TWI624475B - 對於ｔｈ１細胞之ｃｄｃａ１抗原決定位胜肽及含此之疫苗 - Google Patents

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Abstract

於此揭示具有Th1細胞誘導能力之單離的的自CDCA1衍生的抗原決定位胜肽。此種胜肽可藉由MHC第II類分子辨識並誘導Th1細胞。於較佳具體例中，此種本發明之胜肽可混雜地(promiscuously)結合於MHC第II類分子並且除了誘導Th1細胞更誘導CDCA1專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)。因此此種胜肽適用於增強一對象中之免疫反應，因而於癌免疫療法中，特別是作為癌疫苗提供效用。於此也揭示編碼為任意上述胜肽的聚核苷酸、由此種胜肽所誘導的APC與Th1細胞，及與其相關的誘導方法。包含任意上述成分作為有效成分的醫藥組合物，提供效用於癌症或腫瘤之治療及/或預防，此癌症或腫瘤包括例如乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及頭頸癌(HNC)。

Description

對於TH1細胞之CDCA1抗原決定位胜肽及含此之疫苗
本發明係關於生物科學領域，更具體而言，係關於癌症治療的領域。尤其，本發明係關於新穎的胜肽，其作為癌症疫苗與治療或預防腫瘤、或治療及預防腫瘤的藥物極為有效。
優先權
本申請案基於2012年7月10日提申的美國臨時申請案號61/669,971主張優惠，其完整內容引入於此作為參考。
已有人證明CD8陽性細胞毒性T淋巴球(CTL)會辨識在主要組織相容性複合體(MHC)第I類分子上發現之衍生自腫瘤關聯抗原(TAA)的抗原決定基胜肽，且之後殺死該腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原(MAGE)家族為TAA的第一例以來，已主要利用免疫學方法發現了許多其他的TAA(非專利文獻1、2)。此等TAA當中有些正當做免疫療法的標靶進行臨床開發當中。
對於癌細胞的增殖與存活不可欠缺之TAA對於做為免疫療法之標靶是有利的，由於使用此種TAA能降低在治 療所驅使的免疫選擇當中由於TAA的刪除、突變或下調所造成的癌細胞的免疫逃脫的風險到最小。因此，能夠誘導有效及專一性抗腫瘤免疫反應的新TAA之鑑別確保進一步的發展。所以對於許多類型癌症的胜肽疫苗策略的臨床應用正在進行著(非專利文獻3~10)。到目前，已有數個使用這些TAA相關抗原衍生胜肽的臨床試驗的報告。不幸地，到目前為止，這些癌症疫苗試驗僅產生目前已於這些癌症疫苗試驗被觀察到的低目標反應率(非專利文獻11至13)。因此，於本技術領域中，仍需要適合作為免疫治療的標靶之新的TAA。
CDCA1，也已知為細胞分裂週期相關1(cell division cycle associated 1)，被確認為與細胞週期基因共表現之基因之一種(class)的一成員，而細胞週期基因，例如CDC2、細胞週期素(cyclin)、拓樸異構酶(tmopoisomerase)II與其他(非專利文獻14)。特別地，CDCA1被發現與有絲分裂之HeLa細胞的中心粒(centromere)相關，且因此其被視為酵母菌Nuf2之功能性同系物(functional homologue)(非專利文獻15)。
此外，經由基因表現分佈分析使用包含23,040基因之基因組寬cDNA微陣列(非專利文獻16)，也確認CDCA1為一於乳癌(專利文獻1)、膀胱癌(專利文獻2)、食道癌(專利文獻3)、小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)(專利文獻4)中被向上調控之新分子，此揭露之內容引入於此作為參考。CDCA1之表現被特別向上調控於小細胞肺癌、非小細胞肺癌與腫瘤細胞株，然而除睪丸外於23個正常組織中並無偵測到其表現。 此外，於CDCA1表現之肺癌細胞株中，藉由siRNA向下調控CDCA1已顯示導致細胞生長抑制(專利文獻4)。
綜上所述，這些資料建議CDCA1為一新、潛在普遍的致癌抗原(oncoantigen)。因此衍生自CDCA1之抗原決定位胜肽可應用於對於癌症寬組合(wide-array)治療之癌症免疫治療。
最近，已鑑別出能夠從肺癌病患的PBMC誘導腫瘤反應性及HLA-A2(A*02：01)-限制CTL的高免疫原性CDCA1-衍生細胞毒性T淋巴球(CTL)-抗原決定位(非專利文獻17，專利文獻6)。又，也已鑑別出CDCA1-衍生之HLA-A24-限制CTL-抗原決定位(專利文獻7)。所以，CDCA1維持為可應用於癌症免疫療法的一具吸引力的標靶分子。
腫瘤專一性CD4+輔助T(Th)細胞，特別是T-輔助1型(Th1)細胞，在有效率地誘導CTL媒介之抗腫瘤免疫性方面扮演關鍵性角色(非專利文獻18)。主要由Th1細胞產生的IFN-γ，對於誘導及維持長期CTL反應係關鍵性的，其介由對於保持免疫記憶為關鍵性之多重交互作用提供幫助(非專利文獻19,20)。Th1細胞所分泌的IFN-γ，也媒介直接的抗腫瘤或抗血管生成作用(非專利文獻21)。又，據顯示Th細胞必須鋪路以供CTL進入腫瘤部位(非專利文獻22)。所以，能夠活化專一性Th1細胞的腫瘤關連抗原(TAA)-衍生的Th細胞抗原決定位的鑑別，對於在罹患腫瘤的主體誘導有效的腫瘤免疫是重要；理想上，設計有效的疫苗應包括多個抗原決定位，以刺激CTL與Th1細胞兩者(非專利文獻23)。但是，目前尚未鑑別出衍生 自CDCA1的此種抗原決定位。
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於本發明之上下文，本案發明人考慮一種理想的供癌免疫療法的胜肽疫苗係包括針對CTL與Th1細胞兩者的抗原決定位的單一胜肽，此兩者的抗原決定位在天然上係彼此靠近(Kenter GG et al.N Engl J Med 2009；361：1838-47.)。
為此，本案發明人設計一策略以鑑別一新穎的CDCA1衍生的Th1細胞的抗原決定位，其係由混雜的HLA第II類分子之背景中辨識且含有CTL抗原決定位，並假設所辨識之抗原決定位會誘導更有效率之經T細胞媒介之腫瘤免疫性。使用了預測HLA第II類結合胜肽與已知由經HLA-A24(A*24：02)或A2限制之CTL辨識之CTL抗原決定位序列的電腦演算法，來選擇候選的含有CTL抗原決定位之混雜的HLA-第II類限制Th1細胞抗原決定位。
本發明至少部分係基於發現作為誘導Th1細胞反應之免疫療法的標靶的適合抗原決定位胜肽。體認到CDCA1基因在一些癌症類型中係向上調控，包括乳癌、膀胱癌、非小 細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、食道癌及頭頸癌(HNC)，本發明目標為進一步分析此細胞分裂周期關聯蛋白1(CDCA1)基因之基因產物，特別是由GenBank存取編號NM_145697(序列識別號：9)之基因編碼陳列於之序列識別號：10中的多胜肽。在進一步的研究中特別選擇含有會誘導專一於對應分子之Th1細胞的抗原決定位胜肽的CDCA1基因產物。例如，將從健康捐贈者獲得之周邊血液單核細胞(PBMC)使用衍生自人類CDCA1的混雜的HLA-DR及/或DP結合胜肽予以刺激。建立辨識經以各別的候選胜肽脈衝的HLA-DR或DP陽性目標細胞的Th1細胞，並且鑑別可誘導對抗CDCA1之有效及專一性免疫反應之經HLA-DR及/或DP限制之抗原決定位胜肽。此等結果證明CDCA1有強力的免疫原性，且其抗原決定位對於經由Th1細胞反應媒介的腫瘤免疫療法有效。更進一步的研究顯示含有至少一種CTL抗原決定位之混雜的HLA-DR及/或DP結合胜肽也會在同一捐贈者以CDCA1專一性的方式刺激CTL反應。此等結果確認CDCA1係強力免疫原性，且含有Th1細胞與CTL抗原決定位兩者之其抗原決定位，對於經由Th1細胞與CTL反應媒介之腫瘤免疫療法係有效。
因此本發明之一目的係提供具有Th1細胞誘導能力及選自序列識別號：1與2之胺基酸序列的胜肽。本發明思考修飾之胜肽，即具有Th1誘導能力且長度至多30個胺基酸且具有選自序列識別號：10(CDCA1)之胺基酸序列之連續胺基酸序列的胜肽，及其功能上均等物。或者，本發明提供一具有Th1細胞CTL兩者的誘導能力的胜肽。於一些具體例，本發明 之胜肽回應於序列識別號：1或2之胺基酸序列或其經修飾的版本，其中，有2個或更多的胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成而仍維持誘導Th1細胞的能力。
當本胜肽對於一對象投予時，本發明胜肽較佳係呈現在一或多種抗原呈現細胞的表面上，而誘導Th1細胞。當本發明之胜肽更含有至少一CTL抗原決定位，此APC也會處理此胜肽以呈現從此胜肽產生之CTL抗原決定位，因而誘導靶向於各胜肽之CTL。因此，本發明之另一目的為提供呈現任一本發明之胜肽或其片段的抗原呈現細胞，並提供誘導抗原呈現細胞之方法。
投予一或更多本發明之胜肽或編碼為此種胜肽之聚核苷酸，或呈現此種胜肽或其片段之抗原呈現細胞，會因而誘導強力的抗腫瘤免疫反應。因此本發明之又另一目的為提供一種醫藥藥劑或組合物，其包含作為有效成分如以下成分中之一或更多種：(a)一或多種本發明之胜肽、(b)一或多種編碼為此種胜肽之聚核苷酸，及(c)一或多種本發明之抗原呈現細胞。如此之本發明之醫藥藥劑或組合物，特別作為疫苗有用。
本發明另一目的為提供癌症(即腫瘤)之治療及/或預防(亦即(避免)及/或避免其術後再復發之方法。也考慮用於誘導Th1細胞或用於誘導抗腫瘤免疫性之方法，包括投予一或多種本發明之胜肽、聚核苷酸、抗原呈現細胞、或醫藥藥劑或組合物的步驟。再者，本發明之Th1細胞，也發現有用於作為對抗癌症之疫苗，例子包括但不限於乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。
本發明特別考慮之目的的例子包括以下各項：
[1]一種單離的胜肽，其長度為10-30個胺基酸且包含序列識別號：10的一部分胺基酸序列，其中該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一連續的胺基酸序列，其具有選自於序列識別號：1或2之胺基酸序列中的長於9個胺基酸；及(b)一胺基酸序列，其中於(a)之胺基酸序列中有一個、二個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加，該胜肽有誘導T輔助1型(Th1)細胞的能力。
[2]如[1]之單離的胜肽，其中，該胜肽或其片段有結合於至少2種MHC第II類分子的能力。
[3]如[2]之單離的胜肽，其中，該MHC第II類分子選自於由HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組。
[4]如[1]至[3]中任一項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含具有CDCA1專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力之胜肽的胺基酸序列。
[5]如[4]之單離的胜肽，其中，該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一胺基酸序列，其選自於序列識別號：1及2構成之群組；及(b)一胺基酸序列，其中於(a)之胺基酸序列中有一個、二個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加。
[6]一種單離的聚核苷酸，其編碼為如[1]至[5]中任一項 之胜肽。
[7]一種組合物，係用於誘導選自於由以下構成之群組中至少一種細胞：(i)Th1細胞(ii)CTL(iii)有能力誘導Th1細胞之抗原呈現細胞(APC)，及(iv)有能力誘導CTL之APC；其中該組合物包含一或多種如[1]至[5]中任一項之胜肽，或一或多種編碼為此等胜肽的聚核苷酸。
[8]一種醫藥組合物，包含選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分：(a)一或多種如[1]至[5]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[6]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合；且此組合物被配製為供選自於由下列構成之群組中之用途：(i)癌治療(ii)癌預防(iii)預防癌之術後再復發，及(iv)上述(i)至(iii)中任意兩或更多種的組合。
[9]如[8]之醫藥組合物，其中該組合物被配製為供對於具有選自於由HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組中至少一種作為MHC第II類分子之對象投予。
[10]如[8]或[9]之醫藥組合物，其中該組合物更包含有CTL誘導能力之一或多種胜肽。
[11]一種組合物，係供增強由MHC第II類分子媒介之免疫反應，該組合物包含選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分：(a)一或多種如[1]至[5]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[6]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
[12]一種誘導APC之方法，該APC有能力誘導Th1細胞，該方法包含使APC於體外、生物體外或體內與如[1]至[5]中任一項之胜肽接觸的步驟。
[13]一種誘導APC之方法，該APC有能力誘導CTL，該方法包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)使APC於體外、生物體外或體內與如[1]至[5]中任一項之胜肽接觸；及(b)將編碼為如[1]至[5]中任一項之胜肽的聚核苷酸導入APC。
[14]一種誘導Th1細胞之方法，包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞，及在表面呈現MHC第II類分子與如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之複合體的APC；及(b)將編碼為兩種T細胞受體(TCR)次單元之聚核苷酸、或編碼為各TCR次單元之聚核苷酸導入CD4陽性T細胞內，其中該TCR能結合於在細胞表面上呈現的MHC第II類分子與如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之複合體。
[15]一種誘導CTL細胞之方法，該方法包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞兩者，及已接觸如[4]或[5]之胜肽的APC；及(b)共同培養CD8陽性T細胞，及已接觸如[4]或[5]之胜肽的APC。
[16]一種增強由MHC第II類分子媒介之免疫反應的方法，該方法包含對於對象投予選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分的步驟：(a)一或多種如[1]至[5]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[6]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之APC；及 (e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
[17]一種單離的APC，其在表面上呈現MHC第II類分子與如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之複合體。
[18]一種APC，係由如[12]或[13]之方法所誘導。
[19]一種單離的Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之APC。
[20]一種Th1細胞，係由如[14]之方法所誘導。
[21]一種誘導在有須要的對象中對抗癌之免疫反應的方法，該方法包含對於該對象投予包含選自於由以下構成之群組中至少一種有效成分的組合物的步驟：(a)一或多種如[1]至[5]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[6]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[5]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
[22]一種抗體或其在免疫上有活性的片段，係對抗如[1]至[5]中任一項之胜肽。
[23]一種載體，包含編碼為如[1]至[5]中任一項之胜肽的核苷酸序列。
[24]一種宿主細胞，其經過以如[23]之表現載體轉形或轉染。
[25]一種診斷套組，包含如[1]至[5]中任一項之胜肽、如 [6]之聚核苷酸或如[22]之抗體。
如上述之外，當閱讀下列詳細敘述並結合伴隨之圖式與實施例時，本發明之其他目標或特徵將變得更全然明顯。然而，需要瞭解的是，本發明之前述發明內容與下列詳細敘述為做為例子之實施例，並不限制本發明或本發明之其他替代實施例。特別是，當以一些特定實施例敘述本發明於此處，可以瞭解的是，敘述為說明本發明，並不被構築為本發明之限制。熟悉此技藝人士可想到各種修飾與應用，而不違反本發明之精神與範圍，如附上之申請專利為所描述。同樣地，從此發明內容與下述特定實施例，本發明之其他目標、特徵、優勢與優點為明顯的，且對熟悉此技藝人士而言為無困難地明白無誤。自上述結合伴隨之例子、資料、圖式與由其而來被描寫之所有合理的推論，單獨或考慮此處引入之參考文獻，上述的目標、特徵、優勢與優點為明顯。
本發明之各種態樣及應用將會於該技術領域中具有通常知識者在考慮圖式之簡單說明以及本發明之詳細敘述及上述較佳實施例後顯明。
圖1顯示混雜的HLA第II類結合CDCA1衍生胜肽，其包括由電腦演算法預測的CTL抗原決定位(一致性方法)。A部分繪示使用電腦演算法(IEBD analysis resource，一致性方法，http：//tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)實施之人類CDCA1蛋白質之胺基酸序列的分析結果。水平軸之數字代表CDCA1衍生之15員胜肽之N端的胺基酸殘基 位置。越高的一致性百分等級(percentile rank)代表對於HLA第II類分子的結合親合性越強。B部分繪示兩個重疊的26員及24員的長胜肽(CDCA1(39-64)與CDCA1(55-78))，其對於多種HLA-第II類對偶基因產物(DRB1*04：05、DRB1*15：02及DPB1*02：01)具有重疊的高一致性百分等級且其包括由CTL在HLA-A24或-A2之背景中辨識之9員胜肽被選擇(A，黑條)並合成以鑑別含有CTL抗原決定位之混雜的HLA第II類限制Th細胞抗原決定位。
圖2顯示以長胜肽刺激以誘導CDCA1專一性CD4+ T細胞，及鑑別限制HLA-第II類分子。CD4+ T細胞株係由對於帶有各種HLA-第II類基因型之3名健康捐贈者至少經過3回合CDCA1(55-78)與CDCA1(39-64)刺激後所產生，且IFN-γ產生CD4+ T細胞之數目係以ELISPOT分析法分析。於A部分，顯示針對3名健康捐贈者對抗CDCA1(55-78)之反應。此等CD4+ T細胞被以單獨的自體PBMC(-)、經CDCA1(55-78)(10micro-g/ml)脈衝之PBMC，或經CDCA1(55-78)脈衝之PBMC在專一於HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ之5micro-g/ml mAb存在下進行刺激。B部分中，顯示2名健康捐贈者對抗CDCA1(55-78)之反應。此等CD4+ T細胞，被以單獨的自體PBMC(-)、經CDCA1(55-78)(10micro-g/ml)脈衝之PBMC，或經CDCA1(55-78)脈衝之PBMC在專一於HLA-DR或HLA-DP之5micro-g/ml mAb存在下進行刺激。於C部分，顯示2名健康捐贈者對抗CDCA1(39-64)之反應。此等捐贈者的HLA類型顯示在各分格的頂端。資料以二重複或三重複分析之平均值+/- SD代表。顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖3顯示藉由經各種HLA第II類分子限制之Th細胞對CDCA1(55-78)與CDCA1(39-64)胜肽之辨識。於A部分，將從健康捐贈者HD1建立的CDCA1(55-78)專一性CD4+ T細胞株，與經或未經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR4於抗HLA-DR或抗HLA第I類阻斷mAb存在下、經WT1胜肽脈衝之L-DR4或經或未經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR53進行共同培養。IFN-γ產生Th細胞之數目係以ELISPOT分析法分析(上分格)。將來自健康捐贈者HD-2之CDCA1(55-78)專一性CD4+ T細胞株，和經或未經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR15在抗HLA-DR或抗HLA第I類阻斷mAb存在下、或經或未經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR8進行共同培養(下分格)。於B部分，將從捐贈者HD3而來之受HLA-DP限制且CDCA1(55-78)專一性之CD4+ T選殖體，與經或未經CDCA1(55-78)脈衝之來自5名HLA-DP2陽性或陰性捐贈者之異體PBMC在抗HLA-DR或抗HLA-DP阻斷mAb存在下共同培養。C部分繪示受HLA-DR4限制之Th細胞對於CDCA1(55-78)胜肽之辨識。將衍生自健康捐贈者HD4與健康捐贈者HD5之CDCA1(55-78)專一性CD4+ T細胞，和經或未經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR4於抗HLA-DR或抗HLA第I類阻斷mAb存在下、經WT1胜肽脈衝之L-DR4、經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR1或經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR53共同培養。IFN-γ產生Th細胞之數目以ELISPOT分析法分析。此等捐贈者之HLA類型顯示在分格上。資料以二重複或三重複分析之平均值+/- SD顯示。顯示有類似結果的至 少3次獨立實驗的代表性資料。於D部分，將來自捐贈者HD1之CDCA1(39-64)專一性CD4+ T細胞選殖體，和衍生自2名HLA-DP9陽性或陰性之捐贈者之經或未經CDCA1(39-64)脈衝之異體PBMC，一起在抗HLA-DR或抗HLA-DP阻斷mAb存在下進行共同培養(上分格)。將衍生自捐贈者HD3之CDCA1(39-64)專一性CD4+ T細胞株，和經或未經CDCA1(39-64)脈衝之L-DR15在抗HLA-DR或抗HLA第I類阻斷mAb存在下、或經或未經CDCA1(39-64)脈衝之L-DR8進行共同培養(下分格)。此等捐贈者的HLA類型顯示在各分格的頂端。資料以二重複或三重複分析之平均值+/- SD代表。顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖4顯示散裝(bulk)CDCA1(55-78)專一性CD4+ Th細胞株的功能定性。於A-D部分，在將T細胞，和經CDCA1(55-78)或無關之胜肽(WT1-0405或HIV-LP)脈衝之L-DR4(A部分及D部分)或自體PBMC(B與C部分共同培養20小時後，收集培養基並使用Bio-Plex分析系統測量細胞素(IFN-γ、GM-CSF、TNF-alpha、MIP1-beta、IL-4、IL-7)的濃度。資料以三重複分析的平均+/- SD表示。E-H部分繪示在抗原刺激後，CD4+ T細胞的細胞表面上暴露的CD107a的偵測。顯示之事件係針對CD4+ T細胞閘控(gated on)。將細胞以CDCA1(55-78)或無關的胜肽再度刺激(例如WT1-0405)。在圖中的數字代表有此象限特性的細胞群體的百分比(CD4+ CD107a+ T細胞)。
圖5顯示從辨識載有此CDCA1蛋白質之自體DC之捐贈者HD1建立的CDCA1(55-78)與CDCA1(39-64)專一性Th選殖 體。於A部分，該受HLA-DR4限制之CDCA1(55-78)專一性Th選殖體或該受HLA-DR9限制之CDCA1(39-64)專一性Th選殖體(2×104/井)，係與載有重組CDCA1蛋白質(50micro-g/ml)之自體DC(5×103/井)於抗-HLA-DR或抗-HLA第I類阻斷mAb存在下、對照蛋白質、或未載入之DC一起共同培養。IFN-γ產生Th選殖體之數目，以ELISPOT分析法分析。於B部分，從捐贈者HD3建立之受HLA-DP2限制之CDCA1(55-78)專一性Th細胞選殖體，辨識載有該CDCA1蛋白質之自體DC。將受HLA-DP2限制之CDCA1(55-78)專一性Th細胞選殖體，與經CDCA1蛋白質負載之自體DC共同培養，且將IFN-γ產生Th細胞選殖體之數目以ELISPOT分析法分析。資料以二重複之平均+/- SD表示。顯示至少顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖6表示於體外及體內誘導有效的CTL交叉起動的CDCA1-LP。於A部分，將從HLA-2陽性及HLA-DR4陽性捐贈者分離之HD1CD8+ T細胞以經以CDCA1(55-78)LP負載之DC刺激。3次刺激後，將產生的CTL細胞株，與經CDCA1-A2(65-73)SP脈衝之T2細胞在抗HLA第I類或抗-HLA-DR阻斷mAb存在下、或無關胜肽(HIV-A2)脈衝之T2細胞共同培養，且IFN-γ產生CTL之數目以ELISPOT分析法分析。顯示使用2名HLA-2陽性及HLA-DR4陽性之健康捐贈者之PBMC獲得之有類似結果之3次獨立的實驗的代表性資料。於B部分，將經CDCA1(55-78)LP免疫之小鼠中之CDCA1(65-73)SP專一性CTL擴增物，於IFA中乳化。將HLA-A2 Tgm以乳化於IFA 中之CDCA1(55-78)LP對於尾基部免疫。第2或第3次接種CDCA1(55-78)LP後的7天，將鼠蹊部附近之淋巴結的CD8+ T細胞進行陽性分離，並且與經CDCA1-A2(65-73)SP或無關的胜肽脈衝之BM-DC一起培養，並利用生物體外ELISPOT分析法分析IFN-γ產生CD8+ T細胞的數目。顯示有類似結果的7個獨立實驗而來的代表性資料。於C部分，於HLA-A24+/A2+/DR4+ HD5，CDCA1(55-78)LP誘導CDCA1專一性CTL之有效交叉起動。將從HD5分離的純CD8+ T細胞，以負載了CDCA1(55-78)LP之自體DC刺激。3回合刺激後，將產生的CTL以經CDCA1-A2(65-73)SP脈衝之T2細胞、經CDCA1-A24(56-64)SP脈衝之C1R-A2402細胞，或經對照SP脈衝之目標細胞再度刺激。IFN-γ產生CTL之數目，以ELISPOT分析法分析。顯示從有類似結果的3次獨立實驗而來的代表性資料。
於D部分，HLA-A24 Tgm被以CDCA1(55-78)LP(左分格)或CDCA1(39-64)LP(右分格)免疫。於第2次以CDCA1-LP接種後，將鼠蹊部附近之淋巴結的鼠CD8+ T細胞，以經CDCA1-A24(56-64)SP或HIV-A24 SP脈衝之BM-DC或C1R-A2402刺激。於E部分，以CDCA1-LP疫苗優越地誘導CDCA1專一性CTL。將HLA-A24 Tgm以CDCA1(55-78)LP、CDCA1(39-64)LP或CDCA1-A24(56-64)(300nmol/小鼠)免疫。第2次接種CDCA1衍生胜肽後，將鼠蹊部附近之淋巴結中的鼠CD8+ T細胞，以經CDCA1-A24(56-64)SP或HIV-A24 SP(背景)脈衝之BM-DC刺激。結果代表減去背景值後的專一 性IFN-γ點。資料以三重複分析之平均值+/- SD代表。顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖7顯示由於以CDCA1(55-78)LP及CDCA1(55-78)LP專一性CD4+ Th細胞選殖體刺激所致之誘導CDCA1-A2(65-73)、CDCA1-A2(351-359)或CDCA1-A24(56-64)專一性CTL之增強。於A部分，將產生HLA-DR4限制之CDCA1(55-78)專一性CD4+ Th細胞選殖體之來自HLA-A2與DR4陽性健康捐贈者HD1之PBMC，與CDCA1-A2(65-73)及CDCA1-A2(351-359)(混合SP，各20micro g/ml)之混合物、混合SP+CDCA1(55-78)(LP,20micro-g/ml)、混合SP+CDCA1(55-78)專一性CD4+ T細胞選殖體(Th選殖體，5×105/井)或混合SP+LP+Th選殖體之混合物，一起培養11天。培養此培養物7天後，添加此等胜肽(與前述的濃度相同)與IL-2(20U/ml)(第2次刺激)，然後於第9天添加IL-15(5ng/ml)。於培養11天時，將細胞以經PE標定之HLA-A*02：01/CDCA1-A2(65-73)胜肽複合體或HLA-A*02：01/CDCA1-A2(351-359)胜肽複合體的四元體與經FITC標定之抗人類CD8 mAb之組合染色，並以細胞流式計數器分析。在右上象限內的點代表CD8+ 四元體+ T細胞。顯示的事件係針對CD8+ T細胞閘控。在圖中的數字代表此有右上象限特性的細胞群體的百分比(CD8+ 四元體+ T細胞)。資料代表3次有類似結果的獨立實驗的代表。於B部分，顯示於CD8+ 四元體+細胞中之增加值(增加倍數)。於C部分，在培養第14天時，添加此等胜肽(與前述濃度相同)與IL-2(20U/ml)(第3次刺激)，然後於第16天添加IL-15(5ng/ml)。於 培養第18天時，將此細胞以經PE標定之四元體與經FITC標定之抗人類CD8 mAb之組合染色(上分格)。於第18天實施CDCA1-A2反應性T細胞之IFN-γ-ELISPOT分析。條代表當產生之細胞株再度以負載了CDCA1-A2(65-73)、CDCA1-A2(351-359)或無關HIV-A2胜肽之T2細胞刺激時，IFN-γ點之數目(封閉條)。資料以三重複之平均+/- SD表示。統計上顯著差異(p<0.05)，以星號表示(下部分格)。於D部分，於抗原刺激後，檢測於CD8+ T細胞之細胞表面上暴露之CD107a。顯示之事件係針對CD8+ T細胞閘控。將細胞以CDCA1-A2(65-73)、CDCA1-A2(351-359)或無關的HIV-A2胜肽再度刺激。在圖中的數字代表有此象限特性的細胞群體的百分比(CD8+ CD107a+ T細胞)。於E部分，藉由已活化的CDCA1(55-78)LP專一性CD4+ T細胞之CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL之增強的誘導。將衍生自HLA-A24+/DR15+ HD2之CDCA1(55-78)LP專一性散裝CD4+ T細胞及CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CD8+ T細胞，與自體DC一起在CDCA1-A24(56-64)SP(SP單獨)、CDCA1-A24(56-64)SP+對照LP(對照+LP)或CDCA1-A24(56-64)SP+CDCA1(55-78)LP(CDCA1(55-78)LP+SP)存在下一起培養，而不添加任何細胞激素。與胜肽在體外培養1週後，將培養的細胞以經PE標定之HLA-A*24：02/CDCA1-A24(56-64)複合體的四元體與經FITC標定之抗人類CD8 mAb染色。也顯示在無任何胜肽下培養細胞之結果(無胜肽)。預刺激之柱(column)顯示在此實驗中使用之CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CD8+ T細胞之四 元體+CD8+T細胞/井的絕對數目。代表性的CDCA1-A24(56-64)SP專一性四元體染色被顯示(在CD8+ T細胞閘控，點圖)。資料以三重複之平均+/- SD表示。顯示至少顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖8代表從健康捐贈者誘導CDCA1專一性Th細胞。於A部分，由於以CDCA1(55-78)LP刺激，從DR4+健康捐贈者(HD1)產生CDCA1專一性Th細胞。對此產生的Th細胞以經CDCA1(55-78)LP脈衝之自體PBMC或L細胞再度刺激。使用WT1胜肽作為對照胜肽。IFN-γ產生Th細胞之數目以ELISPOT分析法分析。顯示從HD1獲得之至少3次有類似結果之獨立實驗的代表性資料。從2名DR4+捐贈者得到了類似結果(表1；HD4與HD5)。在分格上顯示捐贈者HD1之HLA第II類基因型。畫底線之HLA-第II類對偶基因編碼將此胜肽對於Th細胞呈現之HLA-第II類分子。在HD1未測試HLA-DQ mAb之阻斷作用。於B部分，利用以CDCA1(55-78)LP刺激，從DR4陰性、DR15陽性健康捐贈者(HD2)產生CDCA1專一性Th細胞。顯示有類似結果的至少5次獨立實驗的代表性資料。於C部分，從HD3建立了受HLA-DP2限制及CDCA1(55-78)LP專一性散裝Th細胞株(C-1)或Th細胞選殖體(C-2)。將受HLA-DP限制之Th選殖體，與經或未經CDCA1(55-78)LP脈衝之衍生自HLA-DP2-陽性或陰性捐贈者的異體PBMC共同培養。於D部分，藉由以CDCA1(39-64)LP刺激，從DR15+健康捐贈者(HD3)產生CDCA1(39-64)LP專一性Th細胞。於E部分，從HD1建立此受HLA-DR9限制之CDCA1(39-64)LP專 一性散裝Th細胞(左分格)或Th細胞選殖體(右分格)。將受HLA-DR限制之Th選殖體，與經或未經CDCA1(39-64)LP脈衝之衍生自HLA-DR9-陽性或陰性捐贈者的異體PBMC共同培養。此從HD1產生的受HLA-DR限制之Th細胞選殖體，對於CDCA1(39-64)LP脈衝之L-DR4細胞未顯示反應(資料未顯示)。IFN-γ產生Th細胞之數目以ELISPOT分析法分析。資料以三重複之平均+/- SD表示。顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。在分格上顯示捐贈者之HLA第II類基因型。畫底線之HLA-第II類對偶基因編碼將此胜肽對於Th細胞呈現之HLA-第II類分子。
圖9顯示CDCA1-LP於體外有效率誘導CDCA1-A24(56-64)SP專一性CD8+ T細胞擴增。於A部分，從HD2(HLA-A24+ and DR15+)建立之CDCA1-A24(56-64)專一性散裝CTL，在體外以經CDCA1(55-78)LP(封閉圓)或無關LP(開放圓)脈衝之自體DC刺激。於LP刺激前(第0天)及刺激後第5、7、8及10天，將一小部分培養的細胞(1×105細胞)CD8+ T細胞，以CDCA1-A24(56-64)專一性四元體與抗人類CD8 mAb之組合染色。顯示從3次獨立實驗而來的在第0及10天的代表性資料(右分格)。事件係針對CD8+ T細胞閘控。CD8+ T細胞中之四元體+細胞之百分比，以線繪示(左分格)。於B部分，CDCA1(55-78)LP於體外誘導CDCA1-A24(56-64)SP專一性CD8+ T細胞有效率擴增。將從HD5(HLA-A24+與DR4+)建立之CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CTL，於體外以經CDCA1(55-78)LP(右條)或對照LP(中條)脈衝之自體DC刺 激。於LP刺激前(LP預刺激，第0天；左條)，及刺激後第7天(中及右條)，以ELISPOT分析法計數以經CDCA1-A24(56-64)SP脈衝之或經HIV-A24 SP(背景)脈衝之C1R-A2402細胞(2×104/井)刺激時之IFN-γ產生CD8+ T細胞(1×105/井)之數目。顯示從3次獨立實驗而來之代表性資料。資料以三重複分析之平均值+/- SD代表。於C部分，將從已接種CDCA1-A24(56-64)SP之HNC病患(HNC29)而來的PBMC，與CDCA1(55-78)LP與CDCA1(39-64)LP之混合物一起培養。於第0天(生物體外)及第7天(於體外以CDCA1-LP刺激後)，將此等PBMC以四元體HLA-A*24：02/CDCA1-A24(56-64)複合體或對照四元體染色。(在CD8+ T細胞閘控)。於第7天，也以IFN-γ ELISPOT分析法檢測CDCA1-A24(56-64)-SP專一性CTL的頻率(右方分格，條形圖)。資料以三重複之平均+/- SD表示。於D-G部分，將從已接種CDCA1-A24(56-64)SP之HNC病患(HNC26、31、39及109)而來的PBMC，與CDCA1(55-78)LP與CDCA1(39-64)LP之混合物一起培養。於第0天(生物體外)與第7天(於體外以CDCA1-LP刺激後)，將細胞以四元體HLA-A*24：02/CDCA1-A24(56-64)複合體或對照四元體(於CD8+ T細胞閘控)染色。
圖10顯示經由DC之CDCA1-LP的交叉呈現。於A部分，係由DC攝入並交叉呈現CDCA1(55-78)LP。將未固定或已固定的DC以CDCA1(55-78)LP或CDCA1-A24(56-64)SP脈衝3小時。將此散裝CDCA1-A24(56-64)專一性CTL共同培養6小時，並以IFN-γ標定測量回應。事件針對CD8+ 四元體+ T 細胞閘控，且圖內的數字代表IFN-γ+ T細胞的百分比。於B部分，係顯示經由DC之CDCA1(39-64)LP的交叉呈現。將未固定或已固定之DC，以CDCA1(39-64)LP或CDCA1-A24(56-64)SP脈衝3小時。將此散裝CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL共同培養6小時，並以IFN-γ標定測量反應。事件於CD8+ 四元體+ T細胞閘控且圖內的數字代表IFN-γ+ T細胞的百分比。
圖11顯示從已接種CDCA1-A24(56-64)SP之HNC病患分離之PBMC中，CDCA1-LP專一性Th細胞的存在。於A部分，於體外以CDCA1(39-64)LP與CDCA1(55-78)LP之混合物刺激PBMC 1週以後，以IFN-γ ELISPOT分析檢測個別之CDCA1-LP專一性T細胞之頻率。於B部分，證明相較於正常健康個體，HNC病患顯示升高的CDCA1專一性CD4+ T細胞免疫性。柱狀圖顯示回應於CDCA1-LP之健康捐贈者(對照)與HNC病患之比例。p值代表從費雪正確性檢定(Fisher’s exact test)得到的統計結果。於C部分，評估已接種CDCA1-A24(56-64)SP(接種後)之16名HNC病患、7名未接種之病患(接種前)及10名健康捐贈者中之CDCA1專一性Th細胞反應。結果代表減去背景值後之專一性IFN-γ點。各點代表個別的捐贈者。水平線代表中值，p值代表從無參數曼-惠特尼(Mann-Whitney)U檢定獲得之統計結果。於單一井中，實施19名HNC病患中7名(HNC10、26、34、37、38、40及103)的實驗。於D部分，顯示IFN-γ產生T細胞之HLA第II類限制。將已被LP刺激1個月的PBMC，以各CDCA1-LP，於存 在對HLA-DR、-DP、-DQ或HLA第I類專一的mAb再度刺激。顯示獲自具有類似結果之12名HNC病患(HNC26、29、31、34、35、39、40、42、103、105、107及108)之20個條形圖中的6個。12名HNC病患中有6名的實驗(HNC26、34、40、103及107)係於單一井中實施。CDCA139-64-LP；從10名HNC病患(HNC26、29、31、34、39、40、42、103、107及108)而來之代表性的3個條形圖。CDCA1(55-78)LP；從10名HNC病患(HNC26、29、31、34、35、39、40、103、105及108)而來之代表性的3個條形圖。於E部分，重複接種CTL抗原決定位疫苗誘導(HNC39、40、42及109)或增強(HNC107與108)CDCA1專一性Th細胞反應(CDCA1(39-64)LP，白色條；CDCA1(55-78)-LP，黑色條)。6名HNC病患中有3名(HNC40、108及109)之實驗係於單一井實施。於F部分，顯示HNC病患之臨床特性。如材料與方法項目所述，藉由IFN-γ ELISPOT分析測量CDCA1專一性T細胞反應。19名HNC病患中有7名(HNC10、26、34、37、38、40與103)之實驗係於單一井實施。接種數為「0」，代表未接種前之病患。(+)與(-)代表陽性及陰性反應。畫底線的HLA-第II類對偶基因，編碼在健康捐贈者中呈現CDCA1-LP給Th細胞之HLA-第II類分子(圖8；HLA-DRB1*04：05、DRB1*09：01、DRB1*15：02，及DPB1*02：01)。No.，數目；CTR，臨床試驗登記號；vac.，接種；HNC，頭頸癌；M/F，女/男；LP，長胜肽；n.t.，未測試。
[實施例]
雖然任何類似於或均等於在此所述的方法或材料可用於實施或測試本發明具體例，以下仍敘述較佳的材料、方法及裝置。然而，敘述該材料及方法前，應瞭解此等敘述僅為供理解而非意欲限制。應瞭解本發明不限於在此敘述的特定大小、形狀、方向、尺寸、材料、方法學、試驗步驟等，因為此等會由於例行的實驗及/或最適化而改變。再者，在敘述中使用的用語僅係用敘述特定版本或具體例，不意欲限制本發明的範圍，本發明範圍僅由附帶的申請專利範圍限制。
在本說明書中提到的各出版物、專利或專利申請案的揭示係特別完整納入於此作為參考。但是，不理解為承認本發明不早於此揭示或早先的發明。
I. 定義
除非特別指明，在此使用的所有技術及科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般瞭解的含意相同。然而，若有抵觸，依本說明書，包括定義為準。
除非特別指明，此處使用的單字「一」(“a”or“an”)及「該」意指「至少一」。
與物質(例如，胜肽、抗體、聚核苷酸等)關連使用的用語「經單離」及「經純化」，係指該物質實質上不含有可能會包括在天然來源的至少一種物質。因此，一經單離或經純化的胜肽係指實質上不含細胞材料例如碳水化合物、脂質或來自該胜肽從其衍生出之細胞或組織來源的其他污染蛋白質，或當係化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學物質。用語「實質上不含細胞材料」，包括製備一胜肽，其中該胜肽係從 其單離的細胞的細胞成分分離，或重組產生。因此，實質上不含細胞材料的胜肽，包括多胜肽之製備物其具有少於約30%、20%、10%或5%(以乾重計)的異質蛋白質(在此也稱為「污染蛋白質」)。當該胜肽係以重組產生時，其亦較佳為實質上不含培養基，其包括胜肽之製備物且具有少於約該胜肽製備物的20%、10%、或5%體積的培養基。當該胜肽係以化學合成生產時，較佳為實質上不含化學前驅體或其他化學物質，其包括胜肽之製備物且少於約該胜肽製備物的30%、20%、10%、5%(以乾重計)之涉及合成該胜肽的化學前驅體或其他化學物質。含有經單離的或經純化的胜肽的特定胜肽，例如可藉由將該在蛋白質製備物進行之十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳與考馬西亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色或類似之膠體後之單一譜帶的出現而顯示。於一較佳具體例，本發明之胜肽及聚核苷酸係經單離的或經純化。
用語「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白質」在此係可互換地指胺基酸殘基的聚合物。此用語適用於胺基酸聚合物，於其中一個或更多胺基酸殘基為經修飾的殘基，或非天然發生的殘基，例如對應的天然發生的胺基酸及對應的天然發生的胺基酸聚合物的人造化學擬似物。
用語「胺基酸」在此意指天然發生的及合成的胺基酸，及胺基酸類似物及與天然發生的胺基酸的作用類似的胺基酸擬似物。天然發生的胺基酸係由遺傳碼編碼者，以及於細胞中轉譯後經過修飾者(例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸，及O-磷絲胺酸)。用詞「胺基酸類似物」意指與天然發生胺基酸 具有相同基本化學結構(鍵結於氫的alpha碳、羧基、胺基及R基)但是具有經過修飾的R基或經過修飾的骨架(例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸、亞碸、甲硫胺酸甲基鋶鹽)。用詞「胺基酸擬似物」意指與一般胺基酸具有不同結構但有類似功能的化學化合物。
胺基酸在此可使用其通用的三字母符號或由IUPAC-IUB生化命名協會建議的單字母符號指明。
用語「基因」、「聚核苷酸」及「核酸」在此可互換使用，且如無特別指明，係以其通用可接受的單字母碼所指明者。
用語「劑」、及「組合物」在此可互換使用，意指以特定量含有特定成分的產品，以及將該特定成分以特定量直接或間接組合得到的任意產品。關於醫藥組合物之此種用語係意欲包含含該有效成分及成為擔體的任意鈍性成分的產品，及由直接或間接組合、複合或聚集該等成分中任意2種或更多而獲得的任意產品，或由該等成分中2種或更多解離而得到的任意產品，或由該等成分中2種或更多的其他類型的反應或交互作用而得到的任意產品。因此本發明之醫藥組合物包括藉由混合本發明化合物及醫藥上或生理上可接受擔體而製作的任意組合物。
用詞「有效成分」意指在組合物當中有生物學活性或生理活性的物質。尤其，於一醫藥組合物的背景中，「有效成分」係指顯示目標的藥理作用的物質。例如，當醫藥組合物使用在癌症治療或預防時，組合物中的有效成分可直接或間 接引導至少一種作用在癌細胞及/或組織的生物學或生理學作用。較佳者，該作用包括減少或抑制癌細胞生長，損害或殺死癌細胞及/或組織等。通常，有效成分的間接作用係誘導MHC Class II分子媒介的免疫反應。在被配製(formulated)前，「有效成分」也稱為「散裝物質(bulk)」、「藥物物質」或「技術品」。
此處使用之用語「醫藥上可接受之擔體」或「生理上可接受之擔體」，係指醫藥上或生理上可接受之材料、組合物、物質、化合物或載體，包括但不限於液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊化材料。
除非另外定義，用語「癌症」意指過度表現CDCA1基因的癌症，例如包括乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。
除非另外定義，用語「T淋巴球」及「T細胞」在此可以互換使用。
除非另外定義，用語「細胞毒性T淋巴球」、「細胞毒性T細胞」及「CTL」，在此可互換使用，且除非特別指明，意指T淋巴球的次群組，其能辨識非己細胞(例如腫瘤細胞、受病毒感染的細胞)，並誘導此種細胞的死亡。CTL係從CD8+ T淋巴球分化，且能辨識由MHC第I類分子呈現的胜肽。
除非另外定義，用語「HLA-A24」在此意指包含亞型HLA-A24的型，亞型的例子包括但不限於HLA-A*2401、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2404、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2420、HLA-A*2425及HLA-A*2488。
除非另外定義，用語「HLA-A2」在此代表性意指亞型，亞型的例子包括但不限於HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0213、HLA-A*0216、HLA-A*0218、HLA-A*0219、HLA-A*0228及HLA-A*0250。
除非另外定義，用語「T輔助1型細胞」及「Th1細胞」，在此係可互換使用，且除非特別指明，係指能夠辨識由MHC第II類分子呈現的胜肽且關連於細胞免疫的CD4+ T淋巴球次群組。除非另有定義，用語「Th細胞」、「CD4+ T細胞」及「CD4+ 輔助T細胞」，在此亦可互換使用。Th1細胞分泌多種細胞素(例如IFN-γ、IL-2、TNF-beta、GM-CSF、TNF-alpha等)來幫忙活化及/或刺激其他關於細胞免疫的免疫細胞(例如CTL、巨噬體)。
除非另有定義，用語「HLA-DR4」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*04：01、HLA-DRB1*04：02、HLA-DRB1*04：03,LA-DRB1*04：04、HLA-DRB1*04：05、HLA-DRB1*04：06、HLA-DRB1*04：07、HLA-DRB1*04：08、HLA-DRB1*04：09、HLA-DRB1*04：10及HLA-DRB1*04：11。
除非另有定義，用語「HLA-DR9」，係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*09：01、HLA-DRB1*09：02、HLA-DRB1*09：03,LA-DRB1*09：04、HLA-DRB1*09：05、HLA-DRB1*09：06、HLA-DRB1*09：07、HLA-DRB1*09：08及HLA-DRB1*09：09。
除非另有定義，用語「HLA-DR15」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*15：01、HLA-DRB1*15：02、HLA-DRB1*15：03、HLA-DRB1*15：04、HLA-DRB1*15：05、HLA-DRB1*15：06、HLA-DRB1*15：07、HLA-DRB1*15：08、HLA-DRB1*15：09、HLA-DRB1*15：10及HLA-DRB1*15：11。
除非另有定義，用語「HLA-DP2」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DPB1*0201及HLA-DPB1*02：02。除非另有定義，詞語「經由MHC第II類分子媒介的免疫反應」，係指由於MHC第II類分子呈現胜肽所誘導之免疫反應。在此「由MHC第II類抗原媒介之免疫反應」，包括由CD4+ T細胞，特別是Th1細胞誘導的免疫反應。此種免疫反應的例子包括但不限於生產細胞素(例如IFN-γ、IL-2、TNF-beta、GM-CSF、TNF-alpha等)，及活化及/或刺激其他免疫細胞(例如CTL、巨噬體等)。
除非另有定義，詞語「專一於CDCA1之Th1細胞」，係指由呈現衍生自CDCA1之胜肽的抗原呈現細胞所專一性活化，而不被其他抗原呈現細胞活化的Th1細胞。
除非另有定義，詞語「CDCA1專一性CTL」，係指對抗表現CDCA1之目標細胞專一性顯示細胞毒殺性的CTL。
除非另有定義，當使用在胜肽上下文，詞語「CTL誘導能力」，係指一胜肽當被呈現於抗原呈現細胞上時，誘導CTL的能力。
除非另有定義，在此使用之用語「套組」，係參照試劑及其他材料的組合來使用。在此考慮到此套組可包括微陣列、晶 片、標記等。此用語「套組」不意欲限制在特定的試劑及/或材料的組合。
本發明上下文中，用語「抗體」意指專一性地對於指定蛋白質或其胜肽反應的免疫球蛋白及其片段。抗體可包括人類抗體、靈長源抗體、嵌合抗體、雙專一抗體、人類化抗體、融合於其他蛋白質或放射性標記的抗體，及抗體片段。再者，抗體在此係以最廣的含意使用，且具體而言含蓋完整無缺的單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整無缺的抗體形成的多專一性抗體(例如雙專一性抗體)，及抗體片段，該抗體片段只要能顯現所望的生物學活性即可。「抗體」代表所有類型者(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。
除非另外定義，在此使用的所有技術及科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般了解的含意相同。
II.胜肽
以下詳述之本發明之胜肽，可指稱為「CDCA1胜肽」或「CDCA1多胜肽」。
為了證明衍生自CDCA1之胜肽作用如一被T輔助1型(Th1)細胞所辨認之抗原，分析衍生自CDCA1之胜肽(序列識別號：10)以確定是否其為由一MHC第II類分子混雜地限制之抗原決定位。
衍生自CDCA1之混雜的MHC第II類結合胜肽的候選物，基於其對HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2之結合親和力確認。在藉由載有這些胜肽之樹突細胞(dendritic cell,DC)以體外刺激CD 4+ T細胞後，使用下列各個胜肽成功建立Th1細胞： CDCA1/IVYGIRLEHFYMMPVNSEVMYPHL(55-78；序列識別號：1)及CDCA1/NPKPEVLHMIYMRALQIVYGIRLEHF(39-64；序列識別號：2)。
此等上述提及的已建立的Th1細胞，顯示回應於經各別的胜肽脈衝之抗原呈現細胞的刺激，顯示強的專一性的Th1細胞活性。再者，上述胜肽可以刺激由數種日本群體常見的HLA-DR及HLA-DP分子(例如HLA-DR4、HL-DR15、HLA-DR9及HLA-DP2)限制的Th1細胞。此等結果證明CDCA1係由Th1細胞辨識的抗原，且此胜肽係受數種HLA-第II類分子(例如HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15，及HLA-DP2)混雜的限制的CDCA1的抗原決定位胜肽；因此，此種胜肽作為CTL的細胞毒性的標靶抗原為有效。
上述鑑別的胜肽更包括一CTL抗原決定位之胺基酸序列，其有誘導專一於CDCA1之CTL的能力，且如同此處證明，此胜肽可誘導專一於CDCA1之CTL及Th1細胞。因此此等胜肽作可用於誘導對抗表現CDCA1之癌的免疫反應之適合的胜肽。因為CDCA1基因在大多數癌組織係過度表現，包括例如乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)，代表其係免疫療法的一個良好標的。
因此本發明提供有誘導專一於CDCA1之Th1細胞之能力的胜肽，。
本發明之胜肽可結合於至少一MHC第II類分子， 並被呈現在抗原呈現細胞上。或本發明之胜肽之片段可結合於至少一MHC第II類分子，並被呈現在抗原呈現細胞上。此胜肽之片段，可藉由在抗原呈現細胞處理而產生。於較佳具體例，本發明之胜肽或其片段有能力結合2或更多種MHC第II類分子(例如HLA-DR9及HLA-DR15、HLA-DR4及HLA-DR15、HLA-DR4及HLA-DP2、HLA-DR15及HLA-DP2、或HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2)。換言之，本發明之胜肽有能力誘導受2或更多種MHC第II類分子限制之Th1細胞。於另一具體例，本發明之胜肽包括有CDCA1專一性CTL誘導能力之胜肽之胺基酸序列。此種具CDCA1專一性CTL誘導能力的胜肽的典型例，包括有序列識別號：3或5之胺基酸序列的胜肽。
由於MHC第II類分子中之結合溝係在兩端開放，所以可容MHC第II類結合胜肽於長度有靈活性。MHC第II類分子的核心模體由9個胺基酸殘基組成，且MHC第II類結合胜肽一般在此核心結合模體的側面有其他的胺基酸殘基。側面胺基酸殘基之數目不限。因此，並非序列識別號1或2之所有胺基酸殘基對結合MHC第II類分子為必要。
因此本發明之胜肽可為有能力誘導Th1細胞之胜肽，此種胜肽包括選自於由以下構成之群組之胺基酸序列：(a)一連續的胺基酸序列，其具有選自於序列識別號：1或2之胺基酸序列中的長於9個胺基酸；及(b)如(a)之胺基酸序列，其中胺基酸序列有1個、2個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加。
MHC第II類結合胜肽通常為10-30個胺基酸。當序列識別號：1與2之胺基酸序列係由CDCA1(序列識別號：10)之部分胺基酸序列構成，本發明之胜肽可為以下[1]至[5]之胜肽：
[1]一種單離的胜肽，其長度為10-30個胺基酸且包含序列識別號：10的一部分胺基酸序列，其中該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一連續的胺基酸序列，其具有選自於序列識別號：1或2之胺基酸序列中的長於9個胺基酸；及(b)一胺基酸序列，其中(a)之胺基酸序列有1個、2個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加，該胜肽有誘導T輔助1型(Th1)細胞的能力。
[2]如[1]之單離的胜肽，其中，該胜肽或其片段有結合於至少2種MHC第II類分子的能力。
[3]如[2]之單離的胜肽，其中，該MHC第II類分子選自於由HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組。
[4]如[1]至[3]中任一項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含具有CDCA1專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力之胜肽的胺基酸序列。
[5]如[4]之單離的胜肽，其中，該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一胺基酸序列，其選自於序列識別號：1及2構成之群組；及 (b)一胺基酸序列，其中(a)之胺基酸序列有1個、2個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加。
本發明之胜肽誘導之Th1細胞對於CDCA1係專一。
因此於一些具體例，本發明提供長度少於30個胺基酸之胜肽，其由序列識別號：10的胺基酸序列的一部分胺基酸序列所構成，其中該胜肽包含序列識別號1或2之胺基酸序列。
一般而言，現在例如在網際網路上已有軟體程式例如Wang P et al.2008.PLoS Comput Biol。4(4)：e1000048.11：568；及Wang P et al.2010.BMC Bioinformatics所述者可用於以電腦模擬計算各種胜肽與HLA抗原的結合親和性。與HLA抗原的結合親和性可例如以於例如Nielsen M and Lund O.2009.BMC Bioinformatics.10：296.；Nielsen M et al.2007.BMC Bioinformatics.8：238.Bui HH,et al.2005.Immunogenetics.57：304-314.Sturniolo T et al.1999.Nat Biotechnol.17(6)：555-561 and Nielsen M et al.2008.PLoS Comput Biol.4(7)e1000107敘述者測量。因此本發明包含CDCA1的胜肽，其係以此種已知程式決定會與鑑別的HLA抗原結合。
如上述，MHC第II類結合胜肽在其長度有靈活性，序列識別號1或2之胺基酸序列可選擇性地有額外的胺基酸殘基位在側面，條件是獲得之胜肽保留必要的Th1細胞誘導能力即可。此種有Th1細胞誘導能力的胜肽一般少約於30個胺基酸，常少於約29個胺基酸，經常少於約28或27個胺基酸。位在選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列側面的特定 胺基酸序列，不特別限制，且可包括任意種類胺基酸，條件是只要此側面胺基酸序列不要減弱原始胜肽之Th1細胞誘導能力即可。於典型的具體例，此種側面胺基酸序列可選自於鄰近於序列識別號：1或2之胺基酸序列的序列識別號10之胺基酸序列；但本發明不限於此。如上，本發明也包括有Th1細胞誘導能力的胜肽，及選自序列識別號：1與2之胺基酸序列。
另一方面，由於MHC第II類分子之核心結合模體由9個胺基酸殘基組成，所以序列識別號：1或2之胺基酸序列全長對於結合MHC第II類分子及誘導Th1細胞並非為必要。因此，本發明胜肽之形式可為有超過序列識別號1或2之9個連續胺基酸的胺基酸，前提是此胜肽保留必要的Th1細胞誘導能力。有Th1細胞誘導能力之胜肽，一般長於約10個胺基酸，時常超過11或12個胺基酸，經常長於13或14個胺基酸。因此本發明之胜肽可為有Th1細胞誘導能力之胜肽，且為有來自序列識別號：1或2之胺基酸序列之長於9、10、11、12、13或14個連續胺基酸之胺基酸序列。
一般而言，已知在蛋白質中修飾一個或更多胺基酸不會影響該蛋白質的功能，或有時甚至會增強原始蛋白質的所望功能。事實上，經修飾的胜肽(即，相較於原始參考序列，由在其中一、二或數個胺基酸殘基已被修飾(即，取代、刪除、插入或加成)之胺酸序列所構成的胜肽)已知會保留原始胜肽的生物學活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79： 6409-13)。因此，於本發明一具體例中，本發明之胜肽可具有Th1細胞誘導能力與其中一、二或更多胺基酸經加成、插入、刪除及/或取代之選自序列識別號：1及2中的胺基酸序列兩者。或者，本發明之胜肽可具有Th1細胞誘導能力，及具有一胺基酸序列於其中一、二或更多胺基酸加成、插入、刪除及/或取代於序列識別號：1或2中。
熟悉此技藝人士會認定改變單一胺基酸或一小百分比之胺基酸之對於一胺基酸序列的個別的添加或取代傾向產生保存原始胺基酸支鏈的特性。因此它們常被意指為「保守取代(conservative substitutions)」或「保守修飾(conservative modifications)」，其中一蛋白質之改變導致對原始蛋白質而言一具有功能相似的蛋白質。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。胺基酸支鏈的特徵的例子為疏水胺基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、親水胺基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)與具有下列共同官能基或特徵之支鏈：一脂肪族支鏈(G,A,V,L,I,P)；一含羥基支鏈(S,T,Y)；含硫原子支鏈(C,M)；含羧酸與胺基支鏈(D,N,E,Q)；含鹼支鏈(R,K,H)；以及含芳香族支鏈(H,F,Y,W)。此外，下列八個群體各包含為彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)； 6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如Creighton,Proteins 1984)。
此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而，本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經修飾之胜肽維持原始胜肽的Th1細胞誘導能力。更進一步而言，經修飾之胜肽不排除多形變體(polymorphic variants)、種間同質體(interspecies homologues)與CDCA1對偶基因(alleles)可誘導Th1細胞的胜肽。
為了維持Th1細胞誘導能力，可修飾(插入、加入、刪除/或取代)一小數目(例如一、二或數個)或小百分比之胺基酸。此處用語「數個」指5或更少個胺基酸，例如4個或3個或更少。被修飾之胺基酸之百分比可為，較佳20%或更少，更較佳為，15%或更少，甚至更佳為為，10%或8%，少或1至5%。
本發明之較佳胜肽，即序列識別號：1與2(CDCA1 55-78,39-64)之同源性分析結果確認此等胜肽與其他任何已知人類基因產物所衍生的胜肽不具顯著同源性。所以，當使用於免疫療法時，可顯著降低這些胜肽產生未知或不欲的免疫反應的可能性。因此，此等胜肽被預期對於在癌症病患中誘出對抗CDCA1的免疫性高度有用。
當使用於免疫療法之背景中，本發明之胜肽或其片段應呈現在抗原呈現細胞的表面，較佳為以與HLA第II類 抗原之複合體的形式呈現。因此宜選擇不僅會誘導Th1細胞，而且對於HLA第II類抗原擁有高結合親和性的胜肽。為此，可將胜肽利用取代、插入、刪除及/或加成胺基酸殘基進行修飾，以產生結合親和性有所改善的修飾胜肽。
本發明也考量附加一、二或數個胺基酸到該胜肽的N及/或C端。此種經修飾的具有高度HLA抗原結合親和性的胜肽並保留Th1細胞誘導能力者，也包括於本發明。
例如本發明提供長度短於31、30、29、28、27或26個胺基酸的單離的胜肽，其結合於HLA第II類抗原且具有Th1細胞誘導能力，且包含選自於序列識別號：1與2構成的群組中的胺基酸序列中有1、2或數個胺基酸經修飾的胺基酸序列。
當此等胜肽與APC接觸，或被導入APC，會在APC中被處理而在APC上以經處理的片段呈現。例如，本發明之胜肽可被處理成通常由11-26個(普通為15-25個)胺基酸殘基構成的片段，以呈現在APC表面。
但，當該胜肽序列與具有不同功能的內生或外生蛋白質的胺基酸序列有一部分相同時，可能會引起副作用，例如自體免疫病症或對於特定物質之過敏症狀。因此，可使用可得的資料庫一開始進行同源性檢索，以避免該胜肽的序列符合其他蛋白質的胺基酸序列的情況。當與自然存在之目標胜肽相較，同源性檢索顯示沒有相同或與目標胜肽有1或2個胺基酸差異的胜肽時，可將該目標胜肽修飾以增強與HLA抗原的結合親和性，及/或增強其Th1細胞及/或CTL誘導能力而不會有此種副作用的危險。
雖然上述對於該HLA第II類抗原具有高度結合親和性的胜肽，預期為高度有效，但是依照存在高度結合親和性當做指標的候選胜肽，仍然進一步要檢驗其Th1細胞誘導能力的存在性。在此，用詞「Th1細胞誘導能力」代表當與抗原呈現細胞(APC)接觸時，胜肽經由抗原呈現細胞(APC)授予誘導Th1細胞的能力。又，「Th1細胞誘導能力」包括胜肽誘導Th1細胞活化及/或Th1細胞增殖、促進Th1細胞媒介細胞激素產生，其包括IFN-γ產生，以幫助及/或刺激其他的細胞(例如CTL、巨噬體)。
Th1細胞誘導能力的確認係由以下方式達成：誘導攜帶人類MHC抗原的APC(例如B-淋巴球、巨噬體、及樹狀細胞(DC))，或更具體而言，由人類周邊血液單核白血球衍生的DC，與以該胜肽刺激後，與CD4-陽性T細胞(CD4+ T細胞)混合，然後測量該CD4+ T細胞生產與釋出的IFN-γ。或者，該胜肽的Th1細胞誘導能力，可藉由Th1細胞對於CTL之活化來評估。比如，將CD4+ T細胞與由測試胜肽刺激的DC一起培養，然後跟CTL及針對CTL之標靶細胞混合。可將目標細胞以51Cr等放射性標定，從該Th1細胞釋出的細胞素所活化的CTL的細胞毒殺活性，可藉由計算從該標靶細胞釋出的放射性活性計算。或者，Th1細胞誘導活性，可藉由測量於經測試胜肽刺激的抗原呈現細胞(APC)存在下，Th1細胞所生產及釋出的IFN-γ，並使用抗IFN-γ單株抗體使培養基上的抑制區可見化來評估。
除了上述修飾，本發明之胜肽可進一步連結於其 他物質，只要所產生之經連結的胜肽保留原始胜肽的Th1細胞誘導能力即可。適當物質的例子包括，例如：胜肽、脂質、糖類及糖鏈、乙醯基、天然及合成的聚合物等。本發明之胜肽可包含修飾，例如糖化、側鏈氧化或磷酸化等，所提供之修飾不會損害該原始胜肽的生物學活性。此等種類修飾可實施以用於提供額外的功能(例如標靶功能，及傳遞功能)，或使該胜肽穩定化。
例如，為了增加一胜肽的體內穩定性，該技術領域中已知導入D-胺基酸、胺基酸擬似物或非天然胺基酸；此概念也可採用於本發明之胜肽。一胜肽的穩定性，可以用多種方式分析。例如可使用胜肽酶及各種生物學介質，例如人類血漿及血清，以測試穩定性(參見例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。
本發明之胜肽，可以與HLA第II類抗原一起以複合體形式呈現於APC之表面，然後誘導Th1細胞。因此本發明也包括與HLA第II類抗原形成複合體在APC表面上的胜肽。呈現本發明胜肽之APC，可作為疫苗接種。
包括在上述複合體中之HLA抗原之形式必須匹配於須治療及/或預防之對象之HLA抗原之形式。例如，日本群體中，HLA-DR4、DR9、DR15及DP2係盛行，故適於治療日本病患。一般而言，臨床上會預先檢查須治療之病患的HLA抗原類型，以能夠適當選擇具有對於特定HLA第II類抗原結合之能力的胜肽。於較佳具體例，本發明之胜肽可以混雜的方式誘導Th1細胞。在此，當胜肽可誘導由至少2種不同的MHC 第II類分子限制之Th1細胞時，則此胜肽之Th1細胞誘導能力係「混雜的(promiscuous)」。換言之，當一胜肽被至少2種不同的MHC第II類分子辨識，則此抗原辨識被視為「混雜的」。當使用於胜肽之上下文，詞彙「由至少2種不同之MHC第II類分子辨識」，係指此胜肽或其片段可結合於至少2種不同的MHC第II類分子。例如，CDCA1胜肽(55-78；序列識別號1)及CDCA1胜肽(39-64；序列識別號2)分別被HLA-DR4、DR15及DP2，和HLA-DR9及DR15辨識。因此此等胜肽係「混雜的」抗原決定位的典型例。
當使用HLA-DR4、HLA-DR15或HLA-ADP2陽性APC，宜使用具有序列識別號：1之胺基酸序列的胜肽。另一方面，當使用HLA-DR9或DR15陽性APC，較佳胜肽係具有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽。
因此於較佳具體例，可使用具有胜肽的序列識別號：1之胺基酸序列，於在誘導前已鑑別具有HLA-DR4、HLA-DR15或HLA-DP2之對象中誘導Th1細胞。同樣地可使用具有胜肽的序列識別號：2之胺基酸序列，於在誘導前已鑑別具有HLA-DR9或DR15之對象中誘導Th1細胞。
III. 製備CDCA1胜肽
本發明之胜肽可使用周知的技術製備。例如本發明胜肽可藉由使用重組DNA技術或化學合成被合成製備。本發明之胜肽可個別合成，或製成包括兩個或更多胜肽的較長的多胜肽。本發明胜肽可之後單離成亦即經精製或單離成實質上不含其他天然發生的宿主蛋白質及其片段，或其他任意的化學物質。
本發明之胜肽可包含修飾，例如糖化、側鏈氧化或磷酸化；所提供之修飾不損害原始參考胜肽的生物學活性。可使用其他說明性的修飾，例如包括引入D-胺基酸或其他胺基酸擬似物，以增加該胜肽的血清半衰期。
本發明之胜肽可依據選擇的胺基酸序列由化學合成獲得。例如可採用於合成的習知胜肽合成方法包括：(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；(iii)Peptide Synthesis(in Japanese),Maruzen Co.,1975；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(in Japanese),Maruzen Co.,1985；(v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese),Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；(vi)WO99/67288；及(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,"Solid Phase Peptide Synthesis",Academic Press,New York,1980,100-118.
或者，本發明之胜肽可採用任何已知用於生產胜肽的的遺傳工程方法獲得(例如Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，先製備庇護有編碼為可表現形式(例如對應於啟動子序列的調節序列的下游)的目標胜肽的聚核苷酸的適當載體，並轉形到適當的宿主細胞中。然後將該宿主細胞培養以生產關注的胜肽。本發明之胜肽也可 採用體外轉譯系統於體外生產。
IV. 聚核苷酸
本發明提供聚核苷酸，其編碼為前述本發明胜肽當中任意者。此包括從天然發生的CDCA1基因(GenBank存取號NM_145697(序列識別號：9))衍生的聚核苷酸，及其具有經保守性修飾的核苷酸序列的那些。在此用詞「經保守性修飾的核苷酸序列」係指編碼為相同或基本上相同的胺基酸序列的序列。因為遺傳密碼的退化性，有大量的功能上相同的核酸會編碼為任意給定的蛋白質。比如，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU都編碼為胺基酸丙胺酸。因此，當密碼子在每個位置指明丙胺酸時，該密碼子可改變成任意對應的所述密碼子，而不會改變所編碼的多胜肽。此種核酸變異為「靜默變異」，其為一種經保守性修飾的變異。每個在此敘述的編碼為一胜肽的核酸，也敘述所有該核酸的可能的靜默變異。該技術領域中具有通常知識者將體認到一核酸中的各密碼子(除了AUG以外，AUG通常為甲硫胺酸的唯一密碼子，而TGG通常為色胺酸的唯一密碼子)可經修飾以產生功能上同一的分子。因此，編碼為一胜肽的核酸的各靜默變異係暗示敘述在各揭露的序列中。
本發明之聚核苷酸可由DNA、RNA及其衍生物構成。如該技術領域中為人所知者，DNA分子係適當的由鹼基例如A、T、C及G構成，而在RNA中T係置換為U。該技術領域中具有通常知識者將體認非天然發生的鹼基也會包括在聚核苷酸中。
本發明之聚核苷酸可編碼為有或沒有中介 (intervening)胺基酸序列的多種本發明之胜肽。例如，該中介胺基酸序列可提供該聚核苷酸或該經轉譯的胜肽的切斷部位(例如，酵素辨識序列)。再者該聚核苷酸可包括對於編碼為本發明胜肽的編碼序列的任何額外的序列。例如該聚核苷酸可為一重組聚核苷酸，其包括對表現該胜肽所需的調節序列，或可為具有標記基因的表現載體(質體)等。一般而言，此種重組聚核苷酸可利用習知的重組技術，使用例如聚合酶及內切核酸酶操作聚核苷酸而製備。
重組及化學合成技術均可使用於生產本發明之聚核苷酸。例如聚核苷酸可藉由插到適當載體中而生產，該載體當轉染到勝任細胞內時可表現。或者，聚核苷酸可使用PCR技術放大，或在適當宿主中表現(參見例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，聚核苷酸可使用固相技術合成，如Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3：801-5所敘述。
V.抗原呈現細胞(APC)
本發明也提供抗原呈現細胞(APC)，其在表面上呈現於HLA第II類抗原與本發明之胜肽或其片段之間形成的複合體。藉由與本發明胜肽接觸而獲得之該APC可由受治療及/或預防的病患獲得，且本身可當做疫苗投予，或與其他包括本發明之胜肽、Th1細胞或CTL的藥物組合投予。
該APC不限於特定種類的細胞，且包括但不限於樹狀細胞(DC)、蘭氏(Langerhans)細胞、巨噬體、B細胞及經 活化的T細胞，此等已知會在表面上呈現蛋白質性抗原，而會被淋巴球所辨識。因為DC係代表性的APC，其在APC中具有最強的Th1細胞誘導活性，故DC當成本發明的APC有用。
再者，於較佳具體例，本發明之胜肽也會誘導經由MHC第I類抗原調節之CTL反應及Th1(第II類)。一般，已周知MHC第I類抗原辨識的抗原決定位的長度較短(例如8-10個胺基酸殘基)於MHC第II類(15或更長)。因此，本發明之胜肽之經處理產物造成誘導CTL。事實上，由CDCA1胜肽(55-78；序列識別號：1)誘導的CTL會辨識已鑑別為CTL辨識抗原決定位之此片段(YMMPVNSEV)。同樣地CDCA1胜肽(39-64；序列識別號：2)在其胺基酸序列中也包含CTL辨識抗原決定位序列VYGIRLEHF。因此本發明之胜肽不僅會誘導Th1，也會在APC中將其處理後誘導CTL。換言之，與本發明之胜肽接觸過的APC會將此等處理以將此等片段與MHC第I類抗原一起呈現，且同時將此等的整體與MHC-第II類抗原一起呈現。結果，使用本發明之胜肽，可以誘導Th1，其辨識與MHC第II類抗原一起呈現於APC之本發明胜肽，並誘導經由該胜肽之已處理片段誘導的CTL。
例如APC可藉由從周邊血液單核球誘導DC，然後使其與本發明之胜肽在體外、生物體外或體內接觸(刺激)而獲得。當本發明之胜肽對於該對象投予時，在該對象的體內會誘導呈現本發明之胜肽或其片段的APC。用語「誘導一APC」，包括以本發明之胜肽接觸(刺激)一細胞以將於HLA第II類抗原與本發明之胜肽或其片段之間形成的複合體呈現於細胞表 面上。或者，於將本發明之胜肽導入於APC使APC呈現此胜肽或其片段後，此等APC可以作為疫苗對於該對象投予。例如生物體外投予可包括以下步驟：a：從第一對象收集APC，b：使步驟a的APC接觸本發明之胜肽，c：對於第二對象投予該已載入胜肽的APC。
該第一對象及第二對象可為同一個體或不同個體。或者，依本發明，提供使用本發明之胜肽製造用於誘導抗原呈現細胞的醫藥組合物的用途。此外，本發明提供製造用於誘導抗原呈現細胞的醫藥組合物的方法或處理，其中此方法包括將本發明之胜肽與醫藥上可接受的擔體混合或配製的步驟。又，本發明也提供用以誘導抗原呈現細胞的本發明之胜肽。由步驟(b)獲得的APC可作為疫苗對於該對象投予。
本發明一態樣中，本發明之APC有高水平的Th1細胞誘導能力。在此，用語「高水平的Th1細胞誘導能力」中，高水平係相對於APC沒有與胜肽或與不會誘導Th1細胞的胜肽接觸時的水平。在此，使用於APC的上下文時，用語「Th1細胞誘導能力」，係指APC當與CD4+ T細胞接觸時誘導Th1細胞的能力。如此之具有高水平之Th1細胞誘導能力的APC可藉由包括於體外將含有編碼為本發明胜肽的聚核苷酸的基因轉移到APC的步驟的方法來製備。該導入的基因可為DNA或RNA形式。導入的方法的例子包括，而無特別限制，可使用各種在該領域中實施的習知方法，例如脂染、電穿孔或磷酸鈣法。更具體而言，可依照Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp Med 1996,184：465-72；國際公開號2000-509281的已公開的日文翻譯所述實施。藉由將該基因傳遞到APC中，該基因會在細胞中進行轉錄、轉譯等，然後獲得的蛋白質會由MHC第I類或第II類處理，並經一呈現路徑進行以呈現本發明之該胜肽。
或者，本發明之APC可藉由以包括使APC接觸本發明胜肽之步驟的方法製備。
於較佳具體例，本發明之APC，可為呈現選自於由HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組中之MHC第II類分子與本發明之胜肽(包括選自序列識別號：1之胺基酸序列)之複合體於其表面上的APC。於另一具體例，本發明之APC可為呈現選自於由HLA-DR9及HLA-DR15構成之群組中之MHC第II類分子與本發明之胜肽(包括選自序列識別號：2之胺基酸序列)之複合體於其表面上的APC。較佳者，HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2可各為HLA-DRB1*04：05、HLA-DRB1*09：01、HLA-DRB1*15：02及HLA-DPB1*02：01。
VI. T輔助1型細胞(Th1細胞)
對抗任意本發明之胜肽所誘導之Th1細胞，會強化任意效應子細胞之免疫反應，此任意效應子細胞包括於體內標靶於癌細胞之CTL，且可以與此胜肽本身以類似方式作為疫苗。因此本發明也提供單離的Th1細胞，其係由任意本發明之胜肽所專一性誘導或活化。
此種Th1細胞，可藉由(1)對於一對象投予一或多 種本發明之胜肽，從此對象收集Th1細胞，(2)於體外以本發明之胜肽接觸(刺激)APC及CD4+ T細胞或周邊血液單核白血球，然後單離的Th1細胞，(3)於體外使CD4+ T細胞或周邊血液單核白血球與本發明之APC接觸，或(4)導入編碼為T細胞受體(TCR)次單元兩者之聚核苷酸或編碼為各TCR次單元之聚核苷酸到CD4+ T細胞中，其中此TCR可結合於MHC第II類分子與本發明之胜肽之複合體。如(3)之方法之APC，可藉由上述方法製備。方法(4)的細節將於以下於項目「VII.T細胞受體(TCR)」詳述。
藉由以本發明APC刺激而誘導之Th1細胞，可衍生自待治療及/或預防之病患，且其本身可供投予，或與包括本發明胜肽之其他藥物組合投予，以調節效應之用途。此獲得之Th1細胞可活化及/或刺激負責細胞免疫之免疫細胞(例如CTL、巨噬體)。可由本發明之Th1細胞活化的此種免疫細胞，包括：對於目標細胞例如癌細胞顯示細胞毒性的CTL。例如針對此CTL之目標細胞，可為內源性表現CDCA1之細胞(例如癌細胞)，或經以CDCA1基因轉染的細胞。於較佳具體例，本發明之胜肽可包括至少一CTL抗原決定位胜肽之胺基酸序列，且除了誘導Th1細胞，也誘導對抗表現CDCA1之細胞例如癌細胞之CTL。於此情形本發明之胜肽，可於體外同時或依序誘導Th1細胞及CTL，且此誘導的Th1細胞可有效活化已誘導的CTL。因此此包括至少一CTL抗原決定位胜肽之胺基酸序列的胜肽，為適於癌症免疫療法的胜肽。
再者，本發明之Th1細胞分泌各種細胞激素(例如 IFN-γ)，其能以抗原獨立的方式，活化及/或刺激對抗其他目標細胞的CTL。因此本發明之Th1細胞，也有助於增強標靶於表現腫瘤關連抗原(TAA)而非CDCA1之細胞的CTL活性。因此，本發明之Th1細胞不僅對於表現CDCA1之腫瘤的免疫療法有效，對於表現其他TAA，及本發明之胜肽與APC之腫瘤也有效。
於一些具體例，本發明之Th1細胞辨識呈現HLA-DR或HLA-DP抗原與本發明之胜肽之複合體的細胞。於Th1細胞之上下文，詞彙「辨識一細胞」，係指經由其TCR結合於細胞表面上的MHC第II類分子與本發明之胜肽的複合體，及被以抗原專一性方式活化。在此，詞彙「被以抗原專一性方式活化」，係指回應於特定MHC第II類分子及胜肽而活化，且誘導從此活化的Th1細胞的細胞素生產。於較佳具體例，HLA-DR可選自於HLA-DR4、HLA-DR9及HLA-DR15構成之群組。較佳者，HLA-DR4、HLA-DR9及HLA-DR15可為HLA-DRB1*04：05、HLA-DRB1*09：01及HLA-DRB1*15：02。另一方面，HLA-DP2為HLA-DP抗原之較佳例。又更佳者，HLA-DP2可為HLA-DPB1*02：01。
VII. 細胞毒性T細胞(細胞毒性T淋巴球或CTL)
所誘導的對抗任意本發明之胜肽的片段的細胞毒性T細胞會在體內強化以癌細胞為目標的免疫反應，且可類似於該胜肽當做疫苗。因此，本發明也提供單離的細胞毒性T細胞，其係由本發明任一胜肽專一性誘導或活化。
此種細胞毒性T細胞可藉由以下獲得(1)對於一對 象投予本發明之一或多種胜肽，從該對象收集細胞毒性T細胞，或(2)使對象衍生的APC及CD8+ 細胞、或周邊血液單核白血球在體外與本發明胜肽接觸(刺激)，然後單離的細胞毒性T細胞。
藉由以呈現本發明胜肽之APC而誘導的細胞毒性T細胞，可衍生自欲治療及/或預防之病患，且可將其本身投予或與其他包括本發明胜肽之藥物組合，以用於調整效應。獲得之細胞毒性T細胞，專一性對抗呈現本發明胜肽，例如與用在誘導為相同之胜肽之目標細胞。此等目標細胞例如內源性表現CDCA1之細胞，或經以CDCA1基因轉染的細胞；及由於以此胜肽刺激而在其細胞表面呈現本發明胜肽之細胞，也可作為已活化的CTL攻擊的目標。
於一些具體例，本發明之CTL，辨識呈現HLA-A2或A24抗原與本發明之胜肽的複合體的細胞。於CTL之上下文，詞彙「辨識一細胞」，係指經由其TCR而結合於細胞表面上之HLA-A2或A24抗原與本發明之胜肽之複合體，並顯示對抗該細胞之專一性細胞毒性活性。在此，「專一性的細胞毒性活性」，係指對於呈現HLA-A2或A24抗原與本發明之胜肽之複合體的細胞顯示細胞毒性活性，而非其他細胞。例如序列識別號：1與2包含HLA-A2辨識抗原決定位之胺基酸序列。因此，從包含序列識別號：1或2之胜肽，會產生針對HLA-A2之理想片段。
VIII. T細胞受體(TCR)
本發明也提供一種組合物，其包含編碼一或多個為多胜肽 的一或多個聚核苷酸，該多胜肽能形成T細胞受體(TCR)的次單元；並提供使用其之方法。該TCR次單元具有形成TCR的能力，其對於CD4+ T細胞提供對抗呈現CDCA1胜肽的APC的專一性。藉由使用該技術領域中的已知方法，可鑑別以本發明之胜肽誘導的Th1細胞的TCR次單元的alpha-與beta-鏈的核酸(WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。衍生物TCR可能以高親和力結合於呈現該CDCA1胜肽的APC，且視情形媒介有效率的細胞素生產。
編碼為TCR次單元的一聚核苷酸/多個聚核苷酸(亦即，編碼為TCR次單元兩者的單一聚核苷酸，或編碼為分開之TCR次單元的多個聚核苷酸)可以包含到適當載體內，例如反轉錄病毒載體。此等載體在該技術領域為人所熟知。該聚核苷酸或包含該聚核苷酸的載體，通常可傳送到CD4+T細胞內，例如來自病患的CD4+ T細胞。有利地，本發明提供一種現成(off-the-shelf)的組合物，能夠快速修飾病患所擁有的T細胞(或另一哺乳動物的T細胞)，而快速及簡單產生具有優異的癌細胞殺死性質的經修飾的T細胞。
本發明更提供Th1細胞，其係藉由將編碼為TCR次單元兩者的聚核苷酸，或編碼為各TCR次單元的聚核苷酸進行性狀引入(transduction)而製備，其中此種TCR次單元能結合於CDCA1胜肽(例如序列識別號：1，於HLA-DR4、HLA-DR15或HLA-DP2背景；及或序列識別號：2，於HLA-DR9或HLA-DR15背景)。該經性狀引入的Th1細胞能夠在體內自導引到癌細胞，且能使用周知的培養方法於體外擴增(例如， Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。上述製備之Th1細胞，可使用於形成免疫原性組合物，而有用於需要治療或保護的病患中之癌症的治療或避免。
IX. 醫藥藥劑或組合物
當本發明的方法與組合物在上下文中指出「治療」癌症有用，若其造成臨床上的益處，例如在該對象中的CDAC1基因表現減低、癌症的大小減小、流行程度或轉移潛力減低，則治療係視為「有效」。當該治療係以預防性使用時，「有效」意指其延遲或防止癌症形成或防止或減輕癌症的臨床症狀。有效係利用任何已知相關用於診斷或治療特定腫瘤形式的方法決定。
若本發明的方法與組合物在上下文中指出「防止」及「預防」癌症有用，此等用語係在此可互換地意指任何減低由於疾病所致之死亡率或發病率之負擔的活性。防止及預防可發生於「初級、次級及三級防止水平」。初級防止及預防避免發展出疾病，次級及三級防止及預防水平包含目標為防止及預防疾病進展及展現出症狀及藉由回復功能及減少疾病相關併發症以減少已建立的疾病的影響的活性。或者，防止及預防可包括廣泛的療法，其目標係減輕特定病症的嚴重度，例如減少腫瘤的增殖及轉移、減少血管新生。
本發明上下文中，治療及/或預防癌症及/或防止其術後再發，包括以下任何步驟，例如以外科手術移除癌細胞、抑制癌化細胞的生長、腫瘤退化或回復、誘導緩解及抑制腫瘤發生、腫瘤回復，及減少或抑制轉移。有效的治療及/或預防癌症減少死亡率並改善患癌的個體的預後，減少腫瘤標記物在 血液中的水平，並減輕伴隨癌症的可偵測的症狀。例如，減少或改善症狀構成有效治療及/或預防，包括10%、20%、30%或以上減少，或穩定的疾病。
如上所述，本發明胜肽誘導的Th1細胞能幫助負責細胞免疫之免疫細胞。此種免疫細胞不僅包括對抗表現CDCA1之癌細胞的CTL，也包括對抗表現其他TAA之癌細胞的CTL，由於由Th1細胞分泌的細胞素能以抗原獨立的方式影響CTL。因此本發明提供一種醫藥試劑或組合物，其包含本發明之胜肽中至少一種。於此醫藥試劑或組合物，此胜肽之量係存在治療上或醫藥上有效量。
本發明之醫藥試劑或組合物在幫助、刺激及/或增強任何負責細胞免疫之免疫細胞(例如CTL、巨噬體)為有用，由於本發明之藥試劑或組合物誘導的Th1細胞能分泌影響任何負責細胞免疫之免疫細胞的細胞素。因此，本發明之試劑或組合物對於任何將由包括CTL之此種免疫細胞媒介的免疫反應予以增強或促進的用途有用。例如因為本發明之試劑或組合物能增強或促進對抗由此等免疫細胞媒介的癌或腫瘤的免疫反應，本發明提供包含至少一種本發明之胜肽的試劑或組合物，以用治療及/或預防癌。此種試劑或組合物中的此胜肽量，可為對於罹有表現CDCA1之癌的對象中顯著增強或刺激免疫反應為有效的量。
又，如於圖6中所示，在本發明內容中鑑別的CDCA1衍生之胜肽，已確認會比起僅以CTL抗原決定位刺激，更增強CTL誘導。因此本發明也提供一種試劑或組合物， 供增強或刺激由MHC第I類抗原，例如HLA-A2及HLA-A24媒介的免疫反應。於另一具體例，本發明更提供本發明胜肽之用途，以供製造用於增強或刺激由MHC第I類抗原媒介的免疫反應的試劑或組合物。
於較佳具體例，在本發明內容中鑑別的CDCA1衍生之胜肽可誘導Th1細胞，及對抗CDCA1表現細胞之CTL。因此本發明也提供包含至少一種本發明胜肽之試劑或組合物，以供用於誘導對抗表現CDCA1之癌或腫瘤的CTL。
又，包含至少一種本發明胜肽之試劑或組合物，可用於增強或促進由MHC第II類分子媒介的免疫反應。
因為CDCA1表現在一些癌類型中，包括乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)，相較於在正常組織中係專一性的提高(Cancer Res 2006 Nov 1；66(21)：10339-48,WO2005/028676,WO2005/089735,WO2006/085684,WO2007/013665,WO2007/013671)，本發明之胜肽或編碼為此胜肽之聚核苷酸，可用於癌或腫瘤之治療及/或預防，及/或用於防止其術後再復發。因此，本發明提供一種醫藥試劑或組合物，供癌或腫瘤之治療及/或供預防，及/或防止其術後再復發，其包含一或多種本發明之胜肽、或編碼為此胜肽之聚核苷酸，作為有效成分。或者，本發明之胜肽可以被表現在任意前述細胞的表面上，例如APC，以用於作為醫藥試劑或組合物。此外上述Th1細胞也可用於作為本發明之醫藥癌或腫瘤之劑或組合物的有效成分。
於另一具體例，本發明也提供使用有效成分製造 供治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或藥劑的用途，該有效成分選自以下：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
或者本發明更提供一種有效成分，使用於治療癌症或腫瘤，該有效成分選自以下：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
或者本發明更提供製造用於治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或試劑的方法或處理，其中該方法或處理包括將醫藥上或生理上可接受的擔體與選自以下的有效成分配製的步驟：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
於另一具體例，本發明也提供製造用於治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或試劑的方法或處理，其中該方法或處理 包括將有效成分與醫藥上或生理上可接受的擔體混合的步驟，其中該有效成分選自以下：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
或者，本發明之醫藥組合物或此種試劑可用於預防癌症或腫瘤及預防其術後再發中之一者或兩者。
本發明之醫藥試劑或組合物作為疫苗有用。本發明上下文中，詞彙「疫苗」(也稱為免疫原性組合物)，係指經由對動物接種，有誘導抗腫瘤免疫性的功能的組合物。
本發明之醫藥藥劑或組合物可用於治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或預防其在對象或病患中之術後復發或轉移復發。此等對象的例子包括人及其他哺乳動物，包括但不限於小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒及黑猩猩，尤其是商業上為重要的動物或家畜。
本發明中，具有選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列的胜肽，已發現係由數種HLA-DR及/或HLA-DP分子(即HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15、HLA-DP2)限制的混雜的Th1細胞抗原決定位，且可作為能誘導有效且專一性的對抗由於MHC第II類分子媒介的免疫反應之癌症的免疫反應的候選者。因此包括具有序列識別號：1或2之胺基酸序列的此等胜肽中的任一者的本發明的醫藥試劑或組合物，特別適於對於 至少具有選自HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2中作為MHC第II類分子的對象來投予。對於包含編碼為此等胜肽中任一者的聚核苷酸的醫藥藥劑或組合物也同樣適用。
或者於較佳具體例，本發明鑑別之胜肽，當施用到具有HLA-A2或HLA-A24之對象時，也可誘導對於CDCA1專一之CTL。因此藉由投予本發明之胜肽，可更預期除了Th1細胞誘導外，可誘導對抗表現CDCA1之癌的CTL反應。又，本發明之胜肽不僅經由將其處理而誘導對抗CDCA1表現細胞之CTL反應，也藉由因其為媒介之Th1細胞誘導而增強之。因此為了達成在同一對象中誘導Th1細胞及CDCA1專一性CTL兩者，當投予具有序列識別號：1之胺基酸序列之胜肽時，例如欲治療的對象宜具有選自HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2中至少一者作為MHC第II類分子及HLA-A2或HLA-A24作為MHC第I類分子。同樣地，藉由對於具有HLA-DR9及/或DR15作為MHC第II類分子及HLA-A24作為MHC第I類分子之對象投予具有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽時，可達成該對象中Th1細胞與CDCA1專一性CTL兩者之誘導。
於另一具體例，本發明提供依存於Th1細胞誘導之癌免疫療法。本發明提供之此治療策略可應用且有用於任何獨立於CDCA1表現之癌，只要由Th1細胞分泌的細胞素所活化的免疫細胞係以對象癌細胞為目標。
本發明之醫藥試劑或組合物欲治療的癌或腫瘤包括但不限於，且此等癌之較佳例包括表現CDCA1之任何種類之癌症 或腫瘤，包括，例如乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。
本發明之醫藥試劑或組合物，除了含有上述有效成分，也可含有其他有能力誘導Th1細胞或CTL之胜肽、其他編碼為其他胜肽之聚核苷酸、呈現其他胜肽或其片段之其他細胞等。此種具有誘導Th1細胞或CTL之能力的「其他」胜肽的例子，包括但不限於源自癌專一性抗原(例如已鑑別之TAA)的胜肽，但不限於此。
若需要，本發明之醫藥試劑或組合物可視情形包括其他治療物質當作額外之有效成分，只要該物質不會抑制該有效成分例如本發明胜肽中任一者的抗腫瘤作用即可。例如，配方可包括抗發炎試劑、止痛劑、化學療劑等。除了在藥劑本身當中的其他治療物質，本發明的藥劑也可依序或同時投予一種或更多其他藥理試劑。藥劑及藥理組合物的量，取決於例如使用的藥理試劑的形式、欲治的疾病及投予的時程及路徑。
該技術領域中具有通常知識者應瞭解除了此處特別提及的成分以外，本發明之醫藥試劑或組合物可包括在該技術領域中常見關於配方形式使用的其他試劑(例如，填料、黏結劑、稀釋劑、賦形劑者)。
本發明之一具體例中，該醫藥試劑或組合物可包裝在製造品與套組中，該套組含有治療欲治療的疾病例如癌症的致病情形的有用的物質。製造品可包括附有標記的任意該醫藥試劑或組合物的容器。適當的容器包括瓶、小玻璃瓶及試管。該容器可由各種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器上的標 記必需指示該試劑係用於治療或預防該疾病的一種以上的病況。該標記也可顯示投予指示等。
除了上述容器以外，包含本發明的醫藥試劑或組合物的套組可以視情形更包括第二容器，其盛裝醫藥上可容許的稀釋劑。從商業及使用者所需角度，可更包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、針筒及使用指示之包裝插入物。
該醫藥組合物視需要，可放在包裝或分配裝置中，其可包含一種或更多含有該有效成分的單位的劑量。該包裝例如包括金屬或塑膠箔，例如泡殼包裝。該包裝或分配裝置可以隨附投予指示。
(1)含有該胜肽當做有效成分之醫藥試劑或組合物
本發明之胜肽可直接當做醫藥試劑或組合物投予，或若需要以習知配製方法配製。於後者，除了本發明之胜肽，可適當使用通常使用於藥物的擔體、賦形劑等而無特殊限制。此等擔體的例子包括，但不限於無菌水、生理鹽液、磷酸鹽緩衝液、培養液等。再者該醫藥試劑或組合物視需要可包含安定劑、懸浮劑、保存劑、界面活性劑等。本發明之醫藥藥劑或組合物可用於抗癌症用途。
本發明之胜肽可組合製備成包括兩種或更多本發明之胜肽，以在體內誘導Th1細胞。該胜肽組合可採混合(雞尾酒)形式或使用標準技術彼此接合。例如，該胜肽可以化學連結或表現成單一融合的多胜肽序列。該組合中的胜肽可相同 或不同。
藉由投予本發明之胜肽，該胜肽或其片段藉由該HLA第II類抗原在APC以高密度呈現，然後誘導對於由該呈現的胜肽與該HLA第II類抗原之間形成的複合體為專一性反應的Th1細胞。或者從對象移出APC(例如DC)然後以本發明之胜肽刺激以獲得在其細胞表面呈現任何本發明之胜肽或其片段的APC。此等APC再度對該對象投予以在該對象中誘導Th1細胞，結果可增加對於腫瘤關聯內皮的侵犯。
包括本發明之胜肽當做有效成分之該用於癌症或腫瘤之治療及/或預防的醫藥試劑或組合物，也可包括已知使細胞免疫有效建立之佐劑。或此醫藥試劑或組合物可以與其他有效成分一起投予，且可藉由配製為顆粒投予。佐劑意指當與具有免疫學活性的蛋白質一起(或連續)投予時，會增強對於蛋白質的免疫反應的一化合物。於此考慮的佐劑包括文獻中敘述者(Clin Microbiol Rev 1994,7：277-89)。適合之佐劑的例子包括但不限於磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門毒素、不完全的佛氏佐劑(Incomplete Freund's adjuvant,IFA)、完全的佛氏佐劑(Complete Freund's adjuvant,CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、O/W乳劑等。
再者，可便利地使用微脂體配方、顆粒配方其中該胜肽結合於數微米直徑的珠粒、及脂質結合於該胜肽的配方。
於本發明另一具體例，本發明之胜肽也可以於醫藥上可接受的鹽的形式投予。較佳的鹽的例子包括與鹼金屬的鹽、與金 屬的鹽、與有機鹼的鹽、與有機酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲烷磺酸等)的鹽及與無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等)的鹽。在此使用之用語「醫藥上可接受之鹽」係指保留該化合物之生物學效力以及性質且可藉由與無機酸或鹼例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等反應而獲得之鹽。
於有些具體例，本發明之醫藥試劑或組合物可更包括會啟動Th1細胞，且選擇性啟動CTL的成分。脂質已鑑別係能夠於體內啟動對抗病毒抗原的Th1細胞，選擇性啟動CTL的試劑。例如可將棕櫚酸殘基附著在離胺酸殘基的epsilon-及alpha-胺基然後連結到本發明之胜肽。然後可將該脂質化的胜肽直接以微胞或微粒投予、包入微脂體或於佐劑中乳化而投予。另一例的脂質啟動Th1細胞且選擇性地起動CTL反應，當共價附著於一適當胜肽時，可使用E.coli脂蛋白，例如三棕櫚醯基-S-甘胺醯基半胱胺醯基-絲胺醯基-絲胺酸(P3CSS)可啟動Th1細胞且選擇性起動CTL(參見例如Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)。
適當的投予方法的例子可包括，但不限於口服、皮內、真皮下、肌肉內、髓內、腹膜、靜脈內注射等，及全身性投予或對於目標部位的鄰近處局部投予(即直接注射)。該投予可藉由單一投予或以多次投予追加實施。可將醫藥上或治療上有效量之此胜肽對於須要治療表現CDCA1之癌症的對象投予。或者可將足以增強或刺激由Th1細胞媒介之免疫反應及/ 或誘導對抗表達CDCA1之癌症或腫瘤之CTL的本發明胜肽，對於罹患表現CDCA1之癌症的對象投予。本發明之胜肽的劑量可依照欲治療的疾病、病患年紀、體重、投予方法等適當調整，且通常為0.001mg至1,000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如0.5mg至5mg，且可數天至數月投予一次。該技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適當且最適的劑量。
(2)含有聚核苷酸當做有效成分的醫藥試劑或組合物
本發明之醫藥試劑或組合物也可以可表現形式包括編碼為在此揭露的胜肽的聚核核酸。在此用詞「於可表現的形式」意指當聚核苷酸導入細胞中時，會在體內表現為誘導抗腫瘤免疫性的多胜肽。於說明的具體例中，關注的聚核苷酸的核酸序列包括表現該聚核苷酸需要的調節要素。該聚核苷酸可裝備為可達到在目標細胞的基因體中穩定插入(參見例如Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors。亦參見例如Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；美國專利號碼5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；and WO 98/04720)，DNA-為主的運送技術的例子包括「裸DNA」、經促進的(普寧卡因(bupivacaine)、聚合物、胜肽-媒介的)運送、陽離子性脂質複合體及微粒媒介的(「基因槍」)或壓力媒介的運送(參見例如美國專利號碼5,922,687)。
本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體表現。表 現載體的例子包括減毒病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法涉及使用牛痘病毒，例如當作載體以表現編碼為該胜肽的核苷酸序列。藉由導入宿主中，該重組牛痘病毒會表現該免疫產生性胜肽，且因而引起免疫反應。有用於免疫實驗步驟的牛痘載體與方法敘述於例如美國專利號碼4,722,848。另一載體為BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體敘述於Stover et al.,Nature 1991,351：456-60。廣泛種類之其他有用於治療性投予或免疫的載體例如腺病毒及腺病毒相關的病毒載體、反轉錄病毒載體、傷寒載體、去毒炭疽毒素載體等是顯而易見。參見例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85。
將聚核苷酸運送到病患可為直接進行，於此情形使病患直接暴露於攜帶聚核苷酸的載體，或間接進行，於此情形先使細胞以關注的聚核苷酸於體外轉形，然後將該細胞移殖到對象中。此兩種方法各已知為體內及生物體外基因療法。
針對基因治療的方法的一般評論，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215)。可適用於本發明該技術領域中普通已知的的重組DNA技術的方法，敘述於Ausubel et al.,in Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；及Krieger,in Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990。
如同胜肽的投予，聚核苷酸的投予方法可為口服、皮內、真皮下、髓內、腹腔的及/或靜脈內注射等，且全身性投予或對於目標部位的鄰近處局部投予係有用。該投予可藉由單一投予或以多次投予追加實施。可將醫藥上或治療上有效量之此聚核苷酸對於須要治療表現CDCA1之癌症的對象投予。或者可將足以增強或刺激由Th1細胞中介之免疫反應及/或誘導對抗表達CDCA1之癌症或腫瘤之CTL的本發明聚核苷酸，對於罹患表現CDCA1之癌症的對象投予。於適合擔體或經編碼為本發明胜肽的聚核苷酸轉形的細胞中的聚核苷酸的劑量可依照欲治療的疾病、病患年紀、體重、投予方法等適當調整，且通常為0.001mg至1,000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如，0.5mg至5mg，且可數天至數月投予一次。該技術領域中具有通常知識者可輕易選擇適當及最適的劑量。
X. 使用該胜肽、APC或Th1細胞的方法
本發明之胜肽及編碼為此胜肽之聚核苷酸可用於誘導本發明之APC及Th1細胞。本發明之APC也可用於誘導本發明之Th1細胞。該胜肽、聚核苷酸及APC可與其他任何化合物組合使用，只要該額外的化合物不會抑制Th1細胞誘導能力即可。因此任意上述本發明之醫藥試劑或組合物可用於誘導Th1細胞，此外，可用於誘導APC的包括該胜肽及聚核苷酸說明如下。
(1)誘導抗原呈現細胞(APC)的方法
本發明提供使用本發明之胜肽或編碼為此胜肽之聚核苷酸誘導APC的方法。誘導APC可如上述項目「VI.抗原呈現細胞」般實施。本發明也提供一種誘導具有Th1細胞誘導能力之APC之方法，此誘導也已在上述項目「VI.抗原呈現細胞」中提及過。
或者本發明提供提供製備具有誘導Th1細胞之能力的抗原呈現細胞(APC)之方法，其中此方法可包括以下步驟之一：(a)使本發明胜肽於體外、生物體外或體內與APC接觸；及(b)將編碼為本發明胜肽之聚核苷酸導入到APC中。
或者本發明提供誘導具有Th1細胞誘導能力之APC之方法，其中此方法包括選自以下群組中之步驟：(a)使本發明之胜肽與一APC接觸，(b)將編碼為本發明胜肽之聚核苷酸導入一APC中。
本發明之方法可於體外、生物體外或體內實施。較佳為，本發明之方法可於體外或生物體外實施。在較佳具體例中，用於誘導具有Th1細胞誘導能力之APC的APC，較佳為表現擇自HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2中之至少1種作為MHC第II類分子之APC。此種APC可藉由該技術領域中周知的技術，從具有擇自HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2中之至少1種作為MHC第II類分子的對象所獲得之周邊血液單核細胞(PBMC)製備。本發明之方法所誘導之APC可為在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段與 HLA第II類抗原(例如HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15、HLA-DP2)之複合體的APC。當投予本發明之方法所誘導之APC到一對象以誘導於該對象中對抗癌症之免疫反應時，該對象較佳為與APC的來源為同一者。然而，該對象也可與APC捐贈者為不同者，只要該對象與APC捐贈者具有相同HLA類型即可。
於另一具體例，本發明提供用於誘導具有Th1細胞誘導能力的APC的試劑或組合物，且此種試劑或組合物包括本發明之胜肽或聚核苷酸中1或更多種。
於另一具體例，本發明提供本發明之胜肽或編碼為該胜肽的聚核苷酸之用途，其係用於製造試劑或組合物以配製供誘導APC。
或者，本發明更提供本發明之胜肽或編碼為該胜肽的聚核苷酸之用途，係用於誘導具有Th1細胞誘導能力之APC。
於較佳具體例，本發明之胜肽不僅可誘導Th1反應，還可於將其處理後誘導CTL反應。因此於較佳具體例，本發明之方法製備的APC對於誘導對抗表現CDCA1之細胞的CTL，包括誘導對抗癌細胞之CTL亦有用。例如當由含有序列識別號：3之胺基酸序列的胜肽誘導時，表現HLA-A2之APC係適於誘導CDCA1專一性CTL。或者當由含有序列識別號5：之胺基酸序列的胜肽誘導時，表現HLA-A24之APC係適於誘導CDCA1專一性CTL。
(2)誘導Th1細胞的方法
此外，本發明也提供使用本發明之胜肽、編碼為此胜肽之聚核苷酸、或呈現本發明之胜肽或其片段之APC誘導Th1細胞的方法。本發明也提供使用編碼為多胜肽(即，TCR次單元)的一聚核苷酸誘導Th1細胞的方法，該多胜肽能形成辨識本發明之胜肽與HLA第II類抗原的複合體的T細胞受體(TCR)。較佳者，誘導Th1細胞的方法包括選自以下步驟至少其中之一：a：使CD4+ T細胞與抗原呈現細胞接觸，該抗原呈現細胞在其表面呈現HLA第II類抗原與本發明胜肽或其片段的複合體；b：導入編碼TCR次單元兩者之聚核苷酸或編碼TCR次單元之各個的聚核苷酸到CD4+細胞內，其中TCR能夠辨識或結合本發明之胜肽或其片段與HLA第II類抗原的複合體。
當投予本發明之胜肽到對象中時，會在該對象體內誘導Th1細胞，且由MHC第II類分子媒介的(例如以該癌細胞為目標的之免疫反應)免疫反應強度增強。或者，該胜肽及編碼為該胜肽之聚核苷酸可用於一生物體外的治療法，其中，該對象來源的APC、CD4陽性細胞或周邊血液單核白血球和本發明胜肽在體外接觸(刺激)，誘導出Th1細胞後，已活化的Th1細胞回到該對象。例如該方法可包括以下步驟：a：從該對象收集APC；b：使步驟a的APC接觸本發明之該胜肽；c：將步驟b之APC與CD4+ T細胞混合並共同培養，以誘導Th1細胞，及d：從步驟c之共同培養物收集CD4+ T細胞。
再者，可藉由導入編碼為TCR次單元兩者之一聚核苷酸或編碼為各TCR次單元之多個聚核苷酸到CD4陽性T細胞內來誘導Th1細胞，其中，該TCR能夠結合於本發明之胜肽或其片段與HLA第II類抗原的複合體。此種的轉導可如項目「VIII.T細胞受體(TCR)」所述般實施。
本發明之方法可於體外、生物體外或體內實施。較佳者，本發明之方法可於體外或生物體外實施。用於誘導Th1細胞的CD4陽性T細胞可藉由該技術領域周知的方法從對象獲得之PBMC製備。於較佳具體例，CD4陽性T細胞的捐贈者可為具有至少一選自HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2作為MHC第II類分子的對象。由本發明之方法誘導的Th1細胞，可為能辨識在其表面呈現本發明胜肽或其片段與HLA第II類抗原之複合體的APC者。當本發明方法所誘導之Th1細胞對於一對象投予以誘導該對象中對抗癌症之免疫反應(或由MHC第I類分子媒介之免疫反應)時，該對象較佳為與CD4陽性T細胞之來源為同一對象。但，該對象也可與CD4陽性T細胞之來源為不同對象，只要該對象與CD4+ T細胞之捐贈者有相同HLA類型即可。
於較佳具體例，本發明之胜肽可誘導對抗表現CDCA1之細胞的CTL，及誘導Th1細胞。因此本發明更提供用於誘導CTL之方法，其包含選自以下構成之群組的至少一步驟：a：將CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞兩者與已接觸本發明胜肽之APC共同培養；及 b：將CD8陽性T細胞與與已接觸本發明胜肽之APC共同培養。
於此種誘導CTL之方法，本發明之胜肽在APC中被處理以產生CTL抗原決定位胜肽，且產生之CTL抗原決定位胜肽被呈現在APC的表面。
或者依本發明，提供本發明之胜肽之用途，係供製造誘導Th1細胞之醫藥試劑或組合物。此外本發明提供一種用於製造誘導Th1細胞之醫藥試劑或組合物之方法或處理，其中此方法包含將本發明之胜肽與醫藥上可接受之擔體混合或配製之步驟。又，本發明也提供用於誘導Th1細胞之本發明之胜肽。
由本發明方法誘導之CD4+ T細胞，可對於一對象投予以作為疫苗。
本發明上下文中，過度表現CDCA1之癌症可以此等有效成分治療。此種癌的例子，包括但不限於：乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。因此在投予包含此有效成分之疫苗或醫藥組合物前，宜先確認是否在欲治療之癌細胞或組織中，比起相同器官的正常細胞，CDCA1的表現水平有所增加。因此於一具體例，本發明提供一種用於治療(過度)表現CDCA1之癌症之方法，此方法可包括以下步驟：i)測定在欲治療癌症的對象獲得的癌細胞或組織當中的CDCA1表現水平；ii)將此CDCA1表現水平與正常的對照組比較；及 iii)投予由上述(a)至(d)構成之群組中至少一成分至患有比起正常對照組而言有過度表現CDCA1之癌症的對象。
或者本發明可提供疫苗或醫藥組合物以供對罹患過度表現CDCA1之癌的對象投予，其包括選自由上述(a)至(d)構成之群組中至少一種成分。換言之本發明更提供鑑別欲以本發明CDCA1多胜肽治療之對象的方法，此方法包括決定衍生自對象之癌細胞或組織中的CDCA1表現水平的步驟，其中，相較於該基因之正常對照為增加的水平代表此對象具有可用本發明之CDCA1多胜肽治療的癌症。本發明之癌症治療方法將於以下更詳細敘述。
再者，於較佳具體例，可於投予本發明胜肽前先鑑別一對象之HLA型。例如宜對於鑑別為具有HLA-DR4、HLA-DR15或HLA-DP2之對象投予具有序列識別號：1之胺基酸序列的胜肽。或者，宜對於鑑別為具有HLA-DR9或HLA-DR15之對象投予具有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽。
可使用任何由對象而來的細胞或組織決定CDCA1表現，只要其包括CDCA1的目標轉錄或轉譯產物即可。適合的樣本的例子包括但不限於體組織及體液，例如血、唾液及尿。較佳者，由對象而來的細胞或組織樣本含有包括上皮細胞的細胞群體，更佳為癌上皮細胞或由懷疑為癌的組織所衍生的上皮細胞。又，視需要可從獲得的體組織及體液純化該細胞然後使用當做對象衍生的樣本。
以本發明方法治療的對象較佳為哺乳動物。哺乳動物例如包括但不限於例如人、非人類靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、 馬及牛。
依照本發明，可決定由一對象獲得的癌細胞或組織中的CDCA1表現水平。該表現水平可於轉錄(核酸)產物層級，使用該技術領域已知的方法決定。例如CDCA1的mRNA可以藉由雜交法使用探針定量(例如北方雜交法)。該檢測可於晶片上、陣列上等實施。使用陣列對於偵測CDCA1的表現水平為較佳。該技術領域中具有通常知識者可利用CDCA1的序列資訊製備此種探針。例如可使用CDCA1的cDNA當做探針。視需要，可將該探針以適合的標記例如染料、螢光物質及同位素標記，且該基因的表現水平可以該雜交的標記的強度檢測。
再者，CDCA1的轉錄產物(例如序列識別號：9)，可藉由擴增為主的檢測方法(例如RT-PCR)使用引子定量。此種引子可依照該基因可得的序列資訊製備。
具體而言，將供本發明使用的探針或引子於嚴苛、中度嚴苛或低嚴苛條件下，雜交於CDCA1之mRNA。此處使用的用詞「嚴苛(雜交)條件」係指在此條件下，探針或引子會雜交於其目標序列但不會與其他序列雜交。嚴苛條件為序列依存性，且在不同狀況下會不同。較長序列的特定雜交比起較短的序列會在較高溫觀察到。一般而言，嚴苛條件的溫度係選自比起特定序列在一定義的離子強度及pH時的熱熔點(Tm)低約攝氏5度的溫度。該Tm係指50%互補於其目標序列的探針與該目標序列之雜交達到平衡的溫度(於一定義的離子強度、pH及核酸濃度)。由於該目標序列一般係過量呈現，於Tm，50%的探針會以平衡佔據。通常嚴苛條件為鹽濃度少於約1.0M鈉離 子，通常約0.01至1.0M鈉離子(或其他鹽)、pH 7.0至8.3，且對於短的探針或引子(例如10至50個核苷酸)，溫度至少約攝氏30度，對於較長的探針或引子，至少約攝氏60度。嚴苛條件也可藉由添加去安定物質例如甲醯胺而達到。
或者可偵測轉譯產物以診斷本發明。例如可決定CDCA1蛋白質(序列識別號：10)的量。確認轉譯產物的蛋白質量的方法，包括使用專一性辨識該蛋白質的抗體的免疫分析方法。該抗體可為單株抗體或多株抗體。再者可使用抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)以供偵測，只要該片段或修飾抗體保留對於該CDCA1蛋白質的結合能力即可。製備此種用於偵測蛋白質的抗體的方法在該技術領域中為周知，且可採用任意方法於本發明中以製備此種抗體及其均等物。
就基於轉譯產物偵測CDCA1基因的表現水平的另一方法而言，染色強度可使用對抗該CDCA1蛋白質的抗體，利用免疫組織化學分析測定。亦即，於該測量中，強染色代表該蛋白質的存在/水平增加，且同時，CDCA1基因表現水平高。
目標基因例如CDCA1基因於癌細胞中的表現水平，若水平比起該目標基因的對照組水平(例如於正常細胞中的水平細胞)增加例如10%、25%或50%；或增加超過1.1倍、高於1.5倍、高於2.0倍、高於5.0倍、高於10.0倍或更多，則決定為增加。
該對照水平可與癌細胞同時決定，係藉由使用預先從對象收集並保存的樣本實施，該對象的疾病狀態(有罹癌 或未罹癌)為已知。此外，從具有欲治療的癌的一器官的非癌化區獲得的細胞可當做正常對照。或者該對照水平可依據先前對於從疾病狀態已知的對象得到的樣本中CDCA1基因的表現水平決定的結果分析的統計方法決定。再者，該對照水平可從衍生自先前測試的細胞的表現樣式的資料庫衍生。又，依照本發明一態樣，於一生物學樣本中的CDCA1基因表現水平可以與從多個參考樣本決定的多個對照水平比較。較佳為使用從衍生自與該對象得到的生物學樣本類似的組織類型的參考樣本所決定的對照水平。再者，較佳為使用疾病狀態已知的群體當中的CDCA1基因的表現水平的標準值。該標準值可由該技術領域中已知的任意方法獲得。例如，平均值+/- 2 S.D.或平均值+/- 3 S.D.的範圍可當作該標準值。
本發明文中，由已知非癌化的生物學樣本決定的對照水平，稱為「正常對照水平」。另一方面，若該對照水平係從癌化的生物學樣本決定，其稱為「癌化的對照水平」。樣本表現水平與對照水平之間的差異可常態化為對照核酸例如管家基因的表現水平，其表現水平已知不會取決於細胞的癌化或非癌化而不同。示例之對照基因包括但不限於beta-肌動蛋白、甘油醛3磷酸去氫酶及核糖體蛋白質P1。
當CDCA1基因的表現水平比起正常對照水平為增加時，或者相近/均等於癌化對照水平時，該對象可診斷為患有欲治療的癌症。
更具體而言，本發明提供一種方法，係(i)診斷是否一對象患有欲治療的癌症及/或(ii)選擇供癌症治療的對象，該方法 包括以下步驟：a)測定由懷疑患有欲治療的癌症的對象獲得的癌細胞或組織中的CDCA1表現水平；b)比較其CDCA1表現水平與正常對照水平；c)若CDCA1的表現水平比起正常對照水平為增加，則診斷該對象是患有欲治療的癌症；d)若步驟c)中診斷該對象患有欲治療的癌症時，則選擇供癌症治療的對象。
或者該方法可包括以下步驟：a)測定由懷疑患有欲治療的癌症的對象獲得的癌細胞或組織樣本中的CDCA1表現水平；b)比較其CDCA1表現水平與癌化對照水平；c)若CDCA1的表現水平相似於或等同於癌化對照水平，則診斷該對象是患有欲治療的癌症；及d)若步驟c)中診斷該對象患有欲治療的癌症時，則選擇供癌症治療的對象
於一些具體例，此方法在上述定義的a)-d)步驟後，可更包含鑑別具有選自於由HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組之HLA的對象的步驟。依本發明之癌症療法較佳係針對罹患過度表現CDCA1之癌且具有HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2中之任一者的對象。HLA分型的方法係該技術領域中為人熟知者。例如針對將HLA對偶基因分型的以PCR為主的方法係為人熟知。專一於各HLA分子的抗體，在鑑別一對象之HLA型時亦為適當 的工具。
本發明也提供一種套組，係用於確認患有可利用本發明之CDCA1多胜肽治療的癌症的對象，其也對於評估及/或特定癌症療法，更特別是監控癌症免疫療法的效力或適用性是有用的。適合之癌症的說明性例子包括但不限於乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。尤其，該套組較佳為包括偵測對象衍生的癌細胞中的該CDCA1基因的表現的至少一種試劑，該試劑可選自以下群組：(a)偵測該CDCA1基因之mRNA的試劑；(b)偵測該CDCA1蛋白質的試劑；及(c)偵測該CDCA1蛋白質的生物學活性的試劑。
適合偵測該CDCA1基因之mRNA的試劑的例子，可包括專一性結合於該CDCA1 mRNA或鑑別該CDCA1 mRNA的核酸，例如具有互補於該CDCA1 mRNA的序列的寡核苷酸。此等種類的寡核苷酸例如專一於該CDCA1 mRNA的引子及探針。此等種類的寡核苷酸可依照該技術領域周知的方法製備。若需要，可將偵測該CDCA1 mRNA的試劑固定化在固體基質上。又，該套組中可包括多於一種偵測該CDCA1 mRNA的試劑。
另一方面，適合偵測該CDCA1蛋白質的試劑的例子，包括對於該CDCA1蛋白質的抗體。該抗體可為單株抗體或多株抗體。再者，可使用抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)當做該試劑，只要該片段或 修飾抗體保留對於該CDCA1蛋白質的結合能力即可。製備此等種類的偵測蛋白質的抗體的方法，在該技術領域為人周知，且可在本發明中採用任意方法以製備此種抗體及其均等物。再者，該抗體可經由直接連結或間接標定技術而以訊號產生分子標記。標記抗體及偵測該抗體結合於其目標的標記及方法，在該技術領域係為人周知，且在本發明可使用任意標記及方法。又，該套組中可包括多於一種偵測該CDCA1蛋白質的試劑。
該套組可含有多於一種的上述試劑。例如由沒有癌症或患有癌症的對象獲得的組織樣本，可當做有用的對照試劑。本發明的套組從商業及使用者角度所需，可更包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、針筒及有使用指示的包裝插入物(例如紙、錄音帶、CD-ROM等)。此等試劑保留在有標籤的容器中。適合的容器包括瓶、小玻璃瓶及試管。此等容器可由各種材料形成，例如玻璃或塑膠。
本發明之一具體例中，當該試劑為對抗該CDCA1mRNA的探針時，該試劑可固定化在固體基質上，例如多孔條，以形成至少一個偵測部位。該多孔條的測量或偵測區可包括多個部位，各含有核酸(探針)。試條也可含有供陰性及/或陽性對照的部位。或者對照部位可位在與試條分開的條片上。視情形，該不同的偵測部位可含有不同量的固定化核酸，亦即在第一偵測部位為較高量，而在接續的部位為較低量。藉由添加測試樣本，顯示可偵測訊號的部位的數目提供存在於該樣本中的CDCA1 mRNA量的定量指示。該偵測部位可為任何適於偵測的形狀，通常為或跨越試條寬度方向的桿狀或點狀。
本發明的套組可更包含陽性對照樣本或CDCA1標準樣本。本發明的陽性對照樣本可藉由收集CDCA1陽性樣本，然後分析其CDCA1水平而製備。或者可對不表現CDCA1的細胞添加純化的CDCA1蛋白質或聚核苷酸，以形成該陽性樣本或該CDCA1標準樣本。本發明中，純化的CDCA1可為重組蛋白質。該陽性對照樣本的CDCA1水平例如高於截斷值。
XI. 抗體
本發明更提供結合於本發明之胜肽的抗體。較佳的抗體係專一性結合於本發明之胜肽的抗體且不會(或微弱結合於)非本發明之胜肽。或者結合於本發明的胜肽的抗體，以及其同系物。對抗本發明胜肽的抗體於癌症診斷及預後分析法、及造影方法中有用。同樣地，此種抗體在其他癌症治療、診斷及/或預後方面有用，只要CDCA1在癌症病患中也有表現或過度表現。又，細胞內表現的抗體(例如單鏈抗體)在治療上用於治療涉及CDCA1表現的癌症為有用，癌症的例子包括但不限於乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。
本發明也提供偵測及/或定量包括由選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列構成之多胜肽之CDCA1蛋白質(序列識別號：10)或其片段的各種免疫分析法。此種分析法可包括一種或更多抗CDCA1抗體，其能適當辨識及結合於CDCA1蛋白質或片段。本發明中，結合於CDCA1多胜肽的抗-CDCA1抗體較佳為辨識由選自序列識別號：1與2之胺基酸序列構成之多胜肽者，更佳為排除其他的胜肽。抗體的結合專一性，可利用 抑制試驗確認。即，當欲分析的抗體與全長之CDCA1多胜肽間的結合在存在具有選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列之多胜肽時受抑制，則視為該抗體「專一性地結合」於該片段。本發明中，此種免疫分析法係以該技術領域中周知的各種免疫分析法格式實施，包括但不限於各種放射免疫分析法、免疫層析技術、酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素連結免疫螢光分析法(ELIFA)等。
相關的本發明的免疫學但非抗體分析法可包括T細胞免疫產生性分析法(抑制性或刺激性)，及MHC結合分析法。此外，本發明也提供能偵測表現CDCA1的癌症的免疫造影法，包括但不限於使用本發明經標記抗體的放射閃爍攝影造影法。此種分析法可在臨床上於偵測、監控及預測CDCA1表現的癌症為提供效用，癌症包括但不限於乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)。
本發明也提供結合於本發明胜肽的抗體。本發明的抗體可以任意形式使用，例如單株抗體或多株抗體，且包括藉由以本發明胜肽將動物例如兔子免疫所得的抗血清、所有類型的多株及及單株抗體、人類抗體與由基因重組產生的人類化抗體。
本發明的胜肽當做抗原以獲得的抗體，可由任意動物種衍生，但較佳為衍生自哺乳動物例如人、小鼠、大鼠，更佳為人。人類來源的胜肽可由此處所揭露的核苷酸或胺基酸序列獲得。
依照本發明，作為免疫抗原的該胜肽，可為本發明多胜肽之完整胜肽或部分胜肽。適合之部分胜肽的例子可包括例如本發明胜肽的胺基(N)末端或羧基(C)末端片段。
在此，抗體定義為與CDCA1胜肽的全長或片段反應的蛋白質。於一較佳具體例，本發明抗體可辨識具有選自序列識別號：1及2中之胺基酸序列的CDCA1片段胜肽。用於合成寡胜肽的方法在該技術領域為周知。合成後，在使用為免疫原之前可視情形將胜肽純化。本發明中，該寡胜肽(例如24員或26員)可以與擔體接合或連結以增強免疫產生性。鑰孔血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin，KLH)為周知的擔體。結合KLH與胜肽的方法，也是該技術領域中周知的。
或者可將編碼為本發明胜肽或其片段的基因插入已知的表現載體，然後用於轉形在此敘述的宿主細胞。可從該宿主細胞的外面或裡面以標準方法回收所望的胜肽或其片段，且接著可當做抗原。或者可將表現該胜肽的整個細胞或其溶解物或化學合成的胜肽當做抗原。
可將任何哺乳動物以該抗原免疫，但較佳為考量與用在細胞融合的母細胞的相容性。一般而言，可使用囓齒科動物、兔或靈長科動物。囓齒科的動物包括例如小鼠、大鼠、倉鼠。兔科動物包括例如兔子。靈長科動物例如狹鼻小目(Catarrhini)猴(舊世界猴)，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、獼猴，狒狒、黑猩猩。
以抗原免疫動物的方法為該技術領域中已知。腹膜內注射或皮下注射抗原為免疫動物的標準方法。更具體而 言，可將抗原稀釋及懸浮於適當量的磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)、生理鹽液等。若需要，可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑混合，標準佐劑例如佛洛依德(Freund)完全佐劑，而形成乳劑後對於哺乳動物投予。較佳者，每4至21天數次投予與適量佛洛依德(Freund)不完全佐劑混合的抗原。適當的擔體也可用於進行免疫。如上免疫進行後，可藉由標準方法檢驗血清中所望抗體量的增加。
對抗本發明胜肽的多株抗體可藉由從檢查血清中所望抗體增加的受免疫哺乳動物收集血液，並從血液以習知方法分離血清而製備。多株抗體包括含有該多株抗體的血清且可從該血清分離含有該多株抗體的級分(fraction)。免疫球蛋白G或M從來製備，藉由使用例如偶聯於本發明胜肽的親和管柱，與進一步使用蛋白質A或蛋白質G管柱純化該級分。
為了製備單株抗體用於本發明之內容，從以該抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，並如上述檢查血清中所望抗體的水平是否增加，之後進行細胞融合。用於細胞融合的免疫細胞較佳為從脾臟取得。其他較佳的與上述免疫細胞融合的母細胞，包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更佳為具有以藥物選擇融合細胞的所需性質的骨髓瘤細胞。
上述免疫細胞及骨髓瘤細胞可依照已知方法融合，該方法例如Milstein等人的方法(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981))。
由細胞融合得到的融合瘤可藉由將其在標準選擇培養基例如HAT培養基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的 培養基)中培養而選擇。通常該細胞培養物係在該HAT培養基中繼續培養數天至數週，時間足以使除了所望融合瘤以外的其他細胞(非融合細胞)死亡。然後，可實施標準極限稀釋以篩選並選殖生產所望抗體的融合瘤細胞。
除了上述方法，其中非人類動物係以抗原免疫以製備融合瘤，可將人類淋巴球例如受EB病毒感染者以胜肽、胜肽表現細胞或其溶解物於體外免疫。然後，將經免疫的淋巴球與能無限分裂的人類來源的骨髓瘤細胞例如U266融合，以得到生產能結合於該胜肽的所望人類抗體的融合瘤(未審查的日本公開專利申請案號昭63-17688)。
接著將獲得的融合瘤移殖到小鼠的腹腔，並抽取腹水。獲得的單株抗體可利用例如硫酸銨沉澱、蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換層析或偶聯有本發明胜肽的親和性管柱純化。本發明抗體不僅可用於純化及偵測本發明胜肽，也可當成本發明胜肽的增效劑及拮抗劑的候選者。
或者可將免疫細胞例如經免疫的淋巴球、生產抗體利用致癌基因使不死化並用於製備單株抗體。
獲得的單株抗體也可使用遺傳工程技術以重組方式製備(參見例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies，於英國由MacMillan Publishers LTD(1990)出版)。例如可從免疫細胞例如融合瘤或經免疫的生產該抗體的淋巴球選殖編碼為抗體的DNA，插入適當載體，並導入宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如上述製備的重組抗體。
再者本發明抗體可為抗體片段或經修飾的抗體，只要其結合於一個或更多本發明的胜肽即可。例如，該抗體片段可為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自H及L鏈的Fv片段以適當連結子連接(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具體而言，可利用以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體而產生抗體片段。或者可構建編碼為該抗體片段的基因，插入表現載體並於適當的宿主中表現(參見例如，Co et al.,J Immunol 152：2968-76(1994)；Better與Horwitz,Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.,Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker,Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。
抗體可藉由與各種分子例如聚乙二醇(PEG)接合而修飾。本發明提供此種經修飾的抗體。該經修飾的抗體可藉由將抗體化學修飾而獲得。此等修飾方法在該領域為習知。
或者本發明抗體可獲得為衍生自非人類抗體的可變區與衍生自人類抗體的不變區的嵌合抗體，或人類化抗體，其包括衍生自非人類抗體的互補決定區(CDR)、框架區(FR)及衍生自人類抗體的不變區。此種抗體可依照已知技術製備。人類化可藉由取代囓齒類CDR或CDR序列為人類抗體的對應序列而實施(參見例如Verhoeyen et al.,Science 239：1534-1536(1988))。因此此種人類化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整的人類可變區域已取代成衍生自非人類種的對應序列。
也可使用除了人類框架及不變區外包括人類可變區的完全人類抗體。此種抗體可使用該技術領域已知的各種技術製造。例如體外方法涉及使用呈現在噬菌體的人類抗體片段的重組庫(例如Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991)。同樣地，可藉由將人類免疫球蛋白基因位導入基因轉殖動物例如內生免疫球蛋白已部分或全部失活的小鼠中，而製備人類抗體。此方法敘述於例如美國專利號6,150,584、5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
如上獲得的抗體可純化成同質。例如可依照一般蛋白質使用的分離及純化方法將抗體分離及純化。例如可利用適當選擇及合併使用的管柱層析分離及單離抗體，管柱層析例如親和性層析、過濾、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳及等電點集中法(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於此等。可使用蛋白質A管柱及蛋白質G管柱當做該親和性管柱。示例之可使用的蛋白質A管柱包括例如Hyper D、POROS及Sepharose F.F.(Pharmacia)。
親和層析以外的適合之層析技術的例子，包括例如離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。該等層析程序可利用液相層析，例如HPLC與FPLC實施。
例如可使用測量吸光度、酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射免疫分析法(RIA)及/或免疫螢光以測量本發明抗體的抗原結合活性。ELISA中，係將本發明抗體固定化在一平板上，塗佈本發明胜肽於該平板，然後塗佈含有所望抗體的樣本，例如抗體產生細胞的培養上清或純化的抗體。然後，將辨識該初級抗體的二次抗體以酵素例如鹼性磷解酶標記，然後溫育該平板。清洗後，添加酵素受質例如對硝基苯基磷酸酯到該平板，測量吸光度以評估該樣本的抗原結合活性。可使用該胜肽的片段例如C末端或N端片段當做抗原以評估該抗體的結合活性。可使用BIAcore(Pharmacia)來評估本發明抗體的活性。
上述方法，藉由使本發明抗體暴露於假定含有本發明胜肽的樣本，並偵測或測量該抗體與該胜肽形成的免疫複合體，能偵測或測量本發明的胜肽。
由於根據本發明之偵測或測量本發明胜肽的方法能夠專一性偵測或測量一胜肽，故該方法有用於使用該胜肽的許多實驗中。
XII. 載體與宿主細胞
本發明也提供導入有編碼為本發明胜肽的核苷酸的載體與宿主細胞。本發明的載體在攜帶核苷酸尤其是本發明DNA到宿主細胞以表現本發明之胜肽，或投予本發明核苷酸供基因治療為有用。
當選用宿主細胞為E.coli且載體在E.coli(例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue)中大量放大及生產時， 該載體應具有欲在E.coli中放大的「ori」以及用於選擇經轉形的E.coli的標誌基因(例如由安皮西林、四環黴素、嘉那黴素、氯黴素等藥物選擇的抗藥性基因)。例如，可使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，也可使用pGEM-T、pDIRECT及pT7次選殖及萃取cDNA及上述載體。當使用載體產生本發明蛋白質時，表現載體為有用。例如欲在E.coli中表現的載體應具有上述欲在E.coli中擴增需要的特性。當使用E.coli例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1 Blue當做宿主細胞，該載體應具有啟動子例如lacZ啟動子(Ward et al.,Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))、araB啟動子(Better et al.,Science 240：1041-3(1988))、T7啟動子等。其能有效率地在E.coli中表現所望的基因。於此方面，可使用pGEX-5X-1(Pharmacia)、「QIAexpress system」(Qiagen)、pEGFP及pET(於此情形，宿主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)取代上述載體。此外，該載體也可含有訊號序列以供胜肽分泌。引導該胜肽分泌到E.coli胞間質之示例的訊號序列，為pelB訊號序列(Lei et al.,J Bacteriol 169：4379(1987))。將該等載體導入目標宿主細胞的方法包括例如氯化鈣法及電穿孔法。
除了E.coli，例如可使用衍生自哺乳動物的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)及pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆蟲細胞的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表現載體(例如 pMH1、pMH2)、衍生自動物病毒的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自反轉錄病毒的表現載體(例如pZIpneo)、衍生自酵母菌的表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)，及衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的表現載體(例如pPL608、pKTH50)，用於生產本發明之多胜肽。
為了於動物細胞例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表現載體，該載體應具有對於在此種細胞中表現所需要的啟動子例如SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1 alpha啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV啟動子等，較佳為具有用於選擇轉形體的標記基因(例如由藥物(例如新黴素、G418)選擇的抗藥性基因)。具有此等特性的已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV及pOP13。
以下參考具體的實施例對於本發明更詳細敘述。然而，以下材料、方法及實施例係可協助該技術領域中具有通常知識者製造及使用本發明特定具體例，此等僅是意欲來解說本發明態樣，因此並不限制本發明的範圍。該技術領域中具有通常知識者當可輕易理解到，與在此所述者類似或等同之方法及材料可用於實施或測試本發明。
[實施例]
材料與方法
細胞株及抗體
TAP-缺損及HLA-A2-陽性細胞株T2係從Riken Cell Bank購買。作為抗原呈現細胞(APC)，係使用小鼠纖維母細胞株、L-細胞，其已經過基因改造以表現DR1(DRB1*01：01)；L-DR1、DR4(DRB1*04：05)；L-DR4,DR8(DRB1*08：03)；L-DR8、DR15(DRB1*15：02)；L-DR15或DR53(DRB4*01：03)；L-DR53中之一。該C1R-A2402細胞，係表現微量固有HLA第I類分子之人類B類淋巴母細胞株C1R的HLA-A24轉染體，係受贈於Masafumi Takiguchi(Kumamoto University,Kumamoto,Japan)。T2細胞及C1R-A2402細胞使用為標靶細胞。此等細胞於體外維持於在補充10% FCS之DMEM(L-細胞)或RPMI 1640(T2及C1R-A24細胞)中，於CO2環境在37度中。
病患
從19位報名2個胜肽疫苗實驗的HNC病患收集血液樣本，並調查對於CDCA1-LP有反應性的Th細胞的免疫反應。此等癌免疫療法之階段I/II臨床試驗採用衍生自癌睪丸抗原之3種HLA-A24結合SP(臨床級9-10胺基酸長胜肽)，即CDCA1(CDCA1-A24(56-64)，在此研究中報告，圖1)、IMP-3(IMP-3-A24(508-516))，及LY6K(LY6K-A24(177-186))(Suda T,et al.Cancer Sci 2007；10：1803-8.)，已經過日本熊本的熊本大學人體試驗委員會(Institutional Review Board of Kumamoto University,Kumamoto,Japan)的審核及核可。將胜肽(各抗原1mg)在500micro L Montanide ISA51中乳化，並於第0、7、14、28、42、56、63及70日以皮下注射(s.c.)，之後每月注射直到觀察到腫瘤進展或毒性。所有的HNC病患係於提 供知情同意書後基於HLA-A24擁有性來選擇。罹患無法手術的帶有再復發或轉移性腫瘤且對於標準療法有抗藥性的晚期的HNC的病患；報名University Hospital Medical Information Network Clinical Trials Registry(UMIN-CTR)000008379號(CTR-8379)實驗。經過放射性切除的HNC病患報名UMIN-CTR 000008380號(CTR-8380)的實驗。後者的實驗，將HNC病患以術後胜肽疫苗免疫療法，其係組合S-1、異環磷醯胺(ifosfamide)或阿黴素(doxorubicin)進行治療。此等臨床實驗及分析正在進行。
以演算法預測HLA第II類結合胜肽
為了預測有潛力的混雜的HLA-DR或-DP結合人類CDCA1衍生的胜肽，將該人類CDCA1蛋白質之胺基酸序列使用電腦演算法(IEBD analysis resource,consensus method,http：//tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)(Wang P et al.BMC Bioinformatics；11：568.,Wang P et al.PLoS Comput Biol 2008；4：e1000048.)來分析。該程式分析對完成完整之蛋白質的15個胺基酸長的序列偏移量(offset)進行分析。選擇並合成24及26個胺基酸長的胜肽，其對於由DRB1*04：05、DRB1*15：02或DPB1*02：01對偶基因編碼之多個HLA-第II類分子具有重疊的高一致性百分等級而且係天然地包括CDCA1衍生之9員CTL抗原決定位，以鑑別含有CTL抗原決定位之混雜之輔助T細胞抗原決定位(Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)。
合成胜肽及重組蛋白質
合成3種人類CDCA1衍生短胜肽(SP)，此等係結合於HLA-A2、CDCA1-A2(65-73)、YMMPVNSEV(序列識別號：3)；CDCA1-A2(351-359)、KLATAQFKI(序列識別號：4)，並結合於HLA-A24、CDCA1-A24(56-64)、VYGIRLEHF(序列識別號：5)(純度>95%,Biomatik,Canada)。合成2種重疊的長胜肽(LP)，即CDCA1(55-78),IVYGIRLEHFYMMPVNSEVMYPHL(序列識別號：1)；CDCA1(39-64)NPKPEVLHMIYMRALQIVYGIRLEHF(序列識別號：2)，(純度>90%)，並檢驗其於體外刺激CDCA1專一性人類CD4+ T細胞的能力。使用2種結合於HLA-A24(HIV-A24,RYLRDQQLL(序列識別號6：))及HLA-A2(HIV-A2,SLYNTYATL(序列識別號：7))之HIV胜肽，作為負對照SP(Tomita Y,et al.Cancer Sci；102：697-705.,Tomita Y et al.Cancer Sci；102：71-8.)。使用LP，係結合於DR4之WT1來源胜肽、WT1胜肽(KRYFKLSHLQMHSRKH(序列識別號：8))，作為負對照LP(Fujiki F et al.J Immunother 2007；30：282-93.)。將胜肽以10micro g/micro L或20micro g/micro L的濃度溶於二甲基亞碸，並保存在攝氏-80度。
將帶有6His標籤的重組全長CDCA1蛋白質，及缺少CDCA1(55-78)與CDCA1(39-64)專一性Th細胞辨識之CDCA1衍生的Th抗原決定位兩者的截短的CDCA1蛋白質，由帶有各自之cDNA片段的pET28a載體(Novagen)的大腸桿菌E.coli BL21品系表現。使用該截短的CDCA1蛋白質作為對照蛋白質。將各重組蛋白質使用HisTrap FF管柱(GE Healthcare)依廠商指示進行 純化。蛋白質的純度以SDS-PAGE檢驗。
TAA專一性CD4+ T細胞株及選殖體(clone)的產生
收集與使用衍生自健康捐贈者之周邊血液單核細胞(PBMC)的研究計畫經過熊本大學人體試驗委員會(Institutional Review Board of Kumamoto University)核可。本案發明人從12名健康的捐贈者在收到他們的知情同意書(written informed consents)後獲得血液樣本。本研究中調查的健康捐贈者的HLA-A、DRB1及DPB1對偶基因，係以具有聚合酶連鎖反應及對偶基因專一性探針雜交之HLA基因變異的DNA分型(DNA TYPING)來決定，且如表1中所述。將從健康自願者取得之PBMC如前述般單離(Inoue M,et al.Int J Cancer；127：1393-403.)。藉由使用偶聯了抗CD4單株抗體的磁性微珠以陽性篩選來從PBMC純化CD4+ T細胞(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)。經由如前述方式之體外培養從CD14+細胞生產單核球來源的樹狀細胞(DC)(Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)，並將其作為抗原呈現細胞(APC)以誘導TAA專一性CD4+ T細胞。將DC(1×104/井)以10micro g/ml LP施以脈衝(pulse)3小時並照射輻射(45Gy)，然後與自體CD4+ T細胞(3×104/井)，在96井平底培養盤之各井中混合，各井有200micro l之補充5%人類無補體血漿(decomplemented plasma)的AIM-V。7天後，從各培養物移除半數培養基，然後培養物被添加新鮮培養基(100micro l/井)，其含有以胜肽(10micro g/ml)脈衝的經放射照射的(50Gy)的自體PBMC(1×105)及5ng/ml人類重組(hr)IL-7。於第2次以胜肽刺激後2天，對於各井添加 hr IL-2，使終濃度為10IU/ml。一週後，將各井中的經刺激的CD4+ T細胞在酵素連結之免疫點(ELISPOT)分析中分析專一性。將顯示對於同源(cognate)胜肽有專一性反應的T細胞移到24井盤，並且以週的間隔，對其使用於補充10IU/ml hr IL-2與5ng/ml hr IL-7之培養基中以該胜肽(10micro g/ml)脈衝的經放射照射的自體PBMC(1×106/井)進行再刺激。有些情形，會利用極限稀釋將T細胞選殖，以供前述進一步的研究(Tabata H et al.Hum Immunol 1998；59：549-60.)。
T細胞對於胜肽及蛋白質的反應的評估
使用IFN-γ ELISPOT(Human IFN-γ ELISPOT kit,BD Biosciences)，如前述(Tomita Y et al.Cancer Sci；102：697-705.)評估Th細胞對於經過胜肽及蛋白質脈衝的APC之反應。簡言之，係分析每3×104個散裝CD4+ T細胞在以有經過胜肽脈衝之PBMC(3×104/井)刺激時，或每1×104個散裝CD4+ T細胞在以有經過胜肽脈衝之HLA-DR-表現的L細胞(5×104/井)刺激時，產生干擾素(IFN)-γ之胜肽專一性CD4+ T細胞的頻率。也分析在以有經過胜肽脈衝的T2細胞(2×104/井)刺激時，每1×105個散裝 CTL中的產生干擾素(IFN)-γ的細胞的頻率。或者，將5×103已載有蛋白質之DC和2×104個CD4+ T細胞選殖體/井共同培養。該已載有蛋白質之成熟的DC係如前述，從陽性的單離的CD14+細胞(第0天)製備(Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)。於第5天，將DC於重組CDCA1(50micro g/ml)及OK432存在下培養。於第7天收集該等已載有蛋白質之成熟的DC，洗滌，並作為IFN-γ ELISPOT分析中的刺激劑。為了決定涉及抗原呈現的限制HLA分子，藉由添加抗HLA-DR mAb(L243,Biolegend)、抗HLA-DP mAb,(B7/21,abcam)、抗人類HLA-DQ mAb(SPV-L3,abcam)或抗HLA第I類mAb,(W6/32,abcam)，來檢查抗原誘導之IFN-γ生產之阻斷性。所有的mAb以最終濃度為5micro g/ml來使用。所有的IFN-γ ELISPOT分析的評估被實施兩重複或三重複，且結果係平均值。
T細胞對於PBMC、L細胞及經胜肽(10micro g/mL)脈衝之鼠BM-DC或載有CDCA1蛋白質之人DC(50micro g/mL)的免疫反應，係利用IFN-γ ELISPOT分析(BD Biosciences,San Jose,CA)依廠商指示及如前述來評估(Zarour HM et al.,Cancer Res 2000；60：4946-52.)。簡言之，將經胜肽脈衝之PBMC(3×104/井)、L細胞(5×104/井)、T2細胞(2×104/井)、C1R-A24細胞(2×104/井)、骨髓衍生之DC(BM-DCs,2×104/井)，或已載有蛋白質之DC(5×103/井)，以兩重複或三重複接種於ELISPOT盤作為APC或標靶細胞。為了確認涉及抗原呈現之HLA分子，在接種APC或標靶細胞後，將抗原誘導之IFN-γ生產藉由添加抗HLA-DR單株抗體 (mAb)(L243,BioLegend)、抗HLA-DP mAb(B7/21,Abcam)、抗人類HLA-DQ mAb(SPV-L3,Abcam)或抗HLA第I類mAb(W6/32,Abcam)予以阻斷。所有的mAb以終濃度5micro g/mL來使用。將此等APC或標靶細胞與mAb一起於室溫溫育1小時。然後，收集反應T細胞，洗滌，並移到圖中指示號碼的ELISPOT盤。溫育18小時後，計算點的數目。使用HIV-A2、HIV-A24或WT1衍生的LP作為負對照胜肽。於一些實驗中，使用未經脈衝的PBMC或L細胞作為負對照。使用與PMA(100ng/ml；Sigma-Aldrich)與離子黴素(ionomycin)(500ng/ml；Sigma-Aldrich)一起培養的細胞作為所有IFN-γ ELISPOT分析中的正對照。結果以平均值+/- SD表示。
針對HNC病患之ELISPOT分析中，於和CDCA1-LP一起進行細胞培養1週後，收集此細胞，洗滌，並且於ELISPOT盤(1×105/井)中與CDCA1(55-78)-LP、CDCA1(39-64)-LP或對照LP(HIV-LP)一起培養18小時。減去對照值(背景)後，計算表現為點形成細胞/105細胞的CDCA1-LP專一性Th細胞的數目。當計數的IFN-γ點的平均數超過15且超過背景2倍時，評定反應為陽性。由於可得細胞數目有限，針於HNC病患之細胞的ELISPOT分析係於單一、二、或三個井實施，。
藉由以CDCA1(55-78)-LP刺激，在健康捐贈者中之CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL的增殖
A：以如上述(Tomita Y,et al.Cancer Sci 2011；102：71-8., Imai K,et al.Clin Cancer Res 2008；14：6487-95.)實施藉由以CDCA1-A24(56-64)SP刺激經純化的CD8+ T細胞以誘導CDCA1-A24(56-64)SP-反應性CTL。為了評估藉由經CDCA1(55-78)-LP脈衝之DC刺激，CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL的擴增能力，將獲自HLA-A24+捐贈者之CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CTL(HD2；2×106/井，24井盤，HD5；2×105/井，48井盤)以16micro M CDCA1(55-78)-LP或經對照LP脈衝的自體DC(HD2；2×105/井，HD5；5×104/井)刺激。將此經LP脈衝的成熟DC(3小時)照射放射線並洗滌，然後作為抗原呈現細胞(APC)。於第1及7天，添加rh IL2(20IU/mL)與rhIL-7(5ng/mL)。於從HD2與HD5建立了CTL後，分別以下列實驗步驟(B)及(C)來評估其辨識專一性及細胞毒殺活性。
B(HD2)；在LP刺激(第0天)前及刺激後第5、7、8及10日後，將一些培養細胞(1×105細胞)以經PE標定之HLA-A*24：02/CDCA1-A24(56-64)-複合體的四元體(MBL,Nagoya,Japan)及帶有經FITC標定之抗人類CD8 mAb(選殖體T8,Beckman Coulter,Brea,CA)染色。使用經PE標定之HLA-A24(A*24：02)/HIV-A24(RYLRDQQLL)複合體的四元體作為負對照。
C(HD5)；細胞培養1週後，收集細胞、洗滌，並於ELISPOT盤(1×105/井)培養18小時。以ELISPOT分析(Dobrzanski MJ.et al.Frontiers in oncology 2013；3：63)來計數經以CDCA1-A2456-64 SP-脈衝或HIV-A24 SP(背景)-脈衝之 C1R-A2402細胞(2×104/井)刺激之下的IFN-γ產生CD8+ T細胞的數目。減去對照值(背景)後，計數表現為點形成細胞/105細胞的CDCA1-A2456-64 SP專一性CD8+ T細胞的數目。使用HIV-A24 SP作為負對照SP。
藉由以CDCA1(55-78)-LP刺激，在已接種CDCA1-A24(56-64)SP疫苗的HNC病患中之CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL的增殖
將來自接種了CDCA1-A24(56-64)SP疫苗的5名HNC病患(HNC26、29、31、39、109)的PBMC，與CDCA1(55-78)-LP與CDCA1(39-64)-LP(各10micro g/mL)的混合物一起在24井盤(2×106/井)中培養；於第0及2天添加rhIL-2與rhIL-7。第0天(生物體外)及第7天，將此等PBMC用CDCA1-A24(56-64)專一性四元體染色。
細胞激素分析
將T細胞(1×104/井)與L-DR4(5×104/井)一起在CDCA1(55-78)存在下，於96井培養盤培養。20小時後，收集培養懸浮層，並使用Bio-Plex系統(Bio-Rad)依廠商指示測量細胞激素的水平(IFN-γ、GM-CSF、TNF-alpha、MIP1beta、IL-4、IL-17)。
CD107a移動性分析
為了鑑別經此胜肽刺激的脫顆粒CD8+或CD4+ T淋巴球，使用細胞流式計數儀分析暴露於細胞表面的CD107a(Rubio V et al.Nat Med 2003；9：1377-82.,Betts MR,et al.J Immunol Methods 2003；281：65-78.)。簡言之，以如前述方式實施CD107a 移動性分析(Tomita Y et al.Cancer Sci。2011 Jan；102(1)：71-8.)。添加CDCA1衍生的胜肽或對照胜肽(1micro g/ml)作為刺激物，並且對各井加入經FITC標定的抗人類CD107a mAb或經FITC標定的構造同型(isotype)對照小鼠IgG1及monensin。將細胞於攝氏37度培養5小時。培養後，將此經胜肽刺激的Th細胞或CTL，用有PE結合的抗人類CD4抗體(eBioscience,San Diego,CA)及有PE結合的抗人類CD8抗體(Biolegend)分別染色，並以細胞流式計數儀分析(FACScan；BD Biosciences)。
體外交叉呈現分析及人類CTL反應分析
將HLA-A24+捐贈者(HD2)衍生的DC保持存活或在0.1%戊二醛(Sigma-Aldrich)中固定3分鐘，以胜肽(16micro M)脈衝3小時，並洗滌3次。於此胜肽脈衝期間及之後加入OK432(0.1KE/mL,Chugai Pharmaceutical Co,Tokyo,Japan)以誘導DC成熟。於含10micro g/mL brefeldin A(Sigma-Aldrich)之培養基中，以2：1的比例加入CDCA1-A24(56-64)反應性散裝CTL，持續6小時。於刺激期間，加入brefeldin A以抑制蛋白質分泌。利用胞內標定，來測量藉由CDCA1-A24(56-64)專一性CTL之IFN-γ生產。將此細胞，以經FITC標定之抗人類IFN-γ mAb(BioLegend)組合組合經PerCP標定之抗人類CD8 mAb(BioLegend)及經PE標定之CDCA1-A24(56-64)專一性四元體染色。資料取得係於FACSCalibur(BD Biosciences)實施，並以FlowJo軟體(Tree Star,Ashland,OR)分析資料檔案。
為了評估於體外利用交叉呈現CDCA1(55-78)LP之CDCA1-A2(65-73)SP或CDCA1-A24(56-64)SP反應性CTL 的誘導，使用從HLA-A2或A24-陽性捐贈者單離之經載入CDCA1(55-78)LP之DC作為APC。單離CD14+細胞(第0天)，並於hr IL4(10ng/ml)與GM-CSF(100ng/ml)存在下培養。第5天添加CDCA1(55-78)(10micro g/ml)與OK432。第7天收集經載入LP之成熟DC，洗滌，並使用為APC。如前述般(Imai K,et al.Br J Cancer；104：300-7.)實施以來自HLA-A2陽性健康捐贈者之經載入LP之DC的人類CD8+ T的刺激。在3次以經載入CDCA1(55-78)LP之DC刺激CD8+ T細胞後，以ELISPOT分析計數以CDCA1-A2(65-73)、經HIV-A2胜肽脈衝之T2或經CDCA1-A24(56-64)SP脈衝之C1R-A2402細胞刺激之下，IFN-γ生產CD8+ T細胞之數目。
體內交叉呈現分析
HLA-A2(HHD)與HLA-A24(HHH)基因轉殖小鼠(Tgm)係由F.A.Lemonnier博士好心提供。(Firat H,et al.Eur J Immunol 1999；29：3112-21.,Jung KO,et al.J Virol 2012；86：7616-24.)。以7天為間隔，對於小鼠尾根部以真皮內注射(intradermally)在不完全佛洛依德佐劑(IFA)中乳化之CDCA1-LP溶液(HLA-A2 Tgm,50micro g/每隻小鼠；HLA-A24 Tgm 100micro g/每隻小鼠)。接種CDCA1衍生之LP疫苗第2或第3次的7天後，利用以磁性小珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)進行陽性篩選，從鼠蹊部附近的淋巴結單離CD8+ T細胞。以生物體外ELISPOT分析法計數回應於以經SP脈衝之BM-DC或C1R-A2402細胞之刺激的IFN-γ產生CD8+ T細胞。
CDCA1(55-78)-LP在誘導CDCA1專一性CTL之相乘效果(synergistic effect)
將從產生CDCA1(55-78)-LP專一性Th細胞選殖體(Th選殖體)之HLA-A2+/DR4+ HD1獲得的PBMC，放入24井盤(3×106/井)，再單獨添加SP(CDCA1-A2(351-359),20micro g/mL)、添加SP+LP(CDCA1(55-78)-LP,20micro g/mL)、添加SP+Th選殖體(5×105/井)或添加SP+LP+Th選殖體，最終體積為2mL。培養7天後，添加此等胜肽與IL-2(20U/mL)，然後在第9天加入IL-15(5ng/mL)。第11天時，將細胞以經PE標定之HLA-A*02：01/CDCA1-A2(351-359)-複合體的四元體與經FITC標定的抗人類CD8 mAb染色。以標準鉻釋放分析法測試溶解活性。(Inoue M et al.,Immunol Lett 2009；126：67-72.,Monji M et al.,Clin Cancer Res 2004；10：6047-57.)。
將衍生自HD2的CDCA1(55-78)LP專一性散裝CD4+ T細胞(1×105細胞/井，48井盤)與CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CD8+ T細胞(1×105細胞/井)，和自體DC(2×104細胞/井)一起於單獨存在CDCA1-A24(56-64)SP(10μg/mL；SP)、存在CDCA1-A2456-64 SP+對照LP(各10μg/mL；對照LP+SP)或存在CDCA1-A24(56-64)SP+CDCA1(55-78)LP(各10μg/mL；CDCA1(55-78)LP+SP)的狀況培養，而不添加任何細胞激素。以如前述般(Shedlock DJ,Shen H.Science 2003；300：337-9.)實施藉由以CDCA1-A24(56-64)SP刺激，自HLA-A24+/DR15+捐贈者(HD2)CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CTL的誘導。於體外和胜肽一起培養1週後，將此培養 細胞以經PE標定之HLA-A*24：02/CDCA1-A2456-64複合體(MBL,Nagoya,Japan)的四元體與經FITC標定的抗人類CD8 mAb(BioLegend)染色。
於經CDCA1-A24(56-64)SP免疫之HNC病患中之CDCA1-LP專一性CD4+ T-細胞反應的評估
利用Ficoll-Conray密度梯度離心之方式來單離來自HNC病患之經肝素處理的血液(heparinized blood)的PBMC。將來自HNC病患或健康捐贈者的新鮮PBMC，與CDCA1(39-64)-LP與CDCA1(55-78)-LP(各10micro g/mL)之混合物，於37℃，以最終體積2ml，在補充5%人類去補體血漿(human decomplemented plasma)之AIM-V培養基中一起培養(2×106/井，24井盤)；在第0及2天加入IL-2與IL-7。細胞培養1週之後，以ELISPOT分析法計數抗原專一性IFN-γ產生T細胞的數目。此研究係在依循探索性研究原則(exploratory research principles)下操作的實驗室進行，並係使用調查性的實驗步驟實施。發明人感謝報告針對人類T細胞分析框架的Minimal Information About T-cell Assay(MIATA)的建議(Britten CM et al.,Immunity 2012；37：1-2.)。
對於已誘導之TAA專一性CTL的四元體分析
將從產生CDCA1(55-78)專一性Th細胞選殖體之來自HLA-A2與DR4陽性健康捐贈者HD1的PBMC以3×106/井的濃度置於24井盤後，添加混合的單獨之SP(CDCA1-A2(65-73)+CDCA1-A2(351-359),20micro g/ml respectively)、添加混合的SP+CDCA1(55-78)LP(20micro g/ml)、混合的SP+Th選殖體(5×105/井)、或添加混合的SP+CDCA1(55-78)LP+Th選殖體 於此細胞培養物，最終體積為2ml。培養7天後，添加這些等胜肽及hr IL-2(20U/ml)，然後於第9天添加hr IL-15(5ng/ml)。於培養第11天，收集此細胞，以經PE標定之HLA-A*02：01/CDCA1-A2(65-73)胜肽複合體或HLA-A*02：01/CDCA1-A2(351-359)胜肽複合體的四元體(MBL,Nagoya,Japan)組合經FITC標定的抗人類CD8 mAb(選殖體T8,Beckman Coulter,Brea,CA)進行染色，並以流式細胞計數儀分析。根據同上述程序，對於來自自產生CDCA1(55-78)專一性Th細胞選殖體之另一捐贈者也進行測試。
統計分析
使用雙尾學生t(Student t)檢定(條狀圖)、費雪正確性(Fisher’s exact)檢定或無參數曼-惠特尼(Mann-Whitney)U檢定(散點圖)以評估ELISPOT資料在統計學上的顯著差異。P值小於0.05，被認為是統計上顯著。以市售的統計套裝軟體來實施統計分析(StatView 5.0,Abacus Concepts,Calabasas,CA)。
結果
含有CDCA1之CTL抗原決定位的HLA第II類結合胜肽的預測及選擇
為了鑑別CDCA1之有潛力之混雜的HLA-第II類結合之Th細胞抗原決定位，本案發明人首先使用電腦演算法檢驗CDCA1的胺基酸序列(Wang P,et al.BMC Bioinformatics；11：568.,Wang P,et al.PLoS Comput Biol 2008；4：e1000048.)。有趣地，發明人發現以此電腦演算法預測為有潛力的混雜的HLA第II類結合胜肽的CDCA1蛋白質序列中的其中一區 (CDCA1(39-78))，非常接近該CTL抗原決定位(圖1)。因此，發明人選擇並且合成2個LP(CDCA1(39-64)及CDCA1(55-78))，其係與多個HLA-第II類分子HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2(DPB1*02：01)有高一致性百分等級重疊，且包括由經HLA-A2-或-A24限制之CTL辨識的天然9員胜肽用於後續之分析(圖1A及表2)。
針對指出之HLA-第II類基因型的胜肽結合演算法分數， 係針對CDCA1胜肽(39-78)之各15個胺基酸序列表示。
天然上包括CTL抗原決定位之CDCA1衍生且混雜的HLA第II類結合Th細胞抗原決定位的鑑別
本案發明人評估是否此兩者選出的合成LP能產生CDCA1專一性Th細胞。將衍生自5名健康捐贈者的PBMC的CD4+ T細胞，以每週為間隔以自體DC及經CDCA1(55-78)胜肽脈衝的PBMC進行刺激。於至少3次刺激後，以IFN-γ ELISPOT分析檢查此培養的CD4+ Th細胞的CDCA1(55-78)專一性反應。在3名HLA-DR4陽性健康捐贈者中，產生的Th細胞株回應CDCA1(55-78)產生顯著量的IFN-γ(圖2A及B)。為了說明此等Th細胞株之HLA-限制性，使用對抗HLA-DR或HLA-DP的mAb。當添加HLA-DR專一性mAb時，抗CDCA1(55-78)之Th細胞株的IFN-γ產生顯著減少，而HLA-DP專一性mAb未顯示效果(圖2A及B)。
為了進一步分析HLA限制性，測試Th細胞對於經胜肽脈衝的L-DR4、L-DR53或L-DR1細胞的反應性。從3名DR4陽性健康捐贈者產生的散裝Th細胞株，會專一性辨識經CDCA1(55-78)脈衝的L-DR4細胞，而不是L-DR4細胞、經無關的胜肽(WT1-peptide)脈衝的L-DR4細胞、經CDCA1(55-78)胜肽脈衝的L-DR53細胞或經CDCA1(55-78)脈衝的L-DR1細胞。對抗經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR0405細胞的Th細胞株之IFN-γ產生，顯著受添加抗HLA-DR mAb(L243)抑制，但未受添加抗HLA第I類mAb(W6/32)抑制(圖3A、B及C)。此等結果明顯指出在這些Th細胞株中，CDCA1(55-78)由 HLA-DR4所呈現。
為了調查是否CDCA1(55-78)能結合其他HLA第II類分子並且誘導Th細胞反應，將來自HLA-DR4陰性的2名健康捐贈者的CD4+ T細胞以經CDCA1(55-78)脈衝之自體DC與PBMC進行刺激。從HLA-DR15-陽性捐贈者HD2產生的Th細胞株，回應於經CDCA1(55-78)脈衝之PBMC與L-DR15細胞而專一性地生產顯著量的IFN-γ，但非回應於經CDCA1(55-78)脈衝之L-DR8細胞。對抗經CDCA1(55-78)脈衝之PBMC或L-DR15細胞的Th細胞株之產生IFN-γ，顯著受添加抗HLA-DR mAb抑制，但未受添加HLA-DP-、HLA-DQ-或HLA第I類專一性mAb抑制(圖2A與圖3A、B)。這些結果明顯指出在此T細胞株中，CDCA1(55-78)由HLA-DR15所呈現。
從經CDCA1(55-78)刺激之HLA-DP2陽性捐贈者HD3產生的該Th細胞株回應於CDCA1(55-78)也專一性的生產顯著量的IFN-γ，且此反應由於添加抗HLA-DP mAb顯著受抑制，而不是HLA-DR專一性mAb(圖2A)。因發明人沒有經HLA-DP2與HLA-DR9基因轉導的L細胞，故使用從5名不同的捐贈者得到的異體(allogeneic)PBMC作為APC，以決定HLA-DP分子的共享限制性。CDCA1(55-78)專一性選殖體，藉由來自捐贈者HD3之經DP限制之散裝CD4+ Th細胞株的極限稀釋而獲得。結果，此CDCA1(55-78)專一性選殖體，於IFN-γ ELISPOT分析中僅在表現DP2之異體PBMC存在下，顯示對於CDCA1(55-78)胜肽之專一性反應，且此IFN-γ生產顯著受添加抗HLA-DP mAb抑制，而非HLA-DR專一性mAb。此等 結果啟示來自捐贈者HD3的經DP限制之Th細胞株，受HLA-DP2限制(圖3A、B)。
因此CDCA1(55-78)有結合於HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2的能力啟示CDCA1(55-78)是由在日本群體中混雜的且常見的HLA第II類分子呈現的Th細胞抗原決定位。
其次，本案發明人評估是否另一他胜肽CDCA1(39-64)能產生專一性的Th1細胞。將來自2名健康捐贈者之PBMC之CD4+ T細胞以經CDCA1(39-64)脈衝的自體DC與PBMC以週的間隔刺激。培養的CD4+ Th細胞之CDCA1(39-64)專一性反應係以IFN-γ ELISPOT分析。於HLA-DR4-、HLA-DR9、HLA-DR53陽性健康捐贈者HD1中，產生的Th細胞株回應於CDCA1(39-64)產生顯著量的IFN-γ(圖2C)，且此反應當添加HLA-DR專一性mAb時顯著下降，而HLA-DP專一性mAb未顯示效果。為了進一步分析HLA限制性，檢測Th細胞對於經胜肽脈衝之L-DR4與L-DR53的反應性，但從此名捐贈者產生的經DR限制之散裝CD4+ Th細胞不辨識經CDCA1(39-64)脈衝的L-DR4與L-DR53細胞(資料未顯示)。因此本案發明人認為此CD4+ Th細胞株為經HLA-DR9限制之Th細胞。為了確認，利用此經DR限制之散裝CD4+ Th細胞株的極限稀釋來獲得CDCA1(39-64)專一性選殖體。結果，此Th選殖體於IFN-γ ELISPOT分析中僅在表現DR9之異體PBMC的存在下，對於CDCA1(39-64)顯示專一性反應，且IFN-γ生產由於添加抗HLA-DR mAb顯著抑制，而非抗HLA-DP mAb。這些結果指出此Th選殖體係受DR9限制(圖3D)。
為了調查CDCA1(39-64)是否能結合另一HLA第II類分子並誘導Th細胞反應，將來自HLA-DR9陰性之健康捐贈者的CD4+ T細胞以經CDCA1(39-64)脈衝之自體DC與PBMC刺激。經CDCA1(39-64)刺激產生之Th細胞回應經CDCA1(39-64)脈衝之PBMC與L-DR15細胞而專一性地生產顯著量的IFN-γ，而非經CDCA1(39-64)胜肽脈衝之L-DR8細胞。此Th細胞株之IFN-γ生產由於添加抗HLA-DR mAb顯著受抑制，而非添加抗HLA-DP、抗HLA-DQ或抗HLA第I類mAb(圖2C與圖3D)。這些結果指出Th細胞受HLA-DR15限制。
綜上，呈現於此之這些結果明確證明兩個重疊的胜肽，即CDCA1(39-64)與CDCA1(55-78)有能力刺激經HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15與HLA-DP2限制之Th細胞啟示了這些胜肽能藉由混雜的HLA第II類分子對於Th細胞呈現，且可能可用於許多病患的癌症免疫療法。
為了確認CDCA1(39-64)與CDCA1(55-78)刺激受HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2-限制之Th細胞的能力，本案研究者，對於受HLA第II類分子限制之Th細胞誘導，使用無關的胜肽作為對照來進行實驗。
將從健康捐贈者之PBMC單離的CD4+ T細胞以週的間隔以經CDCA1(55-78)-LP脈衝的自體DC與PBMC刺激。在至少3回合刺激後，藉由IFN-γ ELISPOT分析檢驗培養之CD4+ T細胞的CDCA1(55-78)-LP專一性反應。於一名HLA-DR4陽性健康捐贈者(HD1)中，產生的Th細胞回應於經 CDCA1(55-78)-LP脈衝的PBMC，以依存HLA-DR的方式產生顯著量的IFN-γ。該散裝Th細胞，以HLA-DR依存方式，專一性的辨識經CDCA1(55-78)-LP脈衝的L-DR4細胞，而不是經無關的胜肽脈衝之L-DR4細胞或經CDCA1(55-78)-LP脈衝的L-DR53細胞(圖8A)。從其他2名DR4+捐贈者也獲得類似的結果(表1；HD4與HD5)。這些結果啟示CDCA1(55-78)-LP擁有受HLA-DR4限制之Th細胞抗原決定位。
為了調查是否CDCA1(55-78)-LP會誘導於受其他HLA第II類分子限制之Th細胞中的反應，測試來自HLA-DR4陰性之健康捐贈者的CD4+ T細胞。本案發明人確認CDCA1(55-78)-LP產生受HLA-DR15限制之Th細胞(圖8B)。CDCA1(55-78)-LP也產生受HLA-DP2限制之Th細胞(圖8C)。並無獲得經HLA-DP2轉導的L細胞；因此建立CDCA1(55-78)-LP反應性之Th細胞選殖體(Th選殖體)，並使用來自5名不同捐贈者的異體PBMC作為APC以確認共享的HLA-DP分子的限制性。因此CDCA1(55-78)-LP結合於HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2啟示CDCA1(55-78)-LP擁有在由日本/太平洋亞洲群體(Saito S et al.,Tissue Antigens 2000；56：522-9.,Mack SJ et al.,Tissue Antigens 2000；55：383-400)中常見的HLA第II類分子所呈現的Th細胞抗原決定位。
接著，發明人使用上述方法評估並確認CDCA1(39-64)-LP能產生受HLA-DR9與HLA-DR15限制的Th細胞(圖8D與E)。綜上，這些結果明確證明這些重疊的LP能 刺激受HLA-DR4、-DR9、-DR15及-DP2限制的Th細胞。於此研究中，從健康捐贈者產生的CDCA1-LP專一性Th細胞不對嵌於CDCA1-LP中的CDCA1-A24(56-64)SP反應(圖8A、B、D、E)。
這些結果也顯示CDCA1(39-64)與CDCA1(55-78)有能力誘導受HLA-DR4、HLA-DR9、HLA-DR15及HLA-DP2限制的Th細胞。
CDCA1(55-78)胜肽刺激Th1-型CD4+ T細胞
為了進一步定性經CDCA1胜肽誘導的Th細胞，本案發明人藉由Bio-Plex系統測量回應於帶有同源胜肽之CDCA1(55-78)專一性散裝CD4+ Th細胞株之刺激的數種細胞激素。來自捐贈者的以經同源胜肽脈衝之L-DR0405再刺激之CDCA1(55-78)專一性散裝HTL細胞株產生大量IFN-γ、GM-CSF、TNF-alpha及MIP-1beta但較少IL-4與IL-7，顯示偏向的Th1特徵(圖4A-D)。有趣地，細胞毒性標記CD107a也能於經同源胜肽(圖4E-H)刺激的CDCA1(55-78)專一性散裝Th細胞株上檢測到。因此於此培養條件中，CDCA1(55-78)胜肽專一性Th1細胞被優勢地活化。
CDCA1(55-78)與CDCA1(39-64)係經天然處理的抗原決定位
本案發明人著手評估是否自體DC能攝入並處理CDCA1蛋白質以刺激CDCA1胜肽專一性Th1細胞選殖體。製備該已載入CDCA1(55-78)LP之成熟DC，並使用於IFN-γ ELISPOT分析作為APC。如於圖5A中所示，受HLA-DR4-限制之CDCA1(55-78)反應性Th細胞選殖體有效率地辨識載有CDCA1蛋白質之DC， 並專一性地產生IFN-γ，而不辨識載有對照蛋白質之DC或未載入蛋白質之DC。此外此Th細胞選殖體辨識由DC呈現之經天然處理之CDCA1抗原的能力，由於抗HLA-DR抗體而有效被阻斷，但未受對照抗HLA第I類抗體阻斷，確認此抗原決定位係經由HLA-DR4分子呈現。使用了受HLA-DP2限制及CDCA1(55-78)反應性的Th細胞選殖體實施類似分析。此Th細胞選殖體有效率地辨識載有CDCA1蛋白質的DC並產生IFN-γ，但不辨識載有對照蛋白質之DC，啟示受HLA-DP2限制之Th細胞抗原決定位也在DC中由由CDCA1蛋白質被天然地處理(圖5B)。
該受HLA-DR9限制之CDCA1(39-64)反應性Th細胞選殖體對於載有CDCA1蛋白質之DC反應，而非載有對照蛋白質之DC。此外此Th細胞之反應，被抗HLA-DR抗體有效阻斷，而非對照抗HLA第I類抗體，確認此抗原決定位係經由HLA-DR9分子呈現。
總之，整個結果指出此Th細胞抗原決定位，即CDCA1(55-78)與CDCA1(39-64)係從CDCA1蛋白質被DC天然地處理，且藉由HLA-第II類分子在DC的細胞表面上呈現。
CDCA1(55-78)LP在體外及體內誘導有效率的原始CDCA1-A2(65-73)SP專一性CD8+ T細胞的交叉起動(cross-priming)
本案發明人評估是否CDCA1(55-78)LP能藉由於體外由DC交叉呈現LP而誘導CDCA1-A2(65-73)SP專一性CTL。為了確認，發明人欲藉由以經載入CDCA1(55-78)LP之DC刺激，在 從來自2名產生HLA-A2-陽性捐贈者的周邊血液CD8+ T細胞產生CDCA1-A2(65-73)SP專一性CTL。在3次以經載入LP之DC刺激後，以IFN-γ ELISPO分析來檢驗在獲得之CTL細胞株中專一於CDCA1-A2(65-73)SP的CD8+ T細胞的頻率。如圖6A中所示，藉由經載入CDCA1(55-78)LP之DC刺激產生的CTL，會回應於再度以經CDCA1-A2(65-73)SP脈衝之T2細胞而專一性地產生IFN-γ，而不是經無關胜肽脈衝之T2細胞。此IFN-γ生產由於添加抗HLA第I類mAb受顯著抑制，而非抗HLA-DR mAb，因此指出本案發明人藉由於體外由DC交叉呈現LP而成功地刺激CDCA1-A2(65-73)SP專一性CD8+ T細胞。
其次，檢測CDCA1(55-78)LP於體內刺激CDCA1-A2(65-73)SP專一性細胞的能力。以7天間隔對於HLA-A2 Tgm的尾根部以乳化於IFA的CDCA1(55-78)LP實施免疫2或3次。第2或3次CDCA1(55-78)LP疫苗接種後7天，藉由生物體外ELISPO分析法確認鼠蹊部附近之淋巴結中的IFN-γ分泌CD8+ T細胞數。如圖6B中所示，2次以CDCA1(55-78)LP免疫的HLA-A2 Tgm所產生的CTL回應於再度以經CDCA1-A2(65-73)SP脈衝之BM-DC刺激而專一性生產IFN-γ，而非經無關的HIV-A2胜肽脈衝的BM-DC。此外於第3次接種後，專一性IFN-γ生產T細胞的數目增加。
綜上，這些結果指出在藉由於體外人類DC及於體內在HLA-A2 Tgm以BM-DC交叉呈現後，CDCA1(55-78)LP均誘導顯著比例的IFN-γ生產CDCA1-A2(65-73)SP專一性CTL。
藉由CDCA1(55-78)LP之CDCA1專一性及受HLA 限制之CTL之誘導的增強
接著，本案發明人測試是否CDCA1(55-78)LP能增強CDCA1專一性及受HLA-A2限制之CTL的誘導。當來自HLA-A2陽性與DR4-陽性捐贈者之PBMC單獨被CDCA1-A2(65-73)SP及CDCA1-A2(351-359)SP之混合物刺激時，此等兩種SP專一性四元體+細胞的頻率，各為CD8+ T細胞的0.01%與0.05%(圖7A)。當此等PBMC被兩種SP與CDCA1(55-78)LP共同刺激，此等SP專一性四元體-陽性細胞的頻率各增為0.03%與0.12%(相較於單獨以SP刺激，頻率各增為3倍及2.4倍)(圖7A及B)。四元體+細胞的絕對數目，相較於單獨以SP刺激的那些，藉由僅添加CDCA1(55-78)而顯著增加(資料未顯示)。當PBMC被此兩種SP與CDCA1(55-78)專一性Th選殖體共同刺激，SP專一性四元體+細胞的頻率各增為0.05%與0.19%(各增加5倍及3.8倍)。再者，當PBMC被SP、CDCA1(55-78)及CDCA1(55-78)專一性Th選殖體共同刺激，SP專一性四元體+細胞之頻率顯著各增加至0.1%及0.6%(各增10倍與12倍)。就四元體+細胞頻率而言，添加CDCA1(55-78)輔助胜肽或Th選殖體到培養物中，誘導頻率分別些微增加，而添加它們兩者(CDCA1(55-78)+Th選殖體)，明顯增加專一性CTL之頻率。這些結果於本案發明人使用不同的CDCA1(55-78)專一性Th選殖體，可有再現性地觀察到(資料未顯示)。
將此藉由以SP、CDCA1(55-78)LP與CDCA1(55-78)專一性Th選殖體混合物刺激而成功誘導之CDCA1專一性CTL細胞株，於第14天以SP與CDCA1(55-78)LP再度刺激(第3 次刺激)，並將CDCA1專一性及受HLA-A2限制之CTL擴增。四元體+細胞的頻率顯著各增加到0.1%與5.4%，尤其於CDCA1-A2(351-359)專一性四元體+細胞(圖7C、D)。重要地，胜肽專一性IFN-γ生產及細胞毒性標記CD107a均能於此經同源胜肽刺激的CDCA1專一性CTL細胞株上檢測到(圖7C、D)。
此等結果明確證明藉由在培養物中由CDCA1(55-78)Th細胞抗原決定位胜肽或CDCA1(55-78)專一性Th選殖體刺激而活化的CD4+ T細胞，能增強CDCA1-A2(65-73)SP與CDCA1-A2(351-359)SP專一性CTL兩者之誘導，且此增強在CDCA1(55-78)LP與Th細胞選殖體兩者存在下最大。
於誘導CDCA1-A24專一性CTL之相乘效果，也使用CDCA1-A24(56-64)專一性四元體於HLA-A24+/DR15+ HD2中測試。將CDCA1(55-78)-LP專一性散裝CD4+ T細胞與CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CD8+ T細胞，和自體DC一起於單獨存在CDCA1-A24(56-64)SP(SP)、存在CDCA1-A24(56-64)SP+對照LP(對照LP+SP)或CDCA1-A24(56-64)SP+CDCA1(55-78)-LP(CDCA1(55-78)-LP+SP)之下培養，而不添加任何細胞激素。於和胜肽一起於體外培養1週後，將培養的細胞如於材料與方法項目中敘述，以HLA-A24(A*24：02)/CDCA1-A24(56-64)複合體的四元體及抗人類CD8 mAb染色。如圖7E中所示，添加CDCA1-A24(56-64)SP+CDCA1(55-78)-LP(CDCA1(55-78)-LP+SP)，相較於單獨添加SP或添加對照LP +SP，顯著增加了CDCA1-A24(56-64)SP專一性CD8+ T細胞的絕對數目。此等結果啟示已活化的CDCA1專一性Th細胞能增強誘導CDCA1-A24專一性CTL。
綜上，這些結果明確證明CDCA1(55-78)LP及由以CDCA1(55-78)LP刺激而活化的CDCA1專一性CD4+T細胞，能個別或合作增強CDCA-1專一性及受HLA限制之CTL的誘導。
CDCA1-LP誘導CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL之有效擴增
接著，評估CDCA1-LP可誘導CDCA1專一性散裝CTL擴增的可能性。將從HD2(HLA-A24+/DR15+)之純化的CD8+ T細胞產生的CDCA1-A24(56-64)SP專一性散裝CTL，與經CDCA1(55-78)LP脈衝之自體DC一起培養1週。如於圖9A中所示，藉由經CDCA1(55-78)LP脈衝之DC刺激使CDCA1-A24(56-64)-四元體+ CD8+細胞之群體擴增，但當散裝CTL以經對照LP脈衝之DC刺激時群體減少。於IFN-γ ELSPOT分析中，從HLA-A24+/DR4+ HD5獲得類似結果(圖9B)。本實驗的詳細方法提供於材料與方法項目中。
本案發明人也測試是否CDCA1-LP能於體外誘導經接種CDCA1-A24(56-64)SP之HNC病患之PBMC中之CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL擴增。將來自經接種疫苗的HNC病患的PBMC，和CDCA1(55-78)LP與CDCA1(39-64)LP的混合物一起培養。當將從HNC29分離的新鮮PBMC以CDCA1-A24(56-64)專一性四元體在體外培養(生物體外)前染色時，四元體+細胞之頻率僅為CD8+ T細胞的 0.09%。有趣地，藉由1週於體外以CDCA1(55-78)LP與CDCA(139-64)LP的混合物刺激PBMC後，來自HNC29中之PBMC之四元體+ CD8+ T細胞顯著擴增。CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL之頻率增加至CD8+ T細胞的3.07%(圖9C；第7天)。當將培養細胞以CDCA1-A24(56-64)SP刺激時，也可檢測到T細胞之CDCA1-A24(56-64)SP專一性IFN-γ生產(圖9C；條狀圖，第7天)。此類似結果也可於HNC26、31、39及109獲得(圖9D-G)。這些結果啟示CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL之擴增可能藉由以DC交叉呈現CDCA1-LP而誘導。
CDCA1-LP的交叉呈現有效率地在體外及體內起動(prime)CDCA1專一性CD8+ T細胞
由DC之CDCA1-LP的交叉呈現，係在CDCA1-A24(56-64)專一性四元體+ CD8+ T細胞之IFN-γ反應的背景中評估。不能交叉呈現但能如活DC一樣有效率地呈現CDCA1-A24(56-64)SP的已固定的DC(圖10A，固定的DC+SP)，被使用於排除或評估T細胞反應中LP降解產物之外來性呈現的貢獻。CDCA1(55-78)LP(圖10A)與CDCA1(39-64)LP(圖10B)僅於未固定的DC(DC+LP)交叉呈現時才誘導顯著比例的IFN-γ分泌性四元體+ CD8+ T細胞。經CDCA1-LP脈衝的固定DC不能刺激CDCA1-A24(56-64)專一性CTL，經無關之LP脈衝之未固定DC(固定DC+LP及DC+無關之LP)亦是如此。
為了調查CDCA1專一性CTL之交叉起動，發明人檢驗是否CDCA1(55-78)LP能起動CDCA1-A24專一性CTL。經CDCA1-LP脈衝之固定DC不能刺激CDCA1-A24(56-64)專 一性CTL，經無關之LP脈衝之未固定DC(經固定之DC+LP及DC+無關的LP)亦同。經載入CDCA1(55-78)LP之DC也能於HLA-A24+/A2+/DR4+捐贈者起動CDCA1-A24(56-64)SP專一性CTL與CDCA1-A2(65-73)SP專一性CTL(HD5；圖6C)。
經接種CDCA1(55-78)LP之HLA-A24 Tgm之CD8+ T細胞也能回應於經CDCA1-A24(56-64)SP脈衝的BM-DC與C1R-A2402細胞之刺激而專一性生產IFN-γ(圖6D，左分格)。當HLA-A24 Tgm接種了CDCA1(39-64)LP時也獲得類似結果(圖6D，右分格)。對於HLA-A24 Tgm以2倍量CDCA1-LP進行免疫，原因為HLA-A24 Tgm之CDCA1-A24(56-64)SP專一性點的數目比HLA-A2 Tgm少。再者，接種CDCA1-LP比CDCA1-A24(56-64)SP在誘導SP專一性CTL方面較優良(圖6E)。這些結果證明攝入CDCA1-LP後，APC能在體外及體內交叉起動CDCA1專一性CTL。
於經接種CDCA1-A24(56-64)SP之HNC病患中之CDCA1專一性Th細胞之存在
於癌免疫療法範疇，有強力證據啟示使用受限制之抗原決定位的疫苗可造成對於未存在於疫苗中的抗原的廣泛的CD8+ T細胞反應(Corbière V,et al.Cancer Res 2011；71：1253-62.,Ribas A,ei al。Trends Immunol 2003；24：58-61.,Hunder NN,et al.N Engl J Med 2008；358：2698-703.)。所以本案發明人考慮CDCA1專一性Th細胞反應可能藉由以CDCA1衍生的CTL抗原決定位胜肽之接種而被有效率地誘導。為了檢測病患中的 CDCA1專一性Th細胞反應，收集從已接種CDCA1-A24(56-64)之16名HNC病患及接種前之7名HNC病患分離的PBMC。捐贈者特性整理在圖11F的表。進行1週之以CDCA1-LP刺激PBMC後，以IFN-γ ELISPO分析法來偵測各CDCA1-LP專一性T細胞之頻率(圖11A)。使用從10名健康自願者分離的PBMC作為對照。當IFN-γ分泌細胞至少在負對照的2倍以上，反應視為陽性。
在HNC病患觀察到顯著之CDCA1-LP專一性免疫反應的頻率(CDCA1(39-64)LP，19中之14，4%；CDCA1(55-78)LP，19中之13，68%；圖11B與F)，但於10名健康捐贈者中，未偵測到對於CDCA1-LP之專一性IFN-γ反應。於一些接種前的病患，可偵測到CDCA1-LP專一性Th細胞反應(CDCA1(39-64)LP，7中之2，29%；CDCA1(55-78)LP，7中之2，29%；圖11F)。另一方面，在接種CDCA1-A24(56-64)SP後的許多HNC病患，檢測到CDCA1-LP專一性Th細胞反應(CDCA1(39-64)LP，16中之12，75%；CDCA1(55-78)LP，16中之12，75%；圖11F)。於接種後之病患中之CDCA1-LP專一性IFN-γ生產細胞的數目，顯著多於在接種前之病患及健康捐贈者中者(圖11C)。T細胞之IFN-γ生產，由於添加抗HLA-第II類mAb受顯著抑制，而非抗HLA第I類mAb(圖11D)。這些結果指出CDCA1-LP專一性IFN-γ生產係源自CDCA1-LPs專一性CD4+ T細胞。有趣地，在一些HNC病患中，對於CDCA1-LP之專一性反應會由於重複接種疫苗而誘導或增強(圖11E)。此等觀察現象啟示APC收集並處理衍生自被疫苗誘導的CTL殺死的 腫瘤細胞的CDCA1抗原，然後於體內活化CDCA1專一性Th細胞。
討論
據認為最有吸引力的疫苗化合物，係反應於能誘導治療性CD4+與CD8+反應之TAA序列的合成LP(Melief CJ and van der Burg SH。Nat Rev Cancer 2008；8：351-60.,Kenter GG,Welters MJ,et al.N Engl J Med 2009；361：1838-47.)。在注射此等LP後，病患的DC會攝入LP，對其處理並在各種HLA第I類與HLA第II類分別呈現所有可能的CTL-抗原決定位及Th抗原決定位。因此，發明人認為癌免疫療法的理想胜肽疫苗應為能誘導由最常見HLA限制之CTL與Th1細胞兩者的單一多胜肽。
於本研究，本案發明人鑑別包括被受混雜的HLA-第II類限制的Th1細胞辨識的CTL-抗原決定位的CDCA1衍生LP。
結論為是，本案發明人首先鑑別出包括CTL-抗原決定位之衍生自CDCA1之輔助胜肽，其不僅為增殖及活化CDCA1專一性Th1細胞的良好工具，而且可由交叉呈現增殖及活化CDCA1專一性CTL。這些發現有助於未來對於各種類型的癌症進行CDCA1胜肽為基礎的免疫療法的臨床試驗。
[產業利用性]
本發明敘述能誘導有效抗腫瘤免疫反應之衍生自CDCA1的Th1細胞抗原決定位胜肽，且因此對於廣範圍的癌症類型有用。此種胜肽擔保作為抗癌之胜肽疫苗的進一步發展，尤其對抗表現CDCA1之癌症。本發明之胜肽可誘導Th1 細胞反應，且因而由Th1細胞分泌的細胞素可幫助或活化任何以抗原獨立方式擔任細胞免疫的免疫細胞。因此本發明提供的免疫治療策略可適用於包括癌的任意疾病，只要此疾病可藉由由MHC第II類分子媒介之免疫反應而改善。具體而言，本發明之Th1細胞能改善由CTL引起的免疫反應。因此本發明之胜肽對於增強對象中包括癌之疾病的CTL反應有助益。
又，於較佳具體例，本發明之胜肽也誘導對抗表現CDCA1之細胞的CTL及Th1細胞。本發明之如此的胜肽，對於治療相關於CDCA1之疾病，例如癌症，更具體而言，乳癌、膀胱癌、食道癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸癌(HNC)亦為有效。
雖已對於本發明參照特定具體例詳盡敘述，但應了解上述敘述的本質係示範性及解說性，係用來供理解本發明及其較佳具體例。該技術領域中具有通常知識者可輕易理解經由例行實驗可在不偏離本發明精神及範圍之下進行各種改變及潤飾，本發明的邊界和界限由附帶的申請專利範圍界定。
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<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (17)

  1. 一種單離的胜肽，其由選自由以下構成之群組的胺基酸序列所組成：(a)序列識別號：1之胺基酸序列；及(b)一胺基酸序列，其中於(a)之胺基酸序列中有一個或二個胺基酸係經附加，該胜肽有誘導T-輔助1型(Th1)細胞的能力。
  2. 如申請專利範圍第1項之單離的胜肽，其中，該胜肽有結合於至少2種MHC第II類分子的能力。
  3. 如申請專利範圍第2項之單離的胜肽，其中，該MHC第II類分子選自於由HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含具有CDCA1專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力之胜肽的胺基酸序列。
  5. 一種單離的聚核苷酸，其編碼為如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽。
  6. 一種組合物，包含一或多種如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽，或一或多種編碼該胜肽的聚核苷酸。
  7. 一種用於癌症治療之醫藥組合物，其中該組合物包含選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分：(a)一或多種如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽；(b)一或多種如申請專利範圍第5項之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
  8. 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該組合物被配製為供對於具有選自於由HLA-DR4、HLA-DR15及HLA-DP2構成之群組中至少一種作為MHC第II類分子之對象投予。
  9. 如申請專利範圍第7或8項之醫藥組合物，其中該組合物更包含有CTL誘導能力之一或多種胜肽。
  10. 一種in vitro誘導APC之方法，該APC有能力誘導Th1細胞或CTL，該方法包含使APC與如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽接觸的步驟。
  11. 一種in vitro誘導Th1細胞之方法，包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞，及在表面呈現MHC第II類分子與如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之複合體的APC；及(b)將編碼為兩種T細胞受體(TCR)次單元之聚核苷酸、或編碼為各TCR次單元之聚核苷酸導入CD4陽性T細胞內，其中該TCR能結合於在細胞表面上呈現的MHC第II類分子與如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之複合體。
  12. 一種in vitro誘導CTL細胞之方法，該方法包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞兩者，及已接觸如申請專利範圍第4項之胜肽的APC；及(b)共同培養CD8陽性T細胞，及已接觸如申請專利範圍第4項之胜肽的APC。
  13. 一種單離的APC，其在表面上呈現MHC第II類分子與如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之複合體。
  14. 一種APC，係由如申請專利範圍第10項之方法所誘導。
  15. 一種單離的Th1細胞，其辨識在表面上呈現如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之APC。
  16. 一種Th1細胞，係由如申請專利範圍第11項之方法所誘導。
  17. 一種選自於由以下構成之群組中至少一種有效成分用於製造誘導在對象中對抗癌之免疫反應的組合物的用途：(a)一或多種如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽；(b)一或多種如申請專利範圍第5項之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
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