JP7385556B2 - Ｂｃｍａ抗原に特異的な免疫原性ペプチドおよびその使用 - Google Patents

Ｂｃｍａ抗原に特異的な免疫原性ペプチドおよびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年９月１日に出願された米国特許仮出願第６２／５５３，６６９号の利益を主張する。前記のものの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究の声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｐ５０－１００００７、Ｐ０１－７８３７８およびＲ０１－５０９４７に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本開示は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）に特異的である免疫原性ペプチド並びにその使用方法に関する。
がんは、現在、最も高いヒト死亡率を有する疾患の１つである。世界保健機構統計データによれば、２０１２年には、全世界のがん発生数および死亡症例数は、それぞれ１４００万および８２０万に達した。米国では、がんは、すべての死亡の少なくとも２５％の原因である。
近年、種々の種類のがんを処置するために新規療法が開発されてきた。がんに罹患している患者は、例えば、手術、化学療法および／または免疫療法を使用することによって処置されることが多い。これらの患者の予後は、依然として満足のいくものではないことがある。したがって、がんを処置するための効率的な療法および／または予防的レジメンは、緊急に必要とされている。
本開示は、幾分か、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）または膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）に特異的であるペプチドを封入する、免疫原性ペプチド、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）およびナノ粒子（例えば、ポリマーナノキャリアまたはリポソームナノ粒子）およびそれを使用する方法に関する。
一態様では、本開示は、配列番号１３～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と同一である、または１～６個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドに関する。いくつかの実施形態では、配列番号１３～１７の１位のアミノ酸が変更されない。いくつかの実施形態では、配列番号１３～１７の１、２または９位のうち１つまたは複数位のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている。例えば、１、２もしくは９位が置換されている、１および２位が置換されている、２および９位が置換されている、１および９位が置換されている、または１、２および９位が置換されている。特定の実施形態では、ペプチドは、９～３０アミノ酸長（すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸長）である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列のＮ－および／またはＣ末端に１～１５個（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個）のアミノ酸を含む、配列番号１３～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、配列番号１～１７のいずれか１つに対して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる第１のアミノ酸配列と、第１のアミノ酸配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドに関する。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７の１、２または９位のうち１つまたは複数位のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている。例えば、１、２または９位が置換されている、１および２位が置換されている、２および９位が置換されている、１および９位が置換されている、または１、２および９位が置換されている。特定の実施形態では、ペプチドは、９～３０アミノ酸長（すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸長）である。
別の態様では、本開示は、配列番号１～１７のいずれか１つに対して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるペプチドに関する。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７の３、４、５、６、７または８位のうち１つまたは複数位のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている。例えば、３、４、５、６、７または８位が置換されている、３および４位が置換されている、３および５位が置換されている、３および６位が置換されている、３および７位が置換されている、３および８位が置換されている、４および５位が置換されている、４および６位が置換されている、４および７位が置換されている、４および８位が置換されている、５および６位が置換されている、５および７位が置換されている、５および８位が置換されている、６および７位が置換されている、６および８位が置換されている、７および８位が置換されている、３、４、５、６、７および８位の群からの、３つの異なる、４つの異なる、５つの異なる、または６つの異なる位置の任意の組合せが置換されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣ分子と会合した状態で、Ｔ細胞上の抗原特異的Ｔ細胞受容体によって認識される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ（例えば、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ａ２６、ＨＬＡ－Ａ６８またはＨＬＡ－Ａ１１）、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ２分子またはＨＬＡ－Ａ２４分子である。
本開示はまた、本明細書において記載されるようなペプチドおよび第２の薬剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、抗４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬、（６）ペプチドベースのワクチン、異なる種類のワクチン（ＲＮＡワクチン、ＤＮＡワクチン）、細胞療法、特異的モジュレーターおよび／または特異的阻害剤を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を変更する治療薬ならびに（７）生物学的および非生物学的アプローチを含む、疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、免疫刺激性作用物質（例えば、サイトカインまたはヘルパーＴエピトープ）である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、ヘルパーＴエピトープである。いくつかの実施形態では、ヘルパーＴエピトープは、ＰＡＤＲＥ配列またはユニバーサル破傷風トキソイドヘルパーＴ（ＴＴ Ｔｈ）エピトープである。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、アジュバントである。アジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｔｏｌｌ受容体のリガンド、ＱＳ２１、ＲＩＢＩ、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異体ＣＴ（ＭＣＴ）および変異体Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＭＬＴ）からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、ｔｏｌｌ様受容体－３リガンド（例えば、ポリＩＣＬＣ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、抗インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＩＬ－６阻害剤、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーターである。
一態様では、本開示はまた、本明細書において記載されるようなペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、抗４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を含む。いくつかの例では、医薬組成物は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｔｏｌｌ受容体のリガンド、ＱＳ２１、ＲＩＢＩ、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異体ＣＴ（ＭＣＴ）および変異体Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＭＬＴ））、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）または免疫モジュレーター（例えば、単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１））のうち１種または複数を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、チェックポイント阻害剤をさらに含む。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＬＡＧ３抗体である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、レナリドミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＢＣＭＡに特異的なＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＴＡＣＩに特異的なＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）をさらに含む。特定の例では、ＣＴＬは、配列番号１３または１４のうち１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。その他の例では、ＣＴＬは、配列番号１５～１７のうちいずれか１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、非メモリーＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、エフェクターＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、活性化ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、四量体陽性ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、共刺激分子発現を上方制御したＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、チェックポイント分子発現を上方制御したＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、サイトカインを産生する、および／または上方制御された決定的な細胞溶解性マーカー（例えば、ＣＤ１０７、Ｇｒａｎｚｙｍｅ、パーフォリン）発現および／または産生を有するＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、腫瘍またはその他の標的に対する活性を有するＣＤ８＋ＣＴＬである。
一態様では、本開示は、本明細書において記載されるようなペプチドをコードする核酸に関する。特定の例では、核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。その他の実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの例では、ＲＮＡまたはＤＮＡは、ナノキャリア（例えば、ＰＬＧＡなどのポリマーまたはリポソーム）中に封入される。ＲＮＡおよびＤＮＡは、その他の調節配列（例えば、開始コドン、停止コドン、ポリＡテール）を含み得る。
一態様では、本開示はまた、本明細書において記載されるようなペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、核酸の配列は、プロモーター、調節エレメントまたは発現制御配列に作動可能に連結される。
別の態様では、本開示はまた、本明細書において記載されるようなベクターを含む培養細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞または免疫細胞である。
別の態様では、本開示は、本明細書において記載されるようなペプチドをコードする核酸を含むウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、パルボウイルス、粘液腫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルパスウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである。
一態様では、本開示は、少なくとも２種の異なるペプチドの組合せに関し、少なくとも２種の異なるペプチドは、配列番号１３～１７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択される。組合せは、配列番号１３～１７のうち１つまたは複数に１～４つの置換を有するペプチドを含み得る。いくつかの例では、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの例では、１位は変更されていない。いくつかの例では、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、組合せは、配列番号１３～１７に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも２種、３種、４種、または５種すべてのペプチドを含む。いくつかの例では、組合せは、配列番号１３～１７に示される２つまたはそれより多くのペプチドを含み、２つまたはそれより多くのペプチドは、アミノ酸配列のＮ－および／またはＣ末端に１～１５個（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個）のアミノ酸を有する。
一態様では、本開示はまた、本明細書において記載されるようなペプチドの組合せおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬、ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を含む。いくつかの例では、医薬組成物は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｔｏｌｌ受容体のリガンド、ＱＳ２１、ＲＩＢＩ、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異体ＣＴ（ＭＣＴ）および変異体Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＭＬＴ））、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）ならびに／または単剤としての、および／もしくはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）のうち１種または複数を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫アゴニストをさらに含む。いくつかの例では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、チェックポイント阻害剤をさらに含む。一例では、チェックポイント阻害剤は、抗ＬＡＧ３抗体である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）をさらに含む。一態様では、本開示はまた、単離された樹状細胞を含む組成物を提供し、樹状細胞は、その表面にペプチド配列を提示し、ペプチド配列は、ＢＣＭＡ抗原（配列番号１８）およびＴＡＣＩ抗原（配列番号１９）のうち一方または両方の少なくとも１種の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩペプチドエピトープを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩペプチドエピトープは、ＨＬＡ－Ａ２ペプチドエピトープである。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩペプチドエピトープは、ＨＬＡ－Ａ２４ペプチドエピトープである。
いくつかの実施形態では、樹状細胞は、ペプチド配列を含むペプチドへの曝露によってｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチド配列を獲得する。
いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、合成ペプチド配列である。いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１～１２および配列番号１３～１７のいずれか１つに示される配列である。いくつかの例では、ペプチド配列は、配列番号１３～１７に示されるが、１～４つのアミノ酸置換を有する配列である。特定の場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。１つの特別の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１３である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３であるが、１～４つのアミノ酸置換を有する。特定の場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。別の特別の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１６である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１６であるが、１～４つのアミノ酸置換を有する。特定の場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。
いくつかの実施形態では、組成物は、１０５～１０８個の間の樹状細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１～１２および配列番号１３～１７のいずれか１つに示されるペプチドをさらに含む。１つの特別の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１３である。別の特別の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１６である。いくつかの実施形態では、組成物は、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、抗４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬、（６）ペプチドベースのワクチン、異なる種類のワクチン（ＲＮＡワクチン、ＤＮＡワクチン）、細胞療法、特異的モジュレーターおよび／または特異的阻害剤を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を変更する治療薬ならびに（７）生物学的および非生物学的アプローチを含む、疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）をさらに含む。
一態様では、本開示は、それを必要とするヒト被験体において、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現する細胞（例えば、がん細胞）に対する免疫応答を誘導する方法であって、ヒト被験体に、本明細書において記載されるようなペプチド（例えば、配列番号１３～１７を含む、またはそれからなるペプチド）または本明細書において記載されるような組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む方法に関する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３であるが、１～４つのアミノ酸置換を有する。特定の場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。別の特別の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号１６である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１６であるが、１～４つのアミノ酸置換を有する。特定の場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。
いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現するがんを有し、免疫応答は、このようながん細胞に対するものである。
いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現する非がん細胞を有し、免疫応答は、このような非がん細胞に対するものである。
いくつかの実施形態では、がんは、血液がん（例えば、多発性骨髄腫）である。いくつかの実施形態では、がん細胞は、形質細胞（例えば、がん性形質細胞）である。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、難治性多発性骨髄腫を有する。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、同種移植後に再発する難治性多発性骨髄腫を有する。
いくつかの実施形態では、がん細胞は、ＢＣＭＡを発現し、がん細胞におけるＢＣＭＡのレベルは、健常なヒト被験体における形質細胞よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％多い。
いくつかの実施形態では、がん細胞は、ＴＡＣＩを発現し、がん細胞におけるＴＡＣＩのレベルは、健常なヒト被験体における形質細胞よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％多い。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ＢＣＭＡに特異的なＣＴＬを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ＴＡＣＩに特異的なＣＴＬを投与することをさらに含む。特定の例では、ＣＴＬは、配列番号１３または１４のうち１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。いくつかの場合には、ＣＴＬは、配列番号１３または１４であるが、１～４つの置換を有するペプチドに曝露される。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。その他の例では、ＣＴＬは、配列番号１５～１７のうちいずれか１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。いくつかの場合には、ＣＴＬは、配列番号１５、１６または１７であるが、１～４つの置換を有するペプチドに曝露される。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、エフェクターＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、活性化ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、四量体陽性ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＤ８＋ＣＴＬは、本明細書において記載されたペプチドを用いて刺激されると、共刺激分子発現を上方制御するＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＤ８＋ＣＴＬは、本明細書において記載されたペプチドを用いて刺激されると、チェックポイント分子発現を上方制御するＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、サイトカインを産生する、および／または上方制御された決定的な細胞溶解性マーカー（例えば、ＣＤ１０７、Ｇｒａｎｚｙｍｅ、パーフォリン）発現および／または産生を有するＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、腫瘍またはその他の標的に対する活性を有するＣＤ８＋ＣＴＬである。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、抗４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲである。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）または免疫モジュレーターのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ペプチドまたは組成物を投与した後に、ヒト被験体において、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現するがんに対する免疫応答が生じたか否かを決定することをさらに含む。
一態様では、本開示は、がんまたは前悪性疾患を有するヒト被験体を処置する方法であって、ヒト被験体に、本明細書において記載されるようなペプチドまたは本明細書において記載されるような組成物を投与することを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫または任意のＢ細胞または形質細胞悪性疾患である。
いくつかの実施形態では、前悪性疾患は、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）またはくすぶり型多発性骨髄腫である。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のがん細胞が、ヒト被験体において、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現または過剰発現することを検出することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを過剰発現する１つまたは複数のがん細胞を有し、がん細胞におけるＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩのレベルは、正常細胞（例えば、健常な被験体における形質細胞）よりも少なくとも２０％多い。
いくつかの実施形態では、被験体は、ＭＨＣ分子を発現する１つまたは複数のがん細胞を有する。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ＢＣＭＡに特異的なＣＴＬを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ＴＡＣＩに特異的なＣＴＬを投与することをさらに含む。特定の例では、ＣＴＬは、配列番号１３または１４のうち１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。いくつかの場合には、ＣＴＬは、配列番号１３または１４であるが、１～４つの置換を有するペプチドに曝露される。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。その他の例では、ＣＴＬは、配列番号１５～１７のうちいずれか１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。いくつかの場合には、ＣＴＬは、配列番号１５、１６または１７であるが、１～４つの置換を有するペプチドに曝露される。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、エフェクターＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、活性化ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、四量体陽性ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、共刺激分子発現を上方制御したＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、チェックポイント分子発現を上方制御したＣＤ８＋ＣＴＬである。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）または免疫モジュレーターのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に化学療法または放射線療法を施すことをさらに含む。
一態様では、本開示は、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させる方法であって、１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１３および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞と接触させることを含む方法に関する。いくつかの場合には、ＣＴＬは、配列番号１３または１４であるが、１～４つの置換を有するペプチドに曝露される。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、メモリー細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの例では、ＣＤ８＋ＣＴＬは、本明細書において記載されたペプチドを用いて刺激されると、共刺激分子発現を上方制御するＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＤ８＋ＣＴＬは、本明細書において記載されたペプチドを用いて刺激されると、チェックポイント分子発現を上方制御するＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、サイトカインを産生する、および／または上方制御された決定的な細胞溶解性マーカー（例えば、ＣＤ１０７、Ｇｒａｎｚｙｍｅ、パーフォリン）発現および／または産生を有するＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、腫瘍またはその他の標的に対する活性を有するＣＤ８＋ＣＴＬである。
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）である。１つの特別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３を含む、またはそれからなる。別の態様では、本開示は、ＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する方法であって、１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１５～１７から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞と接触させることを含む方法に関する。いくつかの場合には、ＣＴＬは、配列番号１５、１６または１７であるが、１～４つの置換を有するペプチドに曝露される。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。
１つの特別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１６を含む、またはそれからなる。
一態様では、本開示はまた、標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を、１つまたは複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含む方法に関し、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現または過剰発現する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＨＬＡ－Ａを発現する。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）単剤としての、および／またはデキサメタゾンと組み合わせたレナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド類似体、ＩＭｉＤＳ化合物および／またはＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、免疫アゴニストと接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１３または１４に示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む。いくつかの場合には、ペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列のＮ－および／またはＣ末端に付加された１～１５個（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個）のアミノ酸を有し得る。
いくつかの実施形態では、免疫アゴニストはＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）またはレナリドミドのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
別の態様では、本開示は、標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を、１つまたは複数のＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含む方法に関し、標的細胞は、ＴＡＣＩを発現または過剰発現する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＨＬＡ－Ａを発現する。
いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１５～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む。いくつかの場合には、ペプチドは、配列番号１５～１７のアミノ酸配列のＮ－および／またはＣ末端に付加された１～１５個（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個）のアミノ酸を有し得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤と接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、免疫アゴニストと接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫アゴニストはＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである。
いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）またはレナリドミドのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
一態様では、本開示は、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現する疾患またはがんを有するヒト被験体を処置する方法であって、ヒト被験体に、複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞またはＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、配列番号１３～１７のいずれか１つに示される配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む。いくつかの例では、ペプチドは、１～４つの置換を有する点を除いて配列番号１３～１７のうちの１つに示される配列を有する。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてであり得る。いくつかの例では、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、被験体に免疫アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストはＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）またはレナリドミドのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、ヒト被験体の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、誘導多能性幹細胞に由来する。
いくつかの実施形態では、がんは、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、多発性骨髄腫を有する。
一態様では、本開示は、
（ａ）被験体から骨髄由来単核細胞を得ることと、
（ｂ）単核細胞を、単核細胞が培養容器に接着するようになる条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することと、
（ｃ）接着単核細胞を選択することと、
（ｄ）接着単核細胞を、細胞が抗原提示細胞に分化する条件下で、１種または複数のサイトカインの存在下で培養することと、
（ｅ）抗原提示細胞を、本明細書において記載されるようなペプチド（例えば、配列番号１３～１７）と接触させ、それによって、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子上にペプチドを提示する抗原提示細胞を作製することと
を含むプロセスに関する。
いくつかの実施形態では、主要組織適合複合体分子は、ＭＨＣクラスＩ分子である。
いくつかの実施形態では、１種または複数のサイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む。
いくつかの実施形態では、１種または複数のサイトカインは、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を含む。
いくつかの実施形態では、骨髄由来細胞は、多発性骨髄腫を有すると診断された被験体から得られる。
一態様では、本開示は、ＢＣＭＡのＴ細胞抗原受容体配列を同定する方法であって、
（ａ）本明細書において記載されるような方法によって、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させることと、
（ｂ）ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞において、ＢＣＭＡのＴ細胞抗原受容体配列を決定することと
を含む方法に関する。
別の態様では、本開示は、ＢＣＭＡを発現する疾患またはがんを有するヒト被験体を処置するための方法であって、ヒト被験体に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む組成物を投与することを含む方法に関し、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現し、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡと結合する。
いくつかの実施形態では、がんは、ＢＣＭＡを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、多発性骨髄腫を有する。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、配列番号１３または１４のいずれか一方に示される配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む。いくつかの場合には、ペプチドは、１～４つのアミノ酸置換を有する点を除いて配列番号１３または１４に示される配列を有する。いくつかの例では、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの例では、ペプチドは、９～３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、被験体に免疫アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストはＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）またはレナリドミドのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
一態様では、本開示は、ＴＡＣＩのＴ細胞抗原受容体配列を同定する方法であって、
（ａ）本明細書において記載されるような方法によって、ＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させることと、
（ｂ）ＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞において、ＴＡＣＩのＴ細胞抗原受容体配列を決定することと
を含む方法に関する。
別の態様では、本開示は、ＴＡＣＩを発現する疾患またはがんを有するヒト被験体を処置するための方法であって、ヒト被験体に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む組成物を投与することを含む方法に関し、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現し、キメラ抗原受容体は、ＴＡＣＩと結合する。
いくつかの実施形態では、がんは、ＴＡＣＩを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、多発性骨髄腫を有する。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、配列番号１５～１７のいずれか１つに示される配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ３を含むチェックポイント阻害剤、（２）抗ＯＸ４０および抗ＧＩＴＲを含む免疫アゴニスト、（３）レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバントなどのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する化合物、（５）ワクチン、細胞療法および／または抗体を含む、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬ならびに（６）疾患に対する免疫応答を広く網羅するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを標的化する療法とは独立したアプローチを有する治療薬からなる群より選択される薬剤を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、被験体に免疫アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストはＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）またはレナリドミドのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
一態様では、本開示は、ナノ粒子と、配列番号１～１７のいずれか１つに対して少なくとも６０％同一である配列を含むペプチドとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１３の配列を含む、またはそれからなる。特定の例では、ペプチドは、配列番号１３であるが、１～４つのアミノ酸置換を有する配列を有する。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。ペプチドは、９～３０アミノ酸長であり得る。その他の実施形態では、配列は、配列番号１６の配列を含む、またはそれからなる。特定の例では、ペプチドは、配列番号１６であるが、１～４つのアミノ酸置換を有する配列を有する。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。ペプチドは、９～３０アミノ酸長であり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ナノ粒子中に封入される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、リポソームである。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）コポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１３である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１４である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１５である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１６である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１７である。特定の例では、ペプチドは、配列番号１３～１７のいずれか１つであるが、１～４つのアミノ酸置換を有する配列を有する。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。ペプチドは、９～３０アミノ酸長であり得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、アジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、Ｒ８４８または非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）を含む。
一態様では、本開示は、がんを有するヒト被験体を処置するための方法を提供する。本方法は、ヒト被験体に、本明細書において記載されるような組成物（例えば、ナノ粒子）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、多発性骨髄腫を有する。
いくつかの実施形態では、がんは、ＢＣＭＡを発現する。その他の実施形態では、がんは、ＴＡＣＩを発現する。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、配列番号１５～１７のいずれか１つに示される配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１～４つのアミノ酸置換を有することを除いて、配列番号１５～１７のうちの１つに示される配列を有する。置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてであり得る。ペプチドは、９～３０アミノ酸長であり得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ＢＣＭＡに特異的なＣＴＬを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、ＴＡＣＩに特異的なＣＴＬを投与することをさらに含む。特定の例では、ＣＴＬは、配列番号１３または１４のうち１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。その他の例では、ＣＴＬは、配列番号１５～１７のうちいずれか１つまたは複数を含む、またはそれからなるペプチドへの曝露によって得られたＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、メモリーＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、エフェクターＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、活性化ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、四量体陽性ＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、共刺激分子発現を上方制御したＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの例では、ＣＴＬは、チェックポイント分子発現を上方制御したＣＤ８＋ＣＴＬである。いくつかの実施形態では、本方法は、被験体に免疫アゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、ＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、免疫アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、レナリドミドを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）またはレナリドミドのうち１つまたは複数を投与することをさらに含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１３～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と同一である、または１～４個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号１３～１７の１位のアミノ酸が変更されない、ペプチド。
（項目２）
前記アミノ酸配列が、配列番号１３である、項目１に記載のペプチド。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、配列番号１４である、項目１に記載のペプチド。
（項目４）
前記アミノ酸配列が、配列番号１５である、項目１に記載のペプチド。
（項目５）
前記アミノ酸配列が、配列番号１６である、項目１に記載のペプチド。
（項目６）
前記アミノ酸配列が、配列番号１７である、項目１に記載のペプチド。
（項目７）
配列番号１～１７のいずれか１つに対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列からなる第１のアミノ酸配列と、前記第１のアミノ酸配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含む、ペプチド。
（項目８）
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合する、項目１から７のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目９）
ＭＨＣ分子と会合した状態で、Ｔ細胞上の抗原特異的Ｔ細胞受容体によって認識される、項目１から７のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目１０）
前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子である、項目８または９に記載のペプチド。
（項目１１）
前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩＩ分子である、項目８または９に記載のペプチド。
（項目１２）
前記ＭＨＣ分子が、ＨＬＡ－Ａ２分子またはＨＬＡ－Ａ２４分子である、項目８または９に記載のペプチド。
（項目１３）
項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドおよび第２の薬剤を含む組成物。
（項目１４）
前記第２の薬剤が、免疫刺激剤である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記第２の薬剤が、ヘルパーＴエピトープである、項目１３に記載の組成物。
（項目１６）
前記ヘルパーＴエピトープが、ＰＡＤＲＥ配列またはユニバーサル破傷風トキソイドヘルパーＴ（ＴＴ Ｔｈ）エピトープである、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記第２の薬剤が、アジュバントである、項目１３に記載の組成物。
（項目１８）
前記アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｔｏｌｌ受容体のリガンド、ＱＳ２１、ＲＩＢＩ、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異体ＣＴ（ＭＣＴ）および変異体Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＭＬＴ）からなる群より選択される、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記第２の薬剤が、ｔｏｌｌ様受容体－３リガンド（例えば、ポリＩＣＬＣ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である、項目１３に記載の組成物。
（項目２０）
項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目２１）
項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
（項目２２）
項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸を含むベクター。
（項目２３）
前記核酸の配列が、プロモーター、調節エレメントまたは発現制御配列に作動可能に連結される、項目２２に記載のベクター。
（項目２４）
項目２３に記載のベクターを含む培養細胞。
（項目２５）
哺乳動物細胞である、項目２４に記載の培養細胞。
（項目２６）
ヒト細胞である、項目２４に記載の培養細胞。
（項目２７）
免疫細胞である、項目２４に記載の培養細胞。
（項目２８）
項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸を含むウイルス。
（項目２９）
レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、項目２８に記載のウイルス。
（項目３０）
配列番号１３～１７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択される少なくとも２種の異なるペプチドの組合せ。
（項目３１）
配列番号１３～１７に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも３種、４種、または５種すべてのペプチドを含む、項目３０に記載の組合せ。
（項目３２）
項目３０または３１に記載の組合せと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
（項目３３）
免疫アゴニストをさらに含む、項目３２に記載の医薬組成物。
（項目３４）
前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目３３に記載の医薬組成物。
（項目３５）
単離された樹状細胞を含む組成物であって、前記樹状細胞は、その表面にペプチド配列を提示し、前記ペプチド配列は、ＢＣＭＡ抗原（配列番号１８）およびＴＡＣＩ抗原（配列番号１９）のうち一方または両方の少なくとも１種の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩペプチドエピトープを含む、組成物。
（項目３６）
前記ＭＨＣクラスＩペプチドエピトープが、ＨＬＡ－Ａ２ペプチドエピトープである、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記樹状細胞が、前記ペプチド配列を含む合成ペプチドへの曝露によってｉｎ ｖｉｔｒｏで前記ペプチド配列を獲得する、項目３５に記載の組成物。
（項目３８）
前記ペプチド配列が、合成ペプチド配列である、項目３５に記載の組成物。
（項目３９）
前記ペプチド配列が、配列番号１～１２および配列番号１３～１７のいずれか１つに示される、項目３５に記載の組成物。
（項目４０）
１０ ５ ～１０ ８ 個の間の樹状細胞を含む、項目３５に記載の組成物。
（項目４１）
ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現するがん細胞に対する免疫応答を、それを必要とするヒト被験体において誘導する方法であって、前記ヒト被験体に項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドまたは項目１３から２０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目４２）
前記被験体ががんを有し、前記免疫応答が、がん細胞に対するものである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記がんが血液がんである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記がんが多発性骨髄腫である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記がん細胞が、がん性形質細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記がん細胞が、ＢＣＭＡを発現し、前記がん細胞におけるＢＣＭＡのレベルが、健常なヒト被験体における形質細胞よりも少なくとも２０％多い、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
前記がん細胞が、ＴＡＣＩを発現し、前記がん細胞におけるＴＡＣＩのレベルが、健常なヒト被験体における形質細胞よりも少なくとも２０％多い、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
前記ヒト被験体に免疫アゴニストを投与することをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４９）
前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ヒト被験体に、前記ペプチドまたは前記組成物を投与した後に、前記ヒト被験体において、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現するがんに対する免疫応答が生じたか否かを決定することをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目５１）
がんまたは前悪性疾患を有するヒト被験体を処置する方法であって、前記ヒト被験体に、項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドまたは項目１３から２０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目５２）
前記がんが血液がんである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記がんが、多発性骨髄腫、白血病またはリンパ腫である、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記前悪性疾患が、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）またはくすぶり型多発性骨髄腫である、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
１つまたは複数のがん細胞が、前記ヒト被験体において、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現または過剰発現することを検出することをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記ヒト被験体が、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを過剰発現する１つまたは複数のがん細胞を有し、前記がん細胞におけるＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩのレベルが、正常細胞よりも少なくとも２０％多い、項目５１に記載の方法。
（項目５７）
前記被験体が、ＭＨＣ分子を発現する１つまたは複数のがん細胞を有する、項目５１に記載の方法。
（項目５８）
前記ヒト被験体に、免疫アゴニストを投与することをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５９）
前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を施すことをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目６１）
ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させる方法であって、
１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１３および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドでパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞と接触させること
を含む、方法。
（項目６２）
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、メモリー細胞傷害性Ｔ細胞である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞である、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
ＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する方法であって、１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１５～１７から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドでパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞と接触させることを含む、方法。
（項目６６）
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、メモリー細胞傷害性Ｔ細胞である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞である、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、項目６５に記載の方法。
（項目６９）
標的細胞を死滅させる方法であって、
前記標的細胞を、１つまたは複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含み、前記標的細胞が、ＢＣＭＡを発現または過剰発現し、ＨＬＡ－Ａを発現する、方法。
（項目７０）
前記１つまたは複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、免疫アゴニストと接触させることをさらに含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記免疫アゴニストが、ＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
標的細胞を死滅させる方法であって、
前記標的細胞を、１つまたは複数のＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含み、前記標的細胞が、ＴＡＣＩを発現または過剰発現し、ＨＬＡ－Ａを発現する、方法。
（項目７４）
前記１つまたは複数のＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、免疫アゴニストと接触させることをさらに含む、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記免疫アゴニストが、ＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
がんを有するヒト被験体を処置する方法であって、前記ヒト被験体に、複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞またはＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを含む、方法。
（項目７８）
前記被験体に免疫アゴニストを投与することをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記免疫アゴニストが、ＯＸ４０アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、前記ヒト被験体の細胞に由来する、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、誘導多能性幹細胞に由来する、項目７７に記載の方法。
（項目８３）
（ａ）被験体から骨髄由来単核細胞を得ることと、
（ｂ）前記単核細胞を、単核細胞が培養容器に接着するようになる条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することと、
（ｃ）接着単核細胞を選択することと、
（ｄ）前記接着単核細胞を、前記細胞が抗原提示細胞に分化する条件下で、１種または複数のサイトカインの存在下で培養することと、
（ｅ）前記抗原提示細胞を、項目１から１２のいずれか一項に記載のペプチドと接触させ、それによって、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子上に前記ペプチドを提示する抗原提示細胞を作製することと
を含む、方法。
（項目８４）
前記主要組織適合複合体分子が、ＭＨＣクラスＩ分子である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記１種または複数のサイトカインが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む、項目８３に記載の方法。
（項目８６）
前記１種または複数のサイトカインが、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を含む、項目８３に記載の方法。
（項目８７）
前記骨髄由来細胞が、多発性骨髄腫を有すると診断された被験体から得られる、項目８３に記載の方法。
（項目８８）
ＢＣＭＡのＴ細胞抗原受容体配列を同定する方法であって、
（ａ）項目６１に記載の方法によって、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させることと、
（ｂ）前記ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞において、ＢＣＭＡのＴ細胞抗原受容体配列を決定することと
を含む、方法。
（項目８９）
がんを有するヒト被験体を処置するための方法であって、
前記ヒト被験体に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む組成物を投与することを含み、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現し、前記キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡと結合する、方法。
（項目９０）
ＴＡＣＩのＴ細胞抗原受容体配列を同定する方法であって、
（ａ）項目６５に記載の方法によって、ＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させることと、
（ｂ）前記ＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞において、ＴＡＣＩのＴ細胞抗原受容体配列を決定することと
を含む方法。
（項目９１）
がんを有するヒト被験体を処置するための方法であって、
前記ヒト被験体に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む組成物を投与することを含み、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現し、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＣＩと結合する、方法。
（項目９２）
ナノ粒子と、配列番号１～１７のいずれか１つに対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドとを含む、組成物。
（項目９３）
前記ペプチドが、前記ナノ粒子に封入される、項目９２に記載の組成物。
（項目９４）
前記ナノ粒子が生分解性ポリマーを含む、項目９２に記載の組成物。
（項目９５）
前記ナノ粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む、項目９２に記載の組成物。
（項目９６）
前記ナノ粒子が、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）コポリマーを含む、項目９２に記載の組成物。
（項目９７）
前記ナノ粒子がリポソームである、項目９２に記載の組成物。
（項目９８）
前記アミノ酸配列が配列番号１３である、項目９２から９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９９）
前記アミノ酸配列が配列番号１４である、項目９２から９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１００）
前記アミノ酸配列が配列番号１５である、項目９２から９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０１）
前記アミノ酸配列が配列番号１６である、項目９２から９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０２）
前記アミノ酸配列が配列番号１７である、項目９２から９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０３）
前記ナノ粒子が、アジュバントを含む、項目９２から１０２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０４）
前記ナノ粒子が、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、Ｒ８４８または非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）を含む、項目９５から１０３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０５）
アジュバント、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）、レナリドミドまたはそれらの任意の組合せをさらに含む、項目９２から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０６）
がんを有するヒト被験体を処置するための方法であって、前記ヒト被験体に、項目９５から１０５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目１０７）
前記ヒト被験体が、多発性骨髄腫を有する、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記ヒト被験体が、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを発現するがんを有する、項目１０６に記載の方法。
（項目１０９）
前記ヒト被験体に、配列番号１３～１７の群より選択されるペプチド、ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬまたはＴＡＣＩ特異的ＣＴＬのうちの１つまたはそれより多くを投与することをさらに含む、項目１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記ヒト被験体に、配列番号１３または１６に示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドを投与することをさらに含む、項目１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記ヒト被験体に、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドでのＣＴＬの刺激によって生成されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬを投与することをさらに含む、項目１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記ヒト被験体に、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドでのＣＴＬの刺激によって生成されたＴＡＣＩ特異的ＣＴＬを投与することをさらに含む、項目１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料は本明細書に記載されており、当技術分野で公知のその他の適した方法および材料も使用できる。材料、方法および例は、単に例示であり、限定することを意図したものではない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１Ａ～１Ｉは、多発性骨髄腫細胞系でのＢＣＭＡ発現を示す。 図１Ａ～１Ｉは、多発性骨髄腫細胞系でのＢＣＭＡ発現を示す。 図１Ａ～１Ｉは、多発性骨髄腫細胞系でのＢＣＭＡ発現を示す。
図２は、ＨＬＡ－Ａ２に対する天然ＢＣＭＡペプチドの結合親和性を示す。
図３は、ＨＬＡ－Ａ２に対する天然ＴＡＣＩペプチドの結合親和性を示す。
図４は、ＨＬＡ－Ａ２に対するＢＣＭＡペプチド：天然ペプチド対ヘテロクリティックペプチドの結合親和性を示す。
図５は、ＨＬＡ－Ａ２に対するＴＡＣＩペプチド：天然ペプチド対ヘテロクリティックペプチドの結合親和性を示す。
図６は、ＢＣＭＡ４番および５番ペプチド：天然ペプチド対ヘテロクリティックペプチド（５０ｕｇ／ｍｌ）のＨＬＡ－Ａ２安定性を示す。
図７は、ＴＡＣＩ１番、３番および４番ペプチド：天然ペプチド対ヘテロクリティックペプチド（５０ｕｇ／ｍｌ）のＨＬＡ－Ａ２安定性を示す。
図８Ａ～８Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチド刺激を用いて増大されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を示す。
図９Ａ～９Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチド刺激を用いて減少したナイーブＣＴＬを示す。
図１０Ａ～１０Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチド刺激を用いて増大されたメモリーＣＴＬを示す。
図１１Ａ～１１Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチド刺激を用いたＣＭ対エフェクター細胞の動態を示す。
図１２は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチドによるメモリーＣＤ８＋ＣＴＬの誘導を示す。
図１３は、ヘテロクリティックＴＡＣＩ３番ペプチドによるメモリーＣＤ８＋ＣＴＬの誘導を示す。
図１４は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチド－ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す（Ｎ＝５）。
図１５は、ヘテロクリティックＴＡＣＩ３番ペプチド－ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す（ｎ＝４）。
図１６は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ４番ペプチド－ＣＴＬのＨＬＡ－Ａ２特異的増殖を示す。
図１７は、α－ＯＸ４０またはα－ＧＩＴＲを用いて処置されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬのセントラルメモリー細胞によって増強されたα－腫瘍活性を示す。
図１８Ａ～１８Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドを用いて刺激されたＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬでの決定的なＴ細胞マーカーの上方制御を示す。 図１８Ａ～１８Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドを用いて刺激されたＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬでの決定的なＴ細胞マーカーの上方制御を示す。 図１８Ａ～１８Ｃは、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドを用いて刺激されたＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬでの決定的なＴ細胞マーカーの上方制御を示す。
図１９Ａ～１９Ｆは、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＭ細胞系に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬによるＨＬＡ－Ａ２拘束かつ抗原特異的免疫応答を示す。 図１９Ａ～１９Ｆは、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＭ細胞系に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬによるＨＬＡ－Ａ２拘束かつ抗原特異的免疫応答を示す。
図２０Ａ～２０Ｈは、患者のＭＭ細胞に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ５４～６２特異的ＣＴＬまたはヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。 図２０Ａ～２０Ｈは、患者のＭＭ細胞に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ５４～６２特異的ＣＴＬまたはヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。 図２０Ａ～２０Ｈは、患者のＭＭ細胞に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ５４～６２特異的ＣＴＬまたはヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。 図２０Ａ～２０Ｈは、患者のＭＭ細胞に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ５４～６２特異的ＣＴＬまたはヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。
図２１Ａ～２１Ｃは、別個の表現型およびＭＭ細胞に対する高レベルの抗腫瘍活性を提示するＢＣＭＡ７２～８０特異的四量体＋ＣＴＬである。 図２１Ａ～２１Ｃは、別個の表現型およびＭＭ細胞に対する高レベルの抗腫瘍活性を提示するＢＣＭＡ７２～８０特異的四量体＋ＣＴＬである。 図２１Ａ～２１Ｃは、別個の表現型およびＭＭ細胞に対する高レベルの抗腫瘍活性を提示するＢＣＭＡ７２～８０特異的四量体＋ＣＴＬである。
図２２Ａ～２２Ｅは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを用いる刺激の際のＢＣＭＡ特異的ＣＴＬのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の分化である。 図２２Ａ～２２Ｅは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを用いる刺激の際のＢＣＭＡ特異的ＣＴＬのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の分化である。 図２２Ａ～２２Ｅは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを用いる刺激の際のＢＣＭＡ特異的ＣＴＬのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の分化である。
図２３Ａ～２３Ｃは、ＢＣＭＡ特異的メモリーＣＴＬによる高い抗腫瘍活性（図２３Ａ）およびセントラルメモリーＣＴＬによる最高レベル（図２３Ｂ、図２３Ｃ）の特徴付けである。 図２３Ａ～２３Ｃは、ＢＣＭＡ特異的メモリーＣＴＬによる高い抗腫瘍活性（図２３Ａ）およびセントラルメモリーＣＴＬによる最高レベル（図２３Ｂ、図２３Ｃ）の特徴付けである。 図２３Ａ～２３Ｃは、ＢＣＭＡ特異的メモリーＣＴＬによる高い抗腫瘍活性（図２３Ａ）およびセントラルメモリーＣＴＬによる最高レベル（図２３Ｂ、図２３Ｃ）の特徴付けである。
図２４Ａは、２５ Ｕ２６６細胞と同時培養された（７日）ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬの結果である。
図２４Ｂ～２４Ｃは、抗ＬＡＧ３または抗ＯＸ４０を用いて処置したヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ［１つのＨＬＡ－Ａ２＋個体から作製した］のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増強された抗骨髄腫活性である。 図２４Ｂ～２４Ｃは、抗ＬＡＧ３または抗ＯＸ４０を用いて処置したヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ［１つのＨＬＡ－Ａ２＋個体から作製した］のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増強された抗骨髄腫活性である。
図２４Ｄは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式で骨髄腫細胞に対して抗ＯＸ４０を用いて処置したヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ［ＨＬＡ－Ａ２＋ドナー１、ドナー２またはドナー３から作製された］の増強された抗腫瘍活性である。
図２５Ａ～２５Ｂは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０を用いるペプチド刺激後のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージである。
図２６Ａ～２６Ｂは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０を用いるペプチド刺激後のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージである。
図２７Ａ～２７Ｃは、Ｈ９２９、ＭＭＩＳ、Ｕ２６６およびＯＰＭ１細胞系での高いＢＣＭＡ発現を示すが、乳がん細胞系（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）ではそうではないことを示す。
図２８Ａ～２８Ｂは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０を用いるペプチド刺激後のＰＤ－１およびＬＡＧ－３を発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
図２９Ａ～２９Ｃは、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドを用いる刺激の際のナイーブ細胞のメモリーＣＴＬへの分化を示す。 図２９Ａ～２９Ｃは、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドを用いる刺激の際のナイーブ細胞のメモリーＣＴＬへの分化を示す。 図２９Ａ～２９Ｃは、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドを用いる刺激の際のナイーブ細胞のメモリーＣＴＬへの分化を示す。
図３０Ａ～３０Ｆは、ＨＬＡ－Ａ２＋多発性骨髄腫細胞（ＭｃＣＡＲ）に対するヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ＨＬＡ－Ａ２＋多発性骨髄腫細胞（ＭｃＣＡＲ）に対するヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ＨＬＡ－Ａ２＋多発性骨髄腫細胞（ＭｃＣＡＲ）に対するヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。
図３１Ａ～３１Ｅは、ＨＬＡ－Ａ２＋多発性骨髄腫細胞に対するへテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。 図３１Ａ～３１Ｅは、ＨＬＡ－Ａ２＋多発性骨髄腫細胞に対するへテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性を示す。
図３１Ｆは、ＨＬＡ－Ａ２＋多発性骨髄腫細胞への、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドによるペプチド特異的四量体＋ＣＴＬおよび抗腫瘍活性および増殖の誘導を示す。
図３２Ａは、ＢＣＭＡペプチドが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子の形態学を示す。
図３２Ｂは、ＢＣＭＡペプチドが負荷されたリポソームナノ粒子の形態学を示す。
図３２Ｃは、ＢＣＭＡペプチド定量化を示す。
図３３Ａは、時間依存的な、ナノ粒子（ＰＬＧＡ、リポソーム）に封入する際の樹状細胞でのＢＣＭＡペプチドのより高い負荷効率を示す。
図３３Ｂは、時間依存的な、ナノ粒子（ＰＬＧＡ、リポソーム）に封入する際の樹状細胞でのＢＣＭＡペプチド－ＦＩＴＣのより高い負荷効率を示す。
図３３Ｃは、樹状細胞によるより高いＰＬＧＡ／ペプチド取り込みを示す。
図３３Ｄは、時間依存的な、ＰＬＧＡに封入する際の樹状細胞によるＢＣＭＡペプチド－ＦＩＴＣのより高い取り込みを示す。
図３３Ｅは、時間依存的な、ＰＬＧＡに封入する際のＴ２細胞によるＢＣＭＡペプチド－ＦＩＴＣのより高い取り込みを示す。
図３４Ａは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式でＭＭ細胞系に対するＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高の抗ＭＭ活性を示す。
図３４Ｂは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式でＭＭ細胞系に対するＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高のＩＦＮ－γ産生を示す。
図３４Ｃは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式でＭＭ細胞系に対するＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高のＩＬ－２産生を示す。
図３４Ｄは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式でＭＭ細胞系に対するＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高のＴＮＦ－α産生を示す。
図３４Ｅは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式でＭＭ細胞系に対するＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて異なるＨＬＡ－Ａ２＋個体（Ｎ＝３）から作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高の抗ＭＭ活性およびＴｈ１型サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）産生を示す。
図３５Ａは、腫瘍細胞の非存在下で、ＢＣＭＡペプチド自体、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドまたはリポソーム／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬのベースライン活性を示す。
図３５Ｂは、ＨＬＡ－Ａ２＋骨髄腫患者１番から得た初代ＨＬＡ－Ａ２＋ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に応答したＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高の抗ＭＭ活性を示す。
図３５Ｃは、ＨＬＡ－Ａ２＋骨髄腫患者２番から得た初代ＨＬＡ－Ａ２＋ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に応答したＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高の抗ＭＭ活性を示す。
図３５Ｄは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式で骨髄腫患者の腫瘍細胞に対するＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高の抗ＭＭ活性およびＴｈ１型サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）産生を示す。
図３６Ａは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および共刺激分子を発現する（ＣＤ２８＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い頻度を示す。 図３６Ａは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および共刺激分子を発現する（ＣＤ２８＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い頻度を示す。
図３６Ｂは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによるペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のより高い増大を示す。
図３６Ｃは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによるペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生のより高い増大を示す。
図３７Ａは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる骨髄腫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の最も高い誘導を示す。
図３７Ｂは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いる反復刺激の際のＢＣＭＡ－ＣＴＬ［代表的な結果］におけるＣＤ４５ＲＯ＋メモリー／ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのより高い増大を示す。 図３７Ｂは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いる反復刺激の際のＢＣＭＡ－ＣＴＬ［代表的な結果］におけるＣＤ４５ＲＯ＋メモリー／ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのより高い増大を示す。
図３７Ｃは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いる反復刺激の際のＢＣＭＡ－ＣＴＬ［Ｎ＝３結果］におけるＣＤ４５ＲＯ＋メモリー／ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのより高い増大を示す。
図３７Ｄは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いる反復刺激の際のＢＣＭＡ－ＣＴＬにおけるセントラルメモリー／ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのより高い誘導および維持を示す。
図３８Ａは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式での、骨髄腫細胞に対するセントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＣＴＬおよびその抗ＭＭ活性のより高い誘導を示す。
図３８Ｂは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式での、骨髄腫細胞に対するセントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＣＴＬおよびそのＩＦＮ－γ産生のより高い誘導を示す。
図３８Ｃは、ＢＣＭＡペプチド自体を用いた場合よりも、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式での、骨髄腫細胞に対するセントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＣＴＬおよびその抗ＭＭ活性およびＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α産生のより高い誘導を示す。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）は、例えば、多発性骨髄腫およびその他の血液学的悪性疾患を含む多数のがんに対して特異的かつ決定的な抗原である。本開示は、少なくとも幾分かは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ抗原に由来するＨＬＡ－Ａ２特異的免疫原性ペプチドの同定に基づき、これは、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）特異的Ｔ細胞免疫応答をもたらすために使用できる。したがって、本開示は、ＢＣＭＡ由来ペプチドおよびＴＡＣＩ由来ペプチド（およびその医薬組成物）に関し、これは、例えば、被験体において、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を刺激する）ために、またはサイトカインもしくは抗体の産生を刺激するために使用できる。ペプチドは、免疫応答を誘導する方法、抗体を産生する方法、抗腫瘍免疫応答に関与するサイトカインを製造する方法およびがん（例えば、多発性骨髄腫など）を処置する方法などの種々の適用において使用できる。ペプチドはまた、ＭＨＣ分子多量体組成物に含まれることもあり、例えば、細胞の集団においてＴ細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）を検出する方法において使用できる。
本開示はまた、多発性骨髄腫、その前悪性疾患もしくはその他のがんを含むがん患者、またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ抗原を独特に発現および／もしくは過剰発現する任意の疾患における、本明細書において記載される単剤療法または併用療法としての、操作された技術（ＣＡＲ－ＴＣＲ療法ベースのものおよび誘導多能性幹細胞ベースのものを含む）またはペプチドがパルスされた樹状細胞の注入を用いる、ペプチドベースのワクチン接種、ワクチン（ナノ粒子ベースのものおよびウイルスベースのものを含む）の種々のアプローチを構成するペプチド、ｅｘ ｖｉｖｏで作製されたＢＣＭＡ特異的Ｔ細胞またはＴＡＣＩ特異的Ｔ細胞および抗原特異的Ｔ細胞の養子移入を含む種々の種類の治療適用についての情報を提供する。
ＢＣＭＡ由来ペプチドおよびＴＡＣＩ由来ペプチド
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）（ＮＭ＿００１１９２．２→ＮＰ＿００１１８３．２）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても公知であり、ヒトでは、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球において発現される。この受容体は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１３ｂ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＴＡＬＬ－１／ＢＡＦＦ）と特異的に結合し、ＮＦ－カッパＢおよびＭＡＰＫ８／ＪＮＫ活性化につながると示されている。この受容体はまた、種々のＴＲＡＦファミリーメンバーと結合し、したがって、細胞生存および増殖のためのシグナルを伝達し得る。ＢＣＭＡは、種々のがん細胞において、例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を有する被験体において過剰発現されることが多い。
膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）（ＮＭ＿０１２４５２．２→ＮＰ＿０３６５８４．１）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）としても公知であり、ヒトでは、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴＡＣＩは、Ｂ細胞の表面で主に見られるＴＮＦ受容体スーパーファミリーの膜貫通タンパク質である。ＴＡＣＩは、３種のリガンド：ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦおよびＣＡＭＬを認識する。ＴＡＣＩはまた、同様に種々のがん細胞において、例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を有する被験体において過剰発現されることが多い。
ヒトＢＣＭＡおよびヒトＴＡＣＩのアミノ酸配列は以下に示される。
本開示は、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ抗原に由来するペプチド（例えば、ナイーブペプチド）およびペプチド（ナイーブペプチド）に由来するヘテロクリティックペプチドを提供する。これらのペプチドは、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩペプチドの任意の部分または断片であり得る。いくつかの実施形態では、これらのペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸残基より大きい長さを有する。いくつかの実施形態では、これらのペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸残基より小さい長さを有する。いくつかの実施形態では、これらのペプチドは、８～１２アミノ酸残基、８～１５アミノ酸残基、９～１３アミノ酸残基、９～１２アミノ酸残基または１１～３０アミノ酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、９、１０、１１または１２アミノ酸残基（例えば、９アミノ酸残基）である。
いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩに由来するペプチドは、以下を含む：
これらのペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合し得る。ＭＨＣは、免疫系、自己免疫および生殖において重要な役割を有する大きな遺伝子ファミリーである。ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞に対してその表面で自己および非自己（抗原性）を含むペプチドの提示において役割を担う。ＭＨＣクラスＩ分子は、短いペプチドと結合し、そのＮおよびＣ末端は、ペプチド結合溝の末端に位置するポケット中に固定されている。これらのペプチドの多数が、長さ９のものであるが、中心部分の膨隆によってより長いペプチドも収容されることができ、その結果、例えば、８～１５の長さのペプチドを結合する。クラスＩＩタンパク質と結合するペプチドは、大きさにおいて制約されず、例えば、１１～３０アミノ酸長で変わり得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子におけるペプチド結合溝は、両端で開放しており、これによって比較的長い長さを有するペプチドの結合が可能となる。「コア」の９残基長のセグメントは、ペプチドの認識に最も寄与するが、隣接する領域もまた、クラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの特異性にとって重要である。
したがって、本開示はまた、本開示において記載される任意の配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる配列を有するペプチドも提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ（例えば、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ３０、ＨＬＡ－Ａ２６、ＨＬＡ－Ａ６８またはＨＬＡ－Ａ１１）、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃである。
ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＨＬＡ－Ａ２）分子と結合するペプチドの安定性を改善する、免疫原性を増大する、および／または免疫応答を増大するために、ペプチドに種々の修飾を行うことができる。例えば、免疫原性を増大するために、例えば、本明細書において記載される任意のペプチド（例えば、配列番号１～１７）の３、４、５、６、７および／または８位においてＴＣＲ相互作用部位を変更することによって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する親和性を増強することによって、アミノ酸残基を修飾することができる。
ペプチドのＮおよびＣ末端に、二塩基アミノ酸残基（例えば、Ａｒｇ－Ａｒｇ、Ａｒｇ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－ＡｒｇまたはＬｙｓ－Ｌｙｓ）も付加できる。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アンカー残基（「固定されたアンカーエピトープ」）を修飾することによって主要組織適合複合体（ＭＨＣ）結合を増強するために、またはＴＣＲ相互作用部位（例えば、配列番号１～１７の１、２および／または９位）を修飾することによってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との結合を増強するために置換される。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるエピトープは、任意の位置（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの位置）で修飾され得る。ペプチドはまた、それらをＴ細胞刺激の「超抗原」または「超アゴニスト」にする内部変異を含み得る。超抗原ペプチドは、Ｐｉｎｉｌｌａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３（６）： ９０１－５， １９９２；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２６７（ｌ）： ７９－９７， ２００２；米国特許出願公開第２００４／００７２２４６号およびＬｕｓｔｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １７６： １７９６－１８０５， ２００６に記載されるようなポジショナルスキャニング合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー（ＰＳ－ＣＳＬ）を用いてＴ細胞をスクリーニングすることによって作製できる。いくつかの実施形態では、超アゴニストペプチドは、ペプチドをより強力な免疫原にする１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する本明細書において記載されるようなペプチドである。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩに由来するペプチドの最初のアミノ酸残基は、チロシンに変更され得る。
ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩに由来するいくつかのヘテロクリティックペプチドとして以下が挙げられる：
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロクリティック」（例えば、ヘテロクリティックペプチド）とは、野生型配列または元の配列を有する対応するペプチドよりも免疫原性であるペプチドを製造するために、１個または複数のアミノ酸残基が、野生型または元の配列から修飾されているペプチドの形態を指す。
本開示は、本明細書において記載されるようなペプチド（例えば、配列番号１～１７）の改変体をさらに提供する。本明細書において記載されるペプチドの改変体は、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、１つ以下のアミノ酸置換（例えば、５、４、３、２または１つのアミノ酸置換）を有するペプチドの形態を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるペプチドの改変体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの置換を有するペプチドの形態を含み得る。
いくつかの実施形態では、配列番号１～１７の１、２および／または９位のアミノ酸は、ＨＬＡ結合親和性に寄与し、したがって、ペプチド特異的Ｔ細胞応答に影響を及ぼすことなく置換され得る。したがって、ペプチドの免疫原性は、配列番号１～１７の１、２および／または９位の置換を有する場合も依然として維持され得る。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７（例えば、配列番号１３または配列番号１６）の１位のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７（例えば、配列番号１３または配列番号１６）の２位のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７（例えば、配列番号１３または配列番号１６）の９位のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７の１および２位、１および９位、２および９位または１、２および９位のアミノ酸が置換されている。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書において記載されるような配列（例えば、本明細書において記載されるような置換を有するまたは有さない配列番号１～１７のうち１つ）を含み、最大９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個のアミノ酸を有するペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、９から２０個の間のアミノ酸、９から３０個の間のアミノ酸または９から４０個の間のアミノ酸であり得る。
置換は、任意の種類のアミノ酸置換、例えば、保存的または非保存的であり得る。保存的置換は、以下の群内の置換を含む：（１）バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン、（２）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（３）アスパラギンおよびグルタミン、（４）セリン、システインおよびトレオニン；リジンおよびアルギニンならびに（５）フェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上記の極性、塩基性または酸性基のあるメンバーの、同一群の別のメンバーによる任意の置換は、保存的置換とみなされ得る。対照的に、非保存的置換は、あるアミノ酸による、異なる特徴を有する別のものの置換、例えば、１つのアミノ酸の、別の群内の別のアミノ酸との置換である。
いくつかの実施形態では、ペプチドのいずれかの３、４、５、６、７および８位のうち１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべて）が置換されていない。いくつかの実施形態では、ペプチドの３、４、５、６、７および８位のうち１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべて）が、配列番号１～１７から選択される配列と同一である。本明細書で使用される場合、用語位置とは、ペプチドのＮ末端から始まる位置を指す。例えば、ペプチドの３位とは、ペプチドのＮ末端から始まる３番目のアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７の３、４、５、６、７および８位の残基は、ペプチドの認識に最も寄与する。
本開示は、本開示に記載されるような任意の配列、例えば、配列番号１～１７、配列番号１８および１９ならびに配列番号１～１７をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％（例えば、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一である配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列をさらに提供する。
２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適比較目的で配列を整列させる（例えば、最適アラインメントのために第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、また比較目的のために非相同配列を無視してもよい）。比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９５％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一アミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合に、分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入されることが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一位置の数の関数である。本開示の目的のために、２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、１２のギャップペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティーおよび５のフレームシフトギャップペナルティーを有するＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリクスを使用して達成することができる。
また、第１のアミノ酸配列および第１のアミノ酸配列に対して異種である第２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドも本明細書において提供される。第１のアミノ酸配列に対して「異種である」アミノ酸配列または用語「異種アミノ酸配列」は、第１のアミノ酸配列に隣接するアミノ酸配列であり、隣接する配列は、天然には生じない（例えば、隣接する配列は、天然で第１のアミノ酸配列に連結されていない）。第１のアミノ酸配列は、本明細書において記載されるような任意の配列、例えば、配列番号１～１７または配列番号１～１７に由来する任意の配列（例えば、配列番号１～１７の４つ以下の置換を有する配列）を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。異種の隣接するアミノ酸配列を有するペプチドは、一般に、配列番号１～１７の免疫原性ペプチドの細胞における生成に悪影響を及ぼさない（そうしないように選択される）。細胞機構は、ペプチド中の任意の追加の配列を除去して、配列番号１～１７の免疫原性ペプチドをもたらすと予測され、このペプチドは、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現するがん細胞に対する免疫応答を刺激するようにクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子によって提示される。
異種の隣接する配列は、例えば、組換えタンパク質の精製に使用される配列（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））であり得る。異種配列はまた、診断または検出マーカーとして有用であるタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、免疫グロブリン分子のすべてまたは一部（例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域のすべてまたは一部）を含有し得る。
いくつかの実施形態では、異種配列は、治療薬または免疫刺激性ポリペプチド配列（例えば、ヘルパーＴエピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥエピトープまたは破傷風トキソイドユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープ）またはサイトカインもしくはケモカインのすべてもしくは一部）および／または例えば、免疫応答（例えば、抗体作製のための）を誘発するのに有用な担体（例えば、ＫＬＨ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１種または複数のリンカーペプチド配列を含有し得る。ペプチドはまた、標的化ポリペプチドを含有し得る。異種配列は、変動する長さのものであってよく、いくつかの場合には、異種アミノ酸配列が付着される第１のアミノ酸配列よりも長い配列であり得る。第１のアミノ酸配列および第１のものに対して異種である第２のアミノ酸配列を含有するペプチドは、配列で天然に存在するタンパク質に対応しないということが理解される。
標的化ポリペプチドとは、本明細書で使用される場合、特定の組織（例えば、リンパ節）または細胞（例えば、抗原提示細胞またはその他の免疫細胞）またはｉｎ ｖｉｔｒｏでは、特定の単離された分子もしくは分子複合体に付着している部分（または複数の部分）（例えば、第１のアミノ酸配列）を標的化するポリペプチドである。標的化ポリペプチドは、例えば、抗体（免疫グロブリン）またはその抗原結合断片または細胞表面受容体のリガンドであり得る。抗体（またはその抗原結合性断片）は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体または抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片であり得る。Ｆｃ領域（抗原結合領域を有するまたは有さない）を含む、またはそれである抗体断片はまた、Ｆｃ受容体を発現する細胞（例えば、指状嵌入樹状細胞、マクロファージ、単球またはＢ細胞などの抗原提示細胞）に試薬を標的化するために使用できる。細胞表面受容体のリガンドは、例えば、ケモカイン、サイトカイン（例えば、インターロイキン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６）または細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬまたはＴＮＦα）であり得る。
いくつかの実施形態では、異種配列は、例えば、ペプチドの細胞への、または細胞の特定の区画（例えば、小胞体またはゴルジ体）への送達を補助する「輸送配列」を含み得る。輸送配列として、例えば、膜トランスロケーション配列、トランスポータン配列、アンテナペディア配列、環状インテグリン結合ペプチドおよびＴａｔ媒介性ペプチドまたはそれらの修飾されたバージョンを挙げることができる。
リンカーペプチドは、第１のアミノ酸配列を、１種または複数の異種アミノ酸配列と接続できる。例えば、リンカーペプチドは、第１のアミノ酸配列を、第２のアミノ酸配列と接続できる。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、配列番号１～１７のいずれか１種のペプチドを、配列番号１～１７から選択される第２のペプチドと連結／接続できる。リンカーペプチドは、例えば、少なくとも４～６個のアミノ酸がグリシンであるアミノ酸のストレッチであり得る、または含有し得る（例えば、Ｍａｎｃｅｂｏ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＭｏＩ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０： ２４９２－２５０２を参照のこと）。リンカーは、６個またはそれより多い（例えば、７、８、９、１０、１１または１２個またはそれより多い）ヒスチジン残基であり得る、または含有し得る。リンカーペプチドは、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つまたはそれより多い）プロテアーゼ切断部位を含有し得る、またはそれであり得る。プロテアーゼ部位は、例えば、トリプシン、キモトリプシンまたは第Ｘａ因子切断部位であり得る。このようなプロテアーゼ部位は、例えば、異種配列から第１のアミノ酸配列を分離するのに有用であり得る。例えば、トリプシンプロテアーゼ切断部位によって（例えば、精製のために）ポリヒスチジン配列につながっている第１のアミノ酸配列を含有するペプチドの発現および精製後に、ペプチドをトリプシンと接触させることによって、第１のアミノ酸配列からポリヒスチジン配列を除去することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に、異種である、または天然タンパク質中に存在する最大２００（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００）個のアミノ酸を有し得るペプチド（例えば、配列番号１～１７のうち任意の１種）を提供する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書において記載されるような任意の配列（例えば、配列番号１～１７のうち任意の１種）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含み得る。いくつかの実施形態では、配列は、本明細書において記載されるような任意の配列（例えば、配列番号１～１７のうち任意の１種）と同等のものまたはそれから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸を有し得る。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１３である。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１４である。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１６である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、追加の配列を有し得る。追加の配列は、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、追加の配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個のアミノ酸を有し得る。いくつかの実施形態では、追加の配列は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個のアミノ酸を有し得る。
特定の例では、本開示は、配列番号１３～１７から選択される２つまたはそれより多いペプチドの任意の組合せを包含する。
本明細書において記載されるペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子）と結合し得る。ヒトでは、ＭＨＣは、ＨＬＡ複合体として公知である。「ＨＬＡスーパータイプまたはファミリー」とは、本明細書で使用される場合、共有されるペプチド結合特異性に基づいてグループ化されたＨＬＡ分子のセットを指す。ある特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに対して幾分か同様の結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプにグループ化される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡファミリーおよびＨＬＡｘｘ様分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ型を意味する）は、同義語である。ＨＬＡクラスＩ分子の型として、例えば、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ２７、ＨＬＡ－Ｂ４４、ＨＬＡ－Ｂ５８またはＨＬＡ－Ｂ６２が挙げられる。このようなＨＬＡ分子は、その全開示内容が全文で参照により組み込まれる米国特許第７，０２６，４４３号に詳細に記載されている。
ペプチドは、ＭＨＣ分子と、高親和性または中程度の親和性で結合し得る。本明細書で使用される場合、ペプチドのＨＬＡクラスＩ分子との「高親和性」結合は、５０ｎＭ未満（例えば、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、１、０．５、０．１または０．０５ｎＭ未満）の解離定数（ＫＤ）を有する結合として定義される。「中程度の親和性」は、約５０ｎＭから約５００ｎＭの間（例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ｎＭ）のＫＤを有する、ペプチドのＨＬＡクラスＩ分子との結合である。ペプチドのＨＬＡクラスＩＩ分子との「高親和性」結合は、１００ｎＭ未満（例えば、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、１、０．５、０．１または０．０５ｎＭ未満）のＫＤを有する結合として定義される。ペプチドのＨＬＡクラスＩＩ分子に対する「中程度の親和性」は、約１００から約１０００ｎＭの間（例えば、１００、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ｎＭ）のＫＤを有する結合である。ペプチドおよびＭＨＣ分子の結合親和性を決定する方法は、当技術分野で公知である。適した方法はまた、例えば、米国特許第７，０２６，４４３号に記載されている。
本明細書において記載されるペプチドはまた、ＭＨＣ分子と関連して、Ｔ細胞上の抗原特異的Ｔ細胞受容体によって認識され得る。種々の適した方法を使用して、ペプチドが、ＭＨＣ分子と関連して、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識されるか否かを決定できる。例えば、正常な被験体から得た末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、試験ペプチドとともに、抗原提示細胞の存在下ｉｎ ｖｉｔｒｏで数週間の期間にわたって培養してもよい。ペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間の間に活性化され、例えば、増殖アッセイ（Ｈ－チミジンアッセイのカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイ）、限界希釈アッセイ、細胞毒性アッセイ（例えば、カルセイン放出アッセイ）またはサイトカイン－（例えば、ＩＦＮγ）、リンホカイン－もしくは５１Ｃｒ－放出アッセイ（例えば、各々の開示内容が、その全文で参照により組み込まれるＷｅｎｔｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＭｏＩ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ６０３， １９９５； Ｃｅｌｉｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１ ： ２１０５， １９９４； Ｔｓａｉ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８： １７９６， １９９７； Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５９： １， １９９８を参照のこと）を使用して検出され得る。適したｉｎ ｖｉｖｏ法は、ＨＬＡトランスジェニックマウスを免疫化することを含み、これでは、アジュバント中のペプチドをＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与し、免疫化の数週間後、脾細胞を取り出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験ペプチドの存在下、およそ１週間培養し、ペプチド特異的Ｔ細胞を、例えば、５１Ｃｒ－放出アッセイ（例えば、各々の開示内容がその全文で参照により組み込まれる、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６： ９７， １９９６； Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８： ６５１， １９９６； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ４７５３， １９９７を参照のこと）を使用して検出する。
さらに、抗原特異的Ｔ細胞の直接定量化は、Ｔ細胞を、検出可能に標識された、本明細書において記載されるＭＨＣ分子多量体組成物のいずれかなどのＭＨＣ複合体またはＨＬＡ－Ｉ四量体を用いて染色することによって実施できる（例えば、各々の開示内容がその全文で参照により組み込まれる、Ａｌｔｍａｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０３３０， １９９３およびＡｌｔｍａｎ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４， １９９６に記載されるように）。
いくつかの実施形態では、ペプチドの１つまたは複数の特性を調節する（例えば、増大または減少させる）ために、ペプチドをさらに修飾してもよい（例えば、ペプチドのアミノ酸を置換してもよい）。例えば、ペプチドのＭＨＣ分子に対する親和性を増大するために、本明細書において記載されるペプチドのうち１種の１個または複数の（例えば、２、３または４個の）アミノ酸を置換してもよい。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体とペプチド間の結合相互作用を増強するために（ＭＨＣ分子との関連で）、本明細書において記載されるペプチドのうち１種のアミノ酸（例えば、ペプチドのＴ細胞受容体と接触しているアミノ酸残基）を修飾してもよい。このような修飾されたペプチドは、「変更されたペプチドリガンド」と呼ばれることが多い（例えば、各々の開示内容がその全文で参照により組み込まれるＫａｌｅｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５（ｌ）： ２８０； Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ １８０１および国際公開番号ＷＯ０２０７０００３を参照のこと）。ペプチドを修飾する、ならびに修飾の効果を決定する適した方法は、例えば、その開示内容がその全文で参照により組み込まれるＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （Ｉｍｍｕｎｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ （１９９８） １６３： １５１－１６０）に記載されている。
本開示は、本明細書において記載されるような任意のペプチドを含む組成物をさらに提供する。さらに、それに対して向けられた療法を逃れる腫瘍の能力に対抗するために、組成物は、免疫応答を誘導する種々の特異的ペプチドを含むことができる。例えば、組成物中に同一タンパク質に由来する２種以上のエピトープが含まれ得る、例えば、組成物は、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩに由来する少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種または少なくとも７種の異なるペプチドを含有することができる。さらに、ＢＣＭＡに由来する少なくとも１種（例えば、少なくとも２、３、４、５種）のペプチドおよびＴＡＣＩに由来する少なくとも１種（例えば、少なくとも２、３、４、５種）のペプチドの組合せまたは混合物も使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２、３、４、５、６、７または８種のＢＣＭＡ由来ペプチド（例えば、例えば、配列番号１～６および１３～１４から選択される少なくとも２種のＢＣＭＡ由来ペプチド）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２、３、４、５、６、７または８種のＴＡＣＩ由来ペプチド（例えば、例えば、配列番号７～１２および１６～１７から選択される少なくとも２種のＴＡＣＩ由来ペプチド）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１種（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７または８種）のＢＣＭＡ由来ペプチドおよび少なくとも１種（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７または８種）のＴＡＣＩ由来ペプチドを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、免疫刺激性作用物質（例えば、サイトカインまたはヘルパーＴエピトープ）をさらに含む。ヘルパーＴエピトープは、ＰＡＤＲＥ配列またはユニバーサル破傷風トキソイドヘルパーＴ（ＴＴ Ｔｈ）エピトープであり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｔｏｌｌ受容体のリガンド、ＱＳ２１、ＲＩＢＩまたは同様の免疫賦活剤などのアジュバントを含む。アジュバントとしてまた、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異体ＣＴ（ＭＣＴ）（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： １２０３－１２１０）および変異体Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＭＬＴ）（Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４： ９７４－９７９）が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、ｔｏｌｌ様受容体－３リガンド（例えば、ポリＩＣＬＣ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、化学療法剤（例えば、レナリドミド）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１；Ｎｉｅｓｖｉｚｋｙ， ｅｔ ａｌ． ”ＡＣＹ－２４１， ａ ｎｏｖｅｌ， ＨＤＡＣ６ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ： ｓｙｎｅｒｇｙ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ （ＩＭｉＤ（登録商標）） ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ （ＭＭ） ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ （ＡＣＥ－ＭＭ－２００ Ｓｔｕｄｙ）．” （２０１５）： ３０４０－３０４０； Ｂａｅ ｅｔ ａｌ． ”Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ （ＨＤＡＣ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＡＣＹ２４１ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．” Ｌｅｕｋｅｍｉａ （２０１８）： １を参照のこと）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）または免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１５４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＯＸ４０、ＣＤ２０、ＥＧＦＲまたはＣＤ３１９と特異的に結合する抗体（例えば、ヒト抗体）を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６に示される配列を含むペプチドおよびレナリドミドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６に示される配列を含むペプチドならびに抗ＯＸ４０抗体、抗ＬＡＧ３抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
ペプチドを製造するための核酸および方法
本開示はまた、本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち１種または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４種）をコードする核酸配列（ならびに核酸配列を含有する核酸ベクター）ならびに本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち１種または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４種）を製造する方法を特徴とする。このような方法は、必要に応じて、本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち１種または複数をコードする核酸配列であって、発現制御配列に作動可能に連結している核酸配列を含有する核酸ベクターを含む細胞（または細胞の群）を提供するステップおよび細胞をペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップを含み得る。方法はまた、１種または複数のペプチドを細胞から、または細胞が培養された培地から単離するステップを含み得る。したがって、一態様では、本開示は、例えば、がんワクチンを含む、ＲＮＡベースの治療薬およびＤＮＡベースの治療薬を提供する。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、本明細書において記載されるようなポリヌクレオチド（例えば、配列番号１～１７をコードするポリヌクレオチド）を有し得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、１～４つのアミノ酸置換を有する点を除いて配列番号１～１７のうち１種と同一であるペプチドをコードする。いくつかの場合には、置換は、１、２または９位のうち１つまたは複数においてである。いくつかの場合には、ペプチドは、２～３０アミノ酸長である。いくつかの場合には、核酸は、調節配列（例えば、開始コドン、停止コドン、ポリＡテール）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡがんワクチンは、ポリマーまたはリポソームナノキャリア（例えば、ナノ粒子）内で製剤化され得る。
本明細書において記載されるペプチドのうち１種または複数の組換え発現のための核酸配列およびベクター（例えば、発現ベクター）を構築するための適した方法は、当業者に周知であり、例えば、その開示内容がその全文で参照により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ． １， ２ ａｎｄ ３． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ， Ｎｏｖ． １９８９に記載されている。核酸およびベクターを、例えば、細菌、酵母または哺乳動物細胞を含むさまざまな宿主細胞において、例えば、ペプチドを発現するために使用できる。核酸およびベクターをまた、例えば、以下に記載されるようなｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ法において使用できる。ペプチドをコードする配列は、プロモーター、調節エレメントまたは発現制御配列に作動可能に連結され得る。プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントは、核酸によってコードされるペプチドの発現を指示し得る。エンハンサーは、時間、位置およびレベルの点で発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在するという条件で転写開始部位から可変距離に位置する場合に機能し得る。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流に、または関連遺伝子のエクソン中に位置し得る。コード配列をプロモーターの制御下にもたらすために、ペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、プロモーターの下流（３’）１から約５０ヌクレオチドの間に配置することが必要である。目的のプロモーターとして、これらに限定されないが、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーターおよび酵母α接合因子のプロモーター、アデノウイルスＥＩｂ最小プロモーターまたはチミジンキナーゼ最小プロモーターが挙げられる。
ペプチドをコードする配列またはペプチドをコードする配列を含有するベクターは、シグナルペプチドをコードするリーダー配列を含有し得る。リーダー配列は、本明細書において記載されるペプチドのうち１種または複数をコードする配列の５’末端にあり得る。シグナルペプチドは、所与のペプチドのすぐＮ末端である場合も、リーダー配列が、ペプチドをコードする核酸配列とインフレームにあるという条件で１個または複数（例えば、２、３、４、６、８、１０、１５または２０個）のアミノ酸によってそれから隔てられている場合もある。一般に、分泌に先立ってペプチドから切断される（もちろん、シグナルペプチドが、膜貫通タンパク質の挿入を指示する場合を除く）シグナルペプチドは、付着しているペプチドを、翻訳の間に宿主細胞小胞体（ＥＲ）の内腔中に入るように指示し、次いで、ペプチドが分泌小胞を介して宿主細胞の環境中に分泌される。有用なシグナルペプチドとして、例えば、サイトカインまたは増殖因子の天然リーダー配列、ＫＤＥＬ（Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）または例えば、その開示内容が全文で参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８２７，５１６号に記載される任意のシグナル配列が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ペプチドをコードする配列の５’末端は、非天然ＡＴＧ「出発配列」を含み得る。すなわち、例えば、ＡＴＧ配列は、ペプチドが適切に転写され、翻訳されることを確実にするように、ペプチドをコードする核酸に付加され得る。リーダー配列は、一般に、ＡＴＧ出発配列を含むが、そうではない実施形態では、ＡＴＧ配列がリーダー配列をコードする核酸の５’末端に付加され得る。
ペプチドをコードする配列および発現ベクターを構築する適した方法は、当業者に周知であり、例えば、その開示内容が全文で参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ． １， ２ ａｎｄ ３． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ， Ｎｏｖ． １９８９に記載されている。
組換えベクターは、種々の方法を使用して細胞に導入でき、その方法は、少なくとも幾分かは、核酸が導入される細胞の種類に応じて変わり得る。例えば、細菌細胞を、電気穿孔または熱ショックなどの方法を使用して形質転換することができる。酵母細胞をトランスフェクトする方法として、例えば、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法（例えば、各々の開示内容がその全文で参照により本明細書において組み込まれる、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： １９２９； Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３： １６３；米国特許第４，８７９，２３１号；およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅ ５９： １１５を参照のこと）が挙げられる。動物細胞のトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショック、リポソームまたはＦＵＧＥＮＥ（登録商標）もしくはＬＩＰＯＦＥＣＴ ＡＭＩＮＥ（登録商標）などのトランスフェクション試薬を使用する、または溶液中で裸の核酸ベクターを細胞と接触させることによる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前掲を参照のこと）ベクターの細胞への導入を特徴とし得る。
本明細書において記載されるペプチドの小規模または大規模製造のために使用できる発現系として、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、組換え酵母発現ベクターで形質転換された真菌（例えば、酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａ）などの微生物、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染した昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））が感染した、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞）が挙げられる。また、宿主細胞として有用であるのは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、またはウイルスベクター（例えば、中でも、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクター）を用いて感染された、哺乳動物から直接得られた初代細胞または二次細胞である。
本明細書において記載されるペプチドのいずれかの発現後、ペプチドを、培養細胞から、または細胞が培養された培地から、標準技術を使用して単離できる。タンパク質を単離する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、親和性クロマトグラフィー（例えば、金属キレート化またはイムノアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、沈殿または差次的可溶化が挙げられる。
より小さいペプチド（例えば、２００個未満（例えば、１７５個未満、１５０個未満、１２５個未満、１００個未満、９０個未満、８０個未満、７０個未満または６０個未満）のアミノ酸を有するペプチド）は、ＦＭＯＣ固相合成などの標準的な化学的手段によって化学的に合成できる。
本明細書において記載されるペプチドは、単離できるが、単離する必要はない。本明細書において記載されるペプチドのいずれかに適用されるような用語「単離された」とは、それに天然に付随する構成成分（例えば、タンパク質またはその他の天然に存在する生物学的分子もしくは有機分子）から分離または精製されているペプチド、その断片（または組成物については、高分子複合体）を指す。組換え分子（例えば、組換えペプチド）は常に「単離される」ということが理解される。通常、ペプチド（または断片または高分子複合体）は、調製物中の同一種類の全分子の、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％、例えば、試料中の同一種類の全分子の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を構成する場合に、単離される。例えば、本明細書において記載されたペプチドは、調製物または試料中の全タンパク質の、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を構成する場合に単離されていると考えられる。いくつかの実施形態では、調製物中の分子は、調製物中の同一種類の全分子の、重量で少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９９％からなる。
同様に、本明細書において記載されるペプチドをコードする配列またはペプチドをコードする配列を含有するベクターもまた、単離できる。本明細書において記載されるペプチドをコードする配列またはベクターのいずれかに適用されるような用語「単離された」とは、それに天然に付随する構成成分（例えば、核酸、タンパク質またはその他の天然に存在する生物学的分子もしくは有機分子）から分離または精製されているペプチドをコードする配列またはベクター、その断片を指す。組換え分子（例えば、組換えベクターまたはペプチドをコードする配列）は常に、「単離される」ということが理解される。通常、ペプチドをコードする配列またはベクター（またはその断片）は、調製物中の同一種類の全分子の、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％、例えば、試料中の同一種類の全分子の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を構成する場合に、単離される。例えば、本明細書において記載されるペプチドをコードする配列またはベクターは、調製物または試料中の全核酸の、重量で、少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を構成する場合に単離されていると考えられる。いくつかの実施形態では、調製物中の分子は、調製物中の同一種類の全分子の、重量で少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９９％からなる。
いくつかの実施形態では、単離されたペプチド、ペプチドをコードする配列またはベクターは、分子が活性（例えば、ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子などのＭＨＣ分子と結合する能力またはベクターの細胞におけるペプチドの発現を支持する能力）を保持することを可能にする適当な条件下で凍結、凍結乾燥または固定化および保存できる。
ペプチドの加工処理
本明細書において記載されるペプチドのいずれかの発現または合成後、ペプチドをさらに加工処理できる。さらなる加工処理は、ペプチドへの化学的もしくは酵素的修飾を含むことがあり、またはペプチドが修飾される場合には、加工処理は、既存の修飾の酵素的もしくは化学的変更もしくは両方を含み得る。ペプチドのさらなる加工処理は、これらに限定されないが、本明細書において記載される異種アミノ酸配列のいずれかなどの異種アミノ酸配列の付加（共有結合的または非共有結合的連結）を含み得る。酵素的処理は、ペプチドが修飾されることを可能にする条件下で、ペプチドを、例えば、１種または複数のプロテアーゼ、ホスファターゼまたはキナーゼと接触させることを含み得る。酵素的処理は、ペプチドを、ペプチドのグリコシル化可能な、またはグリコシル化を修飾可能な１種または複数の酵素（例えば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼ）と接触させることを含み得る。
加工処理は、例えば、ペプチドへの検出可能な標識の付加を含み得る。例えば、ペプチドは、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）、蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、ダンシルクロリド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）またはフィコエリトリン）、発光物質（例えば、ランタニドまたはそのキレート）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはエクオリン）または放射性核種（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは３５Ｓ）を用いて検出可能に標識できる。
加工処理はまた、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール部分などのポリアルキレングリコール部分）またはナノ粒子とのペプチドのカップリングを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、Ｎ末端であるペプチド上の部位でポリペプチドにカップリングされる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ポリマーがコンジュゲートされ得る内部ポリマーコンジュゲーション部位を提供する１個または複数の内部アミノ酸挿入を含有し得る。
免疫応答を誘導する方法
本開示はまた、被験体において免疫応答を誘導するための種々の方法（例えば、ペプチドベースのワクチン接種、ナノ粒子ベースの免疫療法、ＡＰＣベースの免疫療法、Ｔ細胞ベースの免疫療法、ＣＡＲＴ細胞ベースの免疫療法または誘導多能性幹細胞アプローチ）を提供する。被験体において免疫応答を誘導する方法は、例えば、被験体に、本明細書において記載される組成物のうち１種または複数（例えば、本明細書において記載されるペプチド（またはペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクター）のいずれか（または本明細書において記載される１種または複数のペプチド（またはベクター）を含有する医薬組成物のいずれか））を投与するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される組成物は、ワクチンとして使用される。
本明細書において記載されるペプチドのいずれかを使用して、本明細書において記載されるペプチドのうち１種または複数をコードする核酸発現系の使用によって免疫応答を刺激できる。すなわち、被験体において免疫応答を誘導する方法は、被験体に、本明細書において記載されるペプチドのうち１種または複数をコードする核酸配列を含有する発現ベクター（または発現ベクターを含有する医薬組成物）を投与するステップを含み得る。免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＴＨ１応答、ＴＨ２応答または両方の種類の応答の組合せであり得る。
上記の方法のいずれも、例えば、被験体においてがん（例えば、多発性骨髄腫などの形質細胞障害、またはＢＣＭＡおよび／もしくはＴＡＣＩを発現する任意のその他のがん）を処置または予防する方法（それに対する予防法）であり得る。用語「予防する」、「予防すること」または「予防」が、所与の状態の所与の処置とともに本明細書において使用される場合、それらは、処置された被験体が、臨床上観察可能なレベルの状態を全く発生しない（例えば、被験体が、状態の１つまたは複数の症状を示さない、またはがんの場合には、被験体が検出可能なレベルのがんを発生しない）、または状態が、処置の非存在下で有すると予想されるものよりも、被験体においてより遅くおよび／もしくはより低い程度で（例えば、被験体におけるより少ない症状もしくはより少ない数のがん細胞）発生することを意味する。これらの用語は、被験体がどのような状態の態様も全く経験しない状況のみに限定されない。例えば、処置は、期間、例えば、状態の所与の症状発現（進行がん）をもたらすと予測されるがんの早期診断（例えば、被験体から得た試料における少ないがん細胞の検出）の期間にそれが施され、そうでなければ予測されるものよりも少ないおよび／または穏やかな症状の状態を被験体が経験することをもたらす場合に、状態を「予防した」と言われる。処置は、被験体ががんの軽度の顕性の症状のみを示す場合に、がん（例えば、多発性骨髄腫などの形質細胞障害）を「予防」し得る。「予防」は、そのように処置された被験体によって単一のがん細胞でさえ発生しなかったはずであるということは暗示しない。
一般に、被験体に送達されるペプチドは、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）に懸濁され、経口的に、直腸に、または非経口的に、例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、または肺内に注射されて投与される。
投与は、医薬組成物のボーラスの周期的注射によってである場合も、外部（例えば、ＩＶバッグ）または内部（例えば、生体内分解性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）インプラント、バイオ人工臓器または埋め込まれた試薬製造細胞のコロニー）であるリザーバーからの静脈内もしくは腹腔内投与による中断されていない、もしくは連続である場合もある。例えば、各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号および同第５，８００，８２８号を参照のこと。
治療用核酸の従来のおよび薬学的に許容される投与経路として、必ずしもこれらに限定されないが、筋肉内、皮下、皮内、経皮、静脈内、経直腸（例えば、浣腸、坐剤）、経口、胃内、鼻腔内（経鼻）および有効な吸入経路のその他の経路および投与のその他の非経口経路が挙げられる。投与の経路は、組み合わせてもよく、望ましい場合には、核酸分子および／または免疫応答に対する所望の効果に応じて調整してもよい。核酸を被験体に投与する方法は、ベクター媒介性遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクションまたは種々のその他のタンパク質ベースのもしくは脂質ベースの遺伝子送達複合体）などの種々の周知の技術ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（電気穿孔、「遺伝子銃」送達および被験体または被験体の細胞へのポリヌクレオチドの導入に使用される種々のその他の技術など）を含み得る。
一般に、必要なペプチドまたは核酸の投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被験体の病気の性質または重症度、被験体の免疫状態、被験体の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与されているその他の薬物ならびに主治医である医療従事者の判断に応じて変わる。
免疫応答を誘導するためのペプチドの適した投与量は、被験体の１ｋｇあたり０．０００００１～１０ｍｇの試薬または抗原性／免疫原性組成物の範囲である。試薬の多様性および種々の投与経路の異なる効率を考慮して、必要とされる投与量の幅広い変動が予測されるべきである。例えば、鼻または直腸投与は、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とし得る。これらの投与量レベルの変動は、当技術分野で十分に理解されるような最適化のための標準的な経験的なルーチンを使用して調整できる。投与は、単回である場合も複数回（例えば、２－、３－、４－、６－、８－、１０－、２０－、５０－、１００－、１５０－倍またはそれより多く）である場合もある。例えば、ペプチドを最初の免疫化として投与し、次いで、追加免疫化として続いて１回または複数回投与することができる。
本明細書において記載される方法に関連して、被験体に投与される核酸の用量は、被験体において経時的に有益な治療応答を達成するのに、または症状を軽減するのに十分でなくてはならない。ただし、使用される投与量は、例えば、被験体または達成されるべき臨床目標に応じて変わる。適した投与量範囲は、単回投与量において担体１ｍｌあたり最大約１μｇ、約１，０００μｇ、約５，０００μｇ、約１０，０００μｇ、約２５，０００μｇまたは約５０，０００μｇの核酸を提供するものである。
治療有効性（例えば、被験体において免疫応答を誘導するための、１種もしくは複数のペプチドまたはペプチドをコードする核酸の有効性）を最適化するために、ペプチドまたは核酸を含有する組成物を、異なる投与レジメンでまず投与することができる。単位用量およびレジメンは、例えば、哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重を含む因子に応じて変わる。医薬組成物（例えば、１種もしくは複数のペプチドまたは本明細書において記載される１種もしくは複数のペプチドをコードする１種もしくは複数の核酸配列を含有する医薬組成物）の投薬の頻度は、医療従事者（例えば、医師または看護師）の技量および臨床判断の範囲内である。通常、投与レジメンは、最適投与パラメータを確立し得る臨床試験によって確立される。しかし、医療従事者は、被験体の年齢、健康、体重、性別および医学的状態に従ってこのような投与レジメンを変更し得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物を被験体に、少なくとも２回（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５または２０回またはそれより多く）投与できる。例えば、医薬組成物を被験体に、月に１回３ヶ月間、週に１回１ヶ月間、年に１回３年間、年に１回５年間、５年ごとに１回、１０年ごとに１回または生涯にわたって３年ごとに１回投与できる。
本明細書において定義されるように、ペプチドまたはペプチドをコードする核酸の「治療有効量」とは、処置された被験体において免疫応答をもたらすことが可能であるペプチドまたは核酸の量である。ペプチドの治療有効量（すなわち、有効投与量）は、被験体または試料重量１キログラムあたりミリグラム、マイクログラム、ナノグラムまたはピコグラム量の薬剤（例えば、１キログラムあたり約１ナノグラム～１キログラムあたり約５００マイクログラム、１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム～１キログラムあたり約５ミリグラムまたは１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含む。核酸の治療有効量はまた、被験体または試料重量１キログラムあたりマイクログラム、ナノグラムまたはピコグラム量の薬剤（例えば、１キログラムあたり約１ナノグラム～１キログラムあたり約５００マイクログラム、１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５００マイクログラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム～１キログラムあたり約５００マイクログラムまたは１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含む。
本明細書において定義されるように、ペプチドまたはペプチドをコードする核酸の「予防有効量」は、処置された被験体においてがん細胞（例えば、多発性骨髄腫）に対する免疫応答をもたらすことが可能であるペプチドまたは核酸の量であり、この免疫応答は、被験体においてがんの発生を防ぐことが可能である、またはがんを発生するもしくはがんを発生し続ける被験体の機会を実質的に低減できる。ペプチドの予防有効量（すなわち、有効投与量）は、被験体または試料重量１キログラムあたりミリグラム、マイクログラム、ナノグラムまたはピコグラム量の薬剤（例えば、１キログラムあたり約１ナノグラム～１キログラムあたり約５００マイクログラム、１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム～１キログラムあたり約５ミリグラムまたは１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含む。核酸の予防有効量はまた、被験体または試料重量１キログラムあたりマイクログラム、ナノグラムまたはピコグラム量の薬剤（例えば、１キログラムあたり約１ナノグラム～１キログラムあたり約５００マイクログラム、１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５００マイクログラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム～１キログラムあたり約５００マイクログラムまたは１キログラムあたり約１マイクログラム～１キログラムあたり約５０マイクログラム）を含む。
いくつかの実施形態では、本方法はまた、組成物を被験体に投与した後に被験体において免疫応答が生じたか否かを決定することを含み得る。被験体において免疫応答が生じたか否かを決定する適した方法は、例えば被験体から得た生体試料におけるペプチドに特異的な抗体の存在を検出するための免疫アッセイの使用を含む。例えば、ペプチドを被験体に投与した後に、被験体から生体試料（例えば、血液試料）を得、ペプチドに特異的な抗体の存在について試験することができる。免疫応答はまた、試料における活性化されたＴ細胞の存在または量についてアッセイすることによって検出できる。このようなアッセイとして、例えば、増殖アッセイ、限界希釈アッセイ、細胞毒性アッセイ（例えば、リンホカイン－または５１Ｃｒ－放出アッセイ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法（例えば、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大する治療薬、ワクチン、細胞療法、抗体ならびに／またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ以外のいくつかの標的を標的化する治療アプローチ）はまた、被験体に、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強する種々の種類の化合物（例えば、サイトカインおよびケモカイン）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および／または抗ＴＩＭ３抗体）、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０または抗ＧＩＴＲ抗体）、免疫モジュレーター（例えば、レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、ＡＣＹ２４１）および／またはアジュバントを投与することを含み得る。
本方法はまた、被験体に、１種もしくは複数の化学療法剤、１つもしくは複数の形態の電離放射線または１種もしくは複数の免疫調節剤を投与するステップを含む。１つまたは複数の形態の電離放射線は、ガンマ照射、Ｘ照射またはベータ照射であり得る。１種または複数の化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド、ベラムピル（ｖｅｒａｍｐｉｌ）、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、サリドマイド、レナリドミド、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ｈｓｐ９０阻害剤（例えば、テネスピンマイシン（ｔｅｎｅｓｐｉｎｍｙｃｉｎ））、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサートまたは上記のもののいずれかの類似体からなる群より選択され得る。免疫調節剤として、例えば、種々のケモカインおよびサイトカイン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ－２）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン１２（ＩＬ－１２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはペプチドをコードする核酸を、免疫モジュレーター、例えば、Ｔｏｌｌ受容体リガンドまたはアジュバントとともに投与できる。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）阻害剤（例えば、ＡＣＹ２４１）である。
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加の治療剤は、免疫調節剤、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）または免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）であり得る。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの阻害剤、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、Ａｋｔの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）および／またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤からなる群より選択される１種または複数の阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１）（ＩＤＯ１）（例えば、エパカドスタット）の阻害剤である。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＨＥＲ３の阻害剤、ＬＳＤ１の阻害剤、ＭＤＭ２の阻害剤、ＢＣＬ２の阻害剤、ＣＨＫ１の阻害剤、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤およびエストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤からなる群より選択される１種または複数の阻害剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、併用療法は、以下のうち１種または複数を含む：
（Ａ）ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増強し得る化合物、例えば（１）サイトカインおよびケモカイン、（２）例えば、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３および／または抗ＴＩＭ３抗体を含むチェックポイント阻害剤、（２）例えば、抗ＯＸ４０および／または抗ＧＩＴＲ抗体を含む免疫アゴニスト、（３）例えば、レナリドミド、ポマリドミド、ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、ＡＣＹ２４１を含む免疫モジュレーター、（４）アジュバント、
（Ｂ）本明細書において記載されるような任意の治療薬（例えば、ワクチン、細胞療法および／または抗体）を含むＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ特異的応答を増大し得る治療薬またはその他の標的を標的化する独立したアプローチ（例えば、非ＢＣＭＡまたは非ＴＡＣＩを標的化する療法）ならびに
（Ｃ）Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの阻害剤、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、Ａｋｔの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤ならびにイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤ならびに／またはインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１）（ＩＤＯ１）（例えば、エパカドスタット）の阻害剤からなる群より選択される１種または複数の阻害剤などの追加の化合物。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル、トレバナニブ、パゾパニブ、セジラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、レオリシン（Ｒｅｏｌｙｓｉｎ）、アリムタ、ジカディア、スーテント、テムシロリムス、アキシチニブ、エベロリムス、ソラフェニブ、ヴォトリエント、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テモゾロミド（Ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドミド、アザシチジン、レナリドミド、ボルテゾミド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ）、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサートおよびエンザスタウリンからなる群より選択される１種または複数の治療剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的化する処置、ＣＸＣＬ９を標的化する処置、ＣＸＣＬ１０を標的化する処置、ＣＣＬ５を標的化する処置、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニストおよびセレクチンアゴニストからなる群より選択される１種または複数の治療剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、カルボプラチン、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、またはＦＯＬＦＩＲＩが被験体に投与される。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１５４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＯＸ４０、ＣＤ２０、ＥＧＦＲまたはＣＤ３１９と特異的に結合する抗体（例えば、ヒト抗体）である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。
本開示はまた、本明細書において記載されるような１種もしくは複数のペプチドをコードする核酸を含むウイルスまたは本明細書において記載されるような１種もしくは複数のペプチドを含むウイルス粒子を提供する。種々のウイルス、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルスなどを使用できる。これらのウイルスを使用して、ペプチドまたはそのペプチドをコードする核酸を被験体に送達して、免疫応答を誘導できる。同様に、本明細書において記載されるような１種もしくは複数のペプチドおよび／またはそのペプチドをコードする核酸を含むリポソームを使用して、ペプチドまたは核酸をそれを必要とする被験体に送達して、免疫応答を誘導することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法は、免疫応答、活性（例えば、サイトカイン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＴＮＦ－αを産生する）または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）の数を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍増大できる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍増大できる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるような方法は、がん細胞を特異的に標的化する、または本明細書において記載されるペプチドを認識する、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の総数または例えば、ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ８＋のパーセンテージ）を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍増大できる。
ナノ粒子
本開示は、本明細書において記載されるような１種もしくは複数のペプチド（例えば、配列番号１～１７）または本明細書において記載されるような１種もしくは複数のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１～１７をコードする配列）を含むナノ粒子またはナノキャリアをさらに提供する。いくつかの場合には、ナノキャリアは、配列番号１～１７のアミノ酸配列と同一であるが、１～４つのアミノ酸置換を有するペプチドを含む。いくつかの例では、置換は、１、２および９位のうち１つまたは複数においてである。このようなペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）もまた、ナノキャリアに封入され得る。ナノ粒子またはナノキャリアを、それを必要とする被験体に投与して、免疫応答を誘導できる。
ペプチドは、種々の付着機序を介してナノ粒子またはナノキャリアに付着され得る。この付着機序は、静電引力、共有結合カップリングまたは疎水性相互作用であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、アジュバントとともに負荷され得る。アジュバントは、樹状細胞標的化分子、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の強力な合成アゴニストとして認識されるＲ－８４８またはＴＬＲ－９の免疫賦活性アゴニストである非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドまたはＴＬＲ－４の免疫賦活性アゴニストであるモノホスホリル脂質Ａまたはエンドソーム膜標的化剤、例えば、Ｅｎｄｏ－Ｐｏｒｔｅｒペプチドであり得る。
ナノ粒子を形成するポリマーは、任意の生分解性または非生分解性合成または天然ポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーは、生分解性ポリマーである。有用な生分解性ポリマーの例として、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）またはポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。これらのポリマーは、確立された安全記録を有しており、ヒト被験体において使用できる（Ｊｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ５７（３）： ３９１－４１０， ２００５； Ａｇｕａｄｏ ａｎｄ Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， １８４（２－３）： １１３－２５， １９９２； Ｂｒａｍｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ５７（９）： １２４７－６５， ２００５）。その他の両親媒性ポリ（アミノ酸）ナノ粒子、両親媒性多糖ナノ粒子またはポリイオンナノ粒子を、本明細書において開示されるワクチン組成物において使用できる（Ａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ． ２４７： ３１－６４， ２０１２を参照のこと）。前記のポリマーは、単独で、物理的混合物として、またはコポリマーを形成することによって使用できる。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ブロック－ポリ（Ｌ－ヒスチジン）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ－ＰＬＨ－ＰＥＧ）トリブロックコポリマー、ＰＬＧＡ－ＰＥＧジブロックコポリマーおよびＰＬＡの混合物によって形成される。これらのコポリマーは、標準技術を使用して合成され得る。例えば、コポリマーＰＬＧＡ－ＰＬＨ－ＰＥＧは、ブロックエンドグラフティング戦略を使用して合成され得る。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、５００ｎｍから０．５ｎｍの間の範囲の、例えば、５０から５００ｎｍの間の直径を有する、１００から４００ｎｍの間である直径を有する、または２００から４００ｎｍの間である直径を有する粒子である。
ナノ粒子ならびにナノ粒子を作製および使用する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、各々その全文で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／０００８４５１、ＵＳ２０１０／０１２９４３９、ＵＳ２０１８／００２１２５８に記載されている。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、リポソームである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリマー粒子である。
ナノ粒子を形成するポリマーは、任意の生分解性または非生分解性合成または天然ポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、生分解性ポリマーである。有用な生分解性ポリマーの例として、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）またはポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。これらのポリマーは、確立された安全記録を有しており、ヒト被験体において使用できる（Ｊｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ５７（３）： ３９１－４１０， ２００５； Ａｇｕａｄｏ ａｎｄ Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， １８４（２－３）： １１３－２５， １９９２； Ｂｒａｍｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ５７（９）： １２４７－６５， ２００５）。その他の両親媒性ポリ（アミノ酸）ナノ粒子、両親媒性多糖ナノ粒子またはポリイオンナノ粒子を、本明細書において開示される組成物において使用できる（Ａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ． ２４７： ３１－６４， ２０１２を参照のこと）。
ポリマーは、単独で、物理的混合物として、またはコポリマーを形成することによって使用できる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ブロック－ポリ（Ｌ－ヒスチジン）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ－ＰＬＨ－ＰＥＧ）トリブロックコポリマー、ＰＬＧＡ－ＰＥＧジブロックコポリマーおよびＰＬＡの混合物によって形成される。これらのコポリマーは、標準技術を使用して合成され得る。例えば、コポリマーＰＬＧＡ－ＰＬＨ－ＰＥＧは、ブロックエンドグラフティング戦略を使用して合成され得る。線形構造（例えば、ＰＬＧＡ－ＰＬＨ－ＰＥＧ）は、ナノ粒子に、循環の延長および電荷媒介性標的化と適合するいくつかの特徴を提供し得る。
いくつかの実施形態では、天然ポリマーを使用できる。天然ポリマーの例として、アルギネートおよびその他の多糖、コラーゲン、アルブミンおよびその他の親水性タンパク質、ゼインおよびその他のプロラミンおよび疎水性タンパク質、それらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。一般に、これらの材料は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける酵素的加水分解または水への曝露のいずれかによって、表面またはバルク侵食によって分解する。
その他の適した生分解性ポリマーとして、これらに限定されないが、ポリ（ヒドロキシ酸）、例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマーおよびコポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）およびポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）が挙げられる。
ポリマーは、親水性または疎水性である生体接着性ポリマーであり得る。親水性ポリマーとして、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）（Ｎｏｖｅｏｎによって製造された、高分子量、架橋、アクリル酸ベースのポリマー）、ポリカルボフィル、セルロースエステルおよびデキストランが挙げられる。
これらのポリマーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ、Ｐａ．、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．、Ｆｌｕｋａ、Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、Ｎ．Ｙ．およびＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆなどの供給源から得ることができる、またはこれらもしくはその他の供給業者から得られたモノマーから標準技術を使用して合成できる。
さまざまなポリマーおよびそれからポリマーマトリクスを形成する方法は、従来公知である。一般に、ポリマーマトリクスは、１種または複数のポリマーを含む。ポリマーは、天然または非天然（合成）ポリマーであり得る。ポリマーは、２つまたはそれより多くのモノマーを含むホモポリマーまたはコポリマーであり得る。配列の点で、コポリマーは、ランダム、ブロックであってもよく、またはランダムおよびブロック配列の組合せを含む。通常、本発明に従うポリマーは、有機ポリマーである。
本明細書に記載される組成物において使用するのに適したポリマーの例として、これらに限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート（例えば、ポリ（１，３－ジオキサン－２オン））、ポリ無水物（例えば、ポリ（セバシン酸無水物））、ポリプロピルフマレート、ポリアミド（例えば、ポリカプロラクタム）、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ（－ヒドロキシアルカノエート）））、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリウレア、ポリスチレンおよびポリアミン、ポリリジン、ポリリジン－ＰＥＧコポリマーおよびポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンイミン）－ＰＥＧコポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明に従うポリマーとして、これらに限定されないが、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３－ジオキサン－２オン））；ポリ無水物（例えば、ポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）；ポリウレタン；ポリメタクリレート；ポリアクリレート；およびポリシアノアクリレートを含む、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１７７．２６００のもと、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によってヒトにおける使用のために承認されているポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、親水性であり得る。例えば、ポリマーは、アニオン基（例えば、リン酸基、硫酸基、カルボン酸基）、カチオン基（例えば、第四級アミン基）または極性基（例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミン基）を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは疎水性であり得る。ポリマーの親水性または疎水性の選択は、合成ナノ粒子内に組み込まれる（例えば、カップリングされる）材料の性質に影響を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリマーを、１つもしくは複数の部分および／または官能基を用いて修飾できる。本発明に従って、種々の部分または官能基を使用できる。いくつかの実施形態では、ポリマーを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、炭水化物を用いて、および／または多糖由来の非環式ポリアセタールを用いて修飾できる（Ｐａｐｉｓｏｖ， ２００１， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， ７８６：３０１）。特定の実施形態は、Ｇｒｅｆらの米国特許第５，５４３，１５８号またはＶｏｎ Ａｎｄｒｉａｎらによる国際公開公報ＷＯ２００９／０５１８３７の一般的な教示を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、ポリマーを、脂質または脂肪酸基を用いて修飾できる。いくつかの実施形態では、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸またはリグノセリン酸のうち１種または複数であり得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファリノール酸、ガンマリノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはエルカ酸のうち１種または複数であり得る。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、乳酸およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えば、本明細書において「ＰＬＧＡ」とまとめて呼ばれる、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）およびポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）ならびに「ＰＧＡ」と本明細書において呼ばれるグリコール酸単位ならびに本明細書において「ＰＬＡ」とまとめて呼ばれる乳酸単位、例えば、ポリ－Ｌ－乳酸、ポリ－Ｄ－乳酸、ポリ－Ｄ，Ｌ－乳酸、ポリ－Ｌ－ラクチド、ポリ－Ｄ－ラクチドおよびポリ－Ｄ，Ｌ－ラクチドを含むホモポリマーを含むポリエステルであり得る。いくつかの実施形態では、例示的ポリエステルとして、例えば、ポリヒドロキシ酸、ＰＥＧコポリマーならびにラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ＰＬＡ－ＰＥＧコポリマー、ＰＧＡ－ＰＥＧコポリマー、ＰＬＧＡ－ＰＥＧコポリマーおよびそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリエステルとして、例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）－ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、ポリ［ａ－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］およびそれらの誘導体が挙げられる。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸：グリコール酸比を変更することによって調整できる。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用されるべきＰＬＧＡは、およそ８５：１５、およそ７５：２５、およそ６０：４０、およそ５０：５０、およそ４０：６０、およそ２５：７５またはおよそ１５：８５の乳酸：グリコール酸比を特徴とする。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、１種または複数のアクリルポリマーであり得る。特定の実施形態では、アクリルポリマーとして、例えば、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸無水物）、メチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）コポリマー、ポリアクリルアミド、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、グリシジルメタクリレートコポリマー、ポリシアノアクリレートおよび前記のポリマーのうち１種または複数を含む組合せが挙げられる。アクリルポリマーは、低含量の第四級アンモニウム基を有するアクリルおよびメタクリル酸エステルの十分に重合されたコポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、カチオンポリマーであり得る。一般に、カチオンポリマーは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはその誘導体）の負に荷電した鎖を縮合および／または保護できる。アミンを含有するポリマー、例えば、ポリ（リジン）（Ｚａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ．， ３０：９７； ａｎｄ Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ６：７）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ； Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， １９９５， ９２：７２９７）およびポリ（アミドアミン）デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ－Ｌａｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９３：４８９７；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ７：７０３； ａｎｄ Ｈａｅｎｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９３， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ４：３７２）は、生理学的ｐＨで正に荷電し、核酸とともにイオン対を形成し、種々の細胞系においてトランスフェクションを媒介する。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、カチオン側鎖を有する分解可能なポリエステルであり得る（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３２：３６５８；Ｂａｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ， １９９３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １１５： １１０１０；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２２：３２５０；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２１：５６３３およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２３：３３９９）。これらのポリエステルの例として、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）（Ｂａｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ， １９９３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １１５： １１０１０）、ポリ（セリンエステル）（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２３：３３９９）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３２：３６５８；およびＬｉｍ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２１ ：５６３３）ならびにポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３２：３６５８；およびＬｉｍ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２１ ：５６３３）が挙げられる。
これらのおよびその他のポリマーの特性ならびにそれらを調製する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，１２３，７２７号、同５，８０４，１７８号、同５，７７０，４１７号、同５，７３６，３７２号、同５，７１６，４０４号、同６，０９５，１４８号、同５，８３７，７５２号、同５，９０２，５９９号、同５，６９６，１７５号、同５，５１４，３７８号、同５，５１２，６００号、同５，３９９，６６５号、同５，０１９，３７９号、同５，０１０，１６７号、同４，８０６，６２１号、同４，６３８，０４５号および同４，９４６，９２９号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００１， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２３：９４８０；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ， ２００１， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２３：２４６０； Ｌａｎｇｅｒ， ２０００， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ３３：９４；Ｌａｎｇｅｒ， １９９９， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ， ６２：７；およびＵｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ９９：３１８１を参照のこと）。より一般的には、特定の適したポリマーを合成するための種々の方法は、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔｓ， Ｅｄ． ｂｙ Ｇｏｅｔｈａｌｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８０；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｏｄｉａｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００４；Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ａｌｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ， １９８１；Ｄｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ， ３９０：３８６に、ならびに米国特許第６，５０６，５７７号、同６，６３２，９２２号、同６，６８６，４４６号および同６，８１８，７３２号に記載されている。前記のものの各々は、その全文で参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、線形または分岐ポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、デンドリマーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、互いに実質的に架橋され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、架橋を実質的に含まないものであり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーを、架橋ステップを起こすことなく本発明に従って使用できる。本発明の合成ナノ粒子は、前記のもののいずれかおよびその他のポリマーのブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ブレンド、混合物および／または付加物を含み得るということはさらに理解されるべきである。当業者ならば、本明細書において列挙されたポリマーは、本発明に従って使用できる例示的であるが包括的ではないポリマーの一覧を表すことを認識していると予想される。
いくつかの実施形態では、合成ナノ粒子は、必要に応じて１種または複数の両親媒性実体を含み得る。いくつかの実施形態では、両親媒性実体は、安定性が増大した、均一性が改善された、または粘性が増大した合成ナノ粒子の製造を促進し得る。いくつかの実施形態では、両親媒性実体は、脂質膜（例えば、脂質二重層、脂質単層など）の内表面と会合している場合がある。当技術分野で公知の多数の両親媒性実体が、本発明に従う合成ナノ粒子の製造において使用するのに適している。このような両親媒性実体として、これらに限定されないが、ホスホグリセリド、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレイルオキシプロピルトリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールスクシネート、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ヘキサンデカノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの脂肪アルコール、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、表面活性脂肪酸、例えば、パルミチン酸またはオレイン酸、脂肪酸、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、脂肪酸アミド、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）グリココレート、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ポリソルベート６５（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリソルベート８５（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）、ポリオキシエチレンモノステアレート、サーファクチン、ポロキサマー、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ソルビタントリオレエート、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル－アミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、チロキサポール、ポリ（エチレングリコール）５０００－ホスファチジルエタノールアミン、ポリ（エチレングリコール）４００－モノステアレート、リン脂質、高い界面活性剤特性を有する合成および／または天然洗浄剤、デオキシコレート、シクロデキストリン、カオトロピック塩、イオン対合剤およびそれらの組合せが挙げられる。両親媒性実体構成成分は、種々の両親媒性実体の混合物であり得る。当業者ならば、これは、例示的であるが包括的ではない界面活性剤活性を有する物質の一覧であることを認識すると予想される。任意の両親媒性実体を、本発明に従って使用されるべき合成ナノ粒子の製造において使用できる。
いくつかの実施形態では、合成ナノ粒子は、必要に応じて１種または複数の炭水化物を含み得る。炭水化物は、天然であっても、合成であってもよい。炭水化物は、誘導体化された天然炭水化物であり得る。特定の実施形態では、炭水化物は、これらに限定されないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、リボース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セルビオース、マンノース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン（ｇａｌａｔｏｓａｍｉｎｅ）およびノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｃ ａｃｉｄ）を含む単糖または二糖を含む。特定の実施形態では、炭水化物は、これらに限定されないが、プルラン、セルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシセルロース（ＨＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン、グリコン（ｇｌｙｃｏｎ）、アミロース、キトサン、Ν，Ο－カルボキシルメチルキトサン、アルギン（ａｌｇｉｎ）およびアルギン酸、デンプン、キチン、イヌリン、コンミャク、グルコマンナン、プスツラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードランおよびキサンタンを含む多糖である。実施形態では、本発明の合成ナノ粒子は、炭水化物、例えば、多糖を含まない（または具体的に排除する）。特定の実施形態では、炭水化物は、炭水化物誘導体、例えば、これらに限定されないがマンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトールおよびラクチトールを含む糖アルコールを含み得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６に示される配列を含むペプチド（例えば、配列番号１３）を含む。特定の例では、本明細書において開示されるナノ粒子を、以下に記載される別の療法（例えば、ＡＰＣベースの療法、ＣＴＬベースの療法、ペプチドワクチン療法）と組み合わせて投与できる。いくつかの例では、本明細書において開示されるナノ粒子を、ヒト被験体に、免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体）、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）および／またはレナリドミドと組み合わせて投与できる。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースの免疫療法
被験体において免疫応答を誘導するためのｅｘ ｖｉｖｏ戦略は、被験体から得られた適した抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球またはマクロファージ）を、本明細書において記載されるペプチドのいずれかと接触させることを含み得る。あるいは、細胞をペプチドのうち１種または複数をコードする核酸（例えば、発現ベクター）を用いてトランスフェクトし、必要に応じて、一定期間、ペプチドの発現を可能にする条件下で培養できる。トランスフェクション法は、細胞の種類および細胞にトランスフェクトされている核酸に応じて変わる。接触させ、トランスフェクションした後、細胞を被験体に戻す。
細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を発現する様々な種類のいずれかであり得る。例えば、細胞は、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）またはＢ細胞を含み得る。
したがって、本開示は、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）を含む組成物を提供し、ＡＰＣは、その表面にペプチド配列を提示し、ペプチド配列は、ＢＣＭＡ抗原（配列番号１８）およびＴＡＣＩ抗原（配列番号１９）の一方または両方の少なくとも１種の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣペプチドエピトープは、ＭＨＣクラスＩペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２４ペプチドエピトープ）である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、ペプチド配列を含む合成ペプチドへの曝露によってｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチド配列を獲得する。
ｅｘ ｖｉｖｏ法のいずれかのいくつかの実施形態では、被験体から、またはこの被験体以外の同一種の（同種異系の）被験体から得られる細胞を、試薬（または免疫原性／抗原性組成物）と接触させ、被験体に投与することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９個のＡＰＣ（例えば、樹状細胞）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０個未満のＡＰＣ（例えば、樹状細胞）を含む。
ａ．抗原提示細胞の調製
被験体（例えば、多発性骨髄腫患者）への投与に適した抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞（ＤＣ）を、このような細胞が見られる任意の組織から単離できる、もしくは得ることができる、またはそうでなければ培養し、提供できる。ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）は、例として、哺乳動物の骨髄または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、哺乳動物の脾臓において、または哺乳動物の皮膚において見ることができる（すなわち、ＤＣのものと同様の特定の品質を有するランゲルハンス細胞は、皮膚において見ることができる）。例えば、骨髄を哺乳動物から回収し、ＤＣの成長を促進する培地で培養できる。この培地に、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４および／またはその他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α）、増殖因子および補充物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）が含まれてもよい。適当なサイトカインを含有する培地中で適した時間量（例えば、ＤＣを拡大増殖させ、成熟ＤＣに分化させるのに適した、例えば、４、６、８、１０、１２または１４日）培養した後、ＤＣのクラスターを、目的の抗原の存在下で（例えば、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの１種もしくは複数のペプチドエピトープまたは配列番号１３～１７の少なくとも２種のペプチドの組合せの存在下で）培養し、標準技術を使用してがんワクチンにおいて使用するために回収する。抗原（例えば、単離されたまたは精製されたペプチド、または合成ペプチド）を培養物に、抗原あたり１μｇ／ｍｌ～５０μｇ／ｍｌの濃度、例えば、抗原あたり２、５、１０、２０、３０または４０μｇ／ｍｌで添加できる。
いくつかの実施形態では、被験体（例えば、ヒト）からＡＰＣを単離する。白血球アフェレーシス（例えば、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａアフェレーシスシステムを使用する）を使用して血液から単核細胞を単離する。組織培養フラスコにおいて、３７℃で２時間インキュベートすることによって単核細胞が接着するようになることを可能にする。洗浄によって非接着細胞を除去する。接着細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（８００ユニット／ｍｌ、臨床等級、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）（５００ユニット／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を追加補充した培地で５日間培養する。５日目に、ＴＮＦ－αをさらに３～４日間培養培地に添加する。８または９日目に、細胞を回収し、洗浄し、組織ローテーター上でペプチド抗原とともに１６～２０時間インキュベートする。ペプチド抗原は、培養物に約１０μｇ／ｍｌ（抗原あたり）の濃度で添加する。
当業者によって認識されるように、種々のその他の方法を使用してＡＰＣを単離できる。ＤＣは、それらが存在するすべての組織において少数で生じる、このため、ＤＣの単離および濃縮が必要となる。反復密度勾配分離、蛍光活性化細胞選別技術、陽性選択、陰性選択またはそれらの組合せを必要とするいくつかの手順のいずれも、単離されたＤＣの濃縮集団を得るために日常的に使用される。ＤＣを単離するためのこのような方法に関するガイダンスは、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７８： １０６７－１０７８， １９９３；Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７１： １３１５－１３３２， １９９０；Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ５７： ７６９８－７７０２， １９９０；Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６７： ２８５－２８９， １９８９；Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ ａｎｄ Ｅｎｇｌｅｍａｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８５： ９５５－９６１， １９９０；Ｍｅｈｔａ－Ｄａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５３： ９９６－１００３， １９９４；およびＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１： ６８４０－６８５２， １９９３に見ることができる。ヒト末梢血からＤＣを単離するための１つの方法は、米国特許第５，６４３，７８６号に記載されている。
本明細書に記載される方法に従って調製された樹状細胞は、抗原に対応するエピトープを腫瘍溶解物（例えば、神経腫瘍溶解物）に曝露された樹状細胞上に存在するエピトープよりも高い平均密度で提示する。抗原提示細胞上の１種または複数の抗原の相対密度は、間接的および直接的両方の手段によって決定できる。ナイーブ動物の一次免疫応答は、抗原提示細胞の抗原密度にだいたい比例する（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７０： １８２２－１８２９， ２００３）。したがって、抗原提示細胞の２つの集団間の相対抗原密度は、動物を各集団を用いて免疫化し、ＢまたはＴ細胞を単離することおよび例えば、四量体アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴまたは定量的ＰＣＲによって特異的抗原に対する特異的免疫応答をモニタリングすることによって推定できる。
相対抗原密度はまた、直接的に測定できる。１つの方法では、抗原提示細胞を、ＭＨＣ－抗原複合体と特異的に結合する抗体を用いて染色し、次いで、各細胞との抗体結合の相対量を決定するために細胞を解析する（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０２： ４８２４－４８２９， ２００５を参照のこと）。抗体結合を解析するための例示的方法として、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別が挙げられる。解析の結果は、例えば、個々のＭＨＣ－抗原複合体についての染色について陽性である細胞の割合または細胞あたりの染色の平均相対量として報告され得る。いくつかの実施形態では、細胞あたりの染色の相対量のヒストグラムが作製され得る。
いくつかの実施形態では、抗原密度は、例えば、質量分析によるＭＨＣと結合しているペプチドの直接解析によって直接的に測定できる（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ３： １９３－２０８， ２００４を参照のこと）。通常、ＭＨＣと結合しているペプチドは、いくつかの方法のうち１種によって単離する。１つの方法では、しばしば小型ペプチドについて濃縮するための限外濾過後に、抗原提示細胞の細胞溶解物を解析する（例えば、Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７４： ４２５－４３４， １９９１； Ｒｏｔｚｘｈｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８： ２５２－２５４， １９９０を参照のこと）。別の方法では、ＭＨＣと結合しているペプチドを、例えば、酸性溶出によって細胞表面から直接的に単離する（例えば、Ｓｔｏｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， １４： ９４－１０３， １９９３； Ｓｔｏｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１： ３７１９－２７， １９９３を参照のこと）。別の方法では、ＭＨＣ－ペプチド複合体を、抗原提示細胞溶解物から免疫アフィニティー精製し、次いで、ＭＨＣと結合しているペプチドを酸処理によって溶出する（例えば、Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５１： ２９０－２９６を参照のこと）。ＭＨＣと結合しているペプチドの単離後、ペプチドを、しばしば分離ステップ（例えば、液体クロマトグラフィー、キャピラリーゲル電気泳動または二次元ゲル電気泳動）後に質量分析によって解析する。個々のペプチド抗原を、質量分析を使用して同定および定量化し、抗原提示細胞の集団中の各抗原の相対平均割合を決定できる。いくつかの方法では、抗原提示細胞の２つの集団中のペプチドの相対量を、１つの集団の安定なアイソトープ標識と、それに続く質量分析を使用して比較する（Ｌｅｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２２： ４５０－４５４， ２００４を参照のこと）。
ｂ．抗原提示細胞の投与
ＡＰＣベースのがんワクチンは、注射、注入、接種、直接外科的送達またはそれらの任意の組合せを含み得る任意の適した送達経路によって患者または試験動物に送達してもよい。いくつかの実施形態では、がんワクチンを三角筋領域または腋窩領域においてヒトに投与する。例えば、ワクチンを腋窩領域中に皮内注射として投与する。いくつかの実施形態では、ワクチンを静脈内に投与する。
細胞を投与するための適当な担体は、慣用的な技術によって当業者によって選択され得る。例えば、薬学的担体は、緩衝食塩水溶液、例えば、細胞培養培地であってもよく、細胞生存度を保存するためのＤＭＳＯを含み得る。
本発明の方法を達成するためにがんワクチンとして患者に投与するのに適当なＡＰＣの量およびこのような投与の最も好都合な経路は、ワクチン自体の製剤化と同様に種々の因子に基づいたものであり得る。これらの因子の一部として、患者の身体的特徴（例えば、年齢、体重および性別）、腫瘍の物理的特徴（例えば、位置、大きさ、成長の速度および到達可能性）およびその他の治療方法論（例えば、化学療法およびビーム照射療法）が、処置レジメン全体と関連して実施されている程度が挙げられる。疾患状態を処置するために本発明の方法を実施することにおいて考慮すべき種々の因子にもかかわらず、哺乳動物は、単回投与で約０．０５ｍＬ～約２ｍＬの溶液（例えば、生理食塩水）中で約１０５～約１０８個のＡＰＣ（例えば、１０７個のＡＰＣ）を用いて投与され得る。上記のおよびその他の因子、例えば、腫瘍病理の重症度に応じて、さらなる投与を実施できる。一実施形態では、約１０６個のＡＰＣの約１～約５回の投与が２週間間隔で実施される。
ＤＣワクチン接種に、その他の処置が付随する場合がある。例えば、ＤＣワクチン接種を受けている患者はまた、化学療法、照射および／または外科的療法を同時に受けている場合がある。化学療法とともにＤＣワクチン接種を使用してがんを処置する方法は、Ｗｈｅｅｌｅｒら、米国特許公開第２００７／００２０２９７号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＣワクチン接種を受けている患者は、がんのための化学療法、照射および／または外科的処置を既に受けていた。一実施形態では、ＹｕおよびＡｋａｓａｋｉ、ＷＯ２００５／０３７９９５に記載されるように、ＤＣワクチン接種を受けている患者は、ＣＯＸ－２阻害剤を用いて処置される。
Ｔ細胞ベースの免疫療法
免疫応答を刺激するためのｅｘ ｖｉｖｏ法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞（例えば、被験体から得られたリンパ球の集団中の）を、本明細書において記載されるペプチドのうち１種と結合しているＭＨＣ分子を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）を活性化するのに十分である時間量の間（かつ条件下で）接触させることを含み得る。したがって、本開示は、ＢＣＭＡ特異的および／またはＴＡＣＩ特異的Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）を作製する、および／または増殖させる方法を提供する。本方法は、１種または複数のＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）を、１種または複数の、本明細書において記載されるようなペプチドをパルスした抗原提示細胞と接触させることを含む。これらのＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、例えば、メモリー細胞傷害性Ｔ細胞、エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞であり得る。
活性化Ｔ細胞を使用して、標的細胞を死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本方法は、標的細胞を、１種または複数のＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含み、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現または過剰発現し、ＨＬＡ－Ａを発現する。いくつかの実施形態では、方法は、標的細胞を、１種または複数のＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞と接触させることを含み、標的細胞は、ＴＡＣＩを発現または過剰発現し、ＨＬＡ－Ａを発現する。
いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ特異的Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）を、本明細書において開示されるペプチド（例えば、配列番号１３～１７のうち１つまたは複数）、ＢＣＭＡ（例えば、配列番号１３または１４）またはＴＡＣＩ（配列番号１６）ペプチドを提示するＡＰＣ、レナリドミド、免疫調節剤、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）または免疫アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ）と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ特異的ＣＴＬＴ細胞とともに投与される追加の治療剤は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１５４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＯＸ４０、ＣＤ２０、ＥＧＦＲまたはＣＤ３１９と特異的に結合する抗体（例えば、ヒト抗体）である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、免疫アゴニスト、例えば、抗ＯＸ４０または抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて投与する。
活性化Ｔ細胞をまた、細胞が得られた被験体に再導入できる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を、この被験体以外の同一種の（同種異系の）被験体から得ることができ、試薬（または免疫原性／抗原性組成物）と接触させ、この被験体に投与することができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、患者由来末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導に由来する。以下のプロトコールを使用して、抗原特異的ＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで患者由来ＰＢＭＣから製造できる。樹状細胞を作製するために、ＰＢＭＣから得たプラスチック接着細胞を、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦおよび組換えヒトＩＬ－４を追加補充したＡＩＭ－Ｖ培地で加湿ＣＯ２（５％）インキュベーター中３７℃で培養する。６日後、培養物中の未熟樹状細胞を、成熟のために組換えヒトＴＮＦ－αを用いて刺激する。次いで、８日目に成熟樹状細胞を回収し、ＰＢＳに、ペプチド（２μｇ／ｍＬ）とともに１ｍＬあたり１×１０６個で再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートする。自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．）を使用してＰＢＭＣから濃縮する。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ウェルあたり２×１０６個）を、２４ウェル組織培養プレートの各ウェルにおいて、２ｍＬ／ウェルの、５％ヒトＡＢ血清および１０ユニット／ｍＬのｒｈＩＬ－７（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を追加補充したＡＩＭ－Ｖ培地中でウェルあたり２×１０５のペプチドがパルスされた樹状細胞と同時培養する。各再刺激の２日後、一定間隔で２４時間後に約２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加する。７日目に、５％ヒトＡＢ血清、ｒｈＩＬ－２およびｒｈＩＬ－７（各１０ユニット／ｍＬ）を追加補充したＡＩＭ－Ｖ培地中でリンパ球をペプチドをパルスした自己樹状細胞を用いて再刺激する。各再刺激の２日後、一定間隔で２４時間後に約２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加する。３ラウンドの再刺激後、７日目に、細胞を回収し、ＣＴＬの活性を試験する。刺激されたＣＤ８＋培養細胞（ＣＴＬ）を、２μｇ／ｍｌ Ｈｅｒ－２、ｇｐ１００、ＡＩＭ－２、ＭＡＧＥ－１またはＩＬ１３受容体α２ペプチドを用いてパルスしたＴ２細胞（ヒトＴＡＰ欠損細胞系）とともに同時培養する。２４時間インキュベートした後、培地中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞ベースの免疫療法
本開示は、がんを処置するためのキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入のための方法をさらに提供する。ＣＡＲ修飾されたＴ細胞を、任意の腫瘍関連抗原（例えば、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩ）を実質的に標的化するように操作できる。普通、Ｔ細胞を、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられたＣＡＲを発現するように遺伝子操作し、次いで、患者に、注入して戻す。
ＣＡＲの一般的な形態は、ＣＤ３－ゼータ膜貫通およびエンドドメインに融合された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。ｓｃＦＶは、Ｔ細胞（例えば、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞またはＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞）の抗原特異的受容体または抗原と特異的に結合する抗体から導くことができる。
いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞またはＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞中のＴ細胞受容体の配列を、例えば、配列決定によって決定する。ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＴＡＣＩ特異的細胞傷害性Ｔ細胞中のＴ細胞受容体の配列を使用して、ＣＡＲを作製できる。
いくつかの実施形態では、これらのＴ細胞を患者から集める。いくつかの実施形態では、これらのＴ細胞を誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得る。
レトロウイルス、レンチウイルスまたはトランスポゾンなどのウイルスベクターを使用して、導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）を宿主細胞ゲノムに組み込むことが多い。あるいは、プラスミドまたはｍＲＮＡなどの非組込みベクターを使用して、ＣＡＲ遺伝子をＴ細胞に移入し、Ｔ細胞を適当な条件下でＣＡＲを発現するようにすることができる。
誘導多能性幹細胞アプローチ
腫瘍特異的抗原を標的化する、多数のｅｘ ｖｉｖｏ拡大増殖された活性化抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の投与を用いる養子Ｔ細胞療法は、選択された悪性疾患において耐久性のある寛解を誘導してきた。ＭＨＣ分子とのペプチド複合体としてすでにプロセシングされ、提示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ． ２００６）細胞内抗原を主に認識するＴＣＲを利用することは、腫瘍選択性をさらに増強し得るが、外因性ＴＣＲ遺伝子の導入は、移入された、ならびに内因性αおよびβ鎖のミスマッチをもたらし、重篤な自己免疫有害事象をもたらし得る（Ｂｅｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０， Ｈｉｎｒｉｃｈｓ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。対照的に、ＣＡＲ－Ｔは、ＭＨＣに拘束されない様式で細胞表面上で発現された抗原を認識する。今日までに、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９を標的化する最も成功したＣＡＲ－Ｔ療法は、再発および化学療法抵抗性Ｂ細胞悪性疾患を有する患者において微小残存病変陰性完全奏効を達成している（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１０， Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。それにもかかわらず、サイトカイン放出症候群を含む有害効果を最小化し、応答の耐久性を改善するように進行中の努力が向けられている（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１２， Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。重要なことに、ＴＣＲベースのまたはＣＡＲベースの療法のために使用される長期拡大増殖の間継続的に腫瘍抗原に曝露されたＣＴＬは、その増殖能を失い（「疲弊する」）、最終分化に伴いその機能活性を失う場合がある。
これらの制限を克服するために、現在開発されている技術は、「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」からの十分に若返らされたＣＴＬの利用である。これらのｉＰＳＣは、規定の転写因子の組の異所発現の際に成体体細胞に由来する特別な種類の多能性細胞である。重要なことに、腫瘍抗原特異的ＣＴＬは、抗原特異的ＣＴＬからのｉＰＳＣ技術によって再プログラミングできる（Ｖｉｚｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． ２０１３， Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。これらのｉＰＳＣ－ＣＴＬは、機能的に若返らされており、それが由来する元のＣＴＬよりも長いテロメア（１．５倍増大）およびより高い増殖能（５～５０倍増大）を実証する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。この強力な再プログラミング治療アプローチは、抗原特異的がん免疫療法の有効性および耐久性を著しく増大する可能性を有する。したがって、本開示は、細胞傷害性Ｔ細胞を若返らせる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、増殖能を少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍増大できる。
腫瘍特異的ＣＴＬの活性化は、多数のがん免疫療法の主な目的である。がん患者からの腫瘍特異的Ｔ細胞の単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ調製（活性化および拡大増殖）およびこれらのＴ細胞の患者への輸注は、Ｔ細胞を用いる適応免疫療法の基本的なステップである。ｉＰＳＣ技術を使用して、養子細胞移入免疫療法（ＡＣＴ）の有効性を改善できる。
ｉＰＳＣは、山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの組合せ）のレトロウイルストランスフェクションによって誘導された分化細胞（例えば、線維芽細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）から得ることができ、Ｆｌｔ－３リガンドおよびＩＬ－７に加えて単層ＯＰ９－ＤＬ１細胞系でそれを培養することによってＴ細胞系統へ分化される。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣをＴ細胞から作製できる。これらの細胞は、拡大増殖後、Ｔ細胞に再度分化される。ヒトＴリンパ球は、ｉＰＳＣ作製のための細胞供給源として働き得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、白血球アフェレーシスまたは静脈穿刺によって全血から分けることができ、次にＩＬ－２および抗ＣＤ３抗体を用いる刺激によってＣＤ３＋Ｔ細胞を拡大増殖することができる。Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳ）は、再プログラミング因子のレトロウイルス形質導入に曝露されると、活性化Ｔ細胞から作製できる。これらのＴ－ｉＰＳＣは、その元のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再配列を保存し、そのため、それらをがんＡＣＴ療法のための内因性腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を有する造血幹細胞の制限されない供給源として使用できる。
したがって、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞から作製する。これらの抗原特異的Ｔ細胞は、本明細書に記載されるような方法によって、例えば、１種または複数のＴ細胞を、１種または複数の、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１７）を含むペプチドをパルスした抗原提示細胞と接触させることによって作製する。Ｔ－ｉＰＳＣは、その元のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再配列を保存するので、これらのＴ－ｉＰＳＣがＴ細胞に分化した後、これらのＴ細胞は、がん細胞上のＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを認識できる。
いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを特異的に認識するＣＡＲをコードする核酸を、Ｔ－ｉＰＳＣに導入できる。これらのＴ－ｉＰＳＣがＴ細胞に分化した後、これらのＴ細胞は、がん細胞上のＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを認識できる。
いくつかの実施形態では、分化したＴ細胞を被験体に投与する。いくつかの実施形態では、Ｔ－ｉＰＳＣを被験体に投与し、次いで、これらの細胞が被験体の身体中で細胞傷害性Ｔ細胞に分化する。
被験体
被験体は、抗原に対して免疫応答が可能である任意の動物であり得る。用語「被験体」および「患者」は、本明細書を通じて同義的に使用され、本開示の方法に従う処置が提供される動物、ヒトまたは非ヒトを説明する。本発明によって獣医学的および非獣医学的適用が考慮される。ヒト患者は、成人ヒトまたは若年のヒト（例えば、１８歳の年齢未満のヒト）であり得る。ヒトに加えて、被験体は、これらに限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌおよび霊長類を含む。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ類、ブタ（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシおよびその他の飼育動物、家畜および動物園の動物が含まれる。
被験体は、がんを有するもの、がんを有すると疑われるもの、またはがんを発生するリスクにあるものであり得る。本明細書で使用される場合、用語「がん」とは、自律成長、すなわち、迅速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の能力を有する細胞を指す。この用語は、侵襲性の病理組織学的種類または段階に関わらず、すべての種類のがん性増殖または発がん性プロセス、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織もしくは臓器を含むものとする。用語「腫瘍」とは、本明細書で使用される場合、がん性細胞、例えば、がん性細胞の塊を指す。本明細書に記載される方法を使用して処置または診断され得るがんとして、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸および泌尿生殖器に影響を及ぼす種々の臓器系の悪性疾患ならびにほとんどの結腸がん、腎細胞癌腫、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性疾患を含む腺癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤は、被験体において癌腫を処置または診断するために設計される。用語「癌腫」は、技術分野で認識され、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳癌、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性疾患を指す。いくつかの実施形態では、がんは、腎癌腫または黒色腫である。例示的癌腫として、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成するものが挙げられる。この用語はまた、例えば、癌性および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、技術分野で認識され、間葉系派生物の悪性腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、被験体は、血液がん、例えば、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫を有する。
いくつかの実施形態では、被験体は、例えば、多発性骨髄腫、Ｂ細胞関連悪性疾患、形質細胞関連悪性疾患、前悪性疾患（例えば、ＭＭ、例えば、ＳＭＭまたはＭＧＵＳの前悪性疾患）を含む、ＢＣＭＡを発現する／過剰発現する疾患またはＴＡＣＩを発現する／過剰発現する疾患を有する。
いくつかの実施形態では、被験体は、形質細胞障害を有する、それを有すると疑われる、またはそれを発生するリスクにあるものであり得る。本明細書で使用される場合、用語「形質細胞障害」とは、クローン性形質細胞（ＰＣ）増殖およびパラプロテイン（例えば、モノクローナル免疫グロブリンおよび／または遊離軽鎖（ＦＬＣ））の過剰分泌を特徴とする疾患または障害の群を指す。
形質細胞障害の限定されない例として、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ）、単発性形質細胞腫（例えば、骨の単発性形質細胞腫または髄外形質細胞腫）、多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患単クローン性高ガンマグロブリン血症および皮膚変化症候群（ＰＯＥＭＳ）および重鎖病が挙げられる。その他の形質細胞障害として、例えば、腎意義の単クローン性高ガンマグロブリン血症（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ Ｒｅｎａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＲＳ）、ＭＧＵＳ関連神経障害およびその他の異常タンパク質性神経障害が挙げられる。
ＭＧＵＳ、くすぶり型ＭＭ（ＳＭＭ）および症候性ＭＭは、同一疾患のスペクトラムを表す。症候性または活性多発性骨髄腫は、任意のレベルの単クローン性タンパク質およびＣＲＡＢ基準（形質細胞クローンと関連すると思われる高カルシウム血症、腎不全、貧血または骨病変）のいずれかの形態の骨髄腫を決定づける（ｄｅｆｙｎｉｎｇ）事象からなる末端臓器損傷の存在または悪性疾患の新規バイオマーカーのいずれか（６０％と等しいまたはそれより多いクローン性形質細胞によるＢＭ関与；１００と等しいまたはそれを超える未関与のＦＬＣに対する関与のＦＬＣの割合および／またはＭＲＩでの２つ以上の骨病変の存在（Ｋｙｌｅ Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２３： ３－９ （２００９）； Ｒａｊｋｕｍａｒ Ｖ．Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， １５： １２， ２０１４）に加えて、クローン性形質細胞による１０％より多いＢＭ浸潤および／または生検によって証明された形質細胞腫を特徴とする。ＭＭは、骨髄（ＢＭ）の過度の浸潤および場合により、ＢＭ空間の内側または外側の悪性形質細胞の別個のクラスターとしての形質細胞腫の形成を特徴的に含む形質細胞悪性疾患である（Ｋｙｌｅ Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３５１： １８６０－７３ （２００４））。この疾患の結果は、多数であり、複数の臓器系が関与する。ＢＭおよび正常な形質細胞機能の破壊は、貧血、白血球減少症、低ガンマグロブリン血症および血小板減少症につながり、これは、さまざまに疲労、感染に対する感受性の増大、および一般的ではないが、出血への傾向の増大をもたらす。骨における疾患関与は、溶骨性病変を作出し、骨疼痛をもたらし、高カルシウム血症と関連し得る（Ｋｙｌｅ Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １１１： ２９６２－７２ （２００８））。
くすぶり型ＭＭ（ＳＭＭ）は、骨髄中に３０ｇ／Ｌもしくはそれより高い血清免疫グロブリン（Ｉｇ）ＧもしくはＩｇＡモノクローナルタンパク質および／または１０％もしくはそれより多い形質細胞を有するが、末端臓器損傷または悪性疾患を決定づける（ｄｅｆｙｎｙｉｎｇ）バイオマーカーの証拠がないことを特徴とする（Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ、２０１４）。ＳＭＭの自然経過の研究は、２種の異なる種類：進化性くすぶり型ＭＭおよび非進化性くすぶり型ＭＭがあることを示唆する（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２３（９）： １５４５－５６ （２００９））。進化性ＳＭＭは、Ｍタンパク質の進行性の増大および１．３年という活性多発性骨髄腫への無増悪期間（ＴＴＰ）のより短いメジアンを特徴とする。非進化性ＳＭＭは、３．９年のメジアンＴＴＰを有する活性多発性骨髄腫への進行の時間で急激に変化し得るより安定なＭタンパク質を有する。
意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）は、標準実験室血液検査の際に異常な免疫グロブリンタンパク質（パラプロテインとして公知）が血液中で見られる状態である。ＭＧＵＳは、多発性骨髄腫および同様の疾患と似ているが、抗体のレベルはより低く、骨髄中の形質細胞（抗体を分泌する白血球）の数は少なく、症状または大きな問題がない。
いくつかの実施形態では、被験体は、多発性骨髄腫、ＳＭＭまたはＭＧＵＳを有する。いくつかの実施形態では、被験体は、多発性骨髄腫からの寛解にあるものであり得る。いくつかの実施形態では、被験体は、前悪性疾患（例えば、ＭＭ、例えば、ＳＭＭまたはＭＧＵＳの前悪性疾患）を有する。
いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現または過剰発現するがんの種類を有し得る。したがって、本方法は、１種または複数のペプチド（または核酸）を被験体に投与する前に、被験体のがん（例えば、多発性骨髄腫）の１個または複数のがん細胞がＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現または過剰発現するか否かを決定するステップを含み得る。これらのタンパク質の発現は、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の両方を含む。細胞においてタンパク質およびｍＲＮＡ発現を検出する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、タンパク質を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンおよびドットブロッティング技術または免疫組織化学技術およびｍＲＮＡを検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）またはノーザンブロッティング技術を含む。いくつかの実施形態では、がん細胞におけるＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの発現の平均レベルは、正常な細胞（例えば、同一被験体における正常な組織細胞、同一被験体における正常な形質細胞または健常な被験体における組織細胞もしくは形質細胞）におけるＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの発現の平均レベルよりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高い。いくつかの実施形態では、がん細胞におけるＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの発現の平均レベルは、正常な細胞（例えば、同一被験体における正常な組織細胞、同一被験体における正常な形質細胞または健常な被験体における組織細胞もしくは形質細胞）におけるＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの発現の平均レベルよりも少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍高い。
被験体は、がん（例えば、多発性骨髄腫）を有し得る、有すると疑われ得る、または発生するリスクにあり得る。「がんを有すると疑われる」被験体は、がんの１つまたは複数の症状を有するものである。がんの症状は、当業者には周知であり、一般的に、制限するものではないが、疼痛、体重減少、脱力、過度の疲労、摂食困難、食欲喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、腹部膨満（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｆｕｌｌｎｅｓｓ）、鼓脹、腹腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ）、結腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、大量の発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、嚥下困難などを含む。多発性骨髄腫の症状として、具体的に、例えば、骨疼痛（例えば、背中または肋骨における）、血液中の高レベルのカルシウム、過度のかわきまたは排尿、便秘、悪心、食欲喪失、錯乱、脚の脱力またはしびれ、体重減少または反復感染を含む。
本明細書で使用される場合、「がんを発生するリスクにある」被験体は、がんを発生する素因、すなわち、がんを発生する遺伝的素因、例えば、腫瘍抑制遺伝子における変異（例えば、ＢＲＣＡｌ、ｐ５３、ＲＢまたはＡＰＣにおける変異）を有する、がんをもたらし得る条件に曝露されている、または条件によって現在影響を受けている被験体である。したがって、被験体はまた、被験体が変異原性または発がん性レベルの特定の化合物（例えば、タバコ煙中の発がん性化合物、例えば、アクロレイン、４－アミノビフェニル、芳香族アミン、ベンゼン、ベンゾ［ａ］アントラセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ホルムアルデヒド、ヒドラジン、ポロニウム－２１０（ラドン）、ウレタンまたは塩化ビニル）に曝露されている場合に「がんを発生するリスクにある」ものであり得る。被験体は、被験体が、例えば、高線量の紫外線またはＸ照射に曝露されている、または腫瘍を引き起こす／腫瘍と関連するウイルス、例えば、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスもしくはヒトＴ細胞白血病リンパ腫ウイルスに曝露される（例えば、感染する）場合に、「がんを発生するリスクに」あり得る。さらに、被験体は、被験体が炎症（例えば、慢性炎症）に罹患している場合に、「がんを発生するリスクに」あり得る。被験体は、例えば、被験体が意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を有する場合に多発性骨髄腫を発生するリスクにあり得る。したがって、「がんを有すると疑われる」または「がんを発生するリスクにある」被験体は、目的の種内のすべての被験体ではないということが理解される。
いくつかの実施形態では、本方法はまた、被験体ががんを有するか否かを決定するステップを含み得る。このような決定のための適した方法は、被験体において検出されるべきがんの種類に応じて変わるが、当技術分野で公知である。このような方法は、定性的または定量的であり得る。例えば、医療従事者は、被験体が、多発性骨髄腫の２種またはそれより多く（例えば、３、４、５または６種またはそれより多い）症状、例えば、本明細書に記載されるもののいずれかを示す場合に、多発性骨髄腫を有すると被験体を診断できる。被験体はまた、血液カルシウムレベル、白血球または赤血球細胞カウントまたは被験体の尿中のタンパク質の量を測定することによって多発性骨髄腫を有すると決定され得る。
ＭＨＣ分子多量体
本開示はまた、（ｉ）本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち１種または複数および（ｉｉ）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子多量体を含む組成物を特徴とする。多量体は、２つまたはそれより多く（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）のＭＨＣ分子全体またはＭＨＣ分子のペプチド結合領域を含有する。１つまたは複数のペプチドが、ＭＨＣ分子多量体と会合している（例えば、共有結合によって、または非共有結合によって結合している）場合がある。
多量体のＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ２分子）またはＭＨＣクラスＩＩ分子であり得る。ＭＨＣ分子は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒトまたは本明細書に記載される任意のその他の哺乳動物）ＭＨＣ分子であり得る。
多量体中の２つまたはそれより多くのＭＨＣ分子（またはＭＨＣ分子のペプチド結合領域）は、同一のＭＨＣ分子に由来するものであっても、異なるＭＨＣ分子に由来するものであってもよい。例えば、ＭＨＣ分子多量体は、５つのＭＨＣ分子を含有することができ、そのうち３つは、同一ＭＨＣ分子であり、そのうち２つは、最初の３つとは異なっている。別の例では、多量体の各ＭＨＣ分子は異なっている。ＭＨＣ分子の少なくとも１つは、ペプチドのうち少なくとも１つと結合し得る。
いくつかの実施形態では、上記の組成物は、本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１５またはそれより多い）を含有し得る。
組成物はまた、検出可能な標識と会合している場合がある。例えば、多量体のＭＨＣ分子のうち１つまたは複数は、検出可能な標識と共有結合によって、または非共有結合によって結合している場合がある。適した検出可能な標識（例えば、酵素、蛍光物質、発光物質、生体発光物質または放射性核種）ならびに検出可能な標識をペプチドまたはＭＨＣ分子とつなげる方法も提供される。
ＭＨＣ多量体組成物は、以下のように本明細書において記載されたペプチドを使用して作製できる：ＨＬＡ分子と結合するペプチドを、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２ミクログロブリンの存在下で再フォールディングして、三分子複合体を作製する。次いで、複合体を以前に重鎖に操作された部位で重鎖のカルボキシル末端でビオチン化する。次いで、ストレプトアビジンの添加によって多量体形成を誘導する。
Ｔ細胞受容体は、さまざまなその他のペプチド－ＭＨＣ複合体の中でも標的細胞上の特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識可能であるので、本明細書に記載されるＭＨＣ多量体組成物を使用して、例えば、無関係のＴ細胞の集団において抗原特異的Ｔ細胞を検出できる。このようなアッセイのために、多量体は、一般に検出可能に標識される。
例えば、免疫原への曝露後に抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するアッセイにおいて、多量体ＭＨＣ分子／ペプチド複合体を使用できる。ＭＨＣ多量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接的に可視化し（例えば、Ｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９： ２１０３－２１０６， １９９８； ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４： ９４－９６， １９９６を参照のこと）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を決定できる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ多量体を多量体化するために使用される検出可能に標識されたストレプトアビジンを使用して、多量体のＭＨＣ分子／ペプチド複合体と結合するＴ細胞を標識できる。これを行うために、多量体を用いて処理された細胞を、例えば、標識（例えば、ビオチンにコンジュゲートしているフルオロフォア）に曝露する。次いで、例えば、フローサイトメトリーを使用して細胞を容易に単離または検出できる。
本明細書に記載されるペプチド（およびその医薬組成物）、組成物を含有するＭＨＣ多量体、キットおよび製造品を、種々の方法で使用できる。例えば、ペプチドを使用して、（ｉ）被験体（例えば、がんを有する被験体）において免疫応答を誘導できる、（ｉｉ）培養においてＴ細胞を活性化できる、および／または（ｉｉｉ）多発性骨髄腫などのがんを処置もしくはイベント予防（ｅｖｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔ）できる。本明細書において記載されるように、組成物を含有するＭＨＣ多量体を使用して、例えば、無関係のＴ細胞集団において抗原特異的Ｔ細胞を検出できる。
被験体において抗体を製造する方法
免疫原（例えば、本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち１つまたは複数）に対して特異的な抗体を製造する方法は、当技術分野で公知である。例えば、本明細書において記載されたペプチドに対して特異的な抗体または抗体断片は、例えば、動物を使用する免疫化によって、またはファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって作製できる。本明細書において記載されたペプチドのすべてまたは一部を使用して、抗体または抗体断片を作製できる。
ペプチドを使用して、適した被験体、（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはヒトなどのその他の哺乳動物）をペプチドを用いて免疫化することによって抗体を調製できる。適当な免疫原性調製物は、例えば、本明細書に記載される組成物のいずれかを含有し得る。調製物は、アジュバント、例えば、フロイント完全または不完全アジュバント、ミョウバン、ＲＩＢＩまたは同様の免疫賦活剤をさらに含み得る。アジュバントとしてまた、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異体ＣＴ（ＭＣＴ）（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： １２０３－１２１０）および変異体Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＭＬＴ）（Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６４： ９７４－９７９）が挙げられる。ＭＣＴおよびＭＬＴは、親分子のものに対して、アジュバント活性を実質的に損なうことなく毒性を実質的に減少させる点変異を含有する。免疫原性ペプチド調製物（例えば、本明細書に記載される組成物のいずれか）を用いる適した被験体の免疫化は、ポリクローナル抗ペプチド抗体応答を誘導する。いくつかの実施形態では、ｔｏｌｌ様受容体－３リガンド（例えば、ポリＩＣＬＣ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を、被験体に投与して、例えば、免疫応答をブーストできる。
用語抗体とは、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、ペプチド（例えば、本明細書において記載されたペプチド）と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を指す。本明細書において記載されたペプチドと特異的に結合する抗体は、ペプチドと結合するが、試料中のその他の分子とは実質的に結合しない抗体である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例として、例えば、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片または本明細書に記載される任意のその他の抗体断片が挙げられる。
本明細書に記載される方法によって製造された単離された抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１～１７のいずれかのアミノ酸配列内の、またはそれと重複するエピトープと選択的に結合できる。抗体はまた、配列番号１～１７のいずれかのアミノ酸配列内の、またはそれと重複するエピトープと結合する抗体の結合を交差遮断するものであり得る。通常、抗体のエピトープとの結合は、抗体が１０－６Ｍ未満のＫＤで結合する場合に選択的と考えられる。必要に応じて、結合条件を変更することによって、選択的結合に実質的に影響を及ぼすことなく非特異的結合を低減できる。「交差遮断する」抗体または「交差遮断抗体」とは、エピトープ（例えば、配列番号１～１７のいずれか内に含有される、またはそれと重複するもの）に結合されると、第２の抗体の、ペプチドと結合する能力を低減する、または排除する（第２の抗体の、第１の抗体の非存在下で生じるペプチドとの結合に対して）第１の抗体を指す。本明細書に記載される方法によって製造される抗体（例えば、本明細書において記載されるペプチドのうち１種または複数に対して特異的な抗体）を使用して、例えば、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現するがん細胞を検出でき、したがって、本明細書に記載される多数の例示的方法において有用であるということが理解される。
免疫学的試験
ワクチン接種された被験体の抗原特異的細胞性免疫応答を、いくつかの異なるアッセイ、例えば、四量体アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴおよび定量的ＰＣＲによってモニタリングできる。これらの方法およびプロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
四量体アッセイを使用して、血液試料内の所与の抗原に対して特異的であるＴ細胞を検出および定量化できる。ペプチドと複合体形成された組換えＭＨＣ分子から構成される四量体を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の集団を同定できる。抗原に対して特異的なＴ細胞を検出するために、これらの抗原から得たペプチドを含有する、蛍光色素で標識された特異的ペプチド四量体複合体（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）－ｔＨＬＡ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）によって合成され、提供されている。特異的ＣＴＬクローンＣＤ８細胞を、１０５個細胞／５０μｌ ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝液および１％不活性化ＦＣＳ緩衝液）で再懸濁する。細胞を１μｌ ｔＨＬＡとともに室温で３０分間インキュベートし、インキュベーションを１０μｌの抗ＣＤ８ ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）とともに４℃で３０分間継続する。細胞を２ｍｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析する。
例えば、ワクチン接種された患者中の細胞が、抗原に応じてサイトカインを分泌するか否かを決定し、それによって、抗原特異的応答が誘発されているか否かを実証するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、サイトカイン分泌細胞を検出できる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキットは、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）から供給されており、製造業者の指示に記載されたように実施される。ワクチン接種の前後で得たレスポンダー（Ｒ）の１×１０５個の患者のＰＢＭＣ細胞を、捕獲Ａｂでコーティングされたニトロセルロース膜インサートを備えた９６ウェルプレートにプレーティングする。スティミュレーター（Ｓ）細胞（抗原がパルスされたＴＡＰ欠損Ｔ２細胞）を、１：１のＲ：Ｓ比で添加する。２４時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄することによって、細胞を除去する。検出Ａｂを各ウェルに添加する。プレートを４℃で一晩インキュベートし、洗浄ステップを反復する。ストレプトアビジン－ＡＰとともに２時間インキュベートした後、プレートを洗浄する。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ色素原のアリコート（１００μｌ）を各ウェルに添加して、スポットを発色させる。６０分後、水で洗浄することによって反応を停止する。コンピュータ支援画像解析（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）を用いて、スポットをスキャンし、カウントする。実験値が、両側ウィルコクソン順位和検定によって決定されるような非パルスＴ２細胞に対するスポットの平均数（バックグラウンド値）から有意に異なる場合には、実験値からバックグラウンド値を差し引く。
定量的ＰＣＲは、免疫応答を評価するための別の手段である。定量的ＰＣＲによって患者におけるＩＦＮ－γ産生を調べるために、患者のワクチン接種前およびワクチン接種後試料から得た低温保存ＰＢＭＣおよび自己樹状細胞を１０％患者血清を有するＲＰＭＩ ＤＣ培養培地中で解凍し、洗浄し、カウントする。ＰＢＭＣを、２４ウェルプレートにおいて２ｍｌの培地中３×１０６個ＰＢＭＣでプレーティングし、樹状細胞を１×１０６個／ｍｌでプレーティングし、２４ウェルプレート中の各ウェルにおいて２ｍｌ中の１０μｇ／ｍｌ腫瘍ペプチドを用いて２４時間パルスする。樹状細胞を集め、洗浄し、カウントし、１×１０６個／ｍｌに希釈し、ＰＢＭＣとともにウェルに３×１０５個（すなわち、３００μｌの溶液）（ＤＣ：ＰＢＭＣ＝１：１０）を添加する。３～４日毎に２．３μｌのＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）を添加し、培養の開始後１０日目から１３日目の間に細胞を回収する。次いで、回収した細胞を、腫瘍細胞または１０μｇ／ｍｌの腫瘍ペプチドでパルスした自己ＰＢＭＣを用いて、３７℃で４時間刺激する。１１～１３日目に、培養物を回収し、２回洗浄し、次いで、４つの異なるウェルにわけ、対照（標的を伴わない）のために使用する２つのウェルおよび別の２つのウェルのＣＴＬを、腫瘍細胞が入手可能である場合には腫瘍細胞とともに（１：１）同時培養する。腫瘍細胞が入手可能ではない場合には、ＣＴＬに１０μｇ／ｍｌの腫瘍溶解物を添加する。４時間刺激した後、細胞を集め、ＲＮＡを抽出し、サーモサイクラー／蛍光カメラシステムを用いてＩＦＮ－γおよびＣＤ８ ｍＲＮＡ発現を評価する。ＰＣＲ増幅効率は、自然対数進行をたどり、線形回帰解析によって、０．９９超の相関係数が実証される。実験的解析に基づいて、１サイクルの相違は、ｍＲＮＡ量で２倍の相違であると解釈され、ＣＤ８によって正規化されたＩＦＮ－γ量が決定される。ワクチン前ＩＦＮ－γに対するワクチン後における＞１．５倍の増大は、陽性Ｉ型ワクチン応答性の確立された標準である。
療法を選択する方法
がん（例えば、多発性骨髄腫などの形質細胞障害またはＢＣＭＡもしくはＴＡＣＩが発現もしくは過剰発現される任意のがん）を有する被験体のために療法を選択する方法は、必要に応じて、被験体の１個または複数のがん細胞が、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現または過剰発現するか否かを決定するステップ、ならびに１つまたは複数の細胞が、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを発現する場合には、被験体のための療法として、アミノ酸配列が、（ｉ）被験体において免疫応答を誘導可能である、（ｉｉ）ＭＨＣ分子と結合可能である、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によってＭＨＣ分子に関連して認識されることが可能であるという条件で、本明細書において記載されるような少なくとも１種のペプチド（配列番号１～１７のうち任意の１種のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１～１７に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一である、または配列番号１～１７のいずれかのアミノ酸配列の４つ以下の置換を有するアミノ酸配列を含むペプチド）を含有する組成物を選択するステップを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、被験体の１個または複数のがん細胞が、ＭＨＣ分子、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するか否かを決定するステップをさらに含む。
被験体のがんの１個または複数の細胞（例えば、形質細胞）が、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方を発現または過剰発現する場合に、適したペプチドの組合せを被験体に送達できるということが理解される。例えば、被験体のがんの１個または複数の細胞（例えば、形質細胞）が、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方を発現または過剰発現すると決定される場合には、療法を選択する方法は、被験体のための療法として、配列番号１～６および１３～１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１種のペプチドを含有する組成物および配列番号７～１２および１５～１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１種のペプチドを含有する組成物の組合せを選択することを含み得る。
１個または複数の細胞が、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩおよび／またはＭＨＣ分子を発現するか否かを決定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、被験体から得られた生体試料（例えば、血液試料またはリンパ節組織試料）を、本明細書に記載される方法によって作製されたＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩ特異的抗体を使用して試験して、細胞（または細胞溶解物）によって発現されたＢＣＭＡおよびＴＡＣＩポリペプチドの存在または量を検出できる。ポリペプチドの存在または量について生体試料をアッセイする方法として、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティングまたはドットブロッティングアッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかはまた、被験体から得た生体試料を提供するステップおよび／または被験体から生体試料を得るステップを含み得る。本明細書に記載される方法に適した生体試料として、目的の分析物タンパク質を含む、任意の生物学的流体、細胞、組織またはその画分が挙げられる。生体試料は、例えば、被験体から得られた検体であり得る、またはこのような被験体から導くことができる。例えば、試料は、生検によって得られた組織切片、または組織培養中に配置された、もしくは組織培養に適合された細胞であり得る。生体試料はまた、細胞を含有する生物学的流体、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液、涙、粘液または吸引液（例えば、肺または乳房乳頭吸引液）または紙もしくはポリマーの基材上に吸収されたこのような試料であり得る。生体試料は、必要に応じて、特定の細胞種を含有する画分にさらに分画できる。例えば、血液試料を、血清に、または特定の種類の血液細胞、例えば、赤血球または白血球（白血球細胞）を含有する画分に分画できる。必要に応じて、試料は、被験体から得た試料の種類の組合せ、例えば、組織および生物学的流体の組合せであり得る。
生体試料は、被験体、例えば、がん（例えば、多発性骨髄腫）を有する、それを有すると疑われる、またはそれを発生するリスクにある被験体から得ることができる。生体試料を得るための任意の適した方法を使用できるが、例示的方法として、例えば、静脈切開、スワブ（例えば、頬側スワブ）、吸引または細針吸引生検手順が挙げられる。細針吸引に感受性の組織の限定されない例として、リンパ節、肺、甲状腺、乳房および肝臓が挙げられる。試料はまた、例えば、顕微解剖（例えば、レーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）またはレーザー顕微解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、スメア（ＰＡＰスメア）または管洗浄によって集めることができる。
医療従事者はまた、がんを処置する１種もしくは複数の追加の治療剤または抗がん剤の副作用を処置するための１種もしくは複数の医薬を選択、処方および／または投与できる。多発性骨髄腫を処置するための適した化学療法剤として、例えば、メルファラン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、プレドニゾン、デキサメタゾン、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、サリドマイドまたはレナリドミドが挙げられる。抗がん剤の副作用として、例えば、貧血、胃腸症状（例えば、悪心、嘔吐、下痢）、白血球減少症（感染を引き起こし得る、白血球数の減少）、一時的な脱毛または血小板減少症（出血を引き起こし得る血小板数の減少）が挙げられる。したがって、医療従事者は、被験体に、ビンクリスチンなどの化学療法剤を、エポエチンアルファ（例えば、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）またはＥｐｏｇｅｎ（登録商標））などの抗貧血医薬とともに処方または投与できる。
核酸ワクチン
本開示は、本明細書において記載されるような１種または複数のポリペプチドをコードする、１種または複数のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド構築物を含む核酸ワクチン（ＮＡＶ）を提供する。例示的ポリヌクレオチドとして、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド構築物が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、ポリマーまたはリポソームナノキャリア（例えば、ナノ粒子）内で製剤化できる。
いくつかの実施形態では、アジュバントまたは免疫増強物質はまた、１種または複数のＮＡＶとともに、またはそれと組み合わせて投与できる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、共シグナルとして作用して、Ｔ細胞および／またはＢ細胞および／またはＮＫ細胞をプライムする。
ＮＡＶは、その結合価が変わり得る。結合価とは、ＮＡＶまたはＮＡＶポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド）またはポリペプチド中の抗原性構成成分の数を指す。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは、一価である。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは二価である。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは三価である。いくつかの実施形態では、ＮＡＶは、多価である。多価ワクチンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い抗原または抗原性部分（例えば、抗原性ペプチドなど）を含み得る。ＮＡＶの抗原性構成成分は、単一ポリヌクレオチド上である場合も、別個のポリヌクレオチド上である場合もある。
ＮＡＶは、治療剤または予防剤として使用できる。それらは、医薬において使用するために、および／または免疫エフェクター細胞のプライミング、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで刺激／トランスフェクトし、活性化細胞を再注入するために提供される。例えば、本明細書に記載されるＮＡＶは、被験体に投与でき、ｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチドが翻訳され、抗原を生成する。ヒトおよびその他の哺乳動物における疾患または状態の診断、処置または予防のための組成物、方法、キットおよび試薬が提供される。活性治療剤は、ＮＡＶ、ＮＡＶを含有する細胞または前記ＮＡＶ中に含有されるポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドを含み得る。
本明細書に記載されるＮＡＶのポリヌクレオチドを使用して細胞、組織または生物においてポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳を誘導する方法が、本明細書において提供される。このような翻訳は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養において、またはｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。細胞、組織または生物を、目的のポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）をコードする少なくとも１つの翻訳可能な領域を有するポリヌクレオチドを含有するＮＡＶを含有する有効量の組成物と接触させる。
ＮＡＶ組成物の「有効量」は、少なくとも幾分かは、標的組織、標的細胞種、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特徴（例えば、大きさおよび修飾されたヌクレオシドの程度）およびＮＡＶのその他の構成成分ならびにその他の決定因子に基づいて提供される。一般に、ＮＡＶ組成物の有効量は、好ましくは、同一抗原をコードする対応する未修飾のポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的な、細胞における抗原産生の機能として誘導された、またはブーストされた免疫応答を提供する。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクション（すなわち、ＮＡＶでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）の増大、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾されたポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の期間の増大によって実証されるような）または宿主細胞の先天性免疫応答の変更によって実証され得る。
本開示はまた、それを必要とする哺乳動物被験体においてポリペプチド抗原のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を誘導する方法を提供する。その中で、少なくとも１つの構造的または化学的修飾およびポリペプチドをコードする翻訳可能な領域（例えば、抗原または免疫原）を有するポリヌクレオチドを含有する有効量のＮＡＶ組成物を、本明細書に記載される送達方法を使用して被験体に投与する。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが細胞において翻訳されるような量およびその他の条件下で提供される。ポリヌクレオチドが局在している細胞または細胞が存在する組織を、１回または１回を超えるラウンドのＮＡＶ投与を用いて標的化できる。
本明細書に記載されるタンパク質を、細胞内、潜在的に、細胞質もしくは核などの特定のコンパートメント内での局在のために操作できる、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜へのトランスロケーションのために操作する。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、１つまたは複数の修飾を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）は、ヌクレオチド類似体／修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含有し得る。本発明に関連して骨格修飾は、本明細書において定義されるような核酸分子中に含有されるヌクレオチドの骨格のホスフェートが化学修飾される修飾である。本発明に関連して糖修飾とは、本明細書において定義されるような核酸分子のヌクレオチドの糖の化学修飾である。さらに、本発明に関連した塩基修飾とは、核酸分子の核酸分子のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この関連で、ヌクレオチド類似体または修飾は、転写および／または翻訳に適用可能であるヌクレオチド類似体から選択されることが好ましい。
核酸分子に組み込まれ得る修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを、糖部分において修飾できる。例えば、ＲＮＡ分子の２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾し、置き換えることができる。「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例として、これらに限定されないが、アルコキシまたはアリールオキシ（－ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン橋によって、同一リボース糖の４’炭素に接続される「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；およびアミノ基（－Ｏ－アミノ、ここで、アミノ基（例えば、ＮＲＲ）は、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）またはアミノアルコキシが挙げられる。
糖基はまた、リボース中の対応する炭素のものとは反対の立体化学的立体配置を有する１個または複数の炭素を含有し得る。したがって、修飾された核酸分子は、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
本明細書に記載されるような核酸分子（例えば、ＲＮＡ）中に組み込まれ得る修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドにおいて、ホスフェート骨格をさらに修飾できる。骨格のホスフェート基を、酸素原子のうち１個または複数を、異なる置換基で置き換えることによって修飾できる。さらに、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾ホスフェート部分の、本明細書に記載されるような修飾されたホスフェートでの完全な置き換えを含み得る。修飾されたホスフェート基の例として、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄によって置き換えられている。ホスフェートリンカーをまた、連結酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレン－ホスホネート）での置き換えによって修飾できる。
本明細書に記載されるような核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）に組み込まれ得る修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを、核酸塩基部分においてさらに修飾できる。ＲＮＡ中に見られる核酸塩基の例として、これらに限定されないが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルが挙げられる。例えば、本明細書に記載されるヌクレオシドおよびヌクレオチドを、主溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）面で化学修飾できる。いくつかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基またはハロ基を含み得る。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体／修飾は、例えば、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノプリン－リボシド－５’－トリホスフェート、２－アミノアデノシン－５’－トリホスフェート、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－トリホスフェート、２－チオシチジン－５’－トリホスフェート、２－チオウリジン－５’－トリホスフェート、２’－フルオロチミジン－５’－トリホスフェート、２’－Ｏ－メチルイノシン－５’－トリホスフェート４－チオウリジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルシチジン－５’－トリホスフェート、５－アミノアリルウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモウリジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－ヨードウリジン－５’－トリホスフェート、５－ヨード－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、５－メチルウリジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシシチジン－５’－トリホスフェート、５－プロピニル－２’－デオキシウリジン－５’－トリホスフェート、６－アザシチジン－５’－トリホスフェート、６－アザウリジン－５’－トリホスフェート、６－クロロプリンリボシド－５’－トリホスフェート、７－デアザアデノシン－５’－トリホスフェート、７－デアザグアノシン－５’－トリホスフェート、８－アザアデノシン－５’－トリホスフェート、８－アジドアデノシン－５’－トリホスフェート、ベンズイミダゾール－リボシド－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－トリホスフェート、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－トリホスフェート、シュードウリジン－５’－トリホスフェートまたはピューロマイシン－５’－トリホスフェート、キサントシン－５’－トリホスフェートから選択され得る塩基修飾から選択される。５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、７－デアザグアノシン－５’－トリホスフェート、５－ブロモシチジン－５’－トリホスフェートおよびシュードウリジン－５’－トリホスフェートからなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のヌクレオチドが特に好ましい。
いくつかの実施形態では、核酸分子を、いわゆる「５’キャップ」構造の付加によって修飾できる。５’－キャップは、一般に、成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップする」実体、通常、修飾されたヌクレオチド実体である。５’－キャップは、通常、修飾されたヌクレオチドによって、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’－キャップは、５’－５’－トリホスフェート連結を介して５’末端に連結される。５’－キャップは、メチル化されてもよい、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’－キャップを保持する核酸の末端５’ヌクレオチド、通常、ＲＮＡの５’末端である）。ｍ７ＧｐｐｐＮは、ポリメラーゼＩＩによって転写されるｍＲＮＡ中に天然に存在する５’キャップ構造であり、したがって、本発明に従う修飾されたＲＮＡ中に含まれる修飾と考えられない。
核酸ワクチンを作製し、使用する方法は、例えば、各々、その全文で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００７０２６９４５１、ＵＳ２０１６０３１７６４７、ＵＳ９８７２９００およびＵＳ２０１７００２９８４に記載されている。
医薬組成物
本明細書において記載されるペプチド、ペプチドをコードする核酸、ナノ粒子および細胞のいずれも、医薬組成物に組み込まれ得る。組成物は、ペプチド（および／またはペプチドをコードする核酸）のうち１種または複数および薬学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用される場合、言語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤などを含む。１種または複数のペプチドは、シロップ、エリキシル剤、懸濁物、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、トローチ、水溶液、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、エマルジョンなどの形態で医薬組成物として製剤化できる。補足的に活性な化合物（例えば、１種または複数の化学療法剤）もまた、組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、一般に、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例として、経口、直腸および非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、経皮または経粘膜が挙げられる。非経口適用に使用される溶液または懸濁物は、以下の構成成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための作用物質。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整できる。組成物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量のバイアルに封入できる。
注射可能な使用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与のために、適した担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、医薬組成物は、滅菌でなくてはならず、易注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物によるあらゆる汚染に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物による汚染の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多数の場合には、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが望ましいと予想される。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって容易にできる。
滅菌注射用溶液は、適当な溶媒中、必要な量で、ペプチドのうち１種または複数（またはペプチドをコードする１種もしくは複数の核酸）を、必要に応じて、１種の成分または成分の組合せとともに組み込み、続いて、濾過滅菌することによって調製できる。一般に、分散物は、ペプチド（またはペプチドをコードする核酸）を、基本分散媒および上記で列挙されたものに由来する必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製方法は、真空乾燥または凍結乾燥を含み得、その事前に滅菌濾過した溶液から有効成分および任意の追加の所望の成分の散剤を得る。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的で、１種または複数のペプチドを、賦形剤とともに組み込み、錠剤、トローチまたはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。マウスウォッシュとして使用するために、経口組成物をまた、流体担体を使用して調製できる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれも含有することができる：微結晶性セルロース、トラガントガムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの矯味矯臭剤。
散剤および錠剤は、１％～９５％（ｗ／ｗ）の個々のペプチドまたは２種もしくはそれより多くのペプチドの混合物を含有し得る。特定の実施形態では、ペプチドは、約５％～７０％（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。適した担体として、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどがある。用語「調製物」は、その他の担体を伴うまたは伴わないペプチドが、担体によって囲まれており、したがって、それと関連しているカプセル剤を提供する担体として、封入材料を有するペプチド（または核酸）の製剤を含むものとする。同様に、カシェおよびロゼンジも含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェおよびロゼンジは、経口投与に適した固体剤形として使用され得る。
経口使用に適した水溶液は、活性成分を水に溶解することおよび必要に応じて適した着色料、矯味矯臭剤、安定化剤および増粘剤を添加することによって調製できる。経口使用に適した水性懸濁物は、微細に分割された活性成分を、粘性材料、例えば、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびその他の周知の懸濁剤とともに水に分散することによって製造できる。
吸入による投与のために、ペプチドまたは核酸を、適した噴霧体、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で送達できる。
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によってであり得る。経粘膜または経皮投与のために、製剤に透過されるべきバリアにとって適当な浸透剤が使用される。このような浸透剤は、一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与には、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成できる。経皮投与には、ペプチドまたは核酸を、一般に当技術分野で公知のように、軟膏、膏薬（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに製剤化できる。
ペプチドまたは核酸はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または保留浣腸の形態で調製できる。
いくつかの実施形態では、ペプチドまたは核酸を、ペプチドを身体からの迅速な排出から保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製する方法は、当業者に明らかと予想される。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することができる。リポソーム懸濁物（例えば、ＡＰＣ特異的抗原に対するモノクローナル抗体を用いてＡＰＣに標的化されるリポソームを含む）はまた、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、当業者に公知の、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような方法に従って調製できる。
投与の容易性および投与量の均一性のために投与量単位形態で経口または非経口組成物を製剤化することは、有利であり得る。投与量単位形態とは、本明細書で使用される場合、処置されるべき被験体のための単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように算出された所定量のペプチド（または核酸）を含有する。投与量単位はまた、使用のための指示が付随し得る。
ペプチドをコードする核酸分子を、ベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用できる。遺伝子療法ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与によって（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射によって（例えば、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３０５４－ ３０５７を参照のこと）被験体に送達できる。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含み得る、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている遅延放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが組換え細胞から無傷で産生され得る場合には、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含み得る。
遺伝子送達ビヒクルの追加の例として、これらに限定されないが、リポソーム、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、細菌、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに種々の真核生物および原核生物宿主における発現のために記載されてきた当技術分野で通常使用され、遺伝子療法のために、ならびに簡単なタンパク質発現のために使用され得るその他の組換えビヒクルが挙げられる。
ウイルスベクターの例として、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。標的化部分、例えば、抗体またはその断片を含むリポソームもまた、使用して、被験体に送達するための核酸の医薬組成物を調製できる。
本明細書に記載される医薬組成物のいずれも、以下に記載されるような投与のための指示と一緒に、容器、パックまたはディスペンサー中に含めることができる。
キットおよび製造品
本開示はまた、種々のキットを特徴とする。キットは、例えば、本明細書に記載されるペプチド（または１種または複数のペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクター）のいずれかのうち１種または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種またはそれより多く）およびペプチドを被験体に投与するための指示を含み得る。キットは、１種または複数の薬学的に許容される担体および／または１種または複数の免疫刺激剤を含み得る。免疫刺激剤は、例えば、ヘルパーＴエピトープ、変更されたペプチドリガンドまたはアジュバントであり得る。キットはまた、１種または複数の治療剤、診断剤または予防剤を含有し得る。１種または複数の治療剤、診断剤または予防剤として、これらに限定されないが、（ｉ）炎症反応を調節する薬剤（例えば、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ステロイド、クロモリンナトリウムまたはテオフィリン）、（ｉｉ）腎および／または心血管機能に影響を及ぼす薬剤（例えば、フロセミド、チアジド、アミロライド、スピロノラクトン、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、ジゴキシン、イソルジル、ドブタミン、リドカイン、キニジン、アデノシン、ジギタリス、メバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチンまたはメバロネート）、（ｉｉｉ）胃腸機能に影響を及ぼす薬物（例えば、オメプラゾールまたはスクラルファート）、（ｉｖ）抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クリンダマイシン、アンホテリシンＢ、キニーネ、メチシリン、バンコマイシン、ペニシリンＧ、アモキシシリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、クロラムフェニコール、イソニアジド、フルコナゾールまたはアマンタジン）、（ｖ）抗がん剤（例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、タモキシフェン、シスプラチンまたはデカルバジン）、（ｖｉ）免疫調節剤（例えば、インターロイキン、インターフェロン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、アザチオプリン、ステロイド）、（ｉｘ）血液および／または血液形成臓器に作用する薬物（例えば、インターロイキン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、エリスロポエチン、ヘパリン、ワルファリンまたはクマリン）または（ｖｉｉ）ホルモン（例えば、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、インスリン、ＦＳＨ、ＣＧ、ソマトスタチン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、チロキシン、トリヨードチロニン）、ホルモンアンタゴニスト、カルシウム沈着および骨代謝回転に影響を及ぼす薬剤（例えば、カルシウム、ホスフェート、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ、ビスホスホネート、カルシトニン、フッ化物）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩ抗体のいずれかのうち１種または複数（例えば、１、２または３種またはそれより多く）を含有し得る。いくつかの実施形態では、キットは、各々異なるタンパク質に対して特異的な２種の抗体を含み得る。例えば、キットは、１種のＢＣＭＡ特異的抗体（本明細書に記載される）および１種のＴＡＣＩ特異的抗体（本明細書に記載される）を含有し得る。キットは、必要に応じて、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩタンパク質のうち１種または複数の存在または量について生体試料をアッセイするための指示を含み得る。また、容器および容器内に含有される組成物を含む製造品も特徴とし、組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において免疫応答を誘導するための有効成分を含み、有効成分は、本明細書において記載されるペプチドのいずれかのうち１種または複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種またはそれより多く）を含み、容器は、組成物が、哺乳動物（例えば、本明細書に記載される哺乳動物のいずれか）において免疫応答を誘導することにおいて使用するためのものであることを示すラベルを有する。ラベルは、組成物が、多発性骨髄腫を有する、それを有すると疑われる、またはそれを発生するリスクにある哺乳動物に投与されるべきであることをさらに示し得る。製造品の組成物は、乾燥または凍結乾燥され得、例えば、乾燥または凍結乾燥した組成物を可溶化するための１種または複数の溶液（および／または指示）を含み得る。
製造品はまた、哺乳動物に組成物を投与するための指示を含み得る。
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、これは特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を制限するものではない。
（実施例１ 多発性骨髄腫細胞系でのＢＣＭＡ発現）
１１種のＭＭ細胞系および１種の乳がん細胞系（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）を含む合計１２種のがん細胞系を、以下のクローン各々に対して特異的な抗体を用いて染色することによって、そのＢＣＭＡ抗原の発現レベルについて評価した；１番．ＡＮＣ３Ｂ１（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ３５７６３０）、２番．ＶＩＣＫＹ１（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＬＳ－Ｃ１８６６２）および３番．１９Ｆ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５７５０６）。細胞系の中でも、Ｈ９２９（ＭＭ細胞系）が、最高レベルのＢＣＭＡ発現を示し、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（乳がん細胞系；ＢＣＭＡ陰性）は、最小レベルのＢＣＭＡ発現を示した。（図１Ａ～１Ｉ）
（実施例２ ＨＬＡ－Ａ２に対して特異的なＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ天然ペプチドの選択）
それぞれ、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ抗原に由来する６種の天然ペプチドを以下のように同定した：
（実施例３ ＨＬＡ－Ａ２分子に対するＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ天然ペプチドの結合親和性）
列挙されたＢＣＭＡペプチドを、ＨＬＡ－Ａ２特異的結合能についてＴ２細胞系を使用して評価した。アッセイでは、Ｔ２細胞を洗浄し、血清不含ＡＩＭ－Ｖ培地に１×１０６個細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁し、２４ウェル組織培養プレートのウェルに移した。細胞を種々の濃度のそれぞれのＢＣＭＡペプチド（０～２００μｇ／ｍｌ）および３μｇ／ｍｌヒトβ２－ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ）を用いてパルスし、加湿空気中３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄し、マウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２－ＦＩＴＣ ｍＡｂを用いて４℃で１５分間染色し、洗浄し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ｖ２．１ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を備えたＦＡＣＳｏｒｔ（商標）フローサイトメーターを使用して解析した。ＨＬＡ－Ａ２とのペプチド結合を、ＨＬＡ－Ａ２特異的ペプチド結合によって引き起こされるＴ２細胞でのＨＬＡ－Ａ２分子の上方制御によって決定し、フローサイトメトリー解析によって平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって実証した。評価したＢＣＭＡペプチドの中で、「４番．ＢＣＭＡ７２～８０（ＶＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号４））」が、最高レベルのＨＬＡ－Ａ２特異性を示し、「５番．ＢＣＭＡ５４～６２（ＡＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号５））」が、２番目に高いレベルの特異性を示した（図２）。評価したＴＡＣＩペプチドの中で、ＴＡＣＩ５番を除くすべてのペプチドが、ＨＬＡ－Ａ２特異性を示したが、最高レベルは、４番．ＴＡＣＩ１６６～１７４（ＴＬＧＬＣＬＣＡＶ（配列番号１０））によって測定された（図３）。
（実施例４ ＨＬＡ－Ａ２分子に対するＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ天然ペプチドの安定性）
ＨＬＡ－Ａ２分子に対するペプチド結合の安定性を改善するために、以下のヘテロクリティックＢＣＭＡまたはＴＡＣＩペプチドを設計した：
天然およびヘテロクリティックＢＣＭＡおよびＴＡＣＩペプチドを、ＨＬＡ－Ａ２結合安定性についてＴ２細胞系を使用して調べた。Ｔ２細胞をそれぞれのペプチドを用いてパルスした。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄して、結合していないペプチドを除去し、それらを上記で示されるように結合親和性について、および以下のように安定性について評価した。細胞を１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートして、新規に合成されたＨＬＡ－Ａ２分子の細胞表面発現をブロックした。ブレフェルジンＡ処置の０、２、４、６および１８時間後にペプチド／ＨＬＡ－Ａ２結合安定性を評価した。インキュベーション期間後、細胞を回収し、洗浄し、マウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２－ＦＩＴＣ ｍＡｂを用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した。「ヘテロクリティック４番ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））」、「ヘテロクリティック５番ＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））」および「ヘテロクリティック３番ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））」のＨＬＡ－Ａ２結合親和性は、その天然ペプチドから増大された（図４および５）。結合安定性の点で、「ヘテロクリティック４番ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））」および「ヘテロクリティック３番ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））」ペプチドは、天然ペプチドと比較して、０、２、４、６および１８時間を含む評価されたすべての時点でそのＨＬＡ－Ａ２親和性の大幅な改善を示した（図６および７）。したがって、ＭＭ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を作製するその免疫原性の可能性のさらなる評価のために、ヘテロクリティック４番ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））およびヘテロクリティック３番．ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６）ペプチドを選択した。
（実施例５ ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩペプチド特異的ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬの誘導）
ＭＭ細胞系を標的化する機能的活性の評価のために、種々のＨＬＡ－Ａ２＋正常ドナーからペプチド特異的ＣＴＬを作製した。ペプチド特異的ＣＴＬを作製するために、同一ドナーから作製した成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を、血清不含ＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁し、５０μｇ／ｍｌのヘテロクリティック４番ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドまたは「ヘテロクリティック３番ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））」ペプチドを用いて、加湿空気中３７℃、５％ＣＯ２で一晩パルスした。ペプチドでパルスしたｍＤＣを洗浄し、カウントし、１０Ｇｙで照射し、これを使用して、１０％ヒトＡＢ血清を追加補充したＡＩＭ－Ｖ培地中、１：２０の抗原提示細胞／ペプチド対ＣＤ３＋Ｔ細胞比でＣＤ３＋Ｔ細胞をプライムした。培養物をペプチドでパルスした照射したＴ２細胞を用いて７日間毎に合計４サイクルの間再刺激した。Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで維持するために、第２の刺激の２日後に培養物にＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）を添加した。対照Ｔ細胞培養物は、ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下、同一培養条件下で維持したが、ペプチド刺激は伴わなかった。得られたＣＴＬの表現型は、ペプチド刺激の各サイクルの１週間後に評価した。フローサイトメトリー解析によって、ヘテロクリティック４番ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いて刺激されたＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの表現型において明確な変化が示され、集団において徐々に増大した。ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドによるＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞増大は、免疫原性ペプチドとしてこれまでに同定された免疫原性ＣＤ１３８２６０～２６８（ＧＬＶＧＬＩＦＡＶ（配列番号２０））を用いたものと同様であり、これは、ＢＣＭＡペプチドの潜在的な免疫原性を示唆する。ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬ培養物は、非ペプチド刺激対照Ｔ細胞（約２０％）と比較して、４サイクルのペプチド刺激の際に、より高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞（約８０％）を含有していた（図８Ａ～８Ｃ）。
（実施例６ ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチド刺激によるナイーブＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬの減少およびメモリーＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬの増大）
抗原特異的ＣＴＬは、その別個の細胞表面抗原の発現によってナイーブＴ細胞からの活性化／メモリーＴ細胞として表現型によって同定され得る。ＢＣＭＡ－ＣＴＬの表現型を、ナイーブおよびメモリー細胞の表現型を解析することによって潜在的なエフェクター細胞として調べた。ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬは、５０μｇ／ｍｌのヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いてパルスされた抗原提示細胞を用いる毎週のＨＬＡ－Ａ２＋正常ドナーのＣＤ３＋Ｔ細胞の反復刺激によって作製した。各ペプチド刺激の１週間後、得られたＣＴＬを、フローサイトメトリーによってその表現型プロファイルについて評価した。ＢＣＭＡ－ＣＴＬは、対照Ｔ細胞と比較したナイーブＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示した（ドナー１：８０％未刺激対２％ ４サイクルの刺激時、ドナー２：８３％未刺激対２％ ４サイクルの刺激時）。ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドを用いた場合に、メモリーＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度において対応する増大が観察された（ドナー１：１８％未刺激対８６％ ４サイクルの刺激時；ドナー２：１０％未刺激対９２％ ４サイクルの刺激時）。これらの表現型変化は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いるＣＤ３＋Ｔ細胞の反復刺激が、メモリー細胞の表現型を有するＣＤ８＋ＣＴＬの拡大増殖をもたらすことを実証し、ＢＣＭＡペプチドの免疫原性を示す（図９および１０）。
（実施例７ ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチド刺激によるセントラルメモリーおよびエフェクターＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬの頻度の変化）
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドを用いるＴ細胞の刺激時の、セントラルメモリーおよびエフェクター細胞のさらなる評価を実施した。３サイクルの刺激後、ＢＣＭＡペプチドによるセントラルメモリーＣＴＬの拡大増殖が検出され、これはエフェクターＣＴＬの減少と一致した。４サイクルのペプチド刺激の際、セントラルメモリーＣＴＬの減少およびエフェクターメモリー細胞を含むエフェクターＣＴＬの増大も検出された。ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドを用いた場合のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるこの表現型の変化のパターンは、ＣＤ１３８２６０～２６８（ＧＬＶＧＬＩＦＡＶ（配列番号２０））を用いて刺激された細胞と同様であった（図１１Ａ～１１Ｃ）。
（実施例８ ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ－配列番号１３）ペプチドまたはヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ－配列番号１６）ペプチドを用いて刺激された特異的ＣＴＬは、特異的Ｔ細胞サブタイプを表す別個の表現型を示す）
本発明者らはまた、ペプチドを用いて刺激されたＣＤ３＋Ｔ細胞培養物中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内のナイーブ（ＣＤ４５ＲＯ－／ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７－）および末端エフェクター（ＣＤ４５ＲＯ－／ＣＣＲ７－）細胞の頻度における、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドまたはヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））ペプチドを用いて刺激されたＣＴＬ内のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける別個の表現型の変化を観察した。４サイクルのペプチド刺激後、エフェクターメモリーＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が増大され、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋／ＣＤ３＋ＣＤ８＋）およびセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋／ＣＤ３＋ＣＤ８＋）における対応する減少を伴った。したがって、これらの結果は、選択されたヘテロクリティックＢＣＭＡまたはＴＡＣＩペプチドを用いるＣＤ３＋Ｔ細胞の反復刺激が、抗原特異的ＣＴＬに特徴的なＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの別個の表現型変化および拡大増殖をもたらすことを実証する（図１２および図１３）。
（実施例９ ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬおよびＴＡＣＩ特異的ＣＴＬは、細胞傷害活性を誘導し、Ｔｈ１型のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）を産生し、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式でＭＭ細胞に対する４１ＢＢ発現を上方制御する）
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドまたはヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））を用いて刺激されたペプチド特異的ＣＴＬを、フローサイトメトリーによって、骨髄腫細胞を溶解し、抗腫瘍活性に関与する決定的なサイトカインを産生するその能力について分析した。ＢＣＭＡ－ＣＴＬおよびＴＡＣＩ特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６細胞の認識の際に、ＣＤ１０７ａ脱顆粒マーカー、細胞傷害活性の尺度を発現する細胞の頻度の大幅な増大を実証し、これは、ＨＬＡ－Ａ２－ＯＰＭ２細胞よりも高かった。ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＭ細胞に対するＢＣＭＡ特異的ＣＴＬおよびＴＡＣＩ特異的ＣＴＬにおいてＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α産生のレベルの増大が検出されたが、ＨＬＡ－Ａ２－ＭＭ細胞に対しては検出されず、これは、免疫応答が、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式にあることを実証する（図１４および図１５）。
（実施例１０ ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２拘束かつ抗原特異的な様式でＭＭ細胞に応じて増殖する）
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いて刺激されたペプチド特異的ＣＴＬの機能活性を、ＣＦＳＥ－増殖アッセイを使用してさらに解析した。ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＭ（Ｕ２６６）、ＨＬＡ－Ａ２＋乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）またはＨＬＡ－Ａ２－ＭＭ（ＭＭ１Ｓ）細胞を用いる刺激後、ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を４日目に測定し、ＣＦＳＥ標識されたＣＴＬの蛍光の減少によって証明された（ＣＦＳＥ低をゲートした）。ＢＣＭＡ－ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６ ＭＭ細胞系に応じて大幅なＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導した（増殖細胞：４６％）。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１またはＭＭ１Ｓに応じて誘導されず、培地単独において培養された細胞（１０％）と同様に低レベルに留まった（１１％～１４％）。総合すると、これらの結果は、ＢＣＭＡ－ＣＴＬは、骨髄腫細胞に特異的に応答し、そのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、ＨＬＡ－Ａ２によって拘束され、抗原特異的であるということを示唆する（図１６）。
（実施例１１ 免疫アゴニストと組み合わせたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬによるより高いレベルの細胞毒性）
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いて刺激されたペプチド特異的ＣＴＬの活性を、４８時間の抗ＯＸ４０または抗ＧＩＴＲを用いる細胞の処置において測定した。細胞毒性のレベルを、ゲートされたＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒によって測定した。未処置群（４３％）と比較して、抗ＯＸ４０（９２％）または抗ＧＩＴＲ（５５％）を用いるＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬの処置の際に、ＣＤ１０７ａ脱顆粒が増大されることが観察され、これは、免疫アゴニストを用いる組合せ処置は、ＢＣＭＡ－ＣＴＬの抗腫瘍活性を誘導するのに役立つことを示唆する（図１７）。
（実施例１２ ＢＣＭＡ特異的セントラルメモリーＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球による多発性骨髄腫の選択的標的化）
幹細胞移植パラダイムに新規療法を組み込む多発性骨髄腫（ＭＭ）の処置における最近の進歩にもかかわらず、進行中のＤＮＡ損傷およびゲノム進化が、多数の患者における再発の根底にある。したがって、別個の作用機序を有する新規治療アプローチが必要である。構成的または進化性の遺伝子複雑性は、Ｂ細胞悪性疾患の免疫応答性と相まって、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、免疫毒素およびＣＡＲＴ細胞を含むＭＭにおける免疫療法の選択肢の開発を刺激してきた。ＭＭ患者特異的ＣＡＲＴ細胞療法は著しく深い応答を達成したが、応答の耐久性は確立されておらず、それらは、労働集約的であり、時間のかかるものであり、高価である。これらの制限を克服するために、この実施例は、患者をより広く、効率的に処置するための既製の免疫療法として免疫原性ペプチドベースのがんワクチンを提供する。ペプチドベースの治療アプローチは、適した翻訳（ｍＲＮＡのために）または転写（ＤＮＡのために）に必要なさらなるステップとともに、タンパク質の内部移行、ＨＬＡに対する最適免疫原性ペプチドへの分解のプロセスを必要とする組換えタンパク質、ｍＲＮＡまたはＤＮＡベースのワクチンの制限を有さない。ＭＨＣ拘束を克服し、免疫原性エピトープワクチンアプローチを使用してより多様な患者集団を処置するために、主要ＨＬＡサブタイプを含むようにペプチドカクテルをプールした。さらに、レナリドミドは、ペプチドワクチン特異的免疫応答およびメモリー細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を増強し、チェックポイント阻害剤および／または免疫アゴニストを用いる組合せアプローチの段階を設定できる。さらに、免疫原性ペプチドによって誘発される抗腫瘍有効性は、エフェクター細胞の生成の際に「エピトープ拡散（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）」を誘導するその能力によって増強されることができ、それによって、標的化された溶解したがん細胞は、新規抗原性エピトープを放出し、それが、続いて、取り込まれ、プロセシングされ、ＣＴＬの新規レパートリーに対して抗原提示細胞によって提示される。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）のメンバーであり、Ｂ細胞成熟および形質細胞への分化の調節において中心的な役割を有するシステインリッチ細胞外ドメインを含有するＩＩＩ型膜貫通タンパク質として特徴付けられている。ＭＭ細胞成長および生存因子Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）の受容体として、ＢＣＭＡがＭＭ細胞の生存に必要であり、それを有望な治療薬標的とする。ほぼすべてのＭＭ腫瘍細胞は、ＢＣＭＡを発現し、腫瘍細胞の同定のためのマーカーとして提案されている。成熟Ｂおよび長期生存形質細胞のサブセットでのその選択的発現は、ＢＣＭＡ指向性処置アプローチの好都合な治療指数をさらに示唆する。現在、ＢＣＭＡは、抗体（裸の抗体、抗体－薬物コンジュゲートおよび二重特異性抗体）および細胞療法（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）を含むいくつかの免疫療法戦略によって標的化されており、再発難治性ＭＭにおいてでさえ有望な臨床結果を有している。さらに、血清可溶性ＢＣＭＡは、ＭＭおよび慢性リンパ性白血病を有する患者の中では上昇しており、予後マーカーおよび応答のモニターとして役立ち得る。最後に、最近の研究によって、ＢＣＭＡは、非造血組織において発現され、ＢＣＭＡは、非小細胞肺がん細胞系において異常に発現され、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路によって腫瘍において役割を果たし得ることが示される。これらのデータは、ＭＭおよび同様に潜在的にＢＣＭＡを発現する固形腫瘍において免疫療法戦略でのＢＣＭＡを標的化することを支持する。
この実施例は、ＭＭ細胞に対して有効な長期持続性免疫を有する抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを作製することによる、ＢＣＭＡを標的化するペプチドベースの免疫療法アプローチを提供する。高度に有効な抗腫瘍活性を有するＭＭ特異的応答を誘発可能である新規免疫原性天然およびヘテロクリティックＨＬＡ－Ａ２特異的ＢＣＭＡペプチドを同定した。重要なことに、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２分子に対する最大の親和性／安定性とともに、最高レベルの免疫原性、ならびにＨＬＡ－Ａ２＋患者のＭＭ細胞およびＭＭ細胞系に対する多機能性活性を有するＢＣＭＡ特異的メモリーＣＴＬの頑強な誘導を実証した。実験は、がんワクチンおよび養子免疫療法プロトコールにおける、この新規の操作された免疫原性ＢＣＭＡ７２～８０ペプチドの臨床適用のための枠組みを示し、ＭＭまたはＢＣＭＡを発現するがんを有する患者において長期持続性メモリー抗腫瘍免疫を提供する。
特に、この結果は、新規に診断されたＭＭ患者（Ｎ＝６１６）から得たＣＤ１３８＋腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原を使用して、現在の多発性骨髄腫（ＭＭ）特異的免疫療法の幅および程度を拡大できることを示す。これらの実験は、ＭＭ細胞に対する有効な長期持続する免疫応答を媒介するＢＣＭＡ特異的メモリーＣＤ８＋ＣＴＬを作製することによって、ＭＭ細胞成長および生存を促進するＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的化するように設計されている。これでは、実験は、ＢＣＭＡ、ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））およびＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））に対して特異的な新規の操作されたペプチドが、その天然ペプチドと比較して、ＨＬＡ－Ａ２に対して改善された親和性／安定性を示し、活性化が増大した（ＣＤ３８、ＣＤ６９）および共刺激性（ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ）分子発現を有するＢＣＭＡ特異的ＣＴＬを誘導することを示す。重要なことに、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬは、ＭＭに対する多機能Ｔｈ１特異的免疫活性［ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α産生、増殖、細胞毒性］を実証し、これは、四量体＋およびメモリーＣＤ８＋ＣＴＬ集団の拡大増殖と直接的に相関していた。抗ＯＸ４０または抗ＬＡＧ３と組み合わせた場合、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬは、特に、セントラルメモリーＣＴＬによるＭＭに対する細胞毒性の増大を示した。これらの結果は、ワクチン接種および養子免疫療法戦略における、単独でのおよび抗ＬＡＧ３および／または抗ＯＸ４０と組み合わせた、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドの臨床適用の枠組みを提供し、ＭＭおよびその他のＢＣＭＡを発現する腫瘍を有する患者において長期持続する自己抗腫瘍免疫を作製する。
この実施例において、以下の材料および方法を使用した。
材料および方法
細胞系
ＭＭ細胞系、ＭＭ１Ｓ、ＯＰＭ２、ＯＰＭ１、Ｈ９２９、ＯＣＩＭＹ５、ＲＰＭＩ、Ｕ２６６、ＫＭＳ１、ＨＳＢ２、ＭｃＣＡＲおよびＡＮＢＬ６ならびに乳がん細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｔ２細胞系、ＨＬＡ－Ａ２分子を発現するヒトＢおよびＴ細胞ハイブリッドは、Ｄｒ． Ｊ． Ｍｏｌｌｄｒｅｍ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍ． Ｄ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって提供された。細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加補充した、ＤＭＥＭ（ＭＭおよびＴ２細胞用；Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）またはＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５（ＭＤＡ－ＭＢ２３１用；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）培地で培養した。
試薬
蛍光色素がコンジュゲートしている抗ヒトＢＣＭＡ、ＨＬＡ－Ａ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６９、４１ＢＢ、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＯＸ４０およびＧＩＴＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色キットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から入手し、ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮ－αおよびＴＮＦ－αは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ＢＣＭＡペプチド特異的四量体－ＰＥは、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）によって合成された。ＬＡＧ３またはＯＸ４０に対する臨床等級ｍＡｂは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）によって提供された。
合成ペプチド
天然ＢＣＭＡペプチド［ＢＣＭＡ６４～７２（ＬＩＩＳＬＡＶＦＶ（配列番号１））、ＢＣＭＡ６９～７７（ＡＶＦＶＬＭＦＬＬ（配列番号２））、ＢＣＭＡ９～１７（ＳＱＮＥＹＦＤＳＬ（配列番号３））、ＢＣＭＡ７２～８０（ＶＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号４））、ＢＣＭＡ５４～６２（ＡＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号５））、ＢＣＭＡ１１４～１２０（ＩＬＰＲＧＬＥＹＴ（配列番号６））］、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチド［ｈＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））、ｈＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））、ｈＢＣＭＡ９～１７（ＹＱＮＥＹＦＤＳＬ（配列番号２２））］およびＨＩＶ－Ｇａｇ７７～８５（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号２１））は、標準ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチル－オキシカルボニル）化学によって合成され、逆相クロマトグラフィーを使用して＞９５％に精製され、分子量の質量分析によって検証された（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）。
ＨＬＡ－Ａ２親和性および安定性アッセイ
Ｔ２細胞を、種々の用量のペプチドおよびβ２－ミクログロブリン（３μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて一晩パルスした。一晩インキュベートした後、細胞をＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ ｍＡｂを用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ）を使用して解析した。ペプチド／ＨＬＡ－Ａ２複合体安定性は、ブレフェルジンＡ処置の０、２、４、６および１４時間後、ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ ｍＡｂを用いる染色およびフローサイトメトリー解析によってペプチドが負荷されたＴ２細胞で測定した。
樹状細胞の作製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された単球を、１０％ ＦＣＳを追加補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１，０００ユニット／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１，０００ユニット／ｍｌのＩＬ－４の存在下で７日間培養した。培養物に新鮮培地およびＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を１日おきに添加した。成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、７日目に得られ、１，０００ユニット／ｍｌのＩＦＮ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αとともにさらに３日インキュベートを続けた。
ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬの誘導
ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬ（ＢＣＭＡ－ＣＴＬ）を、ペプチドがパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いてＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞の反復刺激によってｅｘ ｖｉｖｏで作製した。手短には、ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）がパルスされたＡＰＣを照射し（１０Ｇｙ）、これを使用して、１ＡＰＣ／ペプチド：２０Ｔ細胞比でＴ細胞を刺激した。Ｔ細胞培養物を７日毎に再刺激し、ＩＬ－２（５０ユニット／ｍｌ）の存在下、１０％ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を追加補充したＡＩＭ－Ｖ培地中で維持した。
ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬまたは腫瘍細胞の表現型解析
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色キットおよび蛍光色素がコンジュゲートしている抗ヒトｍＡｂおよび四量体－ＰＥを用いる染色後に、ＢＣＭＡ－ＣＴＬで表現型特徴付けを実施した。あるいは、ＭＭおよび乳がん細胞系を、蛍光色素がコンジュゲートしているＢＣＭＡまたはＨＬＡ－Ａ２ ｍＡｂを用いて染色した。染色後、細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒド中で固定し、フローサイトメトリーによって解析した。
カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）トラッキングによる細胞増殖
ＢＣＭＡ－ＣＴＬを、ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて標識し、ＩＬ－２（１０ユニット／ｍｌ）の存在下で照射された（１０Ｇｙ）腫瘍細胞またはペプチドがパルスされたＡＰＣとともに同時インキュベートした。同時培養の４、５、６または８日目に、細胞を回収し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色キットおよびＣＤ３／ＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ／ＣＣＲ７ ｍＡｂを用いて染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬ増殖のレベルは、フローサイトメトリーによって測定されるようなＣＦＳＥ蛍光強度の低減として決定した。
ＣＤ１０７ａ脱顆粒および細胞内ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－αサイトカイン産生
ＢＣＭＡ－ＣＴＬの機能的細胞溶解活性は、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＴｈ１サイトカイン産生によって測定した。手短には、ＢＣＭＡ－ＣＴＬを、ＣＤ１０７ａ ｍＡｂの存在下で腫瘍細胞またはＴ２／ペプチドとともに同時インキュベートした。１時間インキュベートした後、ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ ｍＡｂ、ブレフェルジンＡおよびＭｏｎｅｎｓｉｎ（ＢＤ）をさらに５時間添加した。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔ細胞抗原に対して特異的なｍＡｂとともにインキュベートした。表面染色後、細胞を固定し／透過処理し、抗ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α ｍＡｂを用いて染色し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ）を用いて洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって解析した。
統計解析
結果を平均±ＳＥとして示す。群を、独立スチューデントｔ検定を使用して比較した。相違は、ｐ＜０．０５である場合に有意と考えた。
ＨＬＡ－Ａ２分子に対するＢＣＭＡペプチド結合親和性および安定性。
ＢＩＭＡＳおよびＮｅｔＣＴＬを含む種々の検索ソフトウェアプログラムを使用して、全長ＢＣＭＡタンパク質配列を評価して、ＨＬＡ－Ａ２親和性、延長された半減時間解離速度、プロテアソームＣ末端切断およびＴＡＰ輸送を有するエピトープを予測した。選択された６種の天然ペプチド［ＢＣＭＡ６４～７２（ＬＩＩＳＬＡＶＦＶ）、ＢＣＭＡ６９～７７（ＡＶＦＶＬＭＦＬＬ）、ＢＣＭＡ９～１７（ＳＱＮＥＹＦＤＳＬ）、ＢＣＭＡ７２～８０（ＶＬＭＦＬＬＲＫＩ）、ＢＣＭＡ５４～６２（ＡＩＬＷＴＣＬＧＬ）、ＢＣＭＡ１１４～１２０（ＩＬＰＲＧＬＥＹＴ）］の中で、ＢＣＭＡ７２～８０（ＶＬＭＦＬＬＲＫＩ）およびＢＣＭＡ５４～６２（ＡＩＬＷＴＣＬＧＬ）が、最高のＨＬＡ－Ａ２結合親和性を用量依存的に示した。設計されたヘテロクリティックペプチドの中で、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））およびヘテロクリティックｈＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））が、その天然ペプチド（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）と比較して、ＨＬＡ－Ａ２結合親和性の最高の増大を示した。対照的に、非ＨＬＡ－Ａ２特異的ＢＣＭＡ９～１７（ＳＱＮＥＹＦＤＳＬ）中のアンカーモチーフをヘテロクライト（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｅ）ＢＣＭＡ９～１７（ＹＱＮＥＹＦＤＳＬ（配列番号２２））に置き換えることは、そのＨＬＡ－Ａ２親和性状態を変更せず、ＨＬＡ－Ａ２特異的ペプチド内の修飾のみによる改善されるＨＬＡ－Ａ２親和性を示した。
ペプチドがパルスされたＴ２細胞のブレフェルジンＡ処置後のＢＣＭＡ７２～８０およびＢＣＭＡ５４～６２ＨＬＡ－Ａ２特異的ペプチドのＨＬＡ－Ａ２安定性を評価した。天然ＢＣＭＡ７２～８０およびＢＣＭＡ５４～６２ペプチドは、６時間より長い拡張されたＨＬＡ－Ａ２安定性を示し、これを、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））およびＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））に操作することによってさらに増強した。全体的に、試験した各時点でＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いて最高レベルのＨＬＡ－Ａ２親和性および安定性が検出され、これは、ＨＬＡ－Ａ２陽性対照ＨＩＶ－Ｇａｇ７７～８５ペプチドよりも高かった。
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））またはＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））を用いて作製したＢＣＭＡ特異的ＣＴＬは、Ｔ細胞活性化および共刺激分子発現の増大を示す。
フローサイトメトリーを使用して、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチド特異的ＣＴＬ（ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ）またはヘテロクリティックｈＢＣＭＡ５４～６２ペプチド特異的ＣＴＬ（ｈＢＣＭＡ５４～６２ＣＴＬ）の表現型特徴付けを、第４ラウンドのペプチド刺激後に実施した。両ＣＴＬ集団が、活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ３８）発現の増大を示し、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬで最高の上方制御が検出された：ＣＤ３８はベースライン２３％から８０％に増大し、ＣＤ６９は、ベースライン７％から３８％に増大した（図１８Ａ）。さらに、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、ｈＢＣＭＡ５４～６２ＣＴＬよりも高い、４１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ３０およびＧＩＴＲ共刺激分子の発現を示した（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
図１８Ａ～１８Ｃでは、ＨＬＡ－Ａ２＋個体から得たＣＤ３＋Ｔ細胞を、それぞれのヘテロクリティックＢＣＭＡペプチド、ＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））またはＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））のいずれかを用いてパルスされた照射されたＡＰＣを用いて毎週刺激した。第４サイクルの刺激の１週間後、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって解析した。Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ３８）および共刺激分子（４１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ３０、ＧＩＴＲ）の発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞で評価した。結果は、代表的なもの（図１８Ａおよび１８Ｂ）または異なる個体（Ｎ＝３）から作製したＢＣＭＡ－ＣＴＬを使用する３つの独立実験のまとめ（図１８Ｃ）として実証されている。
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬは、ＭＭ細胞系に応じて抗原特異的抗腫瘍活性を示す。
各ラウンドのペプチド刺激後にｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬの表現型および活性を評価した。作製された特異的ＣＴＬ（ｎ＝３）において、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））を用いる刺激の際に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞％の漸増（図２５Ａ～２５Ｂ）およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞％の対応する減少（図２６Ａ～２６Ｂ）が観察された。並行して、ＢＣＭＡ ｍＡｂクローン（ＡＮＣ３Ｂ１、ＶＩＣＫＹ１、１９Ｆ２）を用いて染色された標的細胞の表現型解析は、Ｈ９２９、ＭＭＩＳ、Ｕ２６６およびＯＰＭ１細胞系で高いＢＣＭＡ発現を示したが、乳がん細胞系（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）（図２７Ａ～２７Ｃ）では示さなかった。機能活性の評価では、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２－ＢＣＭＡ＋ＭＭ１Ｓ（７％）、ＨＬＡ－Ａ２＋ＢＣＭＡ－ＭＤＡ－ＭＢ２３１（９％）または培地単独（６％）と比較してＨＬＡ－Ａ２＋ＢＣＭＡ＋Ｕ２６６（４９％）に応じて有意に（＊ｐ＜０．０５）より高いＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示した（図１９Ａ～１９Ｄ、ヒストグラム）。このＨＬＡ－Ａ２拘束かつＭＭ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ増殖は、３つのＨＬＡ－Ａ２＋個体から作製されたｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬにおいて一貫して観察された（図１９Ｅ；棒グラフ）。さらに、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ２６６に応答したＣＤ１０７ａ脱顆粒マーカー（４７．１％）を発現する、ならびにＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（３２．６％）およびパーフォリン（２９．９％）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の増大を実証したが、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞は応答しなかった（図１９Ｆ）。抗腫瘍活性における一致した結果が、ＢＣＭＡ＋ＭＭ細胞に対するＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α産生、４１ＢＢ上方制御およびＣＤ１０７ａ脱顆粒によって測定されるように、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式で、その他のＨＬＡ－Ａ２＋個体（Ｎ＝５）から作製されたｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬにおいて観察された。これらのデータは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドによるＭＭ特異的免疫応答の誘導をさらに実証する。
図１９Ａ～９Ｆでは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドを用いる反復刺激によって作製されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬを、ＢＣＭＡ＋ＭＭ細胞またはＢＣＭＡ－乳がん細胞に応答した増殖、ＣＤ１０７ａ脱顆粒、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ／パーフォリン産生、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α産生および４１ＢＢ上方制御によるその抗原特異的な、ＨＬＡ－Ａ２拘束のＣＤ８＋Ｔ細胞応答について調べた。結果は、代表的なもの（図１９Ａ～１９Ｆ）または異なる個体（Ｎ＝３）から作製したＢＣＭＡ－ＣＴＬを使用する３つの独立実験のまとめとして実証されている。
ＨＬＡ－Ａ２＋患者ＭＭ細胞に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ機能的免疫応答
ＭＭ患者のＣＤ１３８＋腫瘍細胞を、標的細胞として利用して、それぞれのヘテロクリティックペプチドを用いて作製されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬを評価した。ヘテロクリティックＢＣＭＡ５４～６２と比較して、ＢＣＭＡ７２～８０ペプチドは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒（ｈＢＣＭＡ５４～６２ＣＴＬ １３．８％対ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ ２１．５％）およびＩＬ－２産生（それぞれ、４．４％対１６．３％）（図２０Ａ）によって測定されるように、患者ＭＭ細胞に対するより頑強な抗原特異的ＣＴＬおよび抗腫瘍活性を惹起した。ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式での、ＣＤ１０７ａ脱顆粒、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ／ＩＦＮ－γ／ＴＮＦ－α上方制御（図２０Ｂ）およびパーフォリン／ＩＬ－２産生（ｎ＝３）（図２０Ｃ～２０Ｈ）を含め、患者細胞に対するより高い抗ＭＭ活性を一貫して実証した。したがって、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬにおいて検出された抗ＭＭ応答は、より高い活性化（ＣＤ６９、ＣＤ３８）および共刺激分子発現（４１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ）（図１８Ａ～１８Ｃ）と一致した。これらのデータは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０の免疫原性に関するさらなる証拠を提供し、新規ＭＭ処置におけるその潜在的な臨床適用を支持する。
図２０Ａ～２０Ｈでは、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬを、患者のＭＭ細胞に対するその機能活性について評価した。ベースライン応答（腫瘍細胞で刺激されていない）に対するＨＬＡ－Ａ２陰性またはＨＬＡ－Ａ２陽性ＭＭ患者から得たＣＤ１３８＋腫瘍細胞に応答したＢＣＭＡ－ＣＴＬの特異的活性を測定した。結果は、代表的なもの（図２０Ａ、図２０Ｂ）または異なる個体（Ｎ＝３）から作製したＢＣＭＡ特異的ＣＴＬを使用する３つの独立実験のまとめ（図２０Ｃ～２０Ｈ）として実証されている。
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬは、頑強な抗ＭＭ活性を有するＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞について濃縮される。
ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬを、四量体陽性集団内でその表現型および抗腫瘍活性についてさらに特徴付けた。四量体陽性ＣＴＬは、有意に増大したＣＤ８＋Ｔ細胞を示し、活性化（ＣＤ３８＋：四量体＋対四量体－：４９．４％対３．２％）および共刺激分子発現（ＣＤ４０Ｌ＋：３８．０％対１．２％、４１ＢＢ：２４．７％対１．９％、ＯＸ４０：４６．２％対１．７％およびＧＩＴＲ：３４．９％対１．５％）（図２１Ａ）を伴った。いくつかのＨＬＡ－Ａ２＋個体（ｎ＝３）から作製したｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、四量体陰性細胞（６％、１８％、１３％；ドナーＡ、ＢまたはＣ ＢＣＭＡ－ＣＴＬ）と比較して、四量体陽性細胞（８３％、９７％、９７％；ドナーＡ、ＢまたはＣ ＢＣＭＡ－ＣＴＬ）によってＵ２６６ ＭＭ細胞に対してより高いレベルの抗ＭＭ活性を一貫して実証した（図２１Ｂ）。ＣＤ１０７ａ陽性またはＣＤ１０７ａ陰性ＣＤ８＋ＣＴＬのいずれか内の四量体陽性細胞の頻度をさらに評価した。ＣＤ１０７ａ陰性ＣＴＬ（１％、２％、１％；ドナーＡ、ＢまたはＣ ＢＣＭＡ－ＣＴＬ）と比較して、脱顆粒ＣＤ１０７ａ陽性ＣＴＬ内の四量体＋細胞の有意に高い頻度（８２％、９８％、９８％；ドナーＡ、ＢまたはＣ）が観察された（図２１Ｃ）。したがって、これらの結果によって、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬの特異的抗ＭＭ活性が、ＣＴＬ活性化および共刺激分子の上方制御を示す、ＢＣＭＡペプチド特異的四量体陽性細胞内に含有されることが確認される。
図２１Ａ～２１Ｃでは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０認識性四量体陽性ＣＴＬまたは非認識性四量体陰性ＣＴＬを、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、４１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲの発現について解析した（図２１Ａ）。ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬ（Ｎ＝３）の抗腫瘍活性を、四量体陽性ＣＴＬまたは四量体陰性ＣＴＬサブセット内のＣＤ１０７上方制御を測定することによって（図２１Ｂ）、およびＣＤ１０７ａ陽性ＣＴＬまたはＣＤ１０７ａ陰性ＣＴＬ内の四量体陽性の状態を評価することによって（図２１Ｃ）さらに特徴付けた。
ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドは、ＭＭ特異的メモリーＣＤ８＋ＣＴＬを誘導する。
ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬ活性を特徴付けるために、実験を実施して、ベースラインと比較した、２サイクルのペプチド刺激後および４サイクルのペプチド刺激後のナイーブ：メモリーＣＴＬサブセットの組成を評価した。ベースラインでのナイーブ（ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋［ドナー１－ナイーブ：８３．０％、ＣＭ：０．４％、ドナー２－ナイーブ：８４．１％］から２サイクルのペプチド刺激後のセントラルメモリー（ＣＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）［ドナー１－ナイーブ：３７．４％、ＣＭ：３２．１％、ドナー２－ナイーブ：１９．０％、ＣＭ：４９．６％］へ、次いで、４サイクルの刺激後のエフェクターメモリー（ＥＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－）ＣＴＬ（ドナー１－ＣＭ：４４．２％、ＥＭ：５４．６％、ドナー２－ＣＭ：１８．３％、ＥＭ：７７．６％）へ進行する徐々に進行する表現型の変化を、ＣＤ８＋Ｔ細胞内で検出した（図２２Ａ）。全体的に、メモリーＣＤ８＋ＣＴＬ発生は、各ラウンド（１、２、３、４サイクル後）のヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチド刺激後に漸増し（図２２Ｂ～２２Ｃ）、ナイーブＴ細胞の対応する減少を伴った（図２２Ｄ～２２Ｅ）。したがって、これらの結果は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを用いるＴ細胞の刺激の際のメモリーＣＴＬの誘導および漸進的発生を実証する。
図２２Ａ～２２Ｅでは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ（ドナー１、ドナー２）のナイーブ：メモリー表現型を、ベースライン（ペプチド刺激なし）またはペプチド刺激の各サイクルの１週間後に解析した。表現型変化、ナイーブからメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞への分化およびメモリーＣＴＬの拡大増殖のパターンを、ＢＣＭＡペプチド刺激の各サイクル後にドットプロット（図２２Ａ）および棒グラフ（図２２Ｂ～２２Ｅ）で実証した。
セントラルメモリーｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、最大の抗ＭＭ活性を実証する
８人（Ｎ＝８）の異なるＨＬＡ－Ａ２＋個体から作製したＢＣＭＡ特異的ＣＴＬ内の特異的メモリーＴ細胞サブセットを、次いで、その抗ＭＭ活性について特徴付けた。ＣＤ４５ＲＯ－非メモリーＣＴＬと比較して、ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ２６６ ＭＭ細胞に応じて増大したＣＤ１０７ａ脱顆粒（非メモリー対メモリー：７．２５％対２８．２％）およびＨＬＡ－Ａ２＋ ＭｃＣＡＲ ＭＭ細胞（非メモリー対メモリー：４．１４％対１３．２％）を実証した（図２３Ａ；ドナーＡ ＢＣＭＡ－ＣＴＬ）。ｈＢＣＭＡ７２～８０特異的四量体＋細胞は、異なる個体から作製したＢＣＭＡ－ＣＴＬにおいてＣＭ表現型を主に、一貫して示した（四量体＋細胞内のＣＭ％－ドナーＢ：８８．２％、ドナーＣ：９７．４％、ドナーＤ：１００％）（図２３Ｂ）。ＣＭ ＣＴＬもＵ２６６ ＭＭ細胞に対するその機能活性について評価した。重要なことに、ＣＤ１０７ａ脱顆粒のレベルは、ＣＭ細胞の頻度と直接的に関連していた（ＣＤ１０７ａ＋細胞内のＣＭ％－ドナーＥ：８１．０％、ドナーＦ：８２．６％、ドナーＧ：６７．０％、ドナーＨ：４１．５％）（図２３Ｃ）。さらに、より高い抗ＭＭ活性を示す高レスポンダー（ドナーＥ、ドナーＦ）は、中レベルレスポンダー（ドナーＧ）または低レベルレスポンダー（ドナーＨ）と比較して、ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＭ ＣＴＬの頻度の増大を示した。したがって、これらの結果は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドによって作製されたＣＭサブセットによって誘導された別個のペプチド特異性および抗ＭＭ活性をさらに示す。
図２３Ａ～２３Ｃでは、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬの抗ＭＭ活性を、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＭ細胞（Ｕ２６６、ＭｃＣＡＲ；図２３Ａ）に応じたナイーブ：メモリーＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内で評価した。セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬ（Ｎ＝３）の異なるＣＴＬサブセットにおいて、四量体陽性または四量体陰性ＣＴＬサブセット内で（図２３Ｂ）およびＣＤ１０７ａ陽性またはＣＤ１０７ａ陰性ＣＴＬサブセット内で（図２３Ｃ）解析した。
ＬＡＧ３の阻害またはＯＸ４０の刺激は、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬの増殖および抗ＭＭ活性を増強する
最後に、実験を実施して、ＭＭ細胞に対して高度に応答性であるＢＣＭＡ－ＣＴＬの特異的Ｔ細胞サブセットを特徴付けた。ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットをゲートし、ＨＬＡ－Ａ２拘束かつＭＭ特異的ＣＴＬ増殖を実証し、そのナイーブ：メモリーサブセットを特徴付けた。Ｕ２６６ ＭＭ細胞に対する最も頑強な応答性および最も増殖するｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、主にＣＭサブセット内であり（ドナー１：９７．４％、ドナー２：１００％）（図２４Ａ）、これによって、抗ＭＭ活性におけるＢＣＭＡ抗原特異的ＣＴＬ内のＣＭサブセットの主要な役割が確認された。次いで、実験を実施して、これらのメモリーＴ細胞に対するチェックポイント阻害剤（抗ＬＡＧ３）または免疫アゴニスト（抗ＯＸ４０）の影響を調べた。抗ＬＡＧ３または抗ＯＸ４０のいずれかを用いて処置されたｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬは、特に、ＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ２６６ ＭＭ細胞に対する（未処置２８．２％対抗ＬＡＧ３処置３５．８％対抗ＯＸ４０処置３９．５％）、およびＨＬＡ－Ａ２＋ ＭｃＣＡＲ ＭＭ細胞に対する（未処置１３．２％対抗ＬＡＧ３処置１４．５％対抗ＯＸ４０処置２０．０％）メモリーＣＴＬによる細胞傷害活性の増強を実証した（図２４Ｂ）。興味深いことに、チェックポイント阻害剤および免疫アゴニストは、ＢＣＭＡ－ＣＴＬ内の非メモリー細胞の抗ＭＭ応答の増強を誘導しなかった。最後に、抗ＬＡＧ３および抗ＯＸ４０の有益な効果を、ｈＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬのＣＭおよびＥＭサブセット内でさらに調べた。いずれの処置も、ＥＭ細胞と比較して、抗ＬＡＧ３または抗ＯＸ４０処置に応じたより高いＣＤ１０７ａ脱顆粒によって証明される、ＢＣＭＡ特異的ＣＭ細胞に対してより大きな影響を誘導した（図２４Ｃ）。したがって、これらの結果は、ＢＣＭＡ特異的ＣＭサブセット内の抗ＭＭ活性をさらに増強する、ｈＢＣＭＡ７２～８０ペプチドによって誘導されたＣＴＬと組み合わせた抗ＬＡＧ３または抗ＯＸ４０抗体の有用性を支持する。
図２４Ａ～２４Ｃでは、Ｕ２６６細胞に応じてヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬ内でＭＭ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導する特異的サブセットを同定した（図２４Ａ）。さらに、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ＣＴＬを、メモリーＴ細胞（図２４Ｂ）またはセントラルメモリーＴ細胞サブセット（図２４Ｃ）による抗骨髄腫活性のその修飾について抗ＬＡＧ３または抗ＯＸ４０と組み合わせて評価した。
考察
同種移植後に再発している難治性ＭＭを有する患者においてでさえ、ドナーリンパ球（ＤＬＩ）の注入を用いて長く持続する応答が達成されている。ＤＬＩのこれらの早期の有望な結果は、ＭＭを処置するための能動特異的免疫療法アプローチの評価の枠組みを提供してきた。がんを標的化するワクチン、このような能動特異的免疫療法アプローチのものは、抗腫瘍活性を有する高度に有効なＣＤ８＋ＣＴＬを誘導する能力を実証した。ワクチン接種の成功は、適当な患者集団の選択、腫瘍で選択的に発現された抗原を標的化することおよび抗原特異的メモリー抗腫瘍免疫応答を有効に誘導し、維持する組合せアプローチを利用することに応じて変わる。本開示は、ＭＭならびに乳がん、膵臓がんおよび結腸がんを含む固形腫瘍において高度に過剰発現されるＸＢＰ１、ＣＤ１３８およびＣＳ１抗原に由来する免疫原性ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ２４特異的ペプチドを提供し、前臨床および臨床研究の両方においてＨＬＡ－Ａ２＋またはＨＬＡ－Ａ２４＋腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を有するペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導するその能力を実証した。さらに、レナリドミドなどの免疫調節薬を用いる、またはヒストンデアセチラーゼ６阻害剤ＡＣＹ２４１を用いるペプチド刺激／ワクチン接種の組合せ研究は、腫瘍細胞に対するペプチド特異的ＣＴＬ活性を増強した。実験は、レナリドミドまたはＡＣＹ２４１のいずれかを用いるペプチド刺激の組合せが、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を増大し、Ｔ－ｂｅｔ／Ｅｏｍｅｓなどの転写調節因子の上方制御および抗原特異的ＣＴＬ分化を、ＦＯＸＯ、ｍＴＯＲおよびＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路と連結するＡＫＴの活性化を伴うことを実証した。重要なことに、これらの効果は主に、抗原特異的ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＣＴＬに限定され、腫瘍細胞に応答したＩＦＮ－γおよびｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ産生およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の最も頑強な増大は、主に特異的ＣＭサブセット内で観察された。
有望な前臨床結果のために、ＸＢＰ１／ＣＤ１３８／ＣＳ１マルチペプチドワクチンは、くすぶり型ＭＭ（ＳＭＭ）を有する患者を処置する臨床試験において、単独およびレナリドミドと組み合わせて、ならびにトリプルネガティブ乳がんを有する患者を処置する臨床試験において抗ＰＤ１と組み合わせて評価された。ＳＭＭを有する患者では、マルチペプチドワクチンは、十分に耐容され、単剤療法として免疫原性であり、ＩＦＮ－γ産生とともに四量体＋ＣＤ８＋ＣＴＬの増強された頻度によって証明され、さらに、レナリドミドとの組合せは、四量体陽性およびＩＦＮ－γ産生を伴うＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い平均倍数の増大を誘発した。重要なことに、ペプチドワクチンによって、ＸＢＰ１／ＣＤ１３８／ＣＳ１ペプチドに対して特異的なＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＣＴＬが誘導され、レナリドミドとの組合せでさらに増強された。ＳＭＭにおいて安定疾患および応答が観察されているが、ペプチドワクチン接種によってＳＭＭから活性疾患までの無増悪期間が延長され得るか否かを評価するには無作為化試験が必要である。
ＭＭ特異的免疫療法を、ＸＢＰ１／ＣＤ１３８／ＣＳ１抗原を超えて拡大するために、本開示はまた、新たに診断されたＭＭ患者（Ｎ＝６１６）からＣＤ１３８＋腫瘍細胞上のさらなる腫瘍関連抗原を同定した。ここで、本開示は、正常および悪性形質細胞上で選択的に発現されたＢＣＭＡおよびＭＭにおけるいくつかの現在の免疫処置の標的を標的化する免疫療法戦略の同定および特徴付けを提供する。実施例は、高度に免疫原性の操作されたＢＣＭＡ特異的ナノペプチド、その天然ＢＣＭＡペプチドから高度に改善されたＨＬＡ－Ａ２親和性／安定性を有するヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））およびＢＣＭＡ５４～６２（ＹＩＬＷＴＣＬＧＬ（配列番号１４））を提供する。これらのペプチドは、ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬ、ＢＣＭＡ特異的四量体＋細胞の増大、ＣＤ１０７脱顆粒の増強、Ｔｈ１型サイトカイン（ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α）産生およびＭＭ細胞への増殖をＨＬＡ－Ａ２拘束様式で惹起する。最も重要なことに、ＢＣＭＡ特異的メモリーＣＤ８＋ＣＴＬ、ＣＭおよびＥＭ細胞の両方の増大は、自己再生およびＭＭ細胞に対する応答の能力とともに、ＭＭにおける新規ワクチン接種および／または免疫療法アプローチにおけるヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドの可能性を強力に支持する。実際、本開示は、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０ペプチドワクチン接種、ＢＣＭＡ特異的ＣＭ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの回収および拡大増殖、これらのＣＭ細胞の養子免疫療法としての再注入、次いで、ＭＭ患者を有効に処置するためのその持続性を保証するためにその後に必要とされるようなＢＣＭＡペプチドを用いるワクチン接種を有する臨床プロトコールを提供する。
ＢＣＭＡ特異的メモリーＣＤ８＋ＣＴＬは、共刺激および免疫抑制の両方のためのＴ細胞機能を調節する重要な分子を発現することが観察されている。共刺激性および免疫チェックポイント分子の最高の誘導が、ＭＭに対する高度に有効な多機能活性を実証した集団である、ｈＢＣＭＡ７２～８０ペプチド特異的ＣＴＬ内のＣＭサブセットで検出された。重要なことに、これらの知見は、ＢＣＭＡ－ＣＴＬのチェックポイント阻害剤または免疫アゴニストとの併用療法の、その機能的抗ＭＭ活性を増強する可能性を示した。ＰＤ－１チェックポイント阻害剤を免疫調節薬レナリドミドもしくはポマリドミドと、または毒性が研究を短縮させたＡｂダラツムマブと組み合わせる場合の最近の関心事を考えると、これは、特に関連性があり得る。ここで、実施例は、代替阻害性受容体およびＭＭ腫瘍微小環境内の抑制機序を標的化するように試みた。特に、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）は、ＣＴＬＡおよびＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１後に臨床において標的化されるべき第３の阻害性受容体であり、ＢＣＭＡ特異的ＣＭ ＣＴＬで発現された。並行して、免疫アゴニスト、特に、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）を標的化する共刺激性腫瘍壊死因子受容体が、抗腫瘍免疫応答の増強におけるその治療有用性についてかなり注目されおり、これらの中でも、抗ＯＸ４０ ｍＡｂが、いくつかの前臨床研究においてエフェクターＴ細胞拡大増殖および機能的抗腫瘍活性をブーストすることによる腫瘍退縮の誘導において有望な有効性を最近実証した。重要なことに、臨床等級抗ＬＡＧ３および抗ＯＸ４０（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹによって提供された）を使用して、ＭＭ細胞に対するヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０特異的ＣＴＬの機能活性を評価した。ｅｘ ｖｉｖｏ実験によって、抗ＬＡＧ３および抗ＯＸ４０の両方とも、非メモリーＣＴＬの活性に影響を及ぼすことなく、ＭＭ細胞に対するＢＣＭＡ－ＣＴＬ内のメモリーＣＴＬの機能活性を特異的に増大することが実証された。複数のＨＬＡ－Ａ２＋個体のＴ細胞から作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬに対する影響は、抗ＯＸ４０を用いる処置後に、抗ＬＡＧ３よりも大きく、ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬ内のＥＭサブセットに対してＣＭで大きかった。これらの研究は、ＢＣＭＡペプチド特異的免疫療法の、免疫アゴニストまたはチェックポイント阻害剤との科学的情報に基づいた組合せ臨床試験の枠組みを提供する。
要約すると、これらの実験は、ＭＭ細胞に対する機能的抗腫瘍活性を有する抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導可能である、新規免疫原性ＨＬＡ－Ａ２特異的操作ＢＣＭＡペプチドを同定し、検証した。これらの結果は、ワクチンとしての、および／または自己抗原特異的メモリーＣＴＬの拡大増殖のための刺激としてのＭＭ患者におけるこれらの高度に免疫原性のヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドの治療適用の枠組みを提供する。それらは、ＢＣＭＡ誘導性抗ＭＭ応答を増強するための、ＢＣＭＡペプチドワクチンまたはＢＣＭＡ特異的養子Ｔ細胞免疫療法を、抗ＯＸ４０および／または抗ＬＡＧ３とともに組み込む組合せの潜在的有用性をさらに支持する。
（実施例１３ ＴＡＣＩ特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発するためのＨＬＡ－Ａ２特異的免疫原性ＴＡＣＩペプチド）
実験を実施して、新規免疫原性操作ヘテロクリティック（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｃｔｉｃ）ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））ペプチドが、ＭＭに対する頑強な多機能性免疫応答を有する抗原特異的メモリーＣＤ８＋ＣＴＬを誘導できることを実証した。この実施例におけるこれらの結果は、ＭＭ患者におけるヘテロクリティックＴＡＣＩペプチドの治療適用の枠組みを提供し、骨髄腫またはＴＡＣＩを発現するその他の疾患を有する患者を処置するための、ＴＡＣＩペプチド特異的ワクチンまたはＴＡＣＩペプチド特異的養子Ｔ細胞免疫療法の治療適用を支持する。
実施例において以下の材料および方法を使用した。
材料および方法
細胞系
ＨＬＡ－Ａ２＋（Ｕ２６６およびＭｃＣＡＲ）およびＨＬＡ－Ａ２－（ＯＰＭ２およびＲＰＭＩ）ＭＭ細胞系は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｔ２細胞系、ＨＬＡ－Ａ２を発現するヒトＢおよびＴ細胞ハイブリッドは、Ｄｒ． Ｊ． Ｍｏｌｌｄｒｅｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍ． Ｄ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって提供された。細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加補充した、ＤＭＥＭ（ＭＭおよびＴ２細胞用；Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）培地で培養した。
試薬
蛍光色素がコンジュゲートしている抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色キットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から入手し、ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮ－αおよびＴＮＦ－αは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ＴＡＣＩペプチド特異的四量体－ＰＥは、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）によって合成された。
合成ペプチド
天然ＴＡＣＩペプチド［ＴＡＣＩ１７８～１８６（ＦＬＶＡＶＡＣＦＬ（配列番号７））、ＴＡＣＩ１７４～１８２（ＶＬＣＣＦＬＶＡＶ（配列番号８））、ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＫＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号９））、ＴＡＣＩ１６６～１７４（ＴＬＧＬＣＬＣＡＶ（配列番号１０））、ＴＡＣＩ１６１～１６９（ＡＬＶＹＳＴＬＧＬ（配列番号１１））、ＴＡＣＩ１５５～１６３（ＬＳＡＤＱＶＡＬＶ（配列番号１２））］、ヘテロクリティックＴＡＣＩペプチド［ＴＡＣＩ１７８～１８６（ＹＬＶＡＶＡＣＦＬ（配列番号１５））、ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））、ＴＡＣＩ１６６～１７４（ＹＬＧＬＣＬＣＡＶ（配列番号１７））］およびＨＩＶ－Ｇａｇ７７～８５（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号２１））ペプチド（ＨＬＡ－Ａ２特異的陽性対照ペプチド）は、標準ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチル－オキシカルボニル）化学によって合成され、逆相クロマトグラフィーを使用して＞９５％に精製され、分子量の質量分析によって検証された（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）。
ＨＬＡ－Ａ２親和性および安定性アッセイ
Ｔ２細胞を、種々の濃度のペプチドおよびβ２－ミクログロブリン（３μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて一晩パルスした。一晩インキュベートした後、細胞をＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ ｍＡｂを用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ）を使用して解析した。ペプチド／ＨＬＡ－Ａ２複合体結合の安定性は、ブレフェルジンＡ処置の０、２、４、６および１４時間後、それに続くＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ ｍＡｂを用いる染色およびフローサイトメトリー解析により、ペプチドが負荷されたＴ２細胞で測定した。
樹状細胞の作製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された単球を、１０％ ＦＣＳを追加補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１，０００ユニット／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１，０００ユニット／ｍｌのＩＬ－４の存在下で７日間培養した。培養物に新鮮培地およびＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を１日おきに添加した。成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、７日目に得られ、１，０００ユニット／ｍｌのＩＦＮ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αとともにさらに３日インキュベートを続けた。
ＴＡＣＩペプチド特異的ＣＴＬの誘導
ＴＡＣＩペプチド特異的ＣＴＬ（ＴＡＣＩ－ＣＴＬ）を、ペプチドがパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を有するＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから得られた濃縮ＣＤ３＋Ｔ細胞の反復刺激によってｅｘ ｖｉｖｏで作製した。手短には、ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）がパルスされたＡＰＣを照射し（１０Ｇｙ）、これを使用して、１：２０のＡＰＣ／ペプチド対Ｔ細胞比でＴ細胞を刺激した。Ｔ細胞培養物を７日毎に再刺激し、ＩＬ－２（５０ユニット／ｍｌ）の存在下、１０％ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を追加補充したＡＩＭ－Ｖ培地中で維持した。
ＴＡＣＩペプチド特異的ＣＴＬまたは刺激性腫瘍細胞の表現型解析
ＭＭ標的細胞で表現型特徴付けを実施して、ＴＡＣＩ発現を適合させた。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色キットおよび蛍光色素がコンジュゲートしている抗ヒトｍＡｂを用いる染色後に、ＴＡＣＩ－ＣＴＬで表現型特徴付けを実施した。染色後、細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒド中で固定し、フローサイトメトリーによって解析した。
カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）トラッキングによる細胞増殖
ＴＡＣＩ－ＣＴＬを、ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて標識し、ＩＬ－２（１０ユニット／ｍｌ）の存在下で照射された（１０Ｇｙ）ＭＭ細胞またはペプチドがパルスされたＡＰＣとともに同時インキュベートした。同時培養の４、５、６または８日目に、細胞を回収し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色キットならびにＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７に対して特異的な蛍光色素がコンジュゲートしている抗ヒトｍＡｂを用いて染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬ増殖のレベルは、フローサイトメトリーによって測定されるようなＣＦＳＥ蛍光強度の低減として決定した。
ＣＤ１０７ａ脱顆粒および細胞内ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－αサイトカイン産生
ＴＡＣＩ－ＣＴＬの機能的細胞溶解活性は、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ脱顆粒（細胞毒性）およびＴｈ１サイトカインの産生によって測定した。手短には、ＴＡＣＩ－ＣＴＬを、ＣＤ１０７ａ ｍＡｂの存在下で腫瘍細胞またはＴ２／ペプチドとともに同時インキュベートした。１時間後、ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ ｍＡｂ、ブレフェルジンＡおよびＭｏｎｅｎｓｉｎ（ＢＤ）をさらに５時間のインキュベーションの間、添加した。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、重要なＴ細胞マーカーに対する、蛍光色素がコンジュゲートしているｍＡｂとともにインキュベートした。表面染色後、細胞を固定し／透過処理し、抗ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α ｍＡｂを用いて染色し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ）を用いて洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって解析した。
統計解析
結果を平均±ＳＥとして示す。群を、独立スチューデントｔ検定を使用して比較した。相違は、ｐ＜０．０５である場合に有意と考えた。
結果
ＨＬＡ－Ａ２分子に対する最高の結合親和性および安定性を有するヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドの同定
ＢＩＭＡＳおよびＮｅｔＣＴＬを含む種々の検索ソフトウェアプログラムを使用して、全長ＴＡＣＩタンパク質配列を評価して、ＨＬＡ－Ａ２親和性、延長された半減時間解離速度、プロテアソームＣ末端切断およびＴＡＰ輸送を有するエピトープを予測した。選択された６種の天然ペプチド［ＴＡＣＩ１７８～１８６（ＦＬＶＡＶＡＣＦＬ（配列番号７））、ＴＡＣＩ１７４～１８２（ＶＬＣＣＦＬＶＡＶ（配列番号８））、ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＫＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号９））、ＴＡＣＩ１６６～１７４（ＴＬＧＬＣＬＣＡＶ（配列番号１０））、ＴＡＣＩ１６１～１６９（ＡＬＶＹＳＴＬＧＬ（配列番号１１））、ＴＡＣＩ１５５～１６３（ＬＳＡＤＱＶＡＬＶ（配列番号１２））］の中で、ＴＡＣＩ１６１～１６９を除くすべてのペプチドが、ＨＬＡ－Ａ２特異性を示したが、最高レベルの親和性は、ＴＡＣＩ１６６～１７４によって検出された。ＨＬＡ－Ａ２分子に対するペプチドの結合および安定性を改善するために、ＴＡＣＩ１７８～１８６（ＹＬＶＡＶＡＣＦＬ（配列番号１５））、ＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））およびＴＡＣＩ１６６～１７４（ＹＬＧＬＣＬＣＡＶ（配列番号１７））ペプチドを含む３種のヘテロクリティックペプチドを設計し、合成し、そのＨＬＡ－Ａ２親和性を評価した。ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドは、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのペプチド用量で、その天然形態から大きく増強された親和性を示した。ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドのＨＬＡ－Ａ２親和性は、ＨＬＡ－Ａ２特異的陽性対照ペプチドとして働くＨＩＶ－Ｇａｇ７７～８５（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号２１））の親和性と同様であった。しかし、操作されたヘテロクリティックＴＡＣＩ１７８～１８６およびＴＡＣＩ１６６～１７４ペプチドは、その天然ペプチドと比較してＨＬＡ－Ａ２親和性において有意な改善を示さなかった。選択されたＴＡＣＩペプチド（５０μｇ／ｍｌ）を、ＨＬＡ－Ａ２分子に対するその親和性および安定性についてさらに評価した。その天然ペプチドと比較して、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２を用いた場合に、最高のＨＬＡ－Ａ２結合親和性（時間＝０）および安定性（２、４、６および１８時間）が見られた。全体的に、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２のＨＬＡ－Ａ２親和性安定性は、種々の時点でＨＬＡ－Ａ２陽性対照ＨＩＶ－Ｇａｇ７７～８５ペプチドと同様であった。調べたＴＡＣＩペプチドの間での最高レベルのＨＬＡ－Ａ２親和性および安定性に基づいて、ＭＭに対する抗原特異的エフェクターＴ細胞を誘導するその免疫原性の可能性のさらなる評価のために、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２を選択した。
ナイーブＣＤ８＋細胞から分化した抗原特異的メモリーＣＤ８＋細胞の発生および拡大増殖による、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチド特異的ＣＴＬの抗腫瘍活性。
ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））を用いる、ＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから得た濃縮ＣＤ３＋Ｔ細胞の毎週刺激後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型変化を、ナイーブ：メモリーサブセット内で評価した。ベースライン［ペプチド刺激の前］で、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分（８４．１％）は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋）細胞サブセットと見られた。ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドを用いる刺激の際、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチド特異的ＣＴＬ（ｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬ）内でのナイーブＣＴＬのセントラルメモリーＣＴＬ（ＣＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋／ＣＤ３＋ＣＤ８＋）への、次いで、エフェクターメモリーＣＴＬ（ＥＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－／ＣＤ３＋ＣＤ８＋）への漸進的分化が観察された。メモリーＣＴＬの発生は、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドを用いる３サイクルのペプチド刺激後［ナイーブ：２．２％、ＣＭ：４７．８％、ＥＭ：５２．４％］に検出された。さらなる分化は、ナイーブＣＴＬからメモリーＣＴＬサブセットへ４サイクルのペプチド刺激後に［ナイーブ：０．７２％、ＣＭ：２４．４％、ＥＭ：７４．１％］および５サイクルの刺激後に［ナイーブ：０．５７％、ＣＭ：７．３６％、ＥＭ：６９．７％］観察され（図２９Ａ）、ペプチドのメモリーＴ細胞を発生させる可能性を支持した。さらなるＨＬＡ－Ａ２＋ドナー（Ｎ＝３）から得たＴ細胞において、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドの免疫原性をさらに評価した（図２９Ｂ）。ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドを用いる刺激後に、ナイーブＣＤ８＋ＣＴＬの漸減およびメモリーＣＤ８＋ＣＴＬ（セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＣＴＬの両方）の増大が、試験したすべての個体のＴ細胞において検証された。したがって、これらの結果から、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドの、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を発生させる能力が確認される。
次いで、実験を実施して、骨髄腫細胞に応答したヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬの免疫機能能力を評価した。ＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ２６６ ＭＭ細胞との同時培養の際のヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチド特異的ＣＴＬにおいて、特に、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＣＴＬサブセットを含むメモリーＣＴＬにおいて、ＣＤ８＋ＣＴＬの増殖を検出した。より多くのサイクルのＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチド刺激後に、ＴＡＣＩ－ＣＴＬの増殖能は、増大し続けた［第２の刺激：増殖ＣＭ－３８．１％、増殖ＥＭ－１９．２％；第３の刺激：増殖ＣＭ－５４．４％、増殖ＥＭ－８５．２％；第４の刺激：増殖ＣＭ－６４．４％、増殖ＥＭ－８６．９％］（図２９Ｃ）。したがって、これらの結果は、骨髄腫細胞に応答したメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の発生および持続的拡大増殖によってヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチド特異的ＣＴＬの免疫機能をさらに支持する。
ＨＬＡ－Ａ２拘束様式での多機能性およびＴｈ１特異的抗骨髄腫活性を実証する、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２特異的ＣＴＬにおけるＴＡＣＩ特異的四量体＋ＣＴＬの増殖。
骨髄腫細胞に対するその多機能免疫応答についてｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬの機能活性を調べた。ｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭｃＣＡＲ ＭＭ細胞に対するＨＬＡ－Ａ２拘束の脱顆粒（ＣＤ１０７ａ上方制御）を実証し、これは、ＨＬＡ－Ａ２－ＲＰＭＩ（８．２４％）または培地単独（５．０３％）と比較して、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性と直接的に関連している（図３０Ａ）。さらに、ｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２－ＲＰＭＩ（ＩＦＮ－γ ８．２６％、ＴＮＦ－α ７．８０％、ＩＬ－２ ６．４２％）または培地単独（ＩＦＮ－γ ５．７６％、ＴＮＦ－α ５．５２％、ＩＬ－２ ６．２４％）と比較して、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭｃＣＡＲに応じたＴｈ１型のサイトカイン、ＩＦＮ－γ（１５．０％）、ＴＮＦ－α（１７．５％）およびＩＬ－２（１４．９％）のより高い産生を実証した。ＭＨＣミスマッチＨＬＡ－Ａ２－ＭＭ細胞（ＲＰＭＩ）と比較して、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生によって測定されるような特異的抗ＭＭ活性が、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＭ細胞（ＭｃＣＡＲ）に対して異なるＨＬＡ－Ａ２＋個体（Ｎ＝５）から作製されたｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬにおいて一貫して観察された（図３０Ｂ、３Ｃ）。ヘテロクリティックｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬのＨＬＡ－Ａ２特異的抗ＭＭ活性を確認するために、実験を実施して、ＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６およびＨＬＡ－２－ＯＰＭ２細胞を含むさらなる骨髄腫細胞系に対するその免疫機能活性を評価した。ＨＬＡ－Ａ２＋ドナー１（図３１Ａ）ならびに合計５人の異なるＨＬＡ－Ａ２＋個体（図３１Ｂ～３１Ｅ）から作製されたｈＴＡＣＩ１５４～１６２－ＣＴＬにおいて、骨髄腫細胞に対して同一パターンのＨＬＡ－Ａ２拘束の機能的抗腫瘍活性が観察された。さらに、ＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチド特異的四量体＋ＣＴＬについて陽性染色されたｈＴＡＣＩ１５４～１６２ＣＴＬおよびこれらの四量体＋細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６骨髄腫細胞に応答した高レベルのＣＤ１０７ａ脱顆粒および増殖を実証した（図３１Ｆ）。したがって、これらの結果は、ＭＭ細胞に対して多機能活性（細胞毒性、Ｔｈ－１型サイトカイン産生）を有する抗原特異的ＣＴＬを惹起する、ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２ペプチドのＨＬＡ－Ａ２拘束の免疫原性を実証し、これは、骨髄腫患者における免疫原性ヘテロクリティックＴＡＣＩ１５４～１６２（ＹＬＳＡＤＱＶＡＬ（配列番号１６））ペプチドの潜在的治療適用を支持する。
（実施例１４ ＢＣＭＡヘテロクリティックペプチドが封入されたナノ粒子は、多発性骨髄腫に対する抗原刺激能および腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を増強する）
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーおよびＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の結合のための受容体および増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）は、ＭＭの有望な治療標的である。ＢＣＭＡはＭＭ細胞および形質細胞上で制限された発現パターンを有し、ＭＭ細胞成長、生存および薬物耐性の促進において役割を有している。
本開示は、ＭＭ患者において抗腫瘍応答を有効に惹起し、増大するトランスレーショナルリサーチの有望な領域として、ＢＣＭＡを標的化するナノ医療ベースの治療薬を同定した。いくつかのナノ医療が利用可能であり、より進歩したナノ粒子構築物が抗原封入の開発下にある。この目的のために、この実施例は、ＢＣＭＡに対して特異的な新規操作ペプチドを提供し、不十分なペプチド安定性、酵素分解に対する感受性ならびに低い抗原取り込みおよび送達を含む、遊離ペプチドワクチンの制限を克服するために、ヘテロクリティックＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドが封入されたナノ粒子をベースとするがんワクチンを使用した。さらに、より持続した抗原放出および増大したバイオアベイラビリティおよび免疫原性ペプチドの提示を有する、ＭＭ患者においてより頑強なＢＣＭＡ特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を誘導するために、ナノ技術をベースとするがんワクチンを開発した。ここで、実験を実施して、ＭＭを有する患者を処置するための、ＢＣＭＡ抗原に対して特異的な新規ナノ医療ベースの治療的送達系の可能性を調べた。この実施例の目的は、機能的抗骨髄腫活性を有するＢＣＭＡ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを効率的に惹起する、最適なナノ粒子によって封入されたＢＣＭＡ抗原構築物を設計することであった。
結果は、種々の抗原放出動態を有するナノ粒子［リポソームまたはポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）］が、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドを抗原提示細胞に効果的に送達し、抗ＭＭ活性を有するＢＣＭＡ抗原特異的ＣＴＬを惹起するその能力を実証したことを示す。ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドが封入されたナノ粒子は、遊離ペプチドよりも、ヒト樹状細胞によるより高い取り込みを実証し、最高の取り込みは、リポソームをベースとするナノ粒子を用いて媒介された。対照的に、ＰＬＧＡベースのナノ粒子を用いて誘導されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬは、ＭＭ細胞に対して最高の機能活性および特異的免疫応答を実証した。重要なことに、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドナノ粒子によって誘導されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬは、遊離ＢＣＭＡペプチドまたはリポソーム／ＢＣＭＡペプチドナノ粒子を用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬよりも、ＭＭ患者の腫瘍細胞およびＭＭ細胞系に応じたより大きなＣＤ１０７ａ脱顆粒、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ増殖およびＴｈ－１型サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α）産生を示した。ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡナノ粒子によって作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬ内のＣＤ２８共刺激分子上方制御、四量体＋ＣＴＬ産生およびペプチド特異的応答もまた、遊離ＢＣＭＡペプチドまたはリポソーム／ＢＣＭＡペプチドナノ粒子を用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬよりも大きかった。さらに、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡナノ粒子は、抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のより頑強な誘導を引き起こし、これは、ＢＣＭＡ－ＣＴＬ内の非メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞よりも、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生によって証明される有意に高い抗腫瘍活性を実証した。ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドによる抗腫瘍活性を有するセントラルメモリーＣＴＬの誘導は、最適ペプチド放出動態および増強された免疫原性と関連していた。
したがって、これらの結果は、ヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドが封入されたナノ粒子戦略が、樹状細胞への、続いて、Ｔ細胞へのペプチド送達を増強し、それによって、ＭＭに対して多機能活性を有するＢＣＭＡ特異的セントラルメモリーＣＴＬを誘導することを実証する。
これらの結果はまた、ＭＭに対するＢＣＭＡペプチド特異的治療薬の免疫原性を増強する封入されたヘテロクリティックＢＣＭＡペプチドを使用するナノ技術の有用性を実証する。重要なことに、観察結果は、ＢＣＭＡ特異的メモリーＴ細胞免疫応答を増強し、現在のペプチドベースのがんワクチンおよび養子免疫療法の制限を克服し、ＭＭにおける患者の転帰を改善するためのＰＬＧＡナノ粒子ベースのヘテロクリティックＢＣＭＡペプチド送達の治療適用の枠組みを提供する。
この実施例において、以下の方法および材料を使用した。
材料および方法
材料
ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ、分子量２３，０００、コポリマー比５０：５０）は、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入した。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、平均分子量３０，０００～７０，０００）、トリフルオロ酢酸、アセトニトリル、リポ多糖類およびＬ－１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培地は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
ＢＣＭＡペプチドが負荷されたＰＬＧＡ－ＮＰの製剤化および特徴付け。
免疫原性ヘテロクリティックｈＢＣＭＡ７２～８０（ＹＬＭＦＬＬＲＫＩ（配列番号１３））ペプチドを使用して、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の作製のためのＢＣＭＡ抗原特異的ナノ粒子調製物を製造した。二重エマルジョン溶媒技術を使用して、ＰＬＧＡ－ＮＰを有するｈＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを製剤化し、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）とともにエマルジョンを安定化した。ＰＬＧＡ－ＮＰを有するヘテロクリティックｈＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを、実質的にこれまでに記載されたように製剤化した（Ｓａｈｏｏ ＳＫ， ｅｔ ａｌ． ２００４）。手短には、ＰＬＧＡ（５０：５０ラクチド対グリコリド比）およびペプチドまたはブランクＰＬＧＡ自体をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で乳化し、混合物を２％ＰＶＡに再懸濁して、油および水エマルジョンを形成した。乳化プロセスは、アイスバケット中、５５ワットで１０分間マイクロチッププローブ超音波装置を使用して完了した。エマルジョンを室温で３時間撹拌して、ＤＣＭの蒸発およびＰＬＧＡ－ＮＰの形成を可能にした。４℃で３０分間の３０，０００ｒｐｍでの超遠心分離によってペプチドが負荷されたＰＬＧＡ－ＮＰを回収して、ＰＶＡおよび遊離ペプチドを枯渇させ、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。ＰＬＧＡ－ＮＰ構造を評価するために、ナノ粒子製剤を２４時間凍結乾燥し、走査型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４８００ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩＬ）を使用して可視化した。
ＢＣＭＡペプチドが負荷されたリポソーム－ＮＰの製剤化および特徴付け
薄膜湿潤化法（ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ＢＣＭＡペプチドが負荷されたリポソーム－ＮＰを合成した。コレステロール（ＭＷ＝３８６．６５４）、ＤＯＰＣ（ＭＷ＝７８６．１１３）およびＤＯＴＡＰ（ＭＷ＝６９８．５４２）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）の混合物を用いてリポソーム脂質二重層を製造した。手短には、３ｍＭコレステロール、５ｍＭ ＤＯＰＣおよび５ｍＭ ＤＯＴＡＰの混合物から１ｍｌのストック溶液を、クロロホルム中で調製した。ロータリーエバポレーター（ＲＶ １０、ＩＫＡ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）を使用して溶媒を蒸発させると、フラスコの底に薄い脂質膜が得られた。脂質膜を一晩真空乾燥に付して、あらゆる残存する有機溶媒を除去した。翌日、リン酸ナトリウム（二塩基性；ｐＨ１１）緩衝液および１％ ＤＭＳＯに溶解したｈＢＣＭＡ７２～８０ペプチドを使用して脂質膜を湿潤化させ、１０回の凍結－解凍サイクル（－８０℃および３７℃）と、それに続く氷上での１分間のプローブ音波処理を使用して、所望の範囲に粒径を低減した。超遠心分離によってペプチドが負荷されたリポソーム－ＮＰを回収し、ＰＢＳに再懸濁した。湿潤化ステップを除く同一手順に従ってブランクリポソームを調製し、これでは、いかなるペプチドも伴わない１％ＤＭＳＯを含む二塩基緩衝液を使用した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、ＢＣＭＡペプチドが負荷されたリポソーム－ＮＰの表面形態学を特徴付けた。陰性染色として酢酸ウラニル（２％）を使用し、ＴＥＭ（ＪＥＭ－１０００、ＪＥＯＬ、東京、日本）を使用してＢＣＭＡペプチドが負荷されたリポソーム－ＮＰを可視化した。
ＰＬＧＡ－ＮＰまたはリポソーム－ＮＰにおけるＢＣＭＡペプチド封入
ＰＬＧＡ－ＮＰまたはリポソーム－ＮＰでのペプチド封入のレベルを、製造業者によって示唆されたプロトコールによって定量的蛍光定量的ペプチドアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。手短には、等量の、懸濁物のＢＣＭＡペプチド、ＰＬＧＡ－ＮＰに負荷されたＢＣＭＡペプチド（１０μｌ）またはリポソーム－ＮＰに負荷されたＢＣＭＡペプチド（１０μｌ）を、９６ウェルの蛍光に適合するマイクロプレートに３連でロードした。陰性対照としてブランクＰＬＧＡまたはブランクリポソームを使用した。次いで、各ウェルに１：１アセトニトリル：ＤＭＳＯの溶液（７０μｌ）およびＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ（商標）ＤＭＥＭ（２０μｌ）を添加し、暗所、室温で５分間インキュベートした。アセトニトリル：ＤＭＳＯ溶液を対照として使用し、バックグラウンド蛍光を測定した。インキュベーション後、３９０ｎｍ／４７５ｎｍでＥｘ／Ｅｍで分光光度計を使用して蛍光を測定した。線形フィットで作製された標準曲線（０～１，０００μｇ／ｍｌ）に基づいてペプチド濃度を決定した。
単球由来樹状細胞の作製
単球由来樹状細胞（ＤＣ）を実質的にこれまでに記載されたように作製した（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｂａｅ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。手短には、ＨＬＡ－Ａ２＋正常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された単球を、１０％ＦＣＳを追加補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１，０００Ｕ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－４の存在下で７日間培養した。サイトカインを含有する新鮮培地を１日おきに置き換える。未熟樹状細胞を、取り込み研究のために７日目に培養物から集めた。成熟ＤＣは、７日目に未熟樹状細胞作製の際に、１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ中の新鮮なＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４とともに、１，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αを添加し、次いで、さらに３日間インキュベートすることによって得た。未熟または成熟ＤＣのいずれかを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。
樹状細胞によるＢＣＭＡペプチドが封入されたナノ粒子の結合および取り込み
未熟ヒト樹状細胞（ｉｍｍＤＣ）を回収し、洗浄し、血清不含培地に再懸濁し（１×１０６個細胞／ｍｌ）、最終で５×１０５個細胞／ウェルの濃度で４８ウェルＴＣプレートのウェルに分注した。細胞を、３μｇ／ｍｌのヒトβ２ミクログロブリンの存在下で５０ｕｇ／ｍｌのＢＣＭＡペプチド－ＦＩＴＣペプチドまたはＢＣＭＡペプチド－ＦＩＴＣが封入されたナノ粒子を用いてパルスし、次いで、３７℃でインキュベートした。ｉｍｍＤＣのペプチド負荷を、フローサイトメトリーによって時間依存的に評価した（０、３０分、１時間、２時間、６時間、１８時間）。さらに、ＢＣＭＡペプチド－ＦＩＴＣ取り込みを、２時間のペプチドパルス後に樹状細胞上で共焦点顕微鏡法（Ｎｉｋｏｎ ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；東京、日本）によって画像化した。インキュベーション後、ＩｍｍＤＣを洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を用いて固定し、３００ｎＭのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色して、細胞核を同定した。
新規に診断された多発性骨髄腫患者からの初代ＣＤ１３８＋腫瘍細胞の単離。
適当なインフォームドコンセント後に、ＲｏｂｏＳｅｐ（登録商標）ＣＤ１３８陽性免疫磁気選択技術（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、初代ＣＤ１３８＋細胞を、ＨＬＡ－Ａ２＋およびＨＬＡ－Ａ２－両方の新規に診断された多発性骨髄腫患者から得た骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）から単離した。
ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬの作製。
ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＴＬ（ＢＣＭＡ－ＣＴＬ）を、（１）ＨＬＡ－Ａ２特異的ＢＣＭＡ免疫原性ペプチド（５０ｕｇ／ｍｌ）、（２）ペプチドを含まないブランクナノ粒子（ＰＬＧＡまたはリポソーム）または（３）ＢＣＭＡペプチド（５０ｕｇ／ｍｌ）が封入されたナノ粒子（ＰＬＧＡ／ペプチドまたはリポソーム／ペプチド）を用いる、ＨＬＡ－Ａ２＋正常ドナーから単離された末梢血単核細胞の反復刺激によってｅｘ ｖｉｖｏで作製した。ＰＢＭＣを１０％ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を追加補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、合計４または５サイクルの間適当なＢＣＭＡペプチドを用いて毎週パルスした。第２の刺激の２日後にＴ細胞培養物にＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）を添加した。
ＢＣＭＡペプチドが封入されたナノ粒子刺激によって作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬの表現型特徴付け。
ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを、ナイーブ：メモリー細胞発生およびＣＤ２８共刺激分子の発現についてフローサイトメトリーによって評価した。さらに、ＢＣＭＡペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬをＢＣＭＡペプチド特異的四量体－ＰＥを用いて染色することによって培養物内で評価した。３７℃で３０分間の四量体染色後、細胞を洗浄し、ＣＤ８－ＦＩＴＣおよびＣＤ２８－ＡＰＣ ｍＡｂを用いて染色した。染色後、細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターを使用して獲得し、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡ（商標）ｖ８．０（ＢＤ）またはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．０．７（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）ソフトウェアを使用して解析した。ＢＣＭＡ－ＣＴＬをゲート化された総ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内の特異的メモリー（セントラルメモリー、エフェクターメモリー）／非メモリー集団の存在／頻度について解析した。
ＢＣＭＡペプチドが封入されたナノ粒子を用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬの抗骨髄腫特異的機能活性の評価。
（１）ＢＣＭＡ免疫原性ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）、（２）ペプチドを含まないブランクナノ粒子または（３）ＢＣＭＡペプチド（５０μｇ／ｍｌ）ＰＧＬＡ／ペプチドまたはリポソーム／ペプチドナノ粒子を用いて作製されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬ（Ｎ＝３）を、ＨＬＡ－Ａ２＋およびＨＬＡ－Ａ２－骨髄腫細胞系の両方または初代ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対するその増殖応答および抗腫瘍活性について評価した。手短には、ＢＣＭＡ抗原特異的ＣＴＬ（５×１０５個細胞）増殖を、ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）標識されたＣＴＬの、照射された（１０Ｇｙ）骨髄腫細胞との同時培養によって測定した。ＣＦＳＥアッセイの３、４、５または６日目に、細胞を回収し、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－ａｑｕａおよび蛍光色素がコンジュゲートしている抗ＣＤ３および抗ＣＤ８ ｍＡｂを用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した。骨髄腫細胞系または初代ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に応答した、ＢＣＭＡ－ＣＴＬ機能的ＣＤ１０７ａ脱顆粒（細胞毒性）およびＴｈ１ ＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－αサイトカイン産生を解析した。手短には、それぞれのＢＣＭＡ－ＣＴＬ（５×１０５個細胞）を、蛍光色素がコンジュゲートしている抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂの存在下で標的細胞とともに同時インキュベートした。１時間同時培養した後、ブレフェルジンＡおよびＭｏｎｅｎｓｉｎ（ＢＤ）のカクテルを添加し、さらに５時間インキュベートした。次いで、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－ａｑｕａおよび種々の細胞表面抗原に対して特異的な蛍光色素がコンジュゲートしているｍＡｂを用いて細胞を染色し、固定し、透過処理し、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＴＮＦ－αに対して特異的なｍＡｂを用いて細胞内染色した。最後に、細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターを使用して獲得し、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡ（商標）ｖ８．０またはＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．０．７ソフトウェアを使用して解析した。
結果
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄における悪性形質細胞のクローン性増殖および蓄積、血清および／または尿における単クローン性タンパク質ならびに骨溶性骨病変の発生を特徴とするＢ細胞悪性疾患である。新規治療薬を使用する処置における最近の進歩にもかかわらず、ＭＭは不治のままである。前臨床研究は、抗骨髄腫ＣＤ８＋ＣＴＬは、ＸＢＰ１、ＣＤ１３８およびＣＳ１を含む種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的化する免疫原性ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２４ペプチドを用いて作製され得ることを示している。さらに、これらのペプチドを用いるワクチン接種は、臨床試験に検出されたように、ＭＭ特異的免疫応答を生成できる。これらの抗原を超えて骨髄腫において抗原特異的免疫療法および養子免疫療法の幅および程度を拡大するために、本開示は、新規に診断されたＭＭ患者（Ｎ＝６１６）から得た腫瘍細胞上のさらなるＴＡＡを提供する。ここで、本開示は、ＢＣＭＡに特異的な新規ヘテロクリティックペプチド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）の結合のための受容体を提供する。ＢＣＭＡ抗原は、ＭＭ細胞成長の促進、生存および薬物耐性におけるその決定的な役割とともに、ＭＭ細胞および形質細胞上でのその制限された発現パターンのために、現在、抗体、免疫毒素およびＣＡＲ Ｔを用いて標的化されているが、好都合な治療指数を有するより有効な骨髄腫特異的エフェクター細胞を誘導可能な新規送達系を設計する必要が依然として大いにある。患者において骨髄微小環境へのＢＣＭＡペプチド送達を促進し、抗腫瘍免疫応答を増大するために、ペプチド安定性、取り込みおよび送達を増大することによって酵素分解からのＢＣＭＡペプチドの潜在的な保護を提供し、遊離ペプチドワクチンの制限を克服するナノ粒子を使用するアプローチを設計した。ナノ技術をベースとするがんワクチンの目的は、持続する抗原放出および免疫原性ペプチドの提示による、より長いより良好なＴ細胞刺激によって、ＭＭ患者においてより頑強なＢＣＭＡ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ免疫応答および抗腫瘍活性を誘発することであった。実験を実施して、ＢＣＭＡペプチドを封入している２種の異なる種類のナノ粒子、ＰＬＧＡおよびリポソームを評価した。ペプチド単独またはリポソーム／ペプチドと比較して、ＰＬＧＡ／ペプチドは、抗原特異的メモリーＣＴＬ誘導と関連している最大の抗腫瘍活性を有するＢＣＭＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を惹起する。これらの結果は、骨髄腫においてＢＣＭＡペプチド特異的抗腫瘍活性を効率的に誘導し、患者の転帰を改善するために、生物分解性および生体適合性を有する、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認められたヒト使用のために承認されているＰＬＧＡナノビヒクルを使用する治療用ワクチン接種および／または養子免疫療法戦略の枠組みを提供する。
ＢＣＭＡペプチドが封入されたナノ粒子の特徴付けおよび定量化
二重エマルジョン溶媒技術は、ＰＬＧＡ ＮＰを製剤化し、エマルジョンを安定化するために最もよく使用される方法である。動的光散乱を使用する大きさおよびゼータ電位測定のために、凍結乾燥粒子を蒸留水に再懸濁した。ブランクＰＬＧＡは、３０９．０±４．０ｎｍ（ｎ＝３）の大きさを示し、一方で、ペプチドが負荷されたＰＬＧＡ－ＮＰは大きさはより小さく（２５７．７±１１．５ｎｍ、ｎ＝３）、これは、ＰＬＧＡポリマーおよびペプチド間の相互作用に起因し得る。ブランクおよびＰＬＧＡ－ＮＰ両方のゼータ電位は、－０．０６～－１．１ｍＶであった。ＰＬＧＡ－ＮＰの多分散指数（ＰＤＩ）は≦０．２であり、均一な大きさ分布を示す。ブランクＰＬＧＡまたはＢＣＭＡペプチドが封入されたＰＬＧＡ－ＮＰを、金／パラジウムを用いてスパッタコーティングし、５０×で２０ｋＶ未満で走査型電子顕微鏡を使用して画像化して、均一な大きさ分布をさらに示した（図３２Ａ）。並行して、脂質ＤＯＴＡＰを使用してリポソーム製剤を合成し、ＢＣＭＡペプチドとの相互作用を可能にした。リポソームに負荷されたＢＣＭＡペプチドナノ粒子は、大きさがおよそ１７２±０．７ｄ．ｎｍ（直径、ナノメートル）（ｎ＝３）であり、０．２のＰＤＩを示し、均一な大きさ分布を示した（図３２Ｂ）。酢酸ウラシルを用いる陰性染色を使用して、ＴＥＭを使用してペプチドが負荷されたリポソームを可視化し、これもまた、均一な大きさ分布を示した。両ＮＰ調製物のペプチド負荷および封入効率を、３９０ｎｍ／４７５ｎｍでＥｘ／Ｅｍで測定した蛍光に基づいて定量的蛍光定量的ペプチドアッセイを使用して評価した。負荷されたペプチドの初期量を上回る、ＰＬＧＡ－ＮＰまたはリポソーム－ＮＰ中に負荷されたペプチドのパーセンテージを示すペプチド封入効率（％）は、ＰＬＧＡを用いた場合５１％±１．１５％（ｎ＝３）またはリポソームを用いた場合４９％±１．３２％（ｎ＝３）であった（図３２Ｃ）。ブランクＰＬＧＡおよびブランクリポソームは、予測されたようにゼロペプチド負荷を有していた。ペプチド封入の確認／正規化後、ＰＬＧＡ／ペプチドおよびリポソーム／ペプチドＮＰを、ＢＣＭＡ抗原供給源として使用して抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製した。
樹状細胞によるＢＣＭＡが封入されたナノ粒子の取り込み。
ＢＣＭＡペプチド取り込みを、ＨＬＡ－Ａ２＋ドナーの単球から作製したＩｍｍＤＣを使用して評価した。各ＢＣＭＡ－ナノ粒子の種類またはペプチド単独によるＩｍｍＤＣに対するペプチド負荷効率を、フローサイトメトリーによって経時的に測定した。ペプチド単独と比較して、ＢＣＭＡが封入されたナノ粒子を用いた場合に、より高い効率のＩｍｍＤＣペプチド負荷が検出された。評価された２種のナノ粒子の中で、リポソーム／ペプチドは、ＰＬＧＡ／ペプチドと比較して、高レベルのペプチド負荷（１００％取り込み、３０分）をより迅速に示し、継時的に維持した（図３３Ａ）。対照的に、ＰＬＧＡ／ペプチドは、経時的にペプチド負荷の漸増を示し、１時間で検出され（担体なし／ペプチド、ＰＬＧＡ／ペプチド対リポソーム／ペプチド：１０±４％、２２±４％対１００±０％）、６時間で増大し（担体なし／ペプチド、ＰＬＧＡ／ペプチド対リポソーム／ペプチド：４２±４％、５９±２％対１００±０％）、１８時間でピークに達した（担体なし／ペプチド、ＰＬＧＡ／ペプチド対リポソーム／ペプチド：５５±８％、８３±５％対１００±０％）（図３３Ｂ）。１８時間パルス後に、ＩｍｍＤＣによるＰＬＧＡ／ペプチドの負荷効率を、共焦点顕微鏡によってさらに評価した。ペプチド単独と比較して、ＰＬＧＡ／ペプチドを用いた場合により高いＩｍｍＤＣ ＢＣＭＡペプチド負荷が見られ（図３３Ｃ）、ＰＬＧＡ／ペプチド製剤が、ＢＣＭＡペプチド送達を増強することが確認された。さらなる評価は、フローサイトメトリーによって測定されるように、時間依存的なＰＬＧＡ／ペプチドによるＩｍｍＤＣペプチド負荷の改善を実証した（担体なし／ペプチド対ＰＬＧＡ／ペプチド：０時間パルス（ベースライン）－４％対３％、２時間パルス－２２％対３６％、４時間パルス－２８％対４６％、６時間パルス－４３％対６２％）（図３３Ｄ）。さらに、抗原提示細胞としてＴ２細胞を使用して、同一パターンの時間依存的なＡＰＣペプチド負荷の改善が検出された（担体なし／ペプチド対ＰＬＧＡ／ペプチド：３０分パルス－１％対４％、２時間パルス－８％対１１％、２４時間パルス－１３％対４１％）（図３３Ｅ）。２種の抗原提示細胞の種類の間で、初代ＩｍｍＤＣは、Ｔ２細胞よりも高い効率のペプチド取り込みを示した。したがって、これらの結果は、抗原提示細胞によるＢＣＭＡペプチド負荷を増強するＰＧＬＡ／ペプチドまたはリポソーム／ペプチド両方の有益な効果を実証する。
ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬは、多発性骨髄腫細胞に対して最高の機能的免疫応答を示す。
ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬを、第４の刺激の１週間後にその腫瘍特異的活性について、ＨＬＡ－Ａ２＋ＢＣＭＡ＋（Ｕ２６６、ＭｃＣＡＲ）またはＨＬＡ－Ａ２－ＢＣＭＡ＋（ＲＰＭＩ）骨髄腫細胞のいずれかとのインキュベーション後に評価した。（１）ＢＣＭＡペプチド自体、（２）ＰＬＧＡ／ペプチドまたは（３）リポソーム／ペプチドによって作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬの代表的なフローサイトメトリー解析は、ＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６骨髄腫細胞に対して、ＣＤ１０７ａ脱顆粒（図３４Ａ）、ＩＦＮ－γ産生（図３４Ｂ）、ＩＬ－２産生（図３４Ｃ）およびＴＮＦ－α産生（図３４Ｄ）を含むＨＬＡ－Ａ２拘束の抗骨髄腫活性を実証したが、ＨＬＡ－Ａ２－ＲＰＭＩ骨髄腫細胞に対しては実証しなかった。ナノ粒子によって作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬの中で、ＰＬＧＡ／ペプチドは、リポソーム／ＢＣＭＡペプチドによって誘導されたＣＴＬよりも高いレベルの抗腫瘍活性［ＣＤ１０７ａ上方制御およびＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α産生］によって証明される優れた抗原特異的ＣＴＬを誘導した。さらなる解析によって、さらなるＨＬＡ－Ａ２＋ドナー（ｎ＝３）から作製されたＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２＋ＢＣＭＡ＋Ｕ２６６およびＨＬＡ－Ａ２＋ＢＣＭＡ＋（ｌｏｗ）ＭｃＣＡＲに応じて最高の抗骨髄腫活性を示すが、ＭＨＣミスマッチＨＬＡ－Ａ２－ＢＣＭＡ＋ＲＰＭＩ骨髄腫細胞にはそうではないことが確認された（図３４Ｅ）。比較して、リポソーム／ペプチド－ＣＴＬは、ＢＣＭＡペプチド－ＣＴＬと比較してわずかに高いレベルの抗ＭＭ活性を有していたが、両方ともＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬよりも低かった。したがって、これらの結果は、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式での多発性骨髄腫細胞に対する多機能ＣＴＬの効率的な誘導をもたらす、ＰＬＧＡ封入の際のＢＣＭＡペプチドの免疫原性の増強を示す。
骨髄腫患者から得た初代ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対するＰＬＧＡによって封入されたＢＣＭＡペプチド刺激を用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる最高の抗ＭＭ活性。
ＮＰ封入を伴って、または伴わずに作製されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬの骨髄腫特異的機能活性を、ＨＬＡ－Ａ２＋またはＨＬＡ－Ａ２－骨髄腫患者から得た初代ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対してさらに評価した。ＢＣＭＡペプチド単独、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドまたはリポソーム／ＢＣＭＡペプチドを用いる刺激によって作製した３種の異なるエフェクター細胞は、エフェクター細胞の間で最小バックグラウンドレベルの（ｐｆ）ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ－γ／ＩＬ－２／ＴＮＦ－α産生をすべて示した（図３５Ａ）。エフェクターＣＴＬの中では、ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬが、初代ＨＬＡ－Ａ２＋ＣＤ１３８＋（ＭＭ患者１）腫瘍細胞に対して最高の抗ＭＭ活性を実証した［ＢＣＭＡペプチド－ＣＴＬ対ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬ対リポソーム／ペプチド－ＣＴＬ：ＣＤ１０７ａ＋ＣＴＬ－１５．０％対３１．７％対１６．２％、ＩＦＮ－γ＋ＣＴＬ－１．９％対７．４％対３．７％、ＩＬ－２＋ＣＴＬ－１４．３％対３２．３％対１７．９％、ＴＮＦ－α＋ＣＴＬ－１６．４％対３６．８％対１９．１％］（図３５Ｂ）。ＤＣによる最高のペプチド取り込みを有するにもかかわらず、リポソーム／ペプチド－ＣＴＬの抗ＭＭ活性は、初代ＨＬＡ－Ａ２＋ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対するＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬよりも小さかった。同様のパターンの機能的抗ＭＭ活性が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＭＭ患者２番から得た初代ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対するエフェクターＣＴＬにおいて検出され、ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬが最高の活性を有していた（図３５Ｃ）。対照的に、種々のＢＣＭＡ－ＣＴＬのうち、ＨＬＡ－Ａ２－ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を有していたものはなく、それによって、ＨＬＡ－Ａ２拘束の免疫応答が実証された（図３５Ｄ）。総合すると、これらの結果は、初代ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞に対してＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチド－ＣＴＬを用いた場合に、ＨＬＡ－Ａ２拘束様式で最高レベルの抗骨髄腫活性が見られることを示す。結果はまた、ＰＬＧＡ中のペプチド封入の際のＢＣＭＡ特異的ＣＴＬの作製による抗腫瘍活性の増大の可能性を強調する。
ＰＬＧＡ封入を用いて作製されたＢＣＭＡ－ＣＴＬによる、ＣＤ２８共刺激分子発現およびペプチド特異的Ｔ細胞増殖の増大。
ＰＬＧＡによって媒介されるＢＣＭＡ特異的ＣＴＬにおける高い抗腫瘍活性の機序をより良好に理解するために、実験を実施して、ＣＤ８＋Ｔ細胞での共刺激分子の発現およびＢＣＭＡペプチド特異的四量体＋ＣＴＬを評価した。ＢＣＭＡペプチド－ＣＴＬと比較して、ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬは、ＣＤ８＋Ｔ細胞での上方制御されたＣＤ２８＋＋発現を有する細胞の独特のサブセットを実証した（ペプチド－ＣＴＬ対ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬ：１５．６％対３２．０％；図３６Ａ上のパネル）。さらに、ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬは、ＢＣＭＡペプチドＣＴＬと比較して、ＢＣＭＡ四量体＋ペプチド特異的ＣＴＬについてより高い割合を含有していた（ペプチド－ＣＴＬ対ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬ：１６．５％対３５．０％；図３６Ａ下のパネル）。さらに、四量体陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、四量体陽性内でより高い頻度の明るいＣＤ２８＋＋細胞が検出された。ＰＬＧＡ／ペプチド四量体＋ＣＴＬは、ＢＣＭＡペプチド四量体＋ＣＴＬよりも高い頻度のＣＤ２８＋＋の明るい細胞を示した（５１．８％対３０．３％）。したがって、これらの結果は、ＰＬＧＡ／ペプチドによって誘導されたＣＴＬが、明るいＣＤ２８＋＋ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬの独特の集団を有するＢＣＭＡ特異的四量体＋細胞のより大きな割合を有することを実証する。次いで、実験を実施して、ＡＰＣによって提示されたその同族ＢＭＣＡペプチドの認識の際の、ＢＣＭＡペプチドＣＴＬおよびＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬの増殖を実証した。ＢＣＭＡペプチドＣＴＬおよびＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬの両方とも、非ＢＣＭＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のベースライン増殖（３日目、４日目対５日目：０％、１％対４％）と比較して、その同族ＢＣＭＡペプチドの認識の際の、時間依存的な増殖の増大を実証した（３日目、４日目対５日目：１１％、１８％対３３％）。重要なことに、すべての時点でＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬにおいて早期に増殖が生じ（３日目、４日目対５日目：２５％、４５％対６９％）（図３６Ｂ）、同族ＢＣＭＡペプチドを認識し、それに応答する能力の増大を示した。最後に、同族ＢＣＭＡペプチドに応じて生じたＴｈ１サイトカイン産生を、各エフェクター細胞集団において測定した。ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬは、ＢＣＭＡペプチドＣＴＬ（２日間のインキュベーション－３１．５％、４日間のインキュベーション－４２．１％）と比較して、より高いレベルのＩＦＮ－γ産生を有していた（２日間のインキュベーション－３３．８％、４日間のインキュベーション－６０．６％）（図３６Ｃ）。したがって、これらの結果は、ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＴＬに応じたペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答、増殖およびＩＦＮ－γ産生の増強を実証し、ＰＬＧＡ／ペプチド封入が、より高い抗腫瘍活性を有するＣＴＬを作製するＢＣＭＡペプチドの免疫原性を増大し得ることを示す。
ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドを用いる刺激に応じた抗骨髄腫活性の増強と関連する、メモリーＣＤ８＋ＣＴＬの有効な作製。
実験をさらに実施して、ＰＬＧＡ／ペプチド、ブランクＰＬＧＡ（対照）およびペプチド単独によって誘導されたＣＴＬのメモリー細胞発生および免疫機能活性を特徴付け、比較した。ＣＦＳＥアッセイでは、ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬは、評価したすべての時点で、ＢＣＭＡペプチド－ＣＴＬ（４日目：１２．２０％、６日目：２９．２０％）よりも（４日目：２８．９０％、６日目：４４．７０％）によってＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６細胞に応じてより高い増殖を示した（図３７Ａ）。ビヒクルとしてＰＬＧＡ自体を用いて刺激したエフェクター細胞は、４日間および６回の同時培養で最小増殖（７％未満）を示した。さらに、培地対照では増殖は見られず、ＣＴＬ増殖が、骨髄腫細胞に対して特異的であったという証拠を提供する。次いで、実験を実施して、ＢＣＭＡペプチドＣＴＬおよびＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬ内でのメモリー細胞発生を特徴付けた。全体として、各ラウンドのペプチド刺激後にＣＴＬメモリー細胞発生の漸増が観察された：総ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＣＴＬは、ＢＣＭＡペプチド（第３の刺激：１５．３％、第４の刺激：１９．５％、第５の刺激：７９．０％）と比較して、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチド刺激後に高かった（第３の刺激：２０．７％、第４の刺激：３２．８％、第５の刺激：９３．５％）（図３７Ｂ）。ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬおよびＢＣＭＡペプチドＣＴＬにおけるこのパターンのメモリー細胞発生は、２サイクルのペプチド刺激後または４サイクルのペプチド刺激後に残っていた（図３７Ｃ）。実験を同様に実施し、ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬおよびＢＣＭＡペプチドＣＴＬにおいて特異的セントラルおよびエフェクターメモリーサブセット発生を特徴付けた。総ＣＤ４５ＲＯ＋メモリー発生と一致して、セントラルメモリー（ＣＭ）およびエフェクターメモリー（ＥＭ）両方のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットは、１サイクルの刺激後に漸増し（ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＭ５．３％、ＥＭ８．１％、ペプチド－ＣＭ２．９％、ＥＭ５．７％）、３サイクルの刺激後にさらに増大した（ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＭ１４．８％、ＥＭ１３．２％、ペプチド－ＣＭ１２．４％、ＥＭ１１．０％）。５サイクルのペプチド刺激後に、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリー細胞の集団の発生において大きな相違が観察された（ＰＬＧＡ／ペプチド－ＣＭ４２．４％、ＥＭ３２．６％、ペプチド－ＣＭ３．５％、ＥＭ９５．４％）。さらに、ＰＬＧＡ／ペプチドＣＴＬは、最高の抗腫瘍活性を有する、エフェクターメモリー細胞へのさらなる分化を伴わないより高い割合のセントラルメモリーＴ細胞を維持した（図３７Ｄ）。
ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドによる有効な抗骨髄腫活性と関連する、セントラルメモリーＣＤ８＋ＣＴＬの維持。
各メモリーＣＴＬサブセット内で特異的抗ＭＭ活性をさらに調べた。ここで、ＰＬＧＡ／ペプチドまたはＢＣＭＡペプチドを用いる刺激によって異なるＨＬＡ－Ａ２＋個体から作製されたＢＣＭＡ特異的ＣＴＬのＨＬＡ－Ａ２拘束の抗骨髄腫活性が確認された。ＰＬＧＡ／ペプチドによって誘導されたＣＴＬにおいて、ＨＬＡ－Ａ２＋Ｕ２６６骨髄腫細胞に応答した最高の免疫機能活性（ＣＤ１０７ａ上方制御およびＴｈ１型サイトカイン産生）が一貫して見られた（図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ）。重要なことに、ＣＤ１０７ａ脱顆粒（図３８Ａ、３８Ｃ）、ＩＦＮ－γ産生（図３８Ｂ、３８Ｃ）およびＩＬ－２／ＴＮＦ－α産生（図３８Ｃ）によって示されるように、エフェクターメモリーサブセットと比較して、最高の抗ＭＭ活性がセントラルメモリー内で見られた。したがって、これらは、ＰＬＧＡによって封入されたＢＣＭＡペプチドは、ＰＬＧＡ／ペプチドＢＣＭＡ抗原特異的ＣＴＬ内でのセントラルメモリー細胞の発生および維持によって証明される、ＢＣＭＡペプチドよりも頑強な腫瘍特異的ＣＴＬ応答を誘導することを示す。
これらの結果は、骨髄腫において新規ワクチン接種および／または養子免疫療法処置プロトコールにおいて抗腫瘍活性を有する有効なＢＣＭＡ ＣＴＬを誘導するための、ＰＬＧＡ／ＢＣＭＡペプチドの使用を支持する。
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであって、制限するものではないことが理解されるべきである。その他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (30)

  1. 配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、９～３０アミノ酸長であり、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的応答を増大する、ペプチド。
  2. 配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる第１のアミノ酸配列と、前記第１のアミノ酸配列に対して異種である第２のアミノ酸配列とを含むペプチドであって、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的応答を増大する、ペプチド。
  3. 前記第１のアミノ酸配列に対して異種である前記第２のアミノ酸配列が、（ｉ）精製タグ、（ｉｉ）検出マーカー、（ｉｉｉ）免疫グロブリン分子、もしくは、重鎖定常領域を含む、前記免疫グロブリン分子の一部分、（ｉｖ）治療薬もしくは免疫刺激性ポリペプチド、（ｖ）担体、あるいは、（ｖｉ）輸送配列を含む、請求項２に記載のペプチド。
  4. 請求項１または２に記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  5. さらに薬剤を含む請求項４に記載の医薬組成物であって、ここで、前記薬剤が、免疫刺激剤、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、ｔｏｌｌ様受容体－３リガンド、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である、医薬組成物。
  6. ナノ粒子、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、および、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  7. 前記ペプチドが前記ナノ粒子中に封入される、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 請求項６または７に記載の医薬組成物であって、
    （ｉ）前記ナノ粒子が生分解性ポリマーを含む；
    （ｉｉ）前記ナノ粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む；
    （ｉｉｉ）前記ナノ粒子が、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）コポリマーを含む；または
    （ｉｖ）前記ナノ粒子がリポソームである、
    医薬組成物。
  9. 前記ナノ粒子が、
    （ｉ）アジュバント、
    （ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、および／または
    （ｉｉｉ）免疫アゴニスト、チェックポイント阻害剤、レナリドミドまたはそれらの任意の組合せ
    を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ポリヌクレオチドが、プロモーター、調節エレメントまたは発現制御配列に作動可能に連結される、ベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクターを含む培養細胞。
  13. 免疫細胞である、請求項１２に記載の培養細胞。
  14. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸を含むウイルス。
  15. 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む第１のペプチド、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む第２のペプチド、および、薬学的に許容される担体を含み、前記第１および第２のペプチドが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的応答を増大する、医薬組成物。
  16. 前記医薬組成物がさらに免疫アゴニストを含み、前記免疫アゴニストが抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. ＢＣＭＡを発現するがん細胞に対する免疫応答をがんを有するヒト被験体において誘導するための、請求項４から９、１５および１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１７に記載の医薬組成物であって、
    （ｉ）前記がんが血液がんである；
    （ｉｉ）前記がんが多発性骨髄腫である；
    （ｉｉｉ）前記ＢＣＭＡを発現するがん細胞が、がん性形質細胞である；または
    （ｉｖ）前記ＢＣＭＡを発現するがん細胞が、同一の前記被験体における非がん性形質細胞よりも少なくとも２０％多いＢＣＭＡの平均レベルを有する、
    医薬組成物。
  19. ヒト被験体においてがんまたは前悪性疾患を処置するための、請求項４から９、１５および１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 前記医薬組成物は、がんを処置するためのものであり、前記がんは、血液がん、多発性骨髄腫、白血病、または、リンパ腫である、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記医薬組成物が、前悪性疾患を処置するためのものであり、前記前悪性疾患が、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）またはくすぶり型多発性骨髄腫である、請求項１９に記載の医薬組成物。
  22. 前記医薬組成物が、化学療法または放射線療法と組み合わせて前記ヒト被験体に投与されることを特徴とする、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 前記医薬組成物が、免疫アゴニストと組み合わせて前記ヒト被験体に投与されることを特徴とする、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 前記免疫アゴニストが、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. ヒト被験体において癌を処置するための、請求項６から９のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物が、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）と組み合わせて前記ヒト被験体に投与されることを特徴とする、医薬組成物。
  26. 前記ＢＣＭＡ特異的ＣＴＬが、１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドをパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることによって作製される、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作製する、および／または増殖させるｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、前記方法は、
    １つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドでパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞と接触させることを含み、
    前記ペプチドは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的応答を増大する、方法。
  28. 請求項２７に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、ここで、前記細胞傷害性Ｔ細胞が、エフェクターメモリー細胞を含み、前記抗原提示細胞が樹状細胞である、方法。
  29. ヒト被験体においてがんまたは前悪性疾患を処置するための組成物であって、前記組成物は、ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を含み、ここで、前記ＢＣＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、前記ヒト被験体に由来する１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞を、配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドでパルスした１つまたは複数の抗原提示細胞とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることによって、作製される、および／または増殖し、前記ペプチドは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的応答を増大する、組成物。
  30. ＨＬＡ－Ａ２分子に結合する、請求項１に記載のペプチド。
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