ES2949364T3 - Terapias de combinación para el tratamiento de cánceres y trastornos autoinmunitarios relacionados con BCMA - Google Patents

Terapias de combinación para el tratamiento de cánceres y trastornos autoinmunitarios relacionados con BCMA Download PDF

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Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos para usar moléculas de unión específicas de BCMA (tales como un receptor o anticuerpo de antígeno quimérico específico de BCMA) en combinación con inhibidores de γ-secretasa, que se pueden realizar de forma concurrente o secuencial, para tratar o prevenir una infección de células B. enfermedad proliferativa relacionada, tal como cáncer o enfermedad autoinmune, o similares. Se puede utilizar una molécula de unión específica de BCMA en combinación con un inhibidor de γ-secretasa, por ejemplo, en inmunoterapia adoptiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapias de combinación para el tratamiento de cánceres y trastornos autoinmunitarios relacionados con BCMA Antecedentes
El sistema inmunitario humano generalmente protege el cuerpo de la invasión de sustancias y patógenos extraños. Los linfocitos B, también denominados células B y un componente del sistema inmunitario, producen anticuerpos que se unen a, y en algunos casos median en la destrucción de, la sustancia o patógeno extraños. En algunos casos, sin embargo, el sistema inmunitario puede desregularse y dar como resultado enfermedades que implican la proliferación no controlada de células B, tales como cáncer, enfermedad autoinmunitaria y enfermedad inflamatoria. Las células B maduras y su progenie diferenciada pueden ser identificadas por moléculas en su superficie celular, tal como el antígeno de maduración de células B (BCMA, también conocido como miembro 17 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF17), TNFRSF13A y CD269), que se expresa en células plasmáticas y algunas células B maduras. Se ha demostrado que BCMA se une específicamente al factor de activación de células B (BAFF, también conocido como TNFSF13B, TALL-1 y CD257) y un ligando inductor de proliferación (APRIL, también conocido como TNFSF13, TALL-2 y CD256), que puede conducir a la activación de NF-κB. Las terapias dirigidas contra BCMA, incluyendo la transferencia adoptiva de células T modificadas con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de BCMA, anticuerpos específicos de BCMA no marcado o la administración de anticuerpos específicos de BCMA conjugados con un resto terapéutico (conjugado anticuerpo-fármaco, ADC, tal como un radiomarcador) pueden usarse para tratar algunos tipos de neoplasias malignas de células B, tales como mieloma múltiple, pero pueden tener una eficacia limitada por el número de moléculas de BCMA expresadas en la superficie celular tumoral y/o la presencia de BCMA soluble en la circulación. La baja expresión de BCMA superficial en las células cancerosas o el BCMA soluble pueden limitar e impedir la eficacia de los agentes terapéuticos debido a una unión inadecuada al BCMA presente en la superficie de las células tumorales. Se ha demostrado que los bajos niveles de otras moléculas diana en las células tumorales (por ejemplo, CD19, CD20) que se seleccionan como diana con un anticuerpo, conjugados anticuerpo-fármaco o células T con receptor de antígeno quimérico limitan la eficacia de estas terapias, y permiten que las células cancerosas que expresan bajos niveles de la molécula diana escapen de la eliminación. En el caso del BCMA, la porción extracelular corta de la molécula se escinde de la superficie celular y se excreta a través de la acción de gamma-secretasa (y-secretasa), una enzima celular localizada en la membrana implicada en la escisión de proteínas. Esta escisión reduce la densidad del BCMA en las células tales como células cancerosas de mieloma que expresan la molécula y da como resultado niveles elevados de BCMA soluble (sBCMA) en el suero de pacientes con determinadas enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico) y cáncer (por ejemplo, mieloma múltiple).
El resumen del documento WO 2017/019496 A1 indica que se proporcionan métodos de tratamiento de una disfunción del sistema inmunitario o afecciones asociadas con BCMA soluble usando moduladores o inhibidores de la gamma-secretasa para tanto restablecer la función inmunitaria como mejorar la eficacia de las terapias dirigidas contra el BCMA presente en la célula B patógena.
Ali et al., 2016. Blood. 128(13): 1688-700 describen un ensayo con aumento de la dosis en el que se administran las células T con CAR que seleccionan como diana BCMA a pacientes con mieloma múltiple.
Actualmente, sigue existiendo la necesidad en el campo de la inmunoterapia de composiciones y métodos alternativos o mejorados para tratar de manera más eficiente una enfermedad autoinmunitaria y un cáncer.
Sumario de la invención
La invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A - 1P muestran el diseño y las pruebas funcionales de moléculas de receptor de antígeno quimérico (CAR) a modo de ejemplo de esta divulgación.
(A) Ilustraciones de los CAR a modo de ejemplo que tienen un componente extracelular que se compone de un scFv específico de BCMA derivado de un anticuerpo A7D12.2 (“A7”) o anticuerpo C11D5.3 (“C11”) y una región de espaciador (que se compone de una región bisagra de IgG4), una porción hidrófoba (que se compone de un dominio transmembrana de CD28), y un componente intracelular que se compone de un dominio efector de CD3^ y un dominio coestimulador de 4-1BB. Los scFv se construyeron con el extremo C-terminal de la región Vh unido (ligador de región variable “G4S” (SEQ ID NO:30)) al extremo N-terminal de la región Vl (orientación “HL”) o el extremo C-terminal de la región Vl unido al extremo N-terminal de la región Vh (orientación “LH”).
(B) Datos de citometría de flujo (tinción con éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE)) que muestran la proliferación de células T humanas que expresan los CAR mostrados en la figura 1A y células T de control que con contiene un CAR en respuesta a células tumorales que expresan BCMA.
(C) Producción de citocinas (IFN-y) por las células T transducidas con CAR mostradas en la figura 1B cuando se cultiva in vitro con las líneas celulares tumorales BCMA-(K562) o BCMA+ (K562 BCMA, U266, MM1.S) indicadas. (D) Lisis específica de las líneas celulares diana indicadas por las células CAR-T contra BCMA.
(E) Ilustración de dos CAR a modo de ejemplo de esta divulgación, en la que la región de espaciador (espaciador ) pueden incluir un casete de etiqueta, un módulo de ligador, una bisagra, un aminoácido espaciador y cualquier combinación de los mismos. Si el CAR contiene una o más etiquetas en la región de espaciador, se denominaría T-ChARM tal como se describe en el presente documento. El CAR superior contiene un componente extracelular (que se compone de un scFv específico de BCMA y una región de espaciador que contiene opcionalmente otros elementos, tales como una etiqueta o un ligador), una porción hidrófoba (que se compone de un dominio transmembrana de CD28), y un componente intracelular (que se compone de un dominio efector de CD3 ^ y un dominio coestimulador de 4-1BB). El CAR inferior contiene un componente extracelular (que se compone de un scFv específico de BCMA y una región de espaciador que contiene opcionalmente otros elementos, tales como una etiqueta o un ligador), una porción hidrófoba (que se compone de un dominio transmembrana de CD28), y un componente intracelular (que se compone de un dominio efector de CD3 ^ y un dominio coestimulador de CD28). Ambos constructos de CAR/T-ChARM específicos de BCMA contienen un marcador génico para la transducción que comprende un EGFR humano truncado (EGFRt), que se separa de los constructos de CAR/T-ChARM específicos de BCMA mediante una secuencia peptídica del virus Thoseaasigna 2A (T2A) autoescindible. También pueden usarse otros péptidos autoescindibles conocidos, tal como teschovirus porcino-1 2A (P2A), virus de la rinitis equina A (ERAV) 2A (E2A) y virus de la fiebre aftosa (FMDV) 2A (F2A).
(F) Constructos de CAR/T-ChARM a modo de ejemplo que tienen regiones de espaciador de diferente longitud, sh = espaciador corto de 12 aminoácidos; 2ST = espaciador de 48 aminoácidos con dos casetes de Strep tag; 3ST = espaciador de 66 aminoácidos con tres casetes de Strep tag; 2ST Int = espaciador de longitud intermedia de 157 aminoácidos con dos casetes de Strep tag; y Lo = espaciador largo de espaciador de 228 aminoácidos. Los espaciadores corto y largo pueden contener opcionalmente un casete de etiqueta, tal como una Strep tag.
(G) Ilustraciones adicionales de constructos de CAR/T-ChARM a modo de ejemplo con un scFv de HL de C11 o A7 y que tienen diferentes regiones de espaciador, incluyendo opcionalmente etiquetas STII.
(H) La capacidad de las células T humanas modificadas con CAR específicos de BCMA para reconocer el BCMA y proliferar se mide marcando las células T con carboxifluorosceína (CFSE), cultivando las células CAR-T o células T marcadas con CFSE no transducidas de control con células K562 transducidas con un polinucleótido que codifica para BCMA de longitud completa (K562/BCMA), y usando citometría de flujo para medir la dilución de CFSE con cada división celular. Las células T marcadas con CFSE que contienen diferentes CAR específicos de BCMA con diferentes longitudes de espaciador, pero no células T no transducidas de control (UT), diluyeron CFSE después del cultivo conjunto con células K562/BCMA. Las células CAR-T que contienen los espaciadores largos o 2 ST proliferaron mejor que las células CAR-T que expresan el espaciador corto.
(I, J) Liberación de citocinas (IFN-y, I; IL-2, J) mediante células CAR-T anti-BCMA con diferentes longitudes de espaciador en respuesta a células de mieloma U266 y 8266 que expresan BCMA.
(K) Expresión de EGFRt y STII en la superficie celular en células T CD8+ transducidas con constructos de T-ChARM de C11 anti-BCMA o de CAR BCMA-2 después del aislamiento y la expansión.
(L, M) Liberación de citocinas (IFN-y, L; IL-2, M) mediante células T humanas CD4 (paneles superiores) y CD8 (paneles inferiores) modificadas con ingeniería para expresar las T-ChARM de C11 de esta divulgación que incluyen un dominio coestimulador de 41BB o un dominio coestimulador de CD28, o mediante un CAR anti-BCMA divulgado anteriormente (“BCMA-2”; véase Carpenter et al. Clin. Cancer Res. 19:2048, 2013).
(N) Proliferación de células T humanas modificadas por ingeniería para expresar las T-ChARM de C11 o el CAR BCMA-2 cuando se cultivan conjuntamente con las líneas celulares que expresan BCMA indicadas.
(O) Lisis de células negativas para BCMA K562 mediante células T CD8 modificadas por ingeniería para expresar las T-ChARM de C11 de esta divulgación (círculo = dominio coestimulador de 41BB, cuadrado = dominio coestimulador de CD28) o CAR BCMA-2 (triángulo) a las razones E:T indicadas.
(P) Lisis de células K562 transducidas para expresar BCMA mediante las células T CD8 modificadas por ingeniería indicadas en la figura 1O en diversas razones E:T (eje x).
Las figuras 2A-2Q muestran la producción de BCMA y PD-L1 mediante células de mieloma múltiple (MM) en cultivo y el efecto de BCMA soluble, BCMA unido a la superficie y PD-L1 unido a la superficie sobre la capacidad de las células T T-ChARM anti-BCMA para reconocer las células tumorales y producir IFN-y.
(A) Se lavaron y se sembraron en placa células de mieloma U266 durante 1, 3, 5 y 24 horas. Se recogió el sobrenadante del medio y se analizó mediante ELISA para determinar el BCMA soluble. Los datos muestran un aumento dependiente del tiempo en los niveles de BCMA soluble (sBCMA) en el sobrenadante.
(B) Histogramas que muestran la expresión de BCMA mediante células de MM de referencia (RPMI 8226) o mediante células de MM primarias de pacientes a modo de ejemplo que tienen una expresión alta (Pt. 1), intermedia (Pt. 2) o baja/negativa (Pt. 3) tal como se mide mediante ELISA (negro = anticuerpo anti-BCMA; línea gris = control de isotipo).
(C) Gráfico que muestra los porcentajes de pacientes con mieloma (n = 19) que tienen una expresión de BCMA alta, intermedia o baja/negativa en células de MM.
(D) Producción de IFN-y mediante células T CD8+ T-ChARM+ de C11 anti-BCMA en respuesta a la estimulación con células de MM del paciente con expresión de BCMA alta (izquierda, n = 5) o baja (derecha, n = 4) (24 horas a E:T 2:1 (ELISA)). Se sometió a prueba la significación usando una prueba de la t bilateral para datos independientes y las barras representan la producción promedio de IFN-y + EEM.
(E) Histogramas que muestran la expresión de PD-L1 mediante células de mieloma RPMI 8226 (panel más a la izquierda) y células de MM primarias de 3 pacientes que tienen expresión de PD-L1 alta, baja/negativa o intermedia, tal como se mide mediante ELISA (sombreado diagonal = tinción con anticuerpo anti-PD-L1; histograma vacío = control de isotipo).
(F) Gráfico que muestra el porcentaje de pacientes (n = 19) que tienen una expresión de PD-L1 alta, intermedia o baja/negativa en células de MM.
(G) Producción de IFN-y mediante células CD8+ T-ChARM+ de C11 anti-BCMA de esta divulgación en respuesta a células de MM del paciente con expresión de PD-L1 alta (izquierda, n = 4) o baja (derecha, n = 5) (24 horas a E:T 2:1 (ELISA)). Se sometió a prueba la significación usando una prueba de la t bilateral para datos independientes y las barras representan la producción promedio de IFN-y + EEM.
(H) Producción de IFN-y mediante células T T-ChARM específicas de BCMA en presencia de BCMA soluble exógeno. Se añadió sBCMA a cultivos conjuntos de células T que expresan una T-ChARM específica de BCMA y células K562 transducidas con un polinucleótido que codifica para BCMA de longitud completa (K562/BCMA+). Existe una inhibición dependiente de la dosis de la función efectora de células T T-ChARM específicas de BCMA, tal como se mide mediante la liberación de IFN-y en el sobrenadante del medio.
(I) Datos de otro experimento de valoración de dosis que muestra el efecto de sBCMA sobre la producción de IFN-y mediante células T T-ChARM específicas de BCMA que reconocen las células K562 BCMA+, que incluía añadir sBCMA al cultivo a otra concentración más alta (5000 ng/ml).
(J) Excreción de BCMA mediante las células de MM indicadas cultivadas in vitro.
(K) sBCMA medido en suero de médula ósea (MO) de pacientes con carga de enfermedad menor (<2 % de células CD138+) o mayor ( >2 % de células CD138+).
(L) Unión de sBCMA a células T C113ST-ChARM de esta divulgación. Se incubaron las células T con los niveles indicados de sBCMA recombinante (lado derecho del diagrama) y luego se tiñeron con una proteína de fusión BCMA-Fc que se conjugó con APC.
(M) Datos de citometría de flujo que muestran tinción superficial (BCMA-Fc conjugado con APC y anticuerpo anti-EGFRt) y expresión de CD4 de células con T-ChARM de C113ST y células CAR-T FMC63.
(N) Datos de citometría de flujo que muestran la producción de IFN-y (eje y) y la expresión de CD4 (eje x) mediante células T que expresan o bien C113ST-ChARM (“C113ST”) de esta divulgación o bien un CAR anti-CD19 de control (“FMC632”), en cultivo conjunto con células K562 que expresan la diana y a las cuales se les administró la proteína de fusión BCMA-Fc (paneles de la izquierda: 0 ng/ml de BCMA-Fc; paneles de la derecha: 1000 ng/ml de BCMA-Fc. (O) Valoración de dosis que muestra la liberación IFN-y mediante las células CAR-T en respuesta a las líneas celulares diana tal como se indica en presencia o ausencia de BCMA recombinante exógeno (proteína de fusión BCMA-Fc). FMC63 (anti-CD19) frente a K562 CD19+ (control; triángulo hacia abajo); células T con T-ChARM de C113ST frente a células RPMI 8226 (triángulo hacia arriba), U266 (cuadrado) y K562 BCMA+ (círculo). Los datos son representativos de 2 experimentos independientes. Las barras representan la media EEM. Valor de p = < 0,05, tal como se determina mediante ANOVA de un factor con prueba a posteriori. MFI= intensidad de fluorescencia media.
(P) Producción de IFN-y (intensidad de fluorescencia media normalizada, MFI) mediante las células T mostrada en la figura 2O en cultivo conjunto con las células que expresan el antígeno indicadas y en presencia o ausencia de BCMA-Fc (eje x).
(Q) Actividad citolítica de células T CD8+ con T-ChARM de C113ST frente a células diana K562 BCMA+ y de células CAR-T FMC63 frente a células diana K562 CD19+ en concentraciones variables de BCMA recombinante, analizada mediante un CRA de 4 horas con una razón E:T de 10:1. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes. Las barras representan la media EEM. Valor de p = < 0,05, tal como se determina mediante ANOVA de un factor con prueba a posteriori. MFI = intensidad de fluorescencia media.
Las figuras 3A-3R muestran el efecto del inhibidor de la y-secretasa (GSI) RO4929097 sobre los niveles de BCMA de la superficie celular y otras moléculas de la superficie celular en líneas celulares de mieloma o células de mieloma primarias.
(A) Se midió BCMA en la superficie celular en cuatro líneas celulares de mieloma (8226, U266B1, MM1.R, H929) mediante citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal anti-BCMA antes y 5 horas después (véanse los diagramas) de la incubación de las líneas celulares de mieloma con GSI RO4929097 en un intervalo de concentraciones de desde 0 |iM (control de DMSO) hasta 1,0 |iM.
(B) Expresión de BCMA superficial por células MM.1R cultivadas con las concentraciones indicadas de RO4929097; tinción con anticuerpo anti-BCMA (líneas negras) en comparación con el control de isotipo (línea gris).
(C) Cambio en veces en la expresión de BCMA superficial mediante líneas celulares de MM cuando se cultivan con las concentraciones indicadas de RO4929097; cambio en veces indicado en relación con las células de MM no tratadas de la misma línea.
(D) Cinética de cambio en veces de la expresión de BCMA superficial a lo largo del tiempo mediante las células de MM indicadas en cultivo con RO49290971 |iM.
(E) Se incubaron células de mieloma U266 durante 1, 3, 5 y 24 horas en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (0,01 |iM, 0,1 |iM y 1,0 |iM) y se evaluó la expresión de BCMA superficial mediante citometría de flujo. La expresión de BCMA aumentó de manera dependiente de la dosis en presencia del GSI con el aumento máximo observado después de 5 horas de exposición.
(F) Cambio en veces de la expresión de BCMA superficial en líneas celulares (MM1R = triángulo; U266 = cuadrado; 8226 = círculo) cultivadas en 1 |iM de GSI a lo largo del tiempo. Se volvió a administrar GSI como medio cambio de medio cada 2 días. El cambio en veces en BCMA se define como (MFIBCMA-MFIiso) tratadas/(MFIBCMA-MFIiso) de control. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.
(G, H) Concentración de sobrenadante de cultivo de sBCMA en células de línea celular de MM cultivadas en presencia de las concentraciones indicadas de RO4929097.
(I) Se lavaron y se sembraron en placa células de mieloma U266 en medios de cultivo en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (0,01 |iM, 0,1 |iM y 1,0 |iM). El sobrenadante de los medios se recogió después de 1, 3, 5 y 24 horas y se analizó para determinar el BCMA soluble (sBCMA) mediante ELISA. Los datos muestran que la cantidad de BCMA liberada de las células tumorales al sobrenadante disminuyó a lo largo del tiempo cuando estaba presente un GSI a una concentración de al menos aproximadamente 0,01 |iM.
(J, K) Cambio en veces en la expresión de BCMA (J) y las concentraciones de sBCMA del sobrenadante (K) en diversos puntos de tiempo después de que se haya eliminado 1 |iM de GSI de cultivos de líneas celulares de mieloma (GSI /-) en comparación con cultivos con presencia continua de GSI (GSI /+).
(L) Viabilidad de las células que expresan MM indicadas, tal como se mide mediante tinción con yoduro de propidio de líneas celulares cultivadas en 1 |iM de GSI.
(M) Expresión de BCMA superficial mediante células de MM primarias del paciente cultivadas con las concentraciones indicadas de R04929097. La tinción fue tal como se describe con respecto a la figura 3B.
(N) Cambio en veces en BCMA en células de mieloma primarias (n=7) cultivadas con cantidades variables de GSI durante 4 h. Se cultivaron las líneas primarias y celulares a 0,5x106 células/ml. El cambio en veces en BCMA se define como (MFIBCMA-MFIiso) tratadas/(MFIBCMA-MFIiso) de control. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con células T derivadas de diferentes donantes.
(O, P) El cultivo conjunto de células de mieloma primarias con diversas concentraciones de GSI durante 4 horas no afecta a los niveles de varias otras moléculas de la superficie celular en las células tumorales, incluyendo CS1, CD86, PD-L1, CD80 y CD38.
(Q) Tinción de diversos marcadores de superficie en células MM1R en presencia (negro) o ausencia (gris) de 1 |iM de GSI en medios de cultivo. La tinción de isotipo se muestra como un gráfico abierto.
(R) Se enriquecieron células de mieloma primarias CD138+ a partir de muestras de médula ósea de pacientes, se incubaron durante 3 horas en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (de 0,01 |iM a 10 |iM) y se evaluaron para determinar la expresión de BCMA superficial mediante citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de BCMA en las células tumorales se presenta como un aumento en veces con respecto a la observada en las células tumorales incubadas sin RO429097. Se observa una regulación por incremento dependiente de la dosis de BCMA.
Las figuras 4A - 4C muestran que la liberación de citocinas después del reconocimiento de células de mieloma primarias mediante células CAR-T específicas de BCMA aumenta cuando las células de mieloma se tratan previamente con un GSI.
(A) Producción de IL-2 mediante células CAR-T contra BCMA (T-ChARM de C11 3ST-CD28 específicas de BCMA y T-ChARM de C11 3ST-41BB específicas de BCMA) o células CAR-T de CD19sh (espaciador corto) de control cultivadas conjuntamente con células tumorales primarias de mieloma humano durante 24 horas solas o con diversas concentraciones de GSI RO429097 (de 0,003 |iM a 3,0 μM).
(B) Producción de IFN-y mediante células T T-ChARM de BMCA cultivadas conjuntamente con células de mieloma en diversas concentraciones de RO429097.
(C) La proliferación de células T T-ChARM específicas de BCMA marcadas con CFSE aumentó de manera dependiente de la dosis después del cultivo conjunto durante 3 días con células tumorales primarias de mieloma humano en medio solo o en medio que contenía GSI RO492097 en las concentraciones indicadas.
Las figuras 5A-5R muestran el efecto de diversas concentraciones de GSI sobre la viabilidad, el crecimiento y la actividad funcional de células CAR-T.
(A) Tinción de CD19 de células K562 CD19+ y Raji que se cultivaron con o sin GSI durante 12-16 h. El control de isotipo se muestra como una línea gris.
(B) Se cultivaron células T humanas primarias en GSI RO4929097 a concentraciones que oscilaban desde 0,01 |iM hasta 100 |iM y la viabilidad se midió mediante la exclusión del tinte azul de tripano después de 24 horas. No hubo efecto del GSI, a ninguna concentración, sobre la viabilidad de las células T.
(C) Se cultivaron conjuntamente células CD19 CAR-T con células diana K562/CD19 en medio que contenía diversas concentraciones de RO4929097. RO4929097 inhibe la función efectora de las células CD19 CAR-T en concentraciones de >3 |iM cuando se cultivan conjuntamente, según se determina midiendo la producción de IL-2 (panel superior) e IFNy (panel inferior). El recuadro muestra el intervalo terapéutico relevante del fármaco que no inhibe la función efectora de las células CAR-T.
(D) Producción de IL-2 mediante células CD19 CAR-T cultivadas con células diana en presencia de concentraciones crecientes de GSI RO4929097.
(E) Producción de IL-2 mediante células CD19 CAR-T cultivadas con células diana (“K562 CD19”) o células de control (“K562 BCMA”) en presencia de concentraciones crecientes de GSI RO4929097. A las células se les administraron las cantidades indicadas de GSI y luego se lavaron (barras vacías) o no (barras llenas).
(F) Datos de otro experimento que muestra la producción de IL-2 mediante células CD19 CAR-T después de un cultivo conjunto durante la noche con células K562 BCMA+ o K562 CD19+ después de la preincubación con concentraciones variables de GSI. Después del lavado, se volvió a añadir GSI (+/+) al, o se dejó fuera (+/-) del, cultivo conjunto para evaluar la reversibilidad de la producción de citocinas.
(G) Lisis específica, mediante células CD19 CAR-T, de las células diana o de control indicadas en presencia de GSI RO4929097.
(H) Proliferación de células CD19 CAR-T cultivadas con células diana que expresan CD19 en presencia o ausencia de GSI o con células de control en ausencia de GSI. Se tiñeron las células con CFSE y se midió la proliferación mediante citometría de flujo.
(I) Representación gráfica del número de divisiones celulares de células CD19 CAR-T en presencia de las concentraciones indicadas de GSI RO4929097. La anchura de las barras horizontales representa la proporción de células CAR-T en cultivo que dividió el número indicado de generaciones (es decir, 5, 4, 3, 2, 1 ó 0 generaciones) a lo largo del experimento.
(J) Recuentos de células (tinción de CD8) durante la expansión de células CAR-T específicas de CD19 con células CD19+ TM LCL e IL-2 exógena en ausencia de GSI (círculo) o presencia de GSI a 0,5 |iM (cuadrado) o 5 |iM (triángulo).
(K) Recuentos de células de células CAR-T específicas de CD19 (CD4:CD8 (1:1) expandidas con células CD19+ TM LCL en ausencia o presencia de GSI tal como se indica, pero sin la adición de IL-2 exógena.
(L) Concentraciones de IFN-y en sobrenadantes de células T anti-CD19 CAR CD8+ expandidas con GSI después de la reestimulación con células K562 (sin antígeno), células K562 CD19+ o células Raji.
(M, N) Producción de IFN-y (M) e IL-2 (N) mediante la mezcla de células CAR-T CD4:CD8 anti-CD19 después de la reestimulación con las líneas celulares indicadas en ausencia de GSI o en presencia de 0,5 |iM o 5 |iM de GSI. (O) Tinción intracelular que muestra la producción de IFN-y (eje y) y la expresión de CD8 (eje x) mediante células T T-ChARM de la presente divulgación cultivadas con células de MM primarias de 2 pacientes en ausencia (0 |iM; paneles izquierdos ) o presencia (1 |iM; paneles derechos) de GSI RO4929097.
(P) Producción de IFN-y (intensidad de fluorescencia media geométrica (gMFI)) mediante células T T-ChARM de la presente divulgación cultivadas con células de MM primarias en presencia de la concentración indicada de RO4929097 (eje x).
(Q) Producción de IFN-y (MFI normalizada; eje y) mediante células T T-ChARM de la presente divulgación cultivadas con células de MM primarias en presencia de la concentración indicada de RO4929097 (eje x).
(R) Proliferación de células T T-ChARM de la presente divulgación en presencia de células de MM primarias que no se trataron (sombreado gris) o se trataron con 1,0 |iM de GSI RO4929097.
Las figuras 6A-6C muestran los efectos de GSI RO4929097 sobre la expresión de BCMA en un modelo preclínico in vivo de mieloma múltiple.
(A) Esquema experimental para un modelo de mieloma murino de xenoinjerto diseminado. Se irradiaron ratones NSG (275 rad) para facilitar el injerto tumoral y recibieron células tumorales de MM humano (5x106 de MM.1R) seguido de tratamiento con GSI (30 mg/kg). Posteriormente, se sacrificó a los ratones y se tomaron muestras de sangre y de MO para determinar si el GSI había regulado por incremento la expresión de BCMA en las células de mieloma in vivo.
(B) Cambio en veces en la expresión de BCMA superficial en células de mieloma en ratones sometidos a eutanasia en los puntos de tiempo indicados después de la segunda administración de GSI.
(C) Niveles de sBCMA en sueros de ratones sacrificados en los puntos de tiempo indicados después de la administración de RO4929097.
Las figuras 7A-7E muestran los efectos de GSI RO4929097 sobre la terapia con células CAR-T anti-BCMA en el modelo preclínico de MM de ratón.
(A) Esquema experimental en el que los ratones recibieron radiación seguida de células tumorales de MM humano (5x106 de MM.1R que expresa luciferasa de luciérnaga). Veinte días después de esto, a los ratones se les administró GSI (30 mg/kg) en los puntos de tiempo indicados y una dosis subóptima única de células T T-ChARM anti-BCMA (0,33x106 células, CD4:CD8 1:1) en el día 0. Se monitorizaron la obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI) y la supervivencia en todo momento.
(B) Imágenes de BLI de ratones tomadas los días 2, 17 y 16 después del tratamiento con células T con T-ChARM de C113ST (0 mg/kg 0,33x106 células, CD4:CD8 1:1, paneles izquierdos; 30 mg/kg, paneles intermedios) o controlar células CAR-T anti-CD19 FM63 (0,33x106 células, CD4:CD81:1, 30 mg/kg, paneles derechos).
(C) Datos de luminiscencia cuantificados de la BLI mostrada en la figura 8B.
(D) Porcentaje de supervivencia de los ratones mostrados en la figura 8B después de la administración de las células T T-ChARM.
(E) (izquierda) Datos de luminiscencia cuantificados de la BLI mostrada en la figura 8B; (derecha) porcentaje de supervivencia de los ratones después de la administración de las células T T-ChARM.
La figura 8 muestra el análisis de citometría de flujo de la unión de una molécula de fusión biespecífica con especificidad para BCMA a células H929 de MM en presencia o ausencia de GSI. También se sometió a prueba una molécula de fusión biespecífica de control que no selecciona como diana BCMA.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno proliferativos a través del uso combinado de un receptor de antígeno quimérico (CAR) o una molécula de receptor de antígeno quimérico marcada (T-ChARM) específicos del antígeno de maduración de células B (BCMA) expresados en una célula T, y un inhibidor de y-secretasa (GSI). Los polinucleótidos que codifican para tales CAR/T-ChARM específicos de BCMA pueden usarse para generar células T huésped modificadas para su uso en, por ejemplo, inmunoterapia adoptiva. La presente divulgación se refiere al uso de una terapia de este tipo en un sujeto que necesita un tratamiento en combinación con un GSI, último tratamiento que puede administrarse antes, de manera concurrente con, o posteriormente a la inmunoterapia adoptiva (es decir, inmunoterapia con una célula T modificada que expresa un CAR o una T-ChARM específicos de BCMA en la superficie celular).
Antes de exponer esta divulgación con más detalle, puede resultar útil para comprender la misma proporcionar definiciones de determinados términos que van a usarse en el presente documento. A lo largo de esta divulgación se exponen definiciones adicionales.
En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentajes, intervalo de razones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Además, debe entenderse que cualquier intervalo de números mencionado en el presente documento que se refiera a cualquier característica física, tal como subunidades de polímero, tamaño o grosor, incluye cualquier número entero dentro del intervalo mencionado, a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa 20 % del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos “un/uno” y “una” tal como se usan en el presente documento se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) significa uno, ambos, o cualquier combinación de las mismas de las alternativas. Tal como se usa en el presente documento, los términos “incluir”, “tener” y “comprender” se usan de manera sinónima, y se pretende que estos términos y variantes de los mismos se interpreten como no limitativos.
Además, debe entenderse que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diversas combinaciones de la estructures y sustituyentes descritos en el presente documento, se divulgan mediante la presente solicitud en la misma medida que si cada compuesto o grupo de compuestos se expuso de manera individual. Por tanto, la selección de estructuras particulares o sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente divulgación.
El término “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados, o a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas de una invención reivindicada. Por ejemplo, un dominio de proteína, región, módulo o casete (por ejemplo, un dominio de unión, región bisagra, módulo de ligador, casete de etiqueta) o una proteína (que puede tener uno o más dominios, regiones, módulos o casetes) “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos particular cuando la secuencia de aminoácidos de un dominio, región, módulo, casete o proteína incluyen extensiones, deleciones, mutaciones, o una combinación de las mismas (por ejemplo, aminoácidos en el extremo amino- o carboxilo-terminal o entre dominios) que, en combinación, contribuyen en como máximo un 20 % (por ejemplo, como máximo un 15 %, 10 %, 8 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de la longitud de un dominio, región, módulo, casete o proteína y no afectan sustancialmente (es decir, no reducen la actividad en más de un 50 %, tal como no más de un 40 %, 30 %, 25%, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 1 %) la actividad del/de los dominios(s), región/regiones, módulo(s), casete(s) o proteína (por ejemplo, la afinidad de unión a la diana de una proteína de unión o casete de etiqueta).
Tal como se usa en el presente documento, “trastorno proliferativo” se refiere a un crecimiento o una proliferación excesivos o de otro modo anómalos en comparación con una célula normal o no enferma. El crecimiento excesivo o anómalo incluye, por ejemplo, el crecimiento o la proliferación desregulados que se produce rápidamente (por ejemplo, hiperproliferación) o puede producirse más lenta o progresivamente a lo largo del tiempo (por ejemplo, mieloma múltiple), dentro de un tejido nativo (por ejemplo, crecimiento de plasmocitoma dentro de la médula ósea), así como propagarse a/crecer dentro de un sitio del cuerpo o tejido distal que es no nativo con respecto a la célula enferma. Los trastornos proliferativos a modo de ejemplo incluyen tumores, cánceres, tejido neoplásico, carcinoma, sarcoma, células malignas, células premalignas, así como trastornos proliferativos no neoplásicos o no malignos (por ejemplo, adenoma, fibroma, lipoma, liomioma, hemangioma, fibrosis, reestenosis), o enfermedades autoinmunitarias (tal como artritis reumatoide, artrosis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, o similares).
Una “proteína de unión” (también denominada “dominio de unión”, “región de unión” o “resto de unión”), tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula, tal como un péptido, oligopéptido, polipéptido, o una proteína que posee la capacidad de asociarse, unirse o combinarse específicamente y de manera no covalente con una molécula diana (por ejemplo, BCMA). Una proteína de unión incluye cualquier pareja de unión que se produce de manera natural, sintético, semisintético o producido de manera recombinante para una molécula biológica, compuesto u otra diana de interés. En algunas realizaciones, un CAR/T-ChARM incluye un dominio de unión o fragmento de unión a antígeno funcional de una inmunoglobulina o molécula similar a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o receptor de células T (TCR). Las proteínas de unión a modo de ejemplo incluyen regiones variables de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, scFv, Fab), ligandos de BCMA (por ejemplo, BAFF, APRIL y fragmentos de unión de los mismos), regiones de unión a antígenos de receptores de células T (TCR), tal como los TCR de cadena sencilla (scTCR), o polipéptidos sintéticos seleccionados por la capacidad específica para unirse a una molécula biológica.
Tal como se usa en el presente documento, “se une específicamente” se refiere a una asociación o unión de un dominio de unión, o una proteína de fusión del mismo, a una molécula diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual a o mayor de 105 M-1, mientras que no asocia o se une significativamente con cualquier otra molécula o componente en una muestra. Los dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) pueden clasificarse como dominios de unión de “alta afinidad” (o proteínas de fusión de los mismos) o dominios de unión de “baja afinidad” (o proteínas de fusión de los mismos). Dominios de unión de “alta afinidad” se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, o al menos 1013 M-1. Dominios de unión de “baja afinidad” se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd ) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5 M a 10-13 M). En determinadas realizaciones, un dominio de unión puede tener una “afinidad mejorada”, que se refiere a un dominio de unión seleccionado o modificado con ingeniería con una unión más fuerte a un antígeno diana que un dominio de unión de tipo natural (u original). Por ejemplo, la afinidad mejorada puede deberse a una Ka (constante de asociación en equilibrio) para el antígeno diana que es mayor que la del dominio de unión de tipo natural, o debido a una Kd (constante de disociación) para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural, o debido a una velocidad de disociación (Kf para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural. Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente divulgación que se unen específicamente a una diana particular, así como para determinar afinidades de dominios de unión o proteínas de fusión, tales como inmunotransferencia de tipo Western, ELISA y análisis Biacore® (véanse también, por ejemplo, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; y las patentes estadounidenses n.os 5.283.173, 5.468.614, o equivalentes).
Tal como se usa en el presente documento, “heterólogo” o “no endógeno” o “exógeno” se refiere a cualquier gen, proteína, compuesto, molécula o actividad que no es nativo con respecto a una célula huésped o un sujeto, o es cualquier gen, proteína, compuesto, molécula o actividad nativo con respecto a un huésped o una célula huésped, pero se ha alterado o mutado de modo que la estructura, la actividad o ambas es diferente entre las moléculas nativas y mutadas. En determinadas realizaciones, las moléculas heterólogas, no endógenas o exógenas (por ejemplo, receptores, ligandos) pueden ser no endógenas con respecto a una célula huésped o un sujeto, pero en cambio pueden haberse añadido ácidos nucleicos que codifican para tales moléculas a una célula huésped mediante conjugación, transformación, transfección, electroporación, o similares, en las que la molécula de ácido nucleico añadida puede integrarse en el genoma de la célula huésped o puede existir como material genético extracromosómico (por ejemplo, como plásmido u otro vector autorreplicante). El término “homólogo” o “el homólogo” se refiere a una molécula o una actividad hallada en o derivada de una célula, especie o cepa huésped. Por ejemplo, una molécula heteróloga o exógena o un gen que codifica para la molécula pueden ser homólogos con respecto a un huésped nativo o molécula nativa o gen nativo de célula huésped que codifica para la molécula, respectivamente, pero puede tener una estructura, secuencia, nivel de expresión alterados o combinaciones de los mismos. Una molécula no endógena puede ser de la misma especie, una especie diferente o una combinación de las mismas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “endógeno” o “nativo” se refiere a un gene, una proteína, un compuesto, una molécula o una actividad que está presente normalmente en un huésped o una célula huésped.
Tal como se usa en el presente documento, “casete de etiqueta” se refiere a una secuencia peptídica única fijada a, fusionada con, o que forma parte de una proteína de interés, a la que puede unirse específicamente una molécula de unión relacionada heteróloga o no endógena (por ejemplo, un receptor, ligando, anticuerpo u otra pareja de unión) donde la propiedad de unión puede usarse para detectar, identificar, aislar o purificar, seguir, enriquecer, o seleccionar como diana una proteína marcada o células que expresan una proteína marcada, particularmente cuando una proteína marcada forma parte de una población heterogénea de proteínas u otro material, o cuando las células que expresan una proteína marcada forman parte de una población heterogénea de células (por ejemplo, una muestra biológica como sangre periférica). En determinadas realizaciones, una célula que expresa una proteína marcada puede ponerse en contacto con una molécula de unión relacionada heteróloga o no endógena e inducir una respuesta biológica, tal como promover la activación celular, proliferación celular o muerte celular. En las proteínas de fusión proporcionadas, la capacidad del/de los casete(s) de etiqueta para unirse específicamente por la(s) molécula(s) de unión relacionada(s) es distinta de o adicional a la capacidad del/de los dominio(s) de unión para unirse específicamente a las molécula(s) diana. El casete de etiqueta generalmente no es una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, no es un anticuerpo o TCR o una porción de unión a antígeno de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, una “región bisagra” o una “bisagra” se refiere a (a) una secuencia bisagra de inmunoglobulina (compuesta, por ejemplo, por regiones superior y central) o un fragmento funcional o variante de la misma, (b) una región del interdominio (tallo) de la lectina C de tipo II o un fragmento funcional o variante de la misma, o (c) una región del tallo de la molécula de grupo de diferenciación (CD) o una variante funcional de la misma. Tal como se usa en el presente documento, una “región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural” se refiere a secuencias de aminoácidos de bisagra superior y media que se producen de manera natural interpuestas entre y conectando los dominios de CH1 y CH2 (para IgG, IgA e IgD) o interpuestas entre y conectando los dominios de CH1 y CH3 (para IgE e IgM) hallados en la cadena pesada de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, una región bisagra es humana y, en realizaciones particulares, comprende una región bisagra de IgG humana.
Tal como se usa en el presente documento, una “región de espaciador” se refiere a una o más proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, dominios, regiones, módulos, casetes, motivos o cualquier combinación de los mismos que unen dos o más proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, dominios, regiones, módulos, casetes, motivos o cualquier combinación de los mismos en una proteína de fusión. Por ejemplo, una región de espaciador puede proporcionar una función de separación o espaciado para facilitar la interacción de dos proteínas de fusión de cadena sencilla, o el posicionamiento de uno o más dominios de unión, de modo que la estructura polipeptídica resultante mantiene una afinidad de unión específica a una molécula diana o mantiene la actividad de señalización (por ejemplo, actividad de dominio efector) o ambas. En determinadas realizaciones, una región de espaciador puede comprender un “módulo de ligador” que es una secuencia de aminoácidos que tiene desde aproximadamente dos hasta aproximadamente 500 aminoácidos, lo que puede proporcionar flexibilidad y espacio para el movimiento conformacional entre dos regiones, dominios, motivos, casetes o módulos conectados por un ligador. Los módulos de ligador a modo de ejemplo incluyen aquellos que tiene desde una hasta aproximadamente diez repeticiones de GlyxSery (SEQ ID NO:31), en el que x e y son independientemente un número entero de desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0 (por ejemplo, (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO:32), (Gly3Ser)2 (SEQ ID NO:33), Gly2Ser, o una combinación de los mismos tal como (Gly3Ser)2Gly2Ser)) (SEQ ID NO:34). En otras realizaciones determinadas, una región de espaciador puede tener un módulo de ligador que comprende una o más regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, tales como una CH3 sola o una CH2CH3. En realizaciones adicionales, una región de espaciador puede comprender una región bisagra o un casete de etiqueta. Cada uno de tal componente de conector no es mutuamente exclusivo. Por ejemplo, una región de espaciador puede comprender una bisagra y uno o más módulos de ligador, o una región de espaciador puede comprender una bisagra, uno o más módulos de ligador, y uno o más casetes de etiqueta. Las regiones de espaciador a modo de ejemplo pueden variar en longitud, por ejemplo, desde aproximadamente cinco hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o desde aproximadamente diez hasta aproximadamente 350 aminoácidos, o desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100 aminoácidos, o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 75 aminoácidos, o desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 aminoácidos. Los espaciadores cortos a modo de ejemplo oscilan desde aproximadamente cinco hasta aproximadamente 100 aminoácidos (por ejemplo, 12 aminoácidos, 15 aminoácidos, 48 aminoácidos, 50 aminoácidos, 66 aminoácidos, 70 aminoácidos), los espaciadores intermedios oscilan desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 aminoácidos (por ejemplo, 110 aminoácidos, 120 aminoácidos, 130 aminoácidos, 140 aminoácidos, 150 aminoácidos,157 aminoácidos, 175 aminoácidos), y los espaciadores largos oscilan desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500 aminoácidos (por ejemplo, 200 aminoácidos, 210 aminoácidos, 220 aminoácidos, 228 aminoácidos, 230 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos).
Una “porción hidrófoba,” tal como se usa en el presente documento, significa cualquier secuencia de aminoácidos que tiene una estructura tridimensional que es termodinámicamente estable en una membrana celular, y generalmente oscila en longitud desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 30 aminoácidos. La estructura de un dominio hidrófobo puede comprender una hélice alfa, un barril beta, una lámina beta, una hélice beta, o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, un “dominio efector” es una porción intracelular de una proteína de fusión o un receptor que puede promover directa o indirectamente una respuesta biológica o fisiológica en una célula cuando recibe la señal apropiada. En determinadas realizaciones, un dominio efector forma parte de una proteína o complejo de proteínas que recibe una señal cuando está unida, o se une directamente a una molécula diana, que desencandena una señal del dominio efector. Un dominio efector puede promover directamente una respuesta celular cuando contiene uno o más motivos o dominios de señalización, tales como un motivo de activación de inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM), y un dominio coestimulador o una porción funcional del mismo puede ayudar a o mejorar una respuesta celular de este tipo. Una proteína a modo de ejemplo que tiene un dominio efector es CD3^. En otras realizaciones, un dominio efector promoverá indirectamente una respuesta celular asociándose con una o más de otras proteínas que promueven directamente una respuesta celular.
Un “dominio coestimulador”, tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a un resto de señalización que proporciona a las células T una señal que, además de la señal primaria (efectora) proporcionada, por ejemplo, una cadena de CD3^ del complejo TCR/CD3, media en una respuesta de células T, incluyendo la activación, proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, o similares. En determinadas realizaciones, un componente intracelular comprende un dominio efector o una porción funcional del mismo, un dominio coestimulador o una porción funcional del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
Un “ligador de región variable” se refiere específicamente a una secuencia de cinco a aproximadamente 35 aminoácidos que conecta una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada a una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o conecta cadenas Va/p y Ca/p (por ejemplo, Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp) de receptor de células T o conecta cada par Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp a una bisagra o un dominio hidrófobo, que proporciona una función de espaciador y flexibilidad suficiente para la interacción de los dos subdominios de unión de modo que el polipéptido de cadena sencilla resultante retiene una afinidad de unión específica a la misma molécula diana que un anticuerpo o receptor de células T. En determinadas realizaciones, un ligador de región variable comprende desde aproximadamente diez hasta aproximadamente 30 aminoácidos o desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 aminoácidos. En realizaciones particulares, un péptido de ligador de región variable comprende desde una hasta diez repeticiones de GlyxSery, en el que x e y son independientemente un número entero desde 1 hasta 5 (por ejemplo, Gly4Ser (SeQ ID NO:1), GlypSer (SEQ ID NO:2), Gly2Ser, o (GlyaSer)n(Gly4Ser)1 (SEQ ID NO:3), (GlyaSer)n(Gly4Ser)n (SEQ ID NO:4), o (Gly4Ser)n(SEQ ID NO:5), en los que n es un número entero de 1, 2, 3, 4 ó 5) y en los que las regiones variables unidas forman un dominio de unión funcional (por ejemplo, scFv, scTCR).
“Aminoácidos de unión” o “residuos de aminoácido de unión” se refieren a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-20) residuos de aminoácido entre dos motivos, regiones o dominios adyacentes de un polipéptido, tal como entre un dominio de unión y una región de ligador adyacente o entre un dominio hidrófobo y un dominio efector adyacente o en uno o ambos extremos de una región de ligador que une dos motivos, regiones o dominios (por ejemplo, entre un ligador y un dominio de unión adyacente y/o entre un ligador y una bisagra adyacente). Los aminoácidos de unión pueden ser el resultado del diseño de constructos de una proteína de fusión (por ejemplo, residuos de aminoácido que resultan del uso de un sitio de enzima de restricción durante la construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión).
Los términos entendidos por los expertos en la técnica de tecnología de anticuerpos reciben cada uno el significado adquirido en la técnica, a menos que se definan expresamente de manera diferente en el presente documento. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, así como una porción de unión a antígeno de un anticuerpo intacto que tiene o retiene la capacidad para unirse a una molécula diana. Un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo puede ser no humano, quimérico, humanizado o humano, preferiblemente humanizado o humano. Se revisan la estructura y función de las inmunoglobulinas, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).
Por ejemplo, los términos “Vl” y “Vh” se refieren a la región variable de unión de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Las regiones variables de unión están compuestas por subregiones discretas, bien definidas conocidas como “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) y “regiones de entramado” (FR). El término “CL” se refiere a una “región constante de cadena ligera de inmunoglobulina” o una “región constante de cadena ligera”, es decir, una región constante de una cadena ligera de un anticuerpo. El término “CH” se refiere a una “región constante de cadena pesada de inmunoglobulina” o una “región constante de cadena pesada,” que además es divisible, dependiendo del isotipo de anticuerpo en los dominios de CH1, CH2 y CH3 (IgA, IgD, IgG), o CH1, CH2, CH3 y CH4 (IgE, IgM). Un “Fab” (fragment de union a antígeno) es la parte de un anticuerpo que se une a antígenos e incluye la región variable y CH1 de la cadena pesada unida a la cadena ligera a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
Tal como se usa en el presente documento, “porción de región de Fc” se refiere al segmento de la región constante de cadena pesada del fragmento Fc (la región de “fragmento cristalizable” o región de Fc) de un anticuerpo, que puede incluir uno o más dominios constantes, tales como CH2, CH3, CH4, o cualquier combinación de los mismos. Una porción de región de Fc puede incluir los dominios de CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG, IgA o IgD o cualquier combinación de los mismos, o los dominios de CH3 y CH4 de un anticuerpo IgM o IgE y cualquier combinación de los mismos. Una estructura de CH2CH3 o CH3CH4 puede tener dominios de subregiones del mismo isotipo de anticuerpo y son humanos, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humana (por ejemplo, CH2CH3 de IgG1 humana). A modo de antecedentes, una región de Fc es responsable de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tal como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores de Fc (por ejemplo, CD16, CD32, FcRn), mayor semivida in vivo en relación con un polipéptido que carece de una región de Fc, unión de proteína A, y quizás incluso transferencia placentaria (véase Capon et al., Nature 337:525, 1989). Una porción de región de Fc hallada en proteínas de fusión puede ser capaz de mediar en una o más de estas funciones efectoras, o carecerá de una o más o todas de estas actividades por medio de, por ejemplo, una o más mutaciones conocidas en la técnica.
Además, los anticuerpos tienen una secuencia de bisagra que está situada normalmente entre la región de Fab y Fc (pero una sección menor de la bisagra puede incluir una porción amino-terminal de la región de Fc). A modo de antecedentes, una bisagra de inmunoglobulina actúa como espaciador flexible para permitir el movimiento libre de la porción de Fab en el espacio. Al contrario que las regiones constantes, las bisagras son estructuralmente diversas, que varían tanto en secuencia como en longitud entre clases de inmunoglobulina e incluso entre subclases. Por ejemplo, una región bisagra de IgG1 humana es libremente flexible, lo que permite que los fragmentos Fab giren alrededor de sus ejes de simetría y se mueven dentro de una esfera centrada en el primero de los dos puentes disulfuro entre cadenas pesadas. En comparación, una bisagra de IgG2 humana es relativamente corta y contiene una hélice doble de poli-prolina rígida estabilizada mediante cuatro puentes disulfuro entre cadenas pesadas, lo que restringe la flexibilidad. Una bisagra de IgG3 humana difiere de otras subclases por su región bisagra extendida única (aproximadamente cuatro veces más larga que la bisagra de IgG1), que contiene 62 aminoácidos (incluyendo 21 prolinas y 11 cisteínas), que forma una hélice doble de poli-prolina no flexible y que proporciona mayor flexibilidad porque los fragmentos Fab están relativamente lejos del fragmento Fc. Una bisagra de IgG4 humana es más corta que la IgG1, pero tiene la misma longitud que IgG2, y su flexibilidad es intermedia entre la de IgG1 e IgG2.
“Receptor de células T” (TCR) se refiere a una molécula hallada en la superficie de células T (o linfocitos T) que, en asociación con CD3, es generalmente responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). El TCR tiene un heterodímero unido a disulfuro de las cadenas a y p altamente variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) en la mayoría de las células T. En un subconjunto pequeño de células T, el TCR está compuesto por un heterodímero de cadenas y y 8 variables (también conocidas como TCRy y TCR8, respectivamente). Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y posee un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana, y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal (véase Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a ed., Current Biology Publications, pág. 4:33, 1997). TCR, tal como se usa en la presente divulgación, puede ser de diversas especies animales, incluyendo humano, ratón, rata, gato, perro, cabra, caballo u otros mamíferos. Los TCR pueden estar unidos a células (es decir, tienen un dominio o región transmembrana) o en forma soluble.
“Moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad” (moléculas del MHC) se refiere a glicoproteínas que transportan antígenos peptídicos a una superficie celular. Las moléculas del MHC de clase I son heterodímeros que consisten una cadena a que atraviesa la membrana (con tres dominios a ) y una microglobulina p2 asociada de manera no covalente. Las moléculas del MHC de clase II están compuestas por dos glicoproteínas transmembrana, a y p, ambas de las cuales atraviesan la membrana. Cada cadena tiene dos dominios. Las moléculas del MHC de clase I transportan péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde el complejo péptido:MHC se reconoce por parte de células T CD8+. Las moléculas del MHC de clase II transportan péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde se reconocen por parte de células T CD4+. Una molécula del MHC puede ser de diversas especies animales, incluyendo humano, ratón, rata u otros mamíferos.
Un “vector” es una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus o un fago. Un “vector de expresión” es un vector que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por uno o más genes portados por el vector cuando está presente en el entorno apropiado.
Los “retrovirus” son virus que tienen un genoma de ARN. “Gammaretrovirus” se refiere a un género de la familia retroviridae. Los gammaretrovirus a modo de ejemplo incluyen virus de las células madre de ratón, virus de la leucemia murina, virus de la leucemia felina, virus del sarcoma felino y virus de la reticuloendoteliosis aviar.
“Lentivirus” se refiere a un género de retrovirus que son capaces de infectar células en división y no en división. Varios ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de la inmunodeficiencia humana: incluyendo VIH de tipo 1, y VIH de tipo 2); virus de la anemia infecciosa equina; virus de la inmunodeficiencia felina (VIF); virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB); y virus de la inmunodeficiencia símica (VIS).
“Células T” o “células del linaje de células T” se refieren células que muestran al menos una característica fenotípica de una célula T o un precursor o progenitor de la misma que distingue las células de otras células linfocíticas, y células de los linajes eritroide o mielógeno. Tales características fenotípicas pueden incluir la expresión de una o más proteínas específicas para células T (por ejemplo, CD3+, CD4+, CD8+), o una característica fisiológica, morfológica, funcional o inmunológica específica para una célula T. Por ejemplo, células del linaje de células T pueden ser células progenitoras o precursoras dedicadas al linaje de células T; células T CD25+ inmaduras e inactivadas; células que se han dedicado al linaje CD4 o CD8; células progenitoras timocíticas que son células T doble positivas CD4+CD8+; positivas únicas CD4+ o CD8+; TCRap o TCRy8; o células T maduras y funcionales o activadas.
Una “molécula de ácido nucleico”, o “polinudeótido,” puede estar en forma de ARN o ADN, que incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. Una molécula ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria, y si es monocatenaria, puede ser la cadena codificante o no codificante (cadena antisentido). Una molécula codificante puede tener una secuencia codificante idéntica a una secuencia codificante conocida en la técnica o puede tener una secuencia codificante diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, o mediante corte y empalme, puede codificar para el mismo polipéptido.
“Tratar” o “tratamiento” o “mejorar” se refiere a un tratamiento médico de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (por ejemplo, un humano o un mamífero no humano, tal como un primate, un caballo, un perro, un ratón, una rata). Por ejemplo, una dosis o un régimen de tratamiento apropiados que comprende una proteína de unión específica de BCMA o una célula huésped que expresa una proteína de unión específica de BCMA usada en combinación con un inhibidor de y-secretasa (GSI) de esta divulgación, y opcionalmente un adyuvante o régimen de acondicionamiento previo, se administra para obtener un beneficio terapéutico o profiláctico. El beneficio terapéutico o profiláctico/preventivo incluye un desenlace clínico mejorado; atenuación o alivio de los síntomas asociados con una enfermedad; reducción de la aparición de síntomas; mejora de la calidad de vida; un estado libre de enfermedad más largo; reducción del alcance de la enfermedad, estabilización del estado patológico; retraso de la progresión de la enfermedad; remisión; supervivencia; supervivencia prolongada; o cualquier combinación de los mismos.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” de una proteína de unión específica de BCMA (también denominada inmunoterapia específica de BCMA o que selecciona como diana BCMA), un inhibidor de y-secretasa, una célula huésped que expresa una proteína de unión específica de BCMA, o una célula huésped que expresa un inhibidor de y-secretasa de esta divulgación (por ejemplo, un CAR específico de BCMA, un anticuerpo anti-y-secretasa) se refiere a esa cantidad de compuesto o células suficientes para dar como resultado una mejora de uno o más síntomas de la enfermedad que se está tratando de una manera estadísticamente significativa. Cuando se hace referencia a un principio activo individual o una célula que expresa un único principio activo, administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a los efectos de dicho principio o dicha célula que expresa ese principio activo solo. Cuando se hace referencia a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a las cantidades combinadas de principios activos o un principio activo complementario combinado con una célula que expresa un principio activo que da como resultado un efecto terapéutico, ya se administre en serie, de manera concurrente o simultáneamente. Otra combinación puede ser una célula que expresa más de un principio activo, tal como dos o más proteínas de unión específicas de BCMA diferentes o similares.
A lo largo de la presente divulgación se presentan definiciones adicionales.
Moléculas o proteínas de unión al antígeno de maduración de células B (BCMA)
En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona un CAR/T-ChARM específico de BCMA y un inhibidor de y-secretasa para su uso en métodos para tratar una enfermedad o un trastorno proliferativos en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene la enfermedad o el trastorno, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del CAR/T-ChARM específico de BCMA y una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de y-secretasa. Un receptor de antígeno quimérico específico de BCMA a modo de ejemplo comprende un componente extracelular y un componente intracelular conectados mediante una porción hidrófoba, en el que el componente extracelular comprende un dominio de unión específico de BCMA (por ejemplo, scFv específico de BCMA, ligando de BCMA o una porción de unión del mismo, tal como BAFF o APRIL) y opcionalmente comprende una región de espaciador o bisagra, y en el que el componente intracelular comprende un dominio efector y opcionalmente un dominio coestimulador.
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona una inmunoterapia dirigida contra BCMA, para su uso con un inhibidor de y-secretasa para tratar una enfermedad o un trastorno proliferativos, que comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de BCMA, o una molécula de receptor de antígeno quimérico marcada (T-ChARM).
Los anticuerpos específicos de BCMA a modo de ejemplo incluyen anticuerpos J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 y pSCHLI373, y porciones de unión a antígeno de los mismos. Diversos anticuerpos específicos de BCMA y porciones de unión a antígeno de los mismos, incluyendo versiones humanizadas, se divulgan en, por ejemplo, las publicaciones de PCT n.os WO 2002/066516, WO 2007/062090, WO 2010/104949, WO 2011/108008, WO 2012/163805, WO 2014/068079, WO 2015/166073, WO 2014/122143, WO 2014/089335, WO 2016/090327 y WO 2016/079177; Ryan et al., Mol. Cancer. Ther. 6(11):3009, 2007; y Abbas et al., Blood 128:1688, 2016. Pueden usarse dominios variables y moléculas de scFv de estos anticuerpos específicos de BCMA como dominio de unión en cualquiera de las proteínas de T-ChARM y CAR mencionadas en el presente documento.
Los dominios o las porciones de unión a antígeno obtenidos de los anticuerpos específicos de BCMA incluyen, por ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), Fab, F(ab')2), nanocuerpos, scFv en tándem, scFv-Fc, dímeros de scFv, cremalleras de scFv, diacuerpos, minicuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, Fab, F(ab)'2, scFab, minianticuerpos, nanocuerpos, nanocuerpo-HSA, acopladores biespecíficos de células T (BiTE), DAR, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpo de cadena sencilla-CH3, o conjuntos de botón en ojal (KIH) de scFv-CH3.
En determinadas realizaciones, un CAR/T-ChARM específico de BCMA comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico o multiespecífico que comprende una primera región de unión (por ejemplo, una región variable de cadena pesada, una región variable de cadena ligera, o ambas) que es específica para BCMA y al menos una otra región de unión que es específica para una segunda diana (por ejemplo, un epítopo de BCMA que es diferente del epítopo de la primera región de unión, o un epítopo de una diana distinta de BCMa , tal como, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor que no es BCMA (por ejemplo, CD19 (por ejemplo, blinatumomab, MOR-208, SGN-19A, SAR3419, coltuximab ravtansina, denituzumab mafodotina, taplitumomab paptox, XmAb 5574, MDI-551, anticuerpo anti-CD19 patentado de Merck también conocido como B4 también conocido como DI-B4, XmAb 5871, MDX-1342, AFM11), CD20 (por ejemplo, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab), CD38 (por ejemplo, daratumumab o isatuximab (SAR650984)), CD45, o una proteína de la superficie celular expresada en una célula efectora inmunitaria, tal como una célula T (por ejemplo, CD3), una célula NK (por ejemplo, CD56), o una célula NK-T (por ejemplo, NK1.1), u otra diana o antígeno no asociado a tumor.
Una T-ChARM a modo de ejemplo comprende un componente extracelular y un componente intracelular conectados mediante una porción hidrófoba, en la que el componente extracelular comprende un dominio de unión que se une específicamente a BCMA, una región de espaciador opcional, un casete de etiqueta y una región bisagra, y en la que el componente intracelular comprende un dominio efector y opcionalmente un dominio coestimulador (por ejemplo, un dominio o porción funcional de 4-1BB, un dominio o porción funcional de CD28, o ambos). En determinadas realizaciones, un dominio de unión de T-ChARM comprende un scFv específico de BCMA, un scTCR específico de BCMA, o un ligando de BCMA o una porción de unión del mismo (por ejemplo, BAFF, APRIL), opcionalmente en la que el scFv específico de BCMA es humano o humanizado. Se divulga diversas realizaciones de las T-ChARM en la publicación de PCT n.° WO 2015/095895.
Los casetes de etiqueta a modo de ejemplo incluyen Strep tag (que se refiere a la Strep®tag original, Strep®tag II, o cualquier variante de la misma; véase, por ejemplo, patente estadounidense n.° 7.981.632), His tag, etiqueta Flag, Xpress tag, Avi tag, etiqueta de calmodulina, etiqueta de poliglutamato, etiqueta HA, etiqueta Myc, Nus tag, S tag, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, V5 tag, proteína de unión a CREB (CBP), glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), proteína verde fluorescente (GFP), etiqueta de tiorredoxina, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un casete de etiqueta puede ser un sitio de afinidad modificado mediante ingeniería genética, tal como un sitio de quelación mínima (por ejemplo, HGGHHG, SEQ ID NO.:6). En determinadas realizaciones, un casete de etiqueta es una Strep tag que tiene una secuencia de aminoácidos de Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.:7) o Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO.:8).
Los casetes de etiqueta pueden estar presentes en copias únicas o múltiples en proteínas de fusión de esta divulgación. Por ejemplo, una T-ChARM específica de BCMA de esta divulgación puede tener uno, dos, tres, cuatro o cinco casetes de etiqueta (por ejemplo, Strep tag). En determinadas realizaciones, un componente extracelular de una T-ChARM específica de BCMA incluye un casete de etiqueta, dos casetes de etiqueta, tres casetes de etiqueta, cuatro casetes de etiqueta, o cinco casetes de etiqueta. Cada uno de la pluralidad de casetes de etiqueta pueden ser iguales o diferentes.
En determinadas realizaciones, un casete de etiqueta comprende desde aproximadamente cinco hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o desde aproximadamente seis hasta aproximadamente 100 aminoácidos, o desde aproximadamente siete hasta aproximadamente 50 aminoácidos, o desde aproximadamente ocho hasta aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, un casete de etiqueta tiene de siete a diez aminoácidos. Preferiblemente, un casete de etiqueta es no inmunógeno o mínimamente inmunógeno. Esencialmente, un casete de etiqueta puede funcionar como señal o baliza para permitir la identificación, el enriquecimiento, el aislamiento, la promoción de la proliferación, la activación, el seguimiento o la eliminación de células que expresan una T-ChARM específica de BCMA.
En realizaciones adicionales, el CAR comprende un componente extracelular y un componente intracelular conectados mediante una porción hidrófoba, en el que el componente extracelular comprende un dominio de unión que se une específicamente a BCMA y una región bisagra, y en el que el componente intracelular comprende un dominio efector y opcionalmente un dominio coestimulador. En determinadas realizaciones, un dominio de unión a CAR comprende un scFv específico de BCMA, un scTCR específico de BCMA, un dominio de unión de TCR específico de BCMA (véase, por ejemplo, Walseng et al., Scientific Reports 7:10713 (2017)), o un ligando de BCMA o una porción de unión del mismo (por ejemplo, BAFF, APRIL), opcionalmente en el que el scFv específico de BCMA es humano o humanizado.
Una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA pueden estar unidos a células (por ejemplo, expresados en una superficie celular) o en forma soluble. En determinadas realizaciones, los polinucleótidos que codifican para proteínas de T-ChARM o CAR específicas de BCMA pueden tener codones optimizados para mejorar o maximizar la expresión en una célula huésped (Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006).
En determinadas realizaciones, una bisagra presente en una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA de esta divulgación puede ser una región bisagra de inmunoglobulina, tal como una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada de la misma. En determinadas realizaciones, una bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina humana de tipo natural. En otras realizaciones determinadas, uno o más residuos de aminoácido pueden añadirse en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural como parte de un diseño de constructos de proteínas de fusión. Por ejemplo, uno, dos o tres residuos de aminoácido de unión adicionales pueden estar presentes en el extremo aminoterminal o carboxilo-terminal de bisagra, o una bisagra puede contener una deleción terminal o interna y tener añadidos de vuelto uno, dos o tres residuos de aminoácido de unión adicionales.
En determinadas realizaciones, una bisagra es una bisagra de inmunoglobulina alterada en la que uno o más residuos de cisteína en una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural se sustituyen con uno o más de otros residuos de aminoácido. Las bisagras de inmunoglobulina alteradas a modo de ejemplo incluyen una región bisagra de inmunoglobulina IgG1, IgG2 o IgG4 humana que tiene uno, dos o tres residuos de cisteína hallados en una bisagra de IgG1, IgG2 o IgG4 humana de tipo natural sustituidos por uno, dos o tres residuos de aminoácido diferentes (por ejemplo, serina o alanina). En determinadas realizaciones, un polipéptido de bisagra comprende o es una secuencia que es al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % idéntica a una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural, tal como una bisagra de IgG1 humana de tipo natural, una bisagra de IgG2 humana de tipo natural, o una bisagra de IgG4 humana de tipo natural.
En realizaciones adicionales, una bisagra presente en una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA de esta divulgación puede ser una bisagra que no se basa en o deriva de una bisagra de inmunoglobulina (es decir, no es una bisagra de inmunoglobulina de tipo natural o una bisagra de inmunoglobulina alterada). Los ejemplos de tales bisagras incluyen péptidos de aproximadamente cinco a aproximadamente 150 aminoácidos de la región de tallo de moléculas de CD o lectinas C de tipo II, incluyendo péptidos de aproximadamente ocho a aproximadamente 25 aminoácidos o péptidos de aproximadamente siete a aproximadamente 18 aminoácidos, o variantes de los mismos.
Una “región de tallo” de una molécula de CD o lectina C de tipo II se refiere a la porción del dominio extracelular de la molécula de CD o lectina C de tipo II que está ubicada entre el dominio similar a lectina de tipo C (CTLD; por ejemplo, similar a CTLD de receptores de linfocíticos citolíticos naturales) y la porción hidrófoba (dominio transmembrana). Por ejemplo, el dominio extracelular de CD94 humano (n.° de registro de GenBank AAC50291.1) corresponde a los residuos de aminoácido 34-179, pero el CTLD corresponde a los residuos de aminoácido 61-176, de modo que la región de tallo de la molécula de CD94 humano comprende los residuos de aminoácido 34-60, que están ubicados entre la porción hidrófoba (dominio transmembrana) y el CTLD (véase Boyington et al., Immunity 10:75, 1999; para descripciones de otras regiones de tallo, véanse también Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; y Figdor et al., Nat. Rev. Immunol. 2:77, 2002). Estas moléculas de CD o lectina C de tipo II también pueden tener aminoácidos de unión entre la región de tallo y la región transmembrana o el CTLD. En otro ejemplo, la proteína NKG2A humana de 233 aminoácidos (n.° de registro de GenBank P26715.1) tiene una porción hidrófoba (dominio transmembrana) que oscila desde los aminoácidos 71-93 y un dominio extracelular que oscila desde los aminoácidos 94-233. El CTLd comprende los aminoácidos 119-231, y la región de tallo comprende los aminoácidos 99-116, que pueden estar flanqueados por aminoácidos de unión adicionales. En la técnica se conocen otras moléculas de CD o lectina C de tipo II, así como sus dominios de unión a ligando extracelulares, regiones de tallo y los CTLD (véanse, por ejemplo, los n.os de registro de GenBank NP_001993.2; AAH07037.1; NP_001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1; para las secuencias de CD23, CD69, CD72, NKG2A y NKG2D humanos y sus descripciones, respectivamente).
Un “derivado” de una bisagra de región de tallo, o un fragmento de la misma, de una molécula de CD o lectina C de tipo II incluye una secuencia de aproximadamente ocho a aproximadamente 150 aminoácidos en la que uno, dos o tres aminoácidos de la región de tallo de una molécula de CD o lectina C de tipo II de tipo natural tienen una deleción, inserción, sustitución, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, un derivado puede comprender una o más sustituciones de aminoácido y/o una deleción de aminoácido. En determinadas realizaciones, un derivado de una región de tallo es más resistente a la escisión proteolítica en comparación con la secuencia de región de tallo de tipo natural, tal como las derivadas de desde aproximadamente ocho hasta aproximadamente 20 aminoácidos de NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 o CD94.
En determinadas realizaciones, las bisagras de región de tallo pueden comprender desde aproximadamente siete hasta aproximadamente 18 aminoácidos y pueden formar una estructura de hélice a superenrollada. En determinadas realizaciones, las bisagras de región de tallo contienen 0, 1, 2, 3 ó 4 cisteínas. Las bisagras de región de tallo a modo de ejemplo incluyen fragmentos de las regiones de tallo, tales como aquellas porciones que comprenden desde aproximadamente diez hasta aproximadamente 150 aminoácidos de las regiones de tallo de CD69, CD72, CD94, NKG2A y NKG2D.
Bisagras alternativas que pueden usarse en T-ChARM y CAR específicos de BCMA de esta divulgación son de porciones de receptores de superficie celular (regiones interdominio) que conectan dominios de tipo V de inmunoglobulina o dominios de tipo C de inmunoglobulina. Las regiones entre dominios de tipo V de Ig donde el receptor de superficie celular contiene múltiples dominios de tipo V de Ig en tándem y entre dominios de tipo C de Ig donde el receptor de superficie celular contiene múltiples regiones de tipo C de Ig en tándem también se contemplan como bisagras útiles en los T-ChARM y CAR específicos de BCMA de esta divulgación. En determinadas realizaciones, las secuencias de bisagra que se componen de regiones interdominio de receptor de superficie celular pueden contener además un motivo que se produce de manera natural o añadido, tal como una secuencia de bisagra central de IgG para proporcionar uno o más enlaces disulfuro para estabilizar la formación de dímeros de T-ChARM o CAR específicos de BCMA. Los ejemplos de bisagras incluyen regiones interdominio entre las regiones de tipo V de Ig y de tipo C de Ig de CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD166 o CD244.
En determinadas realizaciones, las secuencias de bisagra tienen desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 aminoácidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 aminoácidos, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 aminoácidos o de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 aminoácidos. Las bisagras pueden ser principalmente flexibles, pero también pueden proporcionar características más rígidas o pueden contener principalmente una estructura de hélice a con una estructura mínima de láminas p. En determinadas realizaciones, una secuencia de bisagra es estable en plasma y suero, y es resistente a la escisión proteolítica. Por ejemplo, la primera lisina en una región bisagra superior de IgG1 puede mutarse o delecionarse para minimizar la escisión proteolítica, y las bisagras pueden incluir aminoácidos de unión. En algunas realizaciones, una secuencia de bisagra puede contener un motivo que se produce de manera natural o añadido, tal como una estructura central de bisagra de inmunoglobulina CPPCP (SEQ ID NO.:9) que confiere la capacidad de formar un enlace disulfuro o múltiples enlaces disulfuro para estabilizar la formación de dímeros.
Una porción hidrófoba contenida en una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA permitirá que un CAR/T-ChARM específico de BCMA de esta divulgación se asocie con una membrana celular de modo que una porción del CAR/T-ChARM se ubicará de manera extracelular (por ejemplo, casete de etiqueta, dominio de unión) y una porción se ubicará de manera intracelular (por ejemplo, dominio efector, dominio coestimulador). Una porción hidrófoba generalmente estará dispuesta dentro de la bicapa fosfolipídica de la membrana celular. En determinadas realizaciones, uno o más aminoácidos de unión pueden estar dispuestos entre y conectando una porción hidrófoba con un dominio efector, o dispuestos entre y conectando una porción hidrófoba con una región de espaciador, o dispuestos entre y conectando una porción hidrófoba con un casete de etiqueta.
En determinadas realizaciones, un dominio hidrófobo es un dominio transmembrana, tal como uno derivado de una proteína de membrana integral (por ejemplo, receptor, molécula de grupo de diferenciación (CD), enzima, transportador, molécula de adhesión celular, o similares). En realizaciones particulares, una porción hidrófoba es un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD27 o CD28.
Un componente intracelular contenido en una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA será capaz de transmitir señales funcionales a una célula. En determinadas realizaciones, una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA se dimerizarán con una segunda T-ChARM o segundo CAR de cadena sencilla, respectivamente, en el que la dimerización permite que el componente intracelular que comprende un dominio efector y opcionalmente un dominio coestimulador esté muy cerca y promueva la transducción de señales cuando se expone a la señal apropiada. Además de formar tales complejos de proteína dimérica, los dominios efectores y dominios coestimuladores opcionales pueden asociarse además con otros factores de señalización, tales como factores coestimuladores, para formar complejos de multiproteínas que producen una señal intracelular. En determinadas realizaciones, un dominio efector promoverá indirectamente una respuesta celular asociándose con una o más de otras proteínas que promueven directamente una respuesta celular. Un componente intracelular puede incluir uno, dos, tres o más dominios de señalización de receptores (por ejemplo, dominios efectores), dominios coestimuladores, o combinaciones de los mismos. Cualquier componente intracelular que comprende un dominio efector o una porción funcional del mismo, un dominio coestimulador o una porción funcional del mismo, o cualquier combinación de los mismos de cualquiera de una variedad de moléculas de señalización (por ejemplo, receptores de transducción de señales) puede usarse en la T-ChARM o el CAR específicos de BCMA de esta divulgación.
Un componente intracelular puede tener un dominio efector o coestimulador útil en la T-ChARM o el CAR específicos de BCMA de esta divulgación, que puede basarse en o proceder de una proteína de una ruta de señalización de Wnt (por ejemplo, LRP, Ryk, ROR2), ruta de señalización de NOTCH (por ejemplo, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4), ruta de señalización de Hedgehog (por ejemplo, PTCH, SMO), tirosina cinasas receptoras (RTK) (por ejemplo, familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF), familia de receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), familia de receptores del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), familia de receptor de insulina (IR), familia de receptores de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), familia de receptores de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), familia de receptores de cinasa receptora de tropomicina (Trk), familia de receptores de efrina (Eph), familia de receptores de AXL, familia de receptores de tirosina cinasa de leucocitos (LTK), familia de receptores de tirosina cinasa con dominios de tipo inmunoglobulina y de tipo EGF 1 (TIE), familia de receptores huérfanos de tipo tirosina cinasa receptora (ROR), familia de receptores de dominio de discoidina (DDR), familia de receptores reordenados durante la transfección
(RET), familia de receptores de tipo tirosina-proteína cinasa (PTK7), familia de receptores relacionados con tirosina cinasa receptora (RYK), familia de receptores de cinasa específica de músculo (MuSK)); receptores acoplados a proteína G, GPCR (Frizzled, Smoothened); receptores de serina/treonina cinasa (BMPR, TGFR); o receptores de citocinas (IL-1R, IL-2R, IL-7R, IL-15R).
En determinadas realizaciones, un dominio efector comprende un dominio de señalización de receptores de linfocitos o comprende secuencias de aminoácidos que tienen uno o una pluralidad de motivos de activación de inmunoreceptor basados en tirosina (ITAM). En realizaciones todavía adicionales, un dominio efector comprende una porción citoplasmática que se asocia con una proteína de señalización citoplasmática, en el que la proteína de señalización citoplasmática es un receptor de linfocito o dominio de señalización del mismo, una proteína que comprende una pluralidad de ITAM, un factor coestimulador, o cualquier combinación de los mismos.
Los dominios efectores y coestimuladores a modo de ejemplo incluyen los basados en o derivados de 4-1BB, CD3e, CD38, CD3C, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRa , FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3,
LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa , TCRa , TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2, o cualquier combinación de los mismos.
En realizaciones particulares, una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA de esta divulgación comprenden (a) un dominio efector de CD3 ^ o una porción funcional del mismo y un dominio coestimulador de CD28 o una porción funcional del mismo, (b) un dominio efector de CD3 ^o una porción funcional del mismo y un dominio coestimulador de 4-1BB o una porción funcional del mismo, o (c) (a) un dominio efector de CD3 ô una porción funcional del mismo y un dominio coestimulador de CD28 y 4-1BB o porciones funcionales del mismo.
Inhibidores de y-secretasa (GSI)
A modo de antecedentes, la y-secretasa es un complejo de proteasa de membrana integral de múltiples subunidades, que incluye presenilina (PS), nicastrina (NCT), subunidad de faringe anterior-defectuosa 1 (APH-1), y potenciador de presenilina 2 (PEN-2). La PS es la subunidad catalítica que es una aspartato proteasa capaz de formar un poro catalítico hidrófilo incorporado dentro de la membrana (Takasugi et al., Nature 422:438-41, 2003), que escinde proteínas transmembrana de paso único dentro del dominio transmembrana. NCT es una glicoproteína de membrana de tipo I con un dominio extracelular grande (ECD), ECD que captura el extremo amino-terminal del sustrato como receptor de sustrato primario para y-secretasa (Shah et al., Cell 122:435-47, 2005). El complejo de y-secretasa desempeña un papel en el procesamiento de una variedad de sustratos, incluyendo Notch, CD44, cadherinas y efrina B2, así como la escisión de una proteína precursora amiloide para dar un péptido beta amiloide que está implicado en la enfermedad de Alzheimer. También se sabe que el complejo de y-secretasa escinde el antígeno de maduración de células B (BCMA) (Laurent et al., Nature Communications 6, 2015), que es una diana terapéutica en diversos cánceres, incluyendo el mieloma múltiple.
Los inhibidores de y-secretasa (GSI) a modo de ejemplo incluyen moléculas pequeñas, compuestos peptidomiméticos o proteínas de unión específicas de y-secretasa. Un GSI puede seleccionar como diana una cualquiera o más de las proteínas del complejo de y-secretasa, incluyendo presenilina 1 (PS1), presenilina 2 (PS2), nicastrina (NCT), subunidad de faringe anterior-defectuosa 1 (APH-1), y potenciador de presenilina 2 (PEN-2), siempre que la actividad de escisión de y-secretasa se reduzca en comparación con la y-secretasa no inhibida. En determinadas realizaciones, la actividad de la y-secretasa se reduce en al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el menos aproximadamente el 95 %, o el 100 %. En la técnica se conocen ensayos para medir la actividad de la y-secretasa (véase, por ejemplo, Laurent et al., 2015). Por ejemplo, el nivel de BCMA soluble puede ser una medida sustituta para la actividad de la y-secretasa. GSI de molécula pequeña representativos, para su uso con una inmunoterapia que selecciona como diana BCMA para tratar una enfermedad o un trastorno proliferativos o autoinmunitarios, incluyen avagacestat, DAPT, BMS-906024, BMS-986115, LY411575, MK-0752, PF-03084014, RO4929097, semagacestat, YO-01027, y cualquier combinación de los mismos.
Otros GSI son proteínas de unión específicas de y-secretasa, tales como anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, un complejo de y-secretasa o una proteína de complejo de y-secretasa, tal como presenilina
1 (PS1), presenilina 2 (PS2), nicastrina (NCT), subunidad de faringe anterior-defectuosa 1 (APH-1), y potenciador de presenilina 2 (PEN-2). Una proteína de unión específica de y-secretasa a modo de ejemplo es una proteína de unión específica de nicastrina, tal como los anticuerpos scFvG9, A5226A, 2H6, 10C11, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Dominios de unión
Un dominio de unión puede ser cualquier péptido que se une específicamente a BCMA o inhibe específicamente la actividad de la y-secretasa tal como se describe en el presente documento. Las fuentes de dominios de unión incluyen regiones variables de anticuerpos de diversas especies (que pueden estar en forma de anticuerpos, sFv, scFv, Fab, Grababody basado en scFv o dominio de VH soluble o anticuerpos de dominio), incluyendo humano, de roedor, aviar u ovino. Las fuentes adicionales de dominios de unión incluyen regiones variables de anticuerpos de otras especies, tales como camélido (de camellos, dromedarios o llamas; Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 y Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), gatas nodriza (Roux et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998), quimera americana (Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002), o lamprea (Herrin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 y Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008). Estos anticuerpos pueden formar regiones de unión a antígenos usando sólo una región variable de cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas sólo (denominados “anticuerpos de cadena pesada”) (Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006; y Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).
Una fuente alternativa de dominios de unión de esta divulgación incluye secuencias que codifican para bibliotecas de péptidos al azar o secuencias que codifican para una diversidad modificada por ingeniería de aminoácidos en regiones de bucle de armazones distintos de anticuerpos alternativos, tales como scTCR (véanse, por ejemplo, Lake et al., Int. Immunol.11:745, 1999; Maynard et al., J. Immunol. Methods 306:51, 2005; la patente estadounidense n.° 8,361,794), dominios fibrinógenos (véase, por ejemplo, Weisel et al., Science 230:1388, 1985), dominios de Kunitz (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.423.498), proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins) (Binz et al., J. Mol. Biol. 332:489, 2003 y Binz et al., Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), dominios de unión de fibronectina (adnectinas o monocuerpos) (Richards et al., J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker et al., Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 y Hackel et al. (2008) J. Mol. Biol. 381:1238-1252), miniproteínas nodales de cisteína (Vita et al. (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 y Huang et al. (2005) Structure 13:755, 2005), dominios con repeticiones de tetratricopéptidos (Main et al., Structure 11:497, 2003 y Cortajarena et al., ACS Chem. Biol. 3:161, 2008), dominios con repeticiones ricas en leucina (Stumpp et al., J. Mol. Biol. 332:471, 2003), dominios de lipocalina (véanse, por ejemplo, el documento WO 2006/095164, Beste et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 y Schonfeld et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009), dominios de tipo V (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0065431), dominios de lectina de tipo C (Zelensky y Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. (USA) 89:753, 1992 y Sato et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb2 o Fcab™ (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente PCT n.os WO 2007/098934; WO 2006/072620), proteínas con repeticiones de armadillo (véanse, por ejemplo, Madhurantakam et al., Protein Sci. 21: 1015, 2012; la publicación de solicitud de patente PCT n.° WO 2009/040338), afilina (Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372: 172, 2007), aficuerpo, avímeros, knotinas, finómeros, atrímeros, proteína 4 asociada con linfocitos T citotóxicos (Weidle et al., Cancer Gen. Proteo.
70:155, 2013) o similares (Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995; Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz et al., Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma y Plückthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011).
Los dominios de unión de esta divulgación pueden generarse tal como se describe en el presente documento o mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.291.161 y 6.291.158). Por ejemplo, los dominios de unión de esta divulgación pueden identificarse examinando una biblioteca de fagos de Fab en buscar de fragmentos Fab que se unen específicamente a una diana de interés (por ejemplo, BCMA, componente del complejo de y-secretasa tal como presenilina o nicastrina) (véase Hoet et al., Nat. Biotechnol. 23:344, 2005). Adicionalmente, pueden usarse estrategias tradicionales para el desarrollo de hibridomas usando una diana de interés (por ejemplo, BCMA, componente del complejo de y-secretasa tal como presenilina o nicastrina) como inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, HuMAb Mouse®, TC Mouse™, KM-Mouse®, llamas, gallinas, ratas, hámsteres, conejos, etc.) para desarrollar dominios de unión de esta divulgación.
En algunas realizaciones, un dominio de unión es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende regiones VH y VL específicas para una diana de interés (por ejemplo, BCMA, componente del complejo de ysecretasa tal como presenilina o nicastrina). En determinadas realizaciones, las regiones Vh y Vl son humanas. Las regiones Vh y Vl a modo de ejemplo incluyen los segmentos de anticuerpos específicos anti-BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, 5335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 o pSCHLI373. Otras regiones Vh y Vl a modo de ejemplo incluyen los segmentos de anticuerpos específicos anti-nicastrina o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de scFvG9, A5226A, 2H6 o 10C11.
En determinadas realizaciones, un dominio de unión comprende o es una secuencia que es al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 % o el 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera (Vl) (por ejemplo, de anticuerpo anti-BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, o C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, 5335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372, o pSCHLI373; o de anticuerpo anti-nicastrina scFvG9, A5226A, 2H6 o 10C11) o a una región variable de cadena pesada (Vh) (por ejemplo, de anticuerpo anti-BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 o pSCHLI373; o de anticuerpo anti-nicastrina scFvG9, A5226A, 2H6 o 10C11), o ambas, donde cada CDR comprende cero cambios o como máximo uno, dos o tres cambios, con respecto a un anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a una diana de interés (por ejemplo, BCMA, componente del complejo de y-secretasa tal como presenilina o nicastrina).
En determinadas realizaciones, una región Vh de dominio de unión de la presente divulgación puede derivarse de o basarse en una Vh de un anticuerpo monoclonal conocido y contiene una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadoras o sustituciones de aminoácido no conservadoras), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, cuando se compara con la Vh de un anticuerpo monoclonal conocido. Una inserción, deleción o sustitución puede ser en cualquier parte en la región Vh, incluyendo en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal o en ambos extremos de esta región, siempre que cada CDR comprenda cero cambios o como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene la región Vh modificada todavía pueda unirse específicamente a su diana con una afinidad similar al dominio de unión de tipo natural.
En realizaciones adicionales, una región Vl en un dominio de unión de la presente divulgación se deriva de o se basa en una Vl de un anticuerpo monoclonal conocido y contiene una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadoras), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, cuando se compara con la Vl del anticuerpo monoclonal conocido. Una inserción, deleción o sustitución puede ser en cualquier parte en la región VL, incluyendo en el extremo aminoterminal o carboxilo-terminal o en ambos extremos de esta región, siempre que cada CDR comprenda cero cambios o como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene la región Vl modificada todavía pueda unirse específicamente a su diana con una afinidad similar al dominio de unión de tipo natural.
Los dominios de Vh y Vl pueden estar dispuestos en cualquier orientación (es decir, desde el extremo aminoterminal hasta el extremo carboxilo-terminal, Vh-Vl o Vl-Vh) y pueden unirse mediante una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos) capaz de proporcionar una función de espaciador de modo que los dos subdominios de unión puedan interactuar para formar un dominio de unión funcional. En determinadas realizaciones, un ligador de región variable que une los dominios de Vh y Vl incluye aquellos que pertenecen a la familia de (GlynSer), tal como (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1 (SEQ ID NO:3), (GlyaSer)1(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:10), (GlyaSer)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:4), o (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 5), en las que n es un número entero de 1 a 5. En determinadas realizaciones, el ligador es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID No .:12) o (Gly-Gly-Gly-Ser)4 (SEQ ID NO.:13). En determinadas realizaciones, estos ligadores basados en (GlynSer) se usan para unir los dominios de Vh y Vl en un dominio de unión, y estos ligadores también pueden usarse para unir el dominio de unión a un casete de etiqueta, o para unir un casete de etiqueta a una porción hidrófoba o componente intracelular.
En algunas realizaciones, un dominio de unión es un receptor de células T de cadena sencilla (scTCR) que comprende cadenas Va/p y Ca/p (por ejemplo, Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp) o que comprende pares Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp específicos para una diana de interés (por ejemplo, complejo péptido-MHC).
En determinadas realizaciones, un dominio de unión comprende o es una secuencia que es al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 %, o el 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de una Va, Vp, Ca o Cp de TCR, en el que cada CDR comprende cero cambios o como máximo uno, dos o tres cambios, con respecto a un TCR o fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a una diana de interés (por ejemplo, BCMA, componente del complejo de y-secretasa tal como presenilina o nicastrina).
En determinadas realizaciones, una región Va, Vp, Ca, o Cp de dominio de unión de la presente divulgación puede derivarse de o basarse en una Va, Vp, Ca o Cp de un TCR conocido (por ejemplo, un TCR de alta afinidad) y contiene una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadoras o sustituciones de aminoácido no conservadoras), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, cuando se compara con la Va, Vp, Ca o Cp de un TCR conocido. Una inserción, deleción o sustitución puede ser en cualquier parte en una región Va, Vp, Ca o Cp, incluyendo en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal o ambos extremos de estas regiones, siempre que cada CDR comprenda cero cambios o como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene una región Va, Vp, Ca o Cp región todavía pueda unirse específicamente a su diana con una afinidad similar a la del tipo natural.
El BCMA, la y-secretasa, o ambos pueden hallarse en o en asociación con una célula de interés (“célula diana”). Las células diana a modo de ejemplo incluyen una célula cancerosa, una célula asociada con una enfermedad o un trastorno autoinmunitarios o con una enfermedad o un trastorno inflamatorios, y un organismo o célula infecciosos (por ejemplo, bacterias, virus, célula infectada con virus).
Conjugados citotóxicos
Los conjugados anticuerpo-fármaco se usan para suministrar de manera selectiva un elemento citotóxico a una célula diana, por ejemplo, un tumor o una célula cancerosas. Los conjugados anticuerpo-fármaco y las técnicas y químicas relacionadas se describen en, por ejemplo, Nasiri et al., J. Cell. Physiol. (2018), Hedrich et al., Clin. Pharmacokinet. (2017), Drake y Rabuka, BioDrugs 31(6):521 (2017), Meyer et al., Bioconj. Chem. 27(12):2791 (2016), Moek et al., J. Nucl. Med. 58:835 (2017), Nareshkumar et al., Pharm. Res. 32:3526 (2015), Parslow et al., Biomedicines 4:14 (2016), y Green et al., Blood 131:611 (2018).
En determinadas realizaciones de los tratamientos proporcionados en el presente documento, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o una molécula de receptor de antígeno quimérico marcada (T-ChARM) se conjuga o se acopla de otro modo con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterápico. Un agente quimioterápico incluye, pero no se limita a, un inhibidor de la función de la cromatina, un inhibidor de topoisomerasa, un fármaco inhibidor de los microtúbulos, un agente que daña el ADN, un antimetabolito (tal como antagonistas de folato, análogos de pirimidina, análogos de purina y análogos modificados con azúcares), un inhibidor de la síntesis del ADN, un agente interactivo con el ADN (tal como un agente de intercalación), y un inhibidor de la reparación del ADN. Los agentes quimioterápicos ilustrativos incluyen, sin limitación, los siguientes grupos: anti-metabolitos/agentes anticancerígenos, tales como análogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodeoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos incluyendo productos naturales tales como alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina y vinorelbina), disruptores de los microtúbulos tales como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina, epidipodofilotoxinas (etopósido, tenipósido), agentes que dañan el ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, Cytoxan, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, hexametilmelamineoxaliplatino, ifosfamida, melfalán, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, Taxotere, temozolamida, tenipósido, trietilentiofosforamida y etopósido (VP 16)); antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza de manera sistemica L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); antiagregantes plaquetarios; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas nitrogenadas (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalán, clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), alquilsulfonatos-busulfán, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina), Trazenes-dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormonas (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales sintéticas de heparina y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tal como activador de plasminógeno tisular, estreptocinasa y urocinasa), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes antisecretores (breveldina); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimús (FK-506), sirolimús (rapamicina), azatioprina, micofenolato de mofetilo); compuestos anti-angiogénicos (TNP470, genisteína) e inhibidores de factores de crecimiento (inhibidores del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), inhibidores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)); bloqueador de receptores de angiotensina; donadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab, rituximab); receptores de antígenos quiméricos; inhibidores del ciclo celular e inductores de diferenciación (tretinαna); inhibidores de mTOR, inhibidores de topoisomerasa (doxorrubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina, enipósido, epirrubicina, etopósido, idarrubicina, irinotecán (CPT-11) y mitoxantrona, topotecán, irinotecán), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona y prenisolona); inhibidores de cinasa de transducción de señales de factores de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial, toxinas tales como toxina del cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, o toxina de la difteria, y activadores de caspasa; y disruptores de la cromatina.
Un ADC a modo de ejemplo que se une específicamente a BCMA es J6M0-mcMMAF (GSK2857916), descrito en Tai et al., Blood 123(20):3128-3138 (2014). Otro ADC específico de BCMA (SG1-MMAF) se describió por Ryan et al. (Mol. Cancer Ther., 6(11):3009-3018, 2007).
Células huésped y ácidos nucleicos
Las moléculas de ácido nucleico que codifican para uno cualquiera o más del CAR/T-ChARM específico de BCMA o los inhibidores de y-secretasa se describen en el presente documento. Tales moléculas de ácido nucleico pueden insertarse en un vector apropiado (por ejemplo, vector viral o vector plasmídico no viral) para la introducción en una célula huésped de interés (por ejemplo, célula T).
Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” o “no natural” se refiere a un organismo, microorganismo, célula, molécula de ácido nucleico o vector que incluye al menos una alteración genética o se ha modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógena, en la que tales alteraciones o modificaciones se introducen mediante ingeniería genética. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácido nucleico que pueden expresarse que codifican para proteínas, proteínas de fusión o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones de una molécula de ácido nucleico u otra disrupción funcional del material genético de la célula. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones regulatorias no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón. En determinadas realizaciones, una célula T obtenida de un sujeto puede convertirse en una célula T no natural o recombinante introduciendo un ácido nucleico que codifica para un CAR/T-ChARM específico de BCMA o inhibidor de y-secretasa de esta divulgación (por ejemplo, anti-y-secretasa) tal como se describe en el presente documento y mediante lo cual la célula expresa un CAR o una T-ChARM específicos de BCMA ubicados en la superficie celular. Un vector que codifica para un virus central se denomina “vector viral” en el presente documento. Existe un gran número de vectores virales disponibles adecuados para su uso con las composiciones de la presente divulgación, incluyendo aquellos identificados para aplicaciones de terapia génica humana (véase Pfeifer y Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001). Los vectores virales adecuados incluyen vectores basados en virus de ARN, tales como vectores derivados de retrovirus, por ejemplo, vectores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV), e incluyen vectores derivados de retrovirus más complejos, por ejemplo, vectores derivados de lentivirus. Los vectores derivados del VIH-1 pertenecen a esta categoría. Otros ejemplos incluyen vectores de lentivirus derivados del VIH-2, VIF, virus de la anemia infecciosa equina, VIS y virus de Maedi-Visna (lentivirus ovino). Se conocen en la técnica los métodos de uso de vectores virales retrovirales y lentivirales y células de empaquetamiento para transducir células huésped de mamífero con partículas virales que contienen transgenes del receptor de antígeno quimérico y se han descrito previamente, por ejemplo, en la patente estadounidense 8.119.772; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther.
14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. También están disponibles comercialmente sistemas de expresión y constructos de vectores retrovirales y lentivirales.
En determinadas realizaciones, un vector viral se usa para introducir un polinucleótido no endógeno que codifica para un CAR/T-ChARM específico de BCMA o inhibidor de y-secretasa. Un vector viral puede ser un vector retroviral o un vector lentiviral. Un vector viral también puede incluir polinucleótidos que codifican para un marcador para la transducción. Se conocen en la técnica marcadores de transducción para vectores virales e incluyen marcadores de selección, que pueden conferir resistencia a los fármacos, o marcadores detectables, tales como marcadores fluorescentes o proteínas de la superficie celular que pueden detectarse mediante métodos tales como citometría de flujo. En realizaciones particulares, un vector viral comprende además un marcador génico para la transducción que comprende proteína verde fluorescente, un dominio extracelular de CD2 humano, o un EGFR humano truncado (huEGFRt; véase Wang et al., Blood 118:1255, 2011). Cuando un genoma de vector viral comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que van a expresarse en una célula huésped como transcriptos independientes, el vector viral también puede comprender secuencias adicionales entre los dos (o más) transcriptos permitiendo una expresión bicistrónica o multicistrónica. Los ejemplos de tales secuencias usadas en vectores virales incluyen sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), sitios de escisión de furina, péptido viral 2A (por ejemplo, P2A,T2A, E2A, F2A), o cualquier combinación de los mismos.
También pueden usarse otros vectores para el suministro de polinucleótidos incluyendo vectores virales de ADN, incluyendo, por ejemplo, vectores basados en adenovirus y vectores basados en virus adenoasociados (AAV); vectores derivados de virus del herpes simple (VHS), incluyendo vectores de amplicón, VHS defectuoso en replicación y VHS atenuado (Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998).
Otros vectores recientemente desarrollados para sus usos en terapia génica también pueden usarse con las composiciones de esta divulgación. Tales vectores incluyen los derivados de los baculovirus y a -virus. (Jolly, D J.
1999. Emerging Viral Vectors. págs. 209-40 en Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. Nueva York: Cold Spring Harbor Lab), o vectores plasmídicos (tal como vectores de transposón de Bella durmiente u otros vectores). En algunas realizaciones, un vector viral o plasmídico comprende además un marcador génico para la transducción (por ejemplo, proteína verde fluorescente, huEGFRt).
Pueden modificarse células progenitoras hematopoyéticas o células madre embrionarias para comprender un polinucleótido no endógeno que codifica para una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden comprender células progenitoras timocíticas o células madre pluripotentes inducidas, que pueden derivarse de u originarse a partir de tejido hepático fetal, médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden ser de humano, ratón, rata u otros mamíferos. Pueden usarse células progenitoras timocíticas CD24te Lin- CD117+.
Las condiciones de cultivo pueden conllevar cultivar células progenitoras hematopoyéticas que expresan proteínas de fusión de esta divulgación durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciación. Las células se mantienen en cultivo generalmente durante de aproximadamente 3 días a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días. Se apreciará que las células pueden mantenerse durante una cantidad apropiada de tiempo requerida para lograr un resultado deseado, es decir, una composición celular deseada. Por ejemplo, para generar una composición celular que comprende células T principalmente inmaduras e inactivadas, las células pueden mantenerse en cultivo durante de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días. Las células pueden mantenerse en cultivo durante de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 días para generar una composición celular que comprende células T principalmente maduras. También pueden recogerse células no adherentes del cultivo en diversos puntos de tiempo, tales como desde aproximadamente varios días hasta aproximadamente 25 días. Pueden cultivarse conjuntamente células madre hematopoyéticas en líneas celulares estromales (patente estadounidense n.° 7.575.925; Schmitt et al., Nat. Immunol.
5:410, 2004; Schmitt et al., Immunity 17:749, 2002).
Una o más citocinas que promueven la dedicación o diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas pueden añadirse al cultivo. Las citocinas pueden ser humanas o no humanas. Los ejemplos representativos de citocinas que pueden usarse incluyen todos los miembros de la familia de FGF, incluyendo FGF-4 y FGF-2; ligando de Flt-3, factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO) e IL-7. Las citocinas pueden usarse en combinación con un glicosaminoglicano, tal como sulfato de heparina.
Las células huésped capaces de expresar un CAR/T-ChARM específico de BCMA de esta divulgación en la superficie celular son células T, que incluyen líneas celulares o células primarias derivadas de humano, ratón, rata u otros mamíferos. Si se obtiene de un mamífero, una célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, incluyendo sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o líquidos. Puede enriquecerse o purificarse una célula T o subpoblaciones de la misma (por ejemplo, indiferenciada, de memoria central, de memoria efectora). Las líneas de célula T se conocen bien en la técnica, algunas de las cuales se describen en Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000. En determinadas realizaciones, se usan células T que carecen de expresión endógena de las cadenas a y p de TCR. Tales células T pueden carecer de manera natural de expresión endógena de las cadenas a y p de TCR o pueden haberse modificado para bloquear la expresión (por ejemplo, células T de un ratón transgénico que no expresan las cadenas a y p de TCR o células que se han manipulado para inhibir la expresión de las cadenas a y p de TCR) o para desactivar la cadena a de TCR, la cadena p de TCR, o ambos genes.
En cualquiera de las realizaciones proporcionadas en el presente documento, una célula huésped puede ser una célula “donante universal” que se modifica para reducir o eliminar la expresión de uno o más genes endógenos implicados en una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, una célula T puede modificarse para reducir o eliminar la expresión de uno o más polipéptidos seleccionados de PD-1, LAG-3, CTLA4, TIGIT, TlM3, un componente del complejo de HLA, o un TCR o un componente del complejo de TCR. Sin querer limitarse a la teoría, determinadas proteínas de células inmunitarias expresadas de manera endógena pueden reconocerse como extrañas por un huésped alogénico que recibe las células inmunitarias modificadas, lo que puede dar como resultado la eliminación de las células inmunitarias modificadas (por ejemplo, un alelo de HLA), o pueden regularse por disminución la actividad inmunitaria de las células inmunitarias modificadas (por ejemplo, PD-1, LAG-3, CTLA4, TIGIT), o pueden interferir con la actividad de unión de una proteína de unión expresada de manera heteróloga de la presente divulgación (por ejemplo, un TCR endógeno que se une a un antígeno no asociado a tumor e interfiere con el receptor específico de antígeno de la célula inmunitaria modificada uniendo específicamente al antígeno asociado a tumor). Por consiguiente, la disminución o eliminación de la expresión o actividad de tales genes o proteínas endógenos puede mejorar la actividad, tolerancia y persistencia de las células inmunitarias modificadas en un entorno de huésped alogénico, y puede permitir la administración universal de las células (por ejemplo, a cualquier receptor independientemente del tipo de HLA).
En determinadas realizaciones, una célula T modificada de esta divulgación comprende la desactivación génica cromosómica de uno o más genes que codifican para PD-1, LAG-3, CTLA4, TlM3, TIGIT, un componente del complejo de HLA (por ejemplo, un gen que codifica para una macroglobulina a 1, una macroglobulina a 2, una macroglobulina a 3, una microglobulina p1 o una microglobulina p2), un componente del TCR (por ejemplo, un gene que codifica para una región variable de TCR o una región constante de t Cr ) (véanse, por ejemplo, Torikai et al., Nature Sci. Rep. 6:21757 (2016); Torikai et al., Blood 119(24):5697 (2012); y Torikai et al., Blood 122(8):1341 (2013)). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la desactivación génica cromosómica se produce usando un sistema de CRISPR/Cas9, y puede implicar la transfección de la célula inmunitaria modificada con un lentivirus (por ejemplo, μLentiCRISPRv2; Torikai et al., Blood (2016)) que expresa un sistema de CRISPR/Cas9 que selecciona como diana PD-1, LAG-3, CTLA4, un componente de HLA o un componente de TCR, o cualquier combinación de los mismos. Los cebadores útiles para diseñar un lentivirus que expresa un sistema de CRISPR/Cas9 para inhibir una proteína de célula inmunitaria expresa de manera endógena incluyen, por ejemplo, pares de cebadores que comprenden cebadores directos e inversos que tienen las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID NO:22 y 23, 24 y 25, 26 y 27, y 28 y 29.
En determinadas realizaciones, una célula huésped T transfectada para expresar una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA de esta divulgación es una célula T funcional, tal como una célula T específica de virus, una célula T citotóxica específica de antígeno tumoral, una célula T indiferenciada, una célula T madre de memoria, una célula T de memoria central o efectora, o una célula T regulatoria CD4+ CD25+.
Pueden añadirse una o más citocinas de factores de crecimiento que promueven la proliferación de células T que expresan una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA de esta divulgación al cultivo. Las citocinas pueden ser humanas o no humanas. Las citocinas de factores de crecimiento a modo de ejemplo que pueden usarse para promover la proliferación de células T incluyen IL-2, IL-15, IL-21, o similares.
Usos
Las enfermedades que pueden tratarse con células que seleccionan como diana BCMA que expresan una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA en combinación con un inhibidor de y-secretasa (GSI) tal como se describe en la presente divulgación incluyen cáncer (por ejemplo, cánceres que expresan BCMA), enfermedades inmunitarias (por ejemplo, autoinmunitarias), o enfermedades relacionadas con el envejecimiento (por ejemplo, senectud). Las terapias inmunitarias adoptivas y génicas son tratamientos prometedores para diversos tipos de cáncer (Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) y una enfermedad infecciosa (Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011).
Los cánceres que son susceptibles a las composiciones divulgadas en el presente documento son aquellos que expresan, o son capaces de expresar, BCMA en su superficie celular. Los tipos a modo de ejemplo de cáncer que puede tratarse incluyen mielomas (tal como mieloma múltiple), leucemias (tal como leucemia de células plasmáticas), linfomas (tal como linfoma linfoplasmacítico), plasmocitomas, macroglobulinemia de Waldenstrom. Otros cánceres que pueden expresar BCMA incluyen adenocarcinoma de mama y carcinoma broncógeno del pulmón. En determinadas realizaciones, los trastornos proliferativos susceptibles a una terapia de combinación de una T-ChARM o un CAR específicos de BCMA y un GSI son determinados tipos de cáncer de células B, incluyendo trastornos de las células plasmáticas (tal como, por ejemplo, mieloma múltiple).
Las enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias incluyen artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, policondritis, artropatía psoriásica, psoriasis, dermatitis, polimiositis/dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, miositis inflamatoria, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia y esclerosis generalizada, síndrome de CREST, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), meningitis, encefalitis, uveitis, colitis, glomerulonefritis, afecciones alérgicas, eccema, asma, afecciones que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, ateroesclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión leucocitaria, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus discoide, mielitis lúpica, cerebritis lúpica, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, neuromielitis óptica, fiebre reumática, corea de Sydenham, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y T-linfocitos, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de Wegener y enfermedad de Churg-Strauss, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis/angitis por hipersensibilidad, ANCA y vasculitis reumatoidea), anemia aplásica, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica inmunitaria incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de la serie roja (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutrocitopenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucocitopenia, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (CNS), síndrome de lesión orgánica múltiple, miastenia grave, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo de trasplante de órganos sólidos, enfermedad injerto contra huésped (GVHD), penfigoide ampolloso, pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunitarias, espondiloartropatias seronegativas, enfermedad de Reiter, síndrome de la persona rígida, arteritis de células gigantes, nefritis por inmunocomplejos, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica idiopática trombótica (TTP), púrpura de Schoenlein Henoch, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovario incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitarias, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), diabetes tipo I también denominada diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (no por transplante), neumonía intersticial no específica (NSIP), síndrome de Guillain-Barré, vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa), poliarteritis nodosa (PAN) espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), glomerulonefritis rápidamente progresiva, cirrosis biliar primaria, celiaquía (enfermedad celíaca), crioglobulinemia, crioglobulinemia asociada con hepatitis, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), arteriopatía coronaria, poliserositis familiar recurrente, poliangitis microscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldrich y tromboangitis obliterante.
En realizaciones particulares, se trata mieloma múltiple, plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B o linfoma linfoplasmacítico.
Un CAR o una T-ChARM específicos de BCMA puede administrarse a un sujeto en forma unida a células (por ejemplo, terapia génica de una población celular diana (células T maduras (por ejemplo, células T CD8+ o CD4+) u otras células del linaje de células T)). En una realización particular, las células del linaje de células T que expresan un CAR o una T-ChARM específicos de BCMA administradas a un sujeto son células singénicas, alogénicas o autólogas.
En determinadas realizaciones, la combinación puede administrarse de manera concurrente, junto en el mismo portador farmacéuticamente aceptable, o en formulaciones independientes (pero de manera concurrente). La administración concurrente significa que cada componente se administra al mismo tiempo o en el plazo 8-12 horas entre sí. La administración de un segundo componente más de 12 horas después del primer componente se considerará una administración secuencial. En otras realizaciones, un GSI y un producto inmunoterapéutico específico de BCMA pueden administrarse secuencialmente (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve días de diferencia; una, dos, tres o cuatro semanas de diferencia; una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve semanas de diferencia; o uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más años de diferencia; o similares), en cualquier orden y en cualquier combinación. En realizaciones particulares, cuando se administra secuencialmente, el GSI se administra en primer lugar y la inmunoterapia dirigida contra BCMA se administra en segundo lugar. En otras realizaciones, la inmunoterapia que selecciona como diana BCMA se administra en primer lugar y el GSI se administra en segundo lugar. En realizaciones particulares, la inmunoterapia que selecciona como diana BCMA que comprende una célula T CAR-T o T-ChARM específicas de BCMA se administra en primer lugar y el GSI se administra en segundo lugar (por ejemplo, en el plazo de unas horas, días, semanas, meses o años de la inmunoterapia de BCMA). En realizaciones adicionales, la inmunoterapia dirigida contra BCMA que comprende una célula T cAR-T o T-ChARM específicas de BCMA (a) se administra a un sujeto; (b) después de un periodo de tiempo (por ejemplo, de aproximadamente 5 días a aproximadamente una semana, de aproximadamente una semana a aproximadamente dos semanas, de aproximadamente dos semanas a aproximadamente tres semanas, de aproximadamente una semana a aproximadamente un mes, de aproximadamente un mes a aproximadamente seis meses, de aproximadamente tres meses a aproximadamente un año, o más si es necesario), el sujeto o un tejido del sujeto se somete a prueba o se examina para determinar la presencia o persistencia de la célula T modificada administrada previamente que comprende un CAR o una T-ChARM que se unen específicamente a BCMA, y (c) administrar un GSI en segundo lugar después de detectarse la presencia o persistencia de la inmunoterapia de BCMA.
En algunas realizaciones, se administra un GSI a un sujeto al menos una vez antes, simultáneamente con y al menos una vez (por ejemplo, al menos dos, tres o cuatro veces) después de la inmunoterapia dirigida contra BCMA. En realizaciones particulares, una terapia de combinación de esta divulgación comprende una inmunoterapia dirigida contra BCMA y la administración de desde aproximadamente 0,01 |iM de GSI hasta aproximadamente 5 |iM de GSI, desde aproximadamente 0,03 |iM de GSI hasta aproximadamente 1,5 |iM de GSI, desde aproximadamente 0,05 |iM de GSI hasta aproximadamente 2,5 |iM de GSI, o desde aproximadamente 0,1 |iM de GSI hasta aproximadamente 1,0 |iM de GSI. En determinadas realizaciones, una terapia de combinación comprende una menor cantidad de la célula T que se une específicamente a BCMA, el GSI, o ambos en comparación con la administración de estas terapias individualmente.
Por ejemplo, a modo de antecedente y sin querer limitarse a la teoría, durante la inmunoterapia adoptiva, el injerto de células administradas que expresan el CAR o la T-ChARM específicos de BCMA puede facilitarse mediante un acondicionamiento inmunosupresor previo con uno o más agentes o tratamientos quimioterápicos. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el tratamiento comprende además el acondicionamiento previo de un sujeto concurrente con o antes de la administración de una célula T que expresa un CAR/T-ChARM específico de BCMA y un GSI. En realizaciones particulares, un régimen de acondicionamiento previo es un acondicionamiento inmunosupresor que comprende la depleción de linfocitos endógenos (también denominada depleción de linfocitos, que puede ser no mieloablativa o mieloablativa). Puede lograrse una depleción de linfocitos a modo de ejemplo con ciclofosfamida sola, ciclofosfamida en combinación con fludarabina, mediante el uso de otros agentes o tratamientos que son citotóxicos para los linfocitos (por ejemplo, irradiación corporal total), o cualquier combinación de los mismos.
Las composiciones de CAR/T-ChARM, inhibidor o combinación pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, por pulverización de inhalación, por vía vaginal, rectal o por inyección intracraneal, o cualquier combinación de las mismas. Cuando se administran por separado, una inmunoterapia dirigida contra BCMA y un GSI pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la inmunoterapia que selecciona como diana BCMA se administra por vía parenteral y el GSI se administra por vía oral, lo que puede ser de manera concurrente o secuencial. El término “parenteral”, tal como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser dañinas para el receptor. Se prefiere la inyección o infusión, especialmente intravenosa, para administrar una inmunoterapia dirigida contra BCMA.
En otras realizaciones, el GSI puede administrarse a un sujeto en forma soluble.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen una terapia de combinación de una inmunoterapia dirigida contra BCMA y un inhibidor de y-secretasa de esta divulgación pueden administrarse de una manera apropiada para la enfermedad o afección que va a tratarse (o prevenirse) según lo determinen los expertos en la técnica médica. La dosis apropiada, la duración adecuada y la frecuencia de administración de las composiciones estarán determinadas por factores tales como la condición del paciente, el tamaño, el tipo y la gravedad de la enfermedad, la forma particular del principio activo y el método de administración. La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden células T que expresan un CAR o una T-ChARM específicos de BCMA, y un portador, diluyentes o excipiente farmacéuticamente aceptables. Los excipientes adecuados incluyen agua, solución salina, dextrosa, glicerol o similares y combinaciones de los mismos.
Una ventaja de la presente divulgación es que las células T que expresan un CAR o una T-ChARM específicos de BCMA administradas a un paciente pueden deplecionarse usando la pareja de unión relacionada con un casete de etiqueta. Una célula T que expresa una T-ChARM específica de BCMA puede deplecionarse usando un anticuerpo específico para el casete de etiqueta, usando una pareja de unión relacionada específica para el casete de etiqueta o usando una segunda célula T que exprese un cAr y tenga especificidad para el casete de etiqueta. Un casete de etiqueta puede permitir la inmunodepleción de una célula T que expresa una T-ChARM específica de BCMA de esta divulgación. La eliminación de las células T modificadas por ingeniería puede lograrse usando agentes de depleción específicos para un casete de etiqueta. Por ejemplo, si se usa una Strep tag, entonces puede usarse un anticuerpo anti-Strep tag, scFv anti-Strep tag o Strep-Tactin, cada uno fusionado o conjugado con un reactivo tóxico para las células (como una toxina, radiometal), o puede usarse un scFv biespecífico anti-Strep tag/anti-CD3, o una célula T con CAR anti-Strep tag.
La proliferación de una célula T recombinante que expresa una T-ChARM específica de BCMA de esta divulgación puede promoverse selectivamente. Puede usarse una pareja de unión de etiqueta, tal como un anticuerpo, para proliferar selectivamente las células T ex-vivo. La pareja de unión de etiqueta puede expandir las células T funcionales (por ejemplo, específicas de virus, CTL específicos de TAA (antígeno asociado a tumores), o subconjuntos de células T específicas, tales como células T indiferenciadas, células T madre de memoria, células T de memoria central o efectora, células T reguladoras CD4+ CD25+), que puede realizarse opcionalmente en presencia de una pareja de unión de molécula coestimuladora (tal como un anticuerpo anti-CD27 o antiCD28). En todavía realizaciones adicionales, una T-ChARM específica de BCMA permite la promoción selectiva de la proliferación de células T in vivo al expresar una T-ChARM específica de BCMA de esta divulgación. En determinadas realizaciones, una célula T que expresa un CAR que comprende un casete de etiqueta permite la expansión de las células T con CAR in vivo al entrar en contacto con células que expresan un ligando (incluyendo, por ejemplo, ligandos de células supresoras de células T PD-L1, PD-L2). Tales células T expandidas son útiles en los tratamientos de enfermedades descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, se induce in vivo la proliferación o expansión de células que expresan una T-ChARM específica de BCMA tal como se divulga en el presente documento, que puede inducirse con una pareja de unión de casete de etiqueta (tal como un anticuerpo anti-etiqueta) y, opcionalmente, una pareja de unión de molécula coestimuladora (tal como un anticuerpo anti-CD27 o anti-CD28).
En determinadas realizaciones adicionales, las células que expresan una T-ChARM específica de BCMA tal como se divulga en el presente documento se activan in vivo, tal como en el sitio de un tumor. Por ejemplo, una composición (por ejemplo, alginato, matriz de membrana basal (Matrigel®), biopolímero u otra matriz) o un portador (por ejemplo, microperlas, nanopartículas u otra superficie sólida) que comprende una pareja de unión de casete de etiqueta (tal como un anticuerpo anti-etiqueta) y una pareja de unión de molécula coestimuladora (tal como un anticuerpo anti-CD27 o antiCD28) puede usarse para activar localmente en el sitio de un tumor (por ejemplo, un tumor sólido) una célula T que expresa una T-ChARM específica de BCMA tal como se divulga en el presente documento.
En determinadas realizaciones, las células recombinantes que expresan una T-ChARM específica de BCMA pueden detectarse o seguirse in vivo mediante el uso de anticuerpos que se unen con especificidad a un casete de etiqueta (por ejemplo, anticuerpos anti-etiqueta), o mediante otras proteínas de unión relacionadas que se unen específicamente a la secuencia del casete de etiqueta (por ejemplo, unión de Strep-Tactin a Strep tag), cuyas parejas de unión para el casete de etiqueta están conjugados con un tinte fluorescente, radiotrazador, nanopartículas de óxido de hierro u otro agente de obtención de imágenes conocido en la técnica para la detección mediante rayos X, tomografía computarizada, resonancia magnética, exploración PET, ecografía, citometría de flujo, sistemas de obtención de imágenes de infrarrojo cercano u otras modalidades de obtención de imágenes (véase, por ejemplo, Yu et al., Theranostics 2:3, 2012).
Las células que expresan una T-ChARM específica de BCMA de la presente divulgación pueden usarse en métodos de diagnóstico o métodos de obtención de imágenes, incluyendo métodos usados en relación con las indicaciones o condiciones identificadas en el presente documento.
Ejemplos
EJEMPLO 1
DISEÑO Y PRUEBAS DE RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS ESPECÍFICOS DE BCMA
Se prepararon CAR anti-BCMA para examinar su utilidad para la inmunoterapia del mieloma múltiple y otros trastornos. Se construyeron CAR anti-BCMA con scFv que se componen de las regiones Vh y Vl del anticuerpo C115 D5.3 (“C11”) y el anticuerpo A7D12.2 (“A7”), que incluían una región bisagra de IgG4 (espaciador), un dominio transmembrana de CD28, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio efector de CD3^. Se produjeron los scFv en las orientaciones “HL” y “LH” (véase la figura 1A). Se transdujeron las células T humanas con construcciones de expresión que codifican para los CAR anti-BCMA y se examinaron para determinar las características funcionales. Tal como se muestra en la figura 1B, las células T que expresan los CAR de C11 y los CAR de A7 proliferaron cuando se cultivaron conjuntamente con células diana que expresan BCMA, aunque los CAR de C11 parecieron proliferar un poco más robusto que las células T que expresan CAR de A7. Las células CAR-T de C11 también produjeron más citocinas en respuesta a las líneas celulares diana (o bien células K562 transfectadas con antígeno o líneas celulares de MM que expresan BCMA; figura 1C) y tuvieron una mayor actividad de destrucción específica contra las células diana en comparación con las células CAR-T LH de A7 (figura 1D). Se generaron CAR de A7 y C11 adicionales que tenían diferentes componentes intracelulares, incluyendo los CAR que contenían un dominio coestimulador de 4-1BB (figura 1E, ilustración superior) y un dominio coestimulador de CD28 (figura 1E, ilustración inferior). También se varió la longitud del dominio espaciador extracelular para mejorar la interacción entre la célula T que expresa CAR y la célula diana BCMA+, incluyendo espaciadores cortos (por ejemplo, de 12 aminoácidos, 48 aminoácidos y 66 aminoácidos de longitud), intermedios (por ejemplo, de 157 aminoácidos de longitud) y largos (por ejemplo, de 228 aminoácidos de longitud). Los CAR espaciadores de 48 aminoácidos y 157 aminoácidos incluían cada uno dos (2) casetes de Strep-Tag, mientras que el espaciador de 66 aminoácidos incluía tres (3) casetes Strep-Tag (véase la figura 1F). Los receptores de antígenos quiméricos marcados, tales como los CAR que contienen el casete de Strep-Tag mostrados en las figuras 1F y 1G, se denominan en el presente documento T-ChARM.
Se transdujeron células T humanas para expresar las T-ChARM (véase el ejemplo 2) y se analizaron para determinar la funcionalidad. La longitud del espaciador tuvo un efecto sobre los constructos de T-ChARM que comprenden un scFv derivado del anticuerpo anti-BCMA C11 D5.3, en el que los espaciadores de intermedios (de aproximadamente 65 aminoácidos; véanse C11 3ST, C11 2STint y C11Lo de la figura 1H) a largos (de aproximadamente 200 aminoácidos) funcionaron mejor para este dominio de unión. Se seleccionaron C113ST_4-1BB y C113ST_CD28 como constructos de mejor rendimiento (figuras 1H-1J) y se compararon con un CAR anti-BCMA divulgado anteriormente (“BCMA-2”; Carpenter et al. Clin. Cancer Res. 19:2048, 2013). La expresión de EGFRt en las células T primarias fue similar para cada constructo de T-ChARM/CAR y se confirmó la expresión superficial de la T-ChARM para aquellas que contenían secuencias STII, tal como se muestra mediante tinción con anticuerpo monoclonal anti-STII (figura 1K). Las células T que expresan T-ChARM de C113ST produjeron más citocinas (figuras 1L, 1M) y proliferaron de manera más robusta (figura 1N) que las células T que expresan BCMA-2 cuando se cultivaron conjuntamente con células diana. También se determinó que las células T que expresan T-ChARM de C113ST pueden reconocer y lisar células CD138+ de MM del paciente (datos no mostrados). Las células T que expresan T-ChARM de C113ST o CAR BCMA-2 no tuvieron actividad citolítica contra las células K562 que no expresan antígeno (figura 1O), pero lisaron de manera eficaz las células K562 transducidas para expresar el antígeno de BCMA (figura 1P), lo que demuestra que las células T modificadas por ingeniería reconocen específicamente el antígeno.
EJEMPLO 2
PRODUCCIÓN DE CÉLULAS T RECOMBINANTES Y EXPRESIÓN DE T-CHARM ESPECÍFICAS DE BCMA Se aislaron células T CD8+ y CD4+ de PBMC de donantes humanos normales usando el kit de aislamiento de células T CD8+/CD4+ (Miltenyi Biotec), se activaron con perlas de anticuerpo anti-CD3/CD28 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante, y se transdujeron con un sobrenadante lentiviral (epHIB7) que codifica para CAR generado por transfección transitoria de células HEK293T usando plásmidos de empaquetamiento PsPAX2 y μMD2G (MOI = 3) complementado con 0,8 μg/ml de polibreno (Millipore, Bedford, MA) el día 3 después de la activación por centrifugación a 2.100 rpm durante 45 min a 32 °C. Se expandieron las células T en RPMI, suero humano al 10 %, L-glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 1 % (medio CTL), complementados con IL-2 humana recombinante (rh) hasta una concentración final de 50 U/ml cada 48 horas. Después de la expansión, se tiñó una alícuota de cada línea de células T transducidas con anticuerpo anti-EGFR conjugado con biotina y estreptavidina-PE (Miltenyi, Auburn, CA). Se aislaron las células T tEGFR+ mediante clasificación en un clasificador de células FACS-Aria (Becton Dickinson). Luego se estimuló el subconjunto de células T tEGFR+ con CD19+ B-LCL irradiado (8.000 rad) en una razón de células T:LCL de 1:7, y se expandió durante 8 días en medio CTL con la adición de 50 U/ml de IL-2 rh cada 48 horas o usando un protocolo de expansión rápida para células que expresan T-ChARM (Riddell y Greenberg, J. Immunol. Methods 128:189, 1990), en las que la T-ChARM comprende un scFv derivado del anticuerpo anti-BCMA A7 o C11 D5.3.
Se usaron los siguientes anticuerpos conjugados para el fenotipado y el análisis de citometría de flujo: CD4, CD8, CD25, CD137, CD45, anexina V, CD62L, CD27, CD28 (BD Biosciences), anticuerpo anti-Streptag II (Genscript), anticuerpo contra EGFR (ImClone Systems Incorporated, Branchburg, NJ); estreptavidina-PE (BD Biosciences, San José, CA). Se realizó tinción con yoduro de propidio (PI, BD Biosciences) para la discriminación de células vivas/muertas según las instrucciones del fabricante. Se realizaron los análisis de flujo en un dispositivo FACS Canto II, las purificaciones de clasificación en un dispositivo FACS AriaII (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y los datos se analizaron usando el software FlowJo (Treestar, Ashland, OR).
Para examinar la expresión en la superficie celular de T-ChARM específica de BCMA, se clasificaron las células T transducidas según la expresión de EGFRt y se evaluaron mediante tinción con AcM anti-Streptag marcado con fluorocromo. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de la tinción de EGFR fue similar en las células T transducidas con cada una de las T-ChARM específicas de BCMA y CAR corto de CD19. La introducción de una etiqueta en un CAR para producir una T-ChARM no interfirió con la expresión del transgén (datos no mostrados). Un AcM anti-StrepTag tiñó específicamente las células T transducidas con las diversas T-ChARM específicas de BCMA, independientemente de la posición o el número de secuencias de etiqueta en cada T-ChARM.
EJEMPLO 3
BCMA SOLUBLE (sBCMA) INHIBE LA ACTIVIDAD DE CÉLULAS T CON CAR ESPECÍFICO DE BCMA
Se examinó la eficacia potencial de las terapias con células T dirigidas contra BCMA contra la mayoría de los mielomas. Dado que la excreción de BCMA superficial por las células de mieloma puede dificultar el reconocimiento de las células T, se midieron los niveles de BCMA soluble en los sobrenadantes durante el cultivo de una línea de células de mieloma. Se lavaron las células de mieloma U266 y se sembraron en placa en medios de cultivo durante 1, 3, 5 y 24 horas. Se recogió el sobrenadante de los medios y se analizó para determinar el sBCMA mediante ELISA. Los datos muestran un aumento dependiente del tiempo en los niveles de sBCMA en el sobrenadante (figura 2A). A continuación, se examinaron el grado de expresión de BCMA en células de mieloma múltiple (MM) primarias del paciente y la producción de citocinas mediante células T con T-ChARM específica de BCMA que se ponen en contacto con células de MM del paciente. La figura 2B muestra la expresión de BCMA superficial mediante una línea celular de referencia (RPMI, panel izquierdo) y muestras de células de MM primarias de pacientes con diferentes niveles de expresión de BCMA. El gráfico circular de la figura 2C muestra que la expresión de BCMA en la superficie de las células de MM de diecinueve (19) pacientes diferentes resultó positiva para la mayoría de los pacientes, aunque hubo algunas muestras de pacientes que mostraron una expresión de BCMA superficial de intermedia a baja/sin expresión (~ 25 %). Además, la figura 2D muestra que las células T con T-ChARM produjeron más IFN-y cuando se cultivaron con células de MM de pacientes que expresaban altos niveles de BCMA superficial, en comparación con cultivos con células de MM de pacientes con BCMa bajo.
Las células de mieloma expresan con frecuencia PD-L1, que se cree que inhibe la función de las células T al unirse a PD-1 en las células T (Freeman et al. J. Exp. Med. 192(7):1027 (2000)). También se investigó la posibilidad de que PD-L1 afectara a las células T con T-ChARM específica de BCMA. La citometría de flujo de muestras de pacientes mostró que PD-L1 también se expresó en el 79 % de las muestras, con un 47 % de PD-L1alto, 32 % PD-L1int y 21 % PD-L1bajo/negativo (figuras 2E y 2F). No se observó ninguna correlación entre la expresión de BCMA y PD-L1. La figura 2G muestra que las células T con T-ChARM produjeron más IFN-y cuando se cultivaron con células de MM de pacientes que expresaban niveles bajos de PD-L1 frente a niveles altos de PD-L1, aunque esta tendencia no fue estadísticamente significativa.
También se examinó el efecto de sBCMA añadiendo sBCMA a cultivos conjuntos de células T que expresan una T-ChARM específica de BCMA y células K562 transducidas con un polinucleótido que codifica para BCMa de longitud completa (K562/BCMA+). Se detectó una inhibición dependiente de la dosis de la función efectora de células T con T-ChARM específica de BCMA como una medida de la liberación de IFN-y en el sobrenadante del medio tras la administración de sBCMA exógeno (figuras 2H, 2I). Además, las líneas celulares de MM mostraron aumentos sustanciales de sBCMA en el sobrenadante de cultivo en el plazo de 24 horas (figura 2J).
Para examinar si los niveles altos de sBCMA podrían inhibir la actividad de las células T con T-ChARM específica de BCMA, se examinaron los niveles de sBCMA en los sueros de la médula ósea (MO) de los pacientes. Se halló que la MO de los pacientes tenía altos niveles de sBCMA, lo que se correlacionó aproximadamente con la carga de enfermedad tal como se determina mediante el porcentaje de células CD138+ presentes (figura 2K). Para analizar si sBCMA se uniría a las células T con T-ChARM, se incubaron las células T con niveles crecientes de BCMA recombinante y luego se tiñeron usando BCMA-Fc conjugada con APC. Tal como se muestra en la figura 2L, la tinción disminuyó con niveles más altos de BCMA recombinante, lo que indica que sBCMA posiblemente podría tener un efecto perjudicial sobre la función de las células T con T-ChARM específica de BCMA.
Para confirmar la expresión de T-ChARM, se incubaron las células T con T-ChARM de C113ST y las células T con CAR anti-CD19 de control (“FMC63”) con Fc-BCMA y se tiñeron para EGFRt (marcador de transducción de CAR/T-ChARM) y CD4, lo que demuestra que las células expresaron las T-ChARM (figura 2M). La tinción de EGFRt y otras moléculas de la superficie de células T no resultó afectada (datos no mostrados).
Para determinar si la excreción y la unión de sBCMA a las T-ChARM inhibe la función de las células T, se añadió BCMA-Fc a cultivos conjuntos de células T/líneas de células diana, danto como resultado un reconocimiento muy reducido (producción de IFN-y y expresión de CD4) por las células T con T-ChARM que seleccionan como diana BCMA, pero no por las células T con CAR anti-CD19 de control (cultivadas con células K562 que expresan el antígeno de CD19) (figura 2N). El efecto sobre las células T con T-ChARM contra BCMA fue dependiente de la dosis (figuras 2O, 2P). La adición de BCMA recombinante no fusionado con el Fc también inhibió la producción de IFN-y de manera dependiente de la dosis, pero no inhibió la lisis de células K562 BCMA+ mediante células T con T-ChARM (figura 2Q), lo que puede deberse a la alta densidad de antígenos en la superficie de las células diana.
EJEMPLO 4
EFECTO DEL INHIBIDOR DE y-SECRETRASA SOBRE LOS NIVELES DE BCMA EN MM
Para examinar el efecto de la inhibición de la y-secretasa sobre los niveles de BCMA en las células de mieloma, se usó el inhibidor de y-secretasa (GSI) RO4929097. BCMA se regula por incremento rápidamente en diversas líneas celulares de mieloma cuando se incuban con el inhibidor de la y-secretasa (GSI) RO4929097 (la concentración usada osciló desde 0,001 |iM hasta 1,0 |iM) (figuras 3A-3D).
Para examinar el efecto de GSI sobre la cinética de expresión de BCMA superficial, se incubaron células de mieloma U266 durante 1,3, 5 y 24 horas en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (0,01 |iM, 0,1 |iM y 1,0 |iM) y se evaluaron para determinar la expresión de BCMA en la superficie celular mediante citometría de flujo. La expresión de BCMA aumentó de manera dependiente de la dosis en presencia de un GSI (figura 3E). La regulación por incremento persistió a lo largo de 7 días de cultivo en 1,0 |iM de GSI (figura 3F).
Para someter a prueba el efecto de GSI sobre la excreción de BCMA en MM, se lavaron tres líneas celulares de mieloma diferentes (MM1.R, U266 y 8226) y sembraron en placa en medios de cultivo durante 24 horas en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (0,01 |iM, 0,1 |iM y 1,0 |iM). Se recogió el sobrenadante de los medios y se analizó para determinar el sBCMA mediante ELISA. Los niveles de sBCMA disminuyeron en el sobrenadante en presencia de un GSI de manera dependiente de la dosis (figuras 3G y 3H).
Para examinar el efecto sobre los niveles de BCMA soluble (sBCMA) a lo largo del tiempo, se lavaron las células U266 y se sembraron en placa en medios de cultivo durante 1, 3, 5 y 24 horas en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (0,01 |iM, 0,1 |iM y 1,0 |iM ). Se recogió el sobrenadante de los medios y se analizó para determinar el BCMA soluble (sBCMA) mediante ELISA. Los datos muestran una disminución dependiente de la dosis en los niveles de BCMA soluble en el sobrenadante cuando está presente un GSI (figura 3I).
A continuación, se examinó el efecto de eliminar GSI del cultivo de células de MM. Tal como se muestra en las figuras 3J y 3K, los niveles de BCMA superficial disminuyeron después de la eliminación de 1,0 |iM de RO429097, mientras que el sBCMA del sobrenadante aumentó cuando se eliminó el GSI, pero no aumentó cuando permaneció el GSI. Estos datos indican un efecto inhibitorio reversible del GSI sobre la excreción de BCMA superficial. Finalmente, la viabilidad de las líneas celulares de MM sometidas a prueba no resultó afectada por la adición de 1,0 |iM de RO429097 al cultivo (figura 3L).
Luego se sometió a prueba el efecto de GSI sobre la expresión de BCMA en muestras de mieloma primario de pacientes. Se enriquecieron células de mieloma CD138+ a partir de muestras de médula ósea de pacientes, se incubaron durante 3 horas en presencia de diversas concentraciones de GSI RO429097 (de 0,01 |iM a 10 |iM) y se evaluaron para determinar la expresión de BCMA superficial mediante citometría de flujo (figuras 3M y 3R). La intensidad de fluorescencia media (MFI) de BCMA en las células tumorales se presenta como un aumento en veces con respecto a las células tumorales incubadas sin RO4929097. Se observa una regulación por incremento dependiente de la dosis de BCMA en las células tumorales (figura 3N), mientras que no hubo ningún efecto sobre los niveles de varias otras moléculas de la superficie celular, incluyendo CS1, CD86, PD-L1, CD80 y CD38 (figuras 3°-3Q ).
EJEMPLO 5
INHIBIDOR DE y-SECRETASA MEJORA EL RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS DE MIELOMA BCMA+ MEDIANTES CÉLULAS T QUE EXPRESAN T-CHARM ESPECÍFICA DE BCMA
Para examinar el efecto de un GSI en la actividad de las células T con CAR contra mieloma múltiple BCMA+, se midió la producción de IL-2 mediante células CAR-T contra BCMA (T-ChARM específica de BCmA de C11 3ST-CD28 y T-ChARM específica de BCMA de C11 3ST-41BB) o células CAR-T de CD19sh (espaciador corto) de control después del cultivo conjunto con células tumorales primarias de mieloma humano durante 24 horas en medios que contienen diversas concentraciones de GSI RO429097 (de 0,003 |i M a 3,0 |i M) (figura 4A). El tratamiento con GSI dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en la producción de IL-2 mediante las células T con T-ChARM contra BCMA. Además, se midió la producción de IFNy por células T con T-ChARM contra BMCA cultivadas conjuntamente con células de mieloma a diversas concentraciones de RO429097 y también aumentó en presencia de GSI (figura 4B). Estos datos muestran que las células de mieloma múltiple estimulan mejor las células T con T-ChARM específica de BCMA cuando se tratan previamente con un inhibidor de y-secretasa que regula por incremento la expresión de BCMA en la célula tumoral. Finalmente, la proliferación de células T con T-ChARM específica de BCMA marcadas con CFSE aumentó de manera dependiente de la dosis después del cultivo conjunto durante 3 días con células tumorales primarias de mieloma humano en presencia de GSI RO492097 (figura 4C).
Sin querer limitarse a la teoría, una posible advertencia del uso de GSI para aumentar el BCMA en células de mieloma para mejorar el reconocimiento de células CAR-T es que las concentraciones altas de GSI pueden inhibir las funciones efectoras y de señalización de las células T. Véase Eagar et al., Immunity 20(4):407, 2004. Para evaluar los posibles efectos del GSI sobre las células T con CAR en un entorno en el que la expresión del ligando diana permanece estable, se cultivaron conjuntamente células CAR-T de CD19 con células diana Raji o K562/CD19+ en presencia de GSI (de 0,01 |i M a 100 |i M) y se midieron la viabilidad y la función efectora. Por encima de este intervalo de concentración no hubo ningún efecto sobre la expresión del antígeno de CD19 (figura 5a) o sobre la viabilidad de las células CAR-T después de 24 horas (figura 5B). Se halló que el GSI RO4929097 inhibe la función efectora de las células CAR-T de CD19 en concentraciones >1 |i M cuando se cultivan conjuntamente con células K562 CD19+, tal como se determina midiendo la producción de IL-2 (figura 5C, panel superior) e IFNy (figura 5C, panel inferior) (véanse también las figuras 5D-5F). Sin embargo, la capacidad de las células CAR-T de CD19 para destruir específicamente células diana no resultó afectada por la concentración de GSI (figura 5G). Las células CAR-T de CD19 también proliferaron en respuesta a la estimulación de células diana en presencia de 10 |iM de GSI RO4929097, aunque de manera menos eficaz que en ausencia de GSI RO4929097 (figura 5H). Para investigar adicionalmente el efecto de la dosificación de GSI sobre la división de las células CAR-T, se añadió una valoración de dosis de GSI RO4929097 a cultivos conjuntos de células CAR-T de CD19 y células diana. La división de las células CAR-T no resultó esencialmente afectada o sólo ligeramente afectada por la adición de dosis terapéuticas de GSI (de 0,01 |i M-1 |i M), mientras que el GSI en una dosis mayor, no terapéutica (10 |i M) inhibió de manera detectable la proliferación (figura 5I). Las células CAR-T de CD19 cultivadas en presencia de GSI no mostraron una disminución en la expansión a lo largo de 8 días en cultivo con (figura 5J) o sin IL-2 exógena (figura 5K). Además, las células T que se expandieron en presencia de 5 |i M, 0,5 |i M, o ausencia de GSI no mostraron una diferencia significativa en la producción de IFN-y cuando se volvieron a estimular posteriormente con células diana después de la expansión en presencia (figura 5L) o ausencia (figura 5M) de IL-2 exógena. La producción de IL-2 entre los grupos de célula CAR-T tampoco era marcadamente diferente (figura 5N). En general, g S i en niveles terapéuticos no afecta a la función de las células T, incluyendo la producción de citocinas, la actividad de la lisis y la proliferación celular.
A continuación, se examinó el efecto del GSI sobre la funcionalidad de las células T de las células T que contienen una T-ChARM específica de BCMA. El tratamiento con GSI de muestras de tumores de mieloma primario mejoró en gran medida la producción de IFN-y (figuras 5O, 5P y 5Q) y la expresión de CD8 (figura 5O) mediante células T con T-ChARM cultivadas conjuntamente, con efectos observados después del tratamiento con 0,1 |i M de GSI o mayor, y también aumentó la proliferación de las células T (figura 5R).
Estos datos indican la utilidad clínica de combinar células CAR-T específicas de BCMA y un GSI para aumentar los niveles de BCMA en células de mieloma múltiple. Esto puede proporcionar una ventaja o incluso tener un efecto sinérgico en el tratamiento del mieloma múltiple facilitando la eliminación de las células tumorales que expresan niveles bajos de BCMA. Los datos también muestran que un intervalo de concentraciones de un inhibidor de y-secretasa promovió la expresión de BCMA de las células tumorales sin afectar la actividad de las células T.
EJEMPLO 6
ESTUDIO IN VIVO DE LA ACTIVIDAD DE GSI EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE MM
Para investigar si los efectos inhibidores de sBCMA de GSI RO4929097 descritos en el ejemplo 4 podrían replicarse in vivo, se sometió a prueba un modelo de xenoinjerto de ratón de MM humano tal como se ilustra en la figura 6A. En resumen, ratones gamma NOD/SCID (NSG) inmunodeficientes (The Jackson Laboratory) recibieron irradiación subletal (275 rad) en el día -1, seguido de 5 * 106 células MM.1R al día siguiente (día 0). Se administró GSI RO4929097 (30 mg/kg) mediante alimentación por sonda oral el día 19 y el día 20. Se sacrificaron los ratones en diferentes momentos después de la segunda administración mediante alimentación por sonda de GSI y se tomaron muestras de sangre y médula ósea para su análisis. La dosificación de GSI fue seguida por un aumento rápido (> 3 veces por 4 horas después de la segunda alimentación por sonda) en la expresión de BCMA superficial en las células tumorales (figura 6B) y una disminución concurrente en sBCMA (figura 6C). Los efectos observados se redujeron generalmente en el plazo de 48 horas tras el segundo tratamiento mediante alimentación por sonda.
EJEMPLO 7
ESTUDIO IN VIVO DE UNA TERAPIA DE COMBINACIÓN CON GSI CÉLULAS T CON CAR DIRIGIDA CONTRA MM
Se investigó la capacidad de la terapia con GSI para mejorar la terapia con células T con CAR anti-BCMA in vivo. En un experimento similar al descrito en el ejemplo 6, se irradiaron de manera subletal ratones NSG en el día -21, seguido de administración de células de MM humano (5*106 MM.1Rluciferasadeluc) en el día -20 (véase la figura 7A). Se administró una primera dosis de GSI (30 mg/kg de RO4929097) mediante alimentación por sonda oral en el día -1. En el día 0, se les inyectó a los ratones una dosis subóptima de células T con T-ChARM de C11 3ST (0,33*106 células; CD4:CD81:1) y recibieron una segunda dosis del GSI. Se administraron dosis adicionales de GSI en el día 1, día 8 y día 9. Se realizó obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI) a lo largo del experimento y se monitorizó a los ratones para determinar la supervivencia. Tal como se muestra en las figuras 7B, 7C y 7E (gráfico de la izquierda), el grupo que recibió GSI células T tenía una luminiscencia reducida y más ratones sin tumores detectables en comparación con el grupo que recibió solamente las células T (datos de BLI del grupo de células T solamente no mostrados). Los datos de luminiscencia cuantificados (figuras 7C y 7E (gráfico de la izquierda)) indicó que el efecto de las células T con T-ChARM inicial empezó a invertirse en aproximadamente el día 9, cuando los tumores empezaron a crecer (“simulacro células T contra BCMA”). El efecto antitumoral se prolongó mediante combinación con GSI RO4929097 (“RO49 células T contra BCMA”), pero los tumores en ese grupo de tratamiento también crecieron. Los datos de obtención de imágenes eran consistentes con la supervivencia de los ratones (figuras 7D y 7E (gráfico de la derecha)), con los ratones que recibieron la terapia de combinación sobrevivieron más tiempo que el grupo que recibió células T solamente antes de morir. En determinadas realizaciones, se repiten tratamientos con GSI (de al menos 2 a al menos aproximadamente 5 veces hasta al menos aproximadamente 25 veces) cuando se usan en combinación con células T con CAR anti-BCMA, tratamientos con GSI que pueden administrarse de manera concurrente con, antes o después de la administración de las células T con CAR anti-BCMA.
EJEMPLO 8
GSI MEJORA LA UNIÓN A CÉLULAS BCMA+ MM MEDIANTE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN ANTI-BCMA BIESPECÍFICA
Se construyó una proteína de fusión biespecífica que tenía una especificidad para BCMA y para otro antígeno, y con una etiqueta de YFP (proteína amarilla fluorescente). Se añadió la proteína de fusión biespecífica a células H929 de MM que expresan BCMA en cultivo (0,5*106 células) o bien con o bien sin GSI. Se evaluó la unión mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la figura 8, la adición de GSI mejoró la unión por la proteína de fusión biespecífica de unión a BCMA, pero no tuvo ningún efecto sobre la unión por una proteína de fusión biespecífica de control que no selecciona como diana BCMA. Estos datos muestran que las inmunoterapias que implican moléculas biespecíficas que seleccionan como diana BCMA pueden aumentarse o mejorarse con GSI.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Combinación de (1) una célula T modificada que expresa una proteína de unión específica de BCMA, en la que la proteína de unión específica de BCMA es un receptor de antígeno quimérico (CAR) o una molécula de receptor de antígeno quimérico marcada (T-ChARM) y (2) un inhibidor de y-secretasa, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o un trastorno proliferativos asociados con la expresión de BCMA, tal como un cáncer, en un sujeto que tiene la enfermedad o el trastorno proliferativos, en la que el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T modificada y una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de y-secretasa.
    2. Célula T modificada que expresa una proteína de unión específica de BCMA, en la que la proteína de unión específica de BCMA es un receptor de antígeno quimérico (CAR) o una molécula de receptor de antígeno quimérico marcada (T-ChARM), para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o un trastorno proliferativos asociados con la expresión de BCMA, tal como un cáncer, en un sujeto que tiene la enfermedad o el trastorno proliferativos, en la que al sujeto se le ha administrado una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de y-secretasa.
    3. Inhibidor de y-secretasa para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o un trastorno proliferativos asociados con la expresión de BCMA, tal como un cáncer, en un sujeto que tiene la enfermedad o el trastorno proliferativos, en el que al sujeto se le ha administrado una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T modificada que expresa una proteína de unión específica de BCMA, en el que la proteína de unión específica de BCMA es un receptor de antígeno quimérico (CAR) o una molécula de receptor de antígeno quimérico marcada (T-ChARM).
    4. Combinación para su uso según la reivindicación 1, célula T modificada para su uso según la reivindicación 2, o inhibidor de y-secretasa para su uso según la reivindicación 3, en los que el método de tratamiento de la enfermedad o el trastorno proliferativos comprende administrar una menor cantidad de la célula T modificada y/o una menor cantidad del inhibidor de y-secretasa, respectivamente, en comparación con un método que comprende administrar la célula T modificada o el inhibidor de y-secretasa de manera individual para tratar la enfermedad o el trastorno proliferativos.
    5. Combinación para su uso según la reivindicación 1 ó 4, célula T modificada para su uso según la reivindicación 2 ó 4, o inhibidor de y-secretasa para su uso según la reivindicación 3 ó 4, en los que:
    (i) la proteína de unión específica de BCMA comprende un scFv específico de BCMA, un scTCR específico de BCMA o un ligando de BCMA o una porción de unión de los mismos;
    (ii) la proteína de unión específica de BCMA comprende un scFv específico de BCMA que comprende regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo contra BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, S307118G03, SG1, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 o pSCHLI373; y/o
    (iii) la proteína de unión específica de BCMA es un receptor de antígeno quimérico que comprende una porción hidrófoba dispuesta entre un componente extracelular y un componente intracelular, en la que el componente extracelular comprende un dominio de unión específico de BCMA, comprendiendo el dominio de unión específico de BCMA (a) una porción de unión a antígeno específica de BCMA del anticuerpo contra BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, SG1, S307118G03, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 o pSCHLI373; o (b) un ligando de BCMA o porción de unión del mismo basado en o derivado de BAFF o APRIL.
    6. Combinación para su uso según la opción (iii) de la reivindicación 5, célula T modificada para su uso según la opción (iii) de la reivindicación 5, o inhibidor de y-secretasa para su uso según la opción (iii) de la reivindicación 5, en los que:
    (a) la porción hidrófoba es un dominio transmembrana; en la que, opcionalmente, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD28 o CD27;
    (b) el componente intracelular comprende un dominio efector o una porción funcional del mismo, un dominio coestimulador o una porción funcional del mismo, o cualquier combinación de los mismos; en el que, opcionalmente, el componente intracelular comprende 4-1BB (CD137), CD3e, CD38, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRa , FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, OX40 (CD134), ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa , TCRa , TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2, o una porción funcional de los mismos, o cualquier combinación de los mismos, y/o el dominio efector comprende CD3ζ, o una porción funcional del mismo;
    (c) el componente intracelular comprende un dominio coestimulador o una porción funcional del mismo seleccionado de CD27, CD28, 4-1b B (CD137), OX40 (CD134), o cualquier combinación de los mismos;
    (d) el dominio efector o una porción efectora del mismo comprende CD3 ^ o una porción funcional del mismo, y uno o más dominios coestimuladores o una porción funcional de los mismos de 4-1BB (CD137), CD27, CD28 y OX40 (CD134);
    (e) el componente intracelular comprende (e1) 4-1BB o una porción funcional del mismo y CD3ζ, (e2) CD27 o una porción funcional del mismo y CD3ζ, (e3) CD28 o una porción funcional del mismo y CD3ζ, (e4) OX40 o una porción funcional del mismo y CD3ζ, (e5) CD28 o una porción funcional del mismo, 4-1BB o una porción funcional del mismo y CD3ζ, (e6) OX40 o una porción funcional del mismo, 4-1BB o una porción funcional del mismo y CD3ζ o (e7) CD28 o una porción funcional del mismo, OX40 o una porción funcional del mismo y CD3ζ;,
    (f) el componente extracelular comprende una región bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3, un dominio CH3, o cualquier combinación de los mismos dispuestos entre el dominio de unión específico de BCMAy la porción hidrófoba;
    (g) la proteína de unión es una T-ChARM y el dominio extracelular de la T-ChARM comprende una Strep Tag, y/o
    (h) la proteína de unión específica de BCMA es multiespecífica, en la que, opcionalmente, la proteína de unión específica de BCMA es biespecífica.
    Combinación para su uso según la reivindicación 6, célula T modificada para su uso según la reivindicación 6, o inhibidor de y-secretasa para su uso según la reivindicación 6, en los que:
    (i) la proteína de unión específica de BCMA comprende un scFv específico de BCMA que comprende regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo contra BCMA J22.0-xi, J22.9-xi, J6M0, J6M1, J6M2, J9M0, J9M1, J9M2, 11D5-3, CA8, A7D12.2, C11 D5.3, C12A3.2, C13F12.1, 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11, 29F3, 13A7, CA7, S307118G03, SG1, S332121F02, S332126E04, S322110D07, S336105A07, S335115G01, S335122F05, ET140-3, ET140-24, ET140-37, ET140-40, ET140-54, TBL-CLN1, C4.E2.1, Vicky-1, pSCHLI333, pSCHLI372 o pSCHLI373;
    (ii) la proteína de unión específica de BCMA comprende una región de espaciador que comprende una bisagra, en la que la región de espaciador tiene una longitud de desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100 aminoácidos;
    (iii) el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD28 o CD27; o
    (iv) el componente intracelular comprende un dominio coestimulador o una porción funcional del mismo de 4-1BB (CD137), y el dominio efector o una porción del mismo comprende CD3 ^o una porción funcional del mismo.
    Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-7, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-7, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en los que la célula T es una célula T humana, una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T doble negativa CD4- CD8-, una célula T y8, o cualquier combinación de las mismas; en los que, opcionalmente la célula T es una célula T indiferenciada, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora, células T a granel, o cualquier combinación de las mismas.
    Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-8, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en los que el inhibidor de y-secretasa es LY411575, semagacestat, avagacestat, DAPT, BMS-906024, BMS-986115, MK-0752, PF-03084014, RO4929097 o YO-01027.
    Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-9, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-9, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en los que la proteína de unión específica de BCMA comprende un dominio variable que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID nO.:14-16 y un dominio variable que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO.:17-21.
    11. Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-10, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-10, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, en los que el método comprende además acondicionar previamente el sujeto con una pauta posológica inmunosupresora antes de o concurrente con la célula T modificada y el inhibidor de y-secretasa; en los que, opcionalmente, la pauta posológica inmunosupresora comprende un tratamiento no mieloablativo o un tratamiento mieloablativo; en los que, de manera adicional opcionalmente, el tratamiento no mieloablativo comprende ciclofosfamida o ciclofosfamida en combinación con fludarabina.
    12. Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-11, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-11, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en los que:
    (i) el método comprende administrar la célula T modificada y el inhibidor de y-secretasa de manera secuencial, o
    (ii) el método comprende administrar la célula T modificada y el inhibidor de y-secretasa de manera concurrente.
    13. Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-12, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-12, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-12, en los que el método comprende administrar por vía parenteral la célula T modificada y administrar por vía oral el inhibidor de y-secretasa.
    14. Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-13, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-13, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-13, en la que la enfermedad o el trastorno proliferativos es mieloma, leucemia, linfoma, plasmocitoma o macroglobulinemia de Waldenstrom.
    15. Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-14, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-14, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-14, en los que la enfermedad o el trastorno proliferativos es un cáncer hemático o un cáncer sólido; en los que, opcionalmente:
    (i) el cáncer hemático se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B y linfoma linfoplasmacítico; o
    (ii) el cáncer sólido es un adenocarcinoma de mama o un carcinoma broncógeno del pulmón.
    16. Combinación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-15, célula T modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-15, o inhibidor de y-secretasa para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-15, en los que el método comprende administrar el inhibidor de ysecretasa al sujeto al menos una vez posteriormente a una primera administración de la célula T modificada; en los que, opcionalmente el método comprende administrar el inhibidor de y-secretasa al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 veces posteriormente a la primera administración de la célula T modificada.
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