JP2003511419A - ウイルス/抗原処理された樹状細胞による抗原特異的t細胞の活性化 - Google Patents
ウイルス/抗原処理された樹状細胞による抗原特異的t細胞の活性化Info
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Abstract
Description
きる患者の免疫応答を刺激するためのワクチンとして使用され得る、ウイルス処
理された抗原で処理された樹状細胞(DC)及び/又はウイルス及び抗原で別々
に処理された樹状細胞を含むT細胞活性化剤、インビトロでT細胞活性化剤によ
り活性化される活性化TCを含む組成物、T細胞活性化剤及び/又は組成物を含
む医薬組成物、並びにそれらの製造方法に関する。
全又は遺伝性免疫機能障害に悩んでいる患者の免疫系は、非能率的に働き、外部
からの手助けを必要とする。この免疫不全症の原因は、疾患それら自身又は慣用
のガン治療による免疫抑制を含む外的に引き起こされた欠陥であり得る。さらに
、ガン又は感染のような疾患の免疫系による認識は、疾患特異的抗原の弱いまた
は不十分な提示のような問題に直面し得る。
ある。インビトロ活性化同種異系又はオートロガス抗原特異的T細胞の転移、或
いはワクチン接種処置によるそのような細胞のインビボ誘導による細胞治療は、
免疫不全の上記問題を解決することを目的とした、現在のやり方である。
供することができ、また、異物又は疾患関連細胞性抗原を直接攻撃及び全滅し得
るリンパ球である。それらは、そのような抗原に対し、何ヶ月、何年も免疫記憶
を発達及び/又は転移することができ、このように、それらは長期免疫保護の重
要なメディエータである。
プローチは、養子免疫細胞移入治療だった。これらの治療は主にガン治療に用い
られ、まず、いわゆるリンフォカイン活性化キラー細胞(LAK)、後に、オー
トロガス転移のためのリンフォカイン活性化腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)に使
用された。用語“オートロガス”は、転移された細胞が患者自身に由来したこと
を意味する。該キラー細胞は、末梢血液又は手術により新しく得られた腫瘍組織
から生じた。主に、T細胞成長因子[参考文献1.、2.]であるインターロイキ
ン2(IL−2)を含む培地中で、得られたキラー細胞を培養し、活性化した。
養子オートロガス及び同種異系免疫細胞移入の他の試みは、それらがレシピエン
トに養子移入される前の、インビトロ又はインビボの腫瘍細胞及び/又は抗体或
いはサイトカインでのT細胞刺激を含む[参考文献3.〜7.]。用語“同種異系
(allogeneic)”は、転移された細胞が同一でない個人に由来したことを意味する
。
細胞(DC)の使用は、まさに近年確立されてきた[参考文献8.〜13.]。D
Cは、抗原保持細胞自身よりもより強力なT細胞の抗原特異的活性化剤であり得
る、“プロフェッショナル”な抗原提示細胞である。DCは、ペプチド又は細胞
ラーゼートのような抗原、例えば腫瘍細胞由来の抗原でパルス又はロードされる
ことができる。該DCは、抗原材料を処理し、その生成物を、それらをT細胞に
提示することのできるMHCクラスI及び/又はクラスII複合体に組み込む。キ
ラー細胞自身は、MHCクラスIにより提示を認識することができるだけである
が、キラーT細胞の完全な活性化のために、クラスI及びクラスII MHC複合
体両方における、処理された材料の提示が必要である。MHCクラスIIは、ヘル
パーT細胞をさらに活性化するのに必要である。この発見により、MHCクラス
II組み込み可能なヘルパー抗原を示す、キーホール−リンペット(limpet)ヘモ
シアニン(KLH)のような代用物を加えるようになった。さらに、そのような
代用物は、新抗原を示すことができ、このように、トレーサー分子として働くこ
とができる[参考文献8.]。
パラミクソウイルスである。このウイルスは、インビトロ又はインビボでのガン
細胞の感染及び溶解のために直接使用されることができ、それは、ターゲット細
胞に対する刺激性細胞の改善された接着性を向上させるために、腫瘍細胞の修飾
のためにワクチンにおいて使用され得る。NDVはまた、細胞性ワクチンにおけ
る修飾に使用される場合、T細胞活性化のための広い範囲の共刺激シグナルを誘
起し得る[参考文献14.〜22.]。
以前使用されてきた方法は、許容できる臨床リスク−利益関係を示していない。
これはほとんど、全体の免疫系の非特異的活性化、並びに、患者への適用後の、
インビボサイトカイン置換の転移細胞の依存性のためである。高用量サイトカイ
ンで患者の治療の結果は、大きな副作用を伴い、このため、このアプローチは放
棄された。抗原特異的成分又はT細胞受容体を使用する、より洗練された方法が
、ほんの制限された活性しか示さなかった細胞を生成する低用量のサイトカイン
に加え、T細胞のインビトロ活性化を引き起こす。通常、患者への転移後直ぐ細
胞の活性は容易に抑制され、つまり免疫細胞は、インビボでターゲット細胞を見
つけない(すなわち、ターゲット細胞に遊走しない)。それゆえ、このように作
られた免疫記憶は短命であるだけでなく、さらに、一時的治療成功の後、早期疾
患進行に導く。
てきた。しかしながら、DCを用いる治療の成功を妨げてきた問題は、治療適用
のための充分な量又は機能的に活性なDCの生成及び/又は分離であった。今ま
で開発されてきた方法は、不十分にパルスされた又は不十分に分化されたDCに
よる寛容誘導の可能性をほとんど考慮していなかった。さらに、DCでのT細胞
応答のインビボ生成は、欠乏免疫系を有する患者には困難であり得る。
的な不活性化のため、及び異種腫瘍におけるウイルス抵抗性腫瘍細胞のため、困
難であることが分かってきた。今まで抗原特異的T細胞のインビボ活性化のため
に使用されてきたウイルス修飾腫瘍細胞ワクチンは、早期ガンステージにおいて
のみ観察される、ほんの限られた効力を示す。NDVを用いるアプローチは、さ
らに免疫抑制された又は免疫不全患者、つまりT細胞のターゲット細胞により産
生される抑制因子のため、又はワクチン接種された患者における抗原オーバーロ
ードのため不十分に活性なT細胞のような障害にさらに直面する。さらに、抗原
を変化させる(antigen-varying)ターゲット(すなわち、この場合は、腫瘍)
細胞上へ、及びインビボ既存抗原提示細胞上への最適以下の抗原提示は、T細胞
活性化失敗の原因になり得る。
に達するために、かなりの数の抗原保持生細胞を必要とすることである。これは
、これまで、臨床用途におけるウイルス修飾細胞ワクチンの使用を制限してきた
。なぜなら、臨床状況では、比較的大量の原料(ほとんど、外科的に切除可能な
腫瘍材料)が入手可能であるからであり、それはかなりの量の死細胞を含む。
使用前に、それらの不活性化のため、細胞の照射が必要であるという結果になる
。この不活性化法は効果的であるが、制御された製薬製造プロセスに関して応用
することは困難である[参考文献20.、23.〜25.]。
激物のインビボ及びインビトロ誘発を改善することであり、その効果は、治療的
臨床使用の間、T細胞及びTメモリー細胞により特に媒介される。この改善は、
T細胞活性化試みによる寛容誘導の可能性を減少させ、このようにして、処置の
安全性を増すことを含む。
ることにより達成される。
る活性化T細胞を含む組成物に関し、ここで該T細胞は該患者又はその親類から
調製され、インビトロでT細胞活性化剤での処理により活性化される。ここで、
該T細胞活性化剤は、次のステップを含む方法により活性化される、活性化され
た樹状細胞を含む (a)抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、 (b)患者又はその親類から単球を調製する、 (c)インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る (d)得られた樹状細胞を、ステップ(a)で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び/又はステップ(a)で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、 ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング(cosignalling)を調節することができる。
いて抗原に対する免疫応答を刺激することのできる活性化された樹状細胞を含む
組成物又は製剤を意味する。上記で定義されたT細胞活性化剤の活性化された樹
状細胞は、インビトロだけでなくインビボでT細胞を活性化することができる。
ここで、上記で特徴付けられるようなT細胞活性化剤は、インビトロでのT細胞
活性化に用いられる。更なる局面によると、本発明は、インビボでのT細胞活性
化のためのワクチンとして使用され得るT細胞活性化剤自身にも関する。
る、高度に活性な抗原特異的免疫刺激剤の、インビボ及びインビトロ両方の誘導
の改善のための新しい系を提供する: (1)本発明の組成物は、細胞治療の方法において特に有用であり、ここで活性
化T細胞は患者に投与される。そのような方法はまた、養子又は受動的免疫療法
(ADI)と呼ばれる。 (2)本発明によるT細胞活性化剤は、高度に免疫原性の形態の腫瘍抗原のよう
な抗原で患者を免疫化するために、ワクチン、例えば腫瘍ワクチンを提供する。
そのような治療プログラムもまた、活性特異的免疫療法(ASI)と呼ばれる。
化された樹状細胞が患者に投与され得、患者のT細胞は投与部位に遊走し、そこ
でそれらは樹状細胞により活性化される。本発明による組成物中のT細胞の活性
化のために使用されるT細胞活性化剤はまた、組換えDNA技術を用いて調製さ
れる物質も含み得る。好ましくは、本発明による組成物におけるT細胞活性化に
使用されるT細胞活性化剤は、相加的に又は相乗的に樹状細胞と作用する1つ以
上の他のT細胞活性化剤を含む。
に結合した時、有機体の中で免疫応答を誘発することができるあらゆる構造物を
含む。それゆえ、本発明による抗原は、ハプテンのように働く低分子化合物、腫
瘍細胞のような全細胞、並びに、ポリペプチド、それらに由来するオリゴペプチ
ド、糖脂質のような脂質、多糖類及び核酸のようなそれらの部分を含む。さらに
、本発明による抗原は、ウイルスおよびそれらの部分、並びに、バクテリアのよ
うなあらゆる原核生物および真核生物である。上記で定義された組成物の好まし
い実施態様によると、抗原は患者から調製されるが、上記のように、抗原は、他
の有機体から調製されても良く、或いは合成又は生合成であり得る。
ルス処理され得る抗原は、上記で定義された方法のステップ(d)における樹状
細胞でのコインキュベーション前に、照射を用いずに不活性化され得る。腫瘍生
細胞のような生細胞の不活性化及び溶解の好ましい方法は、例えば、凍結−溶解
及び超音波処理(ultrasonification)を含む。照射以外の方法の使用は、より
少ない問題を薬品製造プロセスにもたらす。活性化される予定のT細胞の源とし
て、血液に加え又は血液の代わりに骨髄を用いると、NDV−修飾DCでのコイ
ンキュベーションによる刺激に対し、高度に活性な抗原特異的T細胞、例えばT
メモリー細胞の収量を増加させる。
えば免疫ビーズ(immunobead)技術によりさらに精製され得る。これらの技術は
、細胞または他の薬剤のような汚染成分に対して向けられた抗体に結合する小さ
な磁性金属ビーズ(例えば、Dynal又はMilteny製)の使用を含む。インキュベー
ションステップの間、抗体結合したビーズに結合した後、その汚染物は懸濁液か
らビーズを引き出す磁場をかけることにより、T細胞活性化剤、例えば活性化さ
れた樹状細胞の懸濁液から取り除かれる。さらに、該細胞は、上記ステップ(a
)における例えば患者からそれらの調製後、凍結保存(cryoconservate)され得
、ステップ(a)におけるウイルスでの処理及び/又は上記ステップ(d)にお
ける樹状細胞でのコインキュベーション前又は後に、解凍され得る。
たようなDC活性化法のステップ(d)において抗原自身の代わりに又は抗原自
身に加え、樹状細胞を活性化(パルス)するために、ウイルス処理/修飾された
抗原及び/又は前記ウイルス処理/修飾された抗原が提供する免疫シグナルをコ
ードする遺伝物質、即ちDNA又はRNA(好ましくはmRNA)のような核酸
を使用することも可能である。例えば、樹状細胞は、トランスフェクションによ
り(例えばCa-フォスフェート、リポフェクション又はエレクトロポレーショ
ン法を用いる)、対応する核酸で処理され得る。核酸の好ましい源は、ウイルス
感染した抗原提示細胞である。これらの細胞は、抗原発現のための遺伝子産物だ
けでなく免疫シグナルとして働くウイルス感染により誘導される生成物、例えば
サイトカインのカクテル、熱ショックタンパク質などを処理する。例えば、その
ような生成物をコードするmRNAは、DNAに転写され得、その後、この遺伝
物質はPCRの使用により増幅され得る。このように、製薬的に取り扱い易い、
多数の患者の継続処置のためのウイルス処理/修飾された抗原の絶え間ない源を
提供することができる。
テップ(c)の間、ウイルスとコインキュベートされる。
と、使用されるウイルスは、ニューカッスル病ウイルス(NDV)又はムンプス
ウイルスのようなパラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ミクソウイルス、
ヘルペスウイルス、AIDSウィルス、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)及びマウ
ス乳ガンウイルス(MMTV)からなる群から選択される。
くは非常に障害のある免疫系を持つ患者から調製される抗原及びウイルスで活性
化される樹状細胞を含む。好ましくは、患者の免疫系のこの障害は、ガン、感染
症、透析により処置されなければならない腎不全、自己免疫疾患及び/又は遺伝
性免疫機能障害のような慢性の障害により引き起こされ得る。
好ましい患者はヒトである。該患者の“親類”は、それぞれヒト又は動物であり
、該患者、即ち該ヒト又は該動物と血液及び/又はHLAタイプにより遺伝的に
関係している。
ステップを含む方法により活性化される。
T細胞の処理は、短時間で、低又は中用量サイトカイン含有培地中のコインキュ
ベーションにより行なわれる。より好ましくは、培養培地は6000 U/ml以下のサ
イトカイン、例えばIL‐2を含み、低用量サイトカイン含有培地中の培養は、
7日間より長くない。
定義されたT細胞活性化剤のステップ(b)で調製された単球の少なくとも一部
及び上記で定義された組成物のステップ(i)で調製されたT細胞の少なくとも
一部は、患者の又は親類の骨髄又は血液に由来し得る。それゆえ、従来技術の細
胞治療ワクチンと対照的に、骨髄は、単球から樹状細胞が発育する非常に効果的
な単球の源として、上記で定義されたT細胞活性化剤において使用され得、さら
に、それぞれ単球又はT細胞に加えてウイルス処理されたDCでのインビトロ活
性化のために末梢血液から得られる(メモリー)T細胞の非常に効果的な源とし
て、上記で定義された組成物において使用され得る。
活性化のための新しいアプローチにより、さらにいくつかの利点を示す。
のT細胞の合理的に効果的なインビトロ刺激に、1,5x106 NDV修飾DC及び
対応する1,5x106ターゲット細胞(例えば腫瘍細胞)が必要である。これらを考
慮して、DCによる材料の取り込み及び処理は、最後には生きたTCに対する抗
原提示に導くので、上記のようなT細胞活性化の方法は、死んでいるか生きてい
るどちらかの抗原としてターゲット細胞を使用する可能性を提供する。対照的に
、慣用のウイルス修飾された腫瘍細胞ワクチンにおいて、効果的なT細胞活性化
に導くためには少なくとも1,5x106ターゲット細胞が生きていなければならず、
66%以下の死細胞は生きたターゲット細胞を汚染する[参考文献20.、24
.〜26.]。しかしながら、例えば、新鮮な腫瘍細胞懸濁液において、粗原料
の貯蔵にたいてい必要な凍結保存(cryoconservation)の後、平均50%のター
ゲット細胞が死んでいる。それゆえ、生きたターゲット細胞と同様に死んだター
ゲット細胞も抗原として使用されることができるので(生きたターゲット細胞は
、好ましくは、ショックフリージングにより又はウイルスでの感染により崩壊さ
れる)、オリジナルの抗原保持ターゲット生細胞の代わりにNDV修飾されたD
Cを使用すると、必要な粗原料の量を約50%減らす。
ばNDVの使用は、(メモリー)T細胞のインビトロ又はインビボ活性化に使用
され得る有効なDCの生成を増加させ、容易にする。
記のような樹状細胞の活性化を刺激することのできるNDVのようなパラミクソ
ウイルスの使用は、さらに患者におけるDCの非能率的な数及び/又は機能によ
る寛容性誘起の確率を減らす。この利点、並びにDCの数及びその機能を増やす
ために上記のようなウイルスを使用することが、効果的なDCの生成を改善及び
増加させるという事実は、腫瘍細胞修飾においてNDVのようなウイルスの知ら
れた特性から予想されることのできない、本発明によるT細胞活性化剤のさらに
驚くべき特性を表している。一般的に、DCそれ自体は、最適の抗原提示機能及
びT細胞活性化のための同時刺激シグナリングを行うことができるべきである。
それゆえ、理論上は、NDVのようなウイルスのDCに対する影響の明らかな必
要性はない。しかしながら、実際はNDVのようなウイルスが、同時刺激サイト
カインの分泌を誘発し、上記腫瘍細胞ワクチンのような細胞性ワクチン調製のた
め、より長いT細胞‐ターゲット細胞相互作用のための接着分子を提供する一方
で、それぞれDCの成熟及び/又は分化及び/又は抗原提示を改善する。さらに
、NDVのようなウイルスはまた、改善されたT細胞活性化を発生させるために
DCにおける同時刺激シグナリングを誘発することに加え又は代わりに、修飾も
され得る。
NDVのようなウイルスは、樹状細胞の活性化のステップ(d)において抗原及
び樹状細胞間の融合を、少なくともある程度誘発することができる。該融合は、
樹状細胞と細胞のようなウイルス処理された抗原間のハイブリッドに導く、ウイ
ルス融合タンパク質により媒介され得る。そのようなハイブリッドはさらに、抗
原提供能力及び樹状細胞のT細胞活性化活性を改善する。抗原は、好ましくは患
者由来の腫瘍細胞、または多重の腫瘍関連抗原にハイブリッドを与える腫瘍細胞
系由来の細胞のような細胞である。
ようなウイルスの知られている特性から予期されなかった。それどころか、従来
技術研究から、ウイルスはDCを抑制することが予想された。例えば、Jenneら[
参考文献27.]は、ウイルスによるT細胞刺激特性の抑制を見出し、Rafteryら
[参考文献28.]は、DCのヒトサイトメガロウイルスでの感染後、ヒトサイト
メガロウイルス関連免疫抑制に貢献すると信じられていたDC機能における変化
を見出した。
T細胞活性化剤を用いる上記方法により活性化されるT細胞は、高い効果を示し
、本発明による組成物を用いた治療の潜在的副作用を減らすサイトカインのイン
ビトロ適用への依存を減らす。さらに、本発明に従って活性化されたT細胞は、
より分化され、より効果的に活性化されるので、上記の方法により活性化された
T細胞は、患者における不活性化機構に対する減少した感応性を示す。
又は予防処置のための、薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤と必要に応じ
て組み合わせる、T細胞活性化剤及び/又は本発明による組成物の薬学的有効量
を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明による医薬組成物は、本発明による
T細胞活性化剤及び/又は組成物と相加的に又は相乗的に作用し得る、1つ以上
の他のT細胞活性化剤を含み得る。本発明による医薬組成物は、例えば注入又は
注射による、静脈内、筋肉内、皮内、皮下及び/又はリンパ管内投与のようなワ
クチン接種又は細胞治療に使用されるあらゆる慣用の適用ルートに応用され得る
。
遺伝性免疫機能障害のような疾患により引き起こされ得る免疫系の機能障害に苦
しむ患者の処置方法に応用され得、その方法は、患者において特異的免疫応答を
行なうため及び/又は刺激するために充分な量の、上記で定義した医薬組成物を
投与するステップを含む。
の調製法に関する。本発明による活性化された樹状細胞の調製法は、ステップ (a)抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスと処理する (b)患者又はその親類から単球を調製する (c)インビトロでのインキュベーションにより単球から樹状細胞を発育させる (d)得られた樹状細胞を、ステップ(a)で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで、及び/又はステップ(a)で得られた非処理抗原プラスウイル
スとインビトロでコインキュベートする、 を含み、ここで該ウイルスは、抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗
原の提示を改善することができ、樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナ
リング(cosignalling)を調節することができる。
異系TCでの養子細胞療法 患者からの抗原の調製 NDV修飾された腫瘍細胞の調製は、次のステップを含む: (1)外科的介入による腫瘍材料の分離 (2)機械的及び酵素学的手段により単細胞の懸濁液中への腫瘍細胞材料の解離
:コラゲナーゼ(5 U/ml)及びDNase(15 U/ml)で37℃で30分間イン
キュベーションを4回。必要に応じて、汚染する非腫瘍細胞を減らす腫瘍細胞の
免疫ビーズ(immunobead)精製。 (3)腫瘍細胞の凍結保存(cryoconservation) (4)腫瘍細胞の解凍及びNDVでの修飾/感染:1 x 107細胞当りウイルスの
20〜100赤血球凝集単位。 (5)ショックフリージングと解凍の4〜5サイクルによる、NDV修飾された
腫瘍細胞の不活性化。
ロイキン4(IL−4)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CS
F)及び腫瘍壊死因子(TNF)での標準的な培養によりDC中に成熟及び分化
を促す (i)150 ml血液から細胞の単離 (ii)RPMI 1640プラス2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlス
トレプトマイシン、並びに5%オートロガス、非不活性化血漿、1000 U/ml IL-4(
Promocell製)及び1000 U/ml GM-CSFで補足した中で、1日間単球の培養 (iii)培地を変え、上記培地中で2日間培養(デイ1) (iv)培地を変え、10 ng/mlの最終濃度でTNFα(Promocell製)の添加(
デイ4) (3)ライゼートをDCに加え、続いて細胞培養培地中インキュベーションによ
り、ウイルス修飾された腫瘍細胞ライゼートでDCをロード/パルスする (v)1 ml X-vivo培地中、3部の腫瘍死細胞に対し1部のDCの比で、DCを
腫瘍細胞に加え、低速[1時間当り1000回転(rph)]での遠心分離、37℃で4
時間インキュベーション(デイ5) (vi)蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析を用いた、抗原ロードさ
れたDCの制御 (vii)3日間、RPMI+5%血漿+IL‐4+GM-CSF+TNFα中、
抗原ロードされたDCの培養(デイ8まで) (4)免疫ビーズ濃縮ステップ(これはTCの生成/ローディング段階の間行わ
れ得る)を含む方法による、骨髄及び/又は血液からのTCの単離 (viii)150 ml血液からのTCの単離(赤血球(erythroycte)溶解、粘着性
、PanT細胞単離キット) (ix)FACS分析を用いたTCの制御 (5)細胞培養物におけるTCの増大 (6)これらのサイトカインに対するTCの依存性の誘発を避けるために、低又
は中用量のサイトカインの存在下での短いインキュベーションを含む、NDV修
飾された腫瘍ライゼートでパルスされているDC及びTCのコインキュベーショ
ン (x)34部TCに対して1部DCの比で抗原ロードされたDCへのTCの添
加及び3日間、5%血漿で(しかしサイトカインは無し)補充された新鮮なRP
MI中でのインキュベーション(デイ11まで) (xi)デイ11に培地を変え、IL−2(6000 U/ml)を加え、3日間の培養 (xii)活性化されたTCを収集し、10 ml培地I中でTCを再懸濁させ、静脈
注射のために該懸濁液を注射器に満たし、ろ過する;ろ液を400 μl培地I中に取
りこみ、皮下注射する。 (7)ELISPOTを用いる、活性化されたTCの抗腫瘍活性の分析 T細胞は、20時間、抗原とコインキュベートされる(チャレンジされる(chal
lenged))。その後、γ-インターフェロン(IFN‐γ)生成は、抗IFN-γ
抗体でコートされたプレート上のそれぞれの単T細胞に対して検出される。結合
IFN-γは、ELISA染色によりT細胞を囲んだスポットで検出される。
である、中用量又は用量強化化学療法及び/又は放射線療法及び/又はコルチコ
ステロイド及びシクロスポリンでの患者の免疫抑制。
のヒドロコーチゾルで該患者を処理する。さらに、骨転移の30 Gray照射を行な
った。 (2)デイ15 NDV−DC処理により活性化された同種異系TCの静脈注射注入 上記で記載された方法により活性化されている約5x108T細胞は、250 ml乳酸
リンゲル液の体積で注入される。 (3)6週の休みの後、次の処置サイクル。
解した組換えヒト(rHU)IL-4cc(ストック溶液:1 x 105 U/ml、1 x 105 μg/m
lに対応) PBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA)中に溶解したGM−CSF(スト
ック溶液:1 x 105 U/ml) RPMI 1640/1%BSA中に溶解したrHU TNFα(ストック溶液:1 μg/ml) X-vivo(ストック溶液:6 x 105 U/ml、希釈1:100)、プロロイキン(proleuk
in)(Chiron製)中に溶解したIL−2 ウイルス処理された抗原対非処理抗原でパルスしたときの樹状細胞の増加した
T細胞活性化特性 ウイルス処理対非処理抗原 10%ウシ胎児血清(FCS)で補足されたRPMI培地中で、MCF−7細胞
を培養した。FCSを取り除くために1 x 107細胞を洗い、37℃で60分間ウイル
ス溶液を加えることにより、RPMI培地中、ニューカッスル病ウイルス株アル
スター(Ulster)の60凝集素量(Hemaglutinating Unit)で感染させた。RPMI/2
%FCS中37℃で24時間インキュベーションを行なう前に、非吸着ウイルスを
もう一度洗い落とした。
同様に処理された(すなわち、FCSなしでRPMI中60分間インキュベーシ
ョン、続いてRPMI/2%FCS中24時間インキュベーション)。
細胞を凍結−解凍の3サイクルにより溶解した。タンパク質含有量を両方の調製
物において評価した。
のように、骨髄から樹状細胞を調製する。
非感染したMCF-7-細胞でコインキュベートした。これは、樹状細胞を洗い、洗っ
た細胞を対応する抗原性タンパク質溶液に加えることにより行なった。
ように、患者からのオートロガスT細胞を骨髄から調製した。抗原パルスされた
樹状細胞を、5つのT細胞に対し1つの樹状細胞の割合で、T細胞に加えた。イ
ンキュベーションを48時間行なった。
より、単細胞ベースで測定した。“患者の親類からのT細胞及び樹状細胞の調製
”の項目(7)で上記記載のように、ELISA染色によりT細胞を囲むスポットに
おいて、結合γ-インターフェロンを検出する。
415個のスポット形成細胞が検出された。非感染MCF-7細胞で刺激された2,5x1
04個のT細胞において、たった190個のスポット形成細胞が検出された。パル
スされていない樹状細胞で刺激された2,5x104個のT細胞において、150個の
スポット形成細胞が検出された。全く刺激されていない2,5x104個のT細胞にお
いて、12個より少ないスポットが観察された。樹状細胞が非乳がん細胞系でパ
ルスされていた時、165個のスポットがカウントされた。
細胞のT細胞刺激能は、非感染抗原でパルスされた樹状細胞、非パルス樹状細胞
及び非乳ガン細胞系でパルスされた樹状細胞に比べて、2倍より大きかったこと
を示している。
安定性 抗原として使われた、照射MCF-7腫瘍細胞は、NDVで30分間感染され、さ
らなるインキュベーションなしで4℃で終夜貯蔵された。
非感染MCF-7細胞を使用した。さらなるコントロールとして、末梢血白血球が使
用された。
インターロイキン‐4(IL−4)での、乳がん患者の末梢血からの単球のイン
キュベーションにより生成した(例えば、参考文献8.参照)。
より、感染され照射されしかし溶解されてないMCF−7細胞、又はコントロー
ル細胞でパルスされた。6時間後、樹状細胞の最後の分化を援助するために、T
NF−α、IL−1、IL−6及びプロスタグランジンE2を培地に加えた。そ
の後、インキュベーションを40時間続けた。
細胞を4℃6時間貯蔵し、続いて90時間37℃で、サイトカインは無いがオー
トロガス血清を含む培地中でインキュベーションした。この手順は、ワクチンの
4℃での貯蔵、それから、ワクチンの注射後のオートロガス患者におけるパルス
された樹状細胞のインビボ持続性を模倣する(immitate)。
トロガスT細胞の短期(42時間)刺激に用いた。T細胞に対する樹状細胞の比
は、1対10〜1対100であった。
を、上記ELISPOT法により測定した。
トロール細胞でパルスされていたそれらの樹状細胞より、実質的により多くのγ
−インターフェロン産生(即ち活性化された)T細胞を誘導した。さらに、ウイ
ルス感染したMCF−7細胞でパルスされた樹状細胞は、ウイルス感染したMC
F−7細胞のみ、非感染MCF−7細胞のみ、ウイルスパルスされた樹状細胞又
は末梢血白血球でパルスされた樹状細胞より、T細胞をより効果的に刺激した。
このように、樹状細胞刺激活性のウイルス増強の効果は、サイトカインなしのイ
ンキュベーションの90時間超後でさえ、安定だった。それゆえ、これらの細胞
を含むワクチンとして使用されるT細胞活性化剤は、少なくともこの期間、その
インビボT(メモリー)細胞刺激活性を維持することができる。
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Claims (44)
- 【請求項1】患者における特異的免疫応答を行ない及び刺激することができ
る活性化T細胞を含む組成物であって、該T細胞は該患者又はその親類から調製
され、インビトロでT細胞活性化剤での処理により活性化され、ここで、該T細
胞活性化剤は、次のステップを含む方法により活性化される樹状細胞を含む (a)抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、 (b)患者又はその親類から単球を調製する、 (c)インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る(develop)、 (d)得られた樹状細胞を、ステップ(a)で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び/又はステップ(a)で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、 ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング(cosignalling)を調節することができる。 - 【請求項2】 T細胞の処理が7日間より長くない活性化された樹状細胞
での短期間インキュベーションを含む、請求項1に記載の組成物。 - 【請求項3】 活性化されたT細胞は少なくとも部分的にTメモリー細胞
である、請求項1又は2に記載の組成物。 - 【請求項4】 活性化されるT細胞の少なくとも一部及び/又は単球の少
なくとも一部は患者の又は親類の骨髄から調製される、請求項1〜3のいずれか
1つに記載の組成物。 - 【請求項5】 T細胞の処理は6000 U/ml未満のIL−2を含む培養培地
中で行なわれる、請求項1〜4のいずれか1つに記載の組成物。 - 【請求項6】 該方法は、照射を使用せずに、ステップ(a)で得られた
ウイルス処理された抗原を不活性化するステップをさらに含む、請求項1〜5の
いずれか1つに記載の組成物。 - 【請求項7】 ウイルス処理された抗原が凍結−解凍又は超音波処理(ul
trasonification)により不活性化される、請求項6に記載の組成物。 - 【請求項8】 ステップ(d)において、樹状細胞は、抗原及び/又はウ
イルスでのコインキュベーションに加え又はその代わりに、ウイルス処理された
抗原をコードする(1つ以上の)核酸及び/又は前記ウイルス処理された抗原が
提示する対応する免疫シグナルで処理される、請求項1〜7のいずれか1つに記
載の組成物。 - 【請求項9】 抗原が患者から調製される、請求項1〜8のいずれか1つ
に記載の組成物。 - 【請求項10】 抗原は細胞又はその一部である、請求項1〜9のいずれ
か1つに記載の組成物。 - 【請求項11】 細胞が腫瘍細胞である、請求項10に記載の組成物。
- 【請求項12】 細胞が免疫ビーズ(immunobead)技術によりさらに精製
される、請求項10又は11に記載の組成物。 - 【請求項13】 細胞が、それらの調製後凍結保存(cryoconservated)
され、ステップ(a)でウイルスでの処理及び/又はステップ(d)で樹状細胞
とのコインキュベーションの前又は後に解凍される、請求項10〜12のいずれ
か1つに記載の組成物。 - 【請求項14】 ステップ(c)で、発育する樹状細胞がウイルスともコ
インキュベートされる、請求項1〜13のいずれか1つに記載の組成物。 - 【請求項15】 ステップ(d)において、ウイルスが抗原及び樹状細胞
間の融合を少なくとも一部誘発する、請求項1〜14のいずれか1つに記載の組
成物。 - 【請求項16】 ウイルスが、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス
、ミクソウイルス、ヘルペスウイルス、AIDSウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス
及びマウス乳ガンウイルスからなる群から選択される、請求項1〜15のいずれ
か1つに記載の組成物。 - 【請求項17】 パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス又はム
ンプスウイルスである、請求項16に記載の組成物。 - 【請求項18】 患者の免疫系が著しく障害されている、請求項1〜17
のいずれか1つに記載の組成物。 - 【請求項19】 免疫系の障害がガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及
び/又は遺伝性免疫機能障害により引き起こされる、請求項18に記載の組成物
。 - 【請求項20】 患者がヒトである、請求項1〜19のいずれか1つに記
載の組成物。 - 【請求項21】 1つ以上の他のT細胞活性化剤をさらに含む、請求項1
〜20のいずれか1つに記載の組成物。 - 【請求項22】 患者における特異的免疫応答を行い及び刺激するT細胞
の活性化のための活性化された樹状細胞を含むT細胞活性化剤であって、 ここで、該樹状細胞はステップ (a)抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、 (b)患者又はその親類から単球を調製する、 (c)インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る、 (d)得られた樹状細胞を、ステップ(a)で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び/又はステップ(a)で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、 を含む方法により活性化され、 ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング(cosignalling)を調節することができる。 - 【請求項23】 該方法は、照射を使用せずに、ステップ(a)で得られ
たウイルス処理された抗原を不活性化するステップをさらに含む、請求項22に
記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項24】 ウイルス処理された抗原が凍結−解凍又は超音波処理(ul
trasonification)により不活性化される、請求項23に記載のT細胞活性化剤
。 - 【請求項25】 ステップ(d)において、樹状細胞は、抗原及び/又は
ウイルスでのコインキュベーションに加え又はその代わりに、ウイルス処理され
た抗原をコードする(1つ以上の)核酸及び/又は前記ウイルス処理された抗原
が提示する対応する免疫シグナルで処理される、請求項22〜24のいずれか1
つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項26】 抗原は患者から調製される、請求項22〜25のいずれ
か1つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項27】 抗原は細胞又はその一部である、請求項22〜26のい
ずれか1つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項28】 細胞が腫瘍細胞である、請求項27に記載のT細胞活性
化剤。 - 【請求項29】 細胞が免疫ビーズ(immunobead)技術によりさらに精製
される、請求項27又は28に記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項30】 細胞が、それらの調製後凍結保存(cryoconservated)
され、ステップ(a)でウイルスでの処理及び/又はステップ(d)で樹状細胞
でのコインキュベーションの前又は後に解凍される、請求項27〜29のいずれ
か1つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項31】 ステップ(c)において、発育する樹状細胞もウイルス
とコインキュベートされる、請求項22〜30のいずれか1つに記載のT細胞活
性化剤。 - 【請求項32】 ステップ(d)において、ウイルスが抗原及び樹状細胞
間の融合を少なくとも一部誘発する、請求項22〜31のいずれか1つに記載の
T細胞活性化剤。 - 【請求項33】 ウイルスが、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス
、ミクソウイルス、ヘルペスウイルス、AIDSウィルス、ヒト乳頭腫ウイルス
及びマウス乳ガンウイルスからなる群から選択される、請求項22〜32のいず
れか1つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項34】 パラミクソウイルスがニューカッスル病ウイルス又はム
ンプスウイルスである、請求項33に記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項35】 患者の免疫系が著しく障害されている、請求項22〜3
4のいずれか1つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項36】 免疫系の障害がガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及
び/又は遺伝性免疫機能障害により引き起こされる、請求項35に記載のT細胞
活性化剤。 - 【請求項37】 患者がヒトである、請求項22〜36のいずれか1つに
記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項38】 1つ以上の他のT細胞活性化剤をさらに含む、請求項2
2〜37のいずれか1つに記載のT細胞活性化剤。 - 【請求項39】 必要に応じて医薬的に許容される担体及び/又は希釈剤
と組み合わせて、医薬的に有効量の請求項1〜21のいずれか1つに記載の組成
物及び/又は請求項22〜38のいずれか1つに記載のT細胞活性化剤を含む医
薬組成物。 - 【請求項40】 ガン、感染症及び自己免疫疾患の治療又は予防処置のた
めの請求項39に記載の医薬組成物。 - 【請求項41】 以下のステップ (a)抗原を調製し、必要に応じてインビトロで該抗原をウイルスで処理する、 (b)患者又はその親類から単球を調製する、 (c)インビトロでのインキュベーションにより該単球から樹状細胞を発育させ
る、 (d)得られた樹状細胞を、ステップ(a)で得られたウイルス処理された抗原
とインビトロで及び/又はステップ(a)で得られた非処理抗原プラスウイルス
とインビトロでコインキュベートする、 を含む活性化された樹状細胞の調製法であって、 ここで、該ウイルスは抗原の樹状細胞への接着性及び樹状細胞による抗原の提示
を改善することができ、それは樹状細胞の活性化、成熟、安定性及びコシグナリ
ング(cosignalling)を調節することができる。 - 【請求項42】 (i)患者又はその親類からT細胞を調製する、 (ii)請求項22〜38のいずれか1つに記載のT細胞活性化剤でT細胞をイ
ンビトロ処理する、 のステップを含む活性化されたT細胞の調製法。 - 【請求項43】 患者において特異的免疫応答を刺激及び/又は行なうの
に充分な量で、請求項39又は40に記載の医薬組成物を投与するステップを含
む、免疫系障害を患う患者の治療法。 - 【請求項44】 免疫系障害がガン、感染症、腎不全、自己免疫疾患及び
/又は遺伝性免疫機能障害により引き起こされる、請求項43に記載の方法。
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