JPH08503857A

JPH08503857A - 殺腫瘍性ｔリンパ球

Info

Publication number: JPH08503857A
Application number: JP6521652A
Authority: JP
Inventors: ユングファー，ヘルベルト; ハインリッヒバルヘット; ビンフリートアルベルト; ウルリッヒバイドル
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-26
Publication date: 1996-04-30
Anticipated expiration: 2014-11-22
Also published as: US6576466B2; AU6505394A; EP0693120A1; DE59407809D1; JP2980986B2; CA2159443A1; US20020039569A1; DE4410136A1; WO1994023014A1; ATE176683T1; EP0693120B1; ES2130415T3

Abstract

(57)【要約】いずれの同種刺激を回避しながらリンパ球と同時培養するとき、リンパ球を殺腫瘍性細胞に活性化する哺乳類細胞系、この細胞系とリンパ球との同時培養による殺腫瘍性Ｔ−リンパ球の生産方法、この方法により得られた殺腫瘍性Ｔ−リンパ球及び腫瘍治療において有用な治療剤の製造のためのこれらの細胞の使用。

Description

【発明の詳細な説明】殺腫瘍性Ｔリンパ球本発明は、哺乳動物細胞系及びその活性断片であって、同種刺激が回避される間にそれがリンパ球と同時に培養されるときに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞（tu moricidal T cells）を形成するように活性化するもの、このような細胞系又はそれらの活性断片とリンパ球を同時培養することにより殺腫瘍性Ｔ細胞を生産する方法、この方法により得ることができる殺腫瘍性Ｔリンパ球、並びに腫瘍治療において使用されることができる治療剤の製造のためのこれらのＴリンパ球の使用に関する。細胞性免疫防御は、病因学的に変更された内因性細胞、例えば、ウイルス又は腫瘍細胞により感染された細胞の除去において重要な役割を演じている。この過程においては、細胞毒活性Ｔリンパ球が、表面抗原に基づいてその変更された内因性細胞を認識する。これらの表面抗原は、普通には、それらの細胞により形成されたタンパク質断片であり、そしていわゆる主要組織適合複合体（MHC）の表面レセプターに結合して細胞表面上に存在する（Zinkernagel et al．，Nature 248 (1974)，701-702及びBabbit et al.，Nature 317 (1985)，359-361）。しかしながら、これらの腫瘍細胞のこれらの表面抗原が健康な細胞の対応抗原とほんの僅かに異なる場合には、その免疫系は、それらの腫瘍細胞を除去することができるであろう細胞毒活性Ｔリンパ球をおそらく全く形成することができない。それ故、このような腫瘍細胞に対して細胞性免疫抵抗性を誘導するための試みが既に行われている。このためには、非特異的な免疫 ium parvum又は腫瘍細胞抽出物からのワクチンによる能動的免疫感作を達成することが最初に企てられた（Terry and Rosenberg eds．，Immunotherapy of Huma n Cancer (1982)，Elserier North Holland）。より良好な結果が、いわゆる養子免疫療法（adoptive immunotherapy）の概念を用いて得られた。このケースにおいては、患者のリンパ球がインビトロにおいて活性化され、そしてその後、再移植される。このような“無差別のもう一細胞（promiscuous killer cells）” を形成するためのインビトロにおける活性化（D．Thiele et al.，Immunology T oday 10 (1989)，375-381）は、普通には、インターロイキン２の添加により行われる。得られた細胞毒性リンパ球は、その後リンホカイン活性化キラー細胞（ LAK 細胞）と表示されている（Rosenberg，Immunology Today 9 (1988)，58-62 ）。細胞毒性Ｔリンパ球とは異なり、腫瘍細胞に対するLAK 細胞の作用は、腫瘍抗原の認識のためのMHC 遺伝子の正しい発現に依存せず、そしてこの免疫系のナチュラル・キラー細胞とは異なり、LAK 細胞は、新たな腫瘍細胞に対しても有効である。LAK 細胞を使用しての最初の臨床的成功が既に可能となっている。しかしながら、養子免疫療法の上記形態の欠点は、長い期間にわたり比較的高い投与量において必要とされるインターロイキン２の副作用である。これは、主に毛細血管の透過性における増加及び臓器の同時機能失調をもたらす（Rosenberg，Imm unology Today 9 (1988)，58-62，Rosensteinet al.，Journal Immunology 137 (1986)，1735-1742及びEttinghausen et al.，Surg．Forum 37 (1987)，388-389 ）。さらにLAK 細胞であって、インターロイキン２により刺激されたとき、健康な内因性細胞に対して向けられるものが得られている（B．Chen et al.，Cell． Immunol．118 (1989），458-469）。養子免疫療法のためのより有効な方法についての探索において、活性化されるべきリンパ球が、自己の（autologous）腫瘍細胞の存在申でも培養された（混合リンパ球腫瘍培養、G．Fossati et al.，International Journal o f Cancer 42 (1988)，239-245；G．Deg et al.，J．Exp．Med．170 (1989)，797-819；Darrow et al.，J．Immunol．142 (1989)，3329-3335及びNotter et al.，Int．J．Cancer 45 (1990)，834-841）。さらに、インビトロにおいて腫瘍浸潤リンバ球（TIL）の増殖のための方法も、記載されている（Yron et al.，J．Immunol．125 (1980)，238-245）。LAK 細胞とは異なり、これらの腫瘍浸潤リンパ球は、高い腫瘍特異性をもち、すなわち、それらは、それら自身が単離された腫瘍に対してのみ活性である。このような腫瘍浸潤リンパ球は、他の患者からの同一タイプの腫瘍に対しては等しく有効ではない。これは、それらの治療用途をかなり限定している。本発明の目的は、それ故、先に知られているインビトロにおいて活性化されたＴリンパ球よりも腫瘍治療により好適である腫瘍破壊性Ｔリンパ球を提供することである。この目的は、哺乳動物細胞系又はその活性な亜細胞画分であって、（ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれらをリンパ球と同時培養するとき、それらが、マイトジェン又は成長因子、例えば、インターロイキン２の添加する必要性を伴わずに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化し、そして（ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加を伴わずに、それらの存在中で増殖する、ことを特徴とするものにより達成される。おどろくべきことに、HLA 制限をもたない広い殺腫瘍活性をもつ殺腫瘍Ｔリンパ球が本発明に係る細胞系又はその活性な亜細胞画分／断片と共に同時培養することにより得られることができることが判明した。これに関して、殺腫瘍活性は、対応の腫瘍細胞に対する殺生効果、そして特に溶解効果、並びにこれらの腫瘍細胞の増殖に対する阻害作用と理解される。細胞系は、HeLa細胞（ATCC CCL 2）の特性をもつ無制限の増殖能力をもつような細胞と理解される（James D．Watson et al.，Mole cular Biology of the Ge ne，4th edition，The Beujamin／Cummings Publishing Co.，Inc．(1987)，p． 963）。このような細胞系は、例えば、ヒト血液リンパ球を不死化することにより得られる。不死化は、好ましくは、EP-B 0 093 436又はEP-B 0 256 512（この内容も本特許出願の対象である。）中に記載された方法に従ってマウス・ミエローマ細胞系Ag 8.653からの細胞質体による融合により行われる。このように得られた不死化リンパ球系は、次に、ヒト・ドナー・リンパ球と共に同時培養される。血液リンパ球が、好ましくは、リンパ球として使用される。しかしながら、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）脾臓又はリンパ節からのリンパ球を使用することもできる。これに閏して、使用前にリンパ球調製物を精製することが好ましい。血液リンパ球を使用するとき、赤血球を実質的に除去し、そしてその単核赤血球を濃縮することが特に好都合である。また、本発明に係る細胞系又はそれらの活性断片により同種（allogenically）刺激されることができる細胞の数を減少させることも有利である。同種刺激を回避するために、このような刺激に感受性であるリンパ球を、同時培養前にそのドナー・リンパ球集団から取り除く。このために、単球、マクロファージ・ナチュラル・キラー細胞及びMHC-制限細胞毒性Ｔ細胞、そして特に、その活性細胞系及びそれらの前駆細胞の同種MHC に対して向けられているものは、好ましくは、Thiele and L ipsky （The Journal of Immunology，Vol．136，No．3 (1986)，p．1038-1048 ）に従って、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシン・メチル・エステルと共にインキュベーションすることにより除去される。これらの不死化細胞系は、この同時培養の間にドナー・リンパ球が殺腫瘍性Ｔリンパ球を形成するように活性化することを引き起こす同時培養の後に選択される。この過程において、その同時培養の間にそれらを活性化するドナー・リンパ球により溶解されるリンパ球系を活性化するものを、好ましくは、さらに検査する。さらなる選択のために、リンパ球系を活性化するものを、それにより活性化されているドナー・リンパ球及び一連の異なる腫瘍細胞系と一緒に培養する。最後に、リンパ球系を活性化するものであって、検査された腫瘍細胞系に対して殺腫瘍作用をもつ活性化されたドナー・リンパ球を導くものを、選択する。この場合において、殺腫瘍作用は、その検査された腫瘍細胞系の殺生、特に溶解としてだけでなく、増殖に対する阻害効果としても理解されるべきである。この殺腫瘍作用（tumoricidal action）は、例えば、当業者に馴染みのある細胞毒性テストにより、検出されることができ、例えば、そこでは、その殺腫瘍性Ｔリンパ球並びにその活性化リンパ球系から形態学的に区別されることができる腫瘍細胞系が、長い培養の間に、その同時培養から消失し、又は、殺腫瘍性Ｔリンパ球により少なくとも過増殖される。この殺腫瘍性Ｔリンパ球は、好ましくは、CD3⁺， CD4⁺ 及び／又は CD8⁺である。本発明の好ましい対象は、リンパ球細胞系、特に好ましくはＢリンパ球細胞系、又はそれらの活性断片であって、（ａ）同種刺激が回避される、それらがリンパ球と同時培養されるときに、それらが、マイトジェン又は成長因子、例えば、インターロイキン２を添加することを伴わずに、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化し、そして（ｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加を伴わずに、それらの存在中で増殖する、ことを特徴とするものである。ヒトＢ細胞系HB 654及びHB 617が特に好ましい。本発明に記載の細胞系及び活性画分を使用すれば、これらのリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化することを引き起こすことが、同種刺激を回避しながら単に、リンパ球と同時培養することにより、可能である。この活性は、好ましくは、上記リンパ球が、上記細胞系又はその活性画分（断片）と直接接触する間に生じる。IL 2 及び／又はIL 2 レセプターに対する抗体の添加が、本発明に係る細胞系の活性効果を阻害することが判明している。それ故、本発明は、本発明に係る細胞系又はその活性断片とリンパ球を同時培養することにより殺腫瘍性Ｔリンパ球を生産する方法にも関する。本発明に係る方法を行うために、リンパ球（好ましくは、単核リンパ球）を、最初に、公知の方法に従って、例えば、Ficoll密度勾配遠心分離により、血液又はドナーの腫瘍から単離する。次に、残りのリンパ球を、細胞接触を可能にする条件下で、本発明に係る細胞系、好ましくは、ヒトＢ細胞系HB 654及び／又はHB 617と一緒に、普通のリンパ球培養基中で培養する。この工程においては、上記細胞系は、好ましくは、１：100の不足においてリンパ球に添加される。この培養は、殺腫瘍性Ｔ細胞の活性化が、その活性化細胞系の除去に基づき検出されることができるまで続けられる。約８日間の培養が、普通には、このために必要である。殺腫瘍性Ｔ細胞の活性化及び増殖は、成長因子又はマイトジェン、例えば、リンホカイン、特にインターロイキン２の添加を伴わずに、本発明に従う同時培養により達成される。これは、得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球の治療的適用において特に重要である。なぜなら、このような因子は、その治療的な適用の間に副作用を作り出すことができるからである。しかしながら、得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球の持続的な増殖は、本発明に係る細胞系又はその活性断片の定常的な存在及び細胞−細胞接触の形成の確率を要求する。得られた活性化されたリンパ球の殺腫瘍活性は、本発明に係る細胞系に対しても向けられているため、それ故、持続的増殖を達成するためには、この細胞系を連続的に供給することが必要である。このような添加がなければ、殺腫瘍性Ｔリンパ球の増殖は１〜２日間後に停滞するけれども、殺腫瘍性Ｔリンパ球は、３〜４週間生存し、その間に、それらは、芽細胞から、一緒に結合して凝集物を形成するひじょうに小さな細胞に、形質転換される。それらは、それらの殺腫瘍活性を保持し、そして、本発明に係る細胞系又はその活性断片の添加により３〜６日間の潜伏期間の後に増殖状態に再び変換されることができる。本発明に係る細胞系との同時培養のための生きている増殖可能な細胞に加えて、致死的に照射され又は化学的に固定化されているマイトマイシン、例えば、ホルムアルデヒドにより処理された本発明に係る細胞系又は亜細胞画分、例えば、膜画分、膜小胞又はこのような亜細胞画分からの抽出物を使用することもできる。その上、本発明に係る細胞系を、他の細胞系と融合することもでき、そして得られた融合細胞を活性化のために使用することができる。それ故、本発明は、血液からのリンパ球を、その間に同種刺激を回避して、本発明に係る細胞系、本発明に係る細胞系の活性誘導体又は亜細胞画分又は他の細胞とこの細胞との融合生成物と、マイトジェン又は成長因子、例えば、インターロイキン２の添加を伴わずに、同時培養することによる、殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産方法にも関する。成長因子又はマイトジェンは、上記のような細胞毒性Ｔリンパ球の生産方法において添加される必要はなく、そしてインターロイキン２は、それらの増殖を続けるために得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球に添加される必要はないので、それらは、先に知られた無差別なキラー細胞、例えば、LAK 細胞よりも腫瘍治療における適用についてより好適である。それらのより広い殺腫瘍活性のために、それらは、腫瘍浸潤リンパ球よりも治療的適用により好適である。ナチュラル・キラー細胞とは異なり、本発明に係る方法に従って生産された殺腫瘍性細胞は、Ｔ細胞である。それ故、本発明は、広い殺腫瘍活性をもつ殺腫瘍性Ｔリンパ球であって、（ａ）それらが、腫瘍細胞系、MOLT-4，Jurkat，THP-1，HL-60，HeLa，K-562 ，Malme-3M 及びY79 に対して殺腫瘍効果をもち、そして（ｂ） 0.5IU／mlの検出限界において、細胞系HB 654又はHB 617の存在中これらの細胞の増殖の間にこれらの殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に、インターロイキン２が全く検出されることができない、ということを特徴とするものにも関する。従って、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球は、リンパ球の殺腫瘍性Ｔ細胞への活性化が、例えば、その活性化細胞系の除去により、検出可能となるまで、本発明に係る細胞系、この細胞系の活性誘導体又は亜細胞画分、又はこの細胞系と他の細胞系との融合生成物と、リンパ球を、単に同時培養することにより獲得されることができる。おどろくべきことに、この方法で得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球が、多数の腫瘍細胞系、例えば、MOLT-4，Jurkat，THP-1，HL-60， HeLa，K-562，Malme-3M 及びY79 に対して殺腫瘍作用をもつことが明らかになった。これらの殺腫瘍性Ｔリンパ球のさらに目立った特徴は、インターロイキン２が、その活性化の間又はその活性化された細胞のその後の増殖の間のいずれにおいてもそれらの培養上清中に検出されることができないということである（IL2 ELISA；DuP ont，Catalogue No．NEK-057：検出下限界 0.5IU／ml）。先に述べたように、ヒト殺腫瘍性Ｔリンパ球は、治療の間に副作用を導くことができる、マイトジェン又は成長因子、例えば、リンホカイン、特にインターロイキン２を添加する必要性を伴わずに、本発明に係る活性化細胞系を使用して、得られる。従って、本発明は、腫瘍治療において使用されることができる治療剤の生産のための、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球の使用にも関する。このような治療的適用のために、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球を、当業者に知られた方法に従って（例えば、数回、例えば、３回反復される生理学的生理食塩水中での遠心分離及びペレットの再懸濁により）洗浄され、それらは、所望により単離され、そして投与に好適な媒質（例えば、生理学的生理食塩水）中に取り出される。リンパ球の、殺腫瘍性Ｔリンパ球への上記生体外活性化に加えて、リンパ球は、本発明に係る活性化細胞系又はこの細胞系の誘導体又は亜細胞画分の投与により、殺腫瘍性Ｔリンパ球にインビボにおいて活性化されることもできる。この活性化細胞系は、上記のような治療的適用のために当業者に知られた方法に従って洗浄され、そして投与に好適な媒質、例えば、生理学的生理食塩水中に取り出される。それ故、本発明は、さらに、腫瘍治療において適用可能である治療剤の生産のための、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように誘導する、本発明に係る活性化細胞系又はこの細胞系の活性な亜細胞画分（断片）又は適当な誘導体の使用に関する。これらの活性亜細胞画分は、直接的インビボ適用において特に好適である。これらの画分は、体内のリンパ球を殺腫瘍性Ｔリンパ球に直接活性化するために使用されることができる。腫瘍浸潤性リンパ球を殺腫瘍性Ｔリンパ球に活性化するために、これらの画分を直接的に腫瘍に適用することが特に有利である。活性亜細胞画分（active subcellular fraction）は、本発明に係る細胞系（例えば、HB 617及びHB 654）に類似のやり方で、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することを誘導する本発明に係る細胞系の画分と理解される。このような画分は、例えば、高張ショックにより得られる亜細胞小胞又はサイトカラシンＢとのインキュベーションにより得られる細胞不含膜小胞であることができる。例えば、塩化ナトリウム及びフエン酸ナトリウムとのインキュベーション後に得られることができる本発明に係る細胞系からの溶出物も好適である。本発明に係る細胞系のこのような画分は、当業者に馴染みの方法、例えば、クロマトグラフィー精製により、さらに精製されることができ、その間に、各精製段階の後にその画分の活性（殺腫瘍性Ｔリンパ球の形成能力）をチェックされなければならない。それ故、本発明は、リンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、ａ）その活性画分が、マイトジェン又は成長因子を添加する必要を伴わずに同種刺激を回避する、リンパ球との同時培養において、リンパ球を殺腫瘍性Ｔ細胞に活性化し、そしてｂ）このやり方で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加によらずにその存在中で増殖する、ようなリンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、これらの特性をもつ哺乳類細胞系を、（ｉ）分画し、（ii）それらの画分を分離し、そしてそれらの画分が、その開始細胞系を類似のやり方で、リンパ球を殺腫瘍性Ｔ細胞に活性化するかどうかについて検査し、そして（iii）このような活性画分を、選択し、そしてさらに、所望の精製程度に達するまでその活性をチェックしながら分画し、そして単離する、ことを特徴とする方法にも関する。これらの殺腫瘍性Ｔリンパ球は、細胞調製物中の腫瘍細胞をエクスビボにおいて除去するために使用することもできる。これは、好ましくは、殺腫瘍性Ｔリンパ球又は本発明に係るリンパ球細胞系と同時培養することにより、幹細胞単離物（例えば、骨髄幹細胞）から腫瘍細胞を除去する（取り除く（purging））ために使用されることができる。このやり方で精製された幹細胞は、例えば、照射又は化学療法後に患者内に再び移植されることができる（自己骨髄移植）。最後に、対応の治療組成物も本発明の対象であり、これは、各ケースにおいて、普通の医薬担体、増量剤及び／又は補助剤と共に、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することを誘導する、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球又は本発明に係る活性化細胞系又はこの細胞系の亜細胞画分又は対応の誘導体を含む。本発明に係る細胞系HB 654は、DSM ACC 2122の番号の下、“Deut Mascheroder Weg 1b，D-3300 Braunschweigに、1993年3月24日に寄託された。本発明に係る細胞系HB 617は、DSM ACC 2166の番号の下、“Deut Mascheroder Weg 1b，D-3300 Braunschweig に、1994年3月11日に寄託された。本発明を、以下の実施例によりさらに明らかにする。図１は、生きた血液細胞の数（PBL）及びリンパ芽細胞の形成に対しての本発明に係る小胞の効果について示している（ｄ：日）。図２は、形成されるリンパ芽細胞のキラー活性の測定による、本発明に係る小胞による剌激後のBrdUの放出について示している。曲線１：HB細胞による刺激曲線２：溶出物による刺激曲線３：自然放出曲線４：ブランク値実施例１同種刺激を回避しながらリンパ球と同時培養するときリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することの導入を導く細胞系の生産本発明に係る活性細胞系（activator cell line）の生産を、EP-B 0 093 436 中に記載された方法に従ってリンパ球の不死化により行う。このために、ヒトの末梢血液リンパ球を、最初に、Ficoll勾配遠心分離により単離する。マウス・ミエローマ細胞系P3X63 Ag 8.653 （ATCC CRL 1580）からの細胞質体を、EP-B 0 0 93 436中に記載されたサイトカラシンＢによる処理により作り出した。１×１０⁷ のヒト末梢血液リンパ球を、上記ミエローマ細胞系Ag 8.653の１×10⁷の細胞質体と各回混合し、そして遠心分離により沈澱させた。この上清液を、注意して取り出す。0.8nlの50％ポリエチレン・グリコール4000溶液を、温やかに且つ連続して振とうしながら１分間の期間にわたり一定の低速で添加する。次に、5mlのD ulbecco's最小必須培地（DMEM）を、５分間の時間期間にわたり室温において添加する。さらに20mlのDMEMの添加の後、これらの細胞を、沈澱させ、5 mlの新たなDMEM完全培地中に再懸濁し、そして支持細胞（feeder cells）として腹腔からのネズミ・マクロファージによりコートされた細胞培養プレートのウェルに小分けする。次に、個々のカルチャーを、２〜３日間の間隔においてDMEM完全培地と共に飼養した。最後に、リンパ球がＴリンパ球を形成することを活性化することができるクローンを選択する。このために、末梢血液リンパ球を、同種剌激（allogenic stimulation）により殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化されることができる細胞を除去するために、実施例２に記載するＬ−ロイシル− Ｌ−ロイシン・メチル・エステルと共に最初にインキュベートする。この方法で得られたリンパ球集団を、次に直接的な細胞−細胞接触を可能にする条件下でテストされるべき不死化リンパ球細胞と同時培養する。それにより活性化される殺腫瘍性Ｔリンパ球による上記のような同時培養の間に溶解されるこれらの不死化されたリンパ球細胞系を、さらに検査する。このために、このように選択された細胞系を、活性化されている殺腫瘍性Ｔリンパ球並びにさまざまな腫瘍細胞系と一緒に培養する。最後に、この工程の間に、さまざまな腫瘍細胞系に対する殺腫瘍性効果をもつＴリンパ球を作り出すような不死化された活性リンパ球細胞系を、選択する。この殺腫瘍作用は、殺腫瘍性Ｔリンパ球及び活性化するリンパ球細胞系から形態学的に区別されることができる腫瘍細胞系が、この同時培養の間にそのカルチャーから消失し又は未処理対照カルチャーに比べて数において少なくとも減少するという事実により、検出される。細胞HB 654は、この方法で得られた。エプスタイン・バール・ウイルスによる感染により不死化されている永久ヒトＢリンパ球系を、上記同一手順を用いて活性特性について検査した。単一細胞培養によりクローン化された20の異なるEBV-陽性Ｂ系を、ロイシル−ロイシン・メチル・エステルにより前処理された血液リンパ球との同時培養においてテストする。血液リンパ球の接種密度は、培養基（Iscovemod-DMEM＋15％ FCS；BM）1ml当り２×10⁶である。各Ｂ系の50−，100−、及び200−倍少ない細胞を、別々の調製物中の血液リンパ球に添加し、そして５％ CO₂中37℃においてインキュベートする。同様に、本発明に係る作用をもつ細胞系HB 617を、このやり方で得た。実施例２ヒトＢ細胞系HB 654との同時培養による殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産血液から単離する。単球、マクロファージ、ナチュラル・キラー細胞及びMHC-制限細胞毒性Ｔ細胞、特に活性化細胞系HB 654の同種MHC に対して向けられているもの、並びにそれらの前駆体を除去するために、得られた単核細胞を、Thiele a nd Lipsky （The Journal of Immunology，Vol．136，No．3 (1986)，p．1038-1 048）に従って、250μmol/lのＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシン・メチル・エステルを含むPBS 中室温において15分間インキュベートする。次に、15％ FCSを含むこれらの細胞を、Iscove's修飾Dulbecco's培地中に取り出し、HB 654細胞の不足（約１：10）を添加した後、それらを、殺腫瘍性Ｔリンパ球が、その活性化細胞系に対するそれらの除去活性に基づき検出されることができるまで、37℃において６〜８日間インキェベートする。実施例３殺腫瘍性Ｔリンパ球の効果それぞれ20の異なるドナーから実施例２に従って得られた殺腫瘍性Ｔリンパ球を、ヒト腫瘍系（表IとII参照）のカルチャーに添加する。これらの腫瘍細胞に対する殺腫瘍性効果を顕微鏡下にモニターする。これらのさまざまな腫瘍細胞系の成長は、阻害され又はそれらは、本発明に係る殺腫瘍性Ｔリンパ球により殺される。実施例４サイトカラシンＢによる処理によりHB 654細胞から作り出される細胞不含膜小胞による殺腫瘍性Ｔリンパ球（キラーＴ細胞）の生産Ａ．膜小胞の調製 HB 654細胞は、また、剪断力が（細胞を破壊せずに）その細胞に対して作用することを可能にすることにより分離されることができるサイトカラシンＢ（CB， Aldrich Biochemicals）と共にインキュベートすることにより（Techniques in Somatic Cell Genetics，Ed．J．W．SHAY；Plenum Press，New York，1982中に）MAUL，G．D．により記載された方法を用いて膜小胞（“小気胞（blebs）”）をほぐす（tie off）ことを引き起こされる。対数増殖期内のカルチャーからのHB 654細胞を、無血清培養基（RPMI 1640，B M）中で２回洗浄し、約２×10⁷細胞／mlの密度において、この培地中に再懸濁し、そして、37℃に加熱する。CB （保存溶液：５mg／ml DMSO）を添加する（最終濃度：25μｇ／ml）。この懸濁液を、37℃において１分間インキュベートし、そして次に振とう装置上で１分間回転させた。これらの細胞を、低速遠心分離により懸濁させる。小胞を含む上清を、５μｍフィルターを通して濾過する。平均して、１つのHB 654細胞から３つの膜小胞の収量が得られる。Ｂ．血液リンパ球からの殺腫瘍性キラーＴ細胞の生産単核血液細胞を、勾配遠心分離により実施例２中に記載したように単離し、ロイシル−ロイシン・メチル・エステルにより処理し、そして２×10⁶の小胞が１m l当り添加されている培養基（Iscovemod．DMEM プラス15％ FCS）１ml当り約２ ×１０⁶細胞の密度においてインキュベートする。これらの細胞に、７日目と10 日目に新たな培養基を補い、これは今度は、１ml当り２×10⁶の小胞を含んでいる。３，７，10及び13日目に、そのカルチャー中の生きた血液細胞の全数（PBL ）及びリンパ芽細胞の割合を測定する（図１）。この測定は、生きた血液細胞の数が最初に減少し、そして次に７日目に上昇することを示した。13日目に、生きた細胞の数は、元々接種された細胞の数の約５倍である。リンパ芽細胞の割合は、そのカルチャーの１日目の０％から13日目の約98％まで増加している。Ｃ．腫瘍細胞に対する小胞により誘導されたリンパ芽細胞の効果Ｂ．に従って得られたリンパ芽細胞の、腫瘍系Jurkat，THP-1 及びHB 654に対する殺腫瘍作用をその培養の設定後14日目に検査する。これらの腫瘍細胞の破壊を、製造者の指示に従って“Cellular DNA fragmentation ELISA Kit”（Boehri nger Mannheim GmbH，GER， Order No．1585045）を使用して測定する。原理；腫瘍（標的）細胞を、その培養基への５−ブロモ−２′デオキシ−ウリジン（Br dU）の添加により代謝的に標識する。増殖細胞は、チミジンの代わりにそのDNA 中にBrdUを取り込む。次に、これらの標的細胞に対する細胞毒性効果を、その壁に結合された抗−DNA 抗体及び抗−BrdU抗体−ペルキシダーゼ結合体が使用されるELISA （euzyme-liuked I mmunosorbent assay）により、BrdU−標的DNA の放出に基づき測定することができる。Ｂ．に従ってリンパ芽細胞と24時間同時培養した後、最大に放出されることができる腫瘍細胞DNA の少なくとも80％が、４／１のエフェクター／標的化において３つの腫瘍系の全てにおいて、その培養上清中にあり、そして10／１のＥ／Ｔ比においてその100％がある。実施例５低張ショックにより物理的なやり方で得られた亜細胞小胞によるキラーＴ細胞の生産 Jett et al.，に従って修飾された方法（Jett et al.，J．Biol．Chem．252 ( 1977)，2134-2142）を、請求の効果を作り出すのに好適な亜細胞断片を単離するためのさらなる方法として使用した。これらの小胞を以下のように得た。刺激細胞系HB 654の細胞を、（PBS 中バッファー中に0.9mM 塩化カルシウム及び0.5mM 塩化マグネシウムを含む）Earls バッファー中で洗浄し、その後、元の培養容量の１％内で同一バッファー中に取り込んだ。小胞を製造するために、90 ％グリセロールを、５分間隔において３段階において30％の最終濃度においてこれに添加した。グリセロール共に充填された細胞を、遠心分離し（1200xg，10分間、４℃）、そしてその上清を廃棄した。溶解バッファー（約１％の元の培養容量；10mM Tris/HCI，pH7.4，１mM MgCl₂，１mM CaCl₂）を、激しく混合しながらその細胞沈降物に添加し、そして氷水中で５分間インキュベートした。この後に、細胞死を除去する数回の遠心分離を行い、そしてその小胞画分を遠心分離した。最初の遠心分雌を、10分間700xg において行った。この上清を、10分間700xg において第２の遠心分離に供し、その沈澱物を廃棄した。この第２の遠心分離の沈澱物を再び廃棄し、そして遠心分離を再び行った。この沈澱物を再び廃棄し、そしてその残りの上清を、10分間2300xgにおいて遠心分離に供した。この上清を、10分間4500xgの最後の遠心分離において、それらの小胞を沈澱物にもっていくために使用した。この懸濁された沈澱物を、５μｍフィルターを通してもう一回濾過し、そしてその後に使用した。このやり方で得られた小胞の刺激特性を検査するために、これらを、先に記載ように行われた刺激調製物中に使用した。このために、小胞を、先に記載したように、１×10⁸HB 654細胞から得て、これらを、その後、末梢血液リンパ球を馴らすために使用した（ロイシル− ロイシン・メチル・エステルによる処理後２×10⁷細胞）。この手順は、実施例２と３中に記載されたものと全く同一であった。これらの結果を評価するために、“殺生活性（Kill activity）”のためのテストを行った。このテストを、実施例３中に記載したように行った。この手順において、上記のやり方で生産したキラーＴ細胞を、エフェクター胞として使用し、そしてＴ細胞腫瘍系MOLT 4を、標的細胞として使用した。これらの標的細胞の溶解速度を定量するために、Boehringer Mannheim GmbHからの“Cellular DNA F ragmentation ELISA-Kit”をこのために使用した。この手順を実施例４中に述べたものと同じであった。このテストの結果を図２中に与える。これらの小胞により形成された芽細胞が、キラーＴ細胞活性をもつことが明らかになった。図２中に記載したブランク値は、細胞の添加を伴わない試薬の吸収に一致する。自然放出についての測定値は、標的細胞がエフェクター細胞を伴わずに添加されるときに得られた吸光度に一致する。実施例６好適なバッファーとのインキュベーションにより生産された刺激細胞系からの溶出物によるキラーＴ細胞の生産以下に記載する方法を、請求に係る効果を作り出すのに好適である亜細胞断片を得るためのさらなる方法として使用した：他の実施例中に述べられた方法に従って培養された刺激細胞系HB 654の細胞を、Hanks Balanced Salt Solution （HB SS，Boehringer Mannheim GmbH，GER）中で３回洗浄し、そしてその後、約２×10⁷細胞／mlの密度において、150mmol/l NaCl，15mmol/lクエン酸Na，pH7.2 中に取り出した。それらを、その後、37℃ において30分間インキュベートした。その後、これらの細胞を、4500xgにおいて７分間遠心分離することにより沈降させた。このやり方で得られた上清は、溶出物を提示する。この上清を、５μｍフィルターを通して１回濾過し、そしてその後に使用する。このやり方で得られた溶出物の刺激特性を評価するために、これを、先に記載したように行われた刺激調製物中で使用した。このために、溶出物を、先に記載したように、２×1０⁷HB 654 細胞から得て、そしてこれを、末梢血清リンパ球（２×10⁷細胞）を馴らすためにその後に使用した。この手順は、先の実施例中に記載したものと同じであった。 “殺生活性（Kill activity）”についてのテストを、これらの結果を評価するために行った。このテストを、先の実施例中に記載したように行った。このために、上記のやり方で生産されたキラーＴ細胞を、エフェクター細胞として、そしてJurkatを、標的細胞として使用した。これらの標的細胞の溶解速度を定量するために、Boehringer Mannheim GmbHからの“Cellular DNA Fragmentation ELI SA-Kit”を、このために使用した。この手順は、実施例４中に述べたものと同じであった。この溶出物により形成された芽細胞がキラーＴ細胞活性をもつことが明らかになった。0.121，0.214，0.269 及び0.114 の（自然放出についての吸光度を差し引いた後の）BrdU溶出物についての吸光度を、４つの異なる小胞調製物を用いて得た。

【手続補正書】【提出日】１９９５年９月２９日【補正内容】請求の範囲１．哺乳類細胞系又はその活性画分であって、ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれらをリンパ球と同時培養するとき、それらが、マイトジェン又は成長因子の添加を必要とせずにリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化し、そしてｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖するような哺乳類細胞系又はその活性画分。２．細胞系DSM ACC 2122 (HB 654) 及びDSM ACC 2166 (HB 617)。３．殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産方法であって、その間に同種刺激を回避しながら、リンパ球を、請求項１又は２に記載するような細胞系又はその細胞系の活性画分と同時培養する方法。４．殺腫瘍性Ｔリンパ球であって、ａ）それらが腫瘍細胞系ATCC CRL 1582 (MOLT-4)，ATCC TIB 152 (Jurkat)，A TCC TIB 202 (THP-1)，ATCC CCL 240 (HL-60)，ATCC CCL 2 (HeLa)，ATCC CCL 2 43 (K-562)，ATCC HTB 64 (Malme-3M)及びATCC HTB 18 (Y79) に対する殺腫瘍効果をもち、そしてｂ）インターロイキン２が、細胞系DSM ACC 2122又はDSM ACC 2166の存在中これらの細胞系の増殖の間にこれらの殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に0.5IU/ml の検出眼界において検出されることができない、殺腫瘍性Ｔリンパ球。５．請求項４に記載の殺腫瘍性Ｔリンパ球並びに、所望により、普通に使用される担体、補助剤又は増量剤の中の１を含む治療組成物。６．所望により、普通に使用される担体、補助剤又は増量物質の中の１と一緒に、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することを誘導する、請求項１又は２に記載の細胞系又はこの細胞系の活性亜細胞画分又は適当な誘導体を含む、治療組成物。７．細胞調製物中の腫瘍細胞の殺腫瘍作用の除去のための方法であって、この細胞鋼製物を殺腫瘍性Ｔリンパ球と共にインキュベートし、その殺腫瘍性Ｔリンパ球が、ａ）腫瘍細胞系ATCC CRL 1582 (MOLT-4)，ATCC TIB 152 (Jurkat)，ATCC TIB 202 (THP-1)，ATCC CCL 240 (HL-60)，ATCC CCL 2 (HeLa)，ATCC CCL 243 (K-56 2)，ATCC HTB 64 (Malme-3M)及びATCC HTB 18 (Y79) に対する殺腫瘍効果をもち、そしてｂ）インターロイキン２が、細胞系DSM ACC 2122の存在中これらの細胞の増殖の問に0.5IU/mlの検出限界においてこれらの殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に全く検出されることができない、ような方法。８．幹細胞調製物が細胞鋼製物として使用される、請求項７に記載の方法。９．リンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、そのリンパ球細胞系が、ａ）その間に同種刺激を回避しながらマイトジェン又は成長因子の添加の必要を伴わずに、リンパ球との同時培養において、リンパ球を殺腫瘍性Ｔ細胞に活性化し、そしてｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖し、これらの特性をもつ哺乳類細胞系を、（ｉ）分画し、（ii）これらの画分を分離し、そしてその開始細胞系と類似のやり方で、これらの画分がリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化するかどうかについて、それを検査し、（iii）このような活性画分を選択し、そしてその活性をチェックしながら所望の程度の純度に達するまでさらに分画し、そして単離する、ような方法。 10．DSM ACC 2122又はDSM ACC 216 が、哺乳類細胞系として使用される、請求項９に記載の方法。 11．溶出物、膜小胞又は亜細胞小胞を活性画分として単離する、請求項９又は 10に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アルベルトビンフリートドイツ連邦共和国，デー―82390 エバーフィンク，ハウプトシュトラーセ 16アー (72)発明者バイドルウルリッヒドイツ連邦共和国，デー―80336 ミュンヘン，ランドベールシュトラーセ 56

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類細胞系又はその活性画分であって、ａ）その間に同種刺激を回避しながらそれらをリンパ球と同時培養するとき、それらが、マイトジェン又は成長因子の添加を必要とせずにリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化し、そしてｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖する、ような哺乳類細胞系又はその活性画分。２．それがリンパ球細胞系又は画分である、請求項１に記載の細胞系又は画分。３．細胞系HB 654及びHB 617。４．殺腫瘍性Ｔリンパ球の生産方法であって、その間に同種刺激を回避しながら、リンパ球を、請求項１〜３の中の１に記載するような細胞系又はその細胞系の活性画分と同時培養する方法。５．同時培養が、請求項１〜３の中の１に記載の細胞系の誘導体又は亜細胞画分と共に、又は他の細胞とこの細胞系との融合生成物と共に、行われる、請求項４に記載の方法。６．殺腫瘍性Ｔリンパ球であって、ａ）それらが腫瘍細胞系MOLT-4，Jurkat，THP-1，HL-60，HeLa，K-562，Malme -3M 及びY79 に対する殺腫瘍効果をもち、そしてｂ）インターロイキン２が、細胞系HB 654又はHB 617の存在中これらの細胞系の増殖の間にこれらの殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に0.5IU／mlの検出限界において検出されることができない、殺腫瘍性Ｔリンパ球。７．腫瘍治療において使用されることができる治療剤の製造のための請求項６に記載のヒト殺腫瘍性Ｔリンパ球の使用。８．腫瘍治療において使用されることができる治療剤の製造のための、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように誘導する、請求項１〜３の中の１に記載の細胞系又はこの細胞系の活性亜細胞画分又は適当な誘導体の使用。９．請求項６に記載の殺腫瘍性Ｔリンパ球並びに、所望により、普通に使用される担体、補助剤又は増量剤の中の１を含む治療組成物。 10．所望により、普通に使用される担体、補助剤又は増量物質の中の１と一緒に、リンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成することを誘導する、請求項１〜３の中の１に記載の細胞系又はこの細胞系の活性亜細胞画分又は適当な誘導体を含む、治療組成物。 11．細胞調製物中の腫瘍細胞の殺腫瘍作用の除去のための方法であって、この細胞調製物を殺腫瘍性Ｔリンパ球と共にインキュベートし、その殺腫瘍性Ｔリンパ球が、ａ）腫瘍細胞系MOLT-4，Jurkat，THP-1，HL-60，HeLa，K-562，Malme-3M 及び Y79 に対する殺腫瘍効果をもち、そしてｂ）インターロイキン２が、細胞系HB 654の存在中これらの細胞系の増殖の間に 0.5IU／mlの検出限界においてこれらの殺腫瘍性Ｔリンパ球の培養上清中に全く検出されることができない、ような方法。 12．幹細胞調製物が細胞調製物として使用される、請求項11に記載の方法。 13．リンパ球細胞系からの活性画分の製造方法であって、そのリンパ球細胞系が、ａ）その間に同種刺激を回避しながらマイトジェン又は成長因子の添加の必要を伴わずに、リンパ球との同時培養において、リンパ球を殺腫瘍性Ｔ細胞に活性化し、そしてｂ）この方法で活性化されたリンパ球が、インターロイキン２の添加を伴わずにそれらの存在中で増殖し、これらの特性をもつ哺乳類細胞系を、（ｉ）分画し、（ii）これらの画分を分離し、そしてその開始細胞系と類似のやり方で、これらの画分がリンパ球が殺腫瘍性Ｔ細胞を形成するように活性化するかどうかについて、それを検査し、（iii）このような活性画分を選択し、そしてその活性をチェックしながら所望の程度の純度に達するまでさらに分画し、そして単離する、ような方法。 14．HB 654又はHB 617が、哺乳類細胞系として使用される、請求項13に記載の方法。 15．溶出物、膜小胞又は亜細胞小胞を活性画分として単離する、請求項13又は 14に記載の方法。