JP2980986B2 - 殺腫瘍性ｔリンパ球 - Google Patents
殺腫瘍性ｔリンパ球Info
- Publication number
- JP2980986B2 JP2980986B2 JP6521652A JP52165294A JP2980986B2 JP 2980986 B2 JP2980986 B2 JP 2980986B2 JP 6521652 A JP6521652 A JP 6521652A JP 52165294 A JP52165294 A JP 52165294A JP 2980986 B2 JP2980986 B2 JP 2980986B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lymphocytes
- tumoricidal
- cells
- cell line
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 87
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 78
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 143
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 20
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 14
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 10
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 7
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- AJMOLNFDYWTVQW-QWRGUYRKSA-N L-leucyl-l-leucine methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AJMOLNFDYWTVQW-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims 2
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 claims 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 4
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 108010062054 leucyl-leucine-methyl ester Proteins 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QVDXUKJJGUSGLS-LURJTMIESA-N methyl L-leucinate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC(C)C QVDXUKJJGUSGLS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008025 pharmaceutical bulking agent Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940068918 polyethylene glycol 400 Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- NESLWCLHZZISNB-UHFFFAOYSA-M sodium phenolate Chemical compound [Na+].[O-]C1=CC=CC=C1 NESLWCLHZZISNB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、哺乳動物細胞系及びその活性断片であっ
て、同種刺激が回避される間にそれがリンパ球と同時に
培養されるときに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞（tumori
cidal T cells）を形成するように活性化するもの、こ
のような細胞系又はそれらの活性断片とリンパ球を同時
培養することにより殺腫瘍性Ｔ細胞を生産する方法、こ
の方法により得ることができる殺腫瘍性Ｔリンパ球、並
びに腫瘍治療において使用されることができる治療剤の
製造のためのこれらのＴリンパ球の使用に関する。
て、同種刺激が回避される間にそれがリンパ球と同時に
培養されるときに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞（tumori
cidal T cells）を形成するように活性化するもの、こ
のような細胞系又はそれらの活性断片とリンパ球を同時
培養することにより殺腫瘍性Ｔ細胞を生産する方法、こ
の方法により得ることができる殺腫瘍性Ｔリンパ球、並
びに腫瘍治療において使用されることができる治療剤の
製造のためのこれらのＴリンパ球の使用に関する。
細胞性免疫防御は、病因学的に変更された内因性細
胞、例えば、ウイルス又は腫瘍細胞により感染された細
胞の除去において重要な役割を演じている。この過程に
おいては、細胞毒活性Ｔリンパ球が、表面抗原に基づい
てその変更された内因性細胞を認識する。これらの表面
抗原は、普通には、それらの細胞により形成されたタン
パク質断片であり、そしていわゆる主要組織適合複合体
（MHC）の表面レセプターに結合して細胞表面上に存在
する（Zinkernagel et al.,Nature 248（1974）,701−7
02及びBabbit et al.,Nature 317（1985）,359−36
1）。しかしながら、これらの腫瘍細胞のこれらの表面
抗原が健康な細胞の対応抗原とほんの僅かに異なる場合
には、その免疫系は、それらの腫瘍細胞を除去すること
ができるであろう細胞毒活性Ｔリンパ球をおそらく全く
形成することができない。
胞、例えば、ウイルス又は腫瘍細胞により感染された細
胞の除去において重要な役割を演じている。この過程に
おいては、細胞毒活性Ｔリンパ球が、表面抗原に基づい
てその変更された内因性細胞を認識する。これらの表面
抗原は、普通には、それらの細胞により形成されたタン
パク質断片であり、そしていわゆる主要組織適合複合体
（MHC）の表面レセプターに結合して細胞表面上に存在
する（Zinkernagel et al.,Nature 248（1974）,701−7
02及びBabbit et al.,Nature 317（1985）,359−36
1）。しかしながら、これらの腫瘍細胞のこれらの表面
抗原が健康な細胞の対応抗原とほんの僅かに異なる場合
には、その免疫系は、それらの腫瘍細胞を除去すること
ができるであろう細胞毒活性Ｔリンパ球をおそらく全く
形成することができない。
それ故、このような腫瘍細胞に対して細胞性免疫抵抗
性を誘導するための試みが既に行われている。このため
には、非特異的な免疫刺激剤、例えば、Bacillus Calme
tte−Gurin（BCG）,Corynebacterium parvum又は腫瘍
細胞抽出物からのワクチンによる能動的免疫感作を達成
することが最初に企てられた（Terry and Rosenberg ed
s.,Immunotherapy of Human Cancer（1982）,Elserier
North Holland）。より良好な結果が、いわゆる養子免
疫療法（adoptive immunotherapy）の概念を用いて得ら
れた。このケースにおいては、患者のリンパ球がインビ
トロにおいて活性化され、そしてその後、再移植され
る。このような“無差別のもう一細胞（promiscuous ki
llercells）”を形成するためのインビトロにおける活
性化（D.Thiele et al.,Immunology Today 10（1989）,
375−381）は、普通には、インターロイキン２の添加に
より行われる。得られた細胞毒性リンパ球は、その後リ
ンホカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）と表示されて
いる（Rosenberg,Immunology Today 9（1988）,58−6
2）。細胞毒性Ｔリンパ球とは異なり、腫瘍細胞に対す
るLAK細胞の作用は、腫瘍抗原の認識のためのMHC遺伝子
の正しい発現に依存せず、そしてこの免疫系のナチュラ
ル・キラー細胞とは異なり、LAK細胞は、新たな腫瘍細
胞に対しても有効である。LAK細胞を使用しての最初の
臨床的成功が既に可能となっている。しかしながら、養
子免疫療法の上記形態の欠点は、長い期間にわたり比較
的高い投与量において必要とされるインターロイキン２
の副作用である。これは、主に毛細血管の透過性におけ
る増加及び臓器の同時機能失調をもたらす（Rosenberg,
Immunology Today 9（1988）,58−62,Rosenstein et a
l.,Journal Immunology 137（1986）,1735−1742及びEt
tinghausen et al.,Surg.Forum 37（1987）,388−38
9）。さらにLAK細胞であって、インターロイキン２によ
り刺激されたとき、健康な内因性細胞に対して向けられ
るものが得られている（B.Chen et al.,Cell.Immunol.1
18（1989）,458−469）。
性を誘導するための試みが既に行われている。このため
には、非特異的な免疫刺激剤、例えば、Bacillus Calme
tte−Gurin（BCG）,Corynebacterium parvum又は腫瘍
細胞抽出物からのワクチンによる能動的免疫感作を達成
することが最初に企てられた（Terry and Rosenberg ed
s.,Immunotherapy of Human Cancer（1982）,Elserier
North Holland）。より良好な結果が、いわゆる養子免
疫療法（adoptive immunotherapy）の概念を用いて得ら
れた。このケースにおいては、患者のリンパ球がインビ
トロにおいて活性化され、そしてその後、再移植され
る。このような“無差別のもう一細胞（promiscuous ki
llercells）”を形成するためのインビトロにおける活
性化（D.Thiele et al.,Immunology Today 10（1989）,
375−381）は、普通には、インターロイキン２の添加に
より行われる。得られた細胞毒性リンパ球は、その後リ
ンホカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）と表示されて
いる（Rosenberg,Immunology Today 9（1988）,58−6
2）。細胞毒性Ｔリンパ球とは異なり、腫瘍細胞に対す
るLAK細胞の作用は、腫瘍抗原の認識のためのMHC遺伝子
の正しい発現に依存せず、そしてこの免疫系のナチュラ
ル・キラー細胞とは異なり、LAK細胞は、新たな腫瘍細
胞に対しても有効である。LAK細胞を使用しての最初の
臨床的成功が既に可能となっている。しかしながら、養
子免疫療法の上記形態の欠点は、長い期間にわたり比較
的高い投与量において必要とされるインターロイキン２
の副作用である。これは、主に毛細血管の透過性におけ
る増加及び臓器の同時機能失調をもたらす（Rosenberg,
Immunology Today 9（1988）,58−62,Rosenstein et a
l.,Journal Immunology 137（1986）,1735−1742及びEt
tinghausen et al.,Surg.Forum 37（1987）,388−38
9）。さらにLAK細胞であって、インターロイキン２によ
り刺激されたとき、健康な内因性細胞に対して向けられ
るものが得られている（B.Chen et al.,Cell.Immunol.1
18（1989）,458−469）。
養子免疫療法のためのより有効な方法についての探索
において、活性化されるべきリンパ球が、自己の（auto
logous）腫瘍細胞の存在中でも培養された（混合リンパ
球腫瘍培養、G.Fossati et al.,International Journal
of Cancer 42（1988）,239−245;G.Degiovanni et a
l.,Eur.J.Immunol.18（1988）,671−676;Wlfel et a
l.J.Exp.Med.170（1989）,797−819;Darrow et al.,J.I
mmunol.142（1989）,3329−3335及びNotter et al.,In
t.J.Cancer 45（1990）,834−841）。さらに、インビト
ロにおいて腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の増殖のための方
法も、記載されている（Yron et al.,J.Immunol.125（1
980）,238−245）。LAK細胞とは異なり、これらの腫瘍
浸潤リンパ球は、高い腫瘍特異性をもち、すなわち、そ
れらは、それら自身が単離された腫瘍に対してのみ活性
である。このような腫瘍浸潤リンパ球は、他の患者から
の同一タイプの腫瘍に対しては等しく有効ではない。こ
れは、それらの治療用途をかなり限定している。
において、活性化されるべきリンパ球が、自己の（auto
logous）腫瘍細胞の存在中でも培養された（混合リンパ
球腫瘍培養、G.Fossati et al.,International Journal
of Cancer 42（1988）,239−245;G.Degiovanni et a
l.,Eur.J.Immunol.18（1988）,671−676;Wlfel et a
l.J.Exp.Med.170（1989）,797−819;Darrow et al.,J.I
mmunol.142（1989）,3329−3335及びNotter et al.,In
t.J.Cancer 45（1990）,834−841）。さらに、インビト
ロにおいて腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の増殖のための方
法も、記載されている（Yron et al.,J.Immunol.125（1
980）,238−245）。LAK細胞とは異なり、これらの腫瘍
浸潤リンパ球は、高い腫瘍特異性をもち、すなわち、そ
れらは、それら自身が単離された腫瘍に対してのみ活性
である。このような腫瘍浸潤リンパ球は、他の患者から
の同一タイプの腫瘍に対しては等しく有効ではない。こ
れは、それらの治療用途をかなり限定している。
本発明の目的は、よれ故、先に知られているインビト
ロにおいて活性化されたＴリンパ球よりも腫瘍治療によ
り好適である腫瘍破壊性Ｔリンパ球を提供することであ
る。
ロにおいて活性化されたＴリンパ球よりも腫瘍治療によ
り好適である腫瘍破壊性Ｔリンパ球を提供することであ
る。
この目的は、哺乳動物細胞系又はその活性な亜細胞画
分であって、 （ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれらをリンパ
球と同時培養するとき、それらが、マイトジェン又は成
長因子、例えば、インターロイキン２の添加する必要性
を伴わずに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するよう
に活性化し、そして （ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロ
イキン２の添加を伴わずに、それらの存在中で増殖す
る、 ことを特徴とするものにより達成される。
分であって、 （ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれらをリンパ
球と同時培養するとき、それらが、マイトジェン又は成
長因子、例えば、インターロイキン２の添加する必要性
を伴わずに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するよう
に活性化し、そして （ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロ
イキン２の添加を伴わずに、それらの存在中で増殖す
る、 ことを特徴とするものにより達成される。
おどろくべきことに、HLA制限をもたない広い殺腫瘍
活性をもつ殺腫瘍Ｔリンパ球が本発明に係る細胞系又は
その活性な亜細胞画分／断片と共に同時培養することに
より得られることができることが判明した。これに関し
て、殺腫瘍活性は、対応の腫瘍細胞に対する殺生効果、
そして特に溶解効果、並びにこれらの腫瘍細胞の増殖に
対する阻害作用と理解される。
活性をもつ殺腫瘍Ｔリンパ球が本発明に係る細胞系又は
その活性な亜細胞画分／断片と共に同時培養することに
より得られることができることが判明した。これに関し
て、殺腫瘍活性は、対応の腫瘍細胞に対する殺生効果、
そして特に溶解効果、並びにこれらの腫瘍細胞の増殖に
対する阻害作用と理解される。
細胞系は、HeLa細胞（ATCC CCL 2）の特性をもつ無制
限の増殖能力をもつような細胞と理解される（James D.
Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th ed
ition,The Beujamin/Cummings Publishing Co.,Jnc.（1
987）,p.963）。このような細胞系は、例えば、ヒト血
液リンパ球を不死化することにより得られる。不死化
は、好ましくは、EP−B 0 093 436又はEP−B 0 256 512
（この内容も本特許出願の対象である。）中に記載され
た方法に従ってマウス・ミエローマ細胞系Ag8.653から
の細胞質体による融合により行われる。このように得ら
れた不死化リンパ球系は、次に、ヒト・ドナー・リンパ
球と共に同時培養される。
限の増殖能力をもつような細胞と理解される（James D.
Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th ed
ition,The Beujamin/Cummings Publishing Co.,Jnc.（1
987）,p.963）。このような細胞系は、例えば、ヒト血
液リンパ球を不死化することにより得られる。不死化
は、好ましくは、EP−B 0 093 436又はEP−B 0 256 512
（この内容も本特許出願の対象である。）中に記載され
た方法に従ってマウス・ミエローマ細胞系Ag8.653から
の細胞質体による融合により行われる。このように得ら
れた不死化リンパ球系は、次に、ヒト・ドナー・リンパ
球と共に同時培養される。
血液リンパ球が、好ましくは、リンパ球として使用さ
れる。しかしながら、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）脾臓又
はリンパ節からのリンパ球を使用することもできる。こ
れに関して、使用前にリンパ球調製物を精製することが
好ましい。血液リンパ球を使用するとき、赤血球を実質
的に除去し、そしてその単核赤血球を濃縮することが特
に好都合である。また、本発明に係る細胞系又はそれら
の活性断片により同種（allogenically）刺激されるこ
とができる細胞の数を減少させることも有利である。
れる。しかしながら、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）脾臓又
はリンパ節からのリンパ球を使用することもできる。こ
れに関して、使用前にリンパ球調製物を精製することが
好ましい。血液リンパ球を使用するとき、赤血球を実質
的に除去し、そしてその単核赤血球を濃縮することが特
に好都合である。また、本発明に係る細胞系又はそれら
の活性断片により同種（allogenically）刺激されるこ
とができる細胞の数を減少させることも有利である。
同種刺激を回避するために、このような刺激に感受性
であるリンパ球を、同時培養前にそのドナー・リンパ球
集団から取り除く。このために、単球、マクロファージ
・ナチュラル・キラー細胞及びMHC−制限細胞毒性Ｔ細
胞、そして特に、その活性細胞系及びそれらの前駆細胞
の同種MHCに対して向けられているものは、好ましく
は、Thiele and Lipsky（The Journal of Immunology,V
ol.136,No.3（1986）,p.1038−1048）に従って、Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−ロイシン・メチル・エステルと共にインキ
ュベーションすることにより除去される。これらの不死
化細胞系は、この同時培養の間にドナー・リンパ球が殺
腫瘍性Ｔリンパ球を形成するように活性化することを引
き起こす同時培養の後に選択される。この過程におい
て、その同時培養の間にそれらを活性化するドナー・リ
ンパ球により溶解されるリンパ球系を活性化するもの
を、好ましくは、さらに検査する。さらなる選択のため
に、リンパ球系を活性化するものを、それにより活性化
されているドナー・リンパ球及び一連の異なる腫瘍細胞
系と一緒に培養する。最後に、リンパ球系を活性化する
ものであって、検査された腫瘍細胞系に対して殺腫瘍作
用をもつ活性化されたドナー・リンパ球を導くものを、
選択する。この場合において、殺腫瘍作用は、その検査
された腫瘍細胞系の殺生、特に溶解としてだけでなく、
増殖に対する阻害効果としても理解されるべきである。
この殺腫瘍作用（tumoricidal action）は、例えば、当
業者に馴染みのある細胞毒性テストにより、検出される
ことができ、例えば、そこでは、その殺腫瘍性Ｔリンパ
球並びにその活性化リンパ球系から形態学的に区別され
ることができる腫瘍細胞系が、長い培養の間に、その同
時培養から消失し、又は、殺腫瘍性Ｔリンパ球により少
なくとも過増殖される。この殺腫瘍性Ｔリンパ球は、好
ましくは、CD3+,CD4+及び／又はCD8+である。
であるリンパ球を、同時培養前にそのドナー・リンパ球
集団から取り除く。このために、単球、マクロファージ
・ナチュラル・キラー細胞及びMHC−制限細胞毒性Ｔ細
胞、そして特に、その活性細胞系及びそれらの前駆細胞
の同種MHCに対して向けられているものは、好ましく
は、Thiele and Lipsky（The Journal of Immunology,V
ol.136,No.3（1986）,p.1038−1048）に従って、Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−ロイシン・メチル・エステルと共にインキ
ュベーションすることにより除去される。これらの不死
化細胞系は、この同時培養の間にドナー・リンパ球が殺
腫瘍性Ｔリンパ球を形成するように活性化することを引
き起こす同時培養の後に選択される。この過程におい
て、その同時培養の間にそれらを活性化するドナー・リ
ンパ球により溶解されるリンパ球系を活性化するもの
を、好ましくは、さらに検査する。さらなる選択のため
に、リンパ球系を活性化するものを、それにより活性化
されているドナー・リンパ球及び一連の異なる腫瘍細胞
系と一緒に培養する。最後に、リンパ球系を活性化する
ものであって、検査された腫瘍細胞系に対して殺腫瘍作
用をもつ活性化されたドナー・リンパ球を導くものを、
選択する。この場合において、殺腫瘍作用は、その検査
された腫瘍細胞系の殺生、特に溶解としてだけでなく、
増殖に対する阻害効果としても理解されるべきである。
この殺腫瘍作用（tumoricidal action）は、例えば、当
業者に馴染みのある細胞毒性テストにより、検出される
ことができ、例えば、そこでは、その殺腫瘍性Ｔリンパ
球並びにその活性化リンパ球系から形態学的に区別され
ることができる腫瘍細胞系が、長い培養の間に、その同
時培養から消失し、又は、殺腫瘍性Ｔリンパ球により少
なくとも過増殖される。この殺腫瘍性Ｔリンパ球は、好
ましくは、CD3+,CD4+及び／又はCD8+である。
本発明の好ましい対象は、リンパ球細胞系、特に好ま
しくはＢリンパ球細胞系、又はそれらの活性断片であっ
て、 （ａ）同種刺激が回避される、それらがリンパ球と同時
培養されるときに、それらが、マイトジェン又は成長因
子、例えば、インターロイキン２を添加することを伴わ
ずに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性
化し、そして （ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロ
イキン２の添加を伴わずに、それらの存在中で増殖す
る、 ことを特徴とするものである。
しくはＢリンパ球細胞系、又はそれらの活性断片であっ
て、 （ａ）同種刺激が回避される、それらがリンパ球と同時
培養されるときに、それらが、マイトジェン又は成長因
子、例えば、インターロイキン２を添加することを伴わ
ずに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性
化し、そして （ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロ
イキン２の添加を伴わずに、それらの存在中で増殖す
る、 ことを特徴とするものである。
ヒトＢ細胞系HB654及びHB617が特に好ましい。
本発明に記載の細胞系及び活性画分を使用すれば、こ
れらのリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性
化することを引き起こすことが、同種刺激を回避しなが
ら単に、リンパ球と同時培養することにより、可能であ
る。この活性は、好ましくは、上記リンパ球が、上記細
胞系又はその活性画分（断片）と直接接触する間に生じ
る。IL2及び／又はIL2レセプターに対する抗体の添加
が、本発明に係る細胞系の活性効果を阻害することが判
明している。
れらのリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性
化することを引き起こすことが、同種刺激を回避しなが
ら単に、リンパ球と同時培養することにより、可能であ
る。この活性は、好ましくは、上記リンパ球が、上記細
胞系又はその活性画分（断片）と直接接触する間に生じ
る。IL2及び／又はIL2レセプターに対する抗体の添加
が、本発明に係る細胞系の活性効果を阻害することが判
明している。
それ故、本発明は、本発明に係る細胞系又はその活性
断片とリンパ球を同時培養することにより殺腫瘍性Ｔリ
ンパ球を生産する方法にも関する。
断片とリンパ球を同時培養することにより殺腫瘍性Ｔリ
ンパ球を生産する方法にも関する。
本発明に係る方法を行うために、リンパ球（好ましく
は、単核リンパ球）を、最初に、公知の方法に従って、
例えば、Ficoll密度勾配遠心分離により、血液又はドナ
ーの腫瘍から単離する。次に、残りのリンパ球を、細胞
接触を可能にする条件下で、本発明に係る細胞系、好ま
しくは、ヒトＢ細胞系HB654及び／又はHB617と一緒に、
普通のリンパ球培養基中で培養する。この工程において
は、上記細胞系は、好ましくは、1:100の不足において
リンパ球に添加される。この培養は、殺腫瘍性Ｔ細胞の
活性化が、その活性化細胞系の除去に基づき検出される
ことができるまで続けられる。約８日間の培養が、普通
には、このために必要である。殺腫瘍性Ｔ細胞の活性化
及び増殖は、成長因子又はマイトジェン、例えば、リン
ホカイン、特にインターロイキン２の添加を伴わずに、
本発明に従う同時培養により達成される。これは、得ら
れた殺腫瘍性Ｔリンパ球の治療的適用において特に重要
である。なぜなら、このような因子は、その治療的な適
用の間に副作用を作り出すことができるからである。し
かしながら、得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球の持続的な増
殖は、本発明に係る細胞系又はその活性断片の定常的な
存在及び細胞−細胞接触の形成の確率を要求する。得ら
れた活性化されたリンパ球の殺腫瘍活性は、本発明に係
る細胞系に対しても向けられているため、それ故、持続
的増殖を達成するためには、この細胞系を連続的に供給
することが必要である。このような添加がなければ、殺
腫瘍性Ｔリンパ球の増殖は１〜２日間後に停滞するけれ
ども、殺腫瘍性Ｔリンパ球は、３〜４週間生存し、その
間に、それらは、芽細胞から、一緒に結合して凝集物を
形成するひじょうに小さな細胞に、形質転換される。そ
れらは、それらの殺腫瘍活性を保持し、そして、本発明
に係る細胞系又はその活性断片の添加により３〜６日間
の潜状期間の後の増殖状態に再び変換されることができ
る。
は、単核リンパ球）を、最初に、公知の方法に従って、
例えば、Ficoll密度勾配遠心分離により、血液又はドナ
ーの腫瘍から単離する。次に、残りのリンパ球を、細胞
接触を可能にする条件下で、本発明に係る細胞系、好ま
しくは、ヒトＢ細胞系HB654及び／又はHB617と一緒に、
普通のリンパ球培養基中で培養する。この工程において
は、上記細胞系は、好ましくは、1:100の不足において
リンパ球に添加される。この培養は、殺腫瘍性Ｔ細胞の
活性化が、その活性化細胞系の除去に基づき検出される
ことができるまで続けられる。約８日間の培養が、普通
には、このために必要である。殺腫瘍性Ｔ細胞の活性化
及び増殖は、成長因子又はマイトジェン、例えば、リン
ホカイン、特にインターロイキン２の添加を伴わずに、
本発明に従う同時培養により達成される。これは、得ら
れた殺腫瘍性Ｔリンパ球の治療的適用において特に重要
である。なぜなら、このような因子は、その治療的な適
用の間に副作用を作り出すことができるからである。し
かしながら、得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球の持続的な増
殖は、本発明に係る細胞系又はその活性断片の定常的な
存在及び細胞−細胞接触の形成の確率を要求する。得ら
れた活性化されたリンパ球の殺腫瘍活性は、本発明に係
る細胞系に対しても向けられているため、それ故、持続
的増殖を達成するためには、この細胞系を連続的に供給
することが必要である。このような添加がなければ、殺
腫瘍性Ｔリンパ球の増殖は１〜２日間後に停滞するけれ
ども、殺腫瘍性Ｔリンパ球は、３〜４週間生存し、その
間に、それらは、芽細胞から、一緒に結合して凝集物を
形成するひじょうに小さな細胞に、形質転換される。そ
れらは、それらの殺腫瘍活性を保持し、そして、本発明
に係る細胞系又はその活性断片の添加により３〜６日間
の潜状期間の後の増殖状態に再び変換されることができ
る。
本発明に係る細胞系との同時培養のための生きている
増殖可能な細胞に加えて、致死的に照射され又は化学的
に固定化されているマイトマイシン、例えば、ホルムア
ルデヒドにより処理された本発明に係る細胞系又は亜細
胞画分、例えば、膜画分、膜小胞又はこのような亜細胞
画分からの抽出物を使用することもできる。その上、本
発明に係る細胞系を、他の細胞系と融合することもで
き、そして得られた融合細胞を活性化のために使用する
ことができる。
増殖可能な細胞に加えて、致死的に照射され又は化学的
に固定化されているマイトマイシン、例えば、ホルムア
ルデヒドにより処理された本発明に係る細胞系又は亜細
胞画分、例えば、膜画分、膜小胞又はこのような亜細胞
画分からの抽出物を使用することもできる。その上、本
発明に係る細胞系を、他の細胞系と融合することもで
き、そして得られた融合細胞を活性化のために使用する
ことができる。
それ故、本発明は、血液からのリンパ球を、その間に
同種刺激を回避して、本発明に係る細胞系、本発明に係
る細胞系の活性誘導体又は亜細胞画分又は他の細胞とこ
の細胞との融合生成物と、マイトジェン又は成長因子、
例えば、インターロイキン２の添加を伴わずに、同時培
養することによる、殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産方法にも
関する。
同種刺激を回避して、本発明に係る細胞系、本発明に係
る細胞系の活性誘導体又は亜細胞画分又は他の細胞とこ
の細胞との融合生成物と、マイトジェン又は成長因子、
例えば、インターロイキン２の添加を伴わずに、同時培
養することによる、殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産方法にも
関する。
成長因子又はマイトジェンは、上記のような細胞毒性
Ｔリンパ球の生産方法において添加される必要はなく、
そしてインターロイキン２は、それらの増殖を続けるた
めに得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球に添加される必要はな
いので、それらは、先に知られた無差別なキラー細胞、
例えば、LAK細胞よりも腫瘍治療における適用について
より好適である。それらのより広い殺腫瘍活性のため
に、それらは、腫瘍浸潤リンパ球よりも治療的適用によ
り好適である。ナチュラル・キラー細胞とは異なり、本
発明に係る方法に従って生産された殺腫瘍性細胞は、Ｔ
細胞である。
Ｔリンパ球の生産方法において添加される必要はなく、
そしてインターロイキン２は、それらの増殖を続けるた
めに得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球に添加される必要はな
いので、それらは、先に知られた無差別なキラー細胞、
例えば、LAK細胞よりも腫瘍治療における適用について
より好適である。それらのより広い殺腫瘍活性のため
に、それらは、腫瘍浸潤リンパ球よりも治療的適用によ
り好適である。ナチュラル・キラー細胞とは異なり、本
発明に係る方法に従って生産された殺腫瘍性細胞は、Ｔ
細胞である。
それ故、本発明は、広い殺腫瘍性活性をもつ殺腫瘍性
Ｔリンパ球であって、 （ａ）それらが、腫瘍細胞系、MOLT−4,Jurkat,THP−1,
HL−60,HeLa,K−562,Malme−3M及びY79に対して殺腫瘍
効果をもち、そして （ｂ）0.5IU/mlの検出限界において、細胞系HB654又はH
B617の存在中これらの細胞の増殖の間にこれらの殺腫瘍
性Ｔリンパ球の培養上清中に、インターロイキン２が全
く検出されることができない、ということを特徴とする
ものにも関する。
Ｔリンパ球であって、 （ａ）それらが、腫瘍細胞系、MOLT−4,Jurkat,THP−1,
HL−60,HeLa,K−562,Malme−3M及びY79に対して殺腫瘍
効果をもち、そして （ｂ）0.5IU/mlの検出限界において、細胞系HB654又はH
B617の存在中これらの細胞の増殖の間にこれらの殺腫瘍
性Ｔリンパ球の培養上清中に、インターロイキン２が全
く検出されることができない、ということを特徴とする
ものにも関する。
従って、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球は、リンパ
球の殺腫瘍性Ｔ細胞への活性化が、例えば、その活性化
細胞系の除去により、検出可能となるまで、本発明に係
る細胞系、この細胞系の活性誘導体又は亜細胞画分、又
はこの細胞系と他の細胞系との融合生成物と、リンパ球
を、単に同時培養することにより獲得されることができ
る。おどろくべきことに、この方法で得られた殺腫瘍性
Ｔリンパ球が、多数の腫瘍細胞系、例えば、MOLT−4,Ju
rkat,THP−1,HL−60,HeLa,K−562,Malme−3M及びY79に
対して殺腫瘍作用をもつことが明らかになった。これら
の殺腫瘍性Ｔリンパ球のさらに目立った特徴は、インタ
ーロイキン２が、その活性化の間又はその活性化された
細胞のその後の増殖の間のいずれにおいてもそれらの培
養上清中に検出されることができないということである
（IL2 ELISA;DuPont,Catalogue No.NEK−057;検出下限
界0.5IU/ml）。
球の殺腫瘍性Ｔ細胞への活性化が、例えば、その活性化
細胞系の除去により、検出可能となるまで、本発明に係
る細胞系、この細胞系の活性誘導体又は亜細胞画分、又
はこの細胞系と他の細胞系との融合生成物と、リンパ球
を、単に同時培養することにより獲得されることができ
る。おどろくべきことに、この方法で得られた殺腫瘍性
Ｔリンパ球が、多数の腫瘍細胞系、例えば、MOLT−4,Ju
rkat,THP−1,HL−60,HeLa,K−562,Malme−3M及びY79に
対して殺腫瘍作用をもつことが明らかになった。これら
の殺腫瘍性Ｔリンパ球のさらに目立った特徴は、インタ
ーロイキン２が、その活性化の間又はその活性化された
細胞のその後の増殖の間のいずれにおいてもそれらの培
養上清中に検出されることができないということである
（IL2 ELISA;DuPont,Catalogue No.NEK−057;検出下限
界0.5IU/ml）。
先に述べたように、ヒト殺腫瘍性Ｔリンパ球は、治療
の間に副作用を導くことができる、マイトジェン又は成
長因子、例えば、リンホカイン、特にインターロイキン
２を添加する必要性を伴わずに、本発明に係る活性化細
胞系を使用して、得られる。従って、本発明は、腫瘍治
療において使用されることができる治療剤の生産のため
の、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球の使用にも関す
る。このような治療的適用のために、本発明に係る殺腫
瘍性Ｔリンパ球を、当業者に知られた方法に従って（例
えば、数回、例えば、３回反復される生理学的生理食塩
水中での遠心分離及びペレットの再懸濁により）洗浄さ
れ、それらは、所望により単離され、そして投与に好適
な媒質（例えば、生理学的生理食塩水）中に取り出され
る。
の間に副作用を導くことができる、マイトジェン又は成
長因子、例えば、リンホカイン、特にインターロイキン
２を添加する必要性を伴わずに、本発明に係る活性化細
胞系を使用して、得られる。従って、本発明は、腫瘍治
療において使用されることができる治療剤の生産のため
の、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球の使用にも関す
る。このような治療的適用のために、本発明に係る殺腫
瘍性Ｔリンパ球を、当業者に知られた方法に従って（例
えば、数回、例えば、３回反復される生理学的生理食塩
水中での遠心分離及びペレットの再懸濁により）洗浄さ
れ、それらは、所望により単離され、そして投与に好適
な媒質（例えば、生理学的生理食塩水）中に取り出され
る。
リンパ球の、殺腫瘍性Ｔリンパ球への上記生体外活性
化に加えて、リンパ球は、本発明に係る活性化細胞系又
はこの細胞系の誘導体又は亜細胞画分の投与により、殺
腫瘍性Ｔリンパ球にインビボにおいて活性化されること
もできる。この活性化細胞系は、上記のような治療的適
用のために当業者に知られた方法に従って洗浄され、そ
して投与に好適な媒質、例えば、生理学的生理食塩水中
に取り出される。
化に加えて、リンパ球は、本発明に係る活性化細胞系又
はこの細胞系の誘導体又は亜細胞画分の投与により、殺
腫瘍性Ｔリンパ球にインビボにおいて活性化されること
もできる。この活性化細胞系は、上記のような治療的適
用のために当業者に知られた方法に従って洗浄され、そ
して投与に好適な媒質、例えば、生理学的生理食塩水中
に取り出される。
それ故、本発明は、さらに、腫瘍治療において適用可
能である治療剤の生産のための、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ
細胞を形成するように誘導する、本発明に係る活性化細
胞系又はこの細胞系の活性な亜細胞画分（断片）又は適
当な誘導体の使用に関する。
能である治療剤の生産のための、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ
細胞を形成するように誘導する、本発明に係る活性化細
胞系又はこの細胞系の活性な亜細胞画分（断片）又は適
当な誘導体の使用に関する。
これらの活性亜細胞画分は、直接的インビボ適用にお
いて特に好適である。これらの画分は、体内のリンパ球
を殺腫瘍性Ｔリンパ球に直接活性化するために使用され
ることができる。腫瘍浸潤性リンパ球を殺腫瘍性Ｔリン
パ球に活性化するために、これらの画分を直接的に腫瘍
に適用することが特に有利である。
いて特に好適である。これらの画分は、体内のリンパ球
を殺腫瘍性Ｔリンパ球に直接活性化するために使用され
ることができる。腫瘍浸潤性リンパ球を殺腫瘍性Ｔリン
パ球に活性化するために、これらの画分を直接的に腫瘍
に適用することが特に有利である。
活性亜細胞画分（active subcellular fraction）
は、本発明に係る細胞系（例えば、HB617及びHB654）に
類似のやり方で、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成する
ことを誘導する本発明に係る細胞系の画分と理解され
る。このような画分は、例えば、高張ショックにより得
られる亜細胞小胞又はサイトカラシンＢとのインキュベ
ーションにより得られる細胞不含膜小胞であることがで
きる。例えば、塩化ナトリウム及びフエン酸ナトリウム
とのインキュベーション後に得られることができる本発
明に係る細胞系からの溶出物も好適である。本発明に係
る細胞系のこのような画分は、当業者に馴染みの方法、
例えば、クロマトグラフィー精製により、さらに精製さ
れることができ、その間に、各精製段階の後にその画分
の活性（殺腫瘍性Ｔリンパ球の形成能力）をチェックさ
れなければならない。
は、本発明に係る細胞系（例えば、HB617及びHB654）に
類似のやり方で、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成する
ことを誘導する本発明に係る細胞系の画分と理解され
る。このような画分は、例えば、高張ショックにより得
られる亜細胞小胞又はサイトカラシンＢとのインキュベ
ーションにより得られる細胞不含膜小胞であることがで
きる。例えば、塩化ナトリウム及びフエン酸ナトリウム
とのインキュベーション後に得られることができる本発
明に係る細胞系からの溶出物も好適である。本発明に係
る細胞系のこのような画分は、当業者に馴染みの方法、
例えば、クロマトグラフィー精製により、さらに精製さ
れることができ、その間に、各精製段階の後にその画分
の活性（殺腫瘍性Ｔリンパ球の形成能力）をチェックさ
れなければならない。
それ故、本発明は、リンパ球細胞系からの活性画分の
製造方法であって、 ａ）その活性画分が、マイトジェン又は成長因子を添加
する必要を伴わずに同種刺激を回避する、リンパ球との
同時培養において、リンパ球を殺腫瘍性Ｔ細胞に活性化
し、そして ｂ）このやり方で活性化されたリンパ球が、インターロ
イキン２の添加によらずにその存在中で増殖する、よう
なリンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、 これらの特性をもつ哺乳類細胞系を、 （ｉ）分画し、 （ii）それらの画分を分離し、そしてそれらの画分が、
その開始細胞系を類似のやり方で、リンパ球を殺腫瘍性
Ｔ細胞に活性化するかどうかについて検査し、そして （iii）このような活性画分を、選択し、そしてさら
に、所望の精製程度に達するまでその活性をチェックし
ながら分画し、そして単離する、 ことを特徴とする方法にも関する。
製造方法であって、 ａ）その活性画分が、マイトジェン又は成長因子を添加
する必要を伴わずに同種刺激を回避する、リンパ球との
同時培養において、リンパ球を殺腫瘍性Ｔ細胞に活性化
し、そして ｂ）このやり方で活性化されたリンパ球が、インターロ
イキン２の添加によらずにその存在中で増殖する、よう
なリンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、 これらの特性をもつ哺乳類細胞系を、 （ｉ）分画し、 （ii）それらの画分を分離し、そしてそれらの画分が、
その開始細胞系を類似のやり方で、リンパ球を殺腫瘍性
Ｔ細胞に活性化するかどうかについて検査し、そして （iii）このような活性画分を、選択し、そしてさら
に、所望の精製程度に達するまでその活性をチェックし
ながら分画し、そして単離する、 ことを特徴とする方法にも関する。
これらの殺腫瘍性Ｔリンパ球は、細胞調製物中の腫瘍
細胞をエクスビボにおいて除去するために使用すること
もできる。これは、好ましくは、殺腫瘍性Ｔリンパ球又
は本発明に係るリンパ球細胞系と同時培養することによ
り、幹細胞単離物（例えば、骨髄幹細胞）から腫瘍細胞
を除去する（取り除く（purging））ために使用される
ことができる。このやり方で精製された幹細胞は、例え
ば、照射又は化学療法後に患者内に再び移植されること
ができる（自己骨髄移植）。
細胞をエクスビボにおいて除去するために使用すること
もできる。これは、好ましくは、殺腫瘍性Ｔリンパ球又
は本発明に係るリンパ球細胞系と同時培養することによ
り、幹細胞単離物（例えば、骨髄幹細胞）から腫瘍細胞
を除去する（取り除く（purging））ために使用される
ことができる。このやり方で精製された幹細胞は、例え
ば、照射又は化学療法後に患者内に再び移植されること
ができる（自己骨髄移植）。
最後に、対応の治療組成物も本発明の対象であり、こ
れは、各ケースにおいて、普通の医薬担体、増量剤及び
／又は補強剤と共に、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成
することを誘導する、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球
又は本発明に係る活性化細胞系又はこの細胞系の亜細胞
画分又は対応の誘導体を含む。
れは、各ケースにおいて、普通の医薬担体、増量剤及び
／又は補強剤と共に、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成
することを誘導する、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球
又は本発明に係る活性化細胞系又はこの細胞系の亜細胞
画分又は対応の誘導体を含む。
本発明に係る細胞系HB654は、DSM ACC 2122の番号の
下、“Deutsche Sammlung fr Zellkulturen und Mikr
oorganismen GambH",Mascheroder Weg lb,D−3300 Brau
nschweigに、1993年３月24日に寄託された。
下、“Deutsche Sammlung fr Zellkulturen und Mikr
oorganismen GambH",Mascheroder Weg lb,D−3300 Brau
nschweigに、1993年３月24日に寄託された。
本発明に係る細胞系HB617は、DSM ACC 2166の番号の
下、“Deutsche Sammlung fr Zellkulturen und Mikr
oorganismen GmbH",Mascheroder Weg lb,D−3300 Braun
schweigに、1994年３月11日に寄託された。
下、“Deutsche Sammlung fr Zellkulturen und Mikr
oorganismen GmbH",Mascheroder Weg lb,D−3300 Braun
schweigに、1994年３月11日に寄託された。
本発明を、以下の実施例によりさらに明らかにする。
図１は、生きた血液細胞の数（PBL）及びリンパ芽細
胞の形成に対しての本発明に係る小胞の効果について示
している（d:日）。
胞の形成に対しての本発明に係る小胞の効果について示
している（d:日）。
図２は、形成されるリンパ芽細胞のキラー活性の測定
による、本発明に係る小胞による刺激後のBrdUの放出に
ついて示している。
による、本発明に係る小胞による刺激後のBrdUの放出に
ついて示している。
曲線1:HB細胞による刺激 曲線2:溶出物による刺激 曲線3:自然放出 曲線4:ブランク値 実施例１ 同種刺激を回避しながらリンパ球と同時培養するときリ
ンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することの導入を導く細
胞系の生産 本発明に係る活性細胞系（activator cell line）の
生産を、EP−B 0 093 436中に記載された方法に従って
リンパ球の不死化により行う。このために、ヒトの末梢
血液リンパ球を、最初に、Ficoll勾配遠心分離により単
離する。マウス・ミエローマ細胞系P3X63 Ag8.653（ATC
C CRL 1580）からの細胞質体を、EP−B 0 093 436中に
記載されたサイトカラシンＢによる処理により作り出し
た。１×107のヒト末梢血液リンパ球を、上記ミエロー
マ細胞系Ag8.653の１×107の細胞質体と各回混合し、そ
して遠心分離により沈澱させた。この上清液を、注意し
て取り出す。0.8nlの50％ポリエチレン・グリコール400
0溶液を、温やかに且つ連続して振とうしながら１分間
の期間にわたり一定の低速で添加する。次に、5mlのDul
becco's最小必須培地（DMEM）を、５分間の時間期間に
わたり室温において添加する。さらに20mlのDMEMの添加
の後、これらの細胞を、沈澱させ、5mlの新たなDMEM完
全培地中に再懸濁し、そして支持細胞（feeder cells）
として腹腔からのネズミ・マクロファージによりコート
された細胞培養プレートのウェルに小分けする。次に、
個々のカルチャーを、２〜３日間の間隔においてDMEM完
全培地と共に飼養した。最後に、リンパ球がＴリンパ球
を形成することを活性化することができるクローンを選
択する。このために、末梢血液リンパ球を、同種刺激
（allogenic stimulation）により殺腫瘍性Ｔ細胞を形
成するように活性化されることができる細胞を除去する
ために、実施例２に記載するＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシ
ン・メチル・エステルと共に最初にインキュベートす
る。この方法で得られたリンパ球集団を、次に直接的な
細胞−細胞接触を可能にする条件下でテストされるべき
不死化リンパ球細胞と同時培養する。それにより活性化
される殺腫瘍性Ｔリンパ球による上記のような同時培養
の間に溶解されるこれらの不死化されたリンパ球細胞系
を、さらに検査する。このために、このように選択され
た細胞系を、活性化されている殺腫瘍性Ｔリンパ球並び
にさまざまな腫瘍細胞系と一緒に培養する。最後に、こ
の工程の間に、さまざまな腫瘍細胞系に対する殺腫瘍性
効果をもつＴリンパ球を作り出すような不死化された活
性リンパ球細胞系を、選択する。この殺腫瘍作用は、殺
腫瘍性Ｔリンパ球及び活性化するリンパ球細胞系から形
態学的に区別されることができる腫瘍細胞系が、この同
時培養の間にそのカルチャーから消失し又は未処理対照
カルチャーに比べて数において少なくとも減少するとい
う事実により、検出される。細胞HB654は、この方法で
得られた。
ンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することの導入を導く細
胞系の生産 本発明に係る活性細胞系（activator cell line）の
生産を、EP−B 0 093 436中に記載された方法に従って
リンパ球の不死化により行う。このために、ヒトの末梢
血液リンパ球を、最初に、Ficoll勾配遠心分離により単
離する。マウス・ミエローマ細胞系P3X63 Ag8.653（ATC
C CRL 1580）からの細胞質体を、EP−B 0 093 436中に
記載されたサイトカラシンＢによる処理により作り出し
た。１×107のヒト末梢血液リンパ球を、上記ミエロー
マ細胞系Ag8.653の１×107の細胞質体と各回混合し、そ
して遠心分離により沈澱させた。この上清液を、注意し
て取り出す。0.8nlの50％ポリエチレン・グリコール400
0溶液を、温やかに且つ連続して振とうしながら１分間
の期間にわたり一定の低速で添加する。次に、5mlのDul
becco's最小必須培地（DMEM）を、５分間の時間期間に
わたり室温において添加する。さらに20mlのDMEMの添加
の後、これらの細胞を、沈澱させ、5mlの新たなDMEM完
全培地中に再懸濁し、そして支持細胞（feeder cells）
として腹腔からのネズミ・マクロファージによりコート
された細胞培養プレートのウェルに小分けする。次に、
個々のカルチャーを、２〜３日間の間隔においてDMEM完
全培地と共に飼養した。最後に、リンパ球がＴリンパ球
を形成することを活性化することができるクローンを選
択する。このために、末梢血液リンパ球を、同種刺激
（allogenic stimulation）により殺腫瘍性Ｔ細胞を形
成するように活性化されることができる細胞を除去する
ために、実施例２に記載するＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシ
ン・メチル・エステルと共に最初にインキュベートす
る。この方法で得られたリンパ球集団を、次に直接的な
細胞−細胞接触を可能にする条件下でテストされるべき
不死化リンパ球細胞と同時培養する。それにより活性化
される殺腫瘍性Ｔリンパ球による上記のような同時培養
の間に溶解されるこれらの不死化されたリンパ球細胞系
を、さらに検査する。このために、このように選択され
た細胞系を、活性化されている殺腫瘍性Ｔリンパ球並び
にさまざまな腫瘍細胞系と一緒に培養する。最後に、こ
の工程の間に、さまざまな腫瘍細胞系に対する殺腫瘍性
効果をもつＴリンパ球を作り出すような不死化された活
性リンパ球細胞系を、選択する。この殺腫瘍作用は、殺
腫瘍性Ｔリンパ球及び活性化するリンパ球細胞系から形
態学的に区別されることができる腫瘍細胞系が、この同
時培養の間にそのカルチャーから消失し又は未処理対照
カルチャーに比べて数において少なくとも減少するとい
う事実により、検出される。細胞HB654は、この方法で
得られた。
エプスタイン・バール・ウイルスによる感染により不
死化されている永久ヒトＢリンパ球系を、上記同一手順
を用いて活性特性について検査した。単一細胞培養によ
りクローン化された20の異なるEBV−陽性Ｂ系を、ロイ
シル−ロイシン・メチル・エステルにより前処理された
血液リンパ球との同時培養においてテストする。血液リ
ンパ球の接種密度は、培養基（Iscovemod−DMEM＋15％F
CS;BM）1ml当り２×106である。各Ｂ系の50−,100−、
及び200−倍少ない細胞を、別々の調製物中の血液リン
パ球に添加し、そして５％CO2中37℃においてインキュ
ベートする。同様に、本発明に係る作用をもつ細胞系HB
617を、このやり方で得た。
死化されている永久ヒトＢリンパ球系を、上記同一手順
を用いて活性特性について検査した。単一細胞培養によ
りクローン化された20の異なるEBV−陽性Ｂ系を、ロイ
シル−ロイシン・メチル・エステルにより前処理された
血液リンパ球との同時培養においてテストする。血液リ
ンパ球の接種密度は、培養基（Iscovemod−DMEM＋15％F
CS;BM）1ml当り２×106である。各Ｂ系の50−,100−、
及び200−倍少ない細胞を、別々の調製物中の血液リン
パ球に添加し、そして５％CO2中37℃においてインキュ
ベートする。同様に、本発明に係る作用をもつ細胞系HB
617を、このやり方で得た。
実施例２ ヒトＢ細胞系HB654との同時培養による殺腫瘍性Ｔリン
パ球の生産 単核細胞を、Ficoll 勾配遠心分離による普通の方法
でヒト末梢血液から単離する。単球、マクロファージ、
ナチュラル・キラー細胞及びMHC−制限細胞毒性Ｔ細
胞、特に活性化細胞系HB654の同種MHCに対して向けられ
ているもの、並びにそれらの前駆体を除去するために、
得られた単核細胞を、Thiele and Lipsky（The Journal
of Immunology,Vol.136,No.3（1986）,p.1038−1048）
に従って、250μmol/lのＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシン・
メチル・エステルを含むPBS中室温において15分間イン
キュベートする。次に、15％FCSを含むこれらの細胞
を、Iscove's修飾Dulbecco's培地中に取り出し、HB654
細胞の不足（約1:10）を添加した後、それらを、殺腫瘍
性Ｔリンパ球が、その活性化細胞系に対するそれらの除
去活性に基づき検出されることができるまで、37℃にお
いて６〜８日間インキュベートする。
パ球の生産 単核細胞を、Ficoll 勾配遠心分離による普通の方法
でヒト末梢血液から単離する。単球、マクロファージ、
ナチュラル・キラー細胞及びMHC−制限細胞毒性Ｔ細
胞、特に活性化細胞系HB654の同種MHCに対して向けられ
ているもの、並びにそれらの前駆体を除去するために、
得られた単核細胞を、Thiele and Lipsky（The Journal
of Immunology,Vol.136,No.3（1986）,p.1038−1048）
に従って、250μmol/lのＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシン・
メチル・エステルを含むPBS中室温において15分間イン
キュベートする。次に、15％FCSを含むこれらの細胞
を、Iscove's修飾Dulbecco's培地中に取り出し、HB654
細胞の不足（約1:10）を添加した後、それらを、殺腫瘍
性Ｔリンパ球が、その活性化細胞系に対するそれらの除
去活性に基づき検出されることができるまで、37℃にお
いて６〜８日間インキュベートする。
実施例３ 殺腫瘍性Ｔリンパ球の効果 それぞれ20の異なるドナーから実施例２に従って得ら
れた殺腫瘍性Ｔリンパ球を、ヒト腫瘍系（表ＩとII参
照）のカルチャーに添加する。これらの腫瘍細胞に対す
る殺腫瘍性効果を顕微鏡下にモニターする。これらのさ
まざまな腫瘍細胞系の成長は、阻害され又はそれらは、
本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球により殺される。
れた殺腫瘍性Ｔリンパ球を、ヒト腫瘍系（表ＩとII参
照）のカルチャーに添加する。これらの腫瘍細胞に対す
る殺腫瘍性効果を顕微鏡下にモニターする。これらのさ
まざまな腫瘍細胞系の成長は、阻害され又はそれらは、
本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球により殺される。
実施例４ サイトカラシンＢによる処理によりHB654細胞から作り
出される細胞不含膜小胞による殺腫瘍性Ｔリンパ球（キ
ラーＴ細胞）の生産 A.膜小胞の調製 HB654細胞は、また、剪断力が（細胞を破壊せずに）
その細胞に対して作用することを可能にすることにより
分離されることができるサイトカラシンＢ（CB,Aldrich
Biochemicals）と共にインキュベートすることにより
（Techniques in Somatic Cell Genetics,Ed.J.W.SHAY;
Plenum Press,New York,1982中に）MAUL,G.D.により記
載された方法を用いて膜小胞（“小気泡（blebs）”）
をほぐす（tie off）ことを引き起こされる。
出される細胞不含膜小胞による殺腫瘍性Ｔリンパ球（キ
ラーＴ細胞）の生産 A.膜小胞の調製 HB654細胞は、また、剪断力が（細胞を破壊せずに）
その細胞に対して作用することを可能にすることにより
分離されることができるサイトカラシンＢ（CB,Aldrich
Biochemicals）と共にインキュベートすることにより
（Techniques in Somatic Cell Genetics,Ed.J.W.SHAY;
Plenum Press,New York,1982中に）MAUL,G.D.により記
載された方法を用いて膜小胞（“小気泡（blebs）”）
をほぐす（tie off）ことを引き起こされる。
対数増殖期内のカルチャーからのHB654細胞を、無血
清培養基（RPMI 1640,BM）中で２回洗浄し、約２×107
細胞/mlの密度において、この培地中に再懸濁し、そし
て、37℃に加熱する。CB（保存溶液:5mg/ml DMSO）を添
加する（最終濃度:35μg/ml）。この懸濁液を、37℃に
おいて１分間インキュベートし、そして次に振とう装置
上で１分間回転させた。これらの細胞を、低速遠心分離
により懸濁させる。小胞を含む上清を、５μｍフィルタ
ーを通して濾過する。平均して、１つのHB654細胞から
３つの膜小胞の収量が得られる。
清培養基（RPMI 1640,BM）中で２回洗浄し、約２×107
細胞/mlの密度において、この培地中に再懸濁し、そし
て、37℃に加熱する。CB（保存溶液:5mg/ml DMSO）を添
加する（最終濃度:35μg/ml）。この懸濁液を、37℃に
おいて１分間インキュベートし、そして次に振とう装置
上で１分間回転させた。これらの細胞を、低速遠心分離
により懸濁させる。小胞を含む上清を、５μｍフィルタ
ーを通して濾過する。平均して、１つのHB654細胞から
３つの膜小胞の収量が得られる。
B.血液リンパ球からの殺腫瘍性キラーＴ細胞の生産 単核血液細胞を、勾配遠心分離により実施例２中に記
載したように単離し、ロイシル−ロイシン・メチル・エ
ステルにより処理し、そして２×106の小胞が1ml当り添
加されている培養基（Iscovemod.DMEMプラス15％FCS）1
ml当り約２×106細胞の密度においてインキュベートす
る。これらの細胞に、７日目と10日目に新たな培養基を
補い、これは今度は、1ml当り２×106の小胞を含んでい
る。3,7,10及び13日目に、そのカルチャー中の生きた血
液細胞の全数（PBL）及びリンパ芽細胞の割合を測定す
る（図１）。この測定は、生きた血液細胞の数が最初に
減少し、そして次に７日目に上昇することを示した。13
日目に、生きた細胞の数は、元々接種された細胞の数の
約５倍である。リンパ芽細胞の割合は、そのカルチャー
の１日目の０％から13日目の約98％まで増加している。
載したように単離し、ロイシル−ロイシン・メチル・エ
ステルにより処理し、そして２×106の小胞が1ml当り添
加されている培養基（Iscovemod.DMEMプラス15％FCS）1
ml当り約２×106細胞の密度においてインキュベートす
る。これらの細胞に、７日目と10日目に新たな培養基を
補い、これは今度は、1ml当り２×106の小胞を含んでい
る。3,7,10及び13日目に、そのカルチャー中の生きた血
液細胞の全数（PBL）及びリンパ芽細胞の割合を測定す
る（図１）。この測定は、生きた血液細胞の数が最初に
減少し、そして次に７日目に上昇することを示した。13
日目に、生きた細胞の数は、元々接種された細胞の数の
約５倍である。リンパ芽細胞の割合は、そのカルチャー
の１日目の０％から13日目の約98％まで増加している。
C.腫瘍細胞に対する小胞により誘導されたリンパ芽細胞
の効果 B.に従って得られたリンパ芽細胞の、腫瘍系Jurkat,T
HP−１及びHB654に対する殺腫瘍作用をその培養の設定
後14日目に検査する。これらの腫瘍細胞の破壊を、製造
者の指示に従って“Cellular DNA fragmentation ELISA
Kit"（Boehringer Mannheim GmbH,GER,Order No.15850
45）を使用して測定する。原理；腫瘍（標的）細胞を、
その培養基への５−ブロモ−２′デオキシ−ウリジン
（BrdU）の添加により代謝的に標識する。増殖細胞は、
チミジンの代わりにそのDNA中にBrdUを取り込む。次
に、これらの標的細胞に対する細胞毒性効果を、その壁
に結合された抗−DNA抗体及び抗−BrdU抗体−ペルオキ
シダーゼ結合体が使用されるELISA（euzyme−liuked Im
munosorbent assay）により、BrdU−標的DNAの放出に基
づき測定することができる。
の効果 B.に従って得られたリンパ芽細胞の、腫瘍系Jurkat,T
HP−１及びHB654に対する殺腫瘍作用をその培養の設定
後14日目に検査する。これらの腫瘍細胞の破壊を、製造
者の指示に従って“Cellular DNA fragmentation ELISA
Kit"（Boehringer Mannheim GmbH,GER,Order No.15850
45）を使用して測定する。原理；腫瘍（標的）細胞を、
その培養基への５−ブロモ−２′デオキシ−ウリジン
（BrdU）の添加により代謝的に標識する。増殖細胞は、
チミジンの代わりにそのDNA中にBrdUを取り込む。次
に、これらの標的細胞に対する細胞毒性効果を、その壁
に結合された抗−DNA抗体及び抗−BrdU抗体−ペルオキ
シダーゼ結合体が使用されるELISA（euzyme−liuked Im
munosorbent assay）により、BrdU−標的DNAの放出に基
づき測定することができる。
B.に従ってリンパ芽細胞と24時間同時培養した後、最
大に放出されることができる腫瘍細胞DNAの少なくとも8
0％が、4/1のエフェクター／標的化において３つの腫瘍
系の全てにおいて、その培養上清中にあり、そして10/1
のE/T比においてその100％がある。
大に放出されることができる腫瘍細胞DNAの少なくとも8
0％が、4/1のエフェクター／標的化において３つの腫瘍
系の全てにおいて、その培養上清中にあり、そして10/1
のE/T比においてその100％がある。
実施例５ 低張ショックにより物理的なやり方で得られた亜細胞小
胞によるキラーＴ細胞の生産 Jett et al.,に従って修飾された方法（Jett et al.,
J.Biol.Chem.252（1977）,2134−2142）を、請求の効果
を作り出すのに好適な亜細胞断片を単離するためのさら
なる方法として使用した。これらの小胞を以下のように
得た。
胞によるキラーＴ細胞の生産 Jett et al.,に従って修飾された方法（Jett et al.,
J.Biol.Chem.252（1977）,2134−2142）を、請求の効果
を作り出すのに好適な亜細胞断片を単離するためのさら
なる方法として使用した。これらの小胞を以下のように
得た。
刺激細胞系HB654の細胞を、（PBS中バッファー中に0.
9mM塩化カルシウム及び0.5mM塩化マグネシウムを含む）
Earlsバッファー中で洗浄し、その後、元の培養容量の
１％内で同一バッファー中に取り込んだ。小胞を製造す
るために、90％グリセロールを、５分間隔において３段
階において30％の最終濃度においてこれに添加した。グ
リセロール共に充填された細胞を、遠心分離し（1200x
g,10分間、４℃）、そしてその上清を廃棄した。溶解バ
ッファー（約１％の元の培養容量;10mM Tris/HCl,pH7.
4,1mM MgCl2,1mM CaCl2）を、激しく混合しながらその
細胞沈降物に添加し、そして氷水中で５分間インキュベ
ートした。この後に、細胞死を除去する数回の遠心分離
を行い、そしてその小胞画分を遠心分離した。最初の遠
心分離を、10分間700xgにおいて行った。この上清を、1
0分間700xgにおいて第２の遠心分離に供し、その沈澱物
を廃棄した。この第２の遠心分離の沈澱物を再び廃棄
し、そして遠心分離を再び行った。この沈澱物を再び廃
棄し、そしてその残りの上清を、10分間2300xgにおいて
遠心分離に供した。この上清を、10分間4500xgの最後の
遠心分離において、それらの小胞を沈澱物にもっていく
ために使用した。この懸濁された沈澱物を、５μｍフィ
ルターを通してもう一回濾過し、そしてその後に使用し
た。このやり方で得られた小胞の刺激特性を検査するた
めに、これらを、先に記載ように行われた刺激調製物中
に使用した。このために、小胞を、先に記載したよう
に、１×108HB654細胞から得て、これらを、その後、末
梢血液リンパ球を馴らすために使用した（ロイシル−ロ
イシン・メチル・エステルによる処理後２×107細
胞）。この手順は、実施例２と３中に記載されたものと
全く同一であった。
9mM塩化カルシウム及び0.5mM塩化マグネシウムを含む）
Earlsバッファー中で洗浄し、その後、元の培養容量の
１％内で同一バッファー中に取り込んだ。小胞を製造す
るために、90％グリセロールを、５分間隔において３段
階において30％の最終濃度においてこれに添加した。グ
リセロール共に充填された細胞を、遠心分離し（1200x
g,10分間、４℃）、そしてその上清を廃棄した。溶解バ
ッファー（約１％の元の培養容量;10mM Tris/HCl,pH7.
4,1mM MgCl2,1mM CaCl2）を、激しく混合しながらその
細胞沈降物に添加し、そして氷水中で５分間インキュベ
ートした。この後に、細胞死を除去する数回の遠心分離
を行い、そしてその小胞画分を遠心分離した。最初の遠
心分離を、10分間700xgにおいて行った。この上清を、1
0分間700xgにおいて第２の遠心分離に供し、その沈澱物
を廃棄した。この第２の遠心分離の沈澱物を再び廃棄
し、そして遠心分離を再び行った。この沈澱物を再び廃
棄し、そしてその残りの上清を、10分間2300xgにおいて
遠心分離に供した。この上清を、10分間4500xgの最後の
遠心分離において、それらの小胞を沈澱物にもっていく
ために使用した。この懸濁された沈澱物を、５μｍフィ
ルターを通してもう一回濾過し、そしてその後に使用し
た。このやり方で得られた小胞の刺激特性を検査するた
めに、これらを、先に記載ように行われた刺激調製物中
に使用した。このために、小胞を、先に記載したよう
に、１×108HB654細胞から得て、これらを、その後、末
梢血液リンパ球を馴らすために使用した（ロイシル−ロ
イシン・メチル・エステルによる処理後２×107細
胞）。この手順は、実施例２と３中に記載されたものと
全く同一であった。
これらの結果を評価するために、“殺生活性（Kill a
ctivity）”のためのテストを行った。このテストを、
実施例３中に記載したように行った。この手順におい
て、上記のやり方で生産したキラーＴ細胞を、エフェク
ター細胞として使用し、そしてＴ細胞腫瘍系MOLT4を、
標的細胞として使用した。これらの標的細胞の溶解速度
を定量するために、Boehringer Mannheim GmbHからの
“Cellular DNA Fragmentation ELISA−Kit"をこのため
に使用した。この手順を実施例４中に述べたものと同じ
であった。このテストの結果を図２中に与える。これら
の小胞により形成された芽細胞が、キラーＴ細胞活性を
もつことが明らかになった。
ctivity）”のためのテストを行った。このテストを、
実施例３中に記載したように行った。この手順におい
て、上記のやり方で生産したキラーＴ細胞を、エフェク
ター細胞として使用し、そしてＴ細胞腫瘍系MOLT4を、
標的細胞として使用した。これらの標的細胞の溶解速度
を定量するために、Boehringer Mannheim GmbHからの
“Cellular DNA Fragmentation ELISA−Kit"をこのため
に使用した。この手順を実施例４中に述べたものと同じ
であった。このテストの結果を図２中に与える。これら
の小胞により形成された芽細胞が、キラーＴ細胞活性を
もつことが明らかになった。
図２中に記載したブランク値は、細胞の添加を伴わな
い試薬の吸収に一致する。自然放出についての測定値
は、標的細胞がエフェクター細胞を伴わずに添加される
ときに得られた吸光度に一致する。
い試薬の吸収に一致する。自然放出についての測定値
は、標的細胞がエフェクター細胞を伴わずに添加される
ときに得られた吸光度に一致する。
実施例６ 好適なバッファーとのインキュベーションにより生産さ
れた刺激細胞系からの溶出物によるキラーＴ細胞の生産 以下に記載する方法を、請求に係る効果を作り出すの
に好適である亜細胞断片を得るためのさらなる方法とし
て使用した： 他の実施例中に述べられた方法に従って培養された刺
激細胞系HB654の細胞を、Hanks Balanced Salt Solutio
n（HB SS,Boehringer Mannheim GmbH,GER）中で３回洗
浄し、そしてその後、約２×107細胞/mlの密度におい
て、150mmol/、NaCl,15mmol/lクエン酸Na,pH7.2中に
取り出した。それらを、その後、37℃において30分間イ
ンキュベートした。その後、これらの細胞を、4500xgに
おいて７分間遠心分離することにより沈降させた。
れた刺激細胞系からの溶出物によるキラーＴ細胞の生産 以下に記載する方法を、請求に係る効果を作り出すの
に好適である亜細胞断片を得るためのさらなる方法とし
て使用した： 他の実施例中に述べられた方法に従って培養された刺
激細胞系HB654の細胞を、Hanks Balanced Salt Solutio
n（HB SS,Boehringer Mannheim GmbH,GER）中で３回洗
浄し、そしてその後、約２×107細胞/mlの密度におい
て、150mmol/、NaCl,15mmol/lクエン酸Na,pH7.2中に
取り出した。それらを、その後、37℃において30分間イ
ンキュベートした。その後、これらの細胞を、4500xgに
おいて７分間遠心分離することにより沈降させた。
このやり方で得られた上清は、溶出物を提示する。こ
の上清を、５μｍフィルターを通して１回濾過し、そし
てその後に使用する。このやり方で得られた溶出物の刺
激特性を評価するために、これを、先に記載したように
行われた刺激調製物中で使用した。このために、溶出物
を、先に記載したように、２×107HB654細胞から得て、
そしてこれを、末梢血清リンパ球（２×107細胞）を馴
らすためにその後に使用した。この手順は、先の実施例
中に記載したものと同じであった。
の上清を、５μｍフィルターを通して１回濾過し、そし
てその後に使用する。このやり方で得られた溶出物の刺
激特性を評価するために、これを、先に記載したように
行われた刺激調製物中で使用した。このために、溶出物
を、先に記載したように、２×107HB654細胞から得て、
そしてこれを、末梢血清リンパ球（２×107細胞）を馴
らすためにその後に使用した。この手順は、先の実施例
中に記載したものと同じであった。
“殺生活性（Kill activity）”についてのテスト
を、これらの結果を評価するために行った。このテスト
を、先の実施例中に記載したように行った。このため
に、上記のやり方で生産されたキラーＴ細胞を、エフェ
クター細胞として、そしてJurkatを、標的細胞として使
用した。これらの標的細胞の溶解速度を定量するため
に、Boehringer Mannheim GmbHからの“Cellular DNA F
ragmentation ELISA−Kit"を、このために使用した。こ
の手順は、実施例４中に述べたものと同じであった。こ
の溶出物により形成された芽細胞がキラーＴ細胞活性を
もつことが明らかになった。0.121,0.214,0.269及び0.1
14の（自然放出についての吸光度を差し引いた後の）Br
dU溶出物についての吸光度を、４つの異なる小胞調製物
を用いて得た。
を、これらの結果を評価するために行った。このテスト
を、先の実施例中に記載したように行った。このため
に、上記のやり方で生産されたキラーＴ細胞を、エフェ
クター細胞として、そしてJurkatを、標的細胞として使
用した。これらの標的細胞の溶解速度を定量するため
に、Boehringer Mannheim GmbHからの“Cellular DNA F
ragmentation ELISA−Kit"を、このために使用した。こ
の手順は、実施例４中に述べたものと同じであった。こ
の溶出物により形成された芽細胞がキラーＴ細胞活性を
もつことが明らかになった。0.121,0.214,0.269及び0.1
14の（自然放出についての吸光度を差し引いた後の）Br
dU溶出物についての吸光度を、４つの異なる小胞調製物
を用いて得た。
フロントページの続き (72)発明者 アルベルト ビンフリート ドイツ連邦共和国，デー―82390 エバ ーフィンク，ハウプトシュトラーセ 16 アー (72)発明者 バイドル ウルリッヒ ドイツ連邦共和国，デー―80336 ミュ ンヘン，ランドベールシュトラーセ 56 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 A61K 31/00 - 48/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれ
らをリンパ球と同時培養するとき、それらが、マイトジ
ェン又は成長因子の添加を必要とせずにリンパ球が殺腫
瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化し、そして ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイ
キン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖する、 哺乳類細胞系又はその活性画分であって、以下の段階： ａ）同種刺激により殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活
性化されることができる細胞を除去するために、Ｌ−ロ
イシル−Ｌ−ロイシン・メチル・エステルと共に、ヒト
末梢血液リンパ球又はEBV−陽性ヒトＢリンパ球細胞系
を、インキュベートし； ｂ）得られたリンパ球集団を、直接的な細胞−細胞接触
を可能にする条件下でテストされるべき不死化リンパ球
細胞と同時培養し； ｃ）それにより活性化される殺腫瘍性Ｔリンパ球により
上記のような同時培養の間に溶解されるこれらの不死化
されたリンパ球細胞系を検査し； ｄ）このように選択された細胞系を、それにより活性化
される殺腫瘍性Ｔリンパ球並びにさまざまな腫瘍細胞系
と一緒に培養し；そして ｅ）この工程の間に、さまざまな腫瘍細胞系に対する殺
腫瘍性効果をもつＴリンパ球を作り出すような不死化さ
れた活性リンパ球細胞系を選択する、 を含む工程により作出される哺乳類細胞系又はその活性
画分。 - 【請求項２】ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれ
らをリンパ球と同時培養するとき、それらが、マイトジ
ェン又は成長因子の添加を必要とせずにリンパ球が殺腫
瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化し、そして ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイ
キン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖する、 ヒトＢ細胞系DSM ACC 2122（HB654）又はDSM ACC 2166
（HB617）、又はその活性画分。 - 【請求項３】殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産方法であって、
その間に同種刺激を回避しながら、リンパ球を、請求項
１又は２に記載するような細胞系又はその細胞系の活性
画分と同時培養する方法。 - 【請求項４】殺腫瘍性Ｔリンパ球であって、 ａ）それらが腫瘍細胞系ATCC CRL 1582（MOLT−４）、A
TCC TIB 152（Jurkat）、ATCC TIB 202（THP−１）、AT
CC CCL 240（HL−60）、ATCC CCL 2（HeLa）、ATCC CCL
243（Ｋ−562）、ATCC HTB 64（Malme−3M）及びATCC
HTB 18（Y79）に対する殺腫瘍効果をもち、そして ｂ）インターロイキン２が、細胞系DSM ACC 2122又はDS
M ACC 2166の存在中これらの細胞系の増殖の間にこれら
の殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に0.5IU/mlの検出限
界において検出されることができない、 殺腫瘍性Ｔリンパ球。 - 【請求項５】請求項４に記載の殺腫瘍性Ｔリンパ球並び
に、所望により、普通に使用される担体、補助剤又は増
量剤の中の１を含む、抗腫瘍剤。 - 【請求項６】所望により、普通に使用される担体、補助
剤又は増量剤の中の１と一緒に、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ
細胞を形成することを誘導する、請求項１又は２に記載
の細胞系又はこの細胞系の活性亜細胞画分又は適当な誘
導体を含む、抗腫瘍剤。 - 【請求項７】細胞調製物中の腫瘍細胞の殺腫瘍作用の除
去のための方法であって、この細胞調製物を殺腫瘍性Ｔ
リンパ球と共にインキュベートし、その殺腫瘍性Ｔリン
パ球が、 ａ）腫瘍細胞系ATCC CRL 1582（MOLT−４）、ATCC TIB
152（Jurkat）、ATCC TIB 202（THP−１）、ATCC CCL 2
40（HL−60）、ATCC CCL 2（HeLa）、ATCC CCL 243（Ｋ
−562）、ATCC HTB 64（Malme−3M）及びATCC HTB 18
（Y79）に対する殺腫瘍効果をもち、そして ｂ）インターロイキン２が、細胞系DSM ACC 2122の存在
中これらの細胞の増殖の間に0.5IU/mlの検出限界におい
てこれらの殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に全く検出
されることができない、ような方法。 - 【請求項８】幹細胞調製物が細胞調製物として使用され
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】ａ）その間に同種刺激を回避しながらマイ
トジェン又は成長因子の添加の必要を伴わずに、リンパ
球との同時培養において、リンパ球を活性化して殺腫瘍
性Ｔ細胞を作り、そして ｂ）この方法で活性化されたリンパ球を、インターロイ
キン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖させる リンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、 これらの特性をもつ哺乳類細胞系を、 （ｉ）分画し、 （ii）これらの画分を分離し、そしてその開始細胞系と
類似のやり方で、これらの画分がリンパ球が殺腫瘍性Ｔ
細胞を形成するように活性化するかどうかについて、そ
れを検査し、 （iii）このような活性画分を選択し、そしてその活性
をチェックしながら所望の程度の純度に達するまでさら
に分画し、そして単離する、 ような方法。 - 【請求項１０】DSM ACC 2122又はDSM ACC 2166が、哺乳
類細胞系として使用される、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】溶出物、膜小胞又は亜細胞小胞を活性画
分として単離する、請求項９又は10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4310229 | 1993-03-31 | ||
| DE4310229.8 | 1993-03-31 | ||
| PCT/EP1994/000960 WO1994023014A1 (de) | 1993-03-31 | 1994-03-26 | Tumorizide t-lymphozyten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08503857A JPH08503857A (ja) | 1996-04-30 |
| JP2980986B2 true JP2980986B2 (ja) | 1999-11-22 |
Family
ID=6484173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6521652A Expired - Fee Related JP2980986B2 (ja) | 1993-03-31 | 1994-03-26 | 殺腫瘍性ｔリンパ球 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6576466B2 (ja) |
| EP (1) | EP0693120B1 (ja) |
| JP (1) | JP2980986B2 (ja) |
| AT (1) | ATE176683T1 (ja) |
| AU (1) | AU6505394A (ja) |
| CA (1) | CA2159443A1 (ja) |
| DE (2) | DE4410136A1 (ja) |
| ES (1) | ES2130415T3 (ja) |
| WO (1) | WO1994023014A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE476496T1 (de) | 1996-03-04 | 2010-08-15 | Calyx Bio Ventures Inc | Modifizierte schnellvermehrungsmethode ('modified-rem') zur in vitro vermehrung von t-lymphozyten |
| CA2247131A1 (en) * | 1996-03-04 | 1997-09-12 | Targeted Genetics Corporation | Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes |
| EP0910625A1 (de) * | 1996-05-24 | 1999-04-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kultivierung von zellen |
| WO1998018907A1 (de) * | 1996-10-30 | 1998-05-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur herstellung von tumoriziden t-lymphozyten |
| US6251672B1 (en) | 1997-05-15 | 2001-06-26 | Gsf-Forschungszentrum Fur Umwelt Und Gesundheit | Culturing mammalian cells in contact with cell surface proteins |
| US6579857B1 (en) * | 1999-06-11 | 2003-06-17 | Evanston Northwestern Healthcare Research Institute | Combination cancer therapy comprising adenosine and deaminase enzyme inhibitors |
| US7541184B2 (en) * | 2000-02-24 | 2009-06-02 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of cells |
| US20040151704A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-08-05 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for restoring immune repertoire in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| US20040175373A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-09-09 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| US20050084967A1 (en) * | 2002-06-28 | 2005-04-21 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| US6797905B1 (en) * | 2003-12-23 | 2004-09-28 | Zippy Technology Corp. | Rocker switch |
| WO2011127129A1 (en) * | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Holaday John W | Methods of treating cancer |
| EP3194559A1 (de) | 2015-11-27 | 2017-07-26 | Technische Universität Ilmenau | Verfahren und anordnung zur fermentation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0203403B1 (en) | 1985-05-01 | 1992-10-28 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | A cloned t cell capable of recognizing tumors and a t cell antigen receptor |
| DK0460065T3 (da) * | 1989-02-21 | 1994-09-26 | Terumo Corp | Fremgangsmåde til at fremkalde formering af CD4-lymfocytter |
| DE3923848C2 (de) * | 1989-07-19 | 1998-08-27 | Nikolaus W Prof Dr Med Klehr | Das Demaskierungstraining für autologe Immunozyten gegen maskierte Tumorzellen in vitro |
| EP0415666A1 (en) | 1989-08-29 | 1991-03-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Composition for human cell cultivation and use thereof |
-
1994
- 1994-03-24 DE DE4410136A patent/DE4410136A1/de not_active Withdrawn
- 1994-03-26 EP EP94912545A patent/EP0693120B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-26 AT AT94912545T patent/ATE176683T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-03-26 DE DE59407809T patent/DE59407809D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-26 AU AU65053/94A patent/AU6505394A/en not_active Abandoned
- 1994-03-26 ES ES94912545T patent/ES2130415T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-26 US US08/513,865 patent/US6576466B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-26 JP JP6521652A patent/JP2980986B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-26 WO PCT/EP1994/000960 patent/WO1994023014A1/de active IP Right Grant
- 1994-03-26 CA CA002159443A patent/CA2159443A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6576466B2 (en) | 2003-06-10 |
| AU6505394A (en) | 1994-10-24 |
| EP0693120A1 (de) | 1996-01-24 |
| DE59407809D1 (de) | 1999-03-25 |
| CA2159443A1 (en) | 1994-10-13 |
| US20020039569A1 (en) | 2002-04-04 |
| DE4410136A1 (de) | 1994-10-06 |
| JPH08503857A (ja) | 1996-04-30 |
| WO1994023014A1 (de) | 1994-10-13 |
| ATE176683T1 (de) | 1999-02-15 |
| EP0693120B1 (de) | 1999-02-10 |
| ES2130415T3 (es) | 1999-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2766299T3 (es) | Composiciones y procedimientos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 | |
| AU758622B2 (en) | Method for activating natural killer (NK) cells | |
| JP2980986B2 (ja) | 殺腫瘍性ｔリンパ球 | |
| US20020155108A1 (en) | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells | |
| JP2008119004A (ja) | 樹状細胞を活性化する方法 | |
| JP2001509135A (ja) | 混合リンパ球と組み合わせた腫瘍細胞を用いるガン免疫療法 | |
| JPH07505527A (ja) | ヒト樹状細胞のインビトロ発生およびそれらの用途 | |
| Margolin et al. | Cellular immunotherapy and autologous transplantation for hematologic malignancy | |
| Santin et al. | In vitro induction of tumor-specific human lymphocyte antigen class I–restricted CD8+ cytotoxic T lymphocytes by ovarian tumor antigen–pulsed autologous dendritic cells from patients with advanced ovarian cancer | |
| US20030124091A1 (en) | Endothelial cell derived hematopoietic growth factor | |
| JP2008523067A (ja) | 癌ワクチンアジュバントとしてのαサイモシンペプチド | |
| CA2367590A1 (en) | In vitro induction of antigen-specific t-cells using dendritic cell-tumor cell or dendritic cell-viral cell derived immunogens | |
| JP4435985B2 (ja) | ＴｃＲγδＴ細胞の生産方法 | |
| Gregory et al. | Flt3 ligand pretreatment promotes protective immunity to Listeria monocytogenes | |
| Lesimple et al. | Autologous human macrophages and anti-tumour cell therapy | |
| Santin et al. | Restoration of tumor specific human leukocyte antigens class I-restricted cytotoxicity by dendritic cell stimulation of tumor infiltrating lymphocytes in patients with advanced ovarian cancer | |
| Citterio et al. | Dendritic cells as natural adjuvants | |
| JP5054875B2 (ja) | 樹状細胞ハイブリッドによって活性化される細胞傷害性ｔリンパ球 | |
| JP2003521936A5 (ja) | ||
| Yu et al. | Advances in the treatment of graft-versus-host disease with immunomodulatory cells | |
| JPH08510131A (ja) | 癌およびウイルス性疾患を治療するための改変化ｔａｌｌ−１０４細胞の使用 | |
| Reilly et al. | Increased tumor-specific CTL activity in human tumor-infiltrating lymphocytes stimulated with autologous tumor lines | |
| US20090060946A1 (en) | Activation of antigen-specific T cells by virus/antigen-treated dendritic cells | |
| JP7390740B2 (ja) | 腫瘍の治療及び／又は予防のための組成物 | |
| Okur et al. | Cellular immunotherapy of cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |