DE3923848C2 - Das Demaskierungstraining für autologe Immunozyten gegen maskierte Tumorzellen in vitro - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immunpotenzierung von weißen Blutzellen, die immunpo­ tenzierten weißen Blutzellen und deren Verwendung zur Behandlung von Tumoren.

• 1. Das Patentgesuch fällt unter den Bereich der körper­ eigenen Zelltherapie (Zellbiologie).
• 2. Zum Stand der Technik wird auf die heute gebräuchlichen Gewinnungsverfahren für körpereigene Zellen (siehe auch Text) hingewiesen.
• 3. Mit der Entnahme körpereigener Blutzellen wird in vitro ein Immun-Erkennungs-Training zur Demaskierung von Tumorzellen durchgeführt, welche letztere in vitro kultiviert wurden.
  • 1. 3.1 Im Jahre 1978 hat der Anmelder erstmals im Experiment mit weißen Blutzellen des Menschen (WBC) die Entdeckung gemacht, daß auch WBC Gesunder in der Zellkultur weiterleben können und sich in vitro sogar zum Teil auch vermehren.
    Bislang war dies nur bekannt bei schweren tumorösen Erkrankungen des Blutsystems oder allenfalls noch bei speziellen Viruserkrankungen.
    Bis zu diesem Zeitpunkt galt als Regel, daß
    • a) die WBC nur einige Tage in der Zellkultur am Leben erhalten werden können und
    • b) daß nur durch zusätzliche Gaben von Chemikalien wie beispielsweise PHA die Zellteilung der Lymphozyten angeregt werden könnte, was ausschließlich die "Erhaltung der Zellen am Leben" erreichen könnte (siehe auch die Lehre von den HLA).
    Somit war es dem Anmelder als Erstem gelungen, auch ohne besondere Zusätze, sondern nur mit der geeigneten Technik, die WBC über längere Zeiträume auch in vitro am Leben zu erhalten, und mit ihnen zu experimentieren. Dabei konnte er viele Beobachtungen machen, die bislang so noch nicht beschrieben worden waren und sind.
  • 2. 3.2 Parallel hierzu beschäftigte sich der Antragsteller auch mit dem Wachstumsverhalten von Tumorzellen in vitro. Er legte dabei besonderes Gewicht auf die morphologischen Merkmale und die Rückschlüsse, die man aus diesen Merkmalen ziehen kann.
    Es lag nahe, daß der Antragsteller als Hautarzt sich besonders jenen Tumoren widmete, die in sein Fachgebiet fallen. Gleichwohl bearbeitete er aber auch andere Tumor-Formen.
    Dabei machte er die Beobachtung, daß bei den semimalig­ nen Tumoren, also den halb-bösartigen, ein monomorphes Bild vorherrscht.
    Je "bösartiger" aber ein Primärtumor ist, desto poly­ morpher ist sein morphologischer Charakter in vitro in aller Regel. Insbesondere das maligne Melanom, aber auch andere Tumoren, beobachtete der Antragsteller in vitro und machte dabei die Feststellung, daß oft viele unterschiedliche Zelltypen in einem Tumor vorherrschen.
    Bei der Metastasierung (Setzen von Tochtergeschwülsten) ist diese Polymorphie zwar noch erhalten, aber die Tumorzellen imitieren dort, wohin sie metastasierten, zumindest rein morphologisch gesehen genau jenes Gewebe weitgehend, in welches sie metastasiert sind.
    Sie maskieren sich also durch Imitation des Gewebes rein morphologischerseits, in das sie hineingewachsen sind.
  • 3. 3.3 Bringt man nun die Tumorzellen mit den WBC des gleichen Patienten zusammen, so kann man folgende überraschende Beobachtung machen:
    Die WBC verhalten sich vollkommen neutral zu den Tumor­ zellen in vitro. Sie kontaktieren die Tumorzellen nur zufällig und stoßen sich mit ihren Tentakel-artigen Fortsätzen wieder von ihnen ab.
    Geht aber eine Tumorzelle zugrunde, so wird sie sofort von den Lymphozyten rosettenartig kontaktiert. Durch diese rosettenartige Kontaktnahme wird der Absterbe­ zeitraum für die Tumorzellen erheblich verkürzt im Vergleich zu dem Absterbezeitraum von Tumorzellen ohne Zusatz von WBC.
    Im Anschluß an die Rosettierung werden sofort Makropha­ gen aus der Umgebung in vitro angelockt. Die durch den Rosettierungs-Kontakt hochgeschädigten Tumorzellen werden jetzt rasch von den "herbeigeeilten" Makrophagen in vitro phagozytiert.

Dieser Vorgang kann mikroskopisch verifiziert werden. Er ist aber auch in der Time-laps-Kinematographie gut zu dokumentieren. Darüber hinaus ist das Melanom- Zellmaterial aber auch innerhalb der Makrophagen gut mittels der für tragendes Pigment färberisch darstell­ baren Methoden verifizierbar.

Diese unbedeutend erscheinende Beobachtung wird aber in der Tumorlehre seit langem so postuliert, ohne hierfür bisher exakte Beweise vorlegen zu können. Eine genaue Analyse dieser dargestellten Vorgänge läßt folgende Rückschlüsse zu, die möglicherweise zwar nicht auf alle, aber auf die meisten Tumorformen zutreffen:

• a) Die Zellmembran von Tumorzellen insbesondere im Stadium der Metastasierung hat die Fähigkeit, sich immunologisch zu maskieren. Hierdurch entgeht sie den körpereigenen zellulären Abwehrmechanismen.
• b) Die Tumorzellen imitieren diejenigen Zellen, in deren Gewebe sie metastasiert sind. Sie verhalten sich also zumindest rein morphologisch gesehen genauso wie die gutartigen Zellen desjenigen Gewebes, in welches sie sich als Tochtergeschwülste des Primärtumors abgesiedelt haben.
• c) Erst mit dem beginnenden Zelltod der Tumorzelle wird die Zellmembran aufgelockert und vermehrt durchlässig. Jetzt erkennen die Zellen des Immun­ systems das Tumormaterial.

Die Tumorzellen werden also erst jetzt, also in der Absterbephase, zerstört und phagozytiert. Das heißt, sie werden durch Makrophagen (Freßzellen) partikelweise einverleibt und verdaut.

Kurz vor dem Tode eines Tumorpatienten, der am malignen metastasierenden Melanom erkrankt ist, kann folgende Beobachtung gemacht werden:

Alle Makrophagen des Patienten sind vollgepackt mit nicht nur färberisch darstellbarem Pigment sondern im Mikroskop mit dem bloßen Auge erkennbarem Pigment aus zugrundegegangenen Tumorzellen. Die Freßzellen, die wesentliche Abwehrmechanismen für das Überleben des Patienten zu bewerkstelligen haben, sind also allesamt vollgepackt mit Tumorzell-Material, ohne daß sie noch in der Lage wären, ihrer eigentlichen Abwehrfunktion nachzukommen. Die Infektabwehr wird hierdurch weitge­ hend blockiert. Das Immunsystem des Patienten wird also in der letzten Lebensphase mit zugrundegehendem Zellma­ terial derart blockiert, daß die natürliche Infektab­ wehr nicht mehr vollziehbar ist. Der Tumorpatient muß einem eigentlich banalem Infekt erliegen.

Dieser beschriebenen Maskierung der Tumorzellen über den Aufbau der Zellmembran steht andererseits eine "Luxusfunktion" des Immunsystems gegenüber. Das heißt: Durch die Maskierung intakter Tumorzellen werden nur jene Tumorzellen als "fremd" von der körpereigenen Abwehr erkannt, die ohnehin nicht mehr gefährlich für den Organismus sind. Das Immunsystem "verausgabt" sich also damit, ohnehin schon absterbende und somit ungefährliche Tumorzellen zu zerstören, anstatt (hier mangels Erkennungskriterien) die Tumorzellen in jener Phase zu schädigen oder abzutöten, in der sie für den Organismus noch tatsächlich gefährlich sind.

Nicht einmal in der Zellteilungsphase, also der beson­ ders ungeschützten Phase innerhalb der Zellgeneration, wird das Immunsystem gegen Tumorzellen aktiv. Der Maskierungseffekt hält also auch während der Zelltei­ lungsphase an.

Statt dessen werden nur jene Tumorzellen zerstört, die ohnehin absterben. Solche "unnötigen" Aktivitäten bestimmter biologischer Systeme nennt man "Luxusfunktion", da sie für das natürliche Überleben des Organismus nicht erforderlich sind und eine unnötige Funktion darstellen. Solche Luxusfunktionen führen in aller Regel zur raschen Verausgabung des gesamten biologischen Systems.

Unter der oben beschriebenen Prämisse ist daher zu postulieren, die Tumorzellen noch vor der Absterbe­ phase, also solange sie noch für den Organismus gefähr­ lich sind, erkenntlich zu machen. Hierdurch könnte das körpereigene Immunsystem auch schon in jener Phase, in der die Tumorzellen das Wirtssystem schädigen, diese erkennen und zerstören.

Therapeutisch ist dies heute nur mit der Chemotherapie oder den verschiedenen Bestrahlungstechniken möglich. Alternativ steht die chirurgische Intervention zur Verfügung.

Als weitere Möglichkeit ist zu fordern, das körper­ eigene Immunsystem des Tumorpatienten dazu zu bringen, die Tumorzellen in der Phase bereits zu erkennen, in der sie eine Schädigungspotenz für den Organismus bedeuten. Hierdurch könnten die Tumorzellen rechtzeitig zerstört werden und nicht erst dann, wenn sie ohnehin schon absterben. Dies würde bedeuten:

Aktive gezielte Tumordestruktion durch das körpereigene Abwehrsystem.

Bis zum heutigen Tag gab es solche Hilfeleistungen für die bessere Erkennung der Tumorzellen aber nicht. Praktiziert werden zwar allgemein immunstimulierende Maßnahmen, die aber nur in der Lage sind, das Immun­ system allgemein zu kräftigen, und die Immunozyten zur Vermehrung anzuregen. Hierdurch werden zwar die Immuno­ zyten vervielfältigt und in ihrer Aktivität angeregt. Keineswegs aber gewinnen sie hierdurch die Fähigkeit, plötzlich Tumorzellen zu erkennen. Vielmehr werden sie nur aktiver oder zahlenmäßig größer als bisher, eine spezifische Tumorzellerkennung bleibt jedoch nach wie vor aus.

EP 147 689 beschreibt ein Verfahren zur Induktion von Antitumorzellen, wobei Leukozyten mit einem an einen unlöslichen Träger kovalent gebundenen Liganden zur Induktion in Kontakt gebracht werden. Der Ligand ist dabei aus T-Lymphozyten-aktivierenden Substanzen, antigenen Substanzen, hydrophoben Substanzen und anionischen Substanzen ausgewählt. Datenbank BIOSIS bei STN, 84: 332341 beschreibt durch autologe, gemischte Lymphozyten-Tumorzellen-Kultur (MLTC) induzierte cytotoxische Lymphozyten gegen autologe Tumorzellen. Die MLTC-aktivierten Lymphozyten werden dann mit Tumor­ zellen-Wachstumsfaktor weiter behandelt. Eur. J. Immunol. (1988) Seiten 671-676 beschreibt die Stimulierung von peripheren Blut-Lymphozyten von Melanom-Patienten mit autologen Melanomzellen in einer gemischten Lymphozyten-Tumorzellen-Kultur. Dabei erfolgt eine Stimulierung durch Zugabe von JL-2. Die Zellen werden 35 Tage in Kultur gehalten. Datenbank EMBASE bei STN, 88226424 beschreibt die Kultivierung von peripheren Blutlymphozyten eines Patienten mit einem metastatisierendem Melanom mit autologen Melanom- Zellen und rekombinantem Interleukin 2.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem das körpereigene Immunsystem trainiert werden kann, Tumorzellen zu erkennen und zu zerstören.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen gelöst.

Durch die Kombination Tumorzell-Züchtung in vitro und anschließend Beschichtung mit WBC kann hier eine Thera­ pieverbesserung erzielt werden. Das heißt

• a) Gewinnung von Tumorzellmaterial und nachfolgende Anfertigung einer Zellkultur der Tumorzellen in vitro.
• b) Überschichtung der Tumorzellen in vitro mit WBC für individuell unterschiedlich lange Zeiträume.

Im Patientenorganismus steht den Immunozyten nur kurz­ fristig die Möglichkeit offen, über den Weg des strömenden Blutes bestimmte Signale aus den Tumorzellen aufzunehmen, und diese zu verwerten. Viel zu kurz ist nämlich der Zeitraum für die Immunozyten, am Tumor zu verweilen und Tumorinformationen aufzunehmen.

Mit der oben beschriebenen Überschichtung in der Zellkultur besteht in vitro dagegen die Möglichkeit für die Immunozyten, über längere Zeiträume als in vivo die Tumorzellen zu erkennen, sie rein morphologisch gespro­ chen abzutasten und die Informationen aus diesen Tumor­ zellen zu entnehmen. Es sind dies Informationen, welche die Immunozyten benötigen, um ihre Aktivität gegen die Tumorzellen zu mobilisieren.

Auf die verschiedenen Identifikationssysteme des Immunsystems in vivo soll hier nicht näher eingegangen werden, da dies den Rahmen der gegenständlichen Ausfüh­ rungen sprengen würde. Andererseits sind diese Systeme noch nicht so hinreichend erforscht, daß man eine gültige Aussage treffen könnte.

Die Immunozyten, den Tumorzellkulturen in vitro überschichtet, können aufgrund der anfallenden Stoff­ wechselprodukte einerseits und des längeren Zeitraumes, der ihnen zur Erkennung zur Verfügung steht anderer­ seits, das Tumorzellsystem jetzt besser identifizieren. Die so zur besseren Erkennung der Tumorzellen poten­ zierten Immunozyten werden in einem nächsten Schritt dem Patienten reinjiziert. Im Anschluß an die Reinjek­ tion nehmen die Immunozyten nun ihre verschiedenen Erkennungssysteme und immunologischen Verarbeitungsin­ formationsträgerfunktionen auf. Bedingt durch die längeren Erkennungszeiträume in vitro sind die Informa­ tionen, die die Immunozyten jetzt übermitteln, wesent­ lich effektiver und detaillierter.

Es ist davon auszugehen, daß durch diese Informations­ übermittlung das Immunsystem in der Lage ist, frühzei­ tiger die Tumorzellen anzugreifen, also schon in jenem Zeitraum, da die Tumorzellen für den Wirtsorganismus schädigend sind. Hiermit kann eine Verminderung des Tumorzellmaterials in vivo erreicht werden.

Dies geschieht ohne den Einsatz von Medikamenten oder anderer therapeutischer Systeme, die für den Gesamtor­ ganismus schädlich wären. Vielmehr werden nur die körpereigenen Abwehrkräfte spezifisch mobilisiert, so daß ein natürlicher Abwehrmechanismus in Gang gesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist also

• a) die Anzüchtung der Tumorzellen in vitro und deren Bereitstellung in größeren Mengen für das Immuntraining und anschließend
• b) die Gewinnung von WBC, um sie aufgrund ihrer Funktion als Immunozyten den Tumorzellen zu überschichten, damit in der Folge
• c) die Reinjektion für den Patienten vorgenommen werden kann. Dies bewirkt, daß die Immunozyten, jetzt spezifisch durch die bessere Tumorzell-Erken­ nung potenziert, ihre Abwehrfunktion gegenüber den Tumorzellen schon früher als bisher vornehmen können. Hierdurch kann die Tumormasse in ihrer Ausbreitung gehindert werden und somit deren Schädigung für den Wirtsorganismus reduziert werden.

Die vorteilhafte Wirkung der Erfindung ist, daß hierdurch die bisher bekannten und gebräuchlichen Verfahren zur Tumortherapie durch eine weitere thera­ peutische Variante bereichert werden. Diese therapeuti­ sche Variante hat den Vorteil, daß sie

• 1. auf rein biologischer Basis angelegt ist.
• 2. Die sonst in aller Regel erforderliche totale Entfernung der Tumormassen wird hierdurch nicht mehr erforderlich, da die Immunozyten zur Tumor­ zell-Destruktion potenziert werden sollen.
• 3. Oft teilen sich Tumorzellen langsamer als die Körperzellen. Gerade für solche Tumorzellen-Varian­ ten ist dieses biologische Verfahren geeignet.
• 4. Die oft unterschiedlichen Varianten von Tumorzellen können mit diesem Verfahren allesamt miterfaßt werden, soweit sie auch in vitro darstellbar sind. Hierdurch kann eine bessere breitspezifische tumortherapeutische Wirkung erzielt werden.

Genaue Beschreibung:

• a) Die Tumorzellen werden in aller Regel durch chirur­ gische Entfernung gewonnen und in der Zellstruktur explantiert und vervielfältigt.
• b) Die Gewinnung von WBC zur Überschichtung der Tumorzellkulturen. Einwirkung der WBC über unter­ schiedlich lange Zeiträume: 6, 9, 12 und 48 Stunden.
• c) "Ernten" der so immunpotenzierten WBC und Reinjek­ tion in den Patientenorganismus zur Entfaltung der immuntrainierten Wirkung.

Bei dem Training der Immunozyten ist es günstig, genaue Buchführung zu betreiben. Es muß nämlich gesichert sein, daß nicht die WBC der verschiedenen Patienten untereinander verwechselt werden, oder die WBC des einen Patienten den Tumorzellen des anderen Patienten überschichtet werden.

Durch doppelte Buchführung muß solchen Verwechslungen vorgebeugt werden.

Claims (3)

1. Verfahren zur Immunpotenzierung von autologen weißen Blutzellen, umfassend:

• a) Gewinnen von autologen weißen Blutzellen,
• b) Gewinnen von autologen Tumorzellen,
• c) Überschichten der autologen Tumorzellen mit den autologen weißen Blutzellen und
• d) Einwirken der autologen weißen Blutzellen auf die autologen Tumorzellen über einen Zeitraum von 6 bis 48 Stunden.

2. Immunpotenzierte autologe weiße Blutzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung der immunpotenzierten autologen weißen Blutzellen von Anspruch 2 zur Behandlung von Tumoren, wobei die immunpotenzierten autologen weißen Blutzellen dem Patienten reinjeziert werden.