO　2010/104949, WO 2011/108008, WO　2012/163805, WO 2014/068079, WO 2015/166073, WO 2014/122143, WO 2014/089335, WO 2016/090327, 및 WO 2016/079177; Ryan et al., Mol. Cancer. Ther. 6(11):3009, 2007; 및 Abbas et al., Blood 128:1688, 2016에 기재되어 있으며, 여기에서의 BCMA 특이적 항체, 그의 항원-결합 부분 및 인간화 버전은 모두 본원에 참조로서 인용된다. 이들 BCMA 특이적 항체로부터의 가변 도메인 및 scFv 분자는 본원에 언급된 T-ChARM 및 CAR 단백질 중 어느 것에 결합 도메인으로서 사용될 수 있다.
본 개시의 BCMA 특이적 항체로부터 수득되고 본원에 개시된 방법에서 유용한 항원 결합 부위 또는 도메인은 예를 들어 도메인 항체, sFvs, 단일 사슬 Fv 단편(scFvs), Fabs, F(ab')2), 나노바디, 탠덤 scFvs, scFv-Fcs, scFv 다이머, scFv 지퍼, 디아바디, 미니바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab, F(ab)'2, scFab, 미니안티바디, 나노바디, 나노바디-HSA, 이중특이성 T 세포 Engagers(BiTEs), DAR, sc디아바디, sc디아바디-CH3s 또는 scFv-CH3 Knobs-Into-Holes(KIH) 어셈블리를 포함한다.
특정 구체예에서, BCMA 특이적 결합 단백질은 BCMA에 특이적인 제1 결합 영역(예를 들어, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 둘 모두)을 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 항체(또는 그의 항원-결합 부분) 및 제2 표적(예를 들어, 제1 결합 영역의 에피토프 또는 비-BCMA 표적의 에피토프와 상이한 BCMA 에피토프)에 특이적인 적어도 하나의 다른 결합 영역, 또는 예를 들어 BCMA가 아닌 종양 관련 항원(예를 들어, CD19(예: 블리나투모맙, MOR-208, SGN-19A, SAR3419, 콜툭시맙라브탄신, 데니투주맙마포도틴, 타플리투모맙팝톡스, XmAb 5574, MDI-551, Merck 모체 항-CD19 aka B4 aka DI-B4, XmAb 5871, MDX-1342, AFM11), CD20(예: 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙), CD38(예: 다라투무맙 또는 이사툭시맙(SAR650984)), CD45, 또는 면역 이펙터 세포상에 발현되는 세포 표면 단백질, 예컨대 T 세포(예: CD3), NK 세포(예: CD56) 또는 NK-T 세포(예: NK1.1), 또는 다른 비-종양-관련 항원 또는 표적을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시는 γ-세크레타제 억제제(GSI)와 함께 사용하기 위한, 단독으로 또는 세포에서 T-ChARM으로 발현되는 BCMA 특이적 결합 단백질을 제공한다. 예시적인 T-ChARM은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 외 성분 및 세포 내 성분을 포함하며, 여기서 세포 외 성분은 BCMA에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, 임의적인 스페이서 영역, 태그 카세트 및 힌지 영역을 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인 및 임의로 공-자극 도메인(예: 4-1BB로부터의 기능적 도메인 또는 부분, CD28으로부터의 기능적 도메인 또는 부분 또는 둘 다)을 포함한다. 특정 구체예에서, T-ChARM 결합 도메인은 임의로 BCMA 특이적 scFv가 인간 또는 인간화된 것인 BCMA 특이적 scFv, BCMA 특이적 scTCR, 또는 BCMA 리간드 또는 그의 결합 부분(예: BAFF, APRIL)을 포함한다. T-ChARM의 다양한 구체예는 PCT 공개 번호 WO 2015/095895에 개시되어 있으며, 여기의 T-ChARM 스캐폴드는 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
예시적인 태그 카세트는 Strep 태그(원래의 Strep® 태그, Strep® 태그 II, 또는 그의 변형체를 지칭함; 예를 들어, 미국특허 제7,981,632호 참조, Strep 태그는 본 원에 참조로 인용됨), His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Nus 태그, S 태그, SBP 태그, Softag 1, Softag 3, V5 태그, CREB-결합 단백질(CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), 녹색 형광 단백질(GFP), 티오레독신 태그, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 태그 카세트는 최소 킬레이트화 부위(예: HGGHHG, 서열 번호 6)와 같은 유전적으로 조작된 친화성 부위일 수 있다. 특정 구체예에서, 태그 카세트는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 7) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(서열 번호 8)의 아미노산 서열을 가지는 Strep 태그이다.
태그 카세트는 본 개시의 융합 단백질에서 단일 또는 복수 카피로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질은 1, 2, 3, 4 또는 5 태그 카세트(예를 들어, Strep 태그)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, BCMA 특이적 T-ChARM의 세포 외 성분은 1 태그 카세트, 2 태그 카세트, 3 태그 카세트, 4 태그 카세트, 또는 5 태그 카세트를 포함한다. 복수의 태그 카세트는 각각 동일하거나 상이할 수 있다.
특정 구체예에서, 태그 카세트는 약 5 내지 약 500 아미노산, 또는 약 6 내지 약 100 아미노산, 또는 약 7 내지 약 50 아미노산, 또는 약 8 내지 약 20 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 태그 카세트 7 내지 10 아미노산을 가진다. 바람직하게, 태그 카세트는 비면역원성이거나 최소 면역원성이다. 본질적으로 태그 카세트는 핸들 또는 비콘(beacon)으로 작용하여 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 세포의 동정, 강화, 단리, 증식 증진, 활성화, 트래킹, 또는 제거를 허용할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 개시는 소수성 부분에 의해 연결된 세포 외 성분 및 세포 내 성분을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)인 γ-세크레타제 억제제와 함께 사용하기 위한 BCMA 특이적 결합 단백질을 제공하며, 여기서 세포 외 성분은 BCMA에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 힌지를 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인 및 임의로 공-자극 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, CAR 결합 도메인은 BCMA 특이적 scFv, BCMA 특이적 scTCR, BCMA 특이적인 TCR 결합 도메인(예를 들어, Walseng et al., Scientific Reports 7:10713(2017) 참조, 그의 TCR CAR 구조물은 전체가 본원에 참고로 인용된다), 또는 임의로 BCMA 특이적 scFv가 인간 또는 인간화된 것인 BCMA 리간드 또는 그의 결합 부분(예, BAFF, APRIL)을 포함한다. 이들 임의의 구체예에서, CAR의 형태인 BCMA 특이적 결합 단백질은 면역계 세포(예를 들어, T 세포)와 같은 세포의 표면상에 발현될 수 있다.
BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR은 세포-결합(예를 들어, 세포 표면에서 발현)되거나 가용성 형태일 수 있다. 특정 구체예에서, BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 T 세포와 같은 숙주 세포에서 발현을 증진시키거나 최대화하기 위해 코돈 최적화될 수 있다(Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006).
특정 구체예에서, 본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR에 존재하는 힌지는 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 변경된 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 특정 구체예에서, 힌지는 야생형 인간 면역글로불린 힌지 영역이다. 다른 특정한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 아미노- 또는 카복시-말단에 융합 단백질 구조물 디자인의 일부로서 부가할 수 있다. 예를 들어, 1, 2 또는 3 추가 접합 아미노산 잔기가 힌지 아미노-말단 또는 카복시-말단에 존재하거나 힌지가 말단 또는 내부 결실을 함유할 수 있고, 1, 2 또는 3 추가 접합 아미노산 잔기를 다시 첨가한다.
특정 구체예에서, 힌지는 변경된 면역글로불린 힌지이고, 여기서 야생형 면역글로불린 힌지 영역 내의 하나 이상의 시스테인 잔기는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 예시적인 변경된 면역글로불린 힌지는 1, 2 또는 3의 상이한 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 또는 알라닌)로 치환된 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 힌지에서 발견된 1, 2 또는 3 시스테인 잔기를 갖는 면역글로불린 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 힌지 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 힌지 폴리펩티드는 야생형 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대 야생형 인간 IgG1 힌지, 야생형 인간 IgG2 힌지, 또는 야생형 인간 IgG4 힌지와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 일치하는 서열이거나 이 서열을 포함한다.
추가 구체예에서, 본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR에 존재하는 힌지는 면역글로불린 힌지에 기초하지 않거나 그로부터 유도되지 않은 힌지일 수 있다(즉, 야생형 면역글로불린 힌지 또는 변경된 면역글로불린 힌지가 아니다). 이러한 힌지의 예는 약 5 내지 약 150 아미노산의 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 스토크 영역의 펩티드, 예를 들어 약 8 내지 25 아미노산의 펩티드 또는 약 7 내지 약 18 아미노산의 펩티드, 또는 그의 변이체를 포함한다.
타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 "스토크 영역"이란 C-타입 렉틴-유사 도메인(CTLD; 예를 들어, 자연 킬러 세포 수용체의 CTLD와 유사)과 소수성 부분(막관통 도메인) 사이에 위치한 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 세포 외 도메인의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 인간 CD94의 세포외 도메인(GenBank 등록 번호 AAC50291.1)은 아미노산 잔기 34-179에 해당하지만, CTLD는 아미노산 잔기 61-176에 해당하며, 따라서 인간 CD94 분자의 스토크 영역은 아미노산 잔기 34-60을 포함하고, 이것은 소수성 부분(막관통 도메인)과 CTLD 사이에 위치한다(Boyington et al., Immunity 10:15, 1999 참조; 다른 스토크 영역의 설명에 대해서는, 또한 Beavil et al, Proc. Nat'l . Acad. Sci. USA 89:153, 1992; 및 Figdor et al., Nat. Rev. Immunol. 2:11, 2002 참조). 이러한 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자는 또한 스토크 영역과 막관통 영역 또는 CTLD 사이에 접합 아미노산을 가질 수 있다. 다른 예에서, 233 아미노산 인간 NKG2A 단백질(GenBank 등록 번호. P26715.1)은 아미노산 71-93 범위의 소수성 부분(막관통 도메인) 및 아미노산 94-233 범위의 세포외 도메인을 갖는다. CTLD는 아미노산 119-231을 포함하고 스토크 영역은 아미노산 99-116을 포함하며, 이것은 추가적인 접합 아미노산에 의해 플랭킹될 수 있다. 다른 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자뿐만 아니라 그의 세포 외 리간드 결합 도메인, 스토크 영역, 및 CTLD도 당 업계에 공지되어 있다(예를 들어, 인간 CD23, CD69, CD72, NKG2A 및 NKG2D의 서열 및 이들 설명에 대해 각각 GenBank 등록 번호 NP_001993.2; AAH07037.1; NP_001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1 참조).
타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 스토크 영역 힌지의 "유도체", 또는 그의 단편은 약 8 내지 약 150 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 야생형 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 스토크 영역의 1, 2 또는 3 아미노산은 결실, 삽입, 치환, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다. 예를 들어, 유도체는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 스토크 영역의 유도체는 야생형 스토크 영역 서열, 예컨대 NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72, 또는 CD94의 약 8 내지 약 20 아미노산으로부터 유도된 것들과 비교하여 단백질가수분해성 분해에 대해 더 잘 견딘다.
특정 구체예에서, 스토크 영역 힌지는 약 7 내지 약 18 아미노산을 포함할 수 있고, α-나선형 이중 코일(coiled coil) 구조를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 스토크 영역 힌지는 0, 1, 2, 3, 또는 4 시스테인을 함유한다. 예시적인 스토크 영역 힌지는 스토크 영역의 단편, 예컨대 CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D의 스토크 영역으로부터 약 10 내지 약 150 아미노산을 포함하는 그 일부를 포함한다.
본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM 및 CAR에서 사용될 수 있는 대체 힌지는 면역글로불린 V-유사 또는 면역글로불린 C-유사 도메인을 연결하는 세포 표면 수용체(도메인 간 영역)의 일부로부터 유래한다. 세포 표면 수용체가 다중 Ig V-유사 도메인을 탠덤(tandem)으로 함유하는 Ig V-유사 도메인 사이와 세포 표면 수용체가 다중 탠덤 Ig C-유사 영역을 함유하는 Ig C-유사 도메인 사이의 영역 또한 본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM 및 CAR에 유용한 힌지로서 고려된다. 특정 구체예에서, 세포 표면 수용체 도메인 간 영역으로 이루어진 힌지 서열은 자연 발생 또는 첨가된 모티프, 예컨대 하나 이상의 디설파이드 결합을 제공하기 위해 IgG 코어 힌지 서열을 추가로 함유하여 BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR 다이머 형성을 안정화할 수 있다. 힌지의 예는 CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD 166, 또는 CD244의 Ig V-유사 및 Ig C-유사 영역 사이의 도메인 간 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 힌지 서열은 약 5 내지 약 150 아미노산, 약 5 내지 약 10 아미노산, 약 10 내지 약 20 아미노산, 약 20 내지 약 30 아미노산, 약 30 내지 약 40 아미노산, 약 40 내지 약 50 아미노산, 약 50 내지 약 60 아미노산, 약 5 내지 약 60 아미노산, 약 5 내지 약 40 아미노산, 예를 들어 약 8 내지 약 20 아미노산 또는 약 10 내지 약 15 아미노산을 갖는다. 힌지는 주로 유연할 수 있지만, 또한 더 강성 특성을 제공하거나 최소한의 β-시트 구조를 갖는 주로 α-나선형 구조를 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 힌지 서열은 혈장 및 혈청에서 안정하고 단백질가수분해성 분해에 잘 견딘다. 예를 들어, IgG1 상부 힌지 영역 내의 제1 리신을 돌연변이하거나 결실하여 단백질가수분해성 분해를 최소화할 수 있고, 힌지는 접합 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 힌지 서열은 자연적으로 발생 또는 첨가된 모티프, 예컨대 다이머 형성을 안정화하는 다수 디설파이드 결합 또는 하나의 디설파이드 결합을 형성하는 능력을 부여하는 면역글로불린 힌지 코어 구조 CPPCP(서열번호 9)를 함유할 수 있다.
본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질(예를 들어, BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR)에 함유된 소수성 부분은 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질이 세포막과 연합할 수 있게 하여 결합 단백질의 부분이 세포외적으로 위치하고(예를 들어, 태그 카세트, 결합 도메인), 일부가 세포내적으로 위치(예를 들어, 이펙터 도메인, 공-자극 도메인)하도록 한다. 소수성 부분은 일반적으로 세포막 인지질 이중층 내에 위치하게 된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 접합 아미노산은 이펙터 도메인을 갖는 소수성 부분 사이에 위치하여 이를 연결하거나, 스페이서 영역을 갖는 소수성 부분 사이에 위치하여 이를 연결하거나, 태그 카세트를 갖는 소수성 부분 사이에 위치하여 이를 연결할 수 있다.
특정 구체예에서, 소수성 도메인은 막관통 도메인, 예컨대 내재성 막(integral membrane) 단백질에서 유도된 것(예를 들어, 수용체, 클러스터의 분화(CD) 분자, 효소, 운반체, 세포 부착 분자 등)이다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 CD4, CD8, CD27, 또는 CD28로부터의 막관통 도메인이다.
본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질(예를 들어, BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR)에 함유된 세포 내 성분은 세포에 기능성 신호를 전달할 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR은 제2 단일 사슬 BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR 각각으로 다이머화될 것이며, 여기서 다이머화는 이펙터 도메인 및 임의로 공-자극 도메인을 포함하는 세포내 성분이 아주 근접하도록 하여 적절한 신호에 노출될 때 신호 전달을 촉진할 수 있다. 이러한 다이머 단백질 복합체를 형성하는 것 이외에도, 이펙터 도메인 및 임의적인 공-자극 도메인은 다른 신호전달 인자, 예컨대 공-자극 인자와 추가로 연합하여 세포내 신호를 생성하는 멀티단백질 복합체를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 세포 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 연합하여 세포 반응을 간접적으로 촉진시킬 것이다. 세포 내 성분은 1, 2, 3 또는 그 이상의 수용체 신호전달 도메인(예: 이펙터 도메인), 공-자극 도메인, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 신호전달 분자(예를 들어, 신호 형질도입 수용체)로부터의 이펙터 도메인, 또는 그의 기능성 부분, 공-자극 도메인 또는 그의 기능성 부분, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 세포내 성분을 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질에서 사용할 수 있다.
세포 내 성분은 다음에 기초하거나 이에서 유래하는 것일 수 있는 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질에서 유용한 이펙터 또는 공-자극 도메인을 가질 수 있다다: Wnt 신호전달 경로(예를 들어, LRP, Ryk, ROR2), NOTCH 신호전달 경로(예를 들어, NOTCH1, NTOCH2, NOTCH3, NOTCH4), Hedgehog 신호전달 경로(예를 들어, PTCH, SMO)의 단백질, 수용체 티로신 키나제(RTK)(예를 들어, 상피세포성장인자(EGF) 수용체 부류, 섬유아세포성장인자(FGF) 수용체 부류, 간세포성장인자(HGF) 수용체 부류, 인슐린 수용체(IR) 부류, 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 수용체 부류, 혈관표피성장인자(VEGF) 수용체 부류, 트로포마이신(tropomycin) 수용체 키나제(Trk) 수용체 부류, 에프린(Eph) 수용체 부류, AXL 수용체 부류, 백혈구 티로신 키나제(LTK) 수용체 부류, 면역글로불린-유사 및 EGF-유사 도메인 1(TIE) 수용체 부류를 갖는 티로신 키나제, 수용체 티로신 키나제-유사 오펀(orphan)(ROR) 수용체 부류, 디스코이딘 도메인(DDR) 수용체 부류, 형질감염시 재정렬된(RET) 수용체 부류, 티로신-단백질 키나제-유사(PTK7) 수용체 부류, 수용체 티로신 키나제(RYK) 수용체 부류와 관련, 근육 특이적 키나제(MuSK) 수용체 부류); G-단백질-결합 수용체, GPCR(Frizzled, Smoothened); 세린/트레오닌 키나제 수용체(BMPR, TGFR); 또는 사이토카인 수용체(IL-1R, IL-2R, IL-7R, IL-15R).
특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 림프구 수용체 신호전달 도메인을 포함하거나, 하나 또는 다수의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 세포질 신호전달 단백질과 연합하는 세포질 부분을 포함하고, 여기서 세포질 신호전달 단백질은 림프구 수용체 또는 그의 신호전달 도메인, 다수의 ITAM을 포함하는 단백질, 공-자극 인자, 또는 이들의 임의의 조합이다.
예시적인 이펙터 및 공-자극 도메인은 4-1BB, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이들의 조합에 기반하거나, 이들에서 유래한 것들을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질은 (a) CD3ζ 또는 그의 기능성 부분으로부터의 이펙터 도메인 및 CD28 또는 그의 기능성 부분으로부터의 공-자극 도메인, (b) CD3ζ 또는 그의 기능성 부분으로부터의 이펙터 도메인 및 4-1BB 또는 기능성 부분으로부터의 공-자극 도메인, 또는 (c) (a) CD3ζ 또는 그의 기능성 부분으로부터의 이펙터 도메인 및 CD28 및 4-1BB 또는 기능성 부분으로부터의 공-자극 도메인을 포함한다.
γ- 세크레타제 억제제(GSI)
배경으로, γ-세크레타제는 프레세닐린(PS), 니카스트린(NCT), 앞인두 결손 1(APH1) 및 프레세닐린 증강인자 2(PEN2)를 포함하는 다중 서브유닛 막 프로테아제 복합체이다. PS는 막관통 도메인 내에서 단일 통과 막 단백질을 절단하는, 막 내에 묻혀 있는 친수성 촉매 기공을 형성할 수 있는 아스파테이트 프로테아제인 촉매 서브유닛이다(Takasugi et al., Nature 422:438-41, 2003). NCT는 ECD가 γ-세크레타제의 일차 기질 수용체로서 기질의 아미노 말단을 포획하는 큰 세포 외 도메인(ECD)을 가진 I 형 막 당단백질이다(Shah et al., Cell 122:435-47, 2005). γ-세크레타제 복합체는 노치, CD44, 카드헤린 및 에프린 B2를 비롯한 다양한 기질의 처리뿐만 아니라, 아밀로이드 전구체 단백질을 알츠하이머 병과 관련된 아밀로이드 베타 펩티드로 절단하는 역할을 한다. γ-세크레타제 복합체는 또한 다발성 골수종을 비롯한 다양한 암의 치료 표적인 B-세포 성숙 항원(BCMA)을 절단하는 것으로 알려져 있다(Laurent et al., Nature Communications 6, 2015).
예시적인 γ-세크레타제 억제제(GSIs)는 소분자, 단백질 모방 화합물 또는 γ-세크레타제 특이적 결합 단백질을 포함한다. GSI는 프레세닐린 1(PS1), 프레세닐린 2(PS2), 니카스트린(NCT), 앞인두 결손 1(APH 1) 및 프레세닐린 증강인자 2(PEN 2)를 포함하여 γ-세크레타제 복합체 단백질 중 하나 이상을 표적으로 할 수 있되, γ-세크레타제 절단 활성은 억제되지 않은 γ-세크레타제에 비해 감소된다. 특정 구체예에서, γ-세크레타제 활성은 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%%, 적어도 약 95%, 또는 100% 감소된다. γ-세크레타제 활성을 측정하기 위한 분석은 당 업계에 공지되어 있다(예컨대, Laurent et al., 2015 참조). 예를 들어, 가용성 BCMA의 수준은 γ-세크레타제 활성의 대용 척도가될 수 있다. 증식성 또는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위해 BCMA 표적화 면역치료제와 함께 사용하기 위한 대표적인 소분자 GSI는 아바가세스타트, DAPT, BMS-906024, BMS-986115, LY411575, MK-0752, PF-03084014, RO4929097, 세마가세스타트, YO-01027, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 GSI는 프레세닐린 1(PS1), 프레세닐린 2(PS2), 니카스트린(NCT), 앞인두 결손 1(APH 1) 및 프레세닐린 증강인자 2(PEN 2) 등의 γ-세크레타제 복합체 또는 γ-세크레타제 복합체 단백질과 같은 γ-세크레타제 특이적 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 그의 항원 결합 단백질이다. 예시적인 γ-세크레타제 특이적 결합 단백질은 니카스트린 특이적 결합 단백질, 예컨대 항체 scFvG9, A5226A, 2H6, 10C11 및 그의 항원 결합 단편이다.
결합 도메인
결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이, BCMA에 특이적으로 결합하거나 γ-세크레타제 활성을 특이적으로 억제하는 임의의 펩티드일 수 있다. 결합 도메인의 공급원은 다양한 종, 예를 들어 인간, 설치류, 조류, 또는 양 유래의 항체 가변 영역을 포함한다(이것은 항체, sFvs, scFvs, Fabs, scFv-기반 그라바바디(grababody), 또는 가용성 VH 도메인 또는 도메인 항체의 형태로 존재할 수 있다). 결합 도메인의 다른 공급원은 다른 종, 예컨대 카멜리드(낙타, 단봉 낙타 또는 라마 유래; Ghahroudi et al., FEBSLett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 및 Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), 널스 샤크(nurse shark)(Roux et al, Proc. Natl Acad. Sci.(USA) 95:11804, 1998), 스팟티드 래트피쉬(Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002), 또는 칠성장어(Herrin et al., Proc. Natl Acad. Sci.(USA) 105:2040, 2008 및 Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008) 유래의 항체 가변 영역을 포함한다. 이러한 항체는 중쇄 가변 영역만을 사용하는 항원-결합 영역을 형성할 수 있으며, 즉 이들 기능성 항체는 중쇄만의 호모다이머("중쇄 항체"라 칭함)이다(Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al, Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al, Nature Med. 12:580, 2006; 및 Barthelemy et al, J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).
본 개시의 결합 도메인의 대체 공급원은 랜덤 펩티드 라이브러리를 인코딩하는 서열 또는 대체 비-항체 스캐폴드의 루프 영역에서 아미노산의 조작된 다양성을 인코딩하는 서열, 예컨대 scTCR(예를 들어, Lake et al, Int. Immunol. 11:745, 1999; Maynard et al, J. Immunol. Methods 306:51, 2005; 미국특허 제8,361,794호 참조), 피브리노겐 도메인(예를 들어, Weisel et al., Science 230:1388, 1985 참조), Kunitz 도메인(예를 들어, 미국특허 제6,423,498호 참조), 디자인된 안키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPins)(Binz et al, J. Mol. Biol. 552:489, 2003 및 Binz et al, Nat. Biotechnol. 22:515, 2004), 피브로넥틴 결합 도메인(애드넥틴(adnectins) 또는 모노바디)(Richards et al, J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker et al, Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 및 Hackel et al.(2008) J. Mol. Biol. 381:1238-1252), 시스테인-노트 미니단백질(Vita et al.(1995) Proc. Nat'l . Acad. Sci.(USA) 92:6404-6408; Martin et al.(2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 및 Huang et al.(2005) Structure 13:155, 2005), 테트라트리코펩티드 반복 도메인(Main et al, Structure 11:491, 2003 및 Cortajarena et al, ACS Chem. Biol. 3:161, 2008), 루신이 많은 반복 도메인(Stumpp et al., J. Mol. Biol. 332:471, 2003), 리포칼린 도메인(예를 들어, WO 2006/095164, Beste et al, Proc. Nat'l . Acad. Sci.(USA) 96: 1898, 1999 및 Schoenfeld et al, Proc. Nat'l . Acad. Sci.(USA) 106:8198, 2009 참조), V-유사 도메인(예를 들어, 미국 특허출원 공개 2007/0065431 참조), C-타입 렉틴 도메인(Zelensky and Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil et al, Proc. Nat'l . Acad. Sci.(USA) 89:153, 1992 및 Sato et al, Proc. Nat'l . Acad. Sci.(USA) 100:7779, 2003), mAb2 또는 Fcab™(예를 들어, PCT 특허출원 공개 WO 2007/098934; WO 2006/072620 참조), 아마딜로 반복 단백질(예를 들어, Madhurantakam et al, Protein Sci. 21: 1015, 2012; PCT 특허출원 공개 WO 2009/040338 참조), 아필린(affilin)(Ebersbach et al, J. Mol. Biol. 372:172, 2007), 아피바디, 아비머(avimer), 노틴스(knottins), 파이노머(fynomers), 아트리머, 세포독성 T-림프구 관련 단백질-4(Weidle et al, Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013) 등(Nord et al, Protein Eng. 8:601, 1995; Nord et al, Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al, Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz et al, Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma and Plueckthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011)이 있다.
본 개시의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당분야에서 공지된 다양한 방법(예를 들어, 미국특허 제6,291,161호 및 제6,291,158호 참조)에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 결합 도메인은 대상 표적(예를 들어, BCMA, 프레세닐린 또는 니카스트린과 같은 γ-세크레타제 복합체 성분)에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대해 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝하여 동정할 수 있다(Hoet et al., Nat. Biotechnol. 23:344, 2005 참조). 추가적으로, 간편한 시스템(예를 들어, 마우스, HuMAb 마우스®, TC 마우스™, KM-마우스®, 라마, 닭, 래트, 햄스터, 토끼 등)에서 면역원으로 대상 표적을 사용하는 하이브리도마 발생용 전통적 전략을 사용하여 본 개시의 결합 도메인을 발생할 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 도메인은 대상 표적(예를 들어, BCMA, 프레세닐린 또는 니카스트린과 같은 γ-세크레타제 복합체 성분)에 특이적인 VH 및 VL 영역을 포함하는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. 특정 구체예에서, VH 및 VL 영역은 인간이다. 예시적인 VH 및 VL 영역은 항-BCMA 특이적 항체 J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372, 또는 pSCHLI373의 세그먼트를 포함한다. 다른 예시적인 VH 및 VL 영역은 scFvG9, A5226A, 2H6 또는 10C11으로부터의 항-니카스트린 특이적 항체의 세그먼트 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열(예를 들어, 항-BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372, 또는 pSCHLI373 유래; 또는 항-니카스트린 scFvG9, A5226A, 2H6, 또는 10C11 유래) 또는 중쇄 가변 영역(VH)(예를 들어 항-BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372, 또는 pSCHLI373 유래; 또는 항-니카스트린 scFvG9, A5226A, 2H6, 또는 10C11 유래), 또는 둘 다에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나 이를 포함하고, 여기서 각 CDR은 대상 표적(예를 들어 BCMA, 프레세닐린이나 니카스트린과 같은 γ-세크레타제 복합체 성분)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체로부터 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개 또는 3개의 변경을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 결합 도메인 VH 영역은 공지된 모노클로날 항체의 VH로부터 유도되거나 이에 기초할 수 있고, 공지된 모노클로날 항체의 VH와 비교하여 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 치환(예를 들어, 보존성 아미노산 치환 또는 비보존성 아미노산 치환), 또는 상기한 변경의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 이 영역의 아미노- 또는 카복시-말단 또는 양 말단을 포함하는 VH 영역 어디에서나 가능하나, 단 각각의 CDR은 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개, 또는 3개의 변경을 포함하고, 변형된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인도 여전히 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적과 특이적으로 결합할 수 있다.
추가 구체예에서, 본 개시의 결합 도메인에서 VL 영역은 공지된 모노클로날 항체의 VL로부터 유도되거나 이에 기초할 수 있고, 공지된 모노클로날 항체의 VL과 비교하여 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 치환(예를 들어, 보존성 아미노산 치환), 또는 상기한 변경의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 이 영역의 아미노- 또는 카복시-말단 또는 양 말단을 포함하는 VL 영역 어디에서나 가능하나, 단 각각의 CDR은 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개, 또는 3개의 변경을 포함하고, 변형된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인도 여전히 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적과 특이적으로 결합할 수 있다.
VH 및 VL 도메인은 양 방향(즉, 아미노-말단에서 카복실 말단으로, VH-VL 또는 VL-VH)으로 배열될 수 있고, 스페이서 기능을 제공할 수 있는 (예를 들어, 약 5 내지 약 35 아미노산의 길이를 갖는) 아미노산 서열에 의해 결합되어 두 서브-결합 도메인이 상호작용하여 기능성 결합 도메인을 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, VH 및 VL 도메인을 연결하는 가변 영역 링커는 (GlynSer) 부류에 속하는 것들, 예컨대 (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(서열번호 3), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n(서열번호 10), (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(서열번호 4), 또는 (Gly4Ser)n(서열번호 5)을 포함한다(여기서, n은 1 내지 5의 정수이다). 특정 구체예에서, 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(서열번호 12) 또는 Gly-Gly-Gly-Ser)4(서열번호 13)이다. 특정 구체예에서, 이러한 (GlynSer)-기반 링커를 사용하여 결합 도메인 내에서 VH 및 VL 도메인을 연결하고, 이러한 링커들은 또한 결합 도메인을 태그 카세트에 연결하거나, 태그 카세트를 소수성 성분 또는 세포 내 성분에 연결하기 위해 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 도메인은 Vα /β 및 Cα /β 사슬(예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ) 또는 대상 표적에 특이적인 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍(예를 들어, 펩티드-MHC 복합체)을 포함하는 단일 사슬 T 세포 수용체(scTCR)이다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 TCR Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나 이를 포함하고, 여기서 각각의 CDR은 대상 표적(예를 들어 BCMA, 프레세닐린이나 니카스트린과 같은 γ-세크레타제 복합체 성분)과 특이적으로 결합하는 TCR 또는 그의 단편 또는 유도체로부터 0개의 변경, 또는 최대 1개, 2개 또는 3개의 변경을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 결합 도메인 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역은 공지된 TCR(예를 들어, 고친화도 TCR)의 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ로부터 유도되거나 이에 기초할 수 있고, 공지된 TCR의 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ와 비교하여 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 치환(예를 들어, 보존성 아미노산 치환 또는 비보존성 아미노산 치환), 또는 상기한 변경의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 이들 영역의 아미노- 또는 카복시-말단 또는 양 말단을 포함하여 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역 어디에서나 가능하나, 단 각각의 CDR은 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개, 또는 3개의 변경을 포함하고, 변형된 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역을 함유하는 결합 도메인도 여전히 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적과 특이적으로 결합할 수 있다.
본 개시의 BCMA, γ-세크레타제 또는 둘 다는 대상 세포("표적 세포")에서 또는 그와 관련하여 발견할 수 있다. 예시적인 표적 세포는 암 세포, 자가면역 질환 또는 장애 또는 염증성 질환 또는 장애와 관련된 세포(예를 들어, 박테리아, 바이러스, 바이러스 감염 세포)를 포함한다.
세포독성 접합체
항체-약물 접합체는 세포독성 요소를 표적 세포, 예를 들어 종양 또는 암세포에 선택적으로 전달하기 위해 사용된다. 항체-약물 접합체 및 관련 기술 및 화학은 예를 들어 문헌 [Nasiri et al., J. Cell. Physiol. (2018), Hedrich et al., Clin. Pharmacokinet. (2017), Drake and Rabuka, BioDrugs 31(6):521(2017), Meyer et al., Bioconj. Chem. 27(12):2791(2016), Moek et al., J. Nucl. Med. 58:83S(2017), Nareshkumar et al., Pharm. Res. 32:3526(2015), Parslow et al., Biomedicines 4:14(2016), 및 Green et al., Blood 131:611(2018)]에 기재되어 있으며, 여기서의 항체 포맷, 세포독성 페이로드, 링커 및 접합 화학, 투약 요법, 치료 방법, 약물동태학 및 ADC 설계의 원리는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 제공된 방법의 특정 구체예에서, BCMA 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 표지된 키메라 항원 수용체 분자(T-ChARM)는 세포독성제, 예컨대 화학치료제에 접합되거나 커플링된다. 화학치료제는 크로마틴 기능 억제제, 토포아이소머라제 억제제, 미소관 저해 약물, DNA 손상제, 항대사체(예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제(예컨대, 인터칼레이팅제), 및 DNA 수선 억제제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 화학치료제는 하기 군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 항대사물질/항암제, 예컨대, 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 겜시타빈 및 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제(머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 항증식/항세포분열제, 예를 들면, 자연 산물, 예컨대, 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미소관 파괴인자, 예컨대, 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신(에토포사이드, 테니포사이드), DNA 손상제(악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄포테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로르에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테르, 테모졸라미드, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 에토포시드(VP 16); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 전신적으로 대사시키고 그 자체로 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드(메클로르에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬설포네이트-부설판, 니트로소우레아(카르무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-데카바지닌(DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예컨대, 엽산 유사체(메토트렉세이트); 백금 배위 복합체(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소 용해제(예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자, 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 분비억제제(브레벨딘); 면역억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물(TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제제(혈관 내피세포 성장 인자(VEGF) 억제제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여자; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스투주맙, 리툭시맙); 키메라 항원 수용체; 세포 주기 억제제 및 분화 유도인자(트레티노인); mTOR 억제제, 토포아이소머라제 억제제(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포사이드, 에피루비신, 에토포사이드, 이다루비신 및 이리노테칸(CPT-11) 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도인자 및 독소, 예컨대, 콜레라 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신, 보데텔라 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 또는 디프테리아 독소 및 카스파제 활성인자; 및 염색질 파괴인자.
BCMA에 특이적으로 결합하는 예시적인 ADC는 문헌 [Tai et al., Blood 123(20):3128-3138(2014)]에 기재된 J6M0-mcMMAF(GSK2857916)이고, 그의 ADC 및 이의 사용 방법은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다. 다른 BCMA 특이적 ADC(SG1-MMAF)는 문헌 [Ryan et al.(Mol. Cancer Ther., 6(11):3009-3018, 2007)]에 기재된 것이고, 그의 ADC는 본원에 참고로 인용된다.
숙주 세포 및 핵산
특정 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 BCMA 특이적 결합 단백질(적어도 하나의 BCMA 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 및 이중특이성 결합 단백질 포함) 또는 γ-세크레타제 억제제를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자는 대상 숙주 세포(예를 들어, T 세포) 내 도입을 위한 적절한 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 플라스미드 벡터) 내로 삽입될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "재조합" 또는 "비자연적"이란 적어도 하나의 유전자 변경(alteration)을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입으로 변형된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하며, 여기서 이러한 변경 또는 변형은 유전자 조작에 의해 도입된다. 유전자 변경은, 예를 들어 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 인코딩하는 발현가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 세포의 유전 물질의 다른 핵산 분자 첨가, 결실 치환 또는 다른 기능적 파괴를 포함한다. 다른 변형은, 예를 들어 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경하는 비코딩 조절 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포, 예컨대 대상에서 얻어진 T 세포는 본원에 기술된 바와 같이 본 개시의 MA 특이적 결합 단백질 또는 γ-세크레타제 억제제(예를 들어, BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR 또는 항 γ-세크레타제)를 인코딩하는 핵산을 도입하여 세포가 세포 표면에 위치한 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현함으로써 비자연적 또는 재조합 세포(예를 들어, 비자연적 또는 재조합 T 세포)로 전환될 수 있다.
코어 바이러스를 인코딩하는 벡터는 본원에서 "바이러스 벡터"로 지칭된다. 인간 유전자 치료 적용을 위해 동정된 것들을 포함하여 본 개시의 조성물과 함께 사용하기에 적합한 수많은 이용가능한 바이러스 벡터들이 있다(Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001 참조). 적합한 바이러스 벡터는 RNA 바이러스에 기초한 벡터, 예컨대 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들면 몰로니(Moloney) 설치류 백혈병 바이러스(MLV) 유래 벡터를 포함하고, 더 복잡한 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들면 렌티바이러스 유래 벡터를 포함한다. HIV-1-유래 벡터가 이 카테고리에 속한다. 다른 예는 HIV-2, FIV, 말 전염성 빈혈 바이러스, SIV 및, 메디-비스나(Maedi-Visna) 바이러스(양 렌티바이러스)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스성 벡터의 사용 및 키메릭 항원 수용체 전이유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주 세포를 형질도입하기 위한 세포의 패키징 방법은 당분야에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[미국특허 제8,119,772호; Walchli et al, PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al, J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14: 1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al, Methods Mol. Biol. 506:91, 2009]에서 이전에 기술되었다. 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터 구조물과 발현 시스템은 또한 상업적으로 입수할 수 있다.
특정 구체예에서는 바이러스 벡터를 사용하여 BCMA 특이적 결합 단백질 또는 항 γ-세크레타제 억제제를 인코딩하는 비내인성 폴리뉴클레오티드를 도입한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 형질도입을 위한 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수도 있다. 바이러스 벡터를 위한 형질도입 마커가 당 분야에 알려져 있으며, 약물 내성을 부여할 수 있는 선택 마커, 또는 검출가능한 마커, 예컨대 형광 마커, 또는 유세포 계측법과 같은 방법에 의해 검출할 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 녹색 형광 단백질, 인간 CD2의 세포 외 도메인 또는 절단된(truncated) 인간 EGFR(huEGFRt; Wang et al., Blood 118:1255, 2011 참조)을 포함하는 형질도입을 위한 유전자 마커를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터 게놈이 별도 전사물로서 숙주 세포에서 발현될 다수의 핵산 서열을 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 또한 바이시스트론(bicistron) 또는 멀티시스트론 발현을 허용하는 2개(또는 그 이상) 전사물 사이에 추가의 서열을 또한 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용된 이러한 서열의 예는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위, 바이러스 2A 펩티드(예: P2A, T2A, E2A, F2A), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 전달에 다른 벡터, 예를 들어 아데노바이러스-기반 벡터 및 아데노-관련 바이러스(AAV)-기반 벡터를 포함하는 DNA 바이러스 벡터; 앰플리콘 벡터, 복제-결함 HSV 및 약독화된 HSV를 포함하는 단순 헤르페스 바이러스(HSV)로부터 유래된 벡터를 사용할 수 있다(Krisky et al., Gene Ther. 5:1517-1998).
유전자 치료요법을 위해 최근 개발된 다른 벡터들 또한 본 개시의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 이러한 벡터는 바큘로바이러스 및 α-바이러스(Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab) 또는 플라스미드 벡터(예컨대 슬리핑 뷰티 또는 다른 전이인자(transposon) 벡터)로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 또는 플라스미드 벡터는 형질도입을 위한 유전자 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질, huEGFRt)를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 조혈전구세포 또는 배아줄기세포가 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질(예: BCMA 특이적 T-ChARM 또는 CAR)을 인코딩하는 비내인성 핵산 분자를 포함하도록 변형된다. 조혈전구세포는 흉선세포 전구세포 또는 유도된 만능 줄기세포를 포함할 수 있고, 이것은 태아 간 조직, 골수, 제대혈 또는 말초혈액으로부터 유도되거나 기원할 수 있다. 조혈전구세포는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다. 특정 구체예에서, CD24lo Lin-CD117+ 흉선세포 전구세포가 사용된다.
특정 구체예에서, 배양 조건은 본 개시의 융합 단백질을 발현하는 조혈전구세포를 증식 또는 분화를 유도하기에 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함한다. 세포는 배양에서 일반적으로 약 3 일 내지 약 5 일, 또는 약 4 내지 약 10 일, 또는 약 5 내지 약 20 일 동안 유지된다. 세포는 목적하는 결과, 즉 목적하는 세포 조성 또는 증식 수준을 얻는데 필요한 적절한 시간동안 유지될 수 있다. 예를 들어, 주로 미성숙 및 불활성화 T 세포를 포함하는 세포 조성물을 생성하기 위해서는 세포를 배양에서 약 5 내지 약 20일 동안 유지할 수 있다. 주로 성숙 T 세포를 포함하는 세포 조성물을 생성하기 위해 세포를 배양에서 약 20 내지 약 30일 동안 유지할 수 있다. 비부착 세포는 또한 배양으로부터 다양한 시점, 예컨대 약 수 일 내지 약 25 일까지 수집할 수 있다. 특정 구체예에서, 조혈줄기세포는 기질(stromal) 세포주에서 공-배양된다(미국특허 제7,575,925호; Schmitt et al., Nat. Immunol. 5:410, 2004; Schmitt et al., Immunity 17:749, 2002).
조혈전구세포의 생착(commitment) 또는 분화를 촉진하는 하나 이상의 사이토카인을 배양에 첨가할 수 있다. 사이토카인은 인간 또는 비인간일 수 있다. 사용할 수 있는 사이토카인의 대표적인 예는 FGF 부류의 모든 멤버, 예를 들어 FGF-4 및 FGF-2; Flt-3-리간드, 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 IL-7을 포함한다. 사이토카인은 글리코사미노글리칸, 예컨대 헤파린 설페이트와 조합하여 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 표면상에서 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물로부터 유래하는 일차 세포 또는 세포주를 포함한 T 세포이다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직 또는 체액를 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포 또는 그의 아집단(예를 들어, 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억)은 강화되거나 정제될 수 있다. T 세포주는 당분야에서 공지되어 있고, 이들 중 일부는 문헌[Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000]에 기재되어 있다. 특정 구체예에서는, TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현이 결여된 T 세포가 사용된다. 이러한 T 세포는 자연적으로 TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현이 결여될 수 있거나, 발현(예를 들어, TCRα 및 β 사슬을 발현하지 않는 형질전환 마우스로부터의 T 세포, 또는 TCRα 및 β 사슬의 발현을 억제하기 위해 조작된 세포)을 차단하거나 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, 또는 양 유전자를 녹아웃(knockout)하도록 변형될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 표면상에서 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현할 수 있는 세포는 T 세포 또는 T 세포 계통의 세포가 아니라, 전구세포, 줄기 세포 또는 세포 표면 항-CD3를 발현하도록 변형된 세포와 같은 세포이다.
본원에 제공된 임의의 구체예에서, 숙주 세포는 면역 반응에 관여된 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소 또는 제거하도록 변형된 "만능 공여자(universal donor)" 세포일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIGIT, TIM3, HLA 복합체 성분, 또는 TCR 또는 TCR 복합체 성분으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 감소 또는 제거하도록 변형될 수 있다. 이론에 구애 없이, 내인성으로 발현된 특정 면역 세포 단백질은 변형된 면역 세포를 수용하는 동종이계 숙주에 의해서 외부물질로 인식될 수 있고, 이것은 변형된 면역 세포(예를 들어, HLA 대립유전자)의 제거를 초래할 수 있거나, 변형된 면역 세포(예를 들어, PD-1, LAG-3, CTLA4, TIGIT)의 면역 활성도를 하향조절할 수 있거나, 본 개시의 이종방식으로 발현된 결합 단백질(예를 들어, 비-종양 관련 항원에 결합함으로써 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 변형된 면역 세포의 항원 특이적 수용체를 방해하는 내인성 TCR)의 결합 활성도를 방해할 수 있다. 따라서, 이러한 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성도를 감소 또는 제거하는 것이 동종이계 숙주 환경에서 변형된 면역 세포의 활성도, 용인성 및 지속성을 개선시킬 수 있고, 세포가 (예를 들어, HLA 유형에 관계 없이 임의의 수여자에게) 만능 투여되는 것을 가능하게 한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 숙주 세포(예를 들어, 변형된 면역 세포)는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, TIGIT, HLA 복합체 성분을 인코딩하는 하나 이상의 유전자(예를 들어, α1 마크로글루불린, α2 마크로글루불린, α3 마크로글루불린, β1 마이크로글루불린 또는 β2 마이크로글루불린을 인코딩하는 유전자)의 염색체 유전자 녹아웃 또는 TCR 성분(예를 들어, TCR 가변 영역 또는 TCR 불변 영역을 인코딩하는 유전자)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Torikai et al., Nature Sci. Rep. 6:21757(2016); Torikai et al., Blood 119(24):5697(2012); 및 Torikai et al., Blood 122(8):1341(2013)] 참조, 이들의 유전자 편집 기술, 조성물 및 입양 세포 요법은 전체가 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, 일부 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃은 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 생산되며 PD-1, LAG-3, CTLA4, HLA 성분 또는 TCR 성분, 또는 이들의 임의의 조합을 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 시스템을 발현하는 렌티바이러스(예: pLentiCRISPRv2; Torikai et al., Blood(2016))로 변형된 면역 세포의 형질감염을 포함할 수 있다. 내인성으로 발현된 면역 세포 단백질을 억제하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템을 발현하는 렌티바이러스를 설계하는데 유용한 프라이머는 예를 들어 서열 번호 22 및 23, 24 및 25, 26 및 27, 및 28 및 29에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 순방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하도록 형질감염된 숙주 T 세포(예를 들어, T-ChARM, CAR, 적어도 하나의 BCMA 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 결합 단백질, 적어도 하나의 BCMA 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 결합 단백질)는 기능성 T 세포, 예컨대 바이러스 특이성 T 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 나이브 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중심 또는 이펙터 기억 T 세포 또는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포이다.
본 개시의 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 T 세포의 증식을 촉진하는 하나 이상의 성장 인자 사이토카인이 배양물에 첨가될 수 있다. 사이토카인은 인간 또는 비-인간적인 것일 수 있다. T 세포 증식을 촉진하는데 사용될 수 있는 예시적인 성장 인자 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-21 등을 포함한다.
용도
본원에 기재된 바와 같이 γ-세크레타제 억제제(GSI)와 조합하여 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 세포 또는 BCMA 표적화 면역요법으로 치료될 수 있는 질환은 암(예를 들어, BCMA를 발현하는 암), 면역 질환(예를 들어, 자가면역) 또는 연령관련 질환(예: 노화)을 포함한다. 입양면역 및 유전자 요법이 다양한 유형의 암(Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) 및 감염성 질환(Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011)에 대한 유망한 치료법이다.
본원에 개시된 조성물 및 방법으로 치료가능한 암은 세포 표면에서 BCMA를 발현하거나 발현할 수 있는 암이다. 치료될 수 있는 암의 전형적인 유형은 골수종(예: 다발성 골수종), 백혈병(예: 형질 세포 백혈병), 림프종(예: 림프형질세포성 림프종), 형질세포종, 발덴스트룀 거대글로불린혈증을 포함한다. BCMA를 발현할 수 있는 다른 암에는 유방 선암 및 폐 기관지 암종이 있다. 특정 구체예에서, BCMA 특이적 결합 단백질 및 GSI의 병용 요법으로 치료가능한 증식성 장애는 혈장 세포 장애(예를 들어, 다발성 골수종)를 포함하는 특정 유형의 B-세포 암이다.
염증성 및 자가면역 질환은 관절염, 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발연골염, 건선성 관절염, 건선, 피부염, 다발성근염/피부근염, 봉입체 근염, 염증성 근염, 독성 표피 괴사증, 전신성 경피증 및 경화증, CREST 증후군, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기 증상, 습진, 천식, 만성 염증 반응 및 T 세포 침윤을 수반하는 증상, 아테롬성 동맥경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 아급성 피부 홍반성 루푸스, 원반상 루푸스, 루푸스 척수염, 루푸스 뇌염, 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 시신경 척수염, 류마티스 열, 시드남 무도병, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 베게너 과립구증가증 및 처그-스트라우스 질환을 포함하는 과립구증가증, 무과립구증, 혈관염(과민성 혈관염/맥관염, ANCA 및 류마티스성 혈관염을 포함), 재생불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증(PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 중추신경계(CNS) 염증성 장애, 복합 장기 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병, 캐슬 증후군, 굿페스쳐 증후군, 램버트-이튼 근무력 증후군, 레이노드(Reynaud) 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 고형 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주병(GVHD), 수포성 류천포창, 천포창, 자가면역 다발성 내분비병증, 혈청반응 음성 척추 관절증, 라이터병, 강직 인간 증후군, 거대 세포 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증 또는 IgM 매개 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 헤노흐-쇤라인 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선 기능저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디슨병, 그레이브병, 자가면역 다선성 증후군(또는 다선성 내분비 증후군), 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)으로 칭해지기도 하는 제I형 당뇨병 및 쉬한 증후군을 포함하는 자가면역 내분비 질환; 자가면역 간염, 림프구 간질성 폐렴(HIV), 폐쇄세기관지염(비-이식), 비특이적 간질성 폐렴(NSIP), 길랑-바레 증후군, 거대 혈관 혈관염(류마티스성 다발성근육통 및 거대 세포(다카야수) 동맥염 포함), 중간 혈관 혈관염(가와사키병 및 결절성 동맥염 포함), 결절성 다발성 동맥염(PAN), 강직성 척추염, 버거씨병(IgA 신장병증), 급속 진행성 사구체 신염, 원발성 담즙성 간경변, 셀리악 스프루(글루텐성 장질환), 한랭글로불린혈증, 간염과 관련된 한랭글로불린혈증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 관상 동맥 질환, 가족성 지중해 열, 현미경 다발혈관염, 코간 증후군, 위스코트-알드리흐 증후군 및 폐색성혈전 혈관염을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 γ-세크레타제 억제제와 조합된 BCMA 결합 단백질로 대상을 치료하는 방법은 다발성 골수종, 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, B-세포 림프종 및 림프형질세포성 림프종의 치료를 포함한다.
본 개시의 CAR 또는 T-ChARM과 같은 BCMA 특이적 결합 단백질은 세포-결합 형태로 대상에 투여될 수 있다(예를 들어, 표적 세포 집단(성숙 T 세포(예를 들어, CD8+ 또는 CD4+ T 세포) 또는 T 세포 계통의 다른 세포의 유전자 치료). 특정 구체예에서, 대상에게 투여된 BCMA 특이적 결합 단백질(예를 들어, BCMA 특이적 CAR 또는 T-ChARM)을 발현하는 T 세포 계통의 세포는 동계, 동종이계 또는 자가 세포이다.
본 발명의 방법은 면역 세포 표면(예를 들어, T 세포) 상에 발현된 BCMA 특이적 결합 분자를 투여하고 γ-세크레타제 억제제(GSI)를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 조합물은 동일한 약학적으로 허용 가능한 담체에서 함께, 또는 별도의 제형(하지만 함께)으로 동반 투여될 수 있다. 동반 투여란 각 성분이 동일한 시간에 또는 서로 8-12 시간 이내에 투여됨을 의미한다. 제1 성분이 투여된 후 12 시간이 지나 제2 성분을 투여하는 것은 순차적 투여로 간주될 것이다. 다른 구체예에서, BCMA 특이적 면역치료제 및 GSI는 임의의 순서 및 임의 조합으로 순차적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 일 간격으로, 1, 2, 3 또는 4 주 간격으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 주 간격으로, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 간격 등으로). 특정 구체예에서, 순차적으로 투여되는 경우, GSI가 먼저 투여되고 BCMA 표적화 면역치료제(가용성 또는 세포 형태)가 이차로 투여된다. 다른 구체예에서, BCMA 표적화 면역치료제(가용성 또는 세포 형태)가 먼저 투여되고 GSI가 이차로 투여된다. 특정 구체예에서, BCMA에 특이적으로 결합하는 변형된 면역 세포(예를 들어, CAR-T, T-ChARM, 이중특이성, 다중특이성 T 세포와 같은 BCMA-특이성 T 세포)를 포함하는 BCMA 표적 면역치료제가 먼저 투여되고, GSI가 이차로 투여된다(예를 들어, BCMA 면역치료제의 수 시간, 수 일, 수 개월 또는 수 년 이내). 추가의 구체예에서, BCMA에 특이적으로 결합하는 결합 단백질(예를 들어, CAR-T, T-ChARM, 이중특이성, 다중특이성 T 세포와 같은 BCMA 특이적 T 세포)을 포함하는 변형된 면역 세포를 포함하는 BCMA 표적화 면역치료제가 (a) 대상에게 투여되고; (b) 일정 기간(예를 들어, 약 5 일 내지 약 1 주, 약 1 주 내지 약 2 주, 약 2 주 내지 약 3 주, 약 1 주 내지 약 1 개월, 약 1 개월 내지 약 6 개월 약 3 개월 내지 약 1 년, 또는 필요에 따라 더 길게) 후에, 대상 또는 대상으로부터의 조직이 BCMA에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 포함하는 이전에 투여된 변형된 면역 세포의 존재 또는 지속성에 대해 조사되거나 검사되며, (c) BCMA 면역치료제의 존재 또는 지속성의 검출 후 초 GSI가 투여된다.
일부 구체예에서, GSI는 BCMA 표적화 면역요법 전, 그와 동시에 적어도 한 번 및 그 후에 적어도 한번(예를 들어, 적어도 2, 3 또는 4 회) 대상에게 투여된다. 특정 구체예에서, 본 개시의 조합 요법은 BCMA 표적화 면역요법 및 약 0.01 μM GSI 내지 약 5 μM GSI, 약 0.03 μM GSI 내지 약 1.5 μM GSI, 약 0.05 μM GSI 내지 약 2.5 μM GSI, 또는 약 0.1 μM GSI 내지 약 1.0 μM GSI의 투여를 포함한다. 특정 구체예에서, BCMA 및 GSI에 특이적으로 결합하는 변형된 면역 세포를 포함하는 조합 요법은 이들 요법을 개별적으로 투여하는 것과 비교하여 BCMA, GSI 또는 둘 다에 특이적으로 결합하는 면역 세포를 더 적은 양으로 포함한다.
예를 들어, 배경으로 이론에 구애 없이, 입양 면역요법 동안 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 투여된 세포의 접종은 하나 이상의 화학요법제 또는 치료법에 의한 이전의 면역억제 처치에 의해 촉진될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 방법은 BCMA 표적화 면역요법 또는 GSI 및 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 면역 세포의 투여에 앞서 또는 그와 동시에 환자를 전처치하는 단계를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 전처치 요법은 내인성 림프구 제거(골수비파괴 또는 골수파괴일 수 있는 림프절 제거라고도 함)을 포함하는 면역 억제 처치이다. 예시적인 림프구 제거는 사이클로포스파미드 단독, 플루다라빈과 조합된 사이클로포스파미드, 림프구에 세포독성인 다른 약제 또는 처리(예: 전신 조사) 또는 이들의 임의 조합을 사용하여 달성될 수 있다.
결합 분자, 억제제 또는 조합 조성물은 경구, 국소, 경피, 비경구, 흡입 분무, 질내, 직장 또는 두개 내 주사, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 별도로 투여할 경우, BCMA 표적화 면역치료제 및 GSI는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, BCMA 표적화 면역치료제는 비경구로 투여되고, GSI는 동시에 또는 순차적으로 경구로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 수조 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥 내, 피내, 근육 내, 유방 내, 복강 내, 척수강 내, 구강 내, 폐내 주사 및/또는 특정 부위에 외과적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 발열 물질뿐만 아니라 수여자에게 유해할 수 있는 다른 불순물도 본질적으로 함유하지 않는다. BCMA 표적화 면역치료제의 투여에 주사 또는 주입, 특히 정맥 내 주사가 바람직하다.
다른 구체예에서, BCMA 특이적 결합 단백질, GSI 또는 둘 모두는 가용성 형태(예: 항체)로 환자에게 투여될 수 있다. 가용성 TCR은 또한 당 업계에 공지되어 있다(Molloy et al., Curr. Opin. Pharmacol. 5:438, 2005; 미국 특허 제6,759,243호 참조).
본 개시의 BCMA 표적화 면역치료제 및 γ-세크레타제 억제제의 조합 요법을 포함하는 약학 조성물은 의학 분야의 업자에 의해 결정된 바와 같이 치료(또는 예방) 될 질환 또는 상태에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량, 적절한 지속 시간 및 빈도는 환자의 상태, 크기, 질환의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 본 개시는 CAR 또는 T-ChARM과 같은 BCMA 특이적 결합 단백질을 발현하는 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합한 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합물을 포함한다.
본 개시의 이점은 환자에게 투여된 CAR 또는 T-ChARM과 같은 BCMA 특이적 결합 단백질 발현 세포가 태그 카세트에 동족 접합 파트너를 사용하여 고갈될 수 있다는 것이다. 특정 구체예에서, 본 개시는 태그 카세트에 특이적인 항체를 사용하거나, 태그 카세트에 대한 동족 결합 파트너를 사용하거나, 또는 태그 카세트에 특이적이고 CAR을 발현하는 제2 T 세포를 사용함으로써 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 태그 카세트는 본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포의 면역결핍을 허용한다. 조작된 T 세포의 제거는 태그 카세트에 특이적인 결핍제를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, Strep 태그가 사용되는 경우, 세포독성 시약(예: 독소, 방사성 금속)에 각각 융합되거나 접합된 항-Strep 태그 항체, 항-Strep 태그 scFv 또는 스트렙탁틴이 사용될 수 있거나, 항 Strep 태그/항-CD3 이중특이성 scFv 또는 항 Strep 태그 CAR T 세포가 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원의 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 재조합 T 세포의 증식을 선택적으로 촉진하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 방법은 항체와 같은 태그 결합 파트너를 사용하여 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포를 선택적으로 생체 외 증식하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 기능적 T 세포(예를 들어, 바이러스 특이적, TAA(종양-관련 항원) 특이적 CTL, 또는 특이적인 T 세포 서브 세트, 예를 들어 나이브 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중심 또는 이펙터 기억 T 세포, CD4+ CD25+ 조절 T 세포)를 항체와 같은 태그 결합 파트너와 확장시키는 것을 포함하며, 이는 임의로 공-자극 분자 결합 파트너(예: 항-CD27 또는 항-CD28 항체)의 존재하에 수행될 수 있다.
또 다른 구체예에서, BCMA 특이적 T-ChARM은 본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현할 때 생체 내에서 T 세포 증식의 선택적 촉진을 허용한다. 특정 구체예에서, 태그 카세트를 포함하는 CAR 발현 T 세포는 리간드(예를 들어, T 세포 억제 세포 리간드 PD-L1, PD-L2를 포함함)를 발현하는 세포와 접촉할 때 생체 내에서 CAR T 세포의 확장을 허용한다. 이러한 확장된 T 세포는 본원에 기재된 질환 치료 방법에 유용하다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 세포의 증식 또는 확장은 생체 내에서 유도되며, 태그 카세트 결합 파트너(예컨대 항-태그 항체) 및 임의로 공-자극 분자 결합 파트너(예컨대 항-CD27 또는 항-CD28 항체)로 유도될 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 세포는 생체 내에서, 예를 들어 종양 부위에서 활성화된다. 예를 들어, 태그 카세트 결합 파트너(예컨대 항-tag 항체) 및 공-자극 분자 결합 파트너(예컨대 항-CD27 또는 항-CD28 항체)를 포함하는 조성물(예컨대, 알기네이트, 기저막 매트릭스(Matrigel®), 바이오폴리머 또는 다른 매트릭스) 또는 담체(예를 들어, 마이크로비드, 나노입자 또는 다른 고체 표면)는 본 원에 개시된 바와 같이 종양(예를 들어, 고형 종양)의 부위에서 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포를 국소적으로 활성화시키는데 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 재조합 세포는 태그 카세트(예를 들어, 항-태그 항체)에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하거나, 태그 카세트 서열에 특이적으로 결합하는 기타 동족 접합 단백질(예를 들어, Strep 태그에 결합하는 스트렙탁틴)에 의해 생체 내에서 검출되거나 추적될 수 있으며, 상기 태그 카세트에 대한 결합 파트너는 형광 염료, 방사선 추적자, 산화철 나노입자 또는 X 선, CT 스캔, MRI 스캔, PET 스캔, 초음파, 유세포 계측법, 근적외선 이미징 시스템 또는 다른 이미징 기법에 의한 검출에 대해 당 업계에 알려진 다른 이미징제에 접합된다(예를 들어, Yu et al., Theranostics 2:3, 2012 참조).
추가의 구체예에서, 본 개시의 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 세포는 본원에서 확인된 징후 또는 증상과 관련하여 사용되는 방법을 비롯한 진단 방법 또는 이미징 방법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 예를 들어, BCMA 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 예컨대 항체-약물 접합체를 포함할 수 있는 BCMA 특이적 결합 단백질, 또는 이중특이성 또는 다중특이성 결합 단백질, 예컨대 사전 표적화 방사선 면역요법에 유용한 것과 조합하여 GSI를 투여(예를 들어, 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로)하는 것을 포함한다(예를 들어, Green et al., Blood 131:611(2018) 참조).
실시예
실시예 1
BCMA 특이적 키메라 항원 수용체의 설계 및 검사
항-BCMA CAR을 다발성 골수종 및 기타 장애의 면역요법에 대한 유용성을 조사하기 위해 준비하였다. 항-BCMA CAR은 IgG4 힌지 영역(스페이서), CD28 막관통 도메인, 4-1BB 공-자극 도메인 및 CD3ζ 이펙터 도메인을 포함하고 있는 C115 D5.3("C11") 항체 및 A7D12.2("A7") 항체로부터의 VH 및 VL 영역으로 이루어진 scFv로 구성되었다. scFv는 "HL" 및 "LH" 배향 모두에서 생성되었다(도 1A 참조). 인간 T 세포를 항-BCMA CAR을 인코딩하는 발현 구조물로 형질도입시키고 기능적 특성을 조사하였다. 도 1B에 도시된 바와 같이, BCMA-발현 표적 세포와 공-배양시 C11 CAR 및 A7 CAR를 발현하는 T 세포가 증식되었는데, C11 CAR이 A7 CAR 발현 T 세포보다 좀 더 충실히 증식하는 것으로 보여진다. C11 CAR-T 세포는 또한 표적 세포주(항원-형질감염된 K562 세포 또는 BCMA-발현 MM 세포주; 도 1C)에 반응하여 더 많은 사이토카인을 생성하였고, A7 LH CAR-T 세포에 비해 표적 세포에 대해 보다 큰 특이적 사멸 활성을 나타냈다(도 1D).
4-1BB 공-자극 도메인(도 1E, 상부 표시) 및 CD28 공-자극 도메인(도 1E, 하부 표시)을 함유하는 CAR을 포함하여 상이한 세포 내 성분을 갖는 추가의 A7 및 C11 CAR이 생성되었다. 세포 외 스페이서 도메인의 길이가 또한 짧은(예: 12 아미노산, 48 아미노산 및 66 아미노산 길이), 중간(예: 157 아미노산 길이) 및 긴(예: 228 아미노산 길이) 스페이서를 포함하는 CAR 발현 T 세포와 BCMA+ 표적 세포 사이에 상호작용을 개선하도록 변경되었다. 48 아미노산 및 157 아미노산 스페이서 CAR은 각각 2 개의 Strep-Tag 카세트를 포함한 반면, 66 아미노산 스페이서는 3 개의 Strep-Tag 카세트를 포함하였다(도 1F 참조). 도 1F 및 1G에 도시된 Strep-Tag 카세트-함유 CAR와 같은 태그화 키메라 항원 수용체는 본원에서 T-ChARM으로 지칭된다.
인간 T 세포를 T-ChARM을 발현하도록 형질도입시키고(실시예 2 참조), 기능성을 분석하였다. 스페이서의 길이는 항-BCA 항체 C11 D5.3으로부터 유래된 scFv를 포함하는 T-ChARM 구조물에 영향을 미치는데, 중간(약 65 아미노산; 도 1H의 C11 3ST, C11 2STint 및 C11Lo 참조) 내지 긴(약 200 아미노산) 스페이서가 이 결합 도메인에 가장 잘 작동하였다. C113ST_4-1BB 및 C113ST_CD28을 가장 우수한 수행 구조물로 선택하고(도 1H-1J), 이전에 개시된 항-BCMA CAR("BCMA-2"; Carpenter et al. Clin. Cancer Res. 19:2048, 2013)과 비교하였다. 일차 T 세포에서 EGFRt의 발현은 각각의 T-ChARM/CAR 구조물에 대해 유사하였고, T-ChARM의 표면 발현은 항-STII 모노클로날 항체로의 염색으로 나타난 바와 같이(도 1K) STII 서열을 함유하는 것으로 확인되었다. C113ST T-ChARM을 발현하는 T 세포는 표적 세포와 공-배양하였을 때 BCMA-2를 발현하는 T 세포보다 더 많은 사이토카인(도 1L, 1M)을 생성하였고 더 강하게 증식하였다(도 1N). 또한 C113ST T-ChARM을 발현하는 T 세포가 CD138+ 환자 MM 세포를 인식하고 용해할 수 있다고 결정되었다(데이터는 나타내지 않음). C113ST T-ChARM 또는 BCMA-2 CAR을 발현하는 T 세포는 비-항원 발현 K562 세포(도 1O)에 대해 세포 용해 활성을 갖지 않았지만 BCMA 항원을 발현하도록 형질도입된 K562 세포를 효과적으로 용해시켰으며(도 1P), 이는 조작된 T 세포가 항원을 특이적으로 인식함을 입증한다.
실시예 2
재조합 T 세포의 생산 및 BCMA 특이적 T-ChARM의 발현
제조사의 지시에 따라 항-CD3/CD28 비드(Life Technologies)로 활성화시킨 CD8+/CD4+ T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 정상적인 인간 공여자의 PBMC로부터 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 단리하고, 32 ℃에서 45 분동안 2,100 rpm에서 원심 분리에 의한 활성화 후 3 일째에 0.8 μg/mL 폴리브렌(Millipore, Bedford, MA)을 보충한 PsPAX2 및 pMD2G 패키징 플라스미드(MOI=3)를 사용하여 HEK293T 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성된 CAR-인코딩 렌티바이러스(epHIB7) 상등액으로 형질도입하였다. T 세포를 48 시간마다 50 U/mL의 최종 농도로 재조합 인간(rh) IL-2가 보충된 RPMI, 10% 인간 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CTL 배지)에서 확장하였다. 확장 후, 각각의 형질도입된 T 세포주의 분취량을 바이오틴-접합 항-EGFL 항체 및 스트렙타비딘-PE(Miltenyi, Auburn, CA)로 염색하였다. tEGFR+ T 세포는 FACS-Aria 세포 분류기(Becton Dickinson)로 분류하여 단리하였다. 이어 tEGFR+ T 세포 서브세트를 T 세포:LCL 비 1:7에서 조사(8,000 rad)된 CD19+ B-LCL로 자극시키고, 48 시간마다 50 U/mL rh IL-2를 첨가한 CTL 배지에서, 또는 항-BCA 항체 A7 또는 C11 D5.3으로부터 유래된 scFv를 포함하는 T-ChARM 발현 세포에 대해 고속 확장 프로토콜을 사용하여 8 일 동안 확장시켰다(Riddell and Greenberg, J. Immunol. Methods 128: 189, 1990).
유세포 계측 표현형 및 분석에 다음의 접합 항체를 사용하였다: CD4, CD8, CD25, CD137, CD45, 아넥신 V, CD62L, CD27, CD28(BD Biosciences), 항 Streptag II 항체(Genscript), EGFR 항체(ImClone Systems Incorporated, Branchburg, NJ); 스트렙타빈-PE(BD Biosciences, San Jose, CA). 생/사 세포 판별에 요오드화프로피듐(PI, BD Biosciences)를 이용한 염색을 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 유동 분석을 FACS Canto II에서 행하고, FACS AriaII(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 분류-정제한 후, FlowJo 소프트웨어(Treestar, Ashland, OR)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
BCMA 특이적 T-ChARM의 세포 표면 발현을 조사하기 위해, 형질도입된 T 세포를 EGFRt 발현을 위해 분류하고 형광 색소 표지된 항 Streptag mAb로 염색하여 평가하였다. EGFR 염색의 평균 형광 강도(MFI)는 BCMA 특이적 T-ChARM 및 CD19-Short CAR 각각으로 형질도입된 T 세포에서 유사하였다. T-ChARM을 생성하기 위해 CAR 내로 태그를 도입하는 것은 이식유전자 발현을 방해하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 항 StrepTag mAb는 각 T-ChARM에서 태그 서열의 위치 또는 수에 관계없이 다양한 BCMA 특이적 T-ChARM으로 형질도입된 T 세포로 특이적으로 염색되었다.
실시예 3
가용성 BCMA( sBCMA )는 BCMA 특이적 CAR T 세포 활성을 억제한다
대부분의 골수종에 대한 BCMA-표적화된 T 세포 요법의 잠재적 효과를 조사하였다. 골수종 세포에 의한 표면 BCMA의 쉐딩은 T 세포 인식을 방해할 수 있기 때문에, 골수종 세포주 배양 중에 상등액에서 가용성 BCMA 수준을 측정하였다. U266 골수종 세포를 세척하고 배지에 1, 3, 5 및 24 시간 동안 플레이팅하였다. 배지 상등액을 수거하고 ELISA에 의해 sBCMA에 대해 분석하였다. 데이터는 상등액에서 sBCMA 수준의 시간 의존적 증가를 보여준다(도 2A). 다음으로, 환자 MM 세포와 접촉한 BCMA-특이성 T-ChARM T 세포에 의한 환자의 원발성 다발성 골수종(MM) 세포에서의 BCMA 발현 정도 및 사이토카인 생산을 조사하였다. 도 2B는 기준 세포주(RPMI, 좌측 패널) 및 상이한 수준의 BCMA 발현을 갖는 환자의 원발성 MM 세포로부터의 샘플에 의한 표면 BCMA 발현을 나타낸다. 도 2C의 파이 차트는 19 명의 상이한 환자로부터의 MM 세포의 표면상에서 BCMA 발현이 대부분의 환자에 대해 양성이지만, 일부 환자 샘플에서는 중간 내지 낮은/없는 표면 BCMA 발현(~25%)을 보임을 나타낸다. 또한, 도 2D는 저-BCMA 환자 MM 세포와의 배양에 비해 T-ChARM T 세포가 높은 수준의 표면 BCMA를 발현하는 환자 MM 세포와 배양될 때 IFN-γ를 더 많이 생성한다는 것을 보여준다.
골수종 세포는 종종 T 세포상의 PD-1에 결합하여 T 세포 기능을 억제하는 것으로 여겨지는 PD-L1을 발현한다(Freeman et al. J. Exp. Med. 192(7):1027(2000)). PD-L1이 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포에 영향을 줄 가능성도 조사되었다. 환자 샘플의 유세포 계측법은 PD-L1이 또한 47% PD-L1hi, 32% PD-L1int, 및 21% PD-L1low/neg와 함께 샘플의 79%에서 발현됨을 보여주었다(도 2E 및 2F). BCMA와 PD-L1 발현간에 상관관계는 관찰되지 않았다. 도 2G는 T-ChARM T 세포가 높은 수준의 PD-L1에 대해 낮은 수준의 PD-L1을 발현하는 환자의 MM 세포와 함께 배양되었을 때 IFN-γ가 더 많이 생성되었음을 보여주지만 이러한 경향은 통계적으로 유의하지는 않았다.
마찬가지로 sBCMA를 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포 및 전장 BCMA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 K562(K562/BCMA+) 세포의 공-배양물에 첨가하여 sBCMA의 효과를 시험하였다. BCMA 특이적 T-ChARM T 세포 이펙터 기능의 용량-의존적 억제는 외인성 sBCMA의 투여 시 배지 상등액으로의 IFNγ 방출을 측정함으로써 검출되었다(도 2H, 2I). 또한, MM 세포주는 24 시간 내에 배양 상등액 sBCMA의 실질적인 증가를 보였다(도 2J).
높은 수준의 sBCMA가 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포의 활성을 억제하는지를 조사하기 위해, 환자 골수(BM) 혈청을 sBCMA 수준으로 검사하였다. 환자 BM은 높은 수준의 sBCMA를 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 존재하는 CD138+ 세포의 비율에 의해 결정되는 바와 같이 질환 부담과 대략적인 상관관계가 있다(도 2K). sBCMA가 T-ChARM T 세포에 결합하는지를 시험하기 위해, T 세포를 증가 수준의 재조합 BCMA과 배양하고, 이어서 APC에 접합된 BCMA-Fc를 사용하여 염색하였다. 도 2L에 나타낸 바와 같이, 염색은 재조합 BCMA의 수준이 높을수록 감소하였으며, 이는 sBCMA가 잠재적으로 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포 기능에 유해한 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
T-ChARM 발현을 확인하기 위해, C113ST T-ChARM T 세포 및 대조 항-CD19 CAR T 세포("FMC63")를 Fc-BCMA와 함께 배양하였고 EGFRt(CAR/T-ChARM 형질도입 마커) 및 CD4에 대해 염색되었으며, T-ChARM이 세포에 의해 발현된 것으로 나타났다(도 2M). EGFRt 및 다른 T 세포 표면 분자의 염색은 영향을 받지 않았다(데이터는 나타내지 않았다).
T-ChARMs에 sBCMA의 쉐딩 및 결합이 T 세포 기능을 억제하는 지의 여부를 결정하기 위해 BCMA-Fc를 T 세포/표적 세포주 공-배양물에 첨가하였고, (CDMA 항원을 발현하는 K562 세포와 함께 배양한) 대조 항-CD19 CAR T 세포에 의해서가 아니라 BCMA-표적화 T-ChARM T 세포에 의해 인식(IFN-γ 생산 및 CD4 발현)이 많이 감소되었다(도 2N). BCMA T-ChARM T 세포에 대한 효과는 용량 의존적이었다(도 2O, 2P). Fc에 융합되지 않은 재조합 BCMA의 첨가는 또한 용량 의존적인 방식으로 IFN-γ 생산을 억제하였지만, T-ChARM T 세포에 의한 K562 BCMA+ 세포의 용해를 억제하지 않았는데(도 2Q), 이는 표적 세포 표면의 항원 밀도가 높기 때문일 수 있다.
실시예 4
MM BCMA 수준에 대한 γ- 세크레타제 억제제의 효과
골수종 세포에서 BCMA 수준에 대한 γ-세크레타제 억제 효과를 조사하기 위해, γ-세크레타제 억제제(GSI) RO4929097을 사용하였다. BCMA는 γ-세크레타제 억제제(GSI) RO4929097(농도는 0.001 μM 내지 1.0 μM의 범위로 사용됨)과 함께 배양된 경우 다양한 골수종 세포주에서 급속히 상향조절된다(도 3A-3D).
표면 BCMA 발현 속도에 대한 GSI의 효과를 조사하기 위해, U266 골수종 세포를 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM, 0.1 μM 및 1.0 μM)의 존재하에 1, 3, 5 및 24 시간 동안 배양하고 유세포 계측법에 의해 세포 표면 BCMA 발현을 평가하였다. BCMA 발현은 GSI 존재하에서 용량 의존적으로 증가하였다(도 3E). 상향 조절은 1.0 μM GSI에서 7 일간의 배양에 걸쳐 지속되었다(도 3F).
MM에서 BCMA 쉐딩에 대한 GSI의 효과를 시험하기 위해, 3 종의 상이한 골수종 세포주(MM1.R, U266 및 8226)를 세척하고, 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM, 0.1 μM 및 1.0 μM)의 존재하에 24 시간 동안 배지에 플레이팅하였다. 배지 상등액을 수거하고 ELISA에 의해 sBCMA에 대해 분석하였다. sBCMA 수준은 GSI 존재하에 상등액에서 용량 의존적으로 감소하였다(도 3G 및 3H).
경시적인 가용성 BCMA(sBCMA) 수준에 미치는 영향을 조사하기 위해, U266 세포를 세척하고, 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM, 0.1 μM 및 1.0 μM)의 존재하에 1, 3, 5 및 24 시간 동안 배양 배지에 플레이팅하였다. 배지 상등액을 수거하고 ELISA에 의해 가용성 BCMA(sBCMA)에 대해 분석하였다. 데이터는 GSI가 존재할 때 상등액에서 가용성 BCMA 수준이 용량 의존적으로 감소함을 보여준다(도 3I).
다음으로, MM 세포 배양물로부터 GSI의 제거 효과를 조사하였다. 도 3J 및 3K에 도시된 바와 같이, 표면 BCMA 수준은 1.0 μM RO429097의 제거 후 감소한 반면, 상등액 sBCMA는 GSI가 제거되었을 때 증가하였지만 GSI가 남아있을 때는 증가하지 않았다. 데이터는 표면 BCMA 쉐딩에 대한 GSI의 가역적 억제 효과를 나타낸다. 마지막으로, 시험한 MM 세포주의 생존성은 배양물에 1.0 μM RO429097의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다(도 3L).
이어, BCMA 발현에 대한 GSI의 효과를 환자의 원발성 골수종 샘플에 대해 시험하였다. CD138+ 골수종 세포를 환자 골수 샘플로부터 농축하고, 다양한 농도의 GSI RO429097(0.01 μM 내지 10 μM)의 존재하에서 3 시간 동안 배양한 다음, 유세포 계측법에 의해 표면 BCMA 발현을 평가하였다(도 3M 및 3R). 종양 세포에서의 BCMA 평균 형광 강도(MFI)는 RO4929097 없이 배양된 종양 세포에 비해 배 증가로 제시된다. CS1, CD86, PD L1, CD80 및 CD38(도 3O-3Q)을 포함한 몇몇 다른 세포 표면 분자의 수준에는 영향이 없었지만, 종양 세포 상에 BCMA의 농도 의존적인 상향 조절이 관찰되었다(도 3N).
실시예 5
γ- 세크레타제 억제제는 BCMA 특이적 T-ChARM을 발현하는 T 세포에 의한 BCMA + 골수종 세포의 인식을 향상시킨다
GSI가 BCMA+ 다발성 골수종에 대한 CAR T 세포 활성에 미치는 효과를 조사하기 위해, BCMA CAR-T 세포(BCMA 특이적 T-ChARM C11 3ST-CD28 및 BCMA 특이적 T-ChARM C11 3ST-41BB) 또는 대조 CD19sh CAR(짧은 스페이서)-T 세포에 의한 IL-2의 생산을, 다양한 농도의 GSI RO429097(0.003 μM 내지 3.0 μM)을 함유하는 배지에서 24 시간 동안 원발성 인간 골수종 종양 세포와 공-배양한 후 측정하였다(도 4A). GSI 처리는 BCMA T-ChARM T 세포에 의한 IL-2 생산을 용량 의존적으로 증가시켰다. 또한, 다양한 농도에서 RO429097의 골수종 세포와 공-배양된 BMCA T-ChARM T 세포에 의한 IFNγ 생산을 측정하였는데, GSI의 존재하에서도 또한 증가되었다(도 4B). 이들 데이터는 종양 세포에서 BCMA 발현을 상향 조절하는 γ-세크레타제 억제제로 전처리되면, 다발성 골수종 세포가 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포를 더 잘 자극한다는 것을 보여준다. 마지막으로, GSI RO492097의 존재하에 원발성 인간 골수종 종양 세포와 함께 3 일 동안 공-배양한 후, CFSE-표지된 BCMA 특이적 T-ChARM T 세포의 증식이 용량 의존적 방식으로 증가하였다(도 4C).
이론에 구애 없이, CAR-T 세포 인식을 향상시키기 위해 골수종 세포에서 BCMA를 증가시키기 위해 GSI를 사용할 때 주의해야 할 점은 고 농도의 GSI가 T-세포 신호전달 및 이펙터 기능을 억제할 수 있다는 것이다. 문헌[Eagar et al., Immunity 20(4):407, 2004] 참조. 표적 리간드 발현이 안정하게 유지되는 환경에서 CAR T 세포에 대한 GSI의 잠재적 효과를 평가하기 위해, CD19 CAR-T 세포를 GSI(0.01 μM 내지 100 μM의)의 존재하에 Raji 또는 K562/CD19+ 표적 세포와 공-배양하고, 생존성 및 이펙터 기능을 측정하였다. 이 농도 범위 초과에서는 CD19 항원 발현(도 5A) 또는 24 시간 후의 CAR-T 세포 생존성에 영향을 미치지 않았다(도 5B). GSI RO4929097은 IL-2(도 5C, 상부 패널) 및 IFNγ(도 5C, 하부 패널) 생산을 측정함으로써 결정된 바와 같이(또한 도 5D-5F 참조), K562 CD19+ 세포와 공-배양될 때 1 μM 이상의 농도에서 CD19 CAR-T 세포 이펙터 기능을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, CD19 CAR-T 세포가 표적 세포를 특이적으로 사멸시키는 능력은 GSI 농도에 영향을 받지 않았다(도 5G). CD19 CAR-T 세포는 또한 10 μM GSI RO4929097의 존재하에서 표적 세포 자극에 반응하여 증식하였지만, GSI RO4929097의 부재(도 5H) 하에서보다 덜 효과적이었다. CAR-T 세포 분열에 대한 GSI의 투여 효과를 더 조사하기 위해, GSI RO4929097의 용량 적정을 CD19 CAR-T 및 표적 세포의 공-배양물에 첨가하였다. CAR-T 세포 분열은 치료 용량의 GSI(0.01 μM 내지 1 μM) 첨가에 의해 본질적으로 영향을 받지 않았거나 약간 영향을 받은 반면, 더 높은 비-치료 용량(10 μM)에서의 GSI는 증식을 검출 가능하게 억제하였다(도 5I). GSI의 존재하에 배양된 CD19 CAR-T 세포는 외인성 IL-2의 존재(도 5J) 또는 부재(도 5K) 하에 배양 시 8 일에 걸쳐 확장 감소를 나타내지 않았다. 또한, 5 μM, 0.5 μM의 GSI의 존재 또는 GSI의 부재하에 확장된 T 세포는 외인성 IL-2의 존재(도 5L) 또는 부재(도 5M) 하에 확장된 후 표적 세포로 재자극되었을 때 IFN-γ 생산에 유의한 차이를 나타내지 않았다. CAR-T 세포 그룹 간의 IL-2 생산 또한 현저히 상이하지 않았다(도 5N). 전체적으로, 치료 수준에서의 GSI는 사이토카인 생성, 세포 용해 활성 및 증식을 포함하는 T 세포 기능에 영향을 미치지 않는다.
다음으로, BCMA 특이적 T-ChARM을 함유하는 T 세포의 T 세포 기능에 대한 GSI의 효과를 조사하였다. 원발 골수종 종양 샘플의 GSI 처리는 공-배양된 T-ChARM T 세포에 의한 IFN-γ 생산(도 5O, 5P 및 5Q) 및 CD8 발현(도 5O)을 크게 개선시켰으며, 이 효과는 0.1 μM GSI 이상의 처리 후에 확인되었고 또한 T 세포의 증식을 증가시켰다(도 5R).
이들 데이터는 다발성 골수종 세포에서 BCMA의 수준을 증가시키기 위해 BCMA 특이적 CAR-T 세포와 GSI를 결합시키는 것에 대한 임상적 유용성을 나타낸다. 이것은 낮은 수준의 BCMA를 발현하는 종양 세포의 제거를 촉진함으로써 다발성 골수종을 치료하는데 유리하거나 심지어는 시너지 효과를 제공할 수 있다. 데이터는 또한 γ-세크레타제 억제제의 농도 범위가 T 세포 활성에 영향을 미치지 않으면서 종양 세포의 BCMA 발현을 촉진한다는 것을 보여준다.
실시예 6
MM 이종이식 모델에서 GSI 활성의 생체 내 연구
실시예 4에 기술된 GSI RO4929097의 sBCMA-억제 효과가 생체 내에서 복제될 수 있는지를 조사하기 위해, 인간 MM의 마우스 이종이식 모델을 도 6A에 예시된 바와 같이 시험하였다. 요약하면, 면역결핍 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스(The Jackson Laboratory)를 -1일에 준치사량의 방사선 조사(275 rad) 처리를 하고, 다음날(0 일) 5×106 MM.1R 세포를 투여하였다. GSI RO4929097(30 mg/kg)을 19 일과 20 일에 경구 위관 영양법으로 투여하였다. 마우스를 GSI의 제2 위관 영양법 투여 후 상이한 시간에 희생시키고 분석을 위해 혈액 및 골수 샘플을 채취하였다. GSI 투약 후에 종양 세포에서 표면 BCMA 발현의 급속한 증가(제2 위관 영양법 4 시간에 >3배)(도 6B) 및 sBCMA의 동반 감소(도 6C)가 뒤따랐다. 관찰된 효과는 일반적으로 제2 위관 영양법 처리 후 48 시간 이내에 감소되었다.
실시예 7
MM을 표적으로 한 GSI + CAR T 세포 조합 치료의 생체 내 연구
생체 내에서 항-BCMA CAR T 세포 치료법을 개선하기 위한 GSI 요법의 능력을 조사하였다. 실시예 6에서 기술된 것과 유사한 실험에서, NSG 마우스를 -21 일에 준치사량으로 조사한 뒤, -20 일에 인간 MM 세포(5×106 MM.1Rffluc)를 투여하였다(도 7A 참조). GSI의 제1 용량(30 mg/kg RO4929097)을 -1 일에 경구 위관 영양법으로 투여하였다. 0 일째에, 마우스에게 C11 3ST T-ChARM T 세포(0.33×106 세포; CD4:CD8 1:1)의 최적 이하의 량을 주사하고 제2 용량의 GSI를 투여하였다. GSI의 추가 용량을 +1 일, +8 일 및 +9 일에 투여하였다. 실험 전반에 걸쳐 생물발광 이미징(BLI)을 수행하고 마우스 생존에 대해 모니터링하였다. 도 7B, 7C 및 7E에 도시된 바와 같이(좌측 그래프), GSI + T 세포를 투여받은 군은 T 세포만을 투여받은 군(T 세포 단독 군으로부터의 BLI 데이터는 미도시)과 비교하여 생물발광이 감소되었고, 검출 가능한 종양이 없는 마우스가 더 많았다. 정량화된 발광 데이터(도 7C 및 7E(좌측 그래프))는 초기 T-ChARM T 세포 효과가 종양이 성장하기 시작한 약 9 일("Mock + BCMA T 세포")에 역전되기 시작함을 나타내었다. 항-종양 효과는 GSI RO4929097("RO49+ BCMA T 세포")와의 조합으로 연장되었지만, 그 치료군의 종양도 결국 증가하였다. 이미징 데이터는 마우스의 생존과 일치하였으며(도 7D 및 7E(우측 그래프)), 조합 처리를 받은 마우스는 사망 전에 T 세포만을 투여받은 군보다 더 오래 생존하였다. 특정 구체예에서, 항-BCMA CAR T 세포와 함께 사용되는 경우 GSI 처리를 반복하였고(적어도 2 회 내지 적어도 약 5 회에서 적어도 약 25 회까지), 이때 GSI 처리는 항-BCMA CAR T 세포의 투여와 동시에, 그 전, 또는 후에 투여되었다.
실시예 8
GSI는 이중특이성 항-BCMA 융합 단백질에 의한 BCMA + MM 세포 결합을 향상시킨다
BCMA 및 다른 항원에 대한 특이성을 가지며 YFP(황색 형광 단백질) 태그를 갖는 이중특이성 융합 단백질을 작제하였다. 이중특이성 융합 단백질을 GSI의 존재 또는 부재하에 배양중인 BCMA-발현 H929 MM 세포에 첨가하였다(0.5×106 세포). 결합을 유세포 계측법에 의해 평가하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, GSI의 첨가는 BCMA 결합 이중특이성 융합 단백질에 의한 결합을 향상시켰지만, BCMA를 표적으로 하지 않는 대조 이중특이성 융합 단백질에 의한 결합에는 영향을 미치지 않았다. 이 데이터는 BCMA를 표적으로 하는 이중특이성 분자를 포함하는 면역요법이 GSI로 증가되거나 향상될 수 있음을 보여준다.
상기한 다양한 구체예를 조합하여 추가 구체예를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되거나/되고 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허출원 공개, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 공개물은 전부 그의 전문이 본원에서 참조로 인용되었다. 구체예들의 양태는, 필요에 따라 각종 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하도록 변형되어 추가의 구체예를 제공할 수 있다.
상기한 상세한 설명에 비추어 구체예에 대한 이러한 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어들이 청구범위를 명세서 및 청구항에 기재된 특정 구체예들로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 청구범위가 부여한 대응 전체 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 상기 개시에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Riddell, Stanley R. Green, Damian Hill, Tyler <120> COMBINATION THERAPIES FOR TREATMENT OF BCMA RELATED CANCERS AND AUTOIMMUNE DISORDERS <130> 360056.445WO <140> PCT <141> 2018-02-16 <150> US 62/582,270 <151> 2017-11-06 <150> US 62/406,612 <151> 2017-02-17 <160> 34 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ?? 360056_445WO_SEQUENCE_LISTING <400> 2 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> VARIANT <222> (5) ... (20) <223> anyone or all of amino acids 5-20 can either be present or absent <400> 3 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> VARIANT <222> (5) ... (0) <223> anyone or all of amino acids 5-20 can either be present or absent. <220> <221> VARIANT <222> (26) ... (45) <223> anyone or all of amino acids 26-45 can either be present or absent. <400> 4 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 ?? 368856_445WO_SEQUENCE_LISTING Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 28 25 38 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 48 45 <218> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <228> <221> VARIANT <222> (6) ... (28) <223> anyone or all of amino acids 6-28 can either be present or absent. <488> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 18 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 28 25 <218> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <488> 6 His Gly Gly His His Gly 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22~b <223> Synthetic sequence ?? 360056_445WO_SEQUENCE_LISTING <400> 7 Trp Ser His Pro GIn Phe Glu Lys 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 8 Trp Arg His Pro GIn Phe Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 9 Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> VARTANT <222> (10) ... (29) <223> anyone or all of amino acids 10-29 can either be present or absent. <400> 10 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser ?? 36ee56_445WO_SEQUENCE_LISTING 2e 25 <21e> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 11 Gly Gly Gly 1 <21e> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 12 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 re 15 <21e> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 13 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser i ~ lid l~ <21e> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence ?? 368856_445WO_SEQUENCE_LlSTlNG <488> 14 Asp lIe Val Leu Thr GIn Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 18 15 Glu Arg Ala Thr lIe Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val lIe 28 25 38 Gly Ala His Leu lIe His Trp Tyr GIn GIn Lys Pro Gly GIn Pro Pro 35 48 45 Lys Leu Leu lIe Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala 58 55 68 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lIe Ser 65 78 75 88 Ser Leu GIn Ala Glu Asp Ala~la lIe Tyr Tyr Cys Leu GIn Ser Arg 85 98 95 lIe Phe Pro Arg Thr Phe Gly GIn Gly Thr Lys Leu Glu lIe Lys 188 185 118 <218> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <488> 15 Asp lIe Val Leu Thr GIn Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 18 15 Glu Arg Ala Thr lIe Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val lIe 28 25 38 Gly Ala His Leu lIe His Trp Tyr GIn GIn Lys Pro Gly GIn Pro Pro 35 48 45 Lys Leu Leu lIe Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala 58 55 68 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lIe Ser 65 78 75 88 Ser Leu GIn Ala Glu Asp Ala Ala lIe Tyr Ser Cys Leu GIn Ser Arg 85 98 95 lIe Phe Pro Arg Thr Phe Gly GIn Gly Thr Lys Leu Glu lIe Lys 188 185 118 <218> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence ?? 360056_445WO_SEQUENCE_LlSTlNG <220> <223> Synthetic sequence <400> 16 Asp lIe Val Leu Thr GIn Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr lIe Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val lIe 20 25 30 Gly Ala His Leu lIe His Trp Tyr GIn GIn Lys Pro Gly GIn Pro Pro 35 ?? 40 45 Lys Leu Leu lIe Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lIe Ser 65 78 75 S8 Arg Val GIn Ala Glu Asp Ala Ala lIe Tyr Ser Cys Leu GIn Ser Arg S5 98 95 lIe Phe Pro Arg Thr Phe Gly GIn Gly Thr Lys Leu Glu lIe Lys 180 105 110 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <408> 17 GIn Val GIn Leu Val GIn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 18 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 28 25 38 Ser lIe Asn Trp Val Arg GIn Ala Pro Gly GIn Gly Leu Glu Trp Met 35 48 45 Gly Trp lIe Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 58 55 68 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 78 75 80 Leu GIn lIe Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 98 95 Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GIn Gly Thr Leu 180 185 118 Val Thr Val Ser Ser 115 <218> lS ?? 368856_445WO_SEQUENCE_LlSTlNG <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <488> 18 GIn Val GIn Leu Val GIn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 18 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 28 25 38 Ser lIe Asn Trp Val Arg GIn Ala Pro Gly GIn Gly Leu Glu Trp Met 35 48 45 Gly Trp lIe Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 58 55 68 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 78 75 88 Leu GIn lIe Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 98 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GIn Gly Thr Leu 188 185 118 Val Thr Val Ser Ser 115 <218> 19 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <488> 19 GIn Val GIn Leu Val GIn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 18 15 Ser Val Lys lIe Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 28 2S 30 Ser lIe Asn Trp Val Arg GIn Ala Pro Gly GIn Gly Leu Glu Trp Met 35 48 45 Gly Trp lIe Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 58 55 68 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 78 75 88 Leu GIn lIe Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 98 95 ?? 368856_445WO_SEQUENCE_LlSTlNG Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GIn Gly Thr Leu 188 185 118 Val Thr Val Ser Ser 115 <218> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <488> 28 GIn Val GIn Leu Val GIn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 18 15 Ser Val Lys lIe Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 28 25 38 Ser lIe Asn Trp Val Lys GIn Ala Pro Gly GIn Gly Leu Lys Trp Met 35 48 45 Gly Trp lIe Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 58 55 68 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 78 75 88 Leu GIn lIe Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 98 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GIn Gly Thr Leu 188 185 118 Val Thr Val Ser Ser 115 <218> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <228> <223> Synthetic sequence <488> 21 GIn lIe GIn Leu Val GIn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 18 15 Spr Val Lys lIe Ser Cy~ Lys Ala Ser Gly Tyr' Thr Phe Ihr Asp Tyr 28 25 38 Ser lIe Asn Trp Val Lys GIn Ala Pro Gly GIn Gly Leu Lys Trp Met 35 48 45 ?? 360056_445WO_SEQUENCE_LlSTlNG Gly Trp lIe Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu GIn lIe Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly GIn Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 22 caccggagaa tcaaaatcgg tgaat 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 23 aaacattcac cgattttgat tctcc 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <4aa> L4 caccgcagtt gtgtgacacg gaag 24 <210> 25 ?? 36ee56_445WO_SEQUENCE_LISTING <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 25 aaaccttccg tgtcacacaa ctgc 24 <21e> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 26 caccggcaaa ggtgagtgag acttt 25 <21e> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 27 aaacaaagtc tcactcacct ttgcc 25 <21e> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22e> <223> Synthetic sequence <4ee> 28 caccggtttc tgcagccgct ttggg 25 <21e> 29 ?? 360056_445WO_SEQUENCE_LISTING <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 aaaccccaaa gcggctgcag aaacc 25 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence G4S linker <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> VARIANT <222> (1) ... (20) <223> anyone of amino acids 1-2 can be absent or can be present up 10 times, provided that amino acids 1 and 2 are not both absent <4e~:b 31 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser 20 <210> 32 <211> 10 <212> PRT ?? 360056_445WO_SEQUENCE_LISTING <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 33 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 34 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10

Claims (46)

  1. 치료적 유효량의 BCMA 특이적 결합 단백질 및 치료적 유효량의 γ-세크레타제 억제제를 BCMA 발현과 관련된 질환 또는 장애를 갖거나, 이로 의심되는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서
    (i) 암과 같은 증식성 질환 또는 장애, 및/또는
    (ii) 자가면역 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 BCMA 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 표지된 키메라 항원 수용체 분자(T-ChARM)인 방법.
  3. 제2항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 인간 또는 인간화된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 BCMA 특이적 scFv, BCMA 특이적 scTCR, 또는 BCMA 리간드 또는 그의 결합 부분을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 결합 BCMA 특이적 결합 단백질이 BCMA 항체 J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, S307118G03, SG1, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372, 또는 pSCHLI373에 기초한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 세포 외 성분과 세포 내 성분 사이에 배치된 소수성 부분을 포함하는 키메라 항원 수용체이고, 상기 세포 외 성분은 BCMA 특이적 결합 단백질을 포함하며, 여기서 BCMA 특이적 결합 단백질은 (a) BCMA 항체 J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 또는 pSCHLI373로부터의 BCMA 특이적 항원 결합 부분; 또는 (b) BAFF 또는 APRIL에 기초하거나 이로부터 유래된 BCMA 리간드 또는 그의 결합 부분을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 소수성 부분이 막관통 도메인인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 막관통 도메인이 CD4, CD8, CD28 또는 CD27 막관통 도메인인 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 성분이 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, 공-자극 도메인 또는 그의 기능성 부분, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 세포 내 성분이 4-1BB(CD137), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, OX40(CD134), ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 기능성 부분 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 이펙터 도메인이 CD3ζ 또는 그의 기능성 부분을 포함하는 방법.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 성분이 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 공-자극 도메인 또는 그의 기능성 부분을 포함하는 방법.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 도메인 또는 그의 이펙터 부분이 CD3ζ 또는 그의 기능성 부분, 및 4-1BB(CD137), CD27, CD28 및 OX40(CD134) 중 하나 이상의 공-자극 도메인 또는 그의 기능성 부분을 포함하는 방법.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 성분이 (a) 4-1BB 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ, (b) CD27 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ, (c) CD28 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ, (d) OX40 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ, (e) CD28 또는 그의 기능성 부분, 4-1BB 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ, (f) OX40 또는 그의 기능성 부분, 4-1BB 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ, 또는 (g) CD28 또는 그의 기능성 부분, OX40 또는 그의 기능성 부분 및 CD3ζ을 포함하는 방법.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 외 성분이 BCMA 특이적 결합 단백질과 소수성 부분 사이에 배치된 면역글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인, CH3 도메인 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, CH2 도메인이 IgG1 CH2 도메인이고 CH3 도메인은 IgG1 CH3 도메인인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 외인성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고 숙주 세포에서 발현되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 숙주 세포가 인간 면역계 세포인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 인간 면역계 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 인간 면역계 세포가 T 세포이고, T 세포는 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 벌크 T 세포 또는 이들의 임의의 조합인 발현 벡터.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, γ-세크레타제 억제제가 아바가세스타트, DAPT, BMS-906024, BMS-986115, MK-0752, PF-03084014, RO4929097, 또는 YO-01027인 방법.
  23. 제22항에 있어서, γ-세크레타제 억제제가 니카스트린 특이적 결합 단백질인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 니카스트린 특이적 결합 단백질이 scFvG9, 항체 A5226A, 항체 2H6 또는 항체 10C11인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 서열 번호 14 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 서열 번호 17 내지 21 중 어느 하나의 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질 및 γ-세크레타제 억제제에 앞서 또는 이와 동시에 면역 억제 요법으로 대상을 전처치하는 단계를 더 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 면역 억제 요법이 골수비파괴 치료 또는 골수파괴 치료인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 골수비파괴 치료가 사이클로포스파미드 또는 플루다라빈과 조합된 사이클로포스파미드를 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질 및 γ-세크레타제 억제제가 순차적으로 투여되는 방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질 및 γ-세크레타제 억제제가 동시에 투여되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질 및 γ-세크레타제 억제제가 함께 제형화되는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 비경구로 투여되고 γ-세크레타제 억제제가 경구로 투여되는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환 또는 장애가 혈액암 또는 고형암인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 혈액암이 다발성 골수종, 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, B-세포 림프종 및 림프형질세포성 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 고형암이 유방 선암 또는 폐 기관지 암종인 방법.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 질환이 관절염, 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발연골염, 건선성 관절염, 건선, 피부염, 다발성근염/피부근염, 봉입체 근염, 염증성 근염, 독성 표피 괴사증, 전신성 경피증 및 경화증, CREST 증후군, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기 증상, 습진, 천식, 만성 염증 반응 및 T 세포 침윤을 수반하는 증상, 아테롬성 동맥경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 아급성 피부 홍반성 루푸스, 원반상 루푸스, 루푸스 척수염, 루푸스 뇌염, 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 시신경 척수염, 류마티스 열, 시드남 무도병, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 베게너 과립구증가증 및 처그-스트라우스 질환을 포함하는 과립구증가증, 무과립구증, 혈관염(과민성 혈관염/맥관염, ANCA 및 류마티스성 혈관염을 포함), 재생불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증(PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 중추신경계(CNS) 염증성 장애, 복합 장기 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병, 캐슬 증후군, 굿페스쳐 증후군, 램버트-이튼 근무력 증후군, 레이노드(Reynaud) 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 고형 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주병(GVHD), 수포성 류천포창, 천포창, 자가면역 다발성 내분비병증, 혈청반응 음성 척추 관절증, 라이터병, 강직 인간 증후군, 거대 세포 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신장병증, IgM 다발성신경병증 또는 IgM 매개 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 헤노흐-쇤라인 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선 기능저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디슨병, 그레이브병, 자가면역 다선성 증후군(또는 다선성 내분비 증후군), 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)으로 칭해지기도 하는 제I형 당뇨병 및 쉬한 증후군을 포함하는 자가면역 내분비 질환; 자가면역 간염, 림프구 간질성 폐렴(HIV), 폐쇄세기관지염(비-이식), 비특이적 간질성 폐렴(NSIP), 길랑-바레 증후군, 거대 혈관 혈관염(류마티스성 다발성근육통 및 거대 세포(다카야수) 동맥염 포함), 중간 혈관 혈관염(가와사키병 및 결절성 동맥염 포함), 결절성 다발성 동맥염(PAN), 강직성 척추염, 버거씨병(IgA 신장병증), 급속 진행성 사구체 신염, 원발성 담즙성 간경변, 셀리악 스프루(글루텐성 장질환), 한랭글로불린혈증, 간염과 관련된 한랭글로불린혈증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 관상 동맥 질환, 가족성 지중해 열, 현미경 다발혈관염, 코간 증후군, 위스코트-알드리흐 증후군 및 폐색성혈전 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  37. (a) BCMA 특이적 결합 단백질의 단위 투여량 및 (b) γ-세크레타제 억제제의 단위 투여량을 포함하는, 혈액 및/또는 자가면역 질환 또는 장애 치료용 키트.
  38. 제37항에 있어서, CD20-특이적 결합 단백질, 예컨대 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙; CD19-특이적 결합 단백질; CD45-특이적 결합 단백질; CD38-특이적 결합 단백질; 사이토카인; 케모카인; 성장 인자; 화학요법제; 또는 방사선치료제를 더 포함하는 키트.
  39. 제6항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 T-ChARM을 포함하고, 상기 T-ChARM의 세포 외 도메인은 Strep 태그를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, T-ChARM의 세포 외 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 태그 카세트를 포함하는 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, γ-세크레타제 억제제가 BCMA 특이적 결합 단백질의 첫 투여 후에 적어도 한번 대상에 투여되는 방법.
  42. 제41항에 있어서, γ-세크레타제 억제제가 BCMA 특이적 결합 단백질의 첫 투여 후 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50 회 투여되는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, γ-세크레타제 억제제가 약 30 mg/kg의 농도로 투여되는 방법.
  44. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 세포독성제에 커플링된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 방법.
  45. 제1항 내지 제5항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 다중특이성인 방법.
  46. 제45항에 있어서, BCMA 특이적 결합 단백질이 이중특이성인 방법.
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