DE3524794A1

DE3524794A1 - Pharmazeutisches praeparat enthaltend lebende vermehrungsfaehige embryonalzellen, verfahren zu dessen herstellung und testverfahren zur bestimmung der pharmazeutischen wirksamkeit

Info

Publication number: DE3524794A1
Application number: DE19853524794
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. Arisdorf Hitz; Rolf Dr. Schäfer
Original assignee: Chemisches Institut Schaefer Ag Oberwil; Chemisches Institut Schaefer AG
Current assignee: Ct Holding Ag Neuenburg/neuchatel Ch
Priority date: 1984-07-13
Filing date: 1985-07-11
Publication date: 1986-01-16
Also published as: CH667204A5

Description

Pharmazeutisches Präparat enthaltend lebende vermeh-
rungsfähige Embryonalzellen, Verfahren zu dessen Herstellung und Testverfahren zur Bestimmung der pharmazeutischen Wirksamkeit.
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Präparate, welche lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen mrn Säugetieren in einem flUssigen oder festen inerten Medium enthalten. In diesen pharmazeutischen Präparaten sind üblicherweise mehr als 30 %, vorzugsweise mehr als 50 96, und speziell bevorzugt mehr als 70 96, lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen vorhanden, bezogen auf die Gesamtzahl der in dem Präparat anwesenden Embryonalzellen. Des weiteren enthalten die erfindungsgemässen Präparate üblicherweise weniger als 10 96, bezogen auf die Gesamtzahl der EMbryonalzellen, an Zellbruchstücken oder sie sind vollständig frei von Zellbruchstücken.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate und Testverfahren zur Bestimmung der pharmazeutischen Wirksamkeit der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate.
In der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0038 511 werden Polypeptide, Glycosteroide und Glycosphingolipide beschrieben, die aus Organen von Säugetieren, wie zum Beispiel Pancreas, Herz, Lunge, Muskel und Rückenmark oder auch aus Blutplasma oder Serum von Säugetieren isoliert werden können. Die fraglichen Wirkstoffe werden in pharmazeutischen Präparaten zur Verbesserung der Wundheilung eingesetzt.
In der österreichischen Patentschrift Nr.
364 079 wird ein Verfahren zur Herstellung von entfibrinierten und gefriergetrockneten Placentazellen beschrieben. Bei diesem Verfahren wird die fetomaterne Placenta eines Ende des vierten Monats der Trächtigkeit getöteten Mutterschafes zerkleinert. Die erhaltenen Teilchen werden dann sofort in Ringer-Lösung getaucht, um Blutspuren wegzuwaschen. Anschliessend werden die Teilchen zerteilt und in einer wässrigen Trypsin enthaltenden Lösung unter Rühren einer Trypsinverdauung unterworfen und dann abfiltriert, gewaschen, zentrifugiert und der Rückstand bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet. Die so erhaltenen lyophilisierten Placentazellen enthalten keine lebenden Zellen mehr, besitzen einen hohen Proteingehalt und enthalten gonadotrope Hormone. Sie sollen als Wirkstoffe in medizinischen oder kosmetischen Präparaten verwendet werden, und beispielsweise durch Injektion verabreicht werden.
Auch in der Schweizer Patentschrift Nr.
361 087 wird ein Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates beschrieben, bei dem Organe von Tieren einer enzymatischen Behandlung, unter Verwendung von Trypsin, unterworfen werden.
In der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 3 015 923 werden Verfahren zur Zerkleinerung von Gewebsteilen von warmblütigen Tieren, beispielsweise Embryos von Säugetieren oder Vögeln, beschrieben, um ein Frischzellenpräparat herzustellen, das direkt verwendet werden kann oder tiefgefroren werden kann.
Bei diesem Verfahren werden die Gewebsteile sofort nach der Tötung des Tieres innerhalb von wenigen Stunden tiefgefroren, und zwar durch Schockgefrierung bei sehr tiefen Temperaturen, beispielsweise -190° C.
Die fraglichen Gewebe werden dann bei Temperaturen von -400 C gelagert und im tiefgefrorenen Zustand, unter Verwendung eines Cutters, eines Mixers oder einer ähnlichen Zerkleinerungsmaschine zerkleinert.
Das zerkleinerte Produkt wird dann bei Temperaturen von bis zu -20°C oder -25°C gelagert bis es verwendet wird. Bei der Verwendung werden die tiefgefrorenen Präparate zuerst aufgetaut und der erhaltene Zellbrei wird verdünnt und sofort injiziert. Die in dieser deutschen Offenlegungsschrift beschriebenen Präparate enthalten dementsprechend nicht lebende, vermehrungsfähige Zellen, sondern Zellbruchstücke.
In der deutschen Offenlegungsschrift Nr.
3 947 908 werden ebenfalls Verfahren zur Herstellung von tiefgefrorenen Zellpräparaten beschrieben, bei denen Organe oder Teile von Organen eines Embryos zuerst bei einer Temperatur von -1960 C tiefgefroren werden und dann im tiefgefrorenen Zustand zu kleineren Teilchen zerteilt und schliesslich in einer Ringerlösung fein zerhackt werden. Das Produkt wird bei Temperaturen von -790 C gelagert, um eine Auto- lyse zu verhindern. Auch in diesem Falle enthalten die so hergestellten Präparate keine lebenden, vermehrungsfähigen Zellen, sondern Zellbruchstücke.
In der Schweizer Patentschrift Nr.
283 588 wird ein Verfahren zur Herstellung eines Zellpräparates durch Entwässerung der Zellen beschrieben, vorzugsweise durch Gefriertrocknung der Zellen.
Noch andere Therapieverfahren mit lyophilisierten Zellen sind bereits in der Literatur beschrieben. Auch aus Organextrakten gewonnene Substanzen, wurden bereits durch Injektion verabreicht, um immunogene Reaktionen hervorzurufen. Derartige Therapieverfahren werden als unspezifische Reiztherapien bezeichnet.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es jedoch, ein pharmazeutisches Präparat zu entwickeln, das in der Lage ist, eine Regenerierung von geschädigten Zellen hervorzurufen, bzw. einer Schädigung vorzubeugen. Ueberraschenderweise zeigte es sich, dass ein pharmazeutisches Präparat, das lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthält, zu diesem Zweck geeignet ist.
ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung war es, Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten zu entwickeln, bei denen die aus dem Uterus entnommenen Embryonen zuerst seziert werden und dann die einzelnen Organe, Düsen oder Gewebe, zunächst in kleine Teile und schliesslich mechanisch zu Einzelzellen zerteilt werden, die dann in einem inerten flüssigen Medium dispergiert werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung eines Testverfahrens zur Bestimmung der pharmazeutischen Wirksamkeit von erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten, bzw.
zur Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum von erwachsenen Säugern.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein pharmazeutisches Präparat, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es lebende vermehrungsfähige hmbryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen oder festen inerten-Medium enthält.
In den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten können die lebenden, vermehrungsfähigen Embryonalzellen von toten Zellen einfach unterschieden werden, indem man Anfärbungen mit Trypanblau, bzw. Anfärbungen mit Methylrot durchführt. Das Methylrot wird von den lebenden Zellen aufgenommen, wodurch diese rot gefärbt werden, während tote Zellen ungefärbt bleiben. Im Gegensatz dazu färbt das Trypenblau tote Zellen blau, während lebende Zellen farblos bleiben.
Die entsprechende Bestimmung wird durchgeführt, indem man ein erfindungsgemässes pharmazeutisches Präparat nach einer entsprechenden Verdünnung anfärbt und die gefärbten Zellen zählt. Die Zellbruchstücke werden nicht gezählt. Es zeigte sich dabei, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, deren Embryonalzellen Herzzellen, Knochenmarkzellen, Leberzellen, Milzzellen oder Thymuszellen sind, meist über 90 % an lebenden Zellen enthalten, wobei der Rest auf 100% der Gesamtzellen in dem erfindungage- mässen pharmazeutischen Präparat aus toten Zellen besteht. Wenn die Embryonalzellen aus der Placenta, den Hoden, der Schilddrüse, den Nieren oder den Nebennieren der Eiiibryonen stammen, dann betragen die Anteile der Lebendzellen meist mehr als 30 96, häufig 50 - 80 96.
Die Vermehrungsfähigkeit der in den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten enthaltenen Embryonalzellen konnte dadurch festgestellt werden, dass die Zellen nach Einbringung in ein geeignetes Nährmedium sogenannte Klone bildeten, d.h.
um die teilungsfähigen Zellen herum bildeten sich Höfe von weiteren lebenden Zellen aus.
Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate enthalten im allgemeinen 0,5 bis 25 x 106 lebende Zellen pro ml, vorzugsweise 1 bis 10 x 106 lebende Zellen pro ml.
Es ist bevorzugt, Embryonalzellen von solchen Säugetierembryonen zu verwenden, die ein Sntwicklungsstadium besitzen, das der Hälfte der üblichen Tragzeit der speziellen Säugetierart bis drei Viertel der üblichen Tragzeit der Säugetierart entspricht. In dem angegebenen Entwicklungsstadium haben die Embryonalzellen die für diese Zellart typische Vermehrung, wobei sie sich nach mehreren Passagen in vitro transformieren und/oder nach einer bestimmten Anzahl von Passagen in vitro aus sterben. Zum Unterscheid von Embryonalzellen vermehren sich Zellen von entsprechenden Organen erwachsener Tiere, also adulten Organen, unter den angegebenen Bedingungen im allgemeinen nicht. Die in den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten enthaltenen Embryonalzellen sind, im Gegensatz zu adulten Zellen oder lyophilisierten Zellen schwache Antigene.
Aus wirtschaftlichen Gründen werden zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate bevorzugt Embryonen solcher Säugeti erart en verwendet, bei denen sich das Muttertier nach der Schlachtung als Frischfleisch weiterverwenden lässt.
Bevorzugte Säugetierembryonen sind daher diejenigen von Wiederkäuern, insbesondere Schafen, Ziegen und Rindern oder die Embryonen von Pferden oder Schweinen.
Min weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Uterus eines trächtigen Säugetieres entfernt, ihn in einem sterilen Behälter unter aseptischen Bedingungen öffnet, den Fötus entnimmt und seziert, die einzelnen Gewebe, Organe, bzw. Drüsen von anhaftenden Gewebsfasern und Körperflüssigkeiten befreit, sie anschliessend zu ganz kleinen Stücken zerteilt, in einzelne Zellen mechanisch zerlegt und diese in einem inerten Medium dispergiert.
Bei diesem Verfahren wird zunächst das Muttertier, dessen hmbryo oder Embryonen für die Herstellung der Präparate vorgesehen sind, so markiert, dass seine Erkennung jederzeit möglich ist. Beispielsweise kann eine derartige Markierung durch entsprechende Zeichen an beiden Ohren vorgenommen werden, falls das Muttertier ein Schaf, eine Ziege, ein Schwein oder ein Rind ist.
Ehe dem trächtigen Muttertier der Uterus entnommen wird, werden ihm Blutproben genommen, um mit Sicherheit die folgenden Krankheiten, bzw. die Anwesenheit der entsprechenden Krankheitserreger auszuschliessen: Bruzellose, die durch Brucella abortus (Bang Bakterien) und Brucella melitensis (Maltafieber) hervorgerufen wird, Salmonellose, die durch Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H., Salmonella enteritidis Gärtner 0, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis 0 und/oder Salmonella abortus ovis H hervorgerufen wird, Ornithose, bzw. Psittakose (Papageienkrankheit), die von grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia hervorgerufen werden, sowie ferner Rickettsiose, Listeriose und Leptospirose. Die Tests auf sämtliche dieser Mikroorganismen oder Krankheiten müssen negativ sein.
Die Säugetierembryonen werden dem Muttertier zu einem Zeitpunkt entnommen, der der Hälfte der üblichen Tragzeit der Säugetierart bis drei Viertel der üblichen Tragzeit der Säugetierart entspricht.
Wenn das fragliche Säugetier ein Schaf ist, vorzugsweise die schwarze Rasse der Juraschafe, dann ist der günstigste Zeitpunkt für die Entnahme der Embryonen dreieinhalb Monate nach der Befruchtung des Tieres.
Zur Entnahme der Embryonen wird dem Muttertier ein Kaiserschnitt gemacht und der Uterus wird mit Hilfe einer speziellen Pinzette abgeklemmt, vom Muttertier entnommen und sofort in einen sterilen Behälter eingebracht.
In einem unter aseptischen Bedingungen gehaltenen Operationssaal wird dann der Uterus geöffnet und die Lappen der Plazenta werden abgetupft.
Anschliessend entnimmt man dem geöffneten Uterus den Fötus oder die Föten und seziert sie.
Zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate können praktisch sämtliche Gewebsteile, Organe, bzw. Düsen des Embryos verwendet werden. Beispiele für verwendbare Embryonalzellen, bzw. Organe, Drüsen und Gewebe des Embryos sind die folgenden: Hirn mit sämtlichen Substrukturen, wie Zwischenhirn, Hirnlappen, Hypothalamus, Thalom, Putamen, Dickdarm, Dünndarm, Zwölffingerdarm, Magen, Leber, Herz, Lunge, Milz, Niere, Mastzellen, Thymus, Auge mit sämtlichen Substrukturen, Lymphknoten, Hypophyse mit sämtlichen Substrukturen, nämlich vordere Hypophyse, mittlere Hypophyse und hintere Hypophyse, Rückenmark, Knochenmark, Muskel, Bauchspeicheldrüse, Nebennieren, und zwar sowohl die Nebennierenrinde als auch das Nebennierenmark, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Arterien, Venen, Knorpel, Mundschleimhaut, Nasenschleimhaut, Nerven, einschliesslich des Sehnervs, Haut, Harnblase, Gallenwege, Epiphyse und Knochengewebe.
Von den männlichen Embryonen können ferner die Hoden, die Prostata und die Sertolizellen verwendet werden und von den weiblichen Embryonen die Eierstöcke und die Placenta.
Wenn das aufgearbeitete Embryonalorgan das Gehirn ist, dann entfernt man sofort die harte Hirnhaut.
Wenn das aufgearbeitete zmbryonalorgan aus dem Verdauungstrakt stammt, dann wird sofort der Mageninhalt, bzw. Darminhalt entfernt.
Wenn man die Placenta des Embryos auf- arbeitet, dann werden die Lappen der Placenta von allen fasrigen Geweben, Schleimstoffen und Venen, von denen sie durchzogen sind, befreit.
Sämtliche entnommenen Organe werden von anhaftenden Gewebsfasern befreit und anhaftende Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, werden durch Waschen mit einer inerten Flüssigkeit entfernt, vorzugsweise durch Waschen mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Zur Durchführung der Waschvorgänge ist eine physiologische Kochsalzlösung, die sogenannte Ringerlösung, speziell vorteilhaft.
Jedes der entnommenen Organe wird dann seziert und mit Spezialinstrumenten in ganz kleine Stücke zerteilt und mechanisch in einzelne Zellen zerlegt. Die so isolierten lebenden, vermehrungsfähigen Embryonalzellen des jeweiligen Säugetierorganes werden dann in einem inerten flüssigen Medium suspendiert.
Ein bevorzugtes inertes flüssiges Medium ist eine physiologische Kochsalzlösung.
Anschliessend filtriert man diese die Embryonalzellen suspendiert enthaltende physiologische Kochsalzlösung um darin vorkommende grössere Teilchen zu entfernen, während die embryonalen Einzelzellen das Filter passieren.
Das so erhaltene Filtrat stellt ein erfindungsgemässes pharmazeutisches Präparat dar, das sofort zur intramuskulären Injektion an die Patienten verabreicht werden kann oder in weiter unten beschriebenen Konservierungsverfahren unterworfen werden kann, um die Haltbarkeit des Produktes zu erhöhen.
Erfindungsgemässe Zellsuspensionen, die aus dem Gehirn oder Gehirnteilen des Embryos, sowie aus Verdauungsorganen des Embryos gewonnen wurden, nämlich aus dem Magen, dem Zwölffingerdarm, dem Dünndarm, dem Dickdarm und dem Pankreas, müssen besonders schnell durch Injektion an den Patienten verabreicht werden oder weiter verarbeitet werden, weil die aus dem Hirn stammenden Zellen bekanntlich besonders schwer züchtbar sind und eine geringe Lebensfähigkeit besitzen und die aus den Verdauungsorganen stammenden Zellen vermutlich infolge der Anwesenheit von Spuren von Enzymen ebenfalls häufig nur eine geringe Lebensfähigkeit aufweisen.
Zu beachten ist ferner, dass die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten direkt injizierbaren pharmazeutischen Präparate, welche die vermehrungsfähigen EmbRyonalzellen von Säugetieren enthalten, noch vor der Verabreichung an den Patienten durch Injektion auf die Anwesenheit von krankheitserregenden Mikroorganismen geprüft werden. Besonders wichtig ist dabei eine Prüfung auf die Abwesenheit der Ornithose, bzw. Psittakose hervorrufenden grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia. Es soll auch auf die Abwesenheit von krankheitserregenden Bakterien getestet werden. Zu diesem Zweck können die in der Literatur beschriebenen Färbeverfahren von Stamm, bzw.
Koster und Gram durchgeführt werden.
Es zeigte sich, dass die in dem erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparat enthaltenen Enbryonalzellen weiter gezüchtet werden können, wenn man sie in ein geeignetes Nährmedium überträgt. Die vermehrungsfähigen Embryonalzellen der jeweiligen Organe bilden dabei um sich Höfe von weiteren Tochter- zellen, die als Klone bezeichnet werden.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate werden daher die in dem inerten flüssigen Medium dispergierten Embryonalzellen der Säugetiere in ein wässriges Nährmedium überführt, wobei der Anteil der teilungsfähigen lebenden Zellen durch Zellvermehrung Klone bildet. Die Zellen werden dann nach einer Züchtungszeit von 3 - 15 Tagen erneut in eine physiologische Kochsalzlösung eingebracht und man erhält so ein sofort injizierbares pharmazeutisches Präparat.
Bei der Weiterzüchtung der lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen in einem Nährmedium ist die Anzahl der Zellen pro ml der fraglichen Suspensionszellkultur ein wesentlicher Parameter. Im allgemeinen soll diese Anzahl 100'000 bis eine Million betragen, der optimale Wert ist jedoch abhängig von dem Zelltyp, also von dem Organ des Embryos, von welchem diese Zellen stammen.
Bei der Weiterzüchtung der Zellen in dem Nährmedium wurden die folgenden Grössen bestimmt: Die Klonierausbeute, d.h. die Anzahl derwenigen Zellen, die innerhalb von fünf Tagen in dem Nährmedium Klone gebildet haben, ausgedrückt in Prozent aller in das Nährmedium eingebrachten Zellen.
Die primäre Teilungseffizienz, d.h. die Anzahl der innerhalb von fünf Tagen in der Kultur gebildeten Klone, ausgedrückt in Prozen der eingesäten tatsächlich lebenden Zellen.
Der dritte bestimmte Parameter war die Anzahl der teilungsfähigen Zellen pro ml, d.h. die Anzahl derjenigen Zellen pro ml der in dem Nährmedium hergestellten Suspension, welche innerhalb von fünf Tagen zur Bildung von Klonen befähigt war.
Bei den hier durchgeführten Tests zeigten Herzzellen, Knochenmarkszellen, Leberzellen, Milzzellen und Thymuszellen besonders hohe Lebendzellanteile, Klonierausbeuten und auch eine gute primäre Teilungseffizienz. Bei diesen genannten Zellen lag der Lebendzellanteil zwischen 93 Prozent und 100 Prozent, die Klonierausbeute lag zwischen 38 Prozent und 70 Prozent und die primäre Teilungseffizienz lag zwischen 40 Prozent und 60 Prozent. Die Anzahl der teilungsfähigen Zellen pro ml lag bei den genannten Zellen im Bereich von 4,2 x 106 Zellen pro ml bis 77 x 106 Zellen pro ml.
Auch die Zellsuspensionen, die unter Verwendung von Hypothalamuszellen, Lungenzellen, Nierenzellen, Placentazellen, Schilddrüsenzellen und Hodenzellen hergestellt wurden, zeigten Lebendzellenanteile im Bereich von 46 96 bis 79 96, Klonierausbeuten im Bereich von 13 96 bis 27 % (ausgenommen die Hypothalamuszellen, deren Klonierausbeute schlechter war) und auch eine entsprechend gute primäre Teilungseffizienz.
Bei den Zellen aus dem Magen/Darmtrakt ist die Haltbarkeit der Zellen nach ihrer Aufarbeitung wesentlich schlechter, weil offenbar Spuren an zurUckgebliebenen Verdauungsenzamen zerstörend auf die Zellen einwirken. Auch bei den Zellen, die von Hirnteilen stammen, war die Vermehrungsfähigkeit gering.
Es ist jedoch für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, dass Hirnzellen schlechte Vermehrungsfähigkeiten ausserhalb ihres Gewebeverbandes besitzen.
Die durchgeführten Tests zeigten ferner, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, die vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren in einer physiologischen Kochsalzlösung enthalten, mehr als zehn Tage lang bei 40 C gelagert werden können und dann immer noch hohe Anteile an lebenden vermehrungsfähigen Zellen darin enthalten sind. Die einzigen Ausnahmen stellen Präparate dar, bei denen die Embryonalzellen aus dem Magen/Darmtrakt oder aus dem Gehirn oder Gehirnteilen stammen.
Die Lagerfähigkeit der erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparate lässt sich jedoch durch Tiefgefrieren noch weiter verlängern. Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate wird zunächst ein sofort injizierbares Präparat hergestellt, welches die lebenden Säugetierzellen in einer physiologischen Kochsalzlösung enthält und zu diesem Präparat wird dann eine Substanz zugesetzt, die das Wachsen grosser Eiskristalle verhindert, beispielsweise ein mehrwertiger Alkohol, wie Glyzerin, und anschliessend wird dann die Zellsuspension tiefgefroren, sodass man ein tiefgefrorenes pharmazeutisches Präparat erhält, das in tiefgefrorenem Zustand bis unmittelbar vor dessen Verwendung aufbewahrt wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zur Bestimmung der pharmazeutischen Wirksamkeit eines erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates. Bei diesem Verfahren muss man von einer Zellsuspension ausgehen, welche die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen dispergiert in einem inerten flüssigen Medium enthält.
Dementsprechend führt man diesen Test entweder mit einem erfindungsgemässen injizierbaren pharmazeutischen Präparat aus oder man geht von einem erfindungsgemässen tiefgefrorenen pharmazeutischen Präparat aus, das zunächst aufgetaut wird, wobei ebenfalls ein injizierbares Präparat erhalten wird, welches die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen in einem inerten flüssigen Medium dispergiert enthält. Anschliessend wird diese Zellsuspension zu einer Monolayerkultur von Säugerzellen einer anderen Säugerart, die geschädigt wurden, gegeben, wobei einerseits eine merkliche Vermehrung, andererseits eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen die zellregenerierende Wirksamkeit der Embryonalzellen anzeigt. Als teilungsfähige lebende Embryonalzellen können bei diesem Testverfahren beispielsweise die entsprechenden Embryonalzellen verwendet werden, die von Embryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes stammen. Die Monolayerkultur der adulten Säugerzellen kann von irgendwelchen anderen Säugern stammen, die mit den Säugetieren, aus deren Embryonen das pharmazeutische Präparat hergestellt wurde, in keiner Weise verwandt sind.
Die erfindungsgemässen lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparate sind insbesondere zur Frischzellenbe- handlung bei menschlichen Patienten vorgesehen. Aus diesem Grunde wird beim erfindungsgemässen Verfahren die stimulierende Wirkung des lebende Embryonalzellen enthaltenden Präparates insbesondere auf solche geschädigte adulte Zellen geprüft, die vom Menschen oder einer dem Menschen relativ nahe verwandten Säugetierrasse stammen. Bei den meisten dieser Tests wurden daher als geschädigte adulte Säugerzellen geschädigte menschliche Epithelzellen oder geschädigte Affennierenzellen verwendet.
Bei einem der erfindungsgemässen Tests wurden Affennierenzellen in einem Nährmedium gezüchtet, wobei alle Kulturen bis zu Zellzahlen von 22'000 bis 28'000 Zellen angezogen wurden. Anschliessend wurde in einer Gruppe der Zellen der Serumgehalt des Nährmediums von 5 , auf 1 , gesenkt, wodurch eine deutliche Schädigung der Zellen eintrat. Dies zeigte sich darin, dass bei denjenigen Gruppen, in denen der Serumgehalt des Nährmediums nicht gesenkt wurde, die adulten Nierenzellen bis zum 12. Tag ein kontinuierliches Anwachsen von 24'000 Zellen pro Kultur auf 630'000 Zellen, bzw. 660'000 Zellen aufwiesen.
Im Gegensatz dazu zeigte sich bei denjenigen Gruppen, wo die adulten Zellen durch Senkung des Serumgehaltes geschädigt wurden, bis zum 12. Tag der Züchtung ein Anstieg der Zellzahl pro Kultur von 24'000 auf 6C'000, bzw. auf 160'000.
Zu den Proben mit geschädigten adulten Affennierenzellen wurden dann erfindungsgemässe lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltende pharmazeutische Präparate zugesetzt. Nach der Zugabe dieser lebenden Embryonalzellen trat sowohl eine starke Zellvermehrung als auch eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der adulten Nierenzellen auf und es wurden drei bis sechs Tage nach der Zugabe der lebenden Embryonalzellen Zellzahlen von 400'000 bis 1'500'000 Zellen pro Kultur festgestellt.
Besonders überraschend bei der Durchführung dieser Versuche war es, dass eine Organunabhängigkeit zwischen den im zu testenden Präparat enthaltenen Embryonalzellen und den künstlich geschädigten adulten Säugerzellen der anderen Säugerart festgestellt wurde.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Testverfahrens können also die in dem zu testenden pharmazeutischen Präparat enthaltenen lebenden Embryonalzellen von einem andern Organ, Gewebe oder Drüse als die künstlich geschädigten adulten Säugetierzellen der anderen Säugerart stammen.
Bei den durchgeführten Versuchen zeigte es sich beispielsweise, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, welche lebende vermehrungsfähige Leberzellen, bzw. Herzzellen, bzw. Nierenzellen der Embryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes enthalten, in annähernd gleicher Weise die Regeneration von adulten geschädigten Nierenzellen der Affennieren fördern. Die gleichen Ergebnisse wurden auch bezüglich der Regeneration von geschädigten adulten Herzzellen von Affen festgestellt.
Analoge Versuche wurden auch mit adulten menschlichen Epithelzellen durchgeführt. Die Epithelzellen wurden in Monolayer-Kulturen gezogen und durch Erniedrigung des Serumgehaltes des Nährmediums geschädigt. Zu Vergleichszwecken wurden in anderen Proben die menschlichen Epithelzellen ohne Schädigung weitergezüchtet.
Durch eine intramuskuläre Injektion von gereinigtem a-Actinin in lebende Kaninchen wurden in den Tieren Antiactin-Antikörper gebildet und diese aus dem Blut der Kaninchen isoliert und mit Fluorescein-isothiocyanate (FITC) markiert.
Die gesunden nicht geschädigten menschlichen Epithelzellen werden durch den genannten fluoreszierenden Antikörper markiert. Die geschädigten menschlichen Epithelzellen besitzen offensichtlich in ihrer Zellmembran kein verankertes Actin, sodass der fluoreszierende Antiactin-Antikörper nicht an der Zellmembran gebunden wird. Auch durch ihre amorphe Struktur unterscheiden sich die geschädigten Zellen von den faserförmig gestalteten ungeschädigten menschlichen Spithelzellen. Durch die Zugabe von erfindungsgemässen phermazeutischen Präparaten, die lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthalten, beispielsweise embryonale Nierenzellen der schwarzen Rasse des Juraschafes, konnten die geschädigten menschlichen Spithelzellen wieder regeneriert werden, d.h. sie nahmen die ursprüngliche Grösse und Form der ungeschädigten Zellen an und sie waren auch wieder in der Lage, den fluoreszierenden Antiactin-Antikörper in der Zellmembran aufzunehmen. Dies deutet darauf hin, dass die Zellmembran wieder Actin auf ihr, bzw. in ihr, verankert hatte.
Weitere Tests wurden mit dem Serum von Patienten durchgeführt, und zwar wurde den Patienten vor der Verabreichung der erfindungsgemässen lebende, vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden Präparate Blut entnommen und das Serum aus diesen Blutproben gewonnen. Am vierten Tag, bzw. am elften Tag, nach der Verabreichung der erfindungsgemässen lebende, vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden Präparate durch Injektion wurde den Patienten wiederum Blut entnommen und das Blutserum weiter untersucht.
Die menschlichen Seren wurden sowohl mit adulten Nierenzellen als auch mit embryonalen Nierenzellen in entsprechenden Monolayerkulturen zusammengebracht.
Diese Versuche zeigten, dass in dem Serum der Patienten auch elf Tage nach der Frischzelleninjektion keine zytotoxischen Substanzen vorlagen. Bei der Behandlung der Monokulturen, die embryonale noch nicht differenzierte Zellen enthielten, zeigte das menschliche Serum, das vier Tage nach der Frischzelleninjektion gewonnen wurde, eine leichte Erhöhung der Zellenzahl im Vergleich zu entsprechenden Kulturen von Embryonalzellen, die mit dem Serum des gleichen Patienten vor der Frischzellenbehandlung in Berührung gebracht wurden.
Eine noch stärkere Zunahme der Embryonalzellen wurde festgestellt, wenn diese mit dem Serum des menschlichen Patienten behandelt wurden, das elf Tage nach der Verabreichung der Frischzelleninjektion gewonnen wurde.
Diese Versuchsergebnisse deuten darauf hin, dass während eines längeren Zeitraumes nach der Frischzelleninjektion im menschlichen Serum Faktoren vorhanden sind, die eine zellwachstumsfördernde Wirkung zeigen. Diese Faktoren sind bis jetzt noch nicht näher untersucht worden und werden in der Folge als "Stimuline" bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Testverfahren zur Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum von erwachsenen Säugern, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Serum der Säuger zur Monolayerkultur von adulten Säugerzellen der gleichen Säugerart oder einer anderen Säugerart, die vorher geschädigt wurden, gibt, wobei eine merkliche Vermehrung und/oder eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen, die Anwesenheit von zellregenerierenden Faktoren im getesteten Serum anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsart dieses Testverfahrens wird das Serum von erwachsenen menschlichen Patienten getestet. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann man feststellen, ob ein Patient, dem ein erfindungsgemässes lebende, vermehrungsfahige Embryonalzellen von Säugetieren enthaltendes pharmazeutisches Präparat durch Injektion verabreicht wurde, auf diese Therapie positiv anspricht oder nicht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart wird daher dieses Testverfahren so durchgeführt, dass das Serum von erwachsenen menschlichen Patienten getestet wird, um das Ansprechen des menschlichen Patienten auf eine Injektion von lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen inerten Medium zu überprüfen, indem man sowohl vor der Injektion der Embryonalzellen als auch mindestens eine Woche nach der Injektion von Embryonalzellen dem menschlichen Patienten Blut entnimmt und das Serum jeder der beiden Blutproben zu einer Monolayerkultur von adulten Säugerzellen, die vorher geschädigt wurden, gibt, wobei eine deutliche stärkere Vermehrung und/oder ein höheres Ausmass der Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen in der zweiten Serumprobe im Vergleich zur ersten Serumprobe die Bildung von zellregenerierenden Faktoren im Serum und damit das positive Ansprechen des Patienten auf die Injektion von frischen Embryonalzellen anzeigt.
Bei einer Ausführungsart dieses Tests wurden 20'000 adulte Affennierenzellen in Zellkulturflaschen in einem optimalen Medium bei 370 C gezUchtet. Dieses Medium enthielt 5 96 an fötalem Kälberserum.
Die Anzuchtphase betrug sechs Tage, und anschliessend hatten die einzelnen Kulturen Zellzahlen von 300'000 bis 380'000 erreicht.
Zu Vergleichszwecken wurde eine der Zellkulturen ohne Schädigung in dem 5 ,b fötales Kälberserum enthaltenden Nährmedium während 12 Tagen weitergezüchtet, wobei zu diesem Zeitpunkt dann die fragliche Kultur 2i100?000 Zellen enthielt.
Die restlichen Gruppen an Zellkulturen wurden nach dem sechsten Tag geschädigt, indem man auf ein Medium wechselte, das nur 1 % an fötalem Kälberserum enthielt. 12 Tage nach der Schädigung waren in diesen Proben geringfügige Unterschiede in den Zellzahlen festzustellen, und zwar enthielten die Proben 260'000 Zellen pro Kultur bis 320'000 Zellen pro Kultur.
Menschlichen Patienten wurde unmittelbar vor der Injektion der erfindungsgemässen, lebende ver- mehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthaltenden Präparate Serum entnommen. Wenn man dieses Serum den Zellkulturen mit den geschädigten Affennierenzellen in einer Menge von 2,5 Vol.-Sd, bezogen auf das gesamte Medium zusetzte, und anschliessend sechs Tage lang weiterbrütete, dann trat ein geringfügiger Anstieg der Zellzahlen pro Kultur auf, d.h.
es wurden Zellzahlen erreicht, die im Bereiche von 510'000 bis 630'000 Zellen pro Kultur lagen.
Elf Tage nach der Injektion der erfindungsgemässen Präparate wurde den gleichen Patienten wieder Blut entnommen und das daraus gewonnene Serum getestet. Die Herstellung der Kulturen mit den geschädigten Affennierenzellen erfolgte in der gleichen Weise wie oben beschrieben und die geschädigten Kulturen enthielten 12 Tage nach der Schädigung 260'000 bis 320'000 Zellen pro Kultur.
Sechs Tage nach der Zugabe des Serums, das elf Tage nach der Frischzellentherapie gewonnen wurde, zeigte es sich, dass die Zellzahlen in den geschädigten Kulturen auf 900'000 bis 1'700'000 angestiegen waren.
Bin analoger Test wurde mit dem Serum eines Patienten vor der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates und vier Tage nach der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparages vorgenommen. In diesem Falle zeigte sich überraschenderweise nur eine geringfügige Vermehrung der geschädigten Zellen, bzw. nur eine geringfügige Wiederherstellung der gestörtan Morphologie. Aus diesen Testresultaten sieht man, dass unmittelbar nach der Verabreichung des erfindungsge- mässen Präparates durch Injektion im Serum des behandelten Patienten noch keine oder nur geringfügige Mengen an zellregenerierenden Faktoren anzutreffen sind.
Beginnend etwa mit einer Woche nach der Injektion bilden sich offensichtlich bei den behandelten Patienten ständig grösser werdende Mengen an zellregenerierenden Faktoren. Diese zellregenerierenden Faktoren können nicht von den injizierten lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen stammen, weil ja die Menge an injiziertem pharmazeutischem Präparat im Vergleich zum Körpergewicht des behandelten Patienten überaus gering ist und bei dieser extremen Verdünnung daher zellregenerierende Faktoren, die direkt von den injizierten Embryonalzellen stammen, nicht mehr nachweisbar wären. Ausserdem müssten zellregenerierende Faktoren, die von den injizierten Embryonalzellen selbst stammen, kurze Zeit nach der Injektion bereits im Serum des Patienten vorhanden sein.
es kann eher angenommen werden, dass durch die Injektion der lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen irgendwo im Körper des behandelten Patienten die Bildung von zellregenerierenden Faktoren ausgelöst wird. Diese zellregenerierenden Faktoren werden offensichtlich mit dem Blutserum weitertransportiert und können so ihre zellregenerierende Wirkung an geschädigten Organen des Patienten ausüben.
Bei Patienten, die altersbedingte Gehirnstörungen aufwiesen, wurde festgestellt, dass einige Zeit nach der Verabreichung der erfindungsgemässen, lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden Präparate durch Injektion eine deutliche Besserung der Störungen auftrat. Hochmolekulare Substanzen und natürlich auch lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen können bekanntlich die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden. Es ist also ausgeschlossen, dass die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen direkt regenerierend auf die Gehirnzellen des Patienten einwirken.
Basierend auf der Theorie, dass die Insektion der lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen irgendwo im Körper des Patienten die Produktion von zellwachstumsfördernden Faktoren nach einem sogenannten Kaskadenmechanismus auslöst, kann auch das Phänomen der Besserung von Hirnstörungen erklärt werden. Im Gegensatz zu hochmolekularen Substanzen sind offensichtlich die vom Körper des Patienten selbst gebildeten zellregenerierenden Faktoren in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren und dann im Gehirn selbst ihre zellregenerierende Wirkung auszuüben.
Die Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung eines injizierbaren pharmazeutischen Präparates, das lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen der schwarzen Rasse des Juraschafes enthält.
Vor ihrer Insemination werden die vorgesehenen Muttertiere durch zwei Markierungen an ihren Ohren so gekennzeichnet, dass jedes dieser Tiere in der Herde sofort identifiziert werden kann.
Dies ist deshalb nötig, weil die Embryonen dem Muttertier vor dem Ende der Tragzeit entnommen werden müssen, und zwar jedem Muttertier dreieinhalb Monate nach seiner Befruchtung.
Unmittelbar bevor dem Muttertier die Embryonen entnommen werden, werden dem Muttertier Blutproben entnommen um festzustellen, ob das Tier an einer der folgenden Krankheiten leidet, bzw. die folgenden Krankheitserreger in seinem Blute feststellbar sind: Bruzellose, die durch Brucella abortus (Bang Bakterien) und Brucella melitensis (Maltafieber) hervorgerufen wird, Salmonellose, die durch Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis H hervorgerufen wird, Ornithose, bzw. Psittakose (Papageienkrankheit), die von grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia hervorgerufen werden, sowie ferner Rickettsiose, Listeriose und Leptospirose.
Die entsprechenden Testverfahren sind in der Literatur beschrieben und sie werden in Ublicher Weise durchgeführt. Nur dann, wenn die Tests auf sämtliche dieser Mikroorganismen oder Krankheiten negativ sind, werden dem Tier die Embryonen entnommen.
Kranke Tiere hingegen werden einem entsprechenden Heilverfahren unterzogen und man lässt sie ihre Jungen gebären und aufziehen.
Die Embryonen werden dem Muttertier entnommen, indem man bei dem Muttertier einen Kaiserschnitt vornimmt, den Uterus mit einer speziellen Pinzette abklemmt und ihn anschliessend vom Muttertier entnimmt und sofort in einen sterilen Behälter einbringt.
Unter vollkommen aseptischen Bedingungen, nämlich in einem Operationssaal, wird der Uterus geöffnet und die Lappen der Placenta werden abgetupft. Anschliessend entnimmt man den Fötos oder die Föten aus ihren Fruchtblasen und seziert sie.
Praktisch jedes Organ, jedes Gewebe und jede Drüse des Embryos kann zur Herstellung der lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparate herangezogen werden. Als Beispiele für verwendbare Gewebe, Organe oder Düsen seien die folgenden genannt: Leber, Herz, Nieren, Nebennieren, Milz, Knochenmark, Hypothalamus, Hypophyse, Lunge, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Thymusdrüse, Gehirn, Arterien, Magen, Zwölffingerdarm, Dünndarm, Dickdarm, Pankreas, Bindegewebe, Augen, Placenta, Hoden und viele weitere Organe, Düsen und Gewebe.
Einige der Organe des Embryos müssen einer Spezialbehandlung unterworfen werden, und zwar die folgenden: Bei der Aufarbeitung der Placenta des Embryos werden die Lappen der Placenta von allen fasrigen Geweben, Schleimstoffen und Venen, von denen sie durchzogen sind, befreit.
Bei der Aufarbeitung des Magens des Embryos wird die Magenflüssigkeit sofort entfernt.
Auch bei der Aufarbeitung von Dickdarm, Dünndarm, Zwölffingerdarm und Pankreas wird der Darminhalt, bzw.
der Drüseninhalt sofort entfernt.
Bei der Aufarbeitung des Gehirns entfernt man sofort die harten Hirnhäute.
Sämtliche entnommenen Gewebe werden sofort mit physiologischer Kochsalzlösung, nämlich der sogenannten Ringer-Lösung gewaschen, um sie von anhaftenden Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, zu befreien. Es werden von den entsprechenden Organen anhaftende Gewebsfasern und andere nicht zum Organ gehörende Materialien, wie zum Beispiel Schleimstoffe und ähnliches entfernt, damit diese organfremden Zellen nicht in das aus dem einzelnen Organ hergestellte pharmazeutische Präparat gelangen.
Jedes der einzelnen Organe, Gewebe oder Drüsen wird dann seziert und mit Spezialinstrumenten in ganz kleine Stücke zerteilt und diese werden mechanisch in einzelne Zellen zerlegt. Anschliessend werden diese einzelnen Zellen in der nötigen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung, nämlich der sogenannten Ringer-Lösung suspendiert. Wie in der Folge noch erläutert werden wird, ist die optimale Anzahl an Zellen, die pro ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert wird, vom einzelnen Organ, Gewebe oder der Drüse abhängig.
Die Suspension der einzelnen Embryonalzellen in der physiologischen Kochsalzlösung wird dann filtriert, um darin vorkommende Teilchen, die grösser sind als Einzelzellen, zu entfernen, während die Einzelzellen das Filter passieren und in das Filtrat gelangen.
Das so erhaltene Filtrat stellt das direkt injizierbare pharmazeutische Präparat dar, das durch intramuskuläre Injektion an den Patienten verabreicht werden kann. Unmittelbar vor der Verabreichung der Injektion wird jedoch das pharmazeutische Präparat, das die lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen eines bestimmten Organes, Gewebes oder einer Drüse des schwarzen Juraschafes suspendiert in der physiologischen Kochsalzlösung enthält, darauf geprüft, ob irgendwelche Zellen vorhanden sind, die nicht vom Embryo sondern von den Placentalappen des Muttertieres stammen. Dann wird unmittelbar vor der Injektion, vorzugsweise in einem Laboratorium, direkt beim Operationssaal, geprüft, ob in dem injizierbaren pharmazeutischen Präparat irgendwelche krankheitserregenden Mikroorganismen anwesend sind. Besonders wichtig ist dabei die Prüfung auf die grossen Viren mit der Bezeichnung Chlamydia, die die Vogelseuchen mit der Bezeichnung Ornithosen hervorrufen. Die entsprechende Ornithose wird bei Papageien Papageienkrankheit oder Psittakose genannt. Ferner werden die injizierbaren Präparate vor ihrer Injektion auch auf die Abwesenheit von krankheitserregenden Bakterien getestet. Zu diesem Zweck können die in der Literatur beschriebenen Färbeverfahren von Stamm, bzw. Koster und Gram durchgeführt werden. Wenn alle diese Tests negativ sind, dann wird das injizierbare Präparat sofort verabreicht.
Aus dem nachfolgenden Beispiel 2 ist ersichtlich, dass zmbryonalzellen, die aus dem Gehirn oder Gehirnteilen stammen, wie zum Beispiel verlängertes Mark (medulla oblongata), Hypothalamus und Stirnlappen des Gehirns, in physiologischer Kochsalzlösung nur kurze Zeit überleben und auch in Zellkul- turen schlechte Vermehrungschancen haben. Dies ist nicht überraschen1,weil für den Fachmann auf dem Gebiet der Zellkulturen bekannt ist, dass aus dem Gehirn stammende Zellen ausserordentlich schwer ausserhalb des Gewebeverbandes isoliert zu züchten sind.
In der Praxis muss also beachtet werden, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, bei denen die vermehrungsfähigen Embryonalzellen aus dem Gehirn oder Gehirnteilen des Embryos stammen, sofort durch Injektion an den Patienten verabreicht werden.
Wie aus dem nachfolgenden Beispiel 2 ferner ersichtlich ist, haben auch solche erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate, deren lebende Embryonalzellen aus dem Magen-Darmtrakt des Embryos stammen, häufig nur eine geringe Lagerfähigkeit, d.h.
in ihnen nimmt der Anteil an lebenden Embryonalzellen bisweilen rasch ab. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, dass in derartige Zellsuspensionen manchmal trotz sorgfältiger Reinigung doch noch Verdauungsenzyme des Magen-Darmtraktes gelangen. Diese Verdauungsenzyme wirken zerstörend auf die isolierten Zellen.
Aus diesem Grunde muss man beachten, dass erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate, die pmbryonalzellen aus dem Magen-Darmtrakt enthalten, möglichst rasch durch Injektion an den Patienten verabreicht werden.
Die aus anderen Organen als dem Magen-Darmtrakt und dem Gehirn stammenden Zellen sind jedoch bei Aufbewahrung bei einer Temperatur.von 40 C gut lagerfähig und sie können ferner auch in entsprechenden Nährmedien mit Erfolg weitergezüchtet werden.
Beispiel 2 Weiterzüchtung der lebenden Embrvonalzellen in einem Nährmedium Als Nährmedium wurde das "Minimum essential medium Eagle with earth salt" verwendet, das in der Folge mit MEM abgekürzt wird. Dieses Medium ist in der Veröffentlichung von H. Eagle, in "Science", Heft 30, Seite 342, 1959, beschrieben. Zur Anzucht der Zellen wurde ein Medium bestehend aus 90 Vol.-% MGM plus 10 Vol.-% fötales Kälberserum verwendet.
Bei der Weiterzüchtung von lebenden vermehrungsfähigen Embryonalzellen in Nährmedien ist die Anzahl der Zellen pro ml der fraglichen Suspensionskultur ein wesentlicher Parameter. Die für die Weiterzüchtung optimale Anzahl hängt von dem Organ des Embryos ab, von welchem die Zellen stammen. Im allgemeinen sollen die Zellen in dem Medium zur WeiterzUchtung in einer Menge von 100'000 Zellen pro ml bis l'OOO'O00 Zellen pro ml vorliegen.
In den nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellten Zellsuspensionen wurden bei entsprechender Verdünnung die Zellen gezählt. Anschliessend wurde eine solche Menge der Zellsuspension in 250 ml fassende Kulturflaschen, die das Nährmedium enthielten, eingesät, sodass pro cm2 Oberfläche des Nährmediums 2,3 x 103 Zellen eingebracht wurden. Die Kulturflaschen enthielten 20 ml an Nährmedium. Zum Beginn der Züchtung betrug die Zellkonzentration in dem Nährmedium 1d Zellen pro ml.
Die Zellen wurden unter optimalen Be- dingungen bei 370 C 24 Stunden lang gezüchtet. Anschliessend wurde mit 50 ml Medium aufgefüllt und die Kulturen weitere vier Tage lang unter den optimalen Bedingungen inkubiert. Anschliessend wurden die Höfe mikroskopisch ausgezählt, die sich um die vermehrungsfähigen Zellen gebildet haben. Diese werden als Klone bezeichnet.
Sowohl in der zur Weiterzüchtung verwendeten frischen Zellsuspension als auch nach dem Züchtungsverfahren wurden die lebenden Zellen und die toten Zellen gezählt. Hiezu verwendete man eine Anfärbung mit Trypanblau, bzw. Methylrot in physiologischem Medium. Trypanblau färbt tote Zellen blau, während lebende Zellen farblos bleiben. Im Gegensatz dazu wird Methylrot von lebenden Zellen aufgenommen und diese werden dadurch gefärbt, während tote Zellen ungefärbt bleiben.
Vor der Färbung wurden jeweils 0,2 kl der Originalsuspension entnommen, entsprechend mit physiologischem Medium verdünnt und dann gefärbt. Die Auszählung erfolgte in einer Fuchs-Rosenberg-ZBhlkammer. Aus den ausgezählten Werten wurden die Anzahl an lebenden Zellen und toten Zellen in der ursprünglichen Suspension berechnet. Es wurden die folgenden Werte bestimmt: 1. Gesamtzahl der Zellen pro ml, also die Anzahl der lebenden und toten Zellen pro ml in der Originalsuspension. Zellbruchstücke wurden nicht gezählt.
2. Die Anzahl der toten durch Trypenblau angefärbten Zellen pro ml der Originalsuspension.
3. Die Anzahl der lebenden, durch Methyl- rot gefärbten Zellen pro ml der Originalsuspension.
Dabei zeigte sich nach mehreren Messungen, dass die Summe aus den durch Trypenblau gefärbten Zellen und Methylrot gefärbten Zellen sehr gut mit der Gesamtzahl der Zellen übereinstimmt. Aus diesem Grunde wurde bei weiteren Arbeiten nurmehr eine Färbung mit Trypanblau vorgenommen. Die durch Trypanblau gefärbten Zellen wurden von der Gesamtzahl der Zellen abgezogen, sodass man so die Anzahl der lebenden Zellen erhielt.
4. Berechnet wurde ferner der Anteil an lebenden Zellen, also der Lebendzellenanteil, ausgedrückt in Prozent der Gesamtzellzahl.
Nach dem Züchtungsverfahren wurden ferner die folgenden Grössen bestimmt: A) Die Konierausbeute, also die Anzahl der innerhalb der Züchtungsperiode von insgesamt fünf Tagen in einer Kultur gebildeten Klone, ausgedrückt in Prozent aller eingesäten Zellen.
B) Die primäre Teilungseffizienz, nämlich die Anzahl der innerhalb der insgesamt fünf Tage dauernden Züchtung in einer Kultur gebildeten Klone, ausgedrückt in Prozent der eingesäten lebenden Zellen.
C) Die Anzahl der teilungsfähigen Zellen pro ml, also die Anzahl der Zellen pro ml Originalsuspension, welche innerhalb der fünf Tage dauernden Züchtung zur Bildung von Klonen befähigt waren.
Die für die einzelnen Zellarten gewonnenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt. In der Tabelle werden für die einzelnen Spalten die folgenden Abkürzungen verwendet: GZZ = Gesamtzahl an Zellen pro ml x 106 TZA = Totzellenanteil, also Anzahl der toten Zellen pro ml x 106 LZA = Lebendzellenanteil, also Anteil der lebenden Zellen, ausgedrückt in Prozent der Gesamtzahl der Zellen KA = Klonierausbeute, also Anzahl der gebildeten Klone in Prozent aller eingesäten Zellen PTE = Primäre Teilungseffizienz, Anzahl der Klone in Prozent der eingesäten lebenden Zellen GZZxKA = Anzahl teilungsfähiger Zellen pro ml x 106, also die Menge der Zellen pro ml, welche Klone gebildet haben.

Tabelle I (1. Teil)

Zelltyp GZZ TZA LZA KA PTE GZZxKA

verlängertes

Mark

(viele Debris) 14 # 4 4 # 1 71 % <1% <1.5% <0.21

Herz

(starke Aggreg.) 7 # 2 - 100 % 60 % 60 % 4.2

Hypothalamus 3 # 1 1 # 0.2 67 % <1 % <1.5 % <0.05

Knochenmark 45 # 7 1 98 % 46 % 47 % 20.7

Leber 110 # 4 8 # 1 93 % 45 % 48 % 49.5

Stirnlappen

des Gehirns 8 # 3 5 # 2 37 % <1 % <3 % <0.24

Lunge 43 # 2 14 # 4 67 % 13 % 19 % 8.2

Magen/Darm 22 # 6 20 # 5 9 % 1 % 10 % 2.2

Magen/Darm 9 # 2 3 # 0.6 67 % 4 % 6 % 0.54

Milz 50 # 7 3 # 1 94 % 38 % 40 % 19

Tabelle I (2. Teil)

Zelltyp GZZ TZA LZA KA PTE GZZxKA

Nebenniere 5 # 1 3 # 1 40 % 22 % 55 % 2.8

Nebenniere 0.7 # 0.3 0.6 # 0.1 14 % 8 % 57 % 0.4

Niere 14 # 1 3 # 1 79 % 20 % 25 % 2.8

Placenta 24 # 4 13 # 2 46 % 27 % 59 % 14.2

Placenta

"normale Konz." 17 # 11 16 # 11 6 % 4 % 67 % 0.68

Placenta

"hohe Konz." 66 # 6 36 # 3 45 % 29 % 64 % 19.1

Placenta

"sehr hohe Konz." 473 # 15 170 # 16 64 % 43 % 67 % 203.4

Schilddrüse 23 # 4 16 # 3 30 % 11 % 37 % 2.5

Schilssrüse

"normale Konz." 1.8 # 0.5 0.6 # 0.2 67 % 25 % 37 % 0.5

Tabelle I (3. Teil)

Zelltyp GZZ TZA LZA KA PTE GZZxKa

Schilddrüse

"hohe Konz." 4 # 2 2 # 0.6 50 % 17 % 34 % 0.7

Hoden 23 # 3 9 # 2 61 % 24 % 39 % 5.5

Thymus 3.2.83

"frisch" 110 # 11 - 100 % 70 % 70 % 77

Thymus 3.2.83

6 Std. RT 91 # 4 13 # 1 86 % - - -

Man sieht aus dieser Tabelle, dass frische Thymuszellen, Herzzellen, Knochenmarkzellen, Leberzellen und Milzzellen Lebendzellenanteile von über 90 96, bezogen auf die Gesamtanzahl der Zellen, aufweisen. Relativ gering ist der Lebendzellenanteil bei Gehirnteilen (Stirnlappen) und sehr stark von der Aufarbeitung abhängig bei Zellen aus dem Magen-Darmtrakt.

Die Präparate, die Placentazellen enthalten und Schilddrüsenzellen enthalten, zeigen, dass der Lebendzellenanteil stark von der angewandten Konzentration abhängig ist.
Bei Lagerung der Thymuszellen während sechs Stunden bei Raumtemperatur nimmt der Lebendzellenanteil deutlich ab, was auf die zu hohe Lagerungstemperatur zurückzuführen ist. Werden nämlich die gemäss Beispiel 1 hergestellten Zellsuspensionen unter sterilen Bedingungen in der physiologischen Kochsalzlösung bei 4° C während einer Woche gelagert, dann zeigen einige Organzellen der Embryonen noch immer erstaunlich hohe Lebendzellenanteile.
Tabelle II Zelltyp Lebendzellenanteil nach einer Woche Lagerung Thymus 70,' Milz 96 % Knochenmark 94 % Leber 90 % Schilddrüse 60 , Es ist möglich, aus den im Nährmedium befindlichen, während fünf Tagen weitergezüchteten Embryonalzellen ein injizierbares pharmazeutisches Präparat herzustellen. Zu diesem Zwecke werden die Embryonalzellen aus dem Nährmedium isoliert, beispielsweise indem man sie abzentrifugiert.
Anschliessend werden dann die lebenden Embryonalzellen erneut in einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung dispergiert, wobei man ein entsprechendes injizierbares pharmazeutisches Präparat erhält.
Beispiel 3 Herstellung eines tiefgefrorenen lebende Embrvonalzellen enthaltenden pharmazeutischen Präparates Die nach Beispiel 1 hergestellten injizierbaren pharmazeutischen Präparate sind, wie bereits erwahnt wurde, dann, wenn die Embryonalzellen aus anderen Organen als dem Magen-Darmtrakt und dem Gehirn stammen, bei einer Aufbewahrung bei 40 C ohne weiteres eine Woche oder etwas länger lagerfähig.
Es zeigte sich jedoch, dass die in der physiologischen Kochsalzlösung dispergierten lebenden Embryonalzellen dann, wenn sie von anderen Organen stammen als dem Gehirn und dem Magen-Darmtrakt, noch länger lagerbar sind, indem man die Zellsuspension tiefgefriert.
Vor dem Tiefgefrieren werden der physiologischen Kochsalzlösung ein oder mehrere in injizierbaren Lösungen zulässige Stoffe beigegeben, die die Ausbildung grosser Eiskristalle verhindern. Der- artige Zusätze sind für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und als Beispiel hiefür sei Glyzerin genannt, das im allgemeinen in einer Menge von 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zellsuspension, beigegeben wird.
Mine Zellsuspension in der physiologischen Kochsalzlösung, die Herzzellen enthielt, wurde unter Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen nit 17 Gew.-% Glyzerin, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension versetzt. Dann wurde die Suspension unter sterilen Bedingungen in Ampullen abgefüllt und tiefgefroren und bei einer Temperatur von etwa -120° C bis etwa -180° C aufbewahrt.
Nach eineinhalb Monaten Lagerungszeit wurde die Probe aufgetaut, nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren verdttnnt, mit Trypanblau gefärbt und ausgezählt. Es zeigte sich, dass die Probe einen Lebendzellenanteil von 92 % besass.
Beispiel 4 Regenerierung von geschädigten adulten Affennierenzellen durch Embryonalzellen enthaltende Präparate Adulte Affennierenzellen wurden in Monolayerkulturen zu 80 % Konfluenz gezogen und mit Trypsin suspendiert.
Als optimales Medium zur Weiterzüchtung der adulten Affennierenzellen wurde wieder das im Beispiel 2 beschriebene MEM-MEDIUM verwendet, jedoch wurde in diesem Fall ein Medium aus 95 Vol-% MEM plus 5 Vol- fötalem Kälberserum zur Weiterzüchtung der adulten Affennierenzellen verwendet.
Dieses optimale Zuchtmedium befand sich in 75 ml Kulturflaschen, und zwar enthielt jede Kulturflasche 10 ml an Medium. Pro Kulturflasche wurden 20'000 adulte Affennierenzellen eingesät und die Kulturen randomisiert. Die Kulturen wurden bis zum vierten Tag unter gleichen Bedingungen weitergezüchtet.
Am vierten Tag wurde in allen Kulturen das Medium gewechselt und die Kulturen wurden in die folgenden fünf Gruppen aufgeteilt: Bei den Gruppen 1, 2 und 5 wurde am vierten Tag auf ein Medium gewechselt, das aus nur 1 Vol-% fötalem Kälberserum und 99 Volqd MEM bestand.
Bei den Gruppen 3 und 4 wurde jedoch auf ein Medium gewechselt, das wieder das optimale Medium war, und dementsprechend aus 5 Vol-% fötalem Kälberserum plus 95 Vol-% MEM zusammengesetzt war.
Bis zum Mediumwechsel wurde bei allen Kulturen ein gleiches Wachstum beobachtet und die Kulturen erreichten bis dahin Zellzahlen von 22'000 Zellen pro Kultur bis 28'000 Zellen pro Kultur.
Nach dem Mediumwechsel wurden sämtliche Kulturen bis zum achten Tage inkubiert, und am 12.
Tag wurde wieder bei allen Kulturen das Medium gewechselt.
In den Gruppen 3 und 4 zeigte sich ein kontinuierliches Wachsen der Zellen und am 12. Tag waren in der Gruppe 3 6601000 Zellen pro Kultur vorhanden und in der Gruppe 4 630'ovo0 Zellen pro Kultur.
In den Gruppen, 2 und 5, in'denen die Weiterzüchtung in dem Medium mit dem verminderten Gehalt an fötalem Kälberserum durchgeführt wurde, zeigte sich eine deutliche Schädigung der adulten Affennierenzellen. In den Gruppen 1 und 2 war die Zellzahl pro Kultur bis zum 12. Tag nur auf 60'000 Zellen pro Kultur gestiegen und in der Gruppe 5 betrug die Zellzahl nur 160'000 Zellen pro Kultur.
Ferner zeigte sich in den Gruppen 1, 2 und 5 eine deutliche morphologische Veränderung der geschädigten Zellen gegenüber den ungeschädigten Zellen der Gruppen 3 und 4. Die geschädigten Zellen wiesen ein stark vergrössertes Cytoplasma auf und enthielten mehrere Zellkerne.
Am 12. Tage wurde in allen Gruppen 1, 2, 3, 4 und 5 wiederum das Medium gewechselt und die adulten Affennierenzellen sämtlicher Gruppen wurden wieder in einem Medium aus 95 Vol-% MEM Medium plus 5 Vol- fötalem Kälberserum weitergezogen.
In der Gruppe 3 stieg die Zellzahl der ungeschädigten Nierenzellen von 660'000 am 12. Tag kontinuierlich auf 1'300'000 am 20. Tag an.
Die ungeschädigten Zellen der Gruppe 4 wurden in zwei Untergruppen (a) und (b) unterteilt.
Zu den Kulturen der Untergruppen (a) und (b) wurden am 12. Tag erfindungsgemässe pharmazeutische Präparate zugesetzt, die nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 erhalten worden waren und die lebende Zellen der Embryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes enthielten. Die Zugabe der Embryonalzellen erfolgte in einer solchen Menge, dass zu den Kulturen der Untergruppe (a) 11'000 embryonale Leberzellen pro Kultur zugesetzt wurden und zu den Kulturen der Untergruppe (b) 14tOOO embryonale Herzzellen pro Kultur beigegeben wurden.
Nach der Zugabe der embryonalen Herzzellen in der Untergruppe 4b stieg die Zellenzahl von 630'000 Zellen pro Kultur am 12. Tage auf l'7O0'000 Zellen pro Kultur am 20. Tage an.
Nach der Zugabe der Leberzellen in der Untergruppe 4a konnte die Kultur nur bis zum 18.
Tag verfolgt werden, weil dann bereits vollständige Konfluenz in der Zellkultur-Flasche bestand und sich die Zellen im Wachstum gegenseitig hemmten.
Man sieht aus diesen Werten, dass Kulturen, die ungeschädigte adulte Affennierenzellen enthalten, durch die Zugabe von embryonalen Zellen des Schafes anderer Organe, nämlich zum Beispiel Herzzellen oder Leberzellen, in ihrem Wachstum, also in ihrer Zellvermehrung deutlich gesteigert werden, und zwar gegenüber solchen Kulturen, in welchen die Weiterzüchtung der ungeschädigten Affennierenzellen ohne Zugabe von Embryonalzellen erfolgte.
Die geschädigten Zellen der Gruppe 2 wurden ohne Zugabe von Fötalzellen in dem optimalen Medium aus 5 Vol-Sd fötalem Kälberserum und 95 Vol-% MEM weitergezüchtet. Es zeigte sich dabei bis zum 20. Tage ein leichter Anstieg der Zellzahl von 60'000 Zellen pro Kultur auf 240'000 Zellen pro Kultur. Jedoch blieben die morphologischen Veränderungen der Zellen erhalten, und es wurde keine Abnahme der Anzahl der Zellen mit vergrössertem Cytoplasma festgestellt.
Die geschädigten Zellen der Gruppe 1 wurden bei der Weiterzüchtung in zwei Untergruppen (a) und (b) unterteilt. In der Untergruppe (a) wurde in dem optimalen Medium aus 5 Vol-Sd fötalem Kälberserum und 95 Vol-% MEM weitergezüchtet, wobei pro Kultur 10'000 embryonale Leberzellen zugesetzt wurden. In der Untergruppe (b) wurde in dem gleichen optimalen Medium weitergezüchtet, es wurden jedoch hier pro Kultur 10'000 embryonale Herzzellen zugesetzt. In der Untergruppe (a) stieg dabei die Zellzahl von 60'000 Zellen pro Kultur am 12. Tag bis auf 750'000 Zellen pro Kultur am 20. Tag an. In der Untergruppe (b) stieg die Zellzahl von 60'000 Zellen am 12. Tag auf 1'300'000 adulte Nierenzellen pro Kultur am 20. Tage an.
Die geschädigten Zellen der Gruppe 5 wurden wieder in zwei Untergruppen (a) und (b) unterteilt und in beiden Untergruppen wurde in dem optimalen Medium aus 5 Val-Sd fötalem Kälberserum und 95 Vol-% MEM weitergezüchtet. Zu der Untergruppe 5a wurden 2 Vol-, bezogen auf das gesamte Kultur medium einer Suspension von toten lyophilisierten embryonalen Leberzellen zugesetzt. Zu der Untergruppe 5b wurden pro Kultur 10'000 lebende embryonale Nierenzellen zugesetzt.
In der Untergruppe 5a verminderte sich die Zellzahl von 160'000 Zellen am 12. Tag auf 6O'O00 Zellen pro Kultur am 20. Tag. Vermutlich wurden die geschädigten Nierenzellen durch lysosomale Enzyme, die beim Lyophilisieren der embryonalen Leberzellen freigesetzt wurden, lysiert.
In der Untergruppe 5b hingegen, stieg die Zellzahl von 160'000 am 12. Tag auf 480'000 Zellen pro Kultur am 20. Tag an.
Sehr deutlich konnte auch in den Gruppen la, lb und 5b die Regenerierung der geschädigten adulten Affennierenzellen durch die Zugabe der embryonalen Leberzellen, Herzzellen und Nierenzellen festgestellt werden. Die Anzahl der Zellen mit vergrössertem Cytoplasma nahm ab und es wurden wieder vermehrt die normalen kleineren Nierenzellen aufgefunden.
In der Gruppe 5b, wo organgleiche Embryonalzellen zugesetzt wurden, wurde ferner eine ausgeprägte Kontaktbildung zwischen den embryonalen und den adulten Nierenzellen festgestellt. Es wurden oft Tentakel gebildet.
Die Versuche zeigen, dass geschädigte adulte Zellen durch blosses Zurückwechseln auf das optimale Medium nicht regeneriert werden. Durch Zugabe von lyophilisierten toten Embryonalzellen werden sie sogar noch weiter im Wachstum behindert und geschädigt. Setzt man jedoch bei den geschädigten Zellen zu dem optimalen Wachstumsmedium noch lebende embryonale Zellen des gleichen Organes oder eines fremden Organes zu, so erfolgt nicht nur eine Steigerung des Zellwachstums, sondern auch eine Regenerierung der geschädigten Zellen. Auch ungeschädigte adulte Nierenzellen werden durch die Zugabe von embryonalen Zellen in ihrem Wachstum gefördert.
Beispiel 5 Es wurde die gleiche Versuchsanordnung beibehalten wie in Beispiel 4, jedoch wurden jetzt adulte Affenherzzellen geschädigt und es wurde ihre Regeneration mit frischen fötalen Schafnierenzellen bestimmt. Am Anfang wurde bei diesem Versuche eine höhere Anzahl an adulten Herzzellen eingesät und so war nach vier Tagen Wachstum in dem optimalen Medium aus 95 Vol-% MEM plus 5 Vol-% fötalem Kälberserum in allen Kulturen eine Zellzahl von 280'000 Zellen pro Kultur erreicht. Auch hier wurde am vierten Tag das Medium gewechselt.
In der Gruppe, die weiterhin in dem optimalen Medium mit 5 Vol- Zusatz an fötalem Kälberserum gezüchtet wurde, stieg die Anzahl der Herzzellen auf 1'500'000 bis 1'900'000 pro Kultur nach acht Tagen Weiterzucht, also bis zum 12. Tag an.
In denjenigen Gruppen, wo vom vierten Tag bis zum 12. Tag in einem Medium von nur 1 Vol-% an fötalem Kälberserum und 99 Vol-% MEM weitergezUchtet wurde, war die Zellzahl auf etwa 440'000 Zellen pro Kultur gestiegen.
In sämtlichen Gruppen wurde am 12. Tage wieder das Medium gewechselt und es wurde in allen Gruppen erneut in dem optimalen Medium aus 5 Vol-% fötalem Kälberserum plus 95 Vol-% MEM weitergezüchtet.
In derjenigen Gruppe, in welcher in diesem optimalen Medium weitergezüchtet wurde und keine lebenden fötalen Zellen zugegeben wurden, sank die Zellzahl von 440'000 Zellen pro Kultur am 12. Tage auf 43'000 Zellen pro Kultur am 15. Tage ab. Daraus sieht man, dass eine Regeneration der geschädigten adulten Zellen durch blosses Wchseln auf das optimale Medium nicht mehr möglich war.
Zu denjenigen Kulturen, wo am 12. Tag bei der Weiterzüchtung zu dem optimalen Medium ausserdem noch 10' 000 fötale Schafsnierenzellen pro Kultur zugesetzt wurden, stieg die Zellzahl von 440'000 Zellen pro Kultur am 12. Tag auf 670'000 adulte Zellen pro Kultur am 15. Tage an.
Zu einer Kultur mit ungeschädigtenadulten Affenherzzellen wurden fötale Nierenzellen zugesetzt. Dabei konnten jedoch die Zellzahlen nicht mehr ausgewertet werden, weil die adulten Zellen bereits konfluent waren und der Versuch wurde dementsprechend abgebrochen.
Auch aus diesem Beispiel sieht man, dass geschädigte adulte Zellen durch Zugabe von fötalen Zellen eines anderen Organes regeneriert werden können.
Beispiel 6 Regeneration von geschädigten menschlichen E'pithelzellen durch einbrvonale Nierenzellen Die in Beispiele 4 und 5 beschriebenen Versuche deuten darauf hin, dass bei der Schädigung von adulten Affennierenzellen, bzw. Affenherzzellen, offensichtlich im "Skelett' der Zelle Aenderungen auftreten. Ungeschädigte menschliche Spithelzellen besitzen in ihrer Zellmembran verankertes Actin.
Es soll in diesem Beispiel untersucht werden, wie sich das Actingerüst der menschlichen hpithelzellen bei Schädigung, bzw. Regenerierung verhält.
Zu diesem Zwecke werden die Actin enthaltenden Mikrofilamentbänder durch Antiactin-Antikörper sichtbar gemacht, die mit Fluorescein-isothiocyanat (FITC) markiert sind.
Erzeugung der Antiactin-Antikörper An immunisierte Kaninchen erfolgte eine Verabreichung von Actin, und zwar erhielten sie am 1. und am 7. Tag durch intramuskuläre Injektionjeweils 0,3 mg gereinigtes Actin, das in 0,5 ml Freud's Adjuvans emulgiert war. Freud's Adjuvans ist in "Chemical and Biological Bases of Adjuvants" von Joule und Paraf, Berlin, Springer 1973, beschrieben.
Anschliessend wurden dann an das Kaninchen noch weitere Mengen an Actin verabreicht, jedoch jetzt intravenös mit Actin, das an Aluminiumverbindungen absorbiert ist.
Zu diesem Zweck wurden 1 - 2 mg Actin/ ml mit 0,5 ml einer 10 %-igen wässrigen Lösung von KA1 (S04)2 pro mg Protein gemischt. Der pH-Wert wurde mit Natronlauge auf 7,3 eingestellt und der Niederschlag in 0,15 molarer wässrigen Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 1 mg Actin pro ml suspendiert. Am 16., 18., sowie am 21. Tag wurden 0,1 mg Actin pro Kaninchen injiziert, am 26., 28. und 30.
Tag 0,2 mg Actin pro Kaninchen, am 33. Tag 0,3 mg Actin pro Kaninchen und schliesslich am 37. Tag 0,8 mg Actin pro Kaninchen.
Am 40. Tag wurde den Tieren Blut entnommen.
Nach einer Ammoniumsulfatfällung der gesammelten Seren wurde die Gammaglobulin-Fraktion auf einer Actin-Sepharose-Säule gereinigt.
Die gebundenen Antiactin-Antikörper wurden von der Säule mit 0,2 molarem wässrigen Glyzerin-Lösung, deren pH-Wert mit Salzsäure auf 2,7 eingestellt worden war, eluiert. Diejenigen Fraktionen, welche den Antiactin-Antikörper enthielten, wurden miteinander vereinigt und gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert und auf 0,1 mg/ml Protein konzentriert.
Die Reinheit des Antiactin-Antikörpers wurde mit Actin nach dem Verfahren überprüft, das von Ouchterlony im "Handbook of Experimental Immunology" von L.A. Nilsson, 19.1. - 19.39, Blackwell Scientific Publication, Oxford, 1974, beschrieben ist.
Immunofluoreszenz-Färbung von ungeschädigten. geschäzeigten, bzw. regenerierten menschlichen Epithelzellen Die zellbeschichteten Deckgläser wurden zweimal mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung abgekürzt "PBS" gewaschen und dann mit einer Lösung aus 10 Vol-,' PBS plus 10 Vol-,' Glyzerin plus 10 Vol-,' Dimethylsulfoxid behandelt. Diese zuletzt genannte Lösung wird mit GS-PBS abgekürzt.
Dann fixierte man während 10 Min. durch Behandlung mit einer Lösung aus PBS mit 2 mM KC1, die ferner, bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung, 3,7 Vol-,' Formaldehydlösung, 10 % Glyzerin und 1046 DMSO enthält. Schliesslich wurde zWeimal mit GS-PBS gewaschen, 4 Min. bie Oo C in Methanol getaucht und schliesslich 2 Min. in Aceton bei -70° C gelassen.
Anschliessend wurden die Gläser an der Luft getrocknet und in einer Befeuchtungskammer mit 20 µl des nach dem vorher beschriebenen Verfahren hergestellten Antiactin-Konzentrates bei 370 C während 45 Min. inkubiert. Anschliessend wurde mit PBS gewaschen.
Schliesslich. erfolgte die Markierung mit dem Fluorescein-Isothiocyanat, abgekürzt als FITC, indem man nach dem Waschvorgang mit 20 po an FITC-Konjugiertem Schafsantikaninnnchengammaglobulin bei 37°C während 45 Min. inkubiert. Schliesslich wurde wieder mit PBS gewaschen und die Zellen wurden dann mit einem weiteren Deckgläschen abgedeckt.
Durch dieses MarkLerutWsverfahren wurden in den Zellen die Actin enthaltenden Mikrofilamentbündel durch den fluoreszierenden Antiactin-Antikörper sichtbar gemacht.
Gesunde, nicht geschädigte menschliche Epithelzellen zeigen die mit dem fluoreszierenden Antikörper markierten Äctin-Mikrofilamentbündel. Dabei bildet das Actin mit seiner faserförmigen Struktur das Gerüst der vollständigen Zelle. Das Actin stützt also skelettmässig die äusere Membran der Zelle und bestimmt dadurch ihre äussere Form.
Bei den geschädigten menschlichen Spithelzellen fehlt offenbar die Verankerung des Actins an der Zellmembran. In diesem Fall besitzt das mit dem fluoreszierenden Antikörper markierte Actin keine faserförmige Struktur sondern eine amorphe Struktur und es befindet sich ausserdem hauptsächlich im Inneren der Zelle und nicht an der Zellmembran verankert.
Bei den geschädigten Zellen ist also die äussere Form der Zelle nicht mehr fixiert und die Zellmembran kann sich in allen Richtungen ausdehnen. Es entstehen dadurch Zellen mit stark vergrössertem Umfang, beispielsweise runde Zellen.
Züchtung, Schädigung und Regeneration der menschlichen Epithelzellen Die menschlichen Epithelzellen wurden in Petrischalen auf Deckgläschen in Monolayer-Kulturen gezogen. Als Zuchtmedium diente das optimale Medium aus 95 Vol-% MEM plus 5 Vol-% fötalem Kälber-Serum.
Nach vier Tagen wurde das Medium gewechselt und man züchtet auf einem Medium aus 99 Vol-% MEM und 1 Vol-% embryonalem Kälberserum während acht Tagen, also bis zum 12. Tag, gerechnet vom Beginn der Züchtung, weiter. Durch die Verminderung des Gehaltes an fötalem Kälberserum in dem Zuchtmedium wurden die Zellen geschädigt. Die Schädigung der Zellen wurde nach dem weiter vorne beschriebenen Verfahren mit Hilfe des fluoreszierenden Antiactin-Antikörpers sichtbar gemacht.
Am 12. Tage wurde in allen Kulturen wiederum das Medium gewechselt und man züchtet die Zellen auf dem optimalen Medium aus 95 Vol-% MEM und 5 Vol.-% fötalem Kälberserum weiter. Es erfolgte jetzt eine Aufteilung der Kulturen in zwei Gruppen.
Zu der einen Gruppe an Kulturen setzte man beim Wechsel des Kulturmediums ausserdem ein nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestelltes embryonales Schafsnierenzellen enthaltendes Präparat zu, und zwar in einer solchen Menge, dass pro Kultur lO'O00 embryonale Schafsnierenzellen zugesetzt wurden.
In der zweiten Gruppe an Proben wurde nur auf dem optimalen Medium, ohne Zugabe von embryonalen Zellen,weitergezüchtet. In dieser Gruppe zeigte sicht mehrere Tage später keine Regeneration der geschädigten menschlichen Spitzelzellen. Dies wurde durch die oben beschriebene Anfärbung mit dem fluoreszierenden Antiactin-Antikörper sichtbar gemacht.
In derjenigen Gruppe an Proben, bei denen in dem optimalen Medium unter Zugabe von 10'000 embryonalen Schafsnierenzellen pro Kultur weitergezüchtet worden war, liess sich nach einigen Tagen eine deutliche Regenerierung der geschädigten Zellen feststellen. Mit Hilfe der Anfärbung mit dem fluoreszierenden Äntiactin-Antikörper konnte sichtbar gemacht werden, dass das Actin wieder zur Zellenmembran zurückgewandert war und wie bei den ungeschädigten gesunden Zellen sich offensichtlich wieder in der Zellmembrane verankert hatte und diese stützt. Die regenerierten Zellen nahmen auch wieder ihre ursprUngliche Grösse und Form an.
Die oben beschriebenen Versuche zeigen, dass durch die Zugabe von frischen lebenden Embryonalzellen ein durch Schädigung zerstörtes Stückgerüst des Actins von menschlichen btithelzellen wieder aufgebaut werden kann und dass die geschädigten Zellen so wieder die Form und Grösse von ungeschädigten Zellen annehmen.
Beispiel 7 Nachweis von zellregenerierenden Faktoren im Serum In diesem Beispiel wurde untersucht, wie menschliches Serum das Wachstum von ungeschädigten embryonalen Nierenzellen und ungeschädigten adulten Nierenzellen beeinflusst. Die embryonalen Nierenzel- len waren Nierenzellen der zmbryonen der schwarzen Rasse des Juraschafes, und zwar die gleiche Art an Zellen, die auch zur Herstellung der erfindungsgemässen Präparate verwendet wurde. Die adulten Nierenzellen stammten von Affen.
Bei diesem Versuch wurden 1'000t000 embryonale Nierenzellen, bzw. 1'000'000 adulte Nierenzellen in 75 ml Zellkulturflaschen eingesät. In diesen Zellkulturflaschen befanden sich jeweils 10 m.
des optimalen Kulturmediums aus 95 Vol-5'o MEM plus 5 Vol-Sd fötalem Kälberserum.
Nach der Anzuchtphase wurden die Kulturen in mehrere Gruppen unterteilt, In allen Gruppen wurde das Medium gewechselt. Drei Tage nach dem Mediumwechsel und sieben Tage nach dem Mediumwechsel wurde in den Kulturen die Anzahl der embryonalen Nierenzellen, bzw. drei Tage und fünf Tage nach dem Mediumwechsel die Anzahl der adulten Affennierenzellen bestimmt.
In den Gruppen zu Vergleichszwecken erfolgte die Weiterzüchtung der embrionalen Nierenzellen des Juraschafes, bzw. der adulten Affennierenzellen in dem optimalen Medium aus 95 Vol-Vo MEM plus 5 Vol-% an fötalem Kälberserum ohne irgendeinen Zusatz an menschlichem Serum, also Humanserum, das in der Folge mit HS bezeichnet wird. In den anderen Gruppen wurde ebenfalls auf dem optimalen Medium aus 95 Vol-O MEM plus 5 Vol-% fötalem Kälberserum weitergezüchtet, jedoch wurde zu diesem Medium 2,5 Vol-Sd an Humanserum, bezogen auf das Gesamtmedium, zugegeben.
In diesem Test zeigt eine deutliche Zellvermehrung der ungeschädigten embryonalen, bzw.
adulten Nierenzellen, in den Gruppen, in dem Medium mit Zugabe von menschlichem Serum weitergezüchtet wurden, im Vergleich zu der Kontrollgruppe, die ohne Zugabe von Serum weitergezüchtet wurde, die Anwesenheit von zellregenerierenden Faktoren in dem menschlichen Serum an.
Beispiel 8 Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum erwachsener menschlicher Patienten vor Verabreichung eines erfindunsgemässen Praparates und nach dessen Verabreichung Die Tests wurden nach den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der dort beschriebenen embryonalen Nierenzellen, bzw. adulten Nierenzellen, durchgeführt. Es wurden, wie in Beispiel 7 erläutert, pro Zellkulturflasche li0001000 embryonale Nierenzellen, bzw. 1'000'000 adulte Nierenzellen eingesetzt und nach der Anzuchtphase erfolgte der Mediumwechsel, wobei in der Kontrollgruppe jeweils ohne Zugabe von Humanserum weitergezüchtet wurde, in den übrigen Gruppen unter Zugabe von 2,5 % Humanserum, bezogen auf das Gesamtmedium. Die Medien waren die gleichen wie in Beispiel 7 beschrieben und die Auszählung der Zellen erfolgte zwei Tage nach dem Mediumwechsel und fünf Tage nach dem Mediumwechsel.
Den menschlichen Patienten wurde unmittelbar vor der Injektion eines erfindungsgemässen, lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren enthaltenden pharmazeutischen Präparates Blut entnommen. Vier Tage nach der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates und elf Tage nach der Injektion des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates wurde den gleichen menschlichen Patienten wiederum Blut entnommen. Aus den jeweiligen Blutproben wurde das Serum isoliert.
Wenn in dem Körper des Patienten durch die Verabreichung des erfindungsgemässen lebende Frischzellen enthaltenden Präparates irgendwelche cytotoxischen Substanzen gebildet würden, dann müssen sie vier Tage nach der Verabreichnung, bzw. elf Tage nach der Verabreichung bereits im Serum des Patienten feststellbar sein. Die Anwesenheit solcher cytotoxischer Substanzen würde zu einem Absterben embryonaler Nierenzellen, bzw. adulter Nierenzellen führen und dementsprechend zu einer verminderten Zellenzahl in den Proben unter Zugabe von Humanserum im Vergleich zu den Kontrollproben ohne Zugabe von Humanserum.
Tests unter Verwendung der adulten Nierenzellen Beim Wechsel des Nährmediums nach der Anzuchtphase wurden die folgenden Gruppen an Proben weitergezüchtet: Gruppe % Humanserum Ursprung des Humanserums A 1 0 % Kontrollprobe ohne Zusatz von HS A 2 2,5 , Patient A vor FZ-Inj.
A 3 2,5 % Patient A 4 Tage nach FZ-Inj.
A 4 2,5 % Patient A 11 Tage nach FZ-Inj.
A 5 2,5 % Patient B vor FZ-Injektion A 6 2,5 % Patient B 4 Tage nach FZ-Inj.
A 7 2,5 % Patient B 11 Tage nach FZ-Inj.
In der obigen Tabelle und in nachfolgenden Tabellen bedeutet "FZ-Inj." jeweils Frischzelleninjektion.
Die bei den Gruppen A 1 - A 7 nach drei Tagen, bzw. Fünf Tagen in den Kulturen festgestellten Anzahlen an adulten Nierenzellen, sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III Versuchsgruppe Anzahl Zellen nach 3 Tagen nach 5 Tagen A 1 3,8 x 105 8,6 x 105 A 2 4,5 x 105 9,3 x 105 A 3 4,3 x 105 9,2 x 105 A 4 4,3 x 105 8,7 x 105 A 5 4,8 x 105 8,9 x 105 A 6 4,7 x 105 9,2 x A 7 4,9 x 105 9,0 x 105 Man sieht aus den in Tabelle III angeführten Ergebnissen, dass in sämtlichen Gruppen eine ähnlich starke Zellvermehrung stattgefunden hat. Ein Vergleich der Gruppe A 2 mit der Gruppe A 4, bzw. der Gruppe A 5 mit der Gruppe A 7, zeigt, dass vor der Frischzellentherapie und elf Tage nach der Frischzellentherapie gewonnenes menschliches Serum das Wachstum von adulten Nierenzellen nicht wesentlich beeinflusst. Dies beweist, dass sich im Körper des Patienten nach der Frischzelleninjektion keine cytotoxischen Substanzen gebildet haben, weil in den Proben mit der Zugabe des entsprechenden Serums kein Absterben der adulten Nierenzellen, sondern ein normales Weiterwachsen festgestellt werden konnte.
Bei den in Tabelle III zusammengestellten Tests wurden die adulten Nierenzellen in dem jeweiligen Medium bei 37°c bis zur Konfluenz gezogen.
Nach drei Tagen und nach fünf Tagen wurde jede der Zellkulturflaschen an drei verschiedenen Stellen photographiert und auf den Photographien wurden die Zellen ausgezählt. Die in der Tabelle III angegebenen Zellzahlen sind jeweils der Mittelwert aus diesen drei Auszählungen.
Tests unter Verwendung der embrvonalen Nierenzellen Beim Wechsel des Nährmediums nach der Anzuchtphase der embryonalen Nierenzellen wurden die folgenden Gruppen an Proben weitergezüchtet. Die Kontrollprobe wurde wieder ohne Zusatz von Humanserum gezüchtet. Die Proben an Humanserum stammten von den gleichen Patienten A und B jeweils vor der Frischzelleninjektion, sowie vier Tage nach und elf Tage nach der Frischzelleninjektion.
Nach dem Mediumwechsel wurden die Zellen bei 370 C bis zur Konfluenz gezogen. Drei Tage nach dem Mediumwechsel, bzw. sieben Tage nach dem Mediumwechsel wurde jede der Zellkulturflaschen an drei verschiedenen Stellen photographiert und auf den Photographien wurden die Zellen ausgezählt. Die in der nachfolgenden Tabelle IV angegebenen Zellzahlen sind ebenfalls jeweils der Mittelwert aus diesen drei Aus zählungen.
Es wurden die folgenden Gruppen an Proben weitergezüchtet.
Gruppe 56 Humanserum Ursprung des Humanserums E 1 0 56 Kontrollprobe ohne Zusatz von HS E2 2,5 56 Patient A vor FZ-Inj E 3 2,5 56 Patient A 4 Tage nach FZ-Inj.
E 4 2,5 56 Patient A 11 Tage nach FZ-Inj.
E 5 2,5 56 Patient B vor FZ-Injektion E 6 2,5 56 Patient B 4 Tage nach FZ-Inj.
E 7 2,5 56 Patient B 11 Tage nach FZ-Inj.
Die bei den Gruppen E 1 - E 7 nach drei Tagen, bzw. sieben Tagen in den Kulturen bestimmten Mittelwerte an embryonalen Nierenzellen sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV Versuchs gruppe Anzahl Zellen nach 3 Tagen nach 7 Tagen E 1 2,3 x 105 4,0 x 1 Ei E 2 1,6x105 2,8x105 E3 1,8 x 105 2,7 x 105 E4 3,0 x 105 3,7 x 105 E 5 1,5 x 105 3,0 x 105 E6 1,8 x 105 3,8 x 105 E7 2,2 x 105 3,6 x 105 Aus den in Tabelle IV zusammengestellten Werten für die Zellzahlen sieht man, dass in dem Serum der Patienten nach der Frischzellentherapie keine cytotoxischen Substanzen feststellbar sind.
Beim Vergleich der Gruppe E 2 mit der Gruppe E 4, bzw. der Gruppe X 5 mit der Gruppe E 7, sieht man, dass nach einer Züchtungszeit von drei Tagen zwischen den beiden Gruppen deutlichere Unterschiede in der Anzahl der Zellen pro Kultur bestehen als nach sieben Tagen. Dies ist darauf zurUckzufUhren, dass sich die Zellen nach sieben Tagen bereits nicht mehr in der Wachstumsphase befinden. Nach drei Tagen Züchtung sieht man jedoch, dass sowohl beim Patienten A als auch beim Patienten B ein Serum, das vor der Frischzelleninjektion gewonnen wurde, zu einer wesentlich geringeren Zellvermehrung führt, als ein Serum, das elf Tage nach der Frischzelleninjektion gewonnen wurde. Wie man aus der Tabelle IV sehen kann, haben sich die embryonalen Nierenzellen in der Gruppe E 4, also bei derjenigen Kultur, in der eine Serumprobe des Patienten A zugesetzt wurde, die elf Tage nach der Frischzelleninjektion genommen wurde, im Vergleich zu der Zellkultur, bei der Serum des gleichen Patienten, jedoch vor der Frischzellenbehandlung zugesetzt wurde, nämlich der Gruppe E 2 nahezu verdoppelt.
Aus- diesen Versuchen sieht man also, dass elf Tage nach der Frischzelleninjektion im Serum des Patienten irgendwelche Substanzen enthalten sind, die das Wachstum von embryonalen Nierenzellen fördern.
Diese wachstumsfördernden Substanzen werden in der Folge auch als Stimuline bezeichnet.
Deutlich zu sehen ist aus den Ergebnissen der Tabelle IV ferner, dass in der Gruppe E 3 und in der Gruppe E 6, also in denjenigen Serumproben, die vier Tage nach der Injektion der-Frischzellen gewonnen wurden, offensichtlich weniger das Wachstum der embryonalen Nierenzellen fördernde Substanzen enthalten sind, als in denjenigen Serumrpoben, die dem gleichen Patienten elf Tage nach der Frischzelleninjektion entnommen wurden, nämlich den Proben der Gruppe E 4 und E 7. Daraus kann man schliessen, dass die das Zellwachstum fördernden Stoffe nicht von den injizierten Embryonalzellen selbst stammen, sondern dass die injizierten lebenden Embryonalzellen im Organismus des Patienten die Bildung der Stimuline hervorgerufen haben, die das Wachstum der embryonalen Nierenzellen fördern.
Beispiel 9 Nachweis von zellregenerierenden Faktoren im Serum Es wurde ähnlich gearbeitet, wie in Beispiel 7, jedoch wurde jetzt untersucht, wie menschliches Serum das Wachstum von geschädigten adulten Zellen beeinflusst. Wie in Beispiel 7 wurden als adulte Nierenzellen jetzt wieder entsprechende Affennierenzellen verwendet.
Bei diesem Versuch-wurden jeweils 20'000 adulte Nierenzellen in 75 ml Zellkulturflaschen eingesät. In diesen Zellkulturflaschen befanden sich jeweils 10 ml des optimalen Kulturmediums aus 95 Vol-% MEM plus 5 Vol-O fötalem Kälberserum. Es wurde in diesem Medium wieder bei einer Temperatur von 370 C gezüchtet und nach dieser Anzuchtphase, die sechs Tage-dauerte, wurde das Medium gewechselt. Nach der Anzuchtphase wurden die Kulturen in mehrere Gruppen unterteilt.
In allen Gruppen wurde das Medium gewechselt.
In einer Gruppe, die als Gruppe zu Vergleichszwecken dient, wurde jedoch die folgenden zwölf Tage lang wieder in dem optimalen Medium aus 95 Vol-% an MEM plus 5 Vol- an fötalem Kälberserum weitergezüchtet. In diesem Medium wurden die adulten Affennierenzellen nicht geschädigt.
In den übrigen Gruppen wurde zwölf Tage lang in einem Medium weitergezüchtet, das nur 1 Vol-% an fötalem Kälberserum und 99 Vol-% an MEM enthält. In diesem Medium wurden die adulten Affennierenzellen geschädigt. Nach dieser Schädigungsphase wurde in allen Gruppen das Medium wieder gewech- selt.
In allen Gruppen wurde wiederum in dem optimalen Medium aus 95 Vol- MEM plus 5 Vol-% fötalem Kälberserum weitergezüchtet, in einigen Gruppen wurde in diesem optimalen Medium ohne Zugabe an menschlichem Serum weitergezüchtet, in den anderen Gruppen wurden jeweils 2,5 Vol-, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, an menschlichem Serum zu dem Kulturmedium zur Weiterzüchtung zugesetzt.
Eine merkliche Zellvermehrung in denjenigen Gruppen, die unter Beigabe von menschlichem Serum weitergezüchtet wurden, im Vergleich zu der Gruppe an geschädigten Zellen, die nur in dem Medium aus 95 Vol-% MEM plus 5 Vol-Sd fötalem Kälberserum weitergezüchtet wurde, zeigt die Anwesenheit von zellregenerierenden Faktoren im getesteten Serum an.
Die Anwesenheit von derartigen zellregenerierenden Faktoren kann auch an den geschädigten Zellen festgestellt werden, indem nämlich die gestörte Morphologie der geschädigten adulten Säugetierzellen gebessert oder beseitigt wird. Auch in diesem Falle erfolgt der Vergleich zwischen den entsprechenden Proben mit Serumzusatz und den Proben ohne Serumzusatz.
BeisPiel 10 Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum erwachsener menschlicher Patienten vor Verabreichung eines erfindungsgemässen Präparates und nach dessen Verabreichung Diese Tests wurden nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Affen- nierenzellen durchgeführt. Nach der in Beispiel 9 beschriebenen, sechs Tage dauernden Anwachsphase folgte der Mediumwechsel. In der Gruppe 1 wurden die Zellen nicht geschädigt, da man diese wiederum in dem optimalen Medium aus 5 Vol-Sd fötalem Kälberserum plus 95 Vol-Sd MEM weiterzüchtete.
In den Gruppen 2 bis 7 wurden die Zellen zwölf Tage lang geschädigt, indem man sie in dem Medium mit nur 1 Vol-% Kälberserum plus 99 Vol-% MEM weiterzüchtete. Anschliessend wurden dann in den Gruppen 2 bis 7 die geschädigten Zellen in dem optimalen Medium aus 95 % MEM und 5 % fötalem Kälberserum, das ferner 2,5 Vol-%, bezogen auf das Gesamtvolumen dieses Mediums, an menschlichem Serum enthielt, weitergezüchtet.
Das menschliche Serum wurde aus Blutproben von drei verschiedenen Patienten gewonnen, und zwar wurden die Blutproben bei den Patienten jeweils vor der Frischzelleninjektion und elf Tage nach der Frischzelleninjektion, bzw. vier Tage nach der Frischzelleninjektion, genommen.
Die getesteten Gruppen waren die folgenden: Gruppe % Humanserum Ursprung des Humanserums 1 0 56 ungeschädigte Zellen 2 2,5 56 Patient A vor FZ-Inj.
3 2,5 56 Patient A 11 Tage nach FZ-Inj.
4 2,5 56 Patient C vor FZ-Injektion 5 2,5 56 Patient C 11 Tage nach FZ-Inj.
6 2,5 56 Patient E vor FZ-Injektion 7 2,5 56 Patient E 4 Tage nach FZ-Inj.
Die geschädigten Zellen wurden in dem Nährmedium mit dem Zusatz an 2,5 56 Humanwerum während sechs Tagen gezüchtet. Auch die ungeschädigten Zellen der Gruppe 1 wurden in dem optimalen Medium ohne Beigabe von Humanserum sechs Tage lang weitergezüchtet. Alle Weiterzüchtungen wurden ebenfalls bei 370 C durchgeführt. Alle Zellkulturen wurden vor der Schädigung, nach der Schädigungsphase, sowie nach der sechstägigen Nachzüchtung, photographiert und ausgezählt.
In der nachfolgenden Tabelle V sind die Ergebnisse zusammengestellt. Die dort angeführten Zellzahlen sind jeweils die Mittelwerte aus drei identischen Kulturen.

Tabelle V

Gruppe Anzahl Zellen pro Kultur

nach 12-tägiger nach 6 Tagen

vor Schädigung; Schädigung Nachzucht

1 3,4#105 2,1#106 2,4#106

2 3,7#105 3,2#105 5,1#105

3 3,8#105 3,0#105 15,0#105

4 3,3#105 3,2#105 6,3#105

5 3,0#105 2,7#105 9,5#105

6 3,2t105 1 2,6#105 5,7»105

7 3,5#105 3,1#105 5,9#105

Man sieht aus den in Tabelle V zusammengestellten Werten, dass das Humanserum der Blutproben des Patienten C und insbesondere des Patienten A, die vor der Frischzellenbehandlung entnommen wurden, zu einer wesentlich geringeren Vermehrung der Zellen führten, als das Humanserum, das aus Blutproben der gleichen Patienten gewonnen wurde, die jedoch elf Tage nach der Frischzellenbehandlung entnommen wurden.

Wie ein Vergleich der Gruppe 2 mit der Gruppe 3 zeigt, hat das Serum das Patienten A nach der Frischzellenbehandlung etwa die dreifache Zellvermehrung in den Kulturen hervorgerufen, verglichen mit dem Serum des gleichen Patienten vor der Frischzellenbehandlung. Ein Vergleich der Gruppe 6 mit der Gruppe 7 zeigt, dass jedoch vier Tage nach der Zelleninjektion beim Patienten E das fragliche Serum etwa die gleiche Zellvermehrung hervorruft, wie das Serum des gleichen Patienten vor der Frischzellenbehandlung.
Aus diesem Ergebnis kann man schliessen, dass die Bildung der das Zellwachstum fördernden Substanzen im Körper des Patienten, nach mehr als vier Tagen nach der Frischzelleninjektion einsetzt.
Eine mikroskopische Beobachtung der Gruppe 2 im Vergleich zur Gruppe 3 und der Gruppe 4 im Vergleich zur Gruppe 5, zeigte, dass die im Serum des Patienten 11 Tage nach der Frischzelleninjektion gebildeten wachstumsfördernden Substanzen auch zu einer Regenerierung der geschädigten Zellen führt. In den Gruppen 2 und 4 waren sechs Tage nach der Züchtung in dem 2,5 % Humanserum enthaltenden Medium immer noch geschädigte adulte Affennierenzellen mit stark vergrössertem Cytoplasma erkennbar. Im Gegensatz dazu enthielten die Proben der Gruppen 3 und 5 nur noch sehr wenige geschädigte Zellen mit stark vergrössertem Cytoplasma und eine relativ hohe Dichte an gesunden regenerierten adulten Affennierenzellen.
Auch bei der mikroskopischen Beobachtung wurde festgestellt, dass die Zelldichte in den Gruppen 2 und 4 wesentlich geringer war als die entsprechende Zelldichte in den Gruppen 3 und 5.

Claims

Ansprüche 1. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen oder festen inerten Medium enthält.
2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als 30 %, vorzugsweise mehr als 50 % und speziell bevorzugt, mehr als 70 % der in dem Präparat enthaltenen t;mbryonalzellen lebende Zellen sind und dass das Präparat weniger als 10 % an Zelibruchstttcken enthält und vorzugsweise frei von Zellbruchstücken ist.
3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die im Präparat enthaltenen lebenden Embryonalzellen Mastzellen sind oder von den folgenden Organen stammen: Hirn mit sämtlichen Substrukturen, Dickdarm, Dünndarm, Zwölffingerdarm, Magen, Lunge, Milz, Herz, Nieren, Thymus, Auge mit sämtlichen Substrukturen, Lymphknoten, Hypophyse mit sämtlichen Substrukturen, Riickenmark, Knochenmark, Muskel, Bauchspeicheldrüse, Nebennieren, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Arterien, Venen, Knorpel, Mundschleimhaut, Nasenschleimhat, Nerven, Haut, Harnblase, Gallenwege, Epiphyse, Knochengewebe, sowie ferner bei männlichen Embryonen Hoden, Sertolizellen und Prostata und ferner bei weiblichen Embryonen Placenta und Eierstöcke.
4. Pharmazeutisches Präparat gemäss einem der AnsprUche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Embryonalzellen von Säugetierembryonen stammen, die ein Entwicklungsstadium, entsprechend der Hälfte der üblichen Tragzeit der Säugetierart bis drei Viertel der üblichen Tragzeit der Säugetierart, aufweisen.
5. Pharmazeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugetierembryonen Embryonen von Wiederkäuern, insbesondere Rindern und Schafen, oder Embryonen von Schweinen sind.
6. Pharmazeutisches Präparat gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat als Trägermaterial ein wässriges Medium enthält, vorzugsweise eine physiologische Kochsalzlösung, die gegebenenfalls noch Aminosäuren und/oder Glucose und/oder Fötalserum enthält, oder eine tiefgefrorene Kochsalzlösung ist, die gegebenenfalls noch einen Zusatzstoff enthält, der die Ausbildung grober Eiskristalle beim Gefrieren verhindert, wie zum Beispiel Glyzerin.
7. Pharmazeutisches Präparat gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es 0,5 x 106 bis 25 x 106 lebende Embryonalzellen pro ml, vorzugsweise 1 x 106 bis 10 x 106 lebende Zellen pro ml enthält.
8. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Uterus eines trächtigen Säugetiers entfernt, ihn in einem sterilen Behälter unter aseptischen Bedingungen öffnet, den Fötus entnimmt und seziert, die einzelnen Gewebe, Organe, bzw. Drüsen von anhaftenden Gewebsfasern und Körper flüssigkeiten befreit, sie anschliessend zu ganz kleinen Stücken zerteilt, diese mechanisch in einzelne Zellen zerlegt und die Minzelzellen in einem inerten flüssigen Medium dispergiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Blut des Muttertieres vor der Entnahme des Uterus testet, um mit Sicherheit die folgenden Krankheiten, bzw. die Anwesenheit der entsprechenden Krankheitserreger auszuschliessen: Bruzellose, die durch Brucella abortus und Brucella melitensis hervorgerufen wird, Salmonellose, die durch Salmonella typhi murium 0, Salmonella typhi murium H, Salmonella enteritidis Gärtner 0, Salmonella enteritidis Gärtner H, Salmonella abortus ovis 0 und/oder Salmonella abortus ovis H hervorgerufen wird, Ornithose, bzw. Psittakose, die von Chlamydia hervorgerufen wird, Rickettsiose, Listeriose und Leptospirose.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man Mastzellen des Embryos verwendet oder die folgenden Gewebe, Organe, bzw. Drüsen des Embryos mechanisch in einzelne Zel- len zerlegt: Hirn mit sämtlichen Substrukturen, Dickdarm, Dünndarm, Zwölffingerdarm, Magen, Lunge, Milz, Herz, Nieren, Thymus, Auge mit sämtlichen Substrukturen, Lympbknoten, Hypophyse mit sämtlichen Substrukturen, Rückenmark, Knochenmark, Muskel, Bauchspeicheldrüse, Nebennieren, Schilddritse, Nebenschilddiese, Arterien, Venen, Knorpel, Mundschleimhaut, Nasenschleimhaut, Nerven, Haut, Harnblase, Gallenwege, hpiphyse, Knochengewebe, sowie ferner bei männv lichen Eiiibryonen Hoden, Sertolizellen und Prostata und ferner bei weiblichen Embryonen Placenta und Sierstöcke.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Aufarbeitung von Magen, Dünndarm, Dickdarm und Zwölffingerdarm, den Mageninhalt, bzw. Darminhalt sofort entfernt und bei der Aufarbeitung des Gehirnes die harten Hirnhäute sofort entfernt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Präparat zur sofortigen intramuskulären Injektion herstellt, indem man die in Einzelzellen zerlegten Gewebe, Organe, bzw. Düsen, in einer physiologischen Kochsalzlösung dispergiert und die zu grossen Teilchen durch Filtration abtrennt, wobei die Einzelzellen das Filter passieren und das erhaltene Filtrat das injizierbare pharmazeutische Präparat darstellt.
13. Verfahren nach ein m der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die in dem inerten flüssigen Medium dispergierten Smbryonalzellen der Säugetiere in ein wässriges Nährmedium überführt, wobei der Anteil der teilungsfähigen lebenden Zellen durch Zellvermehrung Klone bildet und dass man nach einer Züchtungszeit von 3 - 15 Tagen die Zellen erneut in eine physiologische Kochsalzlösung einbringt und so ein sofort injizierbares pharmazeutisches Präparat erhält.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem erhaltenen Präparat, welches die lebenden Säugetierzellen in einer physiologischen Kochsalz lösung enthält, ein pharmazeutisch verträgliches Mittel zusetzt, welches beim Tiefgefrieren die Ausbildung von grossen Eiskristallen verhindert, beispielsweise Glyzerin, anschliessend tiefgefriert und das pharmazeutische Präparat bis zu dessen Verwendung im tiefgefrorenen Zustand aufbewahrt.
15. Testverfahren zur Bestimmung der pharmazeutischen Wirksamkeit eines pharmazeutischen Präparates gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein entsprechendes pharmazeutisches Präparat, welches die lebenden vermehrungsfähigen tambryonalzellen von Säugetieren in einem tiefgefrorenen inerten Medium enthält, zunächst auftaut und so ein entsprechendes pharmazeutisches Präparat erhält, das die lebenden vermehrungsfähigen bmbryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen Medium dispergiert enthält oder direkt von einem derartig flüssigen pharmazeutischen Präparat ausgeht und diese Zellsuspensionen in den flüssigen inerten Medien zu einer Monolayerkultur von adulten Säugerzellen einer anderen Säugerart, die geschädigt wurden, gibt, wobei eine merkliche Vermehrung und/oder eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen die zellregenerierende Wirksamkeit der Embryonalzellen anzeigt.
16. Testverfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem zu testenden pharmazeutischen Präparat enthaltenen lebenden htbryozellen von einem anderen Organ, Gewebe oder Drüse stammen, als die künstlich geschädigten adulten Säugerzellen der anderen Säugerart.
17. Testverfahren zur Bestimmung von zellregenerierenden Faktoren im Serum von erwachsenen Säugern, dadurch gekennzeichnet, dass man das Serum der Säuger zu einer Monolayerkultur von adulten Zellen der gleichen Säugerart oder einer anderen Säugerart, die vorher geschädigt wurden, gibt, wobei eine merkliche Vermehrung und/oder eine deutliche Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen, die Anwesenheit von zellregenerierenden Faktoren im getesteten Serum anzeigt.
18. Testverfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum von erwachsenen menschlichen Patienten getestet wird.
19. Testverfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum eines erwachsenen menschlichen Patienten getestet wird, um das Ansprechen des menschlichen Patienten auf eine Injektion eines lebende vermehrungsfähige Embryonalzellen von Säugetieren in einem flüssigen Medium enthaltenden pharmazeutischen Präparatszu überprüfen, indem man sowohl vor der Injektion der Embryonalzellen als auch mindestens eine Woche nach der Injektion der zmbryonalzellen dem menschlichen Patienten Blut entnimmt und das Serum jeder der beiden Blutproben zu einer Monolayerkultur von adulten Säugerzellen, die vorher geschädigt wurden, gibt, wobei eine deutlich stärkere Vermehrung und/oder ein höheres Ausmass der Wiederherstellung der gestörten Morphologie der geschädigten adulten Säugerzellen in der zweiten Serumprobe im Vergleich zur ersten Serumprobe die Bildung von zellregenerierenden Faktoren im Serum und damit das positive Ansprechen des Patienten auf die Injektion von frischen Embryonalzellen anzeigt.