JP2015529629A

JP2015529629A - Ｔｈ１細胞のＣＤＣＡ１エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン

Info

Publication number: JP2015529629A
Application number: JP2015501988A
Authority: JP
Inventors: 西村　泰治; 泰治西村; 雄介冨田; 龍司大沢
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2015-10-08
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: US20150190490A1; US9687538B2; EP2872532A4; US10206989B2; TW201416375A; US20170224795A1; EP2872532A1; US20180117135A9; TWI624475B; TW201726714A; TWI627183B; JP6255593B2; WO2014010229A1

Abstract

Ｔｈ１細胞誘導能を有する単離されたＣＤＣＡ１由来のエピトープペプチドが本明細書において開示される。そのようなペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識され、Ｔｈ１細胞を誘導することができる。好ましい態様では、本発明のそのようなペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子にプロミスキャスに結合することができ、Ｔｈ１細胞に加えてＣＤＣＡ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することができる。そのようなペプチドは、したがって、対象において免疫応答を増強するのに使用することに適しており、したがってがん免疫療法において、特にがんワクチンとして使用することができる。前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、そのようなペプチドによって誘導されるＡＰＣおよびＴｈ１細胞ならびにそれに関連する誘導の方法も本明細書で開示される。前記成分のいずれかを有効成分として含有する医薬組成物は、例えば乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）を含むがんまたは腫瘍の治療および／または予防において使用される。

Description

本発明は生物科学の分野、より詳細にはがん療法の分野に関する。特に、本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬剤に関する。
優先権
本出願は、２０１２年７月１０日出願の米国特許仮出願第６１／６６９，９７１号の恩典を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上で見いだされる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するエピトープペプチドを認識し、その後腫瘍細胞を死滅させることが示されている。ＴＡＡの最初の例として黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、多くの他のＴＡＡが、主として免疫学的アプローチを通して、発見されてきた（非特許文献１、２）。これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発が進められている。

がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡは、免疫療法のための標的として有用であり、というのは、そのようなＴＡＡの使用は、治療的に行われる免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、突然変異または下方制御に起因するがん細胞の免疫回避の広く記述されている危険性を最小限に抑え得るからである。したがって、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる新しいＴＡＡの同定はさらなる発展が保証される。そこで、様々なタイプのがんに対するペプチドワクチン戦略の臨床適用が進行中である（非特許文献３〜１０）。現在までに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを使用した臨床試験のいくつかの報告がある。残念ながら、これまでのところ、これらのがんワクチンの治験は、今までにこれらのがんワクチン治験で認められてきた低い客観的応答率しかもたらしていない（非特許文献１１〜１３）。したがって、免疫療法の標的としての使用に適する新しいＴＡＡが当分野において依然として必要である。

細胞分裂周期関連１（ｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｃｙｃｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ１）としても知られるＣＤＣＡ１遺伝子は、細胞周期遺伝子、例えばＣＤＣ２、サイクリン、トポイソメラーゼＩＩその他と共発現される遺伝子のクラスのメンバーとして同定されている（非特許文献１４）。ＣＤＣＡ１は特に、有糸分裂ＨｅＬａ細胞の動原体に関連することが認められ、それゆえ酵母Ｎｕｆ２の機能的相同体とみなされた（非特許文献１５）。

加えて、２３，０４０遺伝子を含むゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロフィール解析を通して（非特許文献１６）、ＣＤＣＡ１はまた、乳がん（特許文献１）、膀胱がん（特許文献２）、食道がん（特許文献３）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（特許文献４）において上方制御される新規分子としても同定されており、そのような開示の内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤＣＡ１の発現は、特にＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣおよび腫瘍細胞株で上方制御されることが認められたが、２３の正常組織では精巣を除いて発現が検出されなかった。さらに、ｓｉＲＮＡによるＣＤＣＡ１発現の下方制御は、ＣＤＣＡ１発現肺がん細胞株における細胞増殖抑制を引き起こすことが示されている（特許文献４）。

合わせて考慮すると、これらのデータは、ＣＤＣＡ１が新規の潜在的な普遍的がん抗原であることを示唆する。したがって、ＣＤＣＡ１由来のエピトープペプチドは幅広いがんの治療のためのがん免疫療法として適用可能であり得る。
最近、肺がん患者のＰＢＭＣから腫瘍反応性かつＨＬＡ−Ａ２（Ａ^＊０２：０１）拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することができる高度免疫原性のＣＤＣＡ１由来のＣＴＬエピトープ（非特許文献１７、特許文献６）が同定された。さらに、ＣＤＣＡ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬエピトープも同定されている（特許文献７）。それゆえ、ＣＤＣＡ１は、がん免疫療法に適用できる依然として魅力的な標的分子である。
腫瘍特異的ＣＤ４^＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞、特にＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞は、ＣＴＬ媒介性抗腫瘍免疫の効率的な誘導に重要な役割を果たす（非特許文献１８）。Ｔｈ１細胞によって主として産生されるＩＦＮ−γは、長く持続するＣＴＬ応答の誘導と維持のために必須であり、免疫記憶の維持において重要な多数の相互作用を通して支援を提供する（非特許文献１９、２０）。Ｔｈ１細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは、直接の抗腫瘍作用または抗血管新生作用も媒介する（非特許文献２１）。さらに、Ｔｈ細胞は、腫瘍部位におけるＣＴＬの侵入のために道を開かなければならないことが示されている（非特許文献２２）。それゆえ、特異的Ｔｈ１細胞を活性化することができる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来Ｔｈ細胞エピトープの同定は、腫瘍担持宿主における有効な腫瘍免疫の誘導のために重要である；理想的には、有効なワクチンの設計は、ＣＴＬとＴｈ１細胞の両方を刺激する複数のエピトープを含むべきである（非特許文献２３）。しかしながら、ＣＤＣＡ１に由来するそのようなエピトープは未だ同定されていない。

国際公開第２００５／０２８６７６号国際公開第２００６／０８５６８４号国際公開第２００７／０１３６７１号国際公開第２００７／０１３６６５号国際公開第２００５／０８９７３５号国際公開第２００９／０２５１１７号国際公開第２００９／１５３９９２号

ＢｏｏｎＴ，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１９９３Ｍａｙ８，５４（２）：１７７−８０ＢｏｏｎＴａｎｄｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎＰ，ＪＥｘｐＭｅｄ１９９６Ｍａｒ１，１８３（３）：７２５−９ＨａｒｒｉｓＣＣ，ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ１９９６Ｏｃｔ１６，８８（２０）：１４４２−５５ＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄＬＨｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９９Ｊｕｌ１，５９（１３）：３１３４−４２ＶｉｓｓｅｒｓＪＬｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９９Ｎｏｖ１，５９（２１）：５５５４−９ｖａｎｄｅｒＢｕｒｇＳＨｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９６Ｍａｙ１，１５６（９）：３３０８−１４ＴａｎａｋａＦｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９７Ｏｃｔ１５，５７（２０）：４４６５−８ＦｕｊｉｅＴｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１９９９Ｊａｎ１８，８０（２）：１６９−７２ＫｉｋｕｃｈｉＭｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１９９９Ｍａｙ５，８１（３）：４５９−６６ＯｉｓｏＭｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１９９９Ｍａｙ５，８１（３）：３８７−９４ＢｅｌｌｉＦｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００２Ｏｃｔ１５，２０（２０）：４１６９−８０ＣｏｕｌｉｅＰＧｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ２００２Ｏｃｔ，１８８：３３−４２ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ２００４Ｓｅｐ，１０（９）：９０９−１５Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ２００１Ｍａｙ；１（１）：７３−８３ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ２００１Ｊａｎ２２；１５２（２）：３４９−６０ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６Ｎｏｖ１；６６（２１）：１０３３９−４８ＨａｒａｏＭｅｔａｌ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２００８；１２３：２６１６−２５ＣｈａｍｏｔｏＫｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００４；６４：３８６−９０ＢｅｖａｎＭＪ．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２００４；４：５９５−６０２ＳｈｅｄｌｏｃｋＤＪａｎｄＳｈｅｎＨ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００３；３００：３３７−９ＳｔｒｅｅｔＳＥｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ２００１；９７：１９２−７ＢｏｓＲ，ａｎｄＳｈｅｒｍａｎＬＡ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１０；７０：８３６８−７７ＭｅｌｉｅｆＣＪｅｔａｌ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２００８；８：３５１−６０

本発明に関連して、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、両者が互いに天然で近位である、ＣＴＬとＴｈ１細胞の両方のエピトープを含む単一ポリペプチドを含むものであると考えた（ＫｅｎｔｅｒＧＧｅｔａｌ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２００９；３６１：１８３８−４７）。

そのために、本発明者らは、プロミスキャスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＨＬＡクラスＩＩ分子との関連で認識され、ＣＴＬエピトープを含む、新規ＣＤＣＡ１由来Ｔｈ１細胞エピトープを同定する戦略を設計し、そのようにして特徴づけられたエピトープがより効率的なＴ細胞媒介性腫瘍免疫を誘導するという仮定の下で研究を進めた。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを予測するコンピュータアルゴリズムおよびＨＬＡ−Ａ２４（Ａ^＊２４：０２）またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによって認識される公知のＣＴＬエピトープ配列を使用して、候補となる、ＣＴＬエピトープを含有するプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１細胞エピトープを選択した。

本発明は、少なくとも一部には、Ｔｈ１細胞応答を誘導するための免疫療法の標的として役立つ適切なエピトープペプチドの発見に基づく。ＣＤＣＡ１遺伝子は、乳がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、食道がんおよび頭頸部がんを含む多くのがん型で上方制御されることが認められているので、本発明は、細胞分裂周期関連１（ｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｃｙｃｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ１）（ＣＤＣＡ１）遺伝子の遺伝子産物、より詳細にはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５６９７（配列番号：９）の遺伝子によってコードされる配列番号：１０に示すポリペプチドをさらなる分析のための標的とする。対応する分子に特異的なＴｈ１細胞を誘発するエピトープペプチドを含むＣＤＣＡ１遺伝子産物をさらなる試験のために特に選択した。例えば、健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒトＣＤＣＡ１に由来するプロミスキャスなＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＰ結合ペプチドを用いて刺激した。それぞれの候補ペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲまたはＤＰ陽性標的細胞を認識するＴｈ１細胞を樹立し、ＣＤＣＡ１に対する強力で特異的な免疫応答を誘導することができるＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＰ拘束性エピトープペプチドを同定した。これらの結果は、ＣＤＣＡ１が強力な免疫原性をもち、そのエピトープはＴｈ１細胞応答を通して媒介される腫瘍免疫療法のために有効であることを明らかにする。付加的な試験は、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＰ結合ペプチドが、同じドナーにおいてＣＤＣＡ１特異的にＣＴＬ応答を刺激できることも明らかにした。これらの結果は、ＣＤＣＡ１が強く免疫原性であること、ならびにＴｈ１細胞およびＣＴＬエピトープの両方を含むそのエピトープが、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ応答の両方を通して媒介される腫瘍免疫療法のために有効であることを確認する。

それゆえ、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供することが本発明の１つの目的である。本発明は、改変されたペプチド、すなわち最大３０アミノ酸までの長さであり、配列番号：１０（ＣＤＣＡ１）のアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を有する、Ｔｈ１細胞誘導能を備えたペプチド、ならびにその機能的等価物を企図する。あるいは、本発明はまた、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドも提供する。いくつかの態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１または２のアミノ酸配列または、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を維持しつつ、１、２もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加されている、その改変型に対応する。

対象に投与された場合、本発明のペプチドは、好ましくは１つまたは複数の抗原提示細胞の表面に提示され、次にこれがＴｈ１細胞を誘導する。本発明のペプチドが少なくとも１つのＣＴＬエピトープをさらに含む場合、そのようなＡＰＣはまた、本発明のペプチドから生成されるＣＴＬエピトープを提示し、したがってそれぞれのペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するようにペプチドをプロセシングする。それゆえ、本発明のペプチドのいずれかまたはその断片を提示する抗原提示細胞、ならびに抗原提示細胞を誘導するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。

本発明の１つまたは複数のペプチドもしくはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなペプチドもしくはその断片を提示する抗原提示細胞の投与は、強力な抗腫瘍免疫応答の誘導をもたらす。したがって、以下の１つまたは複数を有効成分として含有する薬剤または医薬組成物を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である：（ａ）本発明の１つまたは複数のペプチド、（ｂ）そのようなペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、および（ｃ）本発明の１つまたは複数の抗原提示細胞。そのような本発明の薬剤または医薬組成物は、ワクチンとして特に有用である。

がん（すなわち腫瘍）の治療および／もしくは予防（すなわち防止）、ならびに／またはその術後再発の予防のための方法を提供することが本発明のなおさらなる目的である。本発明の１つまたは複数のペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示細胞または薬剤もしくは医薬組成物を投与する段階を含む、Ｔｈ１細胞を誘導するまたは抗腫瘍免疫を誘導するための方法も企図される。さらに、本発明のＴｈ１細胞はがんに対するワクチンとしても使用され、がんの例には、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の特に企図される目的の例には以下が含まれる：
［１］１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：１０のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって：
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列から選択される９を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を誘導する能力を有するペプチド。
［２］前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、［１］に記載の単離されたペプチド。
［３］前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択される、［２］に記載の単離されたペプチド。
［４］前記ペプチドが、ＣＤＣＡ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド。
［５］前記ペプチドが、
（ａ）配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の単離されたペプチド。
［６］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［７］
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
から成る群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物、または
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
から成る群より選択される少なくとも１種類の細胞を誘導するための組成物であって、［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
［８］
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、ならびに
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
［９］前記組成物が、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与のために製剤化されている［８］に記載の医薬組成物、または前記組成物が、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択される少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象への投与のために製剤化されている［８］に記載の医薬組成物。
［１０］前記組成物が、ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、［８］または［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物。
［１２］Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、ＡＰＣを［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む方法。
［１３］ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
［１４］Ｔｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法、またはＴｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードする単一ポリヌクレオチド、または各々別々のＴＣＲサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、ＡＰＣの細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
［１５］ＣＴＬを誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、［４］または［５］に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、［４］または［５］に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
［１６］ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法。
［１７］ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
［１８］［１２］または［１３］に記載の方法によって誘導されるＡＰＣ。
［１９］ＡＰＣの表面に提示された［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたＴｈ１細胞。
［２０］［１４］に記載の方法によって誘導されるＴｈ１細胞。
［２１］がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法。
［２２］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
［２３］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
［２４］［２３］に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
［２５］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチド、［６］に記載のポリヌクレオチドまたは［２２］に記載の抗体を含む、診断キット。

上記に加えて、本発明の他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を付属の図面および実施例と併せて読めばより十分に明らかになる。しかしながら、本発明の前記概要および以下の詳細な説明はどちらも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、ここでいくつかの特定の態様を参照して本発明を説明するが、説明は本発明を例証するものであり、本発明の限定とは解釈されないことが認識される。様々な変更および適用が、付属の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に想起され得る。同様に、本発明の他の目的、特徴、利益および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかであり、また当業者には容易に明白である。そのような目的、特徴、利益および利点は、単独でまたは本明細書に組み込まれる参考文献を考慮して、付属の実施例、データ、図面およびそれらから引き出されるすべての妥当な推論と併せて上記から明らかとなるであろう。

本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明とその好ましい態様を考慮した上で当業者に明らかになるであろう。

図１は、コンピュータアルゴリズム（コンセンサス法）によって予測されるＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合ＣＤＣＡ１由来ペプチドを示す。パートＡは、コンピュータアルゴリズム（ＩＥＢＤ解析リソース、コンセンサス法、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ＩＩ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）を用いたヒトＣＤＣＡ１タンパク質のアミノ酸配列の解析の結果を表示する。横軸の数字は、ＣＤＣＡ１由来の１５ｍｅｒペプチドのＮ末端のアミノ酸残基位置を示す。より高いコンセンサスパーセンタイル順位は、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのより強い結合親和性を示す。

パートＢは、複数のＨＬＡクラスＩＩアリル産物（ＤＲＢ１^＊０４：０５、ＤＲＢ１^＊１５：０２およびＤＰＢ１^＊０２：０１）についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつＣＴＬによってＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２に関連して認識される９ｍｅｒペプチドを含む、オーバーラップする２６ｍｅｒおよび２４ｍｅｒの２つの長鎖ペプチド（ＣＤＣＡ１（３９−６４）およびＣＤＣＡ１（５５−７８））を選択し（Ａ、黒いバー）、ＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ細胞エピトープを同定するために合成したことを示す。

図２は、長鎖ペプチドでの刺激によるＣＤＣＡ１特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の誘導および拘束ＨＬＡクラスＩＩ分子の同定を示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞株を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）またはＣＤＣＡ１（３９−６４）での少なくとも３回の刺激後に様々なＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型を有する３名の健常ドナーから生成し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４^＋Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。パートＡでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）に対する応答を３名の健常ドナーについて示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、自己ＰＢＭＣ単独（−）、ＣＤＣＡ１（５５−７８）（１０μｇ／ｍｌ）でパルスしたＰＢＭＣ、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰもしくはＨＬＡ−ＤＱに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＰＢＭＣで刺激した。

パートＢでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）に対する応答を２名の健常ドナーについて示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、自己ＰＢＭＣ単独（−）、ＣＤＣＡ１（５５−７８）（１０μｇ／ｍｌ）でパルスしたＰＢＭＣ、またはＨＬＡ−ＤＲもしくはＨＬＡ−ＤＰに特異的な５μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＰＢＭＣで刺激した。パートＣでは、ＣＤＣＡ１（３９−６４）に対する応答を２名の健常ドナーについて示す。ドナーのＨＬＡ型を各パネルの上部に表示した。データは、２回または３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

図３は、様々なＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞によるＣＤＣＡ１（５５−７８）およびＣＤＣＡ１（３９−６４）ペプチドの認識を示す。パートＡでは、健常ドナーＨＤ１から樹立したＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞株を、抗ＨＬＡ−ＤＲもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ４、ＷＴ１ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ４、またはＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ５３と共培養した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した（上のパネル）。健常ドナーＨＤ−２からのＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞株を、抗ＨＬＡ−ＤＲもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ１５、またはＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ８と共培養した（下のパネル）。

パートＢでは、ドナーＨＤ３に由来するＨＬＡ−ＤＰ拘束性およびＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔクローンを、ＨＬＡ−ＤＰ２陽性または陰性の５名のドナーからの抗ＨＬＡ−ＤＲまたは抗ＨＬＡ−ＤＰブロッキングｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたまたはパルスしていない同種ＰＢＭＣと共培養した。

パートＣは、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性Ｔｈ細胞によるＣＤＣＡ１（５５−７８）ペプチドの認識を表示する。健常ドナーＨＤ４および健常ドナーＨＤ５に由来するＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、抗ＨＬＡ−ＤＲもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ４、ＷＴ１ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ４、ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＬ−ＤＲ１、またはＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＬ−ＤＲ５３と共培養した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。ドナーのＨＬＡ型を各パネルの上部に表示した。データは、２回または３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

パートＤでは、ドナーＨＤ１に由来するＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞クローンを、ＨＬＡ−ＤＰ９陽性または陰性の２名のドナーからの抗ＨＬＡ−ＤＲまたは抗ＨＬＡ−ＤＰブロッキングｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスしたまたはパルスしていない同種ＰＢＭＣと共培養した（上のパネル）。ドナーＨＤ３に由来するＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的ＣＤ４^＋Ｔ株を、抗ＨＬＡ−ＤＲもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下にＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ１５、またはＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスしたもしくはパルスしていないＬ−ＤＲ８と共培養した（下のパネル）。ドナーのＨＬＡ型を各パネルの上部に表示した。データは、２回または３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

図４は、バルクＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞株の機能的特性を示す。パートＡ〜Ｄでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）または無関係なペプチド（ＷＴ１−０４０５もしくはＨＩＶ−ＬＰ）でパルスしたＬ−ＤＲ４（パートＡおよびＤ）または自己ＰＢＭＣ（パートＢおよびＣ）と共培養したＴ細胞の２０時間のインキュベーション期間後、培地を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−４、ＩＬ−７）の濃度を測定した。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。パートＥ〜Ｈは、抗原刺激後にＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を表示する。示されている事象はＣＤ４^＋Ｔ細胞にゲートをかけている。細胞をＣＤＣＡ１（５５−７８）または無関係なペプチド（例えばＷＴ１−０４０５）で再刺激した。プロットの内部の数字は、象限の特徴を有する細胞集団（ＣＤ４^＋ＣＤ１０７ａ^＋Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。

パートＢでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）または無関係なペプチド（ＷＴ１−０４０５またはＨＩＶ−ＬＰ）でパルスした自己ＰＢＭＣと共培養したＴ細胞の２０時間のインキュベーション期間後、培地を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−４、ＩＬ−７）の濃度を測定した。

パートＣでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）または無関係なペプチド（ＷＴ１−０４０５またはＨＩＶ−ＬＰ）でパルスした自己ＰＢＭＣと共培養したＴ細胞の２０時間のインキュベーション期間後、培地を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−４、ＩＬ−７）の濃度を測定した。

パートＤでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）または無関係なペプチド（ＷＴ１−０４０５またはＨＩＶ−ＬＰ）でパルスしたＬ−ＤＲ４と共培養したＴ細胞の２０時間のインキュベーション期間後、培地を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイシステムを用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−４、ＩＬ−７）の濃度を測定した。

パートＥは、抗原刺激後にＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を表示する。

パートＦは、抗原刺激後にＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を表示する。

パートＧは、抗原刺激後にＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を表示する。

パートＨは、抗原刺激後にＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を表示する。

図５は、ＣＤＣＡ１タンパク質をロードした自己ＤＣを認識するドナーＨＤ１から樹立したＣＤＣＡ１（５５−７８）およびＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的Ｔｈクローンを示す。パートＡでは、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＴｈクローンまたはＨＬＡ−ＤＲ９拘束性ＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的Ｔｈクローン（２×１０^４／ウェル）を、抗ＨＬＡ−ＤＲもしくは抗ＨＬＡクラスＩブロッキングｍＡｂの存在下に組換えＣＤＣＡ１タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）をロードした自己ＤＣ（５×１０^３／ウェル）、対照タンパク質、またはロードしていないＤＣと共培養した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈクローンの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。パートＢにおいて、ドナーＨＤ３から樹立したＨＬＡ−ＤＰ２拘束性ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈ細胞クローンは、ＣＤＣＡ１タンパク質をロードした自己ＤＣを認識する。ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈ細胞クローンを、ＣＤＣＡ１タンパク質をロードした自己ＤＣと共培養し、ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞クローンの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。データは２回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

図６は、インビトロおよびインビボでＣＴＬの効率的なクロスプライミングを誘導するＣＤＣＡ１−ＬＰを示す。パートＡでは、ＨＬＡ−２陽性かつＨＬＡ−ＤＲ４陽性のドナーＨＤ１から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードしたＤＣで刺激した。３回の刺激後、生成されたＣＴＬ株を、抗ＨＬＡクラスＩまたは抗ＨＬＡ−ＤＲブロッキングｍＡｂまたは無関係なペプチド（ＨＩＶ−Ａ２）の存在下にＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰでパルスしたＴ２細胞と共培養し、ＩＦＮ−γ産生ＣＴＬの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。２名のＨＬＡ−２陽性かつＨＬＡ−ＤＲ４陽性の健常ドナーのＰＢＭＣを使用して得た同様の結果を有する３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。パートＢでは、ＩＦＡ中に乳化したＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰで免疫したマウスにおけるＣＤＣＡ１（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖を示す。ＨＬＡ−Ａ２Ｔｇｍを、尾の基部で、ＩＦＡ中に乳化したＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰを用いて免疫した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでの２回目または３回目のワクチン接種の７日後、鼠径リンパ節中のＣＤ８^＋Ｔ細胞をポジティブ単離し、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣまたは無関係なペプチドと共培養して、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。同様の結果を得た７つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

パートＣにおいて、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰはＨＬＡ−Ａ２４^＋／Ａ２^＋／ＤＲ４^＋ＨＤ５においてＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬの効率的なクロスプライミングを誘導する。ＨＤ５から単離した精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードした自己ＤＣで刺激した。３回の刺激後、生成されたＣＴＬを、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰでパルスしたＴ２細胞、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞、または対照ＳＰでパルスした標的細胞で再刺激した。ＩＦＮ−γ産生ＣＴＬの数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。パートＤでは、ＨＬＡ−Ａ２４ＴｇｍをＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（左側のパネル）またはＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ（右側のパネル）で免疫した。ＣＤＣＡ１−ＬＰでの２回目のワクチン接種後、鼠径リンパ節中のマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰまたはＨＩＶ−Ａ２４ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣまたはＣ１Ｒ−Ａ２４０２で刺激した。

パートＥでは、ＣＤＣＡ１−ＬＰワクチンによるＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬの優れた誘導を示す。ＨＬＡ−Ａ２４ＴｇｍをＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ、ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ、またはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）（３００ｎｍｏｌ／マウス）で免疫した。ＣＤＣＡ１由来ペプチドでの２回目のワクチン接種後、鼠径リンパ節中のマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰまたはＨＩＶ−Ａ２４ＳＰ（バックグラウンド）でパルスしたＢＭ−ＤＣで刺激した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の特異的ＩＦＮ−γスポットを表す。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た３つの独立した実験を代表するものを示す。

図７は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰおよびＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞クローンでの刺激によるＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）またはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的ＣＴＬの誘導の増強を示す。パートＡでは、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞クローンを作製したＨＬＡ−Ａ２かつＤＲ４陽性の健常ドナーＨＤ１からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）およびＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）の混合物（混合ＳＰ、それぞれ２０μｇ／ｍｌ）、混合ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）（ＬＰ、２０μｇ／ｍｌ）、混合ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞クローン（Ｔｈクローン、５×１０^５／ウェル）、または混合ＳＰ＋ＬＰ＋Ｔｈクローンと共に１１日間培養した。７日間の培養後、これらのペプチド（上記で示したのと同じ濃度）およびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を添加し（２回目の刺激）、次にＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を９日目に添加した。培養の１１日目に、細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂと組み合わせてＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ペプチド複合体またはＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）ペプチド複合体のＰＥ標識テトラマーで染色し、フローサイトメトリによって分析した。右上象限のドットはＣＤ８^＋テトラマー^＋Ｔ細胞を表す。示されている事象はＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけている。プロットの内部の数字は、右上象限の特徴を有する細胞集団（ＣＤ８^＋テトラマー^＋Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。データは、同様の結果を得た３つの独立した実験を代表する。

パートＢでは、ＣＤ８^＋テトラマー^＋細胞の増加（増加倍数）の値を示す。

パートＣでは、培養の１４日目に、これらのペプチド（上記で示したのと同じ濃度）およびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を添加し（３回目の刺激）、次にＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を１６日目に添加した。培養の１８日目に、細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂと組み合わせてＰＥ標識テトラマーで染色した（上のパネル）。１８日目のＣＤＣＡ１−Ａ２反応性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。棒は、生成された株をＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）または無関係なＨＩＶ−Ａ２ペプチド（黒い棒）をロードしたＴ２細胞で再刺激した場合のＩＦＮ−γスポットの数を示す。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。統計的に有意の差（ｐ＜０．０５）を星印で示す（下のパネル）。

パートＤでは、抗原刺激後にＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａの検出を示す。示されている事象はＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけている。細胞をＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）、ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）または無関係なＨＩＶ−Ａ２ペプチドで再刺激した。プロットの内部の数字は、象限の特徴を有する細胞集団（ＣＤ８^＋ＣＤ１０７ａ^＋Ｔ細胞）のパーセンテージを示す。

パートＥでは、活性化ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導増強を示す。ＨＬＡ−Ａ２４^＋／ＤＲ１５^＋ＨＤ２由来のＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ特異的バルクＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＤ８^＋Ｔ細胞を、いずれのサイトカインも添加せずに、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ（ＳＰ単独）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ＋対照ＬＰ（対照＋ＬＰ）またはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ＋ＳＰ）の存在下で自己ＤＣと共に培養した。ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、培養細胞をＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）複合体のＰＥ標識テトラマーおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂで染色した。ペプチドなしで培養した細胞（ペプチドなし）の結果も示した。刺激前の棒は、この実験で使用したＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＤ８^＋Ｔ細胞株のテトラマー^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／ウェルの絶対数を示す。代表的なＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的テトラマー染色を示す（ＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけている、ドットプロット）。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

図７Ｅ２は図７Ｅ１の続きである。

図８は、健常ドナーからのＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞の誘導を示す。パートＡでは、ＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでの刺激によってＤＲ４^＋健常ドナー（ＨＤ１）から生成した。生成したＴｈ細胞を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでパルスした自己ＰＢＭＣまたはＬ細胞で再刺激した。ＷＴ１ペプチドを対照ペプチドとして使用した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。ＨＤ１から得た同様の結果を有する少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。他の２名のＤＲ４^＋ドナーからも同様の結果を得た（表１；ＨＤ４およびＨＤ５）。ドナーＨＤ１のＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型をパネルの上方に示す。下線を付したＨＬＡクラスＩＩアリルは、Ｔｈ細胞にペプチドを提示するＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする。ＨＬＡ−ＤＱｍＡｂによるブロッキング作用は、ＨＤ１では試験しなかった。

パートＢでは、ＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでの刺激によってＤＲ４陰性、ＤＲ１５陽性健常ドナー（ＨＤ２）から生成した。同様の結果を得た少なくとも５つの独立した実験からの代表的なデータを示す。

パートＣでは、ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性およびＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ特異的バルクＴｈ細胞株（Ｃ−１）またはＴｈ細胞クローン（Ｃ−２）をＨＤ３から樹立した。ＨＬＡ−ＤＰ拘束性Ｔｈクローンを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでパルスした／パルスしていないＨＬＡ−ＤＰ２陽性または陰性ドナー由来の同種ＰＢＭＣと共培養した。

パートＣ２では、ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性およびＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ特異的バルクＴｈ細胞クローンをＨＤ３から樹立した。

パートＤでは、ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ特異的Ｔｈ細胞を、ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰでの刺激によってＤＲ１５^＋健常ドナー（ＨＤ３）から生成した。

パートＥでは、ＨＬＡ−ＤＲ９拘束性ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ特異的バルクＴｈ細胞（左側のパネル）またはＴｈ細胞クローン（右側のパネル）をＨＤ１から樹立した。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性Ｔｈクローンを、ＨＬＡ−ＤＲ９陽性または陰性ドナーからのＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰでパルスしたまたはパルスしていない同種ＰＢＭＣと共培養した。ＨＤ１から生成したこのＨＬＡ−ＤＲ拘束性Ｔｈ細胞クローンは、ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰでパルスしたＬ−ＤＲ４細胞に対する応答を示さなかった（データは示していない）。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。同様の結果を得た少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。ドナーのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型をパネルの上方に示した。下線を付したＨＬＡクラスＩＩアリルは、Ｔｈ細胞にペプチドを提示するＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする。

図９は、ＣＤＣＡ１−ＬＰがインビトロでＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効率的な増殖を誘導することを示す。パートＡでは、ＨＤ２（ＨＬＡ−Ａ２４^＋およびＤＲ１５^＋）から樹立したＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的バルクＣＴＬを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（黒い丸）または無関係なＬＰ（白い丸）でパルスした自己ＤＣを用いてインビトロで刺激した。ＬＰ刺激の前（０日目）ならびに刺激後５、７、８および１０日目に、培養した細胞（１×１０^５細胞）のＣＤ８^＋Ｔ細胞のアリコートを、抗ヒトＣＤ８ｍＡｂと組み合わせてＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的テトラマーで染色した。３つの独立した実験からの０日目と１０日目の代表的なデータを示す（右側のパネル）。事象はＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけている。ＣＤ８^＋Ｔ細胞中のテトラマー^＋細胞のパーセンテージを線で表示する（左側のパネル）。

パートＢでは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰは、インビトロでＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効率的な増殖を誘導する。ＨＤ５（ＨＬＡ−Ａ２４^＋およびＤＲ４^＋）から樹立したＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＴＬを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（右の棒）または対照ＬＰ（中央の棒）でパルスした自己ＤＣを用いてインビトロで刺激した。ＬＰ刺激の前（ＬＰ刺激前、０日目；左の棒）および刺激後７日目（中央および右の棒）に、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでパルスしたまたはＨＩＶ−Ａ２４ＳＰ（バックグラウンド）でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（２×１０^４／ウェル）での刺激後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞（１×１０^５／ウェル）の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した。３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。

パートＣでは、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者（ＨＮＣ２９）からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物と共に培養した。０日目（エクスビボ）および７日目（ＣＤＣＡ１−ＬＰでのインビトロ刺激後）に、ＰＢＭＣをテトラマーＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）複合体または対照テトラマーで染色した（ＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけた）。７日目に、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの頻度も検出した（右側のパネル、棒グラフ）。データは３回のアッセイの平均±ＳＤとして提示している。

パートＤ〜Ｇでは、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者（ＨＮＣ２６、３１、３９および１０９）からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物と共に培養した。０日目（エクスビボ）および７日目（ＣＤＣＡ１−ＬＰでのインビトロ刺激後）に、細胞をテトラマーＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）複合体または対照テトラマーで染色した（ＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけた）。

パートＥでは、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者（ＨＮＣ３１）からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物と共に培養した。

パートＦでは、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者（ＨＮＣ３９）からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物と共に培養した。

パートＧでは、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者（ＨＮＣ１０９）からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物と共に培養した。

図１０は、ＤＣによるＣＤＣＡ１−ＬＰの交差提示を示す。パートＡでは、ＤＣによるＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰの取込みと交差提示を示す。固定していないまたは固定したＤＣをＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰまたはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰで３時間パルスした。バルクＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的ＣＴＬを６時間共培養し、応答をＩＦＮ−γ標識によって測定した。事象はＣＤ８^＋テトラマー^＋Ｔ細胞にゲートをかけており、プロットの内部の数字はＩＦＮ−γ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

パートＢでは、ＤＣによるＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの交差提示を示す。固定していないまたは固定したＤＣをＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰまたはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰで３時間パルスした。バルクＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬを６時間共培養し、応答をＩＦＮ−γ標識によって測定した。事象はＣＤ８^＋テトラマー^＋Ｔ細胞にゲートをかけており、プロットの内部の数字はＩＦＮ−ｇ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

図１１は、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者から単離したＰＢＭＣにおけるＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を示す。パートＡでは、ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰとＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰの混合物でＰＢＭＣを１週間インビトロ刺激した後、個々のＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した。パートＢにおいて、ＨＮＣ患者は、正常で健康な個人と比較してＣＤＣＡ１特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞免疫の上昇を示す。ＣＤＣＡ１−ＬＰに応答する健常ドナー（対照）およびＨＮＣ患者の割合を示す棒グラフである。ｐ値はフィッシャーの正確確率検定からの統計結果を表す。

パートＣでは、ＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞応答を、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種した１６名のＨＮＣ患者（ワクチン接種後）、７名の非ワクチン接種患者（ワクチン接種前）、および１０名の健常ドナーにおいて評価した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の特異的ＩＦＮ−γスポットを表す。各々のドットは個々のドナーを表す。水平の線は中央値を示し、ｐ値はノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定からの統計結果を表す。１９名のＨＮＣ患者のうち７名（ＨＮＣ１０、２６、３４、３７、３８、４０および１０３）における実験は単一ウェルで実施した。

パートＤでは、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のＨＬＡクラスＩＩ拘束を示す。ＬＰで１週間刺激したＰＢＭＣを、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡクラスＩに特異的なｍＡｂの存在下に各々のＣＤＣＡ１−ＬＰで再刺激した。同様の結果を有する１２名のＨＮＣ患者（ＨＮＣ２６、２９、３１、３４、３５、３９、４０、４２、１０３、１０５、１０７および１０８）から得た２０の棒グラフのうち６つを示す。１２名のＨＮＣ患者のうち６名（ＨＮＣ２６、３４、４０、１０３および１０７）における実験は単一ウェルで実施した。ＣＤＣＡ１_{３９−６４}−ＬＰ；１０名のＨＮＣ患者（ＨＮＣ２６、２９、３１、３４、３９、４０、４２、１０３、１０７および１０８）からの代表的な３つの棒グラフ。ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ；１０名のＨＮＣ患者（ＨＮＣ２６、２９、３１、３４、３５、３９、４０、１０３、１０５および１０８）からの代表的な３つの棒グラフ。

パートＥにおいて、ＣＴＬエピトープワクチンの反復接種は、ＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞応答を誘導する（ＨＮＣ３９、４０、４２および１０９）または増強する（ＨＮＣ１０７および１０８）（ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ、白い棒；ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ、黒い棒）。６名のＨＮＣ患者のうち３名（ＨＮＣ４０、１０８および１０９）における実験は単一ウェルで実施した。

パートＦでは、ＨＮＣ患者の臨床的特徴を示す。「材料および方法」で詳述するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定したＣＤＣＡ１特異的Ｔ細胞応答を示す。１９名のＨＮＣ患者のうち７名（ＨＮＣ１０、２６、３４、３７、３８、４０および１０３）における実験は単一ウェルで実施した。ワクチン接種回数「０」は、ワクチン接種前の患者を示す。（＋）および（−）は陽性および陰性応答を示す。下線を付したＨＬＡクラスＩＩアリルは、健常ドナーにおいてＴｈ細胞にＣＤＣＡ１−ＬＰを提示するＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする（図８；ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０５、ＤＲＢ１＊０９：０１、ＤＲＢ１^＊１５：０２およびＤＰＢ１^＊０２：０１）。Ｎｏ．、回数；ＣＴＲ、臨床試験登録；ｖａｃ．、ワクチン接種；ＨＮＣ、頭頸部がん；Ｍ／Ｆ、男性／女性；ＬＰ、長鎖ペプチド；ｎ．ｔ．、試験せず

態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本発明が本明細書で述べる特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本記載で用いる用語は、特定のバージョンまたは態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。

本明細書で言及する各々の公報、特許または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。しかしながら、本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。

Ｉ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
本明細書で使用する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という語は、特に明確に示されない限り「少なくとも１つの」を意味する。

ある物質（例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、さもなければ天然源中に含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離されたまたは精製されたペプチドは、そのペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの糖質、脂質もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まない、または化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。

「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、ペプチドが、そのペプチドが単離されたまたは組換え生産された細胞の細胞成分から切り離されている、ペプチドの調製物を包含する。したがって、細胞物質を実質的に含まないペプチドは、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物を包含する。ペプチドが組換え生産される場合は、ペプチドは、好ましくは培地も実質的に含まず、ペプチド調製物の容積の約２０％、１０％または５％未満の培地を含むペプチドの調製物を包含する。ペプチドが化学合成によって生産される場合は、ペプチドは、好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、そのペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容積の約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満含むペプチドの調製物を包含する。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えばタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の単一バンドの出現およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色等によって示され得る。好ましい態様では、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは単離または精製されている。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。本用語は、天然のアミノ酸ポリマーに加えて、１つもしくは複数のアミノ酸残基が修飾された残基であるアミノ酸ポリマー、または対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基にも適用される。

本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム）を有する化合物を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様に機能する化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書ではＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される、一般に公知の３文字表記、または１文字表記によって言及され得る。

「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、一般に受け入れられている１文字コードによって言及される。
「剤」および「組成物」という用語は、本明細書では、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接または間接的に生じる任意の生成物を指すために互換的に使用される。医薬組成物に関するそのような用語は、有効成分、および担体を構成する不活性成分を含む生成物、ならびに成分の任意の２つもしくはそれ以上の組合せ、錯体形成もしくは凝集から、または成分の１つもしくは複数の解離から、または成分の１つもしくは複数の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と医薬的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。

「有効成分」という用語は、本明細書では生物学的または生理学的に活性な組成物中の物質を指す。特に、医薬組成物に関連して、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す成分物質を指す。例えば、がんの治療または予防における使用のための医薬組成物の場合、組成物中の有効成分は、直接または間接的にがん細胞および／または組織に対する少なくとも１つの生物学的または生理学的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用は、がん細胞増殖を低減するまたは阻害すること、がん細胞および／または組織を損傷するまたは死滅させること等を含み得る。典型的には、有効成分の間接的効果は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答の誘導である。製剤化される前は、「有効成分」は「バルク」、「原薬」または「原体」とも称され得る。
本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を含むがこれらに限定されない、医薬的または生理学的に許容される材料、組成物、物質またはビヒクルを意味する。

特に定義されない限り、「がん」という用語は、例えば乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）を含む、ＣＤＣＡ１遺伝子を過剰発現するがんを指す。
特に定義されない限り、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

特に定義されない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」および「ＣＴＬ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、非自己細胞（例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。ＣＴＬは、ＣＤ８^＋Ｔリンパ球と区別され、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができる。

特に定義されない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、サブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０１、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０３、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０４、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０７、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０８、ＨＬＡ−Ａ^＊２４２０、ＨＬＡ−Ａ^＊２４２５およびＨＬＡ−Ａ^＊２４８８が含まれるが、これらに限定されない。

特に定義されない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的にはサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０４、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０５、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０７、ＨＬＡ−Ａ^＊０２１０、ＨＬＡ−Ａ^＊０２１１、ＨＬＡ−Ａ^＊０２１３、ＨＬＡ−Ａ^＊０２１６、ＨＬＡ−Ａ^＊０２１８、ＨＬＡ−Ａ^＊０２１９、ＨＬＡ−Ａ^＊０２２８およびＨＬＡ−Ａ^＊０２５０が含まれるが、これらに限定されない。

特に定義されない限り、「Ｔヘルパー１型細胞」および「Ｔｈ１細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができ、細胞性免疫に関連するＣＤ４^＋Ｔリンパ球のサブグループを指す。特に定義されない限り、「Ｔｈ細胞」、「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」および「ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞」という用語も本明細書では互換的に使用される。Ｔｈ１細胞は、細胞性免疫に関する他の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）の活性化および／または刺激を助けるために様々なサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等）を分泌する。

特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ４」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０３、ＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：１０およびＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：１１が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ９」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０３、ＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０８およびＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０９が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ１５」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：１０およびＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：１１が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＰ２」という用語はサブタイプを指し、その例にはＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２０１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２：０２が含まれるが、これらに限定されない。特に定義されない限り、「ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答」という語句は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの提示によって誘導される免疫応答を指す。本明細書では、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって媒介される免疫応答」は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、特にＴｈ１細胞によって誘導される免疫応答を含む。そのような免疫応答の例には、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等）の産生ならびに他の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ等）の活性化および／または刺激が含まれるが、これらに限定されない。

特に定義されない限り、「ＣＤＣＡ１に特異的なＴｈ１細胞」という語句は、ＣＤＣＡ１に由来するペプチドを提示する抗原提示細胞によって特異的に活性化されるが、他の抗原提示細胞では特異的に活性化されないＴｈ１細胞を指す。
特に定義されない限り、「ＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬ」という語句は、ＣＤＣＡ１を発現する標的細胞に対して特異的に細胞傷害性を示すＣＴＬを指す。
特に定義されない限り、ペプチドに関連して使用される場合、「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を指す。
特に定義されない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬と他の材料の組合せに関して用いられる。キットは、マイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが本明細書で企図される。「キット」という用語は、試薬および／または材料の特定の組合せに限定されることを意図しない。

本発明に関連して、「抗体」という用語は、指定されるタンパク質またはそのペプチドに特異的に反応性である免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体は、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射性標識に融合した抗体、および抗体断片を含み得る。さらに、本明細書における抗体はその最も広い意味で使用され、特に無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体］は、すべてのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を示す。
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

ＩＩ．ペプチド
以下で詳細に説明する本発明のペプチドは、「ＣＤＣＡ１ペプチド」または「ＣＤＣＡ１ポリペプチド」と称され得る。
ＣＤＣＡ１に由来するペプチドがＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞によって認識される抗原として機能することを明らかにするため、ＣＤＣＡ１に由来するペプチド（配列番号：１０）を、これらがＭＨＣクラスＩＩ分子によってプロミスキャスに拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定するために分析した。
ＣＤＣＡ１に由来するプロミスキャスなＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２への結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをロードした樹状細胞（ＤＣ）によるＣＤ４^＋Ｔ細胞のインビトロ刺激後、以下のペプチドの各々を用いてＴｈ１細胞を成功裏に樹立した：
ＣＤＣＡ１／ＩＶＹＧＩＲＬＥＨＦＹＭＭＰＶＮＳＥＶＭＹＰＨＬ（５５−７８；配列番号：１）、および
ＣＤＣＡ１／ＮＰＫＰＥＶＬＨＭＩＹＭＲＡＬＱＩＶＹＧＩＲＬＥＨＦ（３９−６４；配列番号：２）。

上述したこれらの樹立されたＴｈ１細胞は、それぞれのペプチドでパルスした抗原提示細胞の刺激に応答して強力な特異的Ｔｈ１細胞活性を示した。さらに、前記ペプチドは、日本人において高頻度に認められるいくつかのＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ９およびＨＬＡ−ＤＰ２）によって拘束されるＴｈ１細胞を刺激することができた。これらの結果は、ＣＤＣＡ１がＴｈ１細胞によって認識される抗原であること、およびペプチドが、いくつかのＨＬＡクラスＩＩ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２など）によってプロミスキャスに拘束されるＣＤＣＡ１のエピトープペプチドであることを明らかにする；したがって、そのようなペプチドは、ＣＴＬによる細胞傷害作用の標的抗原として有効であり得る。

上記で同定したペプチドは、ＣＤＣＡ１に特異的なＣＴＬを誘導する能力を有するＣＴＬエピトープのアミノ酸配列を付加的に含み、本明細書で明らかにするように、そのようなペプチドは、Ｔｈ１細胞に加えてＣＤＣＡ１に特異的なＣＴＬも誘導することができる。したがって、これらのペプチドは、ＣＤＣＡ１を発現するがんに対する免疫応答の誘導のための適切なペプチドであり得る。ＣＤＣＡ１遺伝子は、例えば乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）を含む大部分のがん組織で過剰発現されるので、免疫療法のための良好な標的である。
したがって、本発明は、ＣＤＣＡ１に特異的なＴｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチドを提供する。

本発明のペプチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、抗原提示細胞上に提示され得る。あるいは、本発明のペプチドの断片は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、抗原提示細胞上に提示され得る。ペプチドのこれらの断片は、抗原提示細胞内でのプロセシングによって生成され得る。好ましい態様では、本発明のペプチドまたはその断片は、２またはそれ以上の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ９とＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ４とＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ４とＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＲ１５とＨＬＡ−ＤＰ２、またはＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２）に結合する能力を有する。言い換えると、本発明のペプチドは、２またはそれ以上の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導する能力を有し得る。別の態様では、本発明のペプチドは、ＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬ誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む。ＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドの典型的な例には、配列番号：３または５のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。

ＭＨＣクラスＩＩ分子における結合溝は両端で開いているので、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドはその長さに柔軟性を有し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子についてのコア結合モチーフは９個のアミノ酸残基から成り、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは一般に、コア結合モチーフと隣接する他のアミノ酸残基を有する。隣接アミノ酸残基の数は限定されない。したがって、配列番号：１または２のすべてのアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するために必ずしも必要ではない。
したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチドであり得、そのようなペプチドは以下から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列からの９個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列；および
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列。

ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの長さは一般に１０〜３０アミノ酸である。配列番号：１および２のアミノ酸配列はＣＤＣＡ１のアミノ酸配列（配列番号：１０）の一部から成るので、本発明のペプチドは以下の［１］〜［５］に記載のペプチドであり得る：
［１］１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：１０のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列から選択される９を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列；および
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチド；
［２］前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、［１］に記載の単離されたペプチド；
［３］前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択される、［２］に記載の単離されたペプチド；
［４］前記ペプチドが、ＣＤＣＡ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド；ならびに
［５］前記ペプチドが、
（ａ）配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の単離されたペプチド。

本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞はＣＤＣＡ１に特異的である。それゆえ、いくつかの態様において、本発明は、配列番号：１０のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列から成る３０アミノ酸残基未満のペプチドであって、配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。

一般に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばＷａｎｇＰｅｔａｌ．２００８．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ．４（４）：ｅ１００００４８．１１：５６８；およびＷａｎｇＰｅｔａｌ．２０１０．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．に記載されているソフトウェアプログラムを使用して、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えばＮｉｅｌｓｅｎＭａｎｄＬｕｎｄＯ．２００９．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１０：２９６．；ＮｉｅｌｓｅｎＭｅｔａｌ．２００７．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．８：２３８．ＢｕｉＨＨ，ｅｔａｌ．２００５．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５７：３０４−３１４．ＳｔｕｒｎｉｏｌｏＴｅｔａｌ．１９９９．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（６）：５５５−５６１およびＮｉｅｌｓｅｎＭｅｔａｌ．２００８．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ．４（７）ｅ１０００１０７に記載されているように測定することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムを用いて同定されたＨＬＡ抗原と結合すると決定されたＣＤＣＡ１のペプチドを包含する。

上述したように、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドはその長さに柔軟性があるので、配列番号：１または２のアミノ酸配列は、生じるペプチドが必須のＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、場合により付加的なアミノ酸残基と隣接していてもよい。Ｔｈ１細胞誘導能を有するそのようなペプチドは、典型的には約３０アミノ酸未満、しばしば約２９アミノ酸未満、通常は約２８または２７アミノ酸未満である。配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列に隣接する特定のアミノ酸配列は、そのような隣接アミノ酸配列がもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を損なわない限り、限定されず、任意の種類のアミノ酸で構成され得る。典型的な態様では、そのような隣接アミノ酸配列は、配列番号：１または２のアミノ酸配列に隣接する配列番号：１０のアミノ酸配列の中から選択され得る；しかし、本発明はそれに限定されない。そこで、本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。

他方で、ＭＨＣクラスＩＩ分子についてのコア結合モチーフは９個のアミノ酸残基から成るので、配列番号：１または２のアミノ酸配列の全長がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するためおよびＴｈ１細胞の誘導のために必ずしも必要ではない。したがって、本発明のペプチドは、必須のＴｈ１細胞誘導能を保持することを条件として、配列番号：１または２の９個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸の形態をとることができる。Ｔｈ１細胞誘導能を有するペプチドは、典型的には約１０より多いアミノ酸、しばしば１１または１２より多いアミノ酸、通常は１３または１４より多いアミノ酸である。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能を有し、かつ配列番号：１または２のアミノ酸配列からの９、１０、１１、１２、１３または１４個より多い連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。

タンパク質中の１、２またはそれ以上のアミノ酸の改変はタンパク質の機能に影響を及ぼさず、一部の場合にはもとのタンパク質の所望の機能を増強することさえあることは一般に公知である。実際に、改変されたペプチド（すなわちもとの参照配列と比較して１、２または数個のアミノ酸残基が改変されている（すなわち置換、付加、欠失または挿入されている）アミノ酸配列から成るペプチド）が、もとのペプチドの生物学的活性を保持することは知られている（Ｍａｒｋｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９８４，８１：５６６２−６；ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９８２，１０：６４８７−５００；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９８２，７９：６４０９−１３）。したがって、１つの態様では、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列の両方を有し得、１、２またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されている。あるいは、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１または２のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列の両方を有し得る。

当業者は、単一アミノ酸または小さな割合のアミノ酸を改変するアミノ酸配列への個々の付加または置換は、もとのアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。そこで、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、タンパク質の改変は、もとのタンパク質と類似の機能を有する改変されたペプチドを生じさせる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の共通する官能基または特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）である。加えて、以下の８群は各々相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１９８４参照）。

そのような保存的改変ペプチドも本発明のペプチドとみなされる。しかし、本発明のペプチドはそれらに限定されず、改変されたペプチドがもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、非保存的改変も含み得る。さらに、改変されたペプチドは、ＣＤＣＡ１の多型変異体、種間相同体およびアリルのＴｈ１細胞誘導性ペプチドを除外すべきではない。

必須のＴｈ１細胞誘導能を保持するために、少数の（例えば１、２もしくは数個）または低い割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、欠失および／または置換する）ことができる。本明細書では、「数個」という用語は、５またはそれ以下のアミノ酸、例えば４または３またはそれ以下のアミノ酸を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ以下、より好ましくは１５％もしくはそれ以下、さらに一層好ましくは１０％もしくは８％もしくはそれ以下、または１〜５％である。

本発明の好ましいペプチド、すなわち配列番号：１および２（ＣＤＣＡ１５５−７８、３９−６４）のホモロジー解析は、これらのペプチドが他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意の相同性を有さないことを確認する。したがって、免疫療法に使用した場合、これらのペプチドが未知のまたは望ましくない免疫応答を生じる可能性は有意に低い。したがって、これらのペプチドは、がん患者においてＣＤＣＡ１に対する免疫を誘発するために極めて有用であると期待される。

免疫療法に関連して使用する場合、本発明のペプチドまたはその断片は、抗原提示細胞の表面に、好ましくはＨＬＡクラスＩＩ抗原との複合体として、提示されなければならない。それゆえ、Ｔｈ１細胞を誘導するだけでなく、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に高い結合親和性も有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、ペプチドをアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変し、改善された結合親和性を有する改変されたペプチドを生成することができる。

本発明はまた、上述したペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加を企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、Ｔｈ１細胞誘導能を保持するそのような改変ペプチドも本発明に含まれる。
例えば、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に結合し、Ｔｈ１細胞誘導能を有し、配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を含む、３１、３０、２９、２８、２７または２６未満のアミノ酸長の単離されたペプチドを提供する。
これらのペプチドはまた、ＡＰＣと接触するかまたはＡＰＣに導入された場合、ＡＰＣ中でプロセシングされて、プロセシングされた断片をその上に提示し得る。例えば、本発明のペプチドは、ＡＰＣの表面に提示される通常１１〜２６（典型的には１５〜２５）アミノ酸残基から成る断片にプロセシングされ得る。

しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫疾患および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの負の副作用を誘導し得る。それゆえ、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列とマッチする状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて最初にホモロジー検索を実施することが望ましいと考えられる。目的のペプチドと比較して同一のペプチドまたは１もしくは２個のアミノ酸相違を有するペプチドが自然界に存在しないことがホモロジー検索から明らかになった場合は、そのような副作用の危険性を伴わずにＨＬＡ抗原とのその結合親和性を高めるためならびに／またはそのＴｈ１細胞および／もしくはＣＴＬ誘導能を高めるために目的のペプチドを改変することができる。

上述したＨＬＡクラスＩＩ抗原に高い結合親和性を有するペプチドは極めて有効であると期待されるが、指標として高い結合親和性の存在に従って選択した候補ペプチドを、Ｔｈ１細胞誘導能の存在に関してさらに検討する。本明細書では、「Ｔｈ１細胞誘導能」という語句は、ＡＰＣと接触した場合、ＡＰＣ上でＴｈ１細胞を誘導する能力を付与するペプチドの能力を示す。さらに、「Ｔｈ１細胞誘導能」は、Ｔｈ１細胞の活性化および／またはＴｈ１細胞の増殖を誘導する、ＩＦＮ−γ産生を含むＴｈ１細胞媒介性サイトカイン産生を促進して他の細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を助けるおよび／または刺激する、ペプチドの能力を含む。

Ｔｈ１細胞誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を担持する抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ））、またはより詳細にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）と混合して、次にＣＤ４^＋Ｔ細胞によって産生され、放出されたＩＦＮ−γを測定することによって達成できる。あるいは、ペプチドのＴｈ１細胞誘導能は、Ｔｈ１細胞によるＣＴＬ活性化に基づいて評価することができる。例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を試験ペプチドで刺激したＤＣと共培養し、次にＣＴＬおよびＣＴＬの標的細胞と混合する。標的細胞は、^５１Ｃｒなどで放射性標識することができ、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインによって活性化されたＣＴＬの細胞傷害活性を、標的細胞から放出された放射能から算出することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞誘導能は、試験ペプチドで刺激した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下でＴｈ１細胞によって産生され、放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって評価できる。

上述した改変に加えて、本発明のペプチドはまた、生じる結合ペプチドがもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、他の物質に結合することもできる。適切な物質の例には、例えばペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成ポリマー等が含まれる。本発明のペプチドは、修飾がもとのペプチドの生物学的活性を損なわない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化等のような修飾を含み得る。これらの種類の修飾は、付加的な機能（例えば標的化機能および送達機能）を付与するまたはペプチドを安定化するために実施できる。

例えば、ペプチドのインビボでの安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体または非天然アミノ酸を導入することは当技術分野において公知である；この概念は本発明のペプチドにも適合させ得る。ペプチドの安定性は多くの方法で評価することができる。例えば、ペプチダーゼならびにヒト血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて安定性を試験することができる（例えばＶｅｒｈｏｅｆｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＤｒｕｇＭｅｔａｂＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎ１９８６，１１：２９１−３０２参照）。

本発明のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と組み合わせた複合体としてＡＰＣの表面に提示され、その後Ｔｈ１細胞を誘導し得る。それゆえ、ＡＰＣの表面でＨＬＡクラスＩＩ抗原と複合体を形成するペプチドも本発明に含まれる。本発明のペプチドを提示するＡＰＣをワクチンとして接種することができる。

上記複合体に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象の型とマッチしなければならない。例えば、日本人においては、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２が一般的であり、それゆえ日本人患者の治療に適する。典型的には、臨床において、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を前もって検査し、これにより特定のＨＬＡクラスＩＩ抗原への結合能力を有するペプチドの適切な選択が可能になる。好ましい態様では、本発明のペプチドはＴｈ１細胞をプロミスキャスに誘導することができる。本明細書では、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導することができる場合、このペプチドのＴｈ１細胞誘導能は「プロミスキャス」である。言い換えると、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される場合、そのような抗原認識は「プロミスキャス」とみなされる。ペプチドに関連して使用する場合、「少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される」という語句は、ペプチドまたはその断片が少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることを示す。例えば、ＣＤＣＡ１ペプチド（５５−７８；配列番号：１）およびＣＤＣＡ１ペプチド（３９−６４；配列番号：２）は、それぞれＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２、ならびにＨＬＡ−ＤＲ９およびＨＬＡ−ＤＲ１５によって認識される。それゆえ、これらのペプチドは「プロミスキャス」なエピトープの典型的な例である。

ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＡＤＰ２陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく使用される。他方で、ＨＬＡ−ＤＲ９またはＨＬＡ−ＤＲ１５陽性ＡＰＣを使用する場合は、好ましいペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドである。
したがって、好ましい態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＰ２を有すると同定された対象においてＴｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ９またはＨＬＡ−ＤＲ１５を有すると同定された対象においてＴｈ１細胞の誘導のために使用し得る。

ＩＩＩ．ＣＤＣＡ１ペプチドの調製
本発明のペプチドは周知の技術を用いて調製することができる。例えば、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、合成によって調製することができる。本発明のペプチドは、個別にまたは２もしくはそれ以上のペプチドから成るより長いポリペプチドとして合成することができる。本発明のペプチドを、次に、他の天然の宿主細胞タンパク質およびその断片、または他の何らかの化学物質を実質的に含まないようにするために、単離する、すなわち精製することができる。

本発明のペプチドは、修飾がもとの参照ペプチドの生物学的活性を損なわない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために使用できる、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。

本発明のペプチドは、選択したアミノ酸配列に基づく化学合成を通して得ることができる。この合成に適合させ得る従来のペプチド合成法の例には以下が含まれる：
（ｉ）ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６６；
（ｉｉ）ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）、丸善、１９７５；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）、丸善、１９８５；
（ｖ）「医薬品の開発」（日本語）、続第１４巻（ペプチド合成）、広川書店、１９９１；
（ｖｉ）国際公開第９９／６７２８８号；および
（ｖｉｉ）ＢａｒａｎｙＧ．＆ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＲ．Ｂ．，ＰｅｐｔｉｄｅｓＶｏｌ．２，「ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８０，１００−１１８。

あるいは、本発明のペプチドは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて得ることができる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎＪ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１９７７，１３２：３４９−５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｗｕｅｔａｌ）１９８３，１０１：３４７−６２）。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えばプロモーター配列に対応する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次に宿主細胞を培養して関心対象のペプチドを生産させる。本発明のペプチドはまた、インビトロ翻訳系を採用してインビトロで作製することもできる。

ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のＣＤＣＡ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５６９７（配列番号：９））に由来するポリヌクレオチド、ならびにその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書では、「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重に起因して、数多くの機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく前述した対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である、「サイレント変異」である。ペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識する。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の開示される配列において暗黙のうちに表現される。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体で構成され得る。当技術分野において周知のように、ＤＮＡはＡ、Ｔ、ＣおよびＧなどの塩基で適切に構成され、Ｔは、ＲＮＡではＵに置き換えられる。当業者は、非天然の塩基もポリヌクレオチドに含まれ得ることを認識する。

本発明のポリヌクレオチドは、その間に介在アミノ酸配列を含んでまたは含まずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在アミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば酵素認識配列）を提供することができる。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に加えて任意の付加的な配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであり得るか、またはマーカー遺伝子などを含む発現ベクター（プラスミド）であり得る。一般に、そのような組換えポリヌクレオチドは、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する従来の組換え技術を通したポリヌクレオチドの操作によって調製することができる。

組換えおよび化学合成の両方の技術が、本発明のポリヌクレオチドを作製するために使用できる。例えば、ポリヌクレオチドは適切なベクターへの挿入によって作製でき、これをコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現させ得る。あるいは、ＰＣＲ技術または適切な宿主における発現を用いてポリヌクレオチドを増幅することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９参照）。あるいは、ポリヌクレオチドは、ＢｅａｕｃａｇｅＳＬ＆ＩｙｅｒＲＰ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９２，４８：２２２３−３１１；Ｍａｔｔｈｅｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ１９８４，３：８０１−５に記載されているように、固相技術を用いて合成することができる。

Ｖ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）も提供する。本発明のペプチドと接触させることによって得られるＡＰＣは、治療および／または予防の対象である患者に由来することができ、それだけでまたは本発明のペプチド、Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを含む他の薬剤と組み合わせてワクチンとして投与することができる。

ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を含み、これらは、リンパ球によって認識されるためにタンパク質性抗原をその細胞表面に提示することが公知である。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＴｈ１細胞誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるので、ＤＣは本発明のＡＰＣとして有用である。

さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介されるＣＴＬ応答ならびにＴｈ１（クラスＩＩ）を誘導することもできる。一般に、ＭＨＣクラスＩ抗原によって認識されるエピトープの長さは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のもの（１５またはそれ以上のアミノ酸残基）より短い（例えば８〜１０アミノ酸残基）ことが周知である。それゆえ、本発明のペプチドのプロセシングされた産物はＣＴＬの誘導をもたらす。実際に、ＣＤＣＡ１ペプチド（５５−７８；配列番号：１）から誘導されるＣＴＬは、ＣＴＬ認識エピトープとして既に同定されている断片（ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ；配列番号：３）を認識する。同様に、ＣＤＣＡ１ペプチド（３９−６４；配列番号：２）も、そのアミノ酸配列内にＣＴＬ認識エピトープ配列ＶＹＧＩＲＬＥＨＦ（配列番号：５）を含む。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１を誘導するだけでなく、ＡＰＣ内でのプロセシング後にＣＴＬも誘導する。言い換えると、本発明のペプチドと接触したＡＰＣは、本発明のペプチドをプロセシングして、ＭＨＣクラスＩ抗原と共にそれらの断片を提示し、ならびにＭＨＣクラスＩＩ抗原と共にそれらの全体を提示する。その結果として、ＭＨＣクラスＩＩ抗原と共にＡＰＣに提示される本発明のペプチドを認識するＴｈ１、およびペプチドのプロセシングされた断片を介して誘導されるＣＴＬの両方が、本発明のペプチドを使用して誘導され得る。

例えば、ＡＰＣは、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボまたはインビボで本発明のペプチドと接触させる（刺激する）ことによって得られる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドまたはその断片を提示するＡＰＣが対象の体内で誘導される。本明細書では、「ＡＰＣを誘導する」という語句は、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体をＡＰＣの表面に提示させることを含む。あるいは、本発明のペプチドをＡＰＣに導入して、本発明のペプチドまたはその断片をＡＰＣに提示させた後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、
ａ：最初の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｃ：ペプチドをロードしたＡＰＣを２番目の対象に投与する段階
を含み得る。

最初の対象と２番目の対象は同じ個体であってもよく、または異なる個体でもよい。あるいは、本発明によれば、抗原提示細胞を誘導する医薬組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、前記方法は、本発明のペプチドを医薬的に許容される担体と混合するまたは製剤化するための段階を含む。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。段階（ｂ）によって得たＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。

本発明の１つの側面として、本発明のＡＰＣは高レベルのＴｈ１細胞誘導能を有する。本明細書では、「高レベルのＴｈ１細胞誘導能」という語句において、高レベルとは、ペプチドと接触していないＡＰＣ、またはＴｈ１細胞を誘導することができないペプチドと接触したＡＰＣによるＴｈ１細胞誘導能のレベルと比較したものである。本明細書では、ＡＰＣに関連して使用する場合、「Ｔｈ１細胞誘導能」という語句は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞と接触した場合にＴｈ１細胞を誘導するＡＰＣの能力を示す。高レベルのＴｈ１細胞誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに移入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子はＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、この分野で従来実施されている様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム法などが使用できる。より詳細には、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９６，５６：５６７２−７；ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９８，１６１：５６０７−１３；ＪＥｘｐＭｅｄ１９９６，１８４：４６５−７２；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように実施することができる。遺伝子をＡＰＣに移入することにより、遺伝子は細胞内で転写、翻訳などを受け、その後得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を通してペプチドの提示へと進む。あるいは、本発明のＡＰＣは、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階を誘導する方法によって調製することができる。

好ましい態様では、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２の群から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：１から選択されるアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様では、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ９およびＨＬＡ−ＤＲ１５の群から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：２から選択されるアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２は、それぞれＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０２およびＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２：０１であり得る。

ＶＩ．Ｔヘルパー１型細胞（Ｔｈ１細胞）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されるＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞を標的とするＣＴＬを含むエフェクター細胞のいずれかの免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法で、ワクチンとして役立つ。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導されるまたは活性化される単離されたＴｈ１細胞も提供する。

そのようなＴｈ１細胞は、（１）１つまたは複数の本発明のペプチドを対象に投与し、対象からＴｈ１細胞を回収すること、（２）ＡＰＣおよびＣＤ４^＋Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、その後Ｔｈ１細胞を単離すること、（３）ＣＤ４^＋Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のＡＰＣと接触させること、または（４）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドもしくはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４^＋Ｔ細胞に導入することによって得られ、ここで、ＴＣＲはＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体に結合することができる。（３）の方法のためのそのようなＡＰＣは上述した方法によって調製することができる。（４）の方法の詳細は、以下の「ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で述べる。

本発明のＡＰＣでの刺激によって誘導されたＴｈ１細胞は、治療および／または予防の対象である患者に由来してもよく、作用を調節するために単独でまたは本発明のペプチドを含む他の薬剤と組み合わせて投与することができる。得られたＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を活性化するおよび／または刺激することができる。本発明のＴｈ１細胞によって活性化され得るそのような免疫細胞には、がん細胞などの標的細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬが含まれる。例えば、そのようなＣＴＬの標的細胞は、内因性にＣＤＣＡ１を発現する細胞（例えばがん細胞）、またはＣＤＣＡ１遺伝子をトランスフェクトされた細胞であり得る。好ましい態様では、本発明のペプチドは、ＣＴＬエピトープペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことができ、Ｔｈ１細胞に加えて、がん細胞などのＣＤＣＡ１発現細胞に対するＣＴＬも誘導することができる。この場合、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬをインビボで同時にまたは連続的に誘導することができ、誘導されたＴｈ１細胞は、誘導されたＣＴＬを有効に活性化することができる。したがって、ＣＴＬエピトープペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むそのようなペプチドは、がん免疫療法のための適切なペプチドである。

さらに、本発明のＴｈ１細胞は、他の標的細胞に対する何らかのＣＴＬを抗原非依存的に活性化するおよび／または刺激する様々なサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を分泌する。したがって、本発明のＴｈ１細胞は、ＣＤＣＡ１以外の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する細胞を標的とするＣＴＬ活性を増強することにも寄与し得る。したがって、本発明のＴｈ１細胞は、本発明のペプチドおよびＡＰＣと同様に、ＣＤＣＡ１を発現する腫瘍だけでなく、他のＴＡＡを発現する腫瘍のための免疫療法にも有用である。

いくつかの態様において、本発明のＴｈ１細胞は、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰ抗原と本発明のペプチドの複合体を提示する細胞を認識するＴｈ１細胞である。Ｔｈ１細胞に関連して、「細胞を認識する」という語句は、そのＴＣＲを介した細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体の結合および抗原特異的に活性化されることを指す。本明細書では、「抗原特異的に活性化される」という語句は、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドに応答して活性化されることを指し、活性化されたＴｈ１細胞からのサイトカイン産生が誘導される。好ましい態様では、ＨＬＡ−ＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９およびＨＬＡ−ＤＲ１５から成る群より選択され得る。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９およびＨＬＡ−ＤＲ１５は、それぞれＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０９：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５：０２であり得る。他方で、ＨＬＡ−ＤＰ２はＨＬＡ−ＤＰ抗原の好ましい例である。より好ましくは、ＨＬＡ−ＤＰ２はＨＬＡ−ＤＰＢ１^＊０２：０１であり得る。

ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）
本発明のペプチドの断片のいずれかに対して誘導される細胞傷害性Ｔ細胞は、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法でワクチンとして使用することができる。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。

そのような細胞傷害性Ｔ細胞は、（１）１つまたは複数の本発明のペプチドを対象に投与し、対象から細胞傷害性Ｔ細胞を回収すること、または（２）対象由来のＡＰＣおよびＣＤ８陽性細胞または末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、その後細胞傷害性Ｔ細胞を単離することによって得られ得る。

本発明のペプチドを提示するＡＰＣでの刺激によって誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、治療および／または予防の対象である患者に由来してもよく、作用を調節するために単独でまたは本発明のペプチドを含む他の薬剤と組み合わせて投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、例えば誘導のために使用した同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、内因性にＣＤＣＡ１を発現する細胞、またはＣＤＣＡ１遺伝子をトランスフェクトされた細胞であり得る；そしてペプチドによる刺激によって細胞表面に本発明のペプチドを提示する細胞は、活性化ＣＴＬの攻撃の標的としても役立ち得る。

いくつかの態様において、本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４抗原と本発明のペプチドの複合体を提示する細胞を認識するＣＴＬである。ＣＴＬとの関連において、「細胞を認識する」という語句は、そのＴＣＲを介して細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４抗原と本発明のペプチドの複合体に結合することおよび細胞に対して特異的細胞傷害活性を示すことを指す。本明細書では、「特異的細胞傷害活性」は、ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４抗原と本発明のペプチドの複合体を提示する細胞に対して細胞傷害活性を示すが、他の細胞には細胞傷害活性を示さないことを指す。例えば、配列番号：１および２は、ＨＬＡ−Ａ２認識エピトープのアミノ酸配列を含む。したがって、配列番号：１または２を含むペプチドから、ＨＬＡ−Ａ２のための好ましい断片が生成される。

ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができる１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する組成物、およびこれを使用する方法を提供する。そのようなＴＣＲサブユニットは、ＣＤＣＡ１ペプチドを提示するＡＰＣに対する特異性をＣＤ４^＋Ｔ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野において公知の方法を用いることにより、本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞のＴＣＲサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（国際公開第２００７／０３２２５５号およびＭｏｒｇａｎｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１７１，３２８８（２００３））。誘導体ＴＣＲは、ＣＤＣＡ１ペプチドを提示するＡＰＣに高い結合力で結合することができ、場合により効率的なサイトカイン産生を媒介することができる。

ＴＣＲサブユニットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（すなわちＴＣＲサブユニットの両方をコードする単一ポリヌクレオチドまたは各々別々のＴＣＲサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチド）を適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは当技術分野において周知である。ポリヌクレオチドまたはそれらを含むベクターは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、例えば患者由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞に有用に移入することができる。好都合には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の速やかな改変を可能にし、優れたがん細胞死滅特性を有する改変されたＴ細胞を迅速かつ容易に生産する、すぐに入手可能な組成物を提供する。

本発明はさらに、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドでの形質導入によって調製されるＴｈ１細胞を提供し、ここで、ＴＣＲサブユニットはＣＤＣＡ１ペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５もしくはＨＬＡ−ＤＰ２に関しては配列番号：１、およびまたはＨＬＡ−ＤＲ９もしくはＨＬＡ−ＤＲ１５に関しては配列番号：２）に結合することができる。形質導入されたＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、インビトロで周知の培養方法によって増殖させることができる（例えばＫａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４５２−３４６１（１９８９））。上述したように調製したＴｈ１細胞は、治療または保護を必要とする患者においてがんを治療するまたは予防する上で有用な免疫原性組成物を形成するために使用できる。

ＩＸ．薬剤または医薬組成物
本発明の方法および組成物ががんの「治療」に関連して有用性を有する限り、治療が臨床上の利益、例えばＣＤＡＣ１遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率または転移能の低減を導く場合、治療は「有効」とみなされる。治療が予防的に適用される場合、「有効」は、がんの形成を遅延させるもしくは予防するまたはがんの臨床症状を予防するもしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断するまたは治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
本発明の方法および組成物ががんの「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）に関連して有用性を有する限り、そのような用語は、本明細書では、疾患による死亡率または罹患率の負荷を低減させる任意の行為を指すために互換的に使用される。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「一次、二次および三次予防レベルで」行われ得る。一次予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避し、一方二次および三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、ならびに機能を回復させ、疾患に関連する合併症を減少させることによって既存の疾患の負の影響を低減することを目指す行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減すること、血管新生を減少させることを目指す広範囲の予防的治療を含む。

本発明に関連して、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の防止は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の成長の阻害、腫瘍の退縮または後退、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退行、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの有効な治療および／または予防は、がんを有する個体の死亡率を低下させ、予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、がんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、有効な治療および／または予防を構成する症状の低減または改善は、１０％、２０％、３０％もしくはそれ以上の低減または安定な疾患を含む。

上述したように、本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する免疫細胞を助けることができる。Ｔｈ１細胞によって分泌されるサイトカインは抗原非依存的にＣＴＬに影響を及ぼし得るので、そのような免疫細胞には、ＣＤＣＡ１を発現するがん細胞に対するＣＴＬだけでなく、他のＴＡＡを発現するがん細胞に対するＣＴＬも含まれる。したがって、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを含有する薬剤または医薬組成物を提供する。薬剤または医薬組成物において、そのようなペプチドは治療的または医薬的に有効な量で存在する。

本発明の薬剤または組成物によって誘導されるＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞に影響を及ぼすサイトカインを分泌することができるので、本発明の薬剤または医薬組成物は、細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を助ける、刺激するおよび／または増強するために有用である。それゆえ、本発明の薬剤または組成物は、ＣＴＬを含むそのような免疫細胞によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するあらゆる目的に有用である。例えば、本発明の薬剤または組成物は、そのような免疫細胞によって媒介されるがんまたは腫瘍に対する免疫応答を増強するまたは促進することができるので、本発明は、がんの治療および／または予防における使用のための、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物を提供する。そのような薬剤または組成物中のペプチドの量は、ＣＤＣＡ１を発現するがんを担持する対象において免疫応答を有意に増強するまたは刺激するのに有効な量であり得る。

さらに、図６に示すように、本発明の過程で同定されたＣＤＣＡ１由来ペプチドは、ＣＴＬエピトープ単独での刺激と比較してＣＴＬ誘導を増強することが確認されている。それゆえ、本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４などのＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物も提供する。別の態様では、本発明はさらに、ＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。

好ましい態様において、本発明の過程で同定されたＣＤＣＡ１由来ペプチドは、Ｔｈ１細胞ならびにＣＤＣＡ１発現細胞に対するＣＴＬを含み得る。したがって、本発明はまた、ＣＤＣＡ１を発現するがんまたは腫瘍に対するＣＴＬの誘導における使用のための、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物も提供する。
さらに、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するのに使用することができる。

ＣＤＣＡ１の発現は、正常組織と比較して、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含むいくつかのがん型において特異的に上昇するので（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６Ｎｏｖ１；６６（２１）：１０３３９−４８、国際公開第２００５／０２８６７６号、国際公開第２００５／０８９７３５号、国際公開第２００６／０８５６８４号、国際公開第２００７／０１３６６５号、国際公開第２００７／０１３６７１号）、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の防止のために使用することができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドの１つまたは複数または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の防止のための薬剤または医薬組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドを、薬剤または医薬組成物としての使用のために、ＡＰＣなどの前記細胞のいずれかの表面で発現させることができる。加えて、前記Ｔｈ１細胞も、本発明の薬剤または医薬組成物の有効成分として使用することができる。

別の態様では、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤の製造における、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分の使用を提供する。

あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するのに使用するための、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分を提供する。

あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、有効成分として、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分と医薬的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。

別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分を医薬的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程も提供する。

あるいは、本発明の医薬組成物または薬剤は、がんまたは腫瘍の予防およびその術後再発の防止のいずれかまたは両方のために使用し得る。

本発明の薬剤または医薬組成物はワクチンとして使用される。本発明に関連して、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物に接種した場合抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する組成物を指す。

本発明の薬剤または医薬組成物は、対象または患者においてがんもしくは腫瘍を治療するおよび／もしくは予防する、ならびに／またはその術後再発もしくは転移性再発を防止するために使用できる。そのような対象の例には、ヒトならびに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒおよびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物が含まれる。

本発明の過程で、配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、いくつかのＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＨＬＡ−ＤＰ分子（すなわちＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２）によって拘束されるプロミスキャスなＴｈ１細胞エピトープであることが見出され、これらは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答に起因する、がんに対する強力で特異的な免疫応答を誘導することができる候補であり得る。それゆえ、配列番号：１または２のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬剤または医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２の中から選択される少なくとも１つを有する対象への投与に特に適する。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤または医薬組成物にも当てはまる。

あるいは、好ましい態様では、本発明の過程で同定されたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４を有する対象に適用された場合、ＣＤＣＡ１に特異的なＣＴＬを誘導することもできる。したがって、本発明のペプチドの投与を通して、Ｔｈ１細胞の誘導に加えてＣＤＣＡ１を発現するがんに対するＣＴＬ応答が誘導され得ることがさらに期待される。さらに、本発明のペプチドは、ＣＤＣＡ１発現細胞に対するＣＴＬ応答を、そのプロセシングを介して誘導することができるだけでなく、それによって媒介されるＴｈ１細胞誘導により、ＣＴＬ応答を増強することもできる。したがって、同じ対象においてＴｈ１細胞およびＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２の中から選択される少なくとも１つ、ならびにＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４を有する。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ９および／またはＨＬＡ−ＤＲ１５を、ならびにＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２４を有する対象に配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを投与することにより、Ｔｈ１細胞およびＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬの両方の誘導が対象において達成され得る。

別の態様では、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導に依存するがん免疫療法を提供する。本発明によって提供される治療戦略は、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインによって活性化される免疫細胞が目的のがん細胞を標的とする限り、ＣＤＣＡ１発現とは無関係に任意のがんに適用でき、有効である。
本発明の薬剤または医薬組成物によって治療されるべきがんまたは腫瘍には、限定されないが、そのようながんの好ましい例には、例えば乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）を含む、ＣＤＣＡ１を発現する任意の種類のがんまたは腫瘍が含まれる。

本発明の薬剤または医薬組成物は、前記有効成分に加えて、Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、前記他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、前記他のペプチドまたはその断片を提示する他の細胞等を含有し得る。Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有するそのような「他の」ペプチドの例には、がん特異抗原（例えば同定されたＴＡＡ）に由来するペプチドが含まれるが、これに限定されない。

必要に応じて、本発明の薬剤または医薬組成物は、有効成分、例えば本発明のペプチドのいずれかの抗腫瘍作用を他の治療物質が阻害しない限り、場合により他の治療物質を付加的な有効成分として含んでもよい。例えば、製剤は、抗炎症薬、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を１つまたは複数の他の薬理的剤と連続的にまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理的剤の量は、例えば、使用される薬理的剤の種類、治療される疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。

当業者は、本明細書で特に言及する成分に加えて、本発明の薬剤または医薬組成物が、対象となる製剤の種類を考慮して当技術分野において慣例的な他の剤（例えば増量剤、結合剤、希釈剤、賦形剤等）も含み得ることを認識する。

本発明の１つの態様では、本発明の薬剤または医薬組成物を、治療する疾患、例えばがんの病的状態を治療するために有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。前記製品は、ラベルを付した本発明の薬剤または医薬組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルは、剤が疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防に使用されることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。

上述した容器に加えて、本発明の薬剤または医薬組成物を含むキットは、場合により医薬的に許容される希釈剤を収容する第二の容器をさらに含んでもよい。第二の容器は、使用のための指示書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

薬剤または医薬組成物は、所望する場合は、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置中に包装することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための指示書が添付され得る。

（１）ペプチドを有効成分として含有する薬剤または医薬組成物：
本発明のペプチドは、薬剤もしくは医薬組成物として直接投与することができるか、または必要な場合は、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬剤に通常使用される担体、賦形剤などが、特に制限されることなく適宜含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬剤または医薬組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有し得る。本発明の薬剤または医薬組成物は抗がん目的に用いることができる。

本発明のペプチドは、インビボでＴｈ１細胞を誘導する本発明のペプチドの２つまたはそれ以上で構成される、組合せとして調製することができる。ペプチドの組合せはカクテルの形態をとってもよく、または標準的な技術を用いて互いに複合化し得る。例えば、ペプチドを化学的に連結するかまたは単一融合ポリペプチド配列として発現させることができる。組合せ中のペプチドは、同じであってもよくまたは異なっていてもよい。

本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドまたはその断片がＡＰＣ上のＨＬＡクラスＩＩ抗原によって高密度で提示され、次に提示されたペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原との間で形成された複合体に対して特異的に反応するＴｈ１細胞が誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えばＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドによって刺激して、本発明のペプチドまたはその断片のいずれかを自らの表面に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再投与して、対象においてＴｈ１細胞を誘導することができ、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。

本発明のペプチドを有効成分として含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬剤または医薬組成物は、細胞性免疫を有効に樹立することが公知のアジュバントも含み得る。あるいは、薬剤または医薬組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒に製剤化することによって投与できる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続的に）投与した場合、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書で企図されるアジュバントには、文献（ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ１９９４，７：２７７−８９）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、水中油型エマルション等が含まれるが、これらに限定されない。

さらに、リポソーム製剤、ペプチドが直径数マイクロメートルのビーズに結合している顆粒製剤、および脂質がペプチドに結合している製剤を好都合に使用し得る。
本発明の別の態様では、本発明のペプチドはまた、医薬的に許容される塩の形態で投与し得る。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸（例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸等）との塩、および無機酸（例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩が含まれる。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される塩」という語句は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、無機酸または無機塩基、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等との反応によって得られる塩を指す。

いくつかの態様において、本発明の薬剤または医薬組成物は、Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングする成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＴｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングすることができる剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリシン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合し、次に本発明のペプチドに連結することができる。その後、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子中で直接投与する、リポソーム中に組み込む、またはアジュバント中に乳化することができる。Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質が、適切なペプチドに共有結合した場合、Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングするために使用できる（例えばＤｅｒｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８９，３４２：５６１−４参照）。

適切な投与方法の例には、経口、皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹腔内および静脈内注射など、ならびに全身投与または標的部位の近傍への局所投与（すなわち直接注入）が含まれるが、これらに限定されない。投与は、単回投与によって実施でき、または反復投与によって強化することもできる。医薬的または治療的に有効な量のペプチドを、ＣＤＣＡ１を発現するがんの治療を必要とする対象に投与することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞によって媒介される免疫応答を増強もしくは刺激する、および／またはＣＤＣＡ１を発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するのに十分な量の本発明のペプチドを、ＣＤＣＡ１を発現するがんを担持する対象に投与することができる。
本発明のペプチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日から数ヶ月に１回投与することができる。当業者は、適切で最適な用量を容易に決定することができる。

（２）ポリヌクレオチドを有効成分として含有する薬剤または医薬組成物：
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、本明細書で開示するペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で含有し得る。本明細書では、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様では、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定な組み込みを達成するのに必要なものを備え得る（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばＴｈｏｍａｓＫＲ＆ＣａｐｅｃｃｈｉＭＲ，Ｃｅｌｌ１９８７，５１：５０３−１２参照）。例えば、Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９０，２４７：１４６５−８；米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；および国際公開第９８／０４７２０号参照。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号参照）。

本発明のペプチドは、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによっても発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入後、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を惹起する。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９１，３５１：４５６−６０に記載されている。治療的投与または免疫のために有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えばＳｈａｔａｅｔａｌ．，ＭｏｌＭｅｄＴｏｄａｙ２０００，６：６６−７１；Ｓｈｅｄｌｏｃｋｅｔａｌ．，ＪＬｅｕｋｏｃＢｉｏｌ２０００，６８：７９３−８０６；Ｈｉｐｐｅｔａｌ．，ＩｎＶｉｖｏ２０００，１４：５７１−８５参照。

対象へのポリヌクレオチドの送達は、直接的であってもよく、この場合対象はポリヌクレオチドを担持するベクターに直接暴露され、または間接的であってもよく、この場合は最初にインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次に細胞を対象に移植する。これら２つのアプローチは、それぞれインビボおよびエクスビボ遺伝子治療として公知である。

遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ１９９３，１２：４８８−５０５；ＷｕａｎｄＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ１９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，ＡｎｎＲｅｖＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ１９９３，３３：５７３−９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９３，２６０：９２６−３２；Ｍｏｒｇａｎ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＡｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ１９９３，６２：１９１−２１７；ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９３，１１（５）：１５５−２１５参照）。本発明にも使用できる、組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９３；およびＫｒｉｅｇｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０に記載されている。

ペプチドの投与と同様に、ポリヌクレオチドの投与は、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内および／または腹腔内注射などによって実施してよく、全身投与もしくは標的部位の近傍への局所投与も使用される。投与は、単回投与によって実施でき、または複数回投与によって強化することもできる。医薬的または治療的に有効な量のポリヌクレオチドを、ＣＤＣＡ１を発現するがんの治療を必要とする対象に投与することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞によって媒介される免疫応答を増強もしくは刺激する、および／またはＣＤＣＡ１を発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するのに十分な量の本発明のポリヌクレオチドを、ＣＤＣＡ１を発現するがんを担持する対象に投与することができる。適切な担体または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日ごとに１回から数ヶ月ごとに１回投与することができる。当業者は、適切で最適な投与量を容易に決定することができる。

Ｘ．ペプチド、ＡＰＣまたはＴｈ１細胞を使用する方法
本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＡＰＣおよびＴｈ１細胞を誘導するために使用できる。本発明のＡＰＣはまた、本発明のＴｈ１細胞を誘導するためにも使用できる。ペプチド、ポリヌクレオチドおよびＡＰＣは、任意の他の化合物がこれらのＴｈ１細胞誘導能を阻害しない限り、任意の他の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の前記薬剤または医薬組成物のいずれかを、Ｔｈ１細胞を誘導するために使用でき、それに加えて、ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものも、以下で論じるようにＡＰＣを誘導するために使用できる。

（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章で上述したように実施することができる。本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法も提供し、前記ＡＰＣの誘導は、「ＶＩ．抗原提示細胞」、前出の項目でも言及されている。
あるいは、本発明は、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法であって、以下の段階：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
の１つを含み得る方法を提供する。
あるいは、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法を提供する。

本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法はインビトロまたはエクスビボで実施できる。好ましい態様では、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣの誘導のために使用するＡＰＣは、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２の中から選択される少なくとも１つを発現するＡＰＣであり得る。そのようなＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２の中から選択される少なくとも１つを有する対象から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。本発明の方法によって誘導されるＡＰＣは、本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原（例えばＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明の方法によって誘導されたＡＰＣを対象に投与する場合、対象は、好ましくはＡＰＣが由来するのと同じ対象である。しかし、対象がＡＰＣドナーと同じＨＬＡ型を有する限り、対象はＡＰＣドナーとは異なる対象であってもよい。

別の態様では、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するのに使用するための剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の１つまたは複数のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本発明は、ＡＰＣを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。

あるいは、本発明はさらに、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するのに使用するための本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリペプチドを提供する。
好ましい態様では、本発明のペプチドは、Ｔｈ１応答を誘導するだけでなく、それらをプロセシングした後にＣＴＬ応答も誘導する。したがって、好ましい態様では、本発明の方法によって調製されるＡＰＣは、がん細胞を含む、ＣＤＣＡ１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するためにも有用であり得る。例えば、配列番号：３のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣがＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬを誘導するのに適する。あるいは、配列番号：５のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＡＰＣがＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬを誘導するのに適する。

（２）Ｔｈ１細胞を誘導する方法：
さらに、本発明は、本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドもしくはその断片を提示するＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を誘導するための方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してＴｈ１細胞を誘導するための方法も提供する。好ましくは、Ｔｈ１細胞を誘導するための方法は、
ａ：ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞と接触させる段階、および
ｂ：ＴＣＲが本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を認識するまたは複合体に結合することができる、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階
から成る群より選択される少なくとも１つの段階を含む。

本発明のペプチドを対象に投与した場合、対象の体内でＴｈ１細胞が誘導され、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答（例えばがん細胞を標的とする免疫応答）が増強される。あるいは、本発明のペプチドおよび本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをエクスビボ治療法に使用することができ、この治療法では、対象由来のＡＰＣおよびＣＤ４陽性細胞、または末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（本発明のペプチドで刺激し）、Ｔｈ１細胞を誘導した後、活性化したＴｈ１細胞を対象に戻す。例えば、前記方法は、
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ４^＋Ｔ細胞と混合し、Ｔｈ１細胞を誘導するために共培養する段階；および
ｄ：段階ｃの共培養物からＣＤ４^＋Ｔ細胞を回収する段階
を含み得る。
さらに、Ｔｈ１細胞は、ＴＣＲが本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体に結合することができる、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することによって誘導できる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で上述したように実施することができる。

本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法はインビトロまたはエクスビボで実施できる。Ｔｈ１細胞の誘導のために使用するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、対象から得たＰＢＭＣから当技術分野において周知の方法によって調製することができる。好ましい態様では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のドナーは、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２の中から選択される少なくとも１つを有する対象であり得る。本発明の方法によって誘導されるＴｈ１細胞は、本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣを認識することができるＴｈ１細胞であり得る。対象においてがんに対する免疫応答（またはＭＨＣクラスＩ分子によって媒介される免疫応答）を誘導するために、本発明の方法によって誘導されたＴｈ１細胞を対象に投与する場合、対象は、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞が由来するのと同じ対象である。しかし、対象がＣＤ４陽性Ｔ細胞ドナーと同じＨＬＡ型を有する限り、対象はＣＤ４陽性Ｔ細胞ドナーとは異なる対象であってもよい。

好ましい態様では、本発明のペプチドは、ＣＤＣＡ１発現細胞に対するＣＴＬならびにＴｈ１細胞を誘導することができる。それゆえ、本発明はさらに、ＣＴＬを誘導するための方法であって、
ａ：ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、本発明のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
ｂ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を本発明のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
から成る群より選択される少なくとも１つの段階を含む方法を提供する。
ＣＴＬを誘導するそのような方法では、本発明のペプチドはＡＰＣ内でプロセシングされてＣＴＬエピトープペプチドを生成し、生成されたＣＴＬエピトープペプチドはＡＰＣの表面に提示される。

あるいは、本発明によれば、Ｔｈ１細胞を誘導する薬剤または医薬組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、Ｔｈ１細胞を誘導する薬剤または医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、方法は、本発明のペプチドを医薬的に許容される担体と混合するまたは製剤化するための段階を含む。さらに、本発明はまた、Ｔｈ１細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。

本発明の方法によって誘導されるＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ワクチンとして対象に投与することができる。

本発明に関連して、ＣＤＣＡ１を過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含有するワクチンまたは医薬組成物の投与の前に、治療されるがん細胞または組織におけるＣＤＣＡ１の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増大しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、１つの態様では、本発明は、ＣＤＣＡ１を（過剰）発現するがんを治療するための方法であって、
ｉ）治療されるべきがんを有する対象から得たがん細胞または組織におけるＣＤＣＡ１の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＣＤＣＡ１の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記（ａ）〜（ｄ）から成る群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＣＤＣＡ１を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階
を含み得る方法を提供する。

あるいは、本発明は、ＣＤＣＡ１を過剰発現するがんを有する対象に投与するのに使用するための、上記（ａ）〜（ｄ）から成る群より選択される少なくとも１つの成分を含有するワクチンまたは医薬組成物を提供し得る。言い換えると、本発明はさらに、本発明のＣＤＣＡ１ポリペプチドで治療されるべき対象を同定するための方法であって、対象由来のがん細胞または組織におけるＣＤＣＡ１の発現レベルを測定する段階を含み、遺伝子の正常対照レベルと比較したレベル上昇が、対象が本発明のＣＤＣＡ１ポリペプチドで治療し得るがんを有することを示す方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を以下でより詳細に説明する。
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドを投与する前に対象のＨＬＡ型を同定し得る。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＰ２を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ９またはＨＬＡ−ＤＲ１５を有すると同定された対象に投与する。

目的のＣＤＣＡ１の転写または翻訳産物を含む限り、任意の対象由来の細胞または組織をＣＤＣＡ１発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、血液、唾液および尿などの体組織および体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞またはがん性であることが疑われる組織由来の上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要な場合は、得られた体組織および体液から細胞を精製し、その後対象由来試料として使用してもよい。
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。

本発明によれば、対象から得たがん細胞または組織におけるＣＤＣＡ１の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＣＤＣＡ１のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によりプローブを用いて定量化し得る。検出はチップまたはアレイ上で実施し得る。ＣＤＣＡ１の発現レベルを検出するにはアレイの使用が好ましい。当業者は、ＣＤＣＡ１の配列情報を利用してそのようなプローブを調製することができる。例えば、ＣＤＣＡ１のｃＤＮＡをプローブとして使用し得る。必要な場合は、プローブを色素、蛍光物質および同位体などの適切な標識で標識化してもよく、遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出し得る。

さらに、ＣＤＣＡ１の転写産物（例えば配列番号：９）は、増幅に基づく検出方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを使用して定量化し得る。そのようなプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づいて調製し得る。
詳細には、本発明の方法に使用するプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中等度にストリンジェントな条件下または低ストリンジェントな条件下でＣＤＣＡ１のｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で認められる。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、および温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成し得る。

あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＣＤＣＡ１タンパク質（配列番号：１０）の量を測定し得る。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用する免疫測定法が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の断片または改変抗体がＣＤＣＡ１タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変型（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆｖ等）を検出に使用し得る。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、本発明ではそのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を使用し得る。
翻訳産物に基づきＣＤＣＡ１遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＣＤＣＡ１タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学分析を介して染色の強度を測定し得る。すなわち、この測定では、強い染色は、タンパク質の存在／レベルの増大、および同時に、ＣＤＣＡ１遺伝子の高い発現レベルを指す。
がん細胞における標的遺伝子、例えばＣＤＣＡ１遺伝子の発現レベルは、標的遺伝子の対照レベル（例えば正常細胞におけるレベル）から、例えば１０％、２５％もしくは５０％増大している場合、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超もしくはそれ以上に増大している場合、増大していると決定され得る。

対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象から以前に採取され、保存されていた試料を使用することによって、がん細胞と同時に測定し得る。加えて、治療されるべきがんを有する器官の非がん性領域から得た正常細胞を正常対照として使用してもよい。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において以前に測定されたＣＤＣＡ１遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験した細胞からの発現パターンのデータベースから導き出すことができる。さらに、本発明の１つの局面によれば、生物学的試料におけるＣＤＣＡ１遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較し得る。対象由来の生物学的試料のものと類似の組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＣＤＣＡ１遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は当技術分野において公知の任意の方法によって入手し得る。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用し得る。

本発明に関連して、非がん性であることが既知の生物学的試料から決定した対照レベルを「正常対照レベル」と称する。他方で、対照レベルをがん性生物学的試料から決定した場合は、それを「がん性対照レベル」と称する。試料の発現レベルと対照レベルの差は、発現レベルが細胞のがん性または非がん性状態に依存して異ならないことが公知の対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して基準化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。

ＣＤＣＡ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似／同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断され得る。
より詳細には、本発明は、（ｉ）対象が治療されるべきがんを有するか否かを診断する、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法であって、
ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるＣＤＣＡ１の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＣＤＣＡ１の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＤＣＡ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して増大している場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む方法を提供する。

あるいは、そのような方法は、
ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるＣＤＣＡ１の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＣＤＣＡ１の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＣＤＣＡ１の発現レベルががん性対照レベルと類似または同等である場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む。

いくつかの態様において、そのような方法は、上記で定義した段階ａ）〜ｄ）の後または前に、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択されるＨＬＡを有する対象を同定する段階をさらに含み得る。本発明によるがん療法は、ＣＤＣＡ１を過剰発現するがんに罹患しており、ならびにＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２のいずれか１つを有する対象にとって好ましい。ＨＬＡタイピングの方法は当技術分野において周知である。例えば、ＨＬＡアリルをタイピングするためのＰＣＲに基づく方法は周知である。各々のＨＬＡ分子に特異的な抗体も、対象のＨＬＡ型を同定するための適切なツールである。

本発明はまた、本発明のＣＤＣＡ１ポリペプチドで治療することができるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供し、そのようなキットは、特定のがん療法、より詳細には、がん免疫療法の効果を評価するおよび／またはモニタリングするのにも有用であり得る。適切ながんの説明例には、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）が含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは、好ましくは対象由来のがん細胞におけるＣＤＣＡ１遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、そのような試薬は、
（ａ）ＣＤＣＡ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＣＤＣＡ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＣＤＣＡ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
の群より選択される。

ＣＤＣＡ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＣＤＣＡ１ｍＲＮＡに特異的に結合するまたはＣＤＣＡ１ｍＲＮＡを同定する核酸、例えばＣＤＣＡ１ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＣＤＣＡ１ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製し得る。必要な場合は、ＣＤＣＡ１ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化し得る。さらに、ＣＤＣＡ１ｍＲＮＡを検出するための複数の試薬をキットに含めてもよい。

他方で、ＣＤＣＡ１タンパク質を検出するのに適した試薬の例には、ＣＤＣＡ１タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の断片または改変された抗体がＣＤＣＡ１タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変型（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆｖ等）を試薬として使用し得る。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、本発明ではそのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を使用し得る。さらに、直接結合または間接標識技術により、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに抗体を標識し、その標的への抗体の結合を検出するための方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用し得る。さらに、ＣＤＣＡ１タンパク質を検出するための複数の試薬をキットに含めてもよい。

キットは、前記試薬の複数を含んでもよい。例えば、がんを有さないまたはがんに罹患している対象から得た組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、使用のための指示書と共に、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび添付文書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。これらの試薬などは、ラベルを付した容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。

本発明の１つの態様として、試薬がＣＤＣＡ１ｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位を形成するために試薬を多孔性ストリップなどの固体マトリックス上に固定化し得る。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、各々が核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照のための部位を含んでもよい。あるいは、対照部位は、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置し得る。場合により、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含んでもよく、すなわち、第一検出部位ではより高い量を含み、それに続く部位ではより少ない量を含んでもよい。試験試料の添加後、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するＣＤＣＡ１ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、任意の適切な検出可能形状に構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。

本発明のキットは、陽性対照試料またはＣＤＣＡ１標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＣＤＣＡ１陽性試料を採取し、次にそのＣＤＣＡ１レベルを検定することによって調製し得る。あるいは、精製されたＣＤＣＡ１タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＣＤＣＡ１を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＣＤＣＡ１標準試料を形成してもよい。本発明では、精製ＣＤＣＡ１は組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のＣＤＣＡ１レベルは、例えばカットオフ値を上回る。

ＸＩ．抗体：
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後判定アッセイならびに画像化法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＣＤＣＡ１ががん患者において発現されるまたは過剰発現される限り、他のがんの治療、診断および／または予後判定において使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば一本鎖抗体）は、ＣＤＣＡ１の発現が関与するがんを処置する際に治療的に使用され得、その例には、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明はまた、配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含むＣＤＣＡ１タンパク質（配列番号：１０）またはその断片の検出および／または定量化のための様々な免疫学的アッセイも提供する。そのようなアッセイは、適宜に、ＣＤＣＡ１タンパク質またはその断片を認識し、結合することができる１つまたは複数の抗ＣＤＣＡ１抗体を含み得る。本発明において、ＣＤＣＡ１ポリペプチドに結合する抗ＣＤＣＡ１抗体は、好ましくは他のペプチドを排除して、好ましくは配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長ＣＤＣＡ１ポリペプチドの間の結合が配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、抗体は断片に「特異的に結合する」とみなされる。本発明に関連して、そのような免疫学的アッセイは、様々なタイプの放射免疫測定法、免疫クロマトグラフィ技術、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の様々な免疫学的アッセイ形式内で実施される。

本発明の関連する免疫学的であるが抗体を使用しないアッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびにＭＨＣ結合アッセイも含まれ得る。加えて、本発明の標識抗体を用いたラジオシンチグラフィ画像化法を含むがこれに限定されない、ＣＤＣＡ１を発現するがんを検出することができる免疫学的画像化法も本発明によって提供される。そのようなアッセイは、ＣＤＣＡ１を発現するがんの検出、モニタリングおよび予後診断において臨床的に使用することができ、そのようながんの例には、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体も提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で使用することができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ヒト抗体ならびに遺伝的組換えによって作製されるヒト化抗体を包含する。

抗体を得るための抗原として使用する本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウスまたはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書で開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から入手し得る。
本発明によれば、本発明のポリペプチドの完全なペプチドおよび部分ペプチドは免疫化抗原として役立ち得る。適切な部分ペプチドの例には、例えば本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片が含まれる。

本明細書では、抗体は、全長ＣＤＣＡ１ペプチドまたはＣＤＣＡ１ペプチドの断片のいずれかと反応するタンパク質と定義される。好ましい態様では、本発明の抗体は、配列番号：１および２の中から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＣＡ１の断片ペプチドを認識することができる。オリゴペプチドを合成する方法は当技術分野において周知である。合成後、ペプチドを、場合により免疫原として使用する前に精製してもよい。本発明では、オリゴペプチド（例えば２４ｍｅｒまたは２６ｍｅｒ）を、免疫原性を増強するために担体と複合化または連結してもよい。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は担体として周知である。ＫＬＨとペプチドを複合化する方法も当技術分野において周知である。

あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入してもよく、次にそれを使用して本明細書で述べるような宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を任意の標準的な方法によって宿主細胞の外部または内部から回収することができ、その後抗原として使用し得る。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体またはその溶解物または化学合成したペプチドを抗原として使用してもよい。

任意の哺乳動物を抗原で免疫し得るが、好ましくは細胞融合のために使用する親細胞との適合性を考慮に入れる。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）科の動物を使用し得る。げっ歯目科の動物には、例えばマウス、ラットおよびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒおよびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界ザル）が含まれる。

抗原で動物を免疫する方法は当技術分野において公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射が哺乳動物の免疫のための標準的な方法である。より詳細には、抗原を適切な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等に希釈し、懸濁し得る。所望する場合は、抗原懸濁液を適切な量の標準的なアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、その後哺乳動物に投与してもよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を４〜２１日ごとに数回投与する。適切な担体も免疫のために使用し得る。上記のように免疫した後、血清を、所望抗体の量の増加に関して標準的な方法によって検査し得る。

本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望抗体の増加に関して検査した免疫哺乳動物から血液を採取し、任意の従来の方法で血液から血清を分離することによって調製し得る。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含有する血清、ならびに血清から単離し得るポリクローナル抗体を含有する画分が含まれる。免疫グロブリンＧまたはＭは、例えば本発明のペプチドと結合したアフィニティカラムを用いて本発明のペプチドだけを認識する画分から調製することができ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてこの画分をさらに精製し得る。

本発明に関する使用のためのモノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を採取し、上述したように血清中の所望抗体のレベル上昇を検査して、細胞融合に供する。細胞融合に使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記免疫細胞と融合させる他の好ましい親細胞には、例えば哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
上記免疫細胞と骨髄腫細胞を公知の方法に従って、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．の方法（ＧａｌｆｒｅａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ７３：３−４６（１９８１））に従って融合させることができる。

生じる細胞融合によって得られたハイブリドーマは、それらを標準的な選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有培地）で培養することによって選択し得る。細胞培養を、典型的には数日間から数週間、すなわち所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）を死滅させるのに十分な時間、ＨＡＴ培地中で継続する。その後、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、クローン化し得る。

ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記方法に加えて、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したものをインビトロでペプチド、ペプチド発現細胞またはそれらの溶解物で免疫し得る。次に、免疫したリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、ペプチドに結合することができる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを生成し得る（特開昭６３−１７６８８号）。

得られたハイブリドーマを、その後マウスの腹腔に移植し、腹水を抽出し得る。得られたモノクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィまたは本発明のペプチドを結合させたアフィニティカラムによって精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出に使用できるだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いることができる。
あるいは、抗体を産生する、免疫リンパ球などの免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用してもよい。

このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組換えによって調製することもできる（例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋａｎｄＬａｒｒｉｃｋ，ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍｂｙＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＬＴＤ（１９９０）参照）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを免疫細胞、例えば抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球などからクローン化し、適切なベクターに挿入して、宿主細胞に導入し、組換え抗体を調製し得る。本発明はまた、上述したように調製される組換え抗体も提供する。

本発明の抗体は、抗体の断片または修飾された抗体が本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または修飾された抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆｖ、またはＨ鎖とＬ鎖からのＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり得る（Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５：５８７９−８３（１９８８））。より詳細には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することによって生成し得る。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入して、適切な宿主細胞において発現させてもよい（例えばＣｏｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５２：２９６８−７６（１９９４）；ＢｅｔｔｅｒａｎｄＨｏｒｗｉｔｚ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１７８：４７６−９６（１９８９）；ＰｌｕｃｋｔｈｕｎａｎｄＳｋｅｒｒａ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１２１：６５２−６３（１９８６）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１２１：６６３−９（１９８６）；ＢｉｒｄａｎｄＷａｌｋｅｒ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９：１３２−７（１９９１）参照）。

抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾し得る。本発明はそのような修飾された抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得られ得る。これらの修飾方法は当技術分野において慣例的である。

あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含むヒト化抗体として入手し得る。そのような抗体は公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることによって実施できる（例えばＶｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。したがって、そのようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。

ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体も使用できる。そのような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されるヒト抗体断片の組換えライブラリの使用を含む（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）参照）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製できる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号に記載されている。

上述したようにして得られた抗体を均一に精製し得る。例えば、抗体の分離および精製は、一般的なタンパク質に用いられる分離および精製方法に従って実施できる。例えば、抗体を、アフィニティクロマトグラフィ、フィルター、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動などの、しかしこれらに限定されないカラムクロマトグラフィの適切に選択し、組み合わせた使用によって分離および単離し得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＥｄＨａｒｌｏｗａｎｄＤａｖｉｄＬａｎｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインＡカラムには、例えばＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。

適切なクロマトグラフィ技術の例には、アフィニティクロマトグラフィを除いて、例えばイオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ等が含まれる（ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ．ＥｄＤａｎｉｅｌＲ．Ｍａｒｓｈａｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９６））。クロマトグラフィ手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィによって実施することができる。

例えば、吸光度の測定、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および／または免疫蛍光法を用いて本発明の抗体の抗原結合活性を測定し得る。ＥＬＩＳＡでは、本発明の抗体をプレートに固定化し、本発明のペプチドをプレートに塗布して、次に所望の抗体を含有する試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を適用する。その後、一次抗体を認識する、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチドの断片を、抗体の結合活性を評価するための抗原として使用し得る。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、本発明による抗体の活性を評価するために使用してもよい。

上記方法は、本発明の抗体を、本発明のペプチドを含むと推測される試料に曝露し、抗体とペプチドによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、本発明のペプチドの検出または測定を可能にする。
本発明によるペプチドの検出または測定の方法は、ペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法はペプチドを用いる様々な実験で使用することができる。

ＸＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、本発明のペプチドを発現するためまたは遺伝子治療のために本発明のヌクレオチドを投与するための、宿主細胞における本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡの担体として有用である。

大腸菌を宿主細胞として選択し、ベクターを大腸菌（例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）において大量に増幅し、生産する場合、ベクターは、大腸菌における増幅に適した「複製起点（ｏｒｉ）」および形質転換した大腸菌を選択するのに適したマーカー遺伝子（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等のような薬剤によって選択される薬剤耐性遺伝子）を有するべきである。例えば、Ｍ１３シリーズのベクター、ｐＵＣシリーズのベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が使用できる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴおよびｐＴ７も、上述したベクターと同様に、ｃＤＮＡをサブクローニングし、抽出するために使用できる。本発明のタンパク質を生産するためにベクターを使用する場合は、発現ベクターが使用できる。例えば、大腸菌で発現される発現ベクターは、大腸菌において増幅される上記特徴を有するべきである。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ベクターは、大腸菌において所望の遺伝子を効率的に発現することができるプロモーター、例えばｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−６（１９８９）；ＦＡＳＥＢＪ６：２４２２−７（１９９２））、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−３（１９８８））、Ｔ７プロモーター等を有するべきである。その点に関して、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰおよびｐＥＴ（この場合、宿主は、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）が、例えば、上記ベクターの代わりに使用できる。加えて、ベクターはまた、ペプチド分泌のためのシグナル配列も含み得る。ペプチドが大腸菌のペリプラズムに分泌されるように指令する例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列である（Ｌｅｉｅｔａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１６９：４３７９（１９８７））。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。

大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１８（１７）：５３２２（１９９０））、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えばｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えばｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば「ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えばｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が、本発明のポリペプチドを生産するために使用できる。

ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞においてベクターを発現するために、ベクターは、そのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７７：１０８（１９７９））、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１８：５３２２（１９９０））、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬剤（例えばネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬剤耐性遺伝子）を担持すべきである。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶおよびｐＯＰ１３が含まれる。

以下では、特定の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実験材料、方法および実施例は、当業者が本発明の特定の態様を作製し、使用することを助けるのに役立ち得るが、本発明の態様を例示することだけを意図し、したがっていかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。当業者は容易に認識するように、本明細書で述べるものと類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。

材料および方法
細胞株および抗体
ＴＡＰ欠損およびＨＬＡ−Ａ２陽性細胞株Ｔ２をＲｉｋｅｎＣｅｌｌＢａｎｋから購入した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、ＤＲ１（ＤＲＢ１^＊０１：０１）；Ｌ−ＤＲ１、ＤＲ４（ＤＲＢ１^＊０４：０５）；Ｌ−ＤＲ４、ＤＲ８（ＤＲＢ１^＊０８：０３）；Ｌ−ＤＲ８、ＤＲ１５（ＤＲＢ１^＊１５：０２）；Ｌ−ＤＲ１５またはＤＲ５３（ＤＲＢ４^＊０１：０３）；Ｌ−ＤＲ５３のいずれかを発現するように遺伝的に操作されたマウス線維芽細胞株であるＬ細胞を使用した。微量の内因性ＨＬＡクラスＩ分子を発現するヒトＢリンパ芽球様細胞株Ｃ１ＲのＨＬＡ−Ａ２４形質転換体であるＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞は、滝口雅文博士（熊本大学、熊本、日本）より贈られた。Ｔ２細胞およびＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を標的細胞として使用した。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ（Ｌ細胞）またはＲＰＭＩ１６４０（Ｔ２およびＣ１Ｒ−Ａ２４細胞）中にインビトロで維持した。

患者
２つのペプチドワクチン治験に登録した１９名のＨＮＣ患者から血液試料を採取し、ＣＤＣＡ１−ＬＰに反応性のＴｈ細胞の免疫応答を調べた。がん精巣抗原に由来する３つのＨＬＡ−Ａ２４結合ＳＰ（臨床グレードの９〜１０アミノ酸長ペプチド）、ＣＤＣＡ１（ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）、本試験で報告した、図１）、ＩＭＰ−３（ＩＭＰ−３−Ａ２４（５０８−５１６））およびＬＹ６Ｋ（ＬＹ６Ｋ−Ａ２４（１７７−１８６））（ＳｕｄａＴ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ２００７；１０：１８０３−８）を用いたがん免疫療法のこれらの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、熊本大学（熊本、日本）の治験審査委員会によって審査され、承認された。ペプチド（各抗原１ｍｇ）をＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ５１５００μＬ中に乳化し、０、７、１４、２８、４２、５６、６３および７０日目、その後は腫瘍の進行または毒性が観察されるまで月に１回、皮下（ｓ．ｃ．）注射する。すべてのＨＮＣ患者を、書面によるインフォームドコンセントを得た後、ＨＬＡ−Ａ２４の保有に基づいて選択した。患者は、再発性または転移性腫瘍を有する手術不可能な進行ＨＮＣに罹患しており、標準的な治療に抵抗性であった；これらの患者を大学病院医療情報ネットワーク臨床試験登録システム（ＵＭＩＮ−ＣＴＲ）番号０００００８３７９（ＣＴＲ−８３７９）の下で治験に登録した。根治的切除術を受けたＨＮＣ患者は、ＵＭＩＮ−ＣＴＲ番号０００００８３８０（ＣＴＲ−８３８０）の下で治験に登録した。後者の治験では、ＨＮＣ患者を、Ｓ−１、イフォスファミドまたはドキソルビシンと組み合わせた術後ペプチドワクチン免疫療法で治療した。これらの臨床試験および解析は進行中である。

ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアルゴリズムによる予測
潜在的なプロミスキャスＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰに結合するヒトＣＤＣＡ１由来ペプチドを予測するため、コンピュータアルゴリズム（ＩＥＢＤ解析リソース、コンセンサス法、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ＩＩ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）を用いてヒトＣＤＣＡ１タンパク質のアミノ酸配列を解析した（ＷａｎｇＰｅｔａｌ．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；１１：５６８．，ＷａｎｇＰｅｔａｌ．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ２００８；４：ｅ１００００４８）。プログラムは、タンパク質全体を包含する１５アミノ酸長配列のオフセットを解析した。ＤＲＢ１^＊０４：０５、ＤＲＢ１^＊１５：０２またはＤＰＢ１^＊０２：０１アリルによってコードされる複数のＨＬＡクラスＩＩ分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつＣＤＣＡ１由来の９ｍｅｒＣＴＬエピトープを天然に含む２４および２６アミノ酸長ペプチドを選択し、合成して、ＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなヘルパーＴ細胞エピトープを同定した（ＨａｒａｏＭ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２００８；１２３：２６１６−２５）。

合成ペプチドおよび組換えタンパク質
ＨＬＡ−Ａ２に結合する、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）、ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号：３）；ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）、ＫＬＡＴＡＱＦＫＩ（配列番号：４）、およびＨＬＡ−Ａ２４に結合する、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）、ＶＹＧＩＲＬＥＨＦ（配列番号：５）の３つのヒトＣＤＣＡ１由来短鎖ペプチド（ＳＰ）を合成した（純度＞９５％、Ｂｉｏｍａｔｉｋ，Ｃａｎａｄａ）。２つのオーバーラップする長鎖ペプチド（ＬＰ）である、ＣＤＣＡ１（５５−７８）、ＩＶＹＧＩＲＬＥＨＦＹＭＭＰＶＮＳＥＶＭＹＰＨＬ（配列番号：１）；ＣＤＣＡ１（３９−６４）、ＮＰＫＰＥＶＬＨＭＩＹＭＲＡＬＱＩＶＹＧＩＲＬＥＨＦ（配列番号：２）を合成し（純度＞９０％）、ＣＤＣＡ１特異的ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞をインビトロで刺激するその能力に関して試験した。ＨＬＡ−Ａ２４（ＨＩＶ−Ａ２４、ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ（配列番号：６））およびＨＬＡ−Ａ２（ＨＩＶ−Ａ２、ＳＬＹＮＴＹＡＴＬ（配列番号：７））に結合する２つのＨＩＶペプチドを陰性対照ＳＰとして使用した（ＴｏｍｉｔａＹ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ；１０２：６９７−７０５．，ＴｏｍｉｔａＹｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ；１０２：７１−８）。ＬＰである、ＤＲ４に結合するＷＴ１由来ペプチド、ＷＴ１ペプチド（ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号：８））を陰性対照ＬＰとして使用した（ＦｕｊｉｋｉＦｅｔａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ２００７；３０：２８２−９３）。ペプチドを１０μｇ／μＬまたは２０μｇ／μＬの濃度でジメチルスルホキシドに溶解し、−８０℃で保存した。
６Ｈｉｓタグ組換え全ＣＤＣＡ１タンパク質ならびにＣＤＣＡ１（５５−７８）およびＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的Ｔｈ細胞によって認識される両方のＣＤＣＡ１由来Ｔｈエピトープを欠く切断型ＣＤＣＡ１タンパク質を、それぞれのｃＤＮＡ断片を有するｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて大腸菌ＢＬ２１株によって発現させた。切断型ＣＤＣＡ１タンパク質を対照タンパク質として使用した。各々の組換えタンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐＦＦカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の使用説明書に従って用いて精製した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。

ＴＡＡ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞株およびクローンの作製
健常ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、使用するための研究プロトコルは、熊本大学の治験審査委員会によって承認された。本発明者らは、１２名の健常ドナーから、書面によるインフォームドコンセントを得た後で血液試料を得た。この試験で検討した健常ドナーのＨＬＡ−Ａ、ＤＲＢ１およびＤＰＢ１アリルを、ポリメラーゼ連鎖反応およびアリル特異的プローブハイブリダイゼーションを用いてＨＬＡ遺伝子変異のＤＮＡタイピングによって決定し、表１に示す。健常ボランティアからのＰＢＭＣを以前に述べられているように（ＩｎｏｕｅＭ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ；１２７：１３９３−４０３）単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）と結合した磁気マイクロビーズを用いて陽性選択によってＰＢＭＣから精製した。単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を、以前に述べられているように（ＨａｒａｏＭ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２００８；１２３：２６１６−２５）インビトロ培養によってＣＤ１４^＋細胞から生成し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用して、ＴＡＡ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を誘導した。ＤＣ（１×１０^４／ウェル）を１０μｇ／ｍｌのＬＰで３時間パルスし、照射して（４５Ｇｙ）、その後９６ウェル平底培養プレートの各ウェルにおいて５％ヒト補体除去血漿を添加したＡＩＭ−Ｖ２００μｌ中の自己ＣＤ４^＋Ｔ細胞（３×１０^４／ウェル）と混合した。７日後、培地の半分を各培養物から取り出し、次に、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）および５ｎｇ／ｍｌのヒト組換え（ｈｒ）ＩＬ−７でパルスした、照射した（５０Ｇｙ）自己ＰＢＭＣ（１×１０^５）を含む新鮮培地（１００μｌ／ウェル）を培養物に添加した。ペプチドでの２回目の刺激の２日後に、ｈｒＩＬ−２を１０ＩＵ／ｍｌの最終濃度で各ウェルに添加した。１週間後、各ウェル中の刺激したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにおいて特異性について分析した。コグネイトペプチドに特異的応答を示すＴ細胞を２４ウェルプレートに移し、１０ＩＵ／ｍｌのｈｒＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのｈｒＩＬ−７を添加した培地中、ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）でパルスした照射自己ＰＢＭＣ（１×１０^６／ウェル）を用いて週１回の間隔で再刺激した。一部の場合は、以前に述べられているように（ＴａｂａｔａＨｅｔａｌ．ＨｕｍＩｍｍｕｎｏｌ１９９８；５９：５４９−６０）さらなる試験のためにＴ細胞を限界希釈によってクローン化した。

ペプチドおよびタンパク質に対するＴ細胞応答の評価
ペプチドおよびタンパク質でパルスしたＡＰＣに対するＴｈ細胞の免疫応答を、以前に述べられているように（ＴｏｍｉｔａＹｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ；１０２：６９７−７０５）ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＨｕｍａｎＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴキット、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した。簡単に述べると、ペプチドでパルスしたＰＢＭＣ（３×１０^４／ウェル）での刺激後の３×１０^４のバルクＣＤ４^＋Ｔ細胞、またはペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲを発現するＬ細胞（５×１０^４／ウェル）での刺激後の１×１０^４のバルクＣＤ４^＋Ｔ細胞当たりの、インターフェロン（ＩＦＮ）γを産生するペプチド特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度を分析した。ペプチドでパルスしたＴ２細胞（２×１０^４／ウェル）での刺激後の１×１０^５のＣＴＬ当たりの、インターフェロン（ＩＦＮ）γを産生する細胞の頻度も分析した。あるいは、タンパク質をロードした５×１０^３のＤＣを２×１０^４ＣＤ４^＋Ｔ細胞クローン／ウェルと共培養した。タンパク質をロードした成熟ＤＣを、以前に述べられているように（ＨａｒａｏＭ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２００８；１２３：２６１６−２５）ポジティブ単離したＣＤ１４^＋細胞（０日目）から調製した。５日目に、組換えＣＤＣＡ１（５０μｇ／ｍｌ）およびＯＫ４３２の存在下でＤＣを培養した。タンパク質をロードした成熟ＤＣを７日目に回収し、洗浄して、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける刺激物質として使用した。抗原提示に関与する拘束ＨＬＡ分子を決定するため、抗原誘導性ＩＦＮ−γ産生のブロッキングを、抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ（Ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＨＬＡ−ＤＰｍＡｂ（Ｂ７／２１、ａｂｃａｍ）、抗ヒトＨＬＡ−ＤＱｍＡｂ（ＳＰＶ−Ｌ３、ａｂｃａｍ）または抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂ（Ｗ６／３２、ａｂｃａｍ）を添加することによって検査した。すべてのｍＡｂを５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのすべての評価は２連または３連で実施し、結果は平均値に対応した。

ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）でまたはＣＤＣＡ１タンパク質をロードしたヒトＤＣ（５０μｇ／ｍＬ）でパルスしたＰＢＭＣ、Ｌ細胞およびマウスＢＭ−ＤＣに対するＴ細胞の免疫応答を、製造者の使用説明書に従っておよび以前に述べられているように（ＺａｒｏｕｒＨＭｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０００；６０：４９４６−５２）、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）によって評価した。簡単に述べると、ペプチドでパルスしたＰＢＭＣ（３×１０^４／ウェル）、Ｌ細胞（５×１０^４／ウェル）、Ｔ２細胞（２×１０^４／ウェル）、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞（２×１０^４／ウェル）、骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ、２×１０^４／ウェル）、またはタンパク質をロードしたＤＣ（５×１０^３／ウェル）を、ＡＰＣまたは標的細胞としてＥＬＩＳＰＯＴプレートに３連または２連で接種した。抗原提示に関与するＨＬＡ分子を決定するため、抗原誘導性ＩＦＮ−γ産生を、ＡＰＣまたは標的細胞の接種後に抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｌ２４３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＨＬＡ−ＤＰｍＡｂ（Ｂ７／２１、Ａｂｃａｍ）、抗ヒトＨＬＡ−ＤＱｍＡｂ（ＳＰＶ−Ｌ３、Ａｂｃａｍ）、または抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂ（Ｗ６／３２、Ａｂｃａｍ）を添加することによってブロックした。すべてのｍＡｂを５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。ＡＰＣまたは標的細胞をｍＡｂと共に室温で１時間インキュベートした。次に、応答Ｔ細胞を回収し、洗浄して、図面に示されている数でＥＬＩＳＰＯＴプレートに移した。１８時間のインキュベーション後、スポット数を計数した。ＨＩＶ−Ａ２、ＨＩＶ−Ａ２４またはＷＴ１由来ＬＰを陰性対照ペプチドとして使用した。一部の実験では、パルスしていないＰＢＭＣまたはＬ細胞を陰性対照として使用した。ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に培養した細胞をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのすべての評価において陽性対照として使用した。結果を平均±ＳＤとして示す。

ＨＮＣ患者に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ＣＤＣＡ１−ＬＰとの１週間の細胞培養後に、細胞を採取し、洗浄して、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（１×１０^５／ウェル）においてＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ、ＣＤＣＡ１（３９−６４）−ＬＰまたは対照ＬＰ（ＨＩＶ−ＬＰ）と共に１８時間培養した。スポット形成細胞／１０^５細胞として表したＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の数を、対照値（バックグラウンド）を差し引いた後に算出した。ＩＦＮ−γスポットの平均数が１５より多く、バックグラウンドの２倍を上回る場合は、応答を陽性と採点した。ＨＮＣ患者の細胞に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、使用可能な細胞の数が限られていたため、１連、２連または３連のウェルで実施した。

健常ドナーにおけるＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰでの刺激によるＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖
Ａ：ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでの精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞の刺激によるＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ反応性ＣＴＬの誘導を、以前に述べられているように実施した。（ＴｏｍｉｔａＹ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ２０１１；１０２：７１−８．，ＩｍａｉＫ，ｅｔａｌ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００８；１４：６４８７−９５）ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰでパルスしたＤＣでの刺激によるＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖能力を評価するため、ＨＬＡ−Ａ２４^＋ドナーから得たＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＴＬ（ＨＤ２；２×１０^６／ウェル、２４ウェルプレート、ＨＤ５；２×１０^５／ウェル、４８ウェルプレート）を、１６μＭＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰまたは対照ＬＰでパルスした自己ＤＣ（ＨＤ２；２×１０^５／ウェル、ＨＤ５；５×１０^４／ウェル）で刺激した。ＬＰでパルスした成熟ＤＣ（３時間）を照射し、洗浄して、その後抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。１日目と７日目に、ｒｈＩＬ２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＨＤ２およびＨＤ５からＣＴＬを樹立した後、それらの認識特異性および細胞傷害活性を以下のプロトコル（Ｂ）および（Ｃ）によってそれぞれ評価した。

Ｂ（ＨＤ２）；ＬＰ刺激の前（０日目）ならびに刺激後５、７、８および１０日目に、培養した細胞のアリコート（１×１０^５細胞）を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（クローンＴ８、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）とＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）複合体のＰＥ標識テトラマー（ＭＢＬ、名古屋、日本）で染色した。ＨＬＡ−Ａ２４（Ａ^＊２４：０２）／ＨＩＶ−Ａ２４（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ；配列番号：６）複合体のＰＥ標識テトラマーを陰性対照として使用した。

Ｃ（ＨＤ５）；１週間の細胞培養後、細胞を回収し、洗浄して、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（１×１０^５／ウェル）において１８時間培養した。ＣＤＣＡ１−Ａ２４_{５６−６４}ＳＰでパルスしたまたはＨＩＶ−Ａ２４ＳＰ（バックグラウンド）でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（２×１０^４／ウェル）で刺激した後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した。（ＤｏｂｒｚａｎｓｋｉＭＪ．ｅｔａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｏｎｃｏｌｏｇｙ２０１３；３：６３）スポット形成細胞／１０^５細胞として表したＣＤＣＡ１−Ａ２４_{５６−６４}ＳＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を、対照値（バックグラウンド）を差し引いた後に算出した。ＨＩＶ−Ａ２４ＳＰを陰性対照ＳＰとして使用した。

ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者におけるＣＤＣＡ１−ＬＰでの刺激によるＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖
ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種した５名のＨＮＣ患者（ＨＮＣ２６、２９、３１、３９、１０９）からのＰＢＭＣを、２４ウェルプレート（２×１０^６／ウェル）においてＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）−ＬＰの混合物（各々１０μｇ／ｍＬ）と共に培養し、０日目と２日目にｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−７を添加した。０日目（エクスビボ）および７日目に、ＰＢＭＣをＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的テトラマーで染色した。

サイトカインアッセイ
Ｔ細胞（１×１０^４／ウェル）を、９６ウェル培養プレートにおいてＣＤＣＡ１（５５−７８）の存在下でＬ−ＤＲ４（５×１０^４／ウェル）と共に培養した。２０時間後、培養上清を採取し、サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１β、ＩＬ−４、ＩＬ−１７）レベルを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造者の使用説明書に従って使用して測定した。

ＣＤ１０７ａ動員アッセイ
ペプチドで刺激された脱顆粒ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋Ｔリンパ球を同定するため、細胞表面に露出されたＣＤ１０７ａをフローサイトメトリによって分析した。（ＲｕｂｉｏＶｅｔａｌ．ＮａｔＭｅｄ２００３；９：１３７７−８２．，ＢｅｔｔｓＭＲ，ｅｔａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２００３；２８１：６５−７８）簡単に述べると、ＣＤ１０７ａ動員アッセイを以前に述べられているように実施した。（ＴｏｍｉｔａＹｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．２０１１Ｊａｎ；１０２（１）：７１−８）ＣＤＣＡ１由来ペプチドまたは対照ペプチド（１μｇ／ｍｌ）を刺激剤として添加し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１０７ａｍＡｂまたはＦＩＴＣ標識アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１およびモネンシンを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で５時間培養した。培養後、ペプチドで刺激したＴｈ細胞またはＣＴＬをＰＥ結合抗ヒトＣＤ４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＰＥ結合抗ヒトＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でそれぞれ染色し、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳｃａｎ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。

インビトロ交差提示アッセイおよびヒトＣＴＬ応答分析
ＨＬＡ−Ａ２４^＋ドナー（ＨＤ２）由来のＤＣを、生存状態に保持するかまたは０．１％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３分間固定し、ペプチド（１６μＭ）で３時間パルスして、３回洗浄した。ペプチドパルスの間およびパルス後にＯＫ４３２（０．１ＫＥ／ｍＬ、中外製薬、東京、日本）を添加し、ＤＣの成熟を誘導した。ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）反応性バルクＣＴＬを、１０μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む培地中に２：１の比率で６時間添加した。ブレフェルジンＡは、刺激の間のタンパク質分泌を阻害するために添加した。ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を細胞内標識によって測定した。細胞を、ＰｅｒＣＰ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥ標識ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的テトラマーと組み合わせたＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＦＮ−γ ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。データの取得はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてデータファイルを解析した。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰの交差提示によるインビトロでのＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰまたはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ反応性ＣＴＬの誘導を評価するため、ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４陽性ドナーから単離した、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードしたＤＣをＡＰＣとして使用した。ＣＤ１４^＋細胞を単離し（０日目）、ｈｒＩＬ４（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）（１０μｇ／ｍｌ）およびＯＫ４３２を５日目に添加した。ＬＰをロードした成熟ＤＣを７日目に回収し、洗浄して、ＡＰＣとして使用した。ＨＬＡ−Ａ２陽性健常ドナーからの、ＬＰをロードしたＤＣでのヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の刺激を、以前に述べられているように実施した（ＩｍａｉＫ，ｅｔａｌ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ；１０４：３００−７）。ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードしたＤＣでのＣＤ８^＋Ｔ細胞の３回の刺激後、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）、ＨＩＶ−Ａ２ペプチドでパルスしたＴ２またはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞での刺激後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した。

インビボ交差提示アッセイ
ＨＬＡ−Ａ２（ＨＨＤ）およびＨＬＡ−Ａ２４（ＨＨＨ）トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）は、Ｆ．Ａ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士の厚意により提供された。（ＦｉｒａｔＨ，ｅｔａｌ．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９９；２９：３１１２−２１．，ＪｕｎｇＫＯ，ｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ２０１２；８６：７６１６−２４）。マウスに、７日の間隔で、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化したＣＤＣＡ１−ＬＰ溶液（ＨＬＡ−Ａ２Ｔｇｍ、５０μｇ／マウス；ＨＬＡ−Ａ２４Ｔｇｍ、１００μｇ／マウス）を尾の基部で皮内注射した。ＣＤＣＡ１由来ＬＰでの２回目または３回目のワクチン接種の７日後に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、磁気マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた陽性選択によって鼠径リンパ節から単離した。ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣまたはＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞での刺激に応答したＩＦＮ−γ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した。

ＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬの誘導へのＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰの相乗作用
ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞クローン（Ｔｈクローン）を生成した、ＨＬＡ−Ａ２^＋／ＤＲ４^＋ＨＤ１から得たＰＢＭＣを２４ウェルプレートに播種し（３×１０^６／ウェル）、次いでＳＰ単独（ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）、２０μｇ／ｍＬ）、ＳＰ＋ＬＰ（ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ、２０μｇ／ｍＬ）、ＳＰ＋Ｔｈクローン（５×１０^５／ウェル）、またはＳＰ＋ＬＰ＋Ｔｈクローンを２ｍＬの最終容量で添加した。７日間の培養後、これらのペプチドとＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）を添加し、次に９日目にＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。１１日目に、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂとＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）複合体のＰＥ標識テトラマーで細胞を染色した。溶解活性を標準的なクロム放出アッセイにおいて試験した。（ＩｎｏｕｅＭｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ２００９；１２６：６７−７２．，ＭｏｎｊｉＭｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００４；１０：６０４７−５７）。

ＨＤ２由来のＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ特異的バルクＣＤ４^＋Ｔ細胞（１×１０^５細胞／ウェル、４８ウェルプレート）およびＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＤ８^＋Ｔ細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を、いずれのサイトカインも添加せずに、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ単独（１０μｇ／ｍＬ；ＳＰ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４_{５６−６４}ＳＰ＋対照ＬＰ（各々１０μｇ／ｍＬ；対照ＬＰ＋ＳＰ）、またはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（各々１０μｇ／ｍＬ；ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ＋ＳＰ）の存在下で自己ＤＣ（２×１０^４細胞／ウェル）と共に培養した。ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでの刺激によるＨＬＡ−Ａ２４^＋／ＤＲ１５^＋ドナー（ＨＤ２）からのＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＴＬの誘導を、以前に述べられているように実施した。（ＳｈｅｄｌｏｃｋＤＪ，ＳｈｅｎＨ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００３；３００：３３７−９）ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、培養した細胞を、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＣＤＣＡ１−Ａ２４_{５６−６４}複合体（ＭＢＬ、名古屋、日本）のＰＥ標識テトラマーおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。

ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰで免疫したＨＮＣ患者におけるＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答の評価
ＨＮＣ患者のヘパリン添加血液からのＰＢＭＣをフィコール−コンレイ密度勾配遠心分離によって単離した。ＨＮＣ患者または健常ドナーからの新鮮なＰＢＭＣを、５％ヒト補体除去血漿を添加した最終容量２ｍｌのＡＩＭ−Ｖ中、ＣＤＣＡ１（３９−６４）−ＬＰとＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ（各々１０μｇ／ｍＬ）の混合物と共に３７℃で培養した（２×１０^６／ウェル、２４ウェルプレート）；ＩＬ−２およびＩＬ−７を０日目と２日目に添加した。１週間の細胞培養後、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した。この試験は、探索的研究の原則（ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）の下で活動する研究室で行い、研究プロトコルを用いて実施した。本発明者らは、ヒトＴ細胞アッセイに関する枠組みを報告した「Ｔ細胞アッセイについての最小限情報（ＭｉｎｉｍａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＡｂｏｕｔＴ−ｃｅｌｌＡｓｓａｙ）」（ＭＩＡＴＡ）の推奨（ＢｒｉｔｔｅｎＣＭｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０１２；３７：１−２）に同意する。

誘導されたＴＡＡ特異的ＣＴＬに関するテトラマーアッセイ
ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈ細胞クローンを生成したＨＬＡ−Ａ２かつＤＲ４陽性健常ドナーＨＤ１からのＰＢＭＣを２４ウェルプレートに３×１０^６／ウェルの濃度で播種した後、混合ＳＰ単独（ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）＋ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）、それぞれ２０μｇ／ｍｌ）、混合ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（２０μｇ／ｍｌ）、混合ＳＰ＋Ｔｈクローン（５×１０^５／ウェル）、または混合ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ＋Ｔｈクローンを２ｍｌの最終容量で細胞培養物に添加した。７日間の培養後、これらのペプチドとｈｒＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を添加し、次にｈｒＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を９日目に添加した。培養の１１日目に、細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（クローンＴ８、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）と組み合わせたＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ペプチド複合体またはＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）ペプチド複合体のＰＥ標識テトラマー（ＭＢＬ、名古屋、日本）で染色し、フローサイトメトリによって分析した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈ細胞クローンを生成した別のドナーからのＰＢＭＣを上述した手順に基づいて試験した。

統計解析
両側スチューデントｔ検定（棒グラフ）、フィッシャーの正確確率検定、またはノンパラメトリックのマン−ホイットニーＵ検定（散布点グラフ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴデータにおける差の統計的有意性を評価した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。統計解析は、市販の統計ソフトウェアパッケージ（ＳｔａｔＶｉｅｗ５．０、ＡｂａｃｕｓＣｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）を用いて実施した。

結果
ＣＤＣＡ１のＣＴＬエピトープを含む潜在的なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの予測および選択
ＣＤＣＡ１の潜在的なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合Ｔｈ細胞エピトープを同定するため、本発明者らは、最初に、コンピュータアルゴリズム（ＷａｎｇＰ，ｅｔａｌ．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；１１：５６８．，ＷａｎｇＰ，ｅｔａｌ．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ２００８；４：ｅ１００００４８）を用いてＣＤＣＡ１のアミノ酸配列を検討した。興味深いことに、本発明者らは、コンピュータアルゴリズムによって強力なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと予測されたＣＤＣＡ１タンパク質配列の１つの領域（ＣＤＣＡ１（３９−７８））がＣＴＬエピトープに非常に近位であることを見出した（図１）。それゆえ、本発明者らは、複数のＨＬＡクラスＩＩ分子、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２（ＤＰＢ１^＊０２：０１）についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識される天然の９ｍｅｒペプチドを含む、２つの候補ＬＰ（ＣＤＣＡ１（３９−６４）およびＣＤＣＡ１（５５−７８））（図１Ａおよび表２）をその後の分析のために選択し、合成した。

ＣＴＬエピトープを天然に含むＣＤＣＡ１由来のプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合Ｔｈ細胞エピトープの同定
本発明者らは、これら２つの選択した合成ＬＰがＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞を生成することができるかどうかを評価した。５名の健常ドナーからのＰＢＭＣのＣＤ４^＋Ｔ細胞を、週１回の間隔で、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ペプチドでパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。少なくとも３回の刺激後、培養したＣＤ４^＋Ｔｈ細胞のＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査した。３名のＨＬＡ−ＤＲ４陽性の健常ドナーにおいて、生成されたＴｈ細胞株は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）に応答して有意の量のＩＦＮ−γを産生した（図２ＡおよびＢ）。Ｔｈ細胞株のＨＬＡ拘束を明らかにするため、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰに対するｍＡｂを使用した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）に対するＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂを添加した場合有意に減少したが、ＨＬＡ−ＤＰ特異的ｍＡｂは影響を示さなかった（図２ＡおよびＢ）。

ＨＬＡ拘束をさらに分析するため、ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ４、Ｌ−ＤＲ５３またはＬ−ＤＲ１細胞に対するＴｈ細胞の反応性を試験した。３名のＤＲ４陽性健常ドナーから生成したバルクＴｈ細胞株は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＬ−ＤＲ４細胞を特異的に認識したが、Ｌ−ＤＲ４細胞、無関係なペプチド（ＷＴ１ペプチド）でパルスしたＬ−ＤＲ４細胞、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ５３細胞またはＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＬ−ＤＲ１細胞は認識しなかった。ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＬ−ＤＲ０４０５細胞に対するＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ（Ｌ２４３）の添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂ（Ｗ６／３２）では阻害されなかった（図３Ａ、ＢおよびＣ）。これらの結果は、これらのＴｈ細胞株においてＣＤＣＡ１（５５−７８）がＨＬＡ−ＤＲ４によって提示されることを明らかに示した。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）が他のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合して、Ｔｈ細胞応答を誘導することができるかどうかを調べるため、ＨＬＡ−ＤＲ４陰性の２名の健常ドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。ＨＬＡ−ＤＲ１５陽性ドナーＨＤ２から生成したＴｈ細胞株は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＰＢＭＣおよびＬ−ＤＲ１５細胞に応答して有意の量のＩＦＮ−γを特異的に産生したが、ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＬ−ＤＲ８細胞では有意の量のＩＦＮ−γは産生されなかった。ＣＤＣＡ１（５５−７８）でパルスしたＰＢＭＣまたはＬ−ＤＲ１５細胞に対するＴｈ細胞株のＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−クラスＩ特異的ｍＡｂでは阻害されなかった（図２Ａおよび図３Ａ、Ｂ）。これらの結果は、このＴ細胞株においてＣＤＣＡ１（５５−７８）がＨＬＡ−ＤＲ１５によって提示されたことを明らかに示す。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）での刺激によってＨＬＡ−ＤＰ２陽性ドナーＨＤ３から生成されたＴｈ細胞株も、ＣＤＣＡ１（５５−７８）に応答して有意の量のＩＦＮ−γを特異的に産生し、この応答は抗ＨＬＡ−ＤＰｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂでは阻害されなかった（図２Ａ）。本発明者らはＬ細胞にＨＬＡ−ＤＰ２およびＨＬＡ−ＤＲ９遺伝子を形質導入しなかったので、ＡＰＣとして５名の異なるドナーからの同種ＰＢＭＣを使用して、共通の拘束ＨＬＡ−ＤＰ分子を決定した。ドナーＨＤ３からのこのＤＰ拘束性バルクＣＤ４^＋Ｔｈ細胞株の限界希釈によってＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的クローンを得た。その結果として、ＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的クローンは、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＤＰ２を発現する同種ＰＢＭＣの存在下でのみＣＤＣＡ１（５５−７８）ペプチドに特異的応答を示し、ＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＰｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂでは阻害されなかった。これらの結果は、ドナーＨＤ３に由来するＤＰ拘束性Ｔｈ細胞株がＨＬＡ−ＤＰ２によって拘束されることを示唆する（図３Ａ、Ｂ）。

したがって、ＣＤＣＡ１（５５−７８）はＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２に結合する能力を有しており、このことはＣＤＣＡ１（５５−７８）が日本人群におけるプロミスキャスで高頻度のＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるＴｈ細胞エピトープであることを示唆する。

次に、本発明者らは、別のペプチドである、ＣＤＣＡ１（３９−６４）が特異的Ｔｈ１細胞を生成することができるかどうかを評価した。２名の健常ドナーからのＰＢＭＣのＣＤ４^＋Ｔ細胞を、週１回の間隔で、ＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。培養したＣＤ４^＋Ｔｈ細胞のＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて検査した。ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ５３陽性健常ドナーＨＤ１において、生成されたＴｈ細胞株は、ＣＤＣＡ１（３９−６４）に応答して有意の量のＩＦＮ−γを産生し（図２Ｃ）、この応答は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂを添加した場合有意に低減したが、ＨＬＡ−ＤＰ特異的ｍＡｂは影響を示さなかった。ＨＬＡ拘束をさらに分析するため、ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ４およびＬ−ＤＲ５３に対するＴｈ細胞の反応性を試験したが、このドナーから生成されたこのＤＲ拘束性バルクＣＤ４^＋Ｔｈ細胞は、ＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスしたＬ−ＤＲ４およびＬ−ＤＲ５３細胞を認識しなかった（データは示していない）。それゆえ、本発明者らは、このＣＤ４^＋Ｔｈ細胞株がＨＬＡ−ＤＲ９拘束性Ｔｈ細胞であると考えた。これを確認するため、このＤＲ拘束性バルクＣＤ４^＋Ｔｈ細胞株の限界希釈によってＣＤＣＡ１（３９−６４）特異的クローンを得た。その結果として、Ｔｈクローンは、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＤＲ９を発現する同種ＰＢＭＣの存在下でのみＣＤＣＡ１（３９−６４）に特異的応答を示し、ＩＦＮ−γ産生は抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡ−ＤＰｍＡｂでは阻害されなかった。これらの結果は、このＴｈクローンがＤＲ９によって拘束されることを示した（図３Ｄ）。

ＣＤＣＡ１（３９−６４）が別のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、Ｔｈ細胞応答を誘導することができるかどうかを調べるため、ＨＬＡ−ＤＲ９陰性健常ドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。ＣＤＣＡ１（３９−６４）での刺激によって生成されたＴｈ細胞は、ＣＤＣＡ１（３９−６４）でパルスしたＰＢＭＣおよびＬ−ＤＲ１５細胞に応答して有意の量のＩＦＮ−γを特異的に産生したが、ＣＤＣＡ１（３９−６４）ペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ８細胞では有意の量のＩＦＮ−γは産生されなかった。Ｔｈ細胞株のこのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡ−ＤＰ、抗ＨＬＡ−ＤＱまたは抗ＨＬＡ−クラスＩｍＡｂでは阻害されなかった（図２Ｃおよび図３Ｄ）。これらの結果は、このＴｈ細胞がＨＬＡ−ＤＲ１５によって拘束されることを示した。

合わせて考慮すると、ここで提示したこれらの結果は、２つのオーバーラップするペプチド、ＣＤＣＡ１（３９−６４）およびＣＤＣＡ１（５５−７８）がＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞を刺激する能力を有することを明らかに示し、これらのペプチドが、プロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ分子によってＴｈ細胞に提示され得ることおよび多くの患者のがん免疫療法に使用可能であることを示唆する。
ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞を刺激するＣＤＣＡ１（３９−６４）およびＣＤＣＡ１（５５−７８）の能力を確認するため、本試験者らは、無関係なペプチドをＨＬＡクラスＩＩ分子拘束性Ｔｈ細胞誘導についての対照として用いて実験を行った。

健常ドナーのＰＢＭＣから単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、週１回の間隔で、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでパルスした自己ＤＣおよびＰＢＭＣで刺激した。少なくとも３回の刺激後、培養したＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ特異的応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査した。ＨＬＡ−ＤＲ４陽性健常ドナー（ＨＤ１）において、生成されたＴｈ細胞は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰでパルスしたＰＢＭＣに応答してＨＬＡ−ＤＲ依存的に有意の量のＩＦＮ−γを産生した。バルクＴｈ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰでパルスしたＬ−ＤＲ４細胞を特異的に認識したが、無関係なペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ４細胞またはＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰでパルスしたＬ−ＤＲ５３細胞は認識しなかった（図８Ａ）。同様の結果を他の２名のＤＲ４^＋ドナーから得た（表１；ＨＤ４およびＨＤ５）。これらの結果は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰがＨＬＡ−ＤＲ４拘束性Ｔｈ細胞エピトープを含有することを示唆する。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰが他のＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞において応答を誘導するかどうかを調べるため、ＨＬＡ−ＤＲ４陰性健常ドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞を試験した。本発明者らは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰがＨＬＡ−ＤＲ１５拘束性Ｔｈ細胞を生成することを確認した（図８Ｂ）。ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰはまた、ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞も生成する（図８Ｃ）。ＨＬＡ−ＤＰ２を形質導入したＬ細胞は入手できなかった；そのため、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ反応性Ｔｈ細胞クローン（Ｔｈクローン）を樹立し、５名の異なるドナーからの同種ＰＢＭＣをＡＰＣとして使用して、共通のＨＬＡ−ＤＰ分子による拘束を測定した。したがって、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰはＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２に結合し、このことは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰが、日本人／太平洋アジア人における高頻度のＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるＴｈ細胞エピトープを含有することを示唆する（ＳａｉｔｏＳｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ２０００；５６：５２２−９．，ＭａｃｋＳＪｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ２０００；５５：３８３−４００）。

次に、本発明者らは、上述した方法を用いてＣＤＣＡ１（３９−６４）−ＬＰがＨＬＡ−ＤＲ９およびＨＬＡ−ＤＲ１５拘束性Ｔｈ細胞を生成できることを評価し、確認した（図８ＤおよびＥ）。合わせて考慮すると、これらの結果は、これらのオーバーラップするＬＰが、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞を刺激することができることを明らかに示す。この試験において、健常ドナーから生成したＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞は、ＣＤＣＡ１−ＬＰに包埋したＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰに応答しなかった（図８Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）。
これらの結果も、ＣＤＣＡ１（３９−６４）およびＣＤＣＡ１（５５−７８）が、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞を誘導する能力を有することを示した。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）ペプチドはＴｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激する。
ＣＤＣＡ１ペプチド誘導性Ｔｈ細胞をさらに特徴づけるため、本発明者らは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムにより、コグネイトペプチドでのＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的バルクＣＤ４^＋Ｔｈ細胞株の刺激に応答したいくつかのサイトカインを測定した。ドナーからのＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的バルクＨＴＬ株は、コグネイトペプチドでパルスしたＬ−ＤＲ０４０５での再刺激により、大量のＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−１βを産生したが、ＩＬ−４およびＩＬ−７の産生はより少なく、Ｔｈ１の分極特性を示した（図４Ａ〜Ｄ）。興味深いことに、細胞傷害性マーカーＣＤ１０７ａも、コグネイトペプチドで刺激したＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的バルクＴｈ細胞株上で検出することができた（図４Ｅ〜Ｈ）。したがって、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ペプチド特異的Ｔｈ１細胞は、この培養条件において顕著に活性化された。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）およびＣＤＣＡ１（３９−６４）は天然にプロセシングされるエピトープである。
本発明者らは、自己ＤＣがＣＤＣＡ１タンパク質を取り込み、プロセシングして、ＣＤＣＡ１ペプチド特異的Ｔｈ１細胞クローンを刺激することができるかどうかを評価することへと進んだ。ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードした成熟ＤＣを調製し、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＡＰＣとして使用した。図５Ａに示すように、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＣＤＣＡ１（５５−７８）反応性Ｔｈ細胞クローンは、ＣＤＣＡ１タンパク質をロードしたＤＣを効率的に認識し、ＩＦＮ−γを特異的に産生したが、対照タンパク質をロードしたＤＣまたはタンパク質をロードしていないＤＣは認識しなかった。加えて、ＤＣによって提示される天然にプロセシングされたＣＤＣＡ１抗原を認識するこのＴｈ細胞クローンの能力は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって有効にブロックされたが、対照抗ＨＬＡクラスＩ抗体ではブロックされず、エピトープがＨＬＡ−ＤＲ４分子を介して提示されることを確認した。ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性およびＣＤＣＡ１（５５−７８）反応性Ｔｈ細胞クローンを用いて同様の分析を実施した。このＴｈ細胞クローンは、ＣＤＣＡ１タンパク質をロードしたＤＣを効率的に認識し、ＩＦＮ−γを産生したが、対照タンパク質をロードしたＤＣは認識せず、ＨＬＡ−ＤＰ２拘束性Ｔｈ細胞エピトープも、ＤＣにおいてＣＤＣＡ１タンパク質から天然にプロセシングされることを示唆した（図５Ｂ）。

ＨＬＡ−ＤＲ９拘束性ＣＤＣＡ１（３９−６４）反応性Ｔｈ細胞クローンは、ＣＤＣＡ１タンパク質をロードしたＤＣに応答したが、対照タンパク質をロードしたＤＣには応答しなかった。加えて、Ｔｈ細胞のこの応答は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって有効にブロックされたが、対照抗ＨＬＡクラスＩ抗体によってはブロックされず、エピトープがＨＬＡ−ＤＲ９分子を介して提示されることを確認した。
要約すると、全体的な結果は、Ｔｈ細胞エピトープである、ＣＤＣＡ１（５５−７８）およびＣＤＣＡ１（３９−６４）がＣＤＣＡ１タンパク質からＤＣによって天然にプロセシングされ、ＤＣの細胞表面でＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されることを示す。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰは、インビトロおよびインビボでナイーブＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効率的なクロスプライミングを誘導する。
本発明者らは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰが、インビトロでＤＣによるＬＰの交差提示によってＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＴＬを誘導することができるかどうかを評価した。これを確認するため、本発明者らは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードしたＤＣでの刺激によって２名のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来の末梢血ＣＤ８^＋Ｔ細胞からＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＴＬを生成することを試みた。ＬＰをロードしたＤＣでの３回の刺激後、生じたＣＴＬ株におけるＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査した。図６Ａに示すように、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰをロードしたＤＣでの刺激によって生成されるＣＴＬは、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰでパルスしたＴ２細胞での再刺激に応答してＩＦＮ−γを特異的に産生したが、無関係なペプチドでパルスしたＴ２細胞ではＩＦＮ−γを産生しなかった。ＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂでは阻害されず、したがって、本発明者らがインビトロでＤＣによるＬＰの交差提示を通してＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激することに成功したことを示した。

次に、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的細胞を刺激するＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰの能力をインビボで検討した。ＨＬＡ−Ａ２Ｔｇｍを、７日の間隔で、ＩＦＡ中に乳化したＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰを用いて尾の基部で２回または３回免疫した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでの２回目または３回目のワクチン接種の７日後に、鼠径ＬＮにおけるＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数をエクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。図６Ｂに示すように、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでのＨＬＡ−Ａ２Ｔｇｍの２回の免疫によって生成されたＣＴＬは、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣでの再刺激に応答してＩＦＮ−γを特異的に産生したが、無関係なＨＩＶ−Ａ２ペプチドでパルスしたＢＭ−ＤＣではＩＦＮ−γを産生しなかった。加えて、特異的にＩＦＮ−γを産生するＴ細胞の数は、３回目のワクチン接種後に増大した。
合わせて考慮すると、これらの結果は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰが、インビトロでのヒトＤＣおよびインビボでのＨＬＡ−Ａ２ＴｇｍにおけるＢＭ−ＤＣの両方による交差提示後に、有意の割合のＩＦＮ−γを産生するＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＴＬを誘導することを示した。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰによるＣＤＣＡ１特異的およびＨＬＡ拘束性ＣＴＬの誘導の増強
次に、本発明者らは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰがＣＤＣＡ１特異的およびＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導を増強することができるかどうかを試験した。ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＤＲ４陽性ドナーからのＰＢＭＣをＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰとＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）ＳＰ単独の混合物で刺激した場合、これら２つのＳＰ特異的テトラマー^＋細胞の頻度は、それぞれＣＤ８^＋Ｔ細胞の０．０１％および０．０５％であった（図７Ａ）。ＰＢＭＣをＳＰおよびＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰの両方で共刺激した場合、これらのＳＰ特異的テトラマー陽性細胞の頻度は、それぞれ０．０３％および０．１２％に上昇した（ＳＰ単独で刺激したものと比較してそれぞれ３倍および２．４倍の頻度上昇）（図７ＡおよびＢ）。テトラマー^＋細胞の絶対数も、ＳＰ単独で刺激したものと比較して、ＣＤＣＡ１（５５−７８）を添加するだけで有意に増加した（データは示していない）。ＰＢＭＣをこれら２つのＳＰおよびＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈクローンの両方で共刺激した場合、ＳＰ特異的テトラマー^＋細胞の頻度は、それぞれ０．０５％および０．１９％に上昇した（それぞれ５倍および３．８倍の上昇）。さらに、ＰＢＭＣをＳＰ、ＣＤＣＡ１（５５−７８）およびＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈクローンで共刺激した場合、ＳＰ特異的テトラマー^＋細胞の頻度は、それぞれ０．１％および０．６％に有意に上昇した（それぞれ１０倍および１２倍の上昇）。テトラマー^＋細胞の頻度に関して、培養物へのＣＤＣＡ１（５５−７８）ヘルパーペプチドまたはＴｈクローンの添加は、それぞれ頻度のわずかな上昇を誘導したが、これらの両方（ＣＤＣＡ１（５５−７８）＋Ｔｈクローン）の添加は特異的ＣＴＬの頻度を著しく上昇させた。これらの結果は、本発明者らが異なるＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈクローンを使用した場合も再現可能に観察された（データは示していない）。

ＳＰ、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰおよびＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈクローンの混合物での刺激によって成功裏に誘導されたＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬ株を、１４日目にＳＰおよびＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰで再刺激し（３回目の刺激）、ＣＤＣＡ１特異的およびＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを増殖させた。テトラマー^＋細胞の頻度は、特にＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）特異的テトラマー^＋細胞において、それぞれ０．１％および５．４％に有意に上昇した（図７Ｃ、Ｄ）。重要な点として、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生および細胞傷害性マーカーＣＤ１０７ａの両方を、コグネイトペプチドで刺激したこのＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬ株上で検出することができた（図７Ｃ、Ｄ）。

これらの結果は、培養物中のＣＤＣＡ１（５５−７８）Ｔｈ細胞エピトープペプチドまたはＣＤＣＡ１（５５−７８）特異的Ｔｈクローンでの刺激によって活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞が、ＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＴＬおよびＣＤＣＡ１−Ａ２（３５１−３５９）ＳＰ特異的ＣＴＬの両方の誘導を増強することができ、ならびにＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＴｈ細胞クローンの両方の存在下で増強が最大であったことを明らかに示す。

ＣＤＣＡ１−Ａ２４特異的ＣＴＬの誘導に対する相乗効果も、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的テトラマーを使用してＨＬＡ−Ａ２４^＋／ＤＲ１５^＋ＨＤ２において試験した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ特異的バルクＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＤ８^＋Ｔ細胞を、いずれのサイトカインも添加せずに、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ単独（ＳＰ）、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ＋対照ＬＰ（対照ＬＰ＋ＳＰ）またはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ（ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ＋ＳＰ）の存在下で自己ＤＣと共に培養した。ペプチドとの１週間のインビトロ培養後、「材料および方法」の章で述べたように、培養細胞をＨＬＡ−Ａ２４（Ａ^＊２４：０２）／ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）複合体のテトラマーおよび抗ヒトＣＤ８ｍＡｂで染色した。図７Ｅに示すように、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ＋ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ（ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰ＋ＳＰ）の添加は、ＳＰ単独または対照ＬＰ＋ＳＰの添加と比較して、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数を有意に増加させた。これらの結果は、活性化されたＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞がＣＤＣＡ１−Ａ２４特異的ＣＴＬの誘導を増強できる可能性があることを示唆する。
合わせて考慮すると、これらの結果は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰおよびＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでの刺激による活性化ＣＤＣＡ１特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、個々にまたは協力して、ＣＤＣＡ−１特異的およびＨＬＡ拘束性ＣＴＬの誘導を増強し得ることを明らかに示した。

ＣＤＣＡ１−ＬＰはＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの効率的な増殖を誘導する。
次に、ＣＤＣＡ１−ＬＰがＣＤＣＡ１特異的バルクＣＴＬの増殖を誘導し得る可能性を評価した。ＨＤ２（ＨＬＡ−Ａ２４^＋／ＤＲ１５^＋）の精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞から生成したＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的バルクＣＴＬを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでパルスした自己ＤＣと共に１週間培養した。図９Ａに示すように、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）テトラマー^＋ＣＤ８^＋細胞の集団は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでパルスしたＤＣでの刺激によって増殖したが、対照ＬＰでパルスしたＤＣでバルクＣＴＬを刺激した場合は減少した。同様の結果をＩＦＮ−γ ＥＬＳＰＯＴアッセイにおいてＨＬＡ−Ａ２４^＋／ＤＲ４^＋ＨＤ５から得た（図９Ｂ）。この実験の詳細な方法は「材料および方法」の中で述べられている。

本発明者らはまた、ＣＤＣＡ１−ＬＰが、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者のＰＢＭＣにおいてＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬのインビトロでの増殖を誘導することができるかどうかを試験した。ワクチン接種したＨＮＣ患者からのＰＢＭＣを、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物と共に培養した。ＨＮＣ２９から単離した新鮮なＰＢＭＣを、インビトロ培養（エクスビボ）の前にＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的テトラマーで染色した場合、テトラマー^＋細胞の頻度はＣＤ８^＋Ｔ細胞の０．０９％に過ぎなかった。興味深いことに、ＨＮＣ２９からのＰＢＭＣ中のテトラマー^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰとＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰの混合物でのＰＢＭＣの１週間のインビトロ刺激によって有意に増殖した。ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの頻度はＣＤ８^＋Ｔ細胞の３．０７％に上昇した（図９Ｃ；７日目）。培養した細胞をＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰで刺激した場合、Ｔ細胞のＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＩＦＮ−γ産生も検出された（図９Ｃ；棒グラフ、７日目）。同様の結果がＨＮＣ２６、３１、３９および１０９においても得られた（図９Ｄ〜Ｇ）。これらの結果は、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬの増殖がＤＣによるＣＤＣＡ１−ＬＰの交差提示によって誘導され得ることを示唆する。

ＣＤＣＡ１−ＬＰの交差提示はインビトロおよびインビボでＣＤＣＡ１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を効率的にプライミングする。
ＤＣによるＣＤＣＡ１−ＬＰの交差提示を、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的テトラマー^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ応答に関連して評価した。交差提示することはできないが、生存ＤＣと同程度に効率的にＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰを提示することができる固定ＤＣ（図１０Ａ、固定ＤＣ＋ＳＰ）を、Ｔ細胞応答におけるＬＰ分解産物の外因的提示の寄与を排除するまたは評価するために使用した。ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ（図１０Ａ）およびＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ（図１０Ｂ）は、非固定ＤＣ（ＤＣ＋ＬＰ）によって交差提示された場合にのみ、有意の割合のＩＦＮ−γ分泌性テトラマー^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘導した。ＣＤＣＡ１−ＬＰでパルスした固定ＤＣは、無関係なＬＰでパルスした非固定ＤＣと同様に、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的ＣＴＬを刺激することができなかった（固定ＤＣ＋ＬＰおよびＤＣ＋無関係なＬＰ）。

ＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬのクロスプライミングを調べるため、本発明者らは、ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰがＣＤＣＡ１−Ａ２４特異的ＣＴＬをプライミングすることができるかどうかを検討した。ＣＤＣＡ１−ＬＰでパルスした固定ＤＣは、無関係なＬＰでパルスした非固定ＤＣと同様に、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）特異的ＣＴＬを刺激することができなかった（固定ＤＣ＋ＬＰおよびＤＣ＋無関係なＬＰ）。ＣＤＣＡ１（５５−７８）−ＬＰをロードしたＤＣも、ＨＬＡ−Ａ２４^＋／Ａ２^＋／ＤＲ４^＋ドナー（ＨＤ５；図６Ｃ）においてＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的ＣＴＬおよびＣＤＣＡ１−Ａ２（６５−７３）ＳＰ特異的ＣＴＬをプライミングすることができた。

ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰでワクチン接種したＨＬＡ−Ａ２４ＴｇｍのＣＤ８^＋Ｔ細胞も、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣおよびＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞での刺激に応答してＩＦＮ−γを特異的に産生した（図６Ｄ、左側のパネル）。ＨＬＡ−Ａ２４ＴｇｍをＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰでワクチン接種した場合も同様の結果を得た（図６Ｄ、右側のパネル）。ＨＬＡ−Ａ２４ＴｇｍのＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰ特異的スポットの数はＨＬＡ−Ａ２Ｔｇｍのものよりも少なかったので、ＨＬＡ−Ａ２４Ｔｇｍを２倍量のＣＤＣＡ１−ＬＰで免疫した。さらに、ＣＤＣＡ１−ＬＰでのワクチン接種は、ＳＰ特異的ＣＴＬの誘導においてＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰを上回っていた（図６Ｅ）。これらの結果は、ＣＤＣＡ１−ＬＰの取込み後、ＡＰＣがインビトロおよびインビボでＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬをクロスプライミングできることを明らかにする。

ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでワクチン接種したＨＮＣ患者におけるＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞の存在
がん免疫療法に関連して、拘束性エピトープを使用したワクチンが、ワクチン中には存在しない抗原に対する幅広いＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を生じさせ得ることを示唆する強力な証拠が存在する（ＣｏｒｂｉｅｒｅＶ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１１；７１：１２５３−６２．，ＲｉｂａｓＡ，ｅｉａｌ．ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ２００３；２４：５８−６１．，ＨｕｎｄｅｒＮＮ，ｅｔａｌ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２００８；３５８：２６９８−７０３）。そこで、本発明者らは、ＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞応答がＣＤＣＡ１由来のＣＴＬエピトープペプチドでのワクチン接種によって効率的に誘導され得ると考えた。患者におけるＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞応答を検出するため、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）でワクチン接種した１６名のＨＮＣ患者およびワクチン接種前の７名のＨＮＣ患者から単離したＰＢＭＣを採取した。ドナーの特徴を図１１Ｆの表に要約する。ＣＤＣＡ１−ＬＰでのＰＢＭＣの１週間のインビトロ刺激後、個々のＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（図１１Ａ）。１０名の健常ボランティアから単離したＰＢＭＣを対照として使用した。ＩＦＮ−γ分泌細胞の数が陰性対照の少なくとも２倍である場合に応答を陽性とみなした。
有意の頻度のＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的免疫応答がＨＮＣ患者において観察されたが（ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ、１９名のうち１４名、７４％；ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ、１９名のうち１３名、６８％；図１１ＢおよびＦ）、１０名の健常ドナーではＣＤＣＡ１−ＬＰに対する特異的ＩＦＮ−γ応答は検出されなかった。ワクチン接種前の数名の患者において、ＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞応答が検出可能であった（ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ、７名のうち２名、２９％；ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ、７名のうち２名、２９％；図１１Ｆ）。他方で、ＣＤＣＡ１−Ａ２４（５６−６４）ＳＰでのワクチン接種後の多くのＨＮＣ患者において、ＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞応答が検出された（ＣＤＣＡ１（３９−６４）ＬＰ、１６名のうち１２名、７５％；ＣＤＣＡ１（５５−７８）ＬＰ、１６名のうち１２名、７５％；図１１Ｆ）。ワクチン接種後の患者におけるＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の数は、ワクチン接種前の患者および健常ドナーにおけるよりも有意に多かった（図１１Ｃ）。Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡクラスＩＩｍＡｂの添加によって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡクラスＩｍＡｂによっては阻害されなかった（図１１Ｄ）。これらの結果は、ＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的ＩＦＮ−γ産生がＣＤＣＡ１−ＬＰ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞に由来したことを示す。興味深いことに、一部のＨＮＣ患者では反復ワクチン接種によってＣＤＣＡ１−ＬＰに対する特異的応答が誘導または増大された（図１１Ｅ）。これらの所見は、ＡＰＣが、ワクチンが誘導したＣＴＬによって死滅した腫瘍細胞に由来するＣＤＣＡ１抗原を収集し、プロセシングして、その後インビボでＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ細胞を活性化したことを示唆する。

考察
最も魅力的なワクチン化合物は、治療的ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋応答を誘導することができるＴＡＡの配列に対応する合成ＬＰであると考えられる（ＭｅｌｉｅｆＣＪａｎｄｖａｎｄｅｒＢｕｒｇＳＨ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２００８；８：３５１−６０．，ＫｅｎｔｅｒＧＧ，ＷｅｌｔｅｒｓＭＪ，ｅｔａｌ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２００９；３６１：１８３８−４７）。これらのＬＰの注射後、患者のＤＣがＬＰを取り込み、プロセシングして、様々なＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩにおいてすべての可能なＣＴＬエピトープおよびＴｈエピトープをそれぞれ提示すると考えられる。したがって、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、最も一般的に認められるＨＬＡによって拘束されるＣＴＬおよびＴｈ１細胞の両方を誘導することができる単一ポリペプチドであるべきだと考えた。

この試験において、本発明者らは、プロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１細胞によって認識されるＣＴＬエピトープを含むＣＤＣＡ１由来のＬＰを同定した。
結論として、本発明者らは、ＣＤＣＡ１特異的Ｔｈ１細胞だけでなく交差提示によってＣＤＣＡ１特異的ＣＴＬも増殖させ、活性化するための良好なツールとなる、ＣＴＬエピトープを含むＣＤＣＡ１由来のヘルパーペプチドを初めて同定した。これらの所見は、今後、様々な種類のがんに対するＣＤＣＡ１ペプチドに基づく免疫療法の臨床試験に寄与するであろう。

本発明は、強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、したがって多種多様ながん型に適用可能性を有する、ＣＤＣＡ１由来のＴｈ１細胞エピトープペプチドを記述する。そのようなペプチドは、がん、特にＣＤＣＡ１を発現するがんに対するペプチドワクチンとしてのさらなる開発に値する。本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞応答を誘導することができ、したがってＴｈ１細胞によって分泌されるサイトカインが、抗原依存的に細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞を助けるかまたは活性化することができる。それゆえ、本発明によって提供される免疫治療戦略は、疾患がＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答によって改善され得る限り、がんを含む任意の疾患に適用することができる。特に、本発明のＴｈ１細胞は、ＣＴＬによって惹起される免疫応答を改善することができる。それゆえ、本発明のペプチドは、対象においてがんを含む疾患に対するＣＴＬ応答を増強するのに有益である。
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、Ｔｈ１細胞だけでなく、ＣＤＣＡ１発現細胞に対するＣＴＬも誘導することができる。本発明のそのようなペプチドは、ＣＤＣＡ１に関連する疾患、例えばがん、より詳細には乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部がん（ＨＮＣ）の治療のためにも有用であり得る。

本発明を、詳細におよびその特定の態様を参照して本明細書で説明したが、前記説明は本質的に例示的および説明的であり、本発明とその好ましい態様を例証することを意図する。日常的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。

Claims

１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：１０のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：１または２のアミノ酸配列から選択される９を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を誘導する能力を有するペプチド。
前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択される、請求項２に記載の単離されたペプチド。
ＣＤＣＡ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
（ａ）配列番号：１および２から成る群より選択されるアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離されたペプチド。
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
から成る群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、請求項１から５のいずれか一項に記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、ならびに
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ２から成る群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与用に製剤化されている、請求項８に記載の医薬組成物。
ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、請求項８または９に記載の医薬組成物。
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物。
Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、ＡＰＣを請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む方法。
ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
Ｔｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
ＣＴＬを誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、請求項４または５に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項４または５に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法。
ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
請求項１２または１３に記載の方法によって誘導されるＡＰＣ。
ＡＰＣの表面に提示された請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたＴｈ１細胞。
請求項１４に記載の方法によって誘導されるＴｈ１細胞。
がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）前記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物を前記対象に投与する段階を含む方法。
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
請求項２３に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２２に記載の抗体を含む、診断キット。