JP6255593B2 - Th1細胞のCDCA1エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン - Google Patents
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Description
優先権
本出願は、2012年7月10日出願の米国特許仮出願第61/669,971号の恩典を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
最近、肺がん患者のPBMCから腫瘍反応性かつHLA−A2(A*02:01)拘束性の細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導することができる高度免疫原性のCDCA1由来のCTLエピトープ(非特許文献17、特許文献6)が同定された。さらに、CDCA1由来のHLA−A24拘束性CTLエピトープも同定されている(特許文献7)。それゆえ、CDCA1は、がん免疫療法に適用できる依然として魅力的な標的分子である。
腫瘍特異的CD4+ヘルパーT(Th)細胞、特にTヘルパー1型(Th1)細胞は、CTL媒介性抗腫瘍免疫の効率的な誘導に重要な役割を果たす(非特許文献18)。Th1細胞によって主として産生されるIFN−γは、長く持続するCTL応答の誘導と維持のために必須であり、免疫記憶の維持において重要な多数の相互作用を通して支援を提供する(非特許文献19、20)。Th1細胞によって分泌されるIFN−γは、直接の抗腫瘍作用または抗血管新生作用も媒介する(非特許文献21)。さらに、Th細胞は、腫瘍部位におけるCTLの侵入のために道を開かなければならないことが示されている(非特許文献22)。それゆえ、特異的Th1細胞を活性化することができる腫瘍関連抗原(TAA)由来Th細胞エピトープの同定は、腫瘍担持宿主における有効な腫瘍免疫の誘導のために重要である;理想的には、有効なワクチンの設計は、CTLとTh1細胞の両方を刺激する複数のエピトープを含むべきである(非特許文献23)。しかしながら、CDCA1に由来するそのようなエピトープは未だ同定されていない。
[1]10〜30アミノ酸長を有し、配列番号:10のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって:
(a)配列番号:1または2のアミノ酸配列から選択される9を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Tヘルパー1型(Th1)細胞を誘導する能力を有するペプチド。
[2]前記ペプチドまたはその断片が少なくとも2種類のMHCクラスII分子に結合する能力を有する、[1]に記載の単離されたペプチド。
[3]前記MHCクラスII分子がHLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2から成る群より選択される、[2]に記載の単離されたペプチド。
[4]前記ペプチドが、CDCA1特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、[1]から[3]のいずれか1つに記載の単離されたペプチド。
[5]前記ペプチドが、
(a)配列番号:1および2から成る群より選択されるアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、[4]に記載の単離されたペプチド。
[6][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
[7]
(i)Th1細胞、
(ii)CTL、
(iii)Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)、および
(iv)CTLを誘導する能力を有するAPC
から成る群より選択される細胞の少なくとも1つを誘導するための組成物であって、[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物、または
(i)Th1細胞、
(ii)CTL、
(iii)Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)、および
(iv)CTLを誘導する能力を有するAPC
から成る群より選択される少なくとも1種類の細胞を誘導するための組成物であって、[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[8]
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有し、ならびに
(i)がんの治療、
(ii)がんの予防、
(iii)がんにおける術後再発の予防、および
(iv)上記(i)から(iii)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
[9]前記組成物が、MHCクラスII分子としてHLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2から成る群より選択される少なくとも1つを有する対象への投与のために製剤化されている[8]に記載の医薬組成物、または前記組成物が、HLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2から成る群より選択される少なくとも1つのMHCクラスII分子を有する対象への投与のために製剤化されている[8]に記載の医薬組成物。
[10]前記組成物が、CTL誘導能を有する1つまたは複数のペプチドをさらに含有する、[8]または[9]に記載の医薬組成物。
[11]MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有する組成物。
[12]Th1細胞を誘導する能力を有するAPCを誘導するための方法であって、APCを[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む方法。
[13]CTLを誘導する能力を有するAPCを誘導するための方法であって、
(a)APCを[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階;および
(b)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
[14]Th1細胞を誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞を、MHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するAPCと共培養する段階;および
(b)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階であって、ここでTCRが、細胞表面に提示されるMHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法、またはTh1細胞を誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞を、MHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するAPCと共培養する段階;および
(b)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードする単一ポリヌクレオチド、または各々別々のTCRサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階であって、ここでTCRが、APCの細胞表面に提示されるMHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
[15]CTLを誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方を、[4]または[5]に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階;ならびに
(b)CD8陽性T細胞を、[4]または[5]に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
[16]MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法。
[17]MHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたAPC。
[18][12]または[13]に記載の方法によって誘導されるAPC。
[19]APCの表面に提示された[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたTh1細胞。
[20][14]に記載の方法によって誘導されるTh1細胞。
[21]がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法。
[22][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
[23][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
[24][23]に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
[25][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチド、[6]に記載のポリヌクレオチドまたは[22]に記載の抗体を含む、診断キット。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本発明が本明細書で述べる特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本記載で用いる用語は、特定のバージョンまたは態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
本明細書で使用する「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という語は、特に明確に示されない限り「少なくとも1つの」を意味する。
「剤」および「組成物」という用語は、本明細書では、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接または間接的に生じる任意の生成物を指すために互換的に使用される。医薬組成物に関するそのような用語は、有効成分、および担体を構成する不活性成分を含む生成物、ならびに成分の任意の2つもしくはそれ以上の組合せ、錯体形成もしくは凝集から、または成分の1つもしくは複数の解離から、または成分の1つもしくは複数の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と医薬的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を含むがこれらに限定されない、医薬的または生理学的に許容される材料、組成物、物質またはビヒクルを意味する。
特に定義されない限り、「Tリンパ球」および「T細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
特に定義されない限り、「HLA−DR9」という用語はサブタイプを指し、その例には、HLA−DRB1*09:01、HLA−DRB1*09:02、HLA−DRB1*09:03、LA−DRB1*09:04、HLA−DRB1*09:05、HLA−DRB1*09:06、HLA−DRB1*09:07、HLA−DRB1*09:08およびHLA−DRB1*09:09が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「HLA−DR15」という用語はサブタイプを指し、その例には、HLA−DRB1*15:01、HLA−DRB1*15:02、HLA−DRB1*15:03、HLA−DRB1*15:04、HLA−DRB1*15:05、HLA−DRB1*15:06、HLA−DRB1*15:07、HLA−DRB1*15:08、HLA−DRB1*15:09、HLA−DRB1*15:10およびHLA−DRB1*15:11が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「HLA−DP2」という用語はサブタイプを指し、その例にはHLA−DPB1*0201およびHLA−DPB1*02:02が含まれるが、これらに限定されない。特に定義されない限り、「MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答」という語句は、MHCクラスII分子によるペプチドの提示によって誘導される免疫応答を指す。本明細書では、「MHCクラスII抗原によって媒介される免疫応答」は、CD4+T細胞、特にTh1細胞によって誘導される免疫応答を含む。そのような免疫応答の例には、サイトカイン(例えばIFN−γ、IL−2、TNF−β、GM−CSF、TNF−α等)の産生ならびに他の免疫細胞(例えばCTL、マクロファージ等)の活性化および/または刺激が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「CDCA1特異的CTL」という語句は、CDCA1を発現する標的細胞に対して特異的に細胞傷害性を示すCTLを指す。
特に定義されない限り、ペプチドに関連して使用される場合、「CTL誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合CTLを誘導するペプチドの能力を指す。
特に定義されない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬と他の材料の組合せに関して用いられる。キットは、マイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが本明細書で企図される。「キット」という用語は、試薬および/または材料の特定の組合せに限定されることを意図しない。
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下で詳細に説明する本発明のペプチドは、「CDCA1ペプチド」または「CDCA1ポリペプチド」と称され得る。
CDCA1に由来するペプチドがTヘルパー1型(Th1)細胞によって認識される抗原として機能することを明らかにするため、CDCA1に由来するペプチド(配列番号:10)を、これらがMHCクラスII分子によってプロミスキャスに拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定するために分析した。
CDCA1に由来するプロミスキャスなMHCクラスII結合ペプチドの候補を、HLA−DR4、HLA−DR15およびHLA−DP2への結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをロードした樹状細胞(DC)によるCD4+T細胞のインビトロ刺激後、以下のペプチドの各々を用いてTh1細胞を成功裏に樹立した:
CDCA1/IVYGIRLEHFYMMPVNSEVMYPHL(55−78;配列番号:1)、および
CDCA1/NPKPEVLHMIYMRALQIVYGIRLEHF(39−64;配列番号:2)。
したがって、本発明は、CDCA1に特異的なTh1細胞を誘導する能力を有するペプチドを提供する。
したがって、本発明のペプチドは、Th1細胞を誘導する能力を有するペプチドであり得、そのようなペプチドは以下から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む:
(a)配列番号:1または2のアミノ酸配列からの9個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列;および
(b)1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている(a)のアミノ酸配列。
[1]10〜30アミノ酸長を有し、配列番号:10のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
(a)配列番号:1または2のアミノ酸配列から選択される9を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列;および
(b)1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている(a)のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Th1細胞を誘導する能力を有するペプチド;
[2]前記ペプチドまたはその断片が少なくとも2種類のMHCクラスII分子に結合する能力を有する、[1]に記載の単離されたペプチド;
[3]前記MHCクラスII分子がHLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2から成る群より選択される、[2]に記載の単離されたペプチド;
[4]前記ペプチドが、CDCA1特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、[1]から[3]のいずれか1つに記載の単離されたペプチド;ならびに
[5]前記ペプチドが、
(a)配列番号:1および2から成る群より選択されるアミノ酸配列;ならびに
(b)1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている(a)のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、[4]に記載の単離されたペプチド。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えばCreighton,Proteins 1984参照)。
例えば、本発明は、HLAクラスII抗原に結合し、Th1細胞誘導能を有し、配列番号:1および2から成る群より選択されるアミノ酸配列において1、2または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を含む、31、30、29、28、27または26未満のアミノ酸長の単離されたペプチドを提供する。
これらのペプチドはまた、APCと接触するかまたはAPCに導入された場合、APC中でプロセシングされて、プロセシングされた断片をその上に提示し得る。例えば、本発明のペプチドは、APCの表面に提示される通常11〜26(典型的には15〜25)アミノ酸残基から成る断片にプロセシングされ得る。
したがって、好ましい態様では、配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にHLA−DR4、HLA−DR15またはHLA−DP2を有すると同定された対象においてTh1細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号:2のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にHLA−DR9またはHLA−DR15を有すると同定された対象においてTh1細胞の誘導のために使用し得る。
本発明のペプチドは周知の技術を用いて調製することができる。例えば、本発明のペプチドは、組換えDNA技術または化学合成を用いて、合成によって調製することができる。本発明のペプチドは、個別にまたは2もしくはそれ以上のペプチドから成るより長いポリペプチドとして合成することができる。本発明のペプチドを、次に、他の天然の宿主細胞タンパク質およびその断片、または他の何らかの化学物質を実質的に含まないようにするために、単離する、すなわち精製することができる。
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966;
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976;
(iii)「ペプチド合成」(日本語)、丸善、1975;
(iv)「ペプチド合成の基礎と実験」(日本語)、丸善、1985;
(v)「医薬品の開発」(日本語)、続第14巻(ペプチド合成)、広川書店、1991;
(vi)国際公開第99/67288号;および
(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,「Solid Phase Peptide Synthesis」,Academic Press,New York,1980,100−118。
本発明はまた、本発明の前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のCDCA1遺伝子(GenBankアクセッション番号NM_145697(配列番号:9))に由来するポリヌクレオチド、ならびにその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書では、「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重に起因して、数多くの機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく前述した対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である、「サイレント変異」である。ペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各々のコドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識する。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の開示される配列において暗黙のうちに表現される。
本発明はまた、HLAクラスII抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞(APC)も提供する。本発明のペプチドと接触させることによって得られるAPCは、治療および/または予防の対象である患者に由来することができ、それだけでまたは本発明のペプチド、Th1細胞またはCTLを含む他の薬剤と組み合わせてワクチンとして投与することができる。
a:最初の対象からAPCを回収する段階、
b:段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階、および
c:ペプチドをロードしたAPCを2番目の対象に投与する段階
を含み得る。
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されるTh1細胞は、インビボでがん細胞を標的とするCTLを含むエフェクター細胞のいずれかの免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法で、ワクチンとして役立つ。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導されるまたは活性化される単離されたTh1細胞も提供する。
本発明のペプチドの断片のいずれかに対して誘導される細胞傷害性T細胞は、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法でワクチンとして使用することができる。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化される、単離された細胞傷害性T細胞を提供する。
本発明はまた、T細胞受容体(TCR)のサブユニットを形成することができる1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する組成物、およびこれを使用する方法を提供する。そのようなTCRサブユニットは、CDCA1ペプチドを提示するAPCに対する特異性をCD4+T細胞に付与するTCRを形成する能力を有する。当技術分野において公知の方法を用いることにより、本発明のペプチドによって誘導されるTh1細胞のTCRサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる(国際公開第2007/032255号およびMorgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。誘導体TCRは、CDCA1ペプチドを提示するAPCに高い結合力で結合することができ、場合により効率的なサイトカイン産生を媒介することができる。
本発明の方法および組成物ががんの「治療」に関連して有用性を有する限り、治療が臨床上の利益、例えばCDAC1遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率または転移能の低減を導く場合、治療は「有効」とみなされる。治療が予防的に適用される場合、「有効」は、がんの形成を遅延させるもしくは予防するまたはがんの臨床症状を予防するもしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断するまたは治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
本発明の方法および組成物ががんの「予防」(preventionおよびprophylaxis)に関連して有用性を有する限り、そのような用語は、本明細書では、疾患による死亡率または罹患率の負荷を低減させる任意の行為を指すために互換的に使用される。予防(preventionおよびprophylaxis)は、「一次、二次および三次予防レベルで」行われ得る。一次予防(preventionおよびprophylaxis)は疾患の発生を回避し、一方二次および三次レベルの予防(preventionおよびprophylaxis)は、疾患の進行および症状の出現の予防(preventionおよびprophylaxis)、ならびに機能を回復させ、疾患に関連する合併症を減少させることによって既存の疾患の負の影響を低減することを目指す行為を包含する。あるいは、予防(preventionおよびprophylaxis)は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減すること、血管新生を減少させることを目指す広範囲の予防的治療を含む。
さらに、本発明のペプチドの少なくとも1つを含有する薬剤または組成物は、MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するのに使用することができる。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分の使用を提供する。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分を提供する。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分と医薬的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分を医薬的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程も提供する。
本発明の薬剤または医薬組成物によって治療されるべきがんまたは腫瘍には、限定されないが、そのようながんの好ましい例には、例えば乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん(SCLC)、非小細胞肺がん(NSCLC)および頭頸部がん(HNC)を含む、CDCA1を発現する任意の種類のがんまたは腫瘍が含まれる。
本発明のペプチドは、薬剤もしくは医薬組成物として直接投与することができるか、または必要な場合は、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬剤に通常使用される担体、賦形剤などが、特に制限されることなく適宜含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬剤または医薬組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有し得る。本発明の薬剤または医薬組成物は抗がん目的に用いることができる。
本発明の別の態様では、本発明のペプチドはまた、医薬的に許容される塩の形態で投与し得る。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸(例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸等)との塩、および無機酸(例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等)との塩が含まれる。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される塩」という語句は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、無機酸または無機塩基、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等との反応によって得られる塩を指す。
本発明のペプチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は0.001mg〜1000mg、例えば0.01mg〜100mg、例えば0.1mg〜10mg、例えば0.5mg〜5mgであり、数日から数ヶ月に1回投与することができる。当業者は、適切で最適な用量を容易に決定することができる。
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、本明細書で開示するペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で含有し得る。本明細書では、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様では、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定な組み込みを達成するのに必要なものを備え得る(相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51:503−12参照)。例えば、Wolff et al.,Science 1990,247:1465−8;米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,804,566号;同第5,739,118号;同第5,736,524号;同第5,679,647号;および国際公開第98/04720号参照。DNAに基づく送達技術の例には、「裸のDNA」、促進(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性送達が含まれる(例えば米国特許第5,922,687号参照)。
本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のAPCおよびTh1細胞を誘導するために使用できる。本発明のAPCはまた、本発明のTh1細胞を誘導するためにも使用できる。ペプチド、ポリヌクレオチドおよびAPCは、任意の他の化合物がこれらのTh1細胞誘導能を阻害しない限り、任意の他の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の前記薬剤または医薬組成物のいずれかを、Th1細胞を誘導するために使用でき、それに加えて、ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものも、以下で論じるようにAPCを誘導するために使用できる。
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してAPCを誘導する方法を提供する。APCの誘導は、「VI.抗原提示細胞」の章で上述したように実施することができる。本発明はまた、Th1細胞誘導能を有するAPCを誘導するための方法も提供し、前記APCの誘導は、「VI.抗原提示細胞」、前出の項目でも言及されている。
あるいは、本発明は、Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)を調製するための方法であって、以下の段階:
(a)APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
の1つを含み得る方法を提供する。
あるいは、本発明は、Th1細胞誘導能を有するAPCを誘導するための方法であって、
(a)APCを本発明のペプチドと接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、APCを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
好ましい態様では、本発明のペプチドは、Th1応答を誘導するだけでなく、それらをプロセシングした後にCTL応答も誘導する。したがって、好ましい態様では、本発明の方法によって調製されるAPCは、がん細胞を含む、CDCA1発現細胞に対するCTLを誘導するためにも有用であり得る。例えば、配列番号:3のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、HLA−A2を発現するAPCがCDCA1特異的CTLを誘導するのに適する。あるいは、配列番号:5のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、HLA−A24を発現するAPCがCDCA1特異的CTLを誘導するのに適する。
さらに、本発明は、本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドもしくはその断片を提示するAPCを用いてTh1細胞を誘導するための方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとHLAクラスII抗原の複合体を認識するT細胞受容体(TCR)サブユニットを形成することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してTh1細胞を誘導するための方法も提供する。好ましくは、Th1細胞を誘導するための方法は、
a:CD4陽性T細胞を、HLAクラスII抗原と本発明のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞と接触させる段階、および
b:TCRが本発明のペプチドまたはその断片とHLAクラスII抗原の複合体を認識するまたは複合体に結合することができる、TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階
から成る群より選択される少なくとも1つの段階を含む。
a:対象からAPCを回収する段階;
b:段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階;
c:段階bのAPCをCD4+T細胞と混合し、Th1細胞を誘導するために共培養する段階;および
d:段階cの共培養物からCD4+T細胞を回収する段階
を含み得る。
さらに、Th1細胞は、TCRが本発明のペプチドまたはその断片とHLAクラスII抗原の複合体に結合することができる、TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入することによって誘導できる。そのような形質導入は、「VIII.T細胞受容体(TCR)」の章で上述したように実施することができる。
a:CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方を、本発明のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階;ならびに
b:CD8陽性T細胞を本発明のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階
から成る群より選択される少なくとも1つの段階を含む方法を提供する。
CTLを誘導するそのような方法では、本発明のペプチドはAPC内でプロセシングされてCTLエピトープペプチドを生成し、生成されたCTLエピトープペプチドはAPCの表面に提示される。
i)治療されるべきがんを有する対象から得たがん細胞または組織におけるCDCA1の発現レベルを測定する段階;
ii)CDCA1の発現レベルを正常対照と比較する段階;および
iii)上記(a)〜(d)から成る群より選択される少なくとも1つの成分を、正常対照と比較してCDCA1を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階
を含み得る方法を提供する。
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドを投与する前に対象のHLA型を同定し得る。例えば、配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはHLA−DR4、HLA−DR15またはHLA−DP2を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号:2のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはHLA−DR9またはHLA−DR15を有すると同定された対象に投与する。
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
詳細には、本発明の方法に使用するプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中等度にストリンジェントな条件下または低ストリンジェントな条件下でCDCA1のmRNAにハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で認められる。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHで特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がpH 7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン(または他の塩)であり、および温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成し得る。
翻訳産物に基づきCDCA1遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、CDCA1タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学分析を介して染色の強度を測定し得る。すなわち、この測定では、強い染色は、タンパク質の存在/レベルの増大、および同時に、CDCA1遺伝子の高い発現レベルを指す。
がん細胞における標的遺伝子、例えばCDCA1遺伝子の発現レベルは、標的遺伝子の対照レベル(例えば正常細胞におけるレベル)から、例えば10%、25%もしくは50%増大している場合、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超もしくはそれ以上に増大している場合、増大していると決定され得る。
より詳細には、本発明は、(i)対象が治療されるべきがんを有するか否かを診断する、および/または(ii)がん治療のための対象を選択する方法であって、
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるCDCA1の発現レベルを測定する段階;
b)CDCA1の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c)CDCA1の発現レベルが正常対照レベルと比較して増大している場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む方法を提供する。
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるCDCA1の発現レベルを測定する段階;
b)CDCA1の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
c)CDCA1の発現レベルががん性対照レベルと類似または同等である場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
(a)CDCA1遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)CDCA1タンパク質を検出するための試薬;および
(c)CDCA1タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
の群より選択される。
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない(または弱く結合する)。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後判定アッセイならびに画像化法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、CDCA1ががん患者において発現されるまたは過剰発現される限り、他のがんの治療、診断および/または予後判定において使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体(例えば一本鎖抗体)は、CDCA1の発現が関与するがんを処置する際に治療的に使用され得、その例には、乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん(SCLC)、非小細胞肺がん(NSCLC)および頭頸部がん(HNC)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、本発明のポリペプチドの完全なペプチドおよび部分ペプチドは免疫化抗原として役立ち得る。適切な部分ペプチドの例には、例えば本発明のペプチドのアミノ(N)末端断片またはカルボキシ(C)末端断片が含まれる。
上記免疫細胞と骨髄腫細胞を公知の方法に従って、例えばMilstein et al.の方法(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73:3−46(1981))に従って融合させることができる。
あるいは、抗体を産生する、免疫リンパ球などの免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用してもよい。
本発明によるペプチドの検出または測定の方法は、ペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法はペプチドを用いる様々な実験で使用することができる。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、本発明のペプチドを発現するためまたは遺伝子治療のために本発明のヌクレオチドを投与するための、宿主細胞における本発明のヌクレオチド、特にDNAの担体として有用である。
細胞株および抗体
TAP欠損およびHLA−A2陽性細胞株T2をRiken Cell Bankから購入した。抗原提示細胞(APC)として、DR1(DRB1*01:01);L−DR1、DR4(DRB1*04:05);L−DR4、DR8(DRB1*08:03);L−DR8、DR15(DRB1*15:02);L−DR15またはDR53(DRB4*01:03);L−DR53のいずれかを発現するように遺伝的に操作されたマウス線維芽細胞株であるL細胞を使用した。微量の内因性HLAクラスI分子を発現するヒトBリンパ芽球様細胞株C1RのHLA−A24形質転換体であるC1R−A2402細胞は、滝口雅文博士(熊本大学、熊本、日本)より贈られた。T2細胞およびC1R−A2402細胞を標的細胞として使用した。これらの細胞を、37℃、5%CO2雰囲気で、10%FCSを添加したDMEM(L細胞)またはRPMI 1640(T2およびC1R−A24細胞)中にインビトロで維持した。
2つのペプチドワクチン治験に登録した19名のHNC患者から血液試料を採取し、CDCA1−LPに反応性のTh細胞の免疫応答を調べた。がん精巣抗原に由来する3つのHLA−A24結合SP(臨床グレードの9〜10アミノ酸長ペプチド)、CDCA1(CDCA1−A24(56−64)、本試験で報告した、図1)、IMP−3(IMP−3−A24(508−516))およびLY6K(LY6K−A24(177−186))(Suda T,et al.Cancer Sci 2007;10:1803−8)を用いたがん免疫療法のこれらの第I/II相臨床試験は、熊本大学(熊本、日本)の治験審査委員会によって審査され、承認された。ペプチド(各抗原1mg)をMontanide ISA51 500μL中に乳化し、0、7、14、28、42、56、63および70日目、その後は腫瘍の進行または毒性が観察されるまで月に1回、皮下(s.c.)注射する。すべてのHNC患者を、書面によるインフォームドコンセントを得た後、HLA−A24の保有に基づいて選択した。患者は、再発性または転移性腫瘍を有する手術不可能な進行HNCに罹患しており、標準的な治療に抵抗性であった;これらの患者を大学病院医療情報ネットワーク臨床試験登録システム(UMIN−CTR)番号000008379(CTR−8379)の下で治験に登録した。根治的切除術を受けたHNC患者は、UMIN−CTR番号000008380(CTR−8380)の下で治験に登録した。後者の治験では、HNC患者を、S−1、イフォスファミドまたはドキソルビシンと組み合わせた術後ペプチドワクチン免疫療法で治療した。これらの臨床試験および解析は進行中である。
潜在的なプロミスキャスHLA−DRまたはHLA−DPに結合するヒトCDCA1由来ペプチドを予測するため、コンピュータアルゴリズム(IEBD解析リソース、コンセンサス法、http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)を用いてヒトCDCA1タンパク質のアミノ酸配列を解析した(Wang P et al.BMC Bioinformatics;11:568.,Wang P et al.PLoS Comput Biol 2008;4:e1000048)。プログラムは、タンパク質全体を包含する15アミノ酸長配列のオフセットを解析した。DRB1*04:05、DRB1*15:02またはDPB1*02:01アリルによってコードされる複数のHLAクラスII分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつCDCA1由来の9merCTLエピトープを天然に含む24および26アミノ酸長ペプチドを選択し、合成して、CTLエピトープを含むプロミスキャスなヘルパーT細胞エピトープを同定した(Harao M,et al.Int J Cancer 2008;123:2616−25)。
HLA−A2に結合する、CDCA1−A2(65−73)、YMMPVNSEV(配列番号:3);CDCA1−A2(351−359)、KLATAQFKI(配列番号:4)、およびHLA−A24に結合する、CDCA1−A24(56−64)、VYGIRLEHF(配列番号:5)の3つのヒトCDCA1由来短鎖ペプチド(SP)を合成した(純度>95%、Biomatik,Canada)。2つのオーバーラップする長鎖ペプチド(LP)である、CDCA1(55−78)、IVYGIRLEHFYMMPVNSEVMYPHL(配列番号:1);CDCA1(39−64)、NPKPEVLHMIYMRALQIVYGIRLEHF(配列番号:2)を合成し(純度>90%)、CDCA1特異的ヒトCD4+T細胞をインビトロで刺激するその能力に関して試験した。HLA−A24(HIV−A24、RYLRDQQLL(配列番号:6))およびHLA−A2(HIV−A2、SLYNTYATL(配列番号:7))に結合する2つのHIVペプチドを陰性対照SPとして使用した(Tomita Y,et al.Cancer Sci;102:697−705.,Tomita Y et al.Cancer Sci;102:71−8)。LPである、DR4に結合するWT1由来ペプチド、WT1ペプチド(KRYFKLSHLQMHSRKH(配列番号:8))を陰性対照LPとして使用した(Fujiki F et al.J Immunother 2007;30:282−93)。ペプチドを10μg/μLまたは20μg/μLの濃度でジメチルスルホキシドに溶解し、−80℃で保存した。
6Hisタグ組換え全CDCA1タンパク質ならびにCDCA1(55−78)およびCDCA1(39−64)特異的Th細胞によって認識される両方のCDCA1由来Thエピトープを欠く切断型CDCA1タンパク質を、それぞれのcDNA断片を有するpET28aベクター(Novagen)を用いて大腸菌BL21株によって発現させた。切断型CDCA1タンパク質を対照タンパク質として使用した。各々の組換えタンパク質を、HisTrap FFカラム(GE Healthcare)を製造者の使用説明書に従って用いて精製した。タンパク質の純度をSDS−PAGEによって確認した。
健常ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を採取し、使用するための研究プロトコルは、熊本大学の治験審査委員会によって承認された。本発明者らは、12名の健常ドナーから、書面によるインフォームドコンセントを得た後で血液試料を得た。この試験で検討した健常ドナーのHLA−A、DRB1およびDPB1アリルを、ポリメラーゼ連鎖反応およびアリル特異的プローブハイブリダイゼーションを用いてHLA遺伝子変異のDNAタイピングによって決定し、表1に示す。健常ボランティアからのPBMCを以前に述べられているように(Inoue M,et al.Int J Cancer;127:1393−403)単離した。CD4+T細胞を、抗CD4モノクローナル抗体(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)と結合した磁気マイクロビーズを用いて陽性選択によってPBMCから精製した。単球由来の樹状細胞(DC)を、以前に述べられているように(Harao M,et al.Int J Cancer 2008;123:2616−25)インビトロ培養によってCD14+細胞から生成し、抗原提示細胞(APC)として使用して、TAA特異的CD4+T細胞を誘導した。DC(1×104/ウェル)を10μg/mlのLPで3時間パルスし、照射して(45Gy)、その後96ウェル平底培養プレートの各ウェルにおいて5%ヒト補体除去血漿を添加したAIM−V 200μl中の自己CD4+T細胞(3×104/ウェル)と混合した。7日後、培地の半分を各培養物から取り出し、次に、ペプチド(10μg/ml)および5ng/mlのヒト組換え(hr)IL−7でパルスした、照射した(50Gy)自己PBMC(1×105)を含む新鮮培地(100μl/ウェル)を培養物に添加した。ペプチドでの2回目の刺激の2日後に、hr IL−2を10IU/mlの最終濃度で各ウェルに添加した。1週間後、各ウェル中の刺激したCD4+T細胞を、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイにおいて特異性について分析した。コグネイトペプチドに特異的応答を示すT細胞を24ウェルプレートに移し、10IU/mlのhr IL−2および5ng/mlのhr IL−7を添加した培地中、ペプチド(10μg/ml)でパルスした照射自己PBMC(1×106/ウェル)を用いて週1回の間隔で再刺激した。一部の場合は、以前に述べられているように(Tabata H et al.Hum Immunol 1998;59:549−60)さらなる試験のためにT細胞を限界希釈によってクローン化した。
ペプチドおよびタンパク質でパルスしたAPCに対するTh細胞の免疫応答を、以前に述べられているように(Tomita Y et al.Cancer Sci;102:697−705)IFN−γ ELISPOTアッセイ(Human IFN−γ ELISPOTキット、BD Biosciences)によって評価した。簡単に述べると、ペプチドでパルスしたPBMC(3×104/ウェル)での刺激後の3×104のバルクCD4+T細胞、またはペプチドでパルスしたHLA−DRを発現するL細胞(5×104/ウェル)での刺激後の1×104のバルクCD4+T細胞当たりの、インターフェロン(IFN)γを産生するペプチド特異的CD4+T細胞の頻度を分析した。ペプチドでパルスしたT2細胞(2×104/ウェル)での刺激後の1×105のCTL当たりの、インターフェロン(IFN)γを産生する細胞の頻度も分析した。あるいは、タンパク質をロードした5×103のDCを2×104 CD4+T細胞クローン/ウェルと共培養した。タンパク質をロードした成熟DCを、以前に述べられているように(Harao M,et al.Int J Cancer 2008;123:2616−25)ポジティブ単離したCD14+細胞(0日目)から調製した。5日目に、組換えCDCA1(50μg/ml)およびOK432の存在下でDCを培養した。タンパク質をロードした成熟DCを7日目に回収し、洗浄して、IFN−γ ELISPOTアッセイにおける刺激物質として使用した。抗原提示に関与する拘束HLA分子を決定するため、抗原誘導性IFN−γ産生のブロッキングを、抗HLA−DR mAb(L243、Biolegend)、抗HLA−DP mAb(B7/21、abcam)、抗ヒトHLA−DQ mAb(SPV−L3、abcam)または抗HLAクラスI mAb(W6/32、abcam)を添加することによって検査した。すべてのmAbを5μg/mlの最終濃度で使用した。IFN−γ ELISPOTアッセイのすべての評価は2連または3連で実施し、結果は平均値に対応した。
A:CDCA1−A24(56−64)SPでの精製CD8+T細胞の刺激によるCDCA1−A24(56−64)SP反応性CTLの誘導を、以前に述べられているように実施した。(Tomita Y,et al.Cancer Sci 2011;102:71−8.,Imai K,et al.Clin Cancer Res 2008;14:6487−95)CDCA1(55−78)−LPでパルスしたDCでの刺激によるCDCA1−A24(56−64)SP特異的CTLの増殖能力を評価するため、HLA−A24+ドナーから得たCDCA1−A24(56−64)SP特異的バルクCTL(HD2;2×106/ウェル、24ウェルプレート、HD5;2×105/ウェル、48ウェルプレート)を、16μM CDCA1(55−78)−LPまたは対照LPでパルスした自己DC(HD2;2×105/ウェル、HD5;5×104/ウェル)で刺激した。LPでパルスした成熟DC(3時間)を照射し、洗浄して、その後抗原提示細胞(APC)として使用した。1日目と7日目に、rhIL2(20IU/mL)およびrhIL−7(5ng/mL)を添加した。HD2およびHD5からCTLを樹立した後、それらの認識特異性および細胞傷害活性を以下のプロトコル(B)および(C)によってそれぞれ評価した。
CDCA1−A24(56−64)SPでワクチン接種した5名のHNC患者(HNC26、29、31、39、109)からのPBMCを、24ウェルプレート(2×106/ウェル)においてCDCA1(55−78)−LPとCDCA1(39−64)−LPの混合物(各々10μg/mL)と共に培養し、0日目と2日目にrhIL−2およびrhIL−7を添加した。0日目(エクスビボ)および7日目に、PBMCをCDCA1−A24(56−64)特異的テトラマーで染色した。
T細胞(1×104/ウェル)を、96ウェル培養プレートにおいてCDCA1(55−78)の存在下でL−DR4(5×104/ウェル)と共に培養した。20時間後、培養上清を採取し、サイトカイン(IFN−γ、GM−CSF、TNF−α、MIP1β、IL−4、IL−17)レベルを、Bio−Plexシステム(Bio−Rad)を製造者の使用説明書に従って使用して測定した。
ペプチドで刺激された脱顆粒CD8+またはCD4+Tリンパ球を同定するため、細胞表面に露出されたCD107aをフローサイトメトリによって分析した。(Rubio V et al.Nat Med 2003;9:1377−82.,Betts MR,et al.J Immunol Methods 2003;281:65−78)簡単に述べると、CD107a動員アッセイを以前に述べられているように実施した。(Tomita Y et al.Cancer Sci.2011 Jan;102(1):71−8)CDCA1由来ペプチドまたは対照ペプチド(1μg/ml)を刺激剤として添加し、FITC標識抗ヒトCD107a mAbまたはFITC標識アイソタイプ対照マウスIgG1およびモネンシンを各ウェルに添加した。細胞を37℃で5時間培養した。培養後、ペプチドで刺激したTh細胞またはCTLをPE結合抗ヒトCD4抗体(eBioscience,San Diego,CA)およびPE結合抗ヒトCD8抗体(Biolegend)でそれぞれ染色し、フローサイトメトリ(FACScan;BD Biosciences)によって分析した。
HLA−A24+ドナー(HD2)由来のDCを、生存状態に保持するかまたは0.1%グルタルアルデヒド(Sigma−Aldrich)中で3分間固定し、ペプチド(16μM)で3時間パルスして、3回洗浄した。ペプチドパルスの間およびパルス後にOK432(0.1KE/mL、中外製薬、東京、日本)を添加し、DCの成熟を誘導した。CDCA1−A24(56−64)反応性バルクCTLを、10μg/mLのブレフェルジンA(Sigma−Aldrich)を含む培地中に2:1の比率で6時間添加した。ブレフェルジンAは、刺激の間のタンパク質分泌を阻害するために添加した。CDCA1−A24(56−64)特異的CTLによるIFN−γ産生を細胞内標識によって測定した。細胞を、PerCP標識抗ヒトCD8 mAb(BioLegend)およびPE標識CDCA1−A24(56−64)特異的テトラマーと組み合わせたFITC標識抗ヒトIFN−γ mAb(BioLegend)で染色した。データの取得はFACSCalibur(BD Biosciences)で実施し、FlowJoソフトウェア(Tree Star,Ashland,OR)を用いてデータファイルを解析した。
HLA−A2(HHD)およびHLA−A24(HHH)トランスジェニックマウス(Tgm)は、F.A.Lemonnier博士の厚意により提供された。(Firat H,et al.Eur J Immunol 1999;29:3112−21.,Jung KO,et al.J Virol 2012;86:7616−24)。マウスに、7日の間隔で、不完全フロイントアジュバント(IFA)中に乳化したCDCA1−LP溶液(HLA−A2 Tgm、50μg/マウス;HLA−A24 Tgm、100μg/マウス)を尾の基部で皮内注射した。CDCA1由来LPでの2回目または3回目のワクチン接種の7日後に、CD8+T細胞を、磁気マイクロビーズ(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)を用いた陽性選択によって鼠径リンパ節から単離した。SPでパルスしたBM−DCまたはC1R−A2402細胞での刺激に応答したIFN−γ産生CD8+T細胞の数をエクスビボELISPOTアッセイによって計数した。
CDCA1(55−78)−LP特異的Th細胞クローン(Thクローン)を生成した、HLA−A2+/DR4+HD1から得たPBMCを24ウェルプレートに播種し(3×106/ウェル)、次いでSP単独(CDCA1−A2(351−359)、20μg/mL)、SP+LP(CDCA1(55−78)−LP、20μg/mL)、SP+Thクローン(5×105/ウェル)、またはSP+LP+Thクローンを2mLの最終容量で添加した。7日間の培養後、これらのペプチドとIL−2(20U/mL)を添加し、次に9日目にIL−15(5ng/mL)を添加した。11日目に、FITC標識抗ヒトCD8 mAbとHLA−A*02:01/CDCA1−A2(351−359)複合体のPE標識テトラマーで細胞を染色した。溶解活性を標準的なクロム放出アッセイにおいて試験した。(Inoue M et al.,Immunol Lett 2009;126:67−72.,Monji M et al.,Clin Cancer Res 2004;10:6047−57)。
HNC患者のヘパリン添加血液からのPBMCをフィコール−コンレイ密度勾配遠心分離によって単離した。HNC患者または健常ドナーからの新鮮なPBMCを、5%ヒト補体除去血漿を添加した最終容量2mlのAIM−V中、CDCA1(39−64)−LPとCDCA1(55−78)−LP(各々10μg/mL)の混合物と共に37℃で培養した(2×106/ウェル、24ウェルプレート);IL−2およびIL−7を0日目と2日目に添加した。1週間の細胞培養後、抗原特異的IFN−γ産生T細胞の数をELISPOTアッセイによって計数した。この試験は、探索的研究の原則(exploratory research principles)の下で活動する研究室で行い、研究プロトコルを用いて実施した。本発明者らは、ヒトT細胞アッセイに関する枠組みを報告した「T細胞アッセイについての最小限情報(Minimal Information About T−cell Assay)」(MIATA)の推奨(Britten CM et al.,Immunity 2012;37:1−2)に同意する。
CDCA1(55−78)特異的Th細胞クローンを生成したHLA−A2かつDR4陽性健常ドナーHD1からのPBMCを24ウェルプレートに3×106/ウェルの濃度で播種した後、混合SP単独(CDCA1−A2(65−73)+CDCA1−A2(351−359)、それぞれ20μg/ml)、混合SP+CDCA1(55−78)LP(20μg/ml)、混合SP+Thクローン(5×105/ウェル)、または混合SP+CDCA1(55−78)LP+Thクローンを2mlの最終容量で細胞培養物に添加した。7日間の培養後、これらのペプチドとhr IL−2(20U/ml)を添加し、次にhr IL−15(5ng/ml)を9日目に添加した。培養の11日目に、細胞を回収し、FITC標識抗ヒトCD8 mAb(クローンT8、Beckman Coulter,Brea,CA)と組み合わせたHLA−A*02:01/CDCA1−A2(65−73)ペプチド複合体またはHLA−A*02:01/CDCA1−A2(351−359)ペプチド複合体のPE標識テトラマー(MBL、名古屋、日本)で染色し、フローサイトメトリによって分析した。CDCA1(55−78)特異的Th細胞クローンを生成した別のドナーからのPBMCを上述した手順に基づいて試験した。
両側スチューデントt検定(棒グラフ)、フィッシャーの正確確率検定、またはノンパラメトリックのマン−ホイットニーU検定(散布点グラフ)を用いてELISPOTデータにおける差の統計的有意性を評価した。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。統計解析は、市販の統計ソフトウェアパッケージ(StatView 5.0、Abacus Concepts,Calabasas,CA)を用いて実施した。
CDCA1のCTLエピトープを含む潜在的なプロミスキャスHLAクラスII結合ペプチドの予測および選択
CDCA1の潜在的なプロミスキャスHLAクラスII結合Th細胞エピトープを同定するため、本発明者らは、最初に、コンピュータアルゴリズム(Wang P,et al.BMC Bioinformatics;11:568.,Wang P,et al.PLoS Comput Biol 2008;4:e1000048)を用いてCDCA1のアミノ酸配列を検討した。興味深いことに、本発明者らは、コンピュータアルゴリズムによって強力なプロミスキャスHLAクラスII結合ペプチドと予測されたCDCA1タンパク質配列の1つの領域(CDCA1(39−78))がCTLエピトープに非常に近位であることを見出した(図1)。それゆえ、本発明者らは、複数のHLAクラスII分子、HLA−DR4、HLA−DR15およびHLA−DP2(DPB1*02:01)についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつHLA−A2またはHLA−A24拘束性CTLによって認識される天然の9merペプチドを含む、2つの候補LP(CDCA1(39−64)およびCDCA1(55−78))(図1Aおよび表2)をその後の分析のために選択し、合成した。
本発明者らは、これら2つの選択した合成LPがCDCA1特異的Th細胞を生成することができるかどうかを評価した。5名の健常ドナーからのPBMCのCD4+T細胞を、週1回の間隔で、CDCA1(55−78)ペプチドでパルスした自己DCおよびPBMCで刺激した。少なくとも3回の刺激後、培養したCD4+Th細胞のCDCA1(55−78)特異的応答をIFN−γ ELISPOTアッセイによって検査した。3名のHLA−DR4陽性の健常ドナーにおいて、生成されたTh細胞株は、CDCA1(55−78)に応答して有意の量のIFN−γを産生した(図2AおよびB)。Th細胞株のHLA拘束を明らかにするため、HLA−DRまたはHLA−DPに対するmAbを使用した。CDCA1(55−78)に対するTh細胞株のIFN−γ産生は、HLA−DR特異的mAbを添加した場合有意に減少したが、HLA−DP特異的mAbは影響を示さなかった(図2AおよびB)。
HLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2拘束性Th細胞を刺激するCDCA1(39−64)およびCDCA1(55−78)の能力を確認するため、本試験者らは、無関係なペプチドをHLAクラスII分子拘束性Th細胞誘導についての対照として用いて実験を行った。
これらの結果も、CDCA1(39−64)およびCDCA1(55−78)が、HLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2拘束性Th細胞を誘導する能力を有することを示した。
CDCA1ペプチド誘導性Th細胞をさらに特徴づけるため、本発明者らは、Bio−Plexシステムにより、コグネイトペプチドでのCDCA1(55−78)特異的バルクCD4+Th細胞株の刺激に応答したいくつかのサイトカインを測定した。ドナーからのCDCA1(55−78)特異的バルクHTL株は、コグネイトペプチドでパルスしたL−DR0405での再刺激により、大量のIFN−γ、GM−CSF、TNF−αおよびMIP−1βを産生したが、IL−4およびIL−7の産生はより少なく、Th1の分極特性を示した(図4A〜D)。興味深いことに、細胞傷害性マーカーCD107aも、コグネイトペプチドで刺激したCDCA1(55−78)特異的バルクTh細胞株上で検出することができた(図4E〜H)。したがって、CDCA1(55−78)ペプチド特異的Th1細胞は、この培養条件において顕著に活性化された。
本発明者らは、自己DCがCDCA1タンパク質を取り込み、プロセシングして、CDCA1ペプチド特異的Th1細胞クローンを刺激することができるかどうかを評価することへと進んだ。CDCA1(55−78)LPをロードした成熟DCを調製し、IFN−γ ELISPOTアッセイにおけるAPCとして使用した。図5Aに示すように、HLA−DR4拘束性CDCA1(55−78)反応性Th細胞クローンは、CDCA1タンパク質をロードしたDCを効率的に認識し、IFN−γを特異的に産生したが、対照タンパク質をロードしたDCまたはタンパク質をロードしていないDCは認識しなかった。加えて、DCによって提示される天然にプロセシングされたCDCA1抗原を認識するこのTh細胞クローンの能力は、抗HLA−DR抗体によって有効にブロックされたが、対照抗HLAクラスI抗体ではブロックされず、エピトープがHLA−DR4分子を介して提示されることを確認した。HLA−DP2拘束性およびCDCA1(55−78)反応性Th細胞クローンを用いて同様の分析を実施した。このTh細胞クローンは、CDCA1タンパク質をロードしたDCを効率的に認識し、IFN−γを産生したが、対照タンパク質をロードしたDCは認識せず、HLA−DP2拘束性Th細胞エピトープも、DCにおいてCDCA1タンパク質から天然にプロセシングされることを示唆した(図5B)。
要約すると、全体的な結果は、Th細胞エピトープである、CDCA1(55−78)およびCDCA1(39−64)がCDCA1タンパク質からDCによって天然にプロセシングされ、DCの細胞表面でHLAクラスII分子によって提示されることを示す。
本発明者らは、CDCA1(55−78)LPが、インビトロでDCによるLPの交差提示によってCDCA1−A2(65−73)SP特異的CTLを誘導することができるかどうかを評価した。これを確認するため、本発明者らは、CDCA1(55−78)LPをロードしたDCでの刺激によって2名のHLA−A2陽性ドナー由来の末梢血CD8+T細胞からCDCA1−A2(65−73)SP特異的CTLを生成することを試みた。LPをロードしたDCでの3回の刺激後、生じたCTL株におけるCDCA1−A2(65−73)SPに特異的なCD8+T細胞の頻度をIFN−γ ELISPOTアッセイによって検査した。図6Aに示すように、CDCA1(55−78)LPをロードしたDCでの刺激によって生成されるCTLは、CDCA1−A2(65−73)SPでパルスしたT2細胞での再刺激に応答してIFN−γを特異的に産生したが、無関係なペプチドでパルスしたT2細胞ではIFN−γを産生しなかった。IFN−γ産生は、抗HLAクラスI mAbの添加によって有意に阻害されたが、抗HLA−DR mAbでは阻害されず、したがって、本発明者らがインビトロでDCによるLPの交差提示を通してCDCA1−A2(65−73)SP特異的CD8+T細胞を刺激することに成功したことを示した。
合わせて考慮すると、これらの結果は、CDCA1(55−78)LPが、インビトロでのヒトDCおよびインビボでのHLA−A2 TgmにおけるBM−DCの両方による交差提示後に、有意の割合のIFN−γを産生するCDCA1−A2(65−73)SP特異的CTLを誘導することを示した。
次に、本発明者らは、CDCA1(55−78)LPがCDCA1特異的およびHLA−A2拘束性CTLの誘導を増強することができるかどうかを試験した。HLA−A2陽性かつDR4陽性ドナーからのPBMCをCDCA1−A2(65−73)SPとCDCA1−A2(351−359)SP単独の混合物で刺激した場合、これら2つのSP特異的テトラマー+細胞の頻度は、それぞれCD8+T細胞の0.01%および0.05%であった(図7A)。PBMCをSPおよびCDCA1(55−78)LPの両方で共刺激した場合、これらのSP特異的テトラマー陽性細胞の頻度は、それぞれ0.03%および0.12%に上昇した(SP単独で刺激したものと比較してそれぞれ3倍および2.4倍の頻度上昇)(図7AおよびB)。テトラマー+細胞の絶対数も、SP単独で刺激したものと比較して、CDCA1(55−78)を添加するだけで有意に増加した(データは示していない)。PBMCをこれら2つのSPおよびCDCA1(55−78)特異的Thクローンの両方で共刺激した場合、SP特異的テトラマー+細胞の頻度は、それぞれ0.05%および0.19%に上昇した(それぞれ5倍および3.8倍の上昇)。さらに、PBMCをSP、CDCA1(55−78)およびCDCA1(55−78)特異的Thクローンで共刺激した場合、SP特異的テトラマー+細胞の頻度は、それぞれ0.1%および0.6%に有意に上昇した(それぞれ10倍および12倍の上昇)。テトラマー+細胞の頻度に関して、培養物へのCDCA1(55−78)ヘルパーペプチドまたはThクローンの添加は、それぞれ頻度のわずかな上昇を誘導したが、これらの両方(CDCA1(55−78)+Thクローン)の添加は特異的CTLの頻度を著しく上昇させた。これらの結果は、本発明者らが異なるCDCA1(55−78)特異的Thクローンを使用した場合も再現可能に観察された(データは示していない)。
合わせて考慮すると、これらの結果は、CDCA1(55−78)LPおよびCDCA1(55−78)LPでの刺激による活性化CDCA1特異的CD4+T細胞が、個々にまたは協力して、CDCA−1特異的およびHLA拘束性CTLの誘導を増強し得ることを明らかに示した。
次に、CDCA1−LPがCDCA1特異的バルクCTLの増殖を誘導し得る可能性を評価した。HD2(HLA−A24+/DR15+)の精製CD8+T細胞から生成したCDCA1−A24(56−64)SP特異的バルクCTLを、CDCA1(55−78)LPでパルスした自己DCと共に1週間培養した。図9Aに示すように、CDCA1−A24(56−64)テトラマー+CD8+細胞の集団は、CDCA1(55−78)LPでパルスしたDCでの刺激によって増殖したが、対照LPでパルスしたDCでバルクCTLを刺激した場合は減少した。同様の結果をIFN−γ ELSPOTアッセイにおいてHLA−A24+/DR4+ HD5から得た(図9B)。この実験の詳細な方法は「材料および方法」の中で述べられている。
DCによるCDCA1−LPの交差提示を、CDCA1−A24(56−64)特異的テトラマー+CD8+T細胞のIFN−γ応答に関連して評価した。交差提示することはできないが、生存DCと同程度に効率的にCDCA1−A24(56−64)SPを提示することができる固定DC(図10A、固定DC+SP)を、T細胞応答におけるLP分解産物の外因的提示の寄与を排除するまたは評価するために使用した。CDCA1(55−78)LP(図10A)およびCDCA1(39−64)LP(図10B)は、非固定DC(DC+LP)によって交差提示された場合にのみ、有意の割合のIFN−γ分泌性テトラマー+CD8+T細胞を誘導した。CDCA1−LPでパルスした固定DCは、無関係なLPでパルスした非固定DCと同様に、CDCA1−A24(56−64)特異的CTLを刺激することができなかった(固定DC+LPおよびDC+無関係なLP)。
がん免疫療法に関連して、拘束性エピトープを使用したワクチンが、ワクチン中には存在しない抗原に対する幅広いCD8+T細胞応答を生じさせ得ることを示唆する強力な証拠が存在する(Corbiere V,et al.Cancer Res 2011;71:1253−62.,Ribas A,ei al.Trends Immunol 2003;24:58−61.,Hunder NN,et al.N Engl J Med 2008;358:2698−703)。そこで、本発明者らは、CDCA1特異的Th細胞応答がCDCA1由来のCTLエピトープペプチドでのワクチン接種によって効率的に誘導され得ると考えた。患者におけるCDCA1特異的Th細胞応答を検出するため、CDCA1−A24(56−64)でワクチン接種した16名のHNC患者およびワクチン接種前の7名のHNC患者から単離したPBMCを採取した。ドナーの特徴を図11Fの表に要約する。CDCA1−LPでのPBMCの1週間のインビトロ刺激後、個々のCDCA1−LP特異的T細胞の頻度をIFN−γ ELISPOTアッセイによって検出した(図11A)。10名の健常ボランティアから単離したPBMCを対照として使用した。IFN−γ分泌細胞の数が陰性対照の少なくとも2倍である場合に応答を陽性とみなした。
有意の頻度のCDCA1−LP特異的免疫応答がHNC患者において観察されたが(CDCA1(39−64)LP、19名のうち14名、74%;CDCA1(55−78)LP、19名のうち13名、68%;図11BおよびF)、10名の健常ドナーではCDCA1−LPに対する特異的IFN−γ応答は検出されなかった。ワクチン接種前の数名の患者において、CDCA1−LP特異的Th細胞応答が検出可能であった(CDCA1(39−64)LP、7名のうち2名、29%;CDCA1(55−78)LP、7名のうち2名、29%;図11F)。他方で、CDCA1−A24(56−64)SPでのワクチン接種後の多くのHNC患者において、CDCA1−LP特異的Th細胞応答が検出された(CDCA1(39−64)LP、16名のうち12名、75%;CDCA1(55−78)LP、16名のうち12名、75%;図11F)。ワクチン接種後の患者におけるCDCA1−LP特異的IFN−γ産生細胞の数は、ワクチン接種前の患者および健常ドナーにおけるよりも有意に多かった(図11C)。T細胞によるIFN−γ産生は、抗HLAクラスII mAbの添加によって有意に阻害されたが、抗HLAクラスI mAbによっては阻害されなかった(図11D)。これらの結果は、CDCA1−LP特異的IFN−γ産生がCDCA1−LP特異的CD4+T細胞に由来したことを示す。興味深いことに、一部のHNC患者では反復ワクチン接種によってCDCA1−LPに対する特異的応答が誘導または増大された(図11E)。これらの所見は、APCが、ワクチンが誘導したCTLによって死滅した腫瘍細胞に由来するCDCA1抗原を収集し、プロセシングして、その後インビボでCDCA1特異的Th細胞を活性化したことを示唆する。
最も魅力的なワクチン化合物は、治療的CD4+およびCD8+応答を誘導することができるTAAの配列に対応する合成LPであると考えられる(Melief CJ and van der Burg SH.Nat Rev Cancer 2008;8:351−60.,Kenter GG,Welters MJ,et al.N Engl J Med 2009;361:1838−47)。これらのLPの注射後、患者のDCがLPを取り込み、プロセシングして、様々なHLAクラスIおよびHLAクラスIIにおいてすべての可能なCTLエピトープおよびThエピトープをそれぞれ提示すると考えられる。したがって、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、最も一般的に認められるHLAによって拘束されるCTLおよびTh1細胞の両方を誘導することができる単一ポリペプチドであるべきだと考えた。
結論として、本発明者らは、CDCA1特異的Th1細胞だけでなく交差提示によってCDCA1特異的CTLも増殖させ、活性化するための良好なツールとなる、CTLエピトープを含むCDCA1由来のヘルパーペプチドを初めて同定した。これらの所見は、今後、様々な種類のがんに対するCDCA1ペプチドに基づく免疫療法の臨床試験に寄与するであろう。
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、Th1細胞だけでなく、CDCA1発現細胞に対するCTLも誘導することができる。本発明のそのようなペプチドは、CDCA1に関連する疾患、例えばがん、より詳細には乳がん、膀胱がん、食道がん、小細胞肺がん(SCLC)、非小細胞肺がん(NSCLC)および頭頸部がん(HNC)の治療のためにも有用であり得る。
Claims (17)
- 配列番号:10のアミノ酸配列の一部を含む30アミノ酸以下の単離されたペプチドであって、
(a)配列番号:1または2のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1または2個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Tヘルパー1型(Th1)細胞を誘導する能力を有するペプチド。 - 前記ペプチドが少なくとも2種類のMHCクラスII分子に結合する能力を有する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記MHCクラスII分子が、HLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2から成る群より選択される、請求項2に記載の単離されたペプチド。
- CDCA1特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
- (a)配列番号:1および2から成る群より選択されるアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1または2個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項4に記載の単離されたペプチド。 - 配列番号:1および2から成る群より選択されるアミノ酸配列からなる請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- (i)Th1細胞、
(ii)CTL、
(iii)Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)、および
(iv)CTLを誘導する能力を有するAPC
から成る群より選択される細胞の少なくとも1つを誘導するための組成物であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の1つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。 - (a)請求項1から6のいずれか一項に記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)請求項7に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)前記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有し、ならびに
(i)がんの治療、
(ii)がんの予防、
(iii)がんにおける術後再発の予防、および
(iv)前記(i)から(iii)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。 - MHCクラスII分子としてHLA−DR4、HLA−DR9、HLA−DR15およびHLA−DP2から成る群より選択される少なくとも1つを有する対象への投与用に製剤化されている、請求項9に記載の医薬組成物。
- CTL誘導能を有する1つまたは複数のペプチドをさらに含有する、請求項9または10に記載の医薬組成物。
- MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
(a)請求項1から6のいずれか一項に記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)請求項7に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)前記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有する組成物。 - Th1細胞を誘導する能力を有するAPCを誘導するための方法であって、APCを請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させる段階を含む方法。
- Th1細胞をインビトロで誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞を、MHCクラスII分子と請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自らの表面に提示するAPCと共培養する段階;および
(b)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階であって、ここでTCRが、細胞表面に提示されるMHCクラスII分子と請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。 - CTLをインビトロで誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方を、請求項4または5に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階;ならびに
(b)CD8陽性T細胞を、請求項4または5に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。 - MHCクラスII分子と請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自らの表面に提示する、単離されたAPC。
- APCの表面に提示された請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを認識する、単離されたTh1細胞。
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