DE2126957B2

DE2126957B2 - Verfahren zur herstellung von impfstoffen gegen gaensehepatitis

Info

Publication number: DE2126957B2
Application number: DE19712126957
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Schettler, Hermann, Dr, East Lan sing, Mich (VStA)
Priority date: 1971-05-29
Filing date: 1971-05-29
Publication date: 1977-07-07
Also published as: NL7109033A; FR2143588A1; DE2126957A1

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Impfstoffen zur aktiven bzw. passiven Immunisierung von Wassergeflügel, insbesondere von Gänsen, gegen Gänsehepatitis.

Die Gänsehepatitis ist eine Viruskrankheit, welche in Wassergeflügelzuchten großen wirtschaftlichen Schaden verursachen kann. Bisherige Untersuchungen befaßten sich vorwiegend mit einer klinischen Beschreibung von verschiedenen Virusstämmen. Das Resultat der Untersuchungen war, daß keines der isolierten Viren in der Lage war, das im Felde beobachtete Krankheitsbild zu reproduzieren, so daß die isolierten Erreger nicht als die die Krankheit verursachenden Viren angesprochen werden konnten. Es wurde nicht erkannt, daß sich die Krankheit vorwiegend in einer Entzündung der Leber der erkrankten Tiere manifestiert. Genaue Untersuchungen haben aber nun ergeben, daß sich die Krankheit vorwiegend in einer Leberentzündung (Hepatitis) und in einer Bauchspeicheldrüsenentzündung (Pankreatitis) äußert. Da das Krankheitsbild je nach Empfänglichkeit der Gänseküken, die wiederum von deren mütterlichen Antikörpergehalt im Blut sowie von deren Alter zum Zeitpunkt der Infektion abhängt, in verschiedenen Erscheinungsformen auftritt, muß angenommen werden, daß die Krankheit in variierenden klinischen Bildern auftritt.

Nach experimenteller Infektion mit dem gemäß Beispiel 1 isolierten Virus wurden vier verschiedene Krankheitsformen beobachtet:

1. Werden Gänseküken in einem Alter von 1 bis 8 Tagen infiziert, so kommt es zu einer sehr plötzlich auftretenden schweren Krankheit, der alle Gösse] zum Opfer fallen, falls sie keinen mütterlichen Antikörperschutz besitzen. Die ersten Krankheitszeichen sind gewöhnlich am 3. Tage nach der Infektion zu beobachten. Am 3. Tage ateo, manchmal aber auch erst am 4. oder 6. Tage, verweigern die infizierten Tiere das Futter, schlagen häufig mit dem Kopf, bekommen etwas Lidbindehautentzündung und sitzen die meiste Zeit dicht gedrängt zusammen. Sie sind vermehrt wärmebedürftig. Zu dieser Zeit sind die Gänschen noch ziemlich kräftig, da sie bis zur Verweigerung des Futters gleich gut wachsen wie nichtinfizierte Tiere. 1 bis 2 Tage später verweigern sie dann auch das Trinkwasser, bekommen ein eingefallenes Gesicht und verklebte Augen. In der Zwischenzeit sind sie so schwach geworden, daß sie sich nur mit großer Mühe erheben können und dann auch nur wenige Schritte laufen. Den Kopf stützen sie dabei auf den Boden und verenden in diesem Stadium meist innerhalb von wenigen Stunden.

Das Sektionsbild zeigt deutlich geschwollene Leber, dick gefüllte Gallenblase, vermehrte Flüssigkeit in der Bauchhöhle und graugrünlichen schleimigen Mageninhalt, der häufig nach dem Eintritt des Todes aus dem Schnabel läuft.

2. 12 bis 14 Tage alte infizierte Tiere zeigen zwei verschiedene Krankheitsbilder:

a) 5 bis 6 Tage nach der Ansteckung erkranken alle infizierten Gänschen augenscheinlich. Ein Teil verweigert das Futter, andere zeigen mehr einen reduzierten Futterverbrauch. Der Kot wird dünnflüssig-weißlich, später schleimigweiß. Ein Teil dieser Tiere wird auffällig müde und schwach und verendet ungefähr 4 bis 10 Tage nach Auftreten der ersten Krankheitssymptome. Die meisten dieser Gänse haben verklebte Nasenöffnungen und Augen sowie membranartige fibrinöse Auflagerungen auf der Zunge und am Gaumen.

b) Die überlebenden Tiere bleiben deutlich im Wachstum zurück, bekommen einen deutlich eingezogenen Brustkorb und manchmal einen vergrößerten Leib, verlieren die Federn, besonders auf Rücken, Flügeln und Hals. Einige Tiere erscheinen generell nackt mit stark geröteter Haut und deutlich geschwollener Bürzeldrüse. Herden mit derartigem Erscheinungsbild sind also schon von weitem als infiziert zu erkennen. Der größte Teil dieser Gänse ist schwach, sondert sich von der übrigen Herde ab und verendet noch bis zur 8. oder 10. Woche.

3. Drei Wochen alte Gänse erkranken klinisch nur zu einem Teil. Das dann auftretende Krankheitsbild ist zwar etwas verzögert, ähnelt aber im wesentlichen dem unter 2b) beschriebenen Krankheitsbild. In dieser Gruppe wurden jedoch vermehrte Lahmheiten beobachtet. Die Gänse hinkten meist auf einem Bein, manchmal aber auch auf beiden, und konnten sich nur schwer vom Boden erheben. Ein Teil dieser Tiere starb, andere überlebten unter deutlich zurückgebliebenem Wachstum. Ungefähr 30% aller überlebenden Tiere zeigten in der 10. bis 12. Woche eine hochgradige Lidbindehautentzündung. Infolge einer darauffolgenden Infektion mit Bakterien aus der Pasteurellagruppe erblindeten sehr viele dieser Tiere.

4. Vier Wochen alte Junggänse durchseuchen bei Kontaktinfektion ohne sichtbare Krankheitserscheinungen. Sie sind jedoch nicht 100% resistent, da sie intravenös infiziert dasselbe Krankheitshild entwickeln wie es unter 2. beschrieben wurde.

Diese Erkrankungsformen wurden auch in Feldbeobachtungen festgestellt. Die Inkubationszeit ist also mindestens 3 Tage, kann sich aber bis zu 18 Tagen nach der Ansteckung erstrecken.

Die Prognose ist, wie den Beschreibungen unter 1 und zu entnehmen ist, schlecht. Die Gewebeveränderungen der erkrankten Tiere erscheinen besonders in der Leber, die meistens stark vergrößert und somit geschwollen erscheint. Weiterhin kommt es zu Gewebsveränderungen der Bauchspeicheldrüse, der serösen Häute des Bauchraumes, zu Veränderungen am Herzmuskel und gegebenenfalls noch bei anderen Organen. Spezielle Untersuchungen, die die biologischen und physiko-chemikalischen Eigenschaften des Gänsehepatitisvirus betreffen, haben ergeben, daß der Erreger Eigenschaften besitzt, die von allen bisher bekannten Geflügelviren differieren. Diese seien als folgende aufgeführt:

1. Eine serologische Verwandschaft mit folgenden Geflügelviren konnte ausgeschlossen werden:
Infektiöse Bronchitis der Hühner

Atypische Geflügelpest (Newcastle disease)

Geflügelpocken

Geflügelinfluenza A

Aviare Encephalomyelitis

Aviares Adenovirus (CELO)

Aviare Reovirus (Stamm 2313)

Infektiöse Laryngotracheitis

Gänse-Reovirus(lsolat Krauss)

Gänse-Reovirus (Isolat Csontos, Derzsy)

Infektiöse Entenhepatitis (Klassischer Stamm)

Entenpest (Infektiöse Entenenteritis)

Infektiöse Leber- und Milzentzündung

der Eulen

Infektiöse Bursitisder Hühner

2. Gänsehepatitisvirus vermehrt sich in der Gewebekultur (Gänsefibroblasten) mit bisher für Geflügelviren nicht bekannten Veränderungen an den infizierten Zellen. Einschlußkörperchen wurden in Zellkernen und Zellplasma beobachtet.

Die physikalischen Eigenschaften werden im folgenden zusammengefaßt:

1. Das Virus hat keine Hülle. Es ist folglich resistcm gegen Äther und Chloroform.

2. Das Virus ist hochgradig resistent gegen folgende Inaktivierungsmittel: (Empfindlichkeit oder Resistenz sind Kriterien für die Klassifizierung von

a) Thermische Inaktivierung

b) Fermenteinfluß (0,25% Trypsin)

c) 1-molare MgCl₂-Lösung bei 56° C

d) niedrigen pH (3,0)

e) niedrige Chlorfluorkohlenwasserstoffe (C₂FiCl₃)

0 Natriumdodecylsulfat (0,1⁰Zo) g) Formalin I -.1000
h) Phenol 0,5%

i) Natriumdesoxycholat (0,25%)

k) Äther- und Chloroformbehandlung

3. Filtrationsversuche haben ergeben, daß die durchschnittliche Partikelgröße des Erregers unter 50 nm liegt.

4. Der cytopathogene Effekt (CPE) in Gänseembryo-Fibroblastenkulturen konnte durch Zugabe von DNS-Inhibitoren (5-]od-2-desoxyuridin) vollständig verhindert werden. Dies bedeutet, daß das isolierte Virus als Nucleinsäure Desoxyribonueleinsäure (DNS) enthält.

Die unterschiedlichen Eigenschaften gegenüber anderen Geflügelviren seien hier noch einmal kurz zusammengestellt.

1. Größe: kleiner als 50 nm | (unbekannt furan-

2. DNS-Typ der Nucleinsäure I dereGeflügelv.ren)

3. Der typische CPE in Gewebekultur ist verschieden von allen bisher bekannten Geflügelviren.

4. Extreme Resistenz gegenüber lnaktivierungsmitteln.

5. Keine serologische Verwandschafi mn anderen bekannten Geflügelviren.

Alle diese Eigenschaften dienen als Charakteristik der als Parvovirusgruppe zusammengefaßten Viren, von denen einige Vertreter bisher nur vorn Menschen und Säugetieren isoliert werden konnten.

Wirtschaftliche Verluste durch die beschriebene Infektion sind einmal durch die unmittelbaren Todesfälle und zum anderen durch die mangelnde Gewichtszunahme der erkrankt gewesenen, aber wieder genesenen Junggänse bedingt.

Hinweise auf diese Krankheit, die als Gänsehepatiiis bezeichnet werden soll und die vom Erfinder in »Deutsche Geflügelwirtschaft« 3/1971, S. 55-57, näher beschrieben ist, finden sich in der »Berliner und Münchner Tierärztlichen Wochenschrift« 78. 1965, S. 372-375. Diese Literatur stützt sich aber nur auf Feldbeobachtungen. Als vorbeugende Maßnahme wurde die Verimpfung von Serumproben aus Herden mit Verlusten empfohlen, die aber keinen hundertprozentigen Erfolg zeigten, da bisher weder der Antikörpergehalt, noch die Spezifität dieser Seren geprüft werden konnten. Außerdem haben Versuche ergeben, daß so immunisierte Gänseküken nach experimenteller Infektion mit Gänsehepatitisvirus an Hepatitis erkrankten.

Weiterhin gab es noch kein Verfahren, um ein geeignetes, gegen die Krankheit gerichtetes Hyperimmunserum herzustellen, das. Gänseküken oder bebrütete Gänseembryonen vom Zeitpunkt der Impfung an vor dem Ausbruch der Gänsehepatitis schützt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur aktiven Immunisierung von mindestens 4 Wochen alten Gänsen gegen Gänsehepatitis, das dadurch gekennzeichne; ist, daß man (a) Leber. Milz oder Pankreas an Gänsehepatitis erkrankter. Gänsen mit steriler Pufferlösung zu einem Homogenisat verrührt und mit Antibiotika versetzt, das Homogenisat nach 30minütigem Stehenlassen bei

Zimmertemperatur abzentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit auf die Chorioallantoismembran vorbeorüteter Gänseembryonen inokuliert und als Virunräger die Amnion-Allantoisflüssigkeit, die Chorioallantoismembran und die Embryonen, bei denen der spezifische Embryotod zwischen dem 5. und 15. Bebrütungstag eingetreten ist, sammelt, gegebenenfalls eine erneute Passage über I5tägig vorbebrütete Gänseembryonen durchführt und (b) entweder auf 15tägig vorbebrüteten Gänseeiern oder auf Wassergeflügel-Fibroplastenkulturen vermehrt und (c) das Zellmaterial zerkleinert und durch Zentrifugieren abtrennt und die überstehende Flüssigkeit in üblicher Weise konfektioniert.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Totvakzine gegen Gänsehepatitis bei Wassergeflügel, das dadurch gekennzeichnet is', daß man durch Zentrifugieren der wie vorstehend erhaltenen virushaltigen Flüssigkeit eine zehnfache Konzentration der Viruspartikeln erhält und durch Zusatz von /ϊ-Propiolacton inaktiviert.

Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur passiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, das nach einer Alternative dadurch gekennzeichnet ist, daß man Gänse mit dem, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen Impfstoff immunisiert und das Serum gewinnt, mit Konservierungsstoffen versetzt und anschließend steril filtriert.

Nach einer zweiten Alternative ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man Geflügel oder Säugetiere mit einem Viruskonzentrat immunisiert, das durch Mischen der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen klarzentrifugierten virushaltigen Suspension mit einem niederen Chlorfluorkohlenwasserstoff im Verhältnis 1:1, Zentrifugieren und Präzipitieren des Virus aus der wäßrigen Phase erhalten worden ist, und daß man das Serum gewinnt, mit Konservierungsstoffen versetzt und steril filtriert.

Wird das Serum zur passiven Immunisierung von Wassergeflügel (insbesondere Gänsen) oder deren Embryonen verwendet, so wird es im ersten Fall 1 bis 2 Tage alten Gänseküken parenteral inokuliert; im zweiten Fall wird das Serum befruchteten Gänseeiern inokuliert, vorzugsweise am 8. Bebrütungstag in den Dottersack. Hierdurch wird der sich entwickelnde Embryo bereits im Ei geschützt, da in den meisten Fällen bereits die Bruteier infiziert sind.

Die Erfindung ist durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellungeines Impfstoffes
zur aktiven Immunisierung

Von an Hepatitis erkrankten Gänsen (vgl. Deutsche Geflügelwirtschaft 3/1971, S. 55-57) werden Leber, Milz und Pankreas entnommen und mit steriler Pufferlösung zu einem Homogenisat verrührt und mit Antibiotika versetzt (80 mg Streptomycin, 10 000 IE Penicillin/ml). Nach 30minütigem Stehenlassen bei Zimmertemperatur wird das Homogenisat bei 3000 g abzentrifugiert und von der überstehenden Flüssigkeit 1 cm¹ auf die Chorioallantoismembran (CAM) 15tägig vorbebrüteter Gänseembryonen inokuliert. Eier, die nach 24-28 Stunden absterben, werden verworfen, da sie meist bakteriell kontaminiert sind. Spezifischer Embryotod wird vom 5. bis 15. Bebrütungstage nach der Inokulation zu erwarten sein. Als Virusträger werden die Amnion-Allantoisflüssigkeit und die CAM der Embryonen gesammelt. Bei Embryonen, die in einem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium absterben, wird eine neue Passage über Gänseembryonen empfohlen.
Ein so isolierter Virusstamm wird durch Inokulation von 0,2 ml auf die Chorioallantoismembran (CAM) 15tägig bebrüteter Gänseeier vermehrt. Die so infizierten Eikulturen sterben infolge Virusvermehrung ab. Von den innerhalb von 4 — 8 Tagen nach der Infektion

ίο abgestorbenen Embryonen werden die Amnion-Allantoisflüssigkeit, die CAM und die Embryonen steril gesammelt, das Zellmaterial nach üblichen Methoden zerstört, bei -2O⁰C eingefroren oder mit Ultraschall bzw. mit einer Natriumdesoxycholatlösung behandelt.

Nach dem Auftauen bzw. nach der anderen Behandlung wird das grobe Zellmaterial abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und als Impflösung verwendet. Der Virusgehalt der Lösung wird durch Titrierung in Gewebe- oder Eikulturen bestimmt. Er beläuft sich gewöhnlich auf 10⁵ bis 10^b gänseembryoletale Dosen (ELDi₀) pro ml. Diese Lösung kann anschließend nach Zusatz von Antibiotika als Impfstoff verwendet werden.

Die Lösung kann aber auch bis zur Verwendung im Zustand der Kältestarre deponiert (bei -20 bis -70⁰C eingefroren oder lyophilisiert) und vor Gebrauch in üblicher Weise mit einem Adjuvans konfektioniert werden.

Der Impfstoff ist sowohl für eine parenterale als auch

.10 orale Applikation geeignet, da es sich hierbei um ein lebendes Virus handelt, das in einem homologen Wert verabreicht, diesen zur Eigenvermehrung des Virus anregen kann und der durch diesen Prozeß der Infektion zur Antikörperbildung veranlaßt wird.

Als weiteres Verfahren zur Herstellung von Impfvirus kann die Gewebekultur verwendet werden. Dazu werden Wassergeflügel-Fibroblastenkulturen, gewachsen in technischen, käuflichen Nährmedien, wie z. B. Medium 199 (vgl. Tissue Cultures in Biological Research,

G. Pe η so und D. Balducci, Elsevier Comp. 1963, S. 79 - 81), mit Proteinzusätzen (typisch abgebaute Casein-Phosphat-Brühe und Serum) mit an die Gewebekultur adaptiertem Gänsehepatitisvirus infiziert und nach einer weiteren Bebrütung von 4 bis 6 Tagen geerntet.

Das Virus verursacht infolge seiner Vermehrung eine Zerstörung des Zellrasens. Bei der Virusernte wird sowohl die überstehende Flüssigkeit als auch der Zellrasen von dem Kulturträger entfernt, das Flüssigkeit-Zellgemisch, wie oben beschrieben, auf physikalischem oder chemischem Wege aufgeschlossen, das Zellmaterial abzentrifugiert und wie das Eikislturvirus weiterbehandelt.

Zur aktiven Immunisierung werden von dem vorstehend hergestellten Impfstoff 3 ecm subcutan zweimal im Abstand von 3 bis 6 Wochen Gänsen verabreicht. Die letzte Impfung soll mindestens 6 Wochen vor Legebeginn abgeschlossen sein.

Da Untersuchungen ergeben haben, daß Gänse erst ab einem Alter von 4 Wochen eine genügend

Ίο ausgeprägte Altersresistenz besitzen, sollten nur Gänse ab diesem Alter, vorzugsweise Gänse, die älter als 8 Wochen sind, immunisiert werden. Um Mißerfolgen vorzubeugen, wird zweckmäßig die ganze Herde, und zwar männliche und weibliche Tiere, an einem Tage

('S immunisiert. Drei Wochen vor Legebeginn sollte der Antikörperstatus der Herde durch Entnahme einiger Serumproben geprüft werden, um bei mangelnden Antikörpertiter die Herde noch einmal immunisieren zu

<önnen. Die Immunisierung kann auch mit Impfstoff ahne Zusatz des Adjuvans durchgeführt werden.

Im allgemeinen beträgt die Impfstoffdosis etwa 10⁵ gewebekulturinfektiöse Dosen pro ml.

s Beispiel 2

Herstellung einer Totvakcine

Bei diesem Verfahren wird das Gänsehepatitisvirus, wie oben beschrieben, in Eikulturen oder in Gewebekul- to türen gezüchtet. Das Virus wird nach der Klarzentrifugation durch Ultrazentrifugation (100 000 g, 60 Min.) oder durch Zusatz von Na₂CO₃ (50 mM Endkonzentration) und AICI3 (25 mM Endkonzentration) präzipitiert. Außerdem können andere physikalische und chemische is Konzentrationsprozesse, die aus der Literatur bekannt sind, angewendet werden. Die hierbei erhaltene zehnfache Konzentration der Viruspartikeln wird durch Zusatz von 0-Propiolacton (BPL) inaktiviert. Hierbei wird eine 0,5%ige Lösung unmittelbar vor seiner Verwendung hergestellt. Dann wird ein Teil des verdünnten BPL zu neun Teilen Viruskonzentrat gegeben. Die Verdünnungen von BPL werden bei

0 —4°C hergestellt. Nach der Zugabe des BPL zu der konzentrierten Virussuspension wird das Gemisch in verschlossenen Gefäßen bei 4° C 10 Min. geschüttelt und anschließend 4 Stunden in einem Wasserbad bei 37°C unter Rühren mittels Magnetrührer belassen. Das Präparat wird dann über Nacht bei 4°C aufbewahrt, wobei das BPL vollständig hydrolysiert. Die so behandelte Virussuspension wird durch Aufbringen von 0,1 ml unverdünnter Suspension und 0,1 ml einer

1 :100-Verdünnung auf die Chorioallantoismembran von 14 Tage embryonierten Gä'.iseeiern auf Restinfektiosität getestet. Von der den so inaktivierten Virus enthaltenden Lösung werden 3 ecm mindestens zweimal im Abstand von drei Wochen subkutan oder intramuskulär verabreicht.

Im allgemeinen beträgt die Dosis etwa 10'' gewebekulturinfektiöse Dosen pro ml (vor der Inaktivierung).

Beispiel 3

Herstellung eines Impfstoffes
zur passiven Immunisierung (Immunserum)

a) Homologe Wirte (Gänse)

Zu diesem Zwecke werden Gänse, die zum Zwecke der Immunserumherstellung eingestellt werden, dreimal im Abstand von drei Wochen intramuskulär mit 5 ml des wie vorstehend hergestellten inaktivierten Virus immunisiert. Nach dem Antikörpertest durch serologische Reaktion werden die Tiere entweder 20 Tage nach der letzten Impfung durch Schlachtung entblutet oder aber durch Venenpunktion (zweckmäßigerweise Flügelvene oder Fußvene) geblutet

Im letzteren Falle bleiben die Tiere am Leben und können nach der physiologischen Erneuerung des Blutverlustes wiederholt geblutet werden. Die maximal von einer ausgewachsenen Gans zu entnehmende, tolerierbare Blutmenge beträgt 100 bis 150 ml (je nach Körpergewicht). Nach jeder Blutentnahme soll eine erneute Infektion (i. m.) mit inaktivem Virus durchgeführt werden. Von dem gewonnenen Blut kann das Blutplasma (wobei das Blut durch Zusatz von 3% Natriumeitrat [1 ml 3%iges Natriumeitrat pro 12 ml Blut] ungerinnbar gemacht wurde) durch Abzentrifugieren der Blutkörperchen gewonnen werden.

Ohne Koagulationshemmungsmittel kommt es zu

einer Erstarrung des Blutes, wobei sich das Serum vom Blutkuchen trennt. Dieser physiologische Prozeß kann durch Zentrifugation von erstarrtem Blut (bei 3000 U/min, 45 Min.) beschleunigt werden. Das abzentrifugierte bernsteingelbe oder etwas rötlichgefärbte Serum wird gesammelt, mit Konservierungsstoffen versetzt und anschließend steril filtriert (Konservierungsstoff: 0,5% Phenol oder Natrium-Äthyl-Mercurithiosalicylat 1:10 000). Das fertige Serum wird bis zur Verwendung in gefrorenem Zustand bei -20⁰C aufbewahrt. Serum ohne Konservierungsstoff kann mit Antibiotika (10 000 IE Penicillin und 40 mg Streptomycin pro ml) versetzt werden.

b) Heterologe Wirte

Die Reaktion heterologer Wirte (anderes Geflügel und Säugetiere) nach einer Infektion mit Gänsehepatitisvirus basiert nicht auf einer Antikörperbildung infolge Virusvermehrung in dem entsprechenden Wirt, sondern auf einer Abwehrreaktion des Wirtes gegenüber artfremden Eiweißkörpern, wobei der Wirt Antikörper bildet. Die so erzeugten Antikörper sind geeignet, Gänse vor dem Ausbruch der Krankheit zu schützen.

Die Antikörper werden durch den physiologischen Abbauprozeß innerhalb von 3 bis 4 Wochen aus dem Blutstrom eliminiert.

Zur Herstellung dieser Seren wird ein nach Beispiel 1 erhaltenes Viruskonzentrat verwendet. Nach dem Einfrieren wird die klar zentrifugierte Flüssigkeit mit C2F3CI3 in einem Verhältnis von 1 :1 mittels hochtouriger Homogenisatoren innig vermischt und nach einer Unterbrechung von 30 bis 40 Minuten bei 3000 U/Min, in einer Kühlzentrifuge bei 4°C 20 Min. zentrifugiert. Hierbei geliert das Gemisch aus Protein und C₂F₁CIj und wird auf den Boden des Zentrifugenglases geschleudert, während die Viruspartikeln in der überstehenden wäßrigen Phase verbleiben. Aus dieser Flüssigkeit wird das Virus mittels 50 mM Na₂CO) und 25 mM AICl, präzipitiert.

Von diesem Viruskonzentrat werden dann die zu verwendenden Wirte mindestens dreimal in einem Abstand von drei Wochen immunisiert. Die Menge des verwendeten Viruskonzentrat richtet sich nach der Größe des verwendeten Wirtes (2 ml für Geflügel, 20 ml für ein erwachsenes Gtjßtier). Vor jeder Wiederholungsimpfung wird der Antikörperliter durch serologische Laboratoriumsmethoden bestimmt, und die Tiere werden bei Erreichen von genügend hohen Titerwerten entblutet. Sollen die so immunisierten Tiere am Leben bleiben, richtet sich die zu entnehmende Blutmenge nach dem maximal zu tolerierenden Blutverlust. Nach jeder Blutentnahme wird eine Reinimmunisierung empfohlen. Die Serumgewinnung kann wie bei den homologen Wirten erfolgen.

1. Tauben

3 vier Wochen alte Tauben wurden mit Eikulturvirus, das mit einem niederen Chlorfluorkohlenwasserstoff gereinigt war. viermal im Abstand von 7 Tagen immunisiert. Das Serum wurde anschließend in der Komplementbindungsreaktion gegen Gänsehepatitisvirus getestet und erwies sich als positiv (Titer 1 :64). Der Versuch zeigt, daß auch artfremde Tiere gegen das Virus Antikörper bilden können.

2. Pferde

8 bis 10 Zentner schwere Pferde werden, wie oben beschrieben, immunisiert. Nach Beendigung des Immu·

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nisierungsprozesses werden die Tiere geblutet. Das Blut wird mittels Antikoagulatien (2,8%iges Natriumeitrat) ungerinnbar gemacht. Von einem 9 Zentner schweren Pferd werden 8 Liter Blut durch Punktion der Vena Jugularis entnommen und bei 4° C über Nacht stehengelassen. Am nächsten Morgen wird das Blutplasma von dem Bodensatz der roten und weißen Blutkörperchen abgetrennt und die Blutkörperchen nach Resuspension in 37°C warmer physiologischer Kochsalzlösung durch sterile Gazefilter in den Spenderwirt reinfundiert. Auf diese Weise können jede Woche 8 Liter Blut entnommen werden, wobei die maximale Plasmamenge 4 Liter beträgt. Ähnliche Verfahren können mit Ziegen oder Schafen angewendet werden.

In den meisten Fällen erübrigt sich eine spezielle Trennung der Immun-Gammaglobuline durch chemische Fällung. Diese kann jedoch, falls gewünscht, in an sich bekannter Weise durchgeführt werden (Präzipitation mit Ammoniumsulfat - 40- bis 50%ige Sättigung mit anschließender Dialyse gegen geeignete Pufferlösungen).

Eine Supplementierung des Immunserums mit Vitamin und speziellen Antibiotikakonzentrationen kann mit therapeutischen Dosen, bezogen auf ein Gänseküken, durchgeführt werden.

Anwendungsbeispiel 1 Anwendung des Immunserums bei Gänseküken

Homologes und heterologes Immunserurn können in gleicher Weise angewendet werden. Im allgemeinen sollte 1 ml Hyperimmunserum pro Gänseküken verwendet werden. Es hat sich gezeigt, daß eine möglichst frühzeitige Immunisierung der Gänseküken angezeigt ist, da eine Infektion bereits in Ονο oder aber während des Schlupfvorganges stattfinden kann.

Die Gänseküken werden also zweckmäßigerweise bei der Entnahme aus dem Schlupfbrüter mit 1 cm³ Serum subkutan auf der dorsalen Seite vom Obeigang des Halses zum Brustkorb geimpft. An dieser Stelle ist genügend lockeres Unterhautbindegewebe vorhanden, in das man gut 1 cm³ Serum deponieren kann. Bei einer Impfung in die Schenkelmuskulatur kann es leicht zu Verletzungen von Sehnenscheiden und Gelenken kommen, wobei es zu nachfolgenden Lahmheiten kommen kann.

Anwendungsbeispiel 2 Anwendung des Immunserums bei Gänseembryonen

Die bebrüteten Gänseeier werden am 8. Tage nach der Einlage durchleuchtet und die nichtbefruchteten Eier sowie die abgestorbenen Embryonen entfernt. Die Eier werden auf der Spitze stehend fixiert, und unter Lichtkontrolle wird ein kleines Loch kurz oberhalb der Eiflüssigkeit in die Luftkammer gebohrt Die öffnung soll möglichst an der dem Embryo abgewandten Seite angebracht werden. Nach Desinfektion der so markierten Inokulationsstelle mittels Jodtinkturlösung wird mit einer möglichst dünnen Kanüle (Nr. 18 oder 14) 1 cm¹ Serum tief in das Eiinnere inokuliert Bei den ersten Versuchen kann durch leichte Aspiration der Spritze der genaue Sitz im Dottersack geprüft werden. Die öffnung in der Schale wird anschließend durch Kerzenwachs verschlossen, und die Eier werden weiter bebrütet

Die so erzeugte Immunität der Gänseküken erwies sich als äußerst wirksam gegen den Ausbruch der Gänsehepatitis. Das zu diesem Zweck verwendete Immunserum sollte außer Antibiotika keine Konservierungsstoffe enthalten. Die geschlüpften Gänseküken brauchen in diesem Fall nicht noch einmal immunisiert zu werden.

Die nachstehend angegebenen Untersuchungen dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung:

Versuch Nr. 1

126 Gänseküken eines gemeinsamen Schlupfes

ίο wurden in einem besonderen Isolierstall gehalten und jeweils zu den in folgender Tabelle ersichtlichen Zeiten infiziert (Virus nach Beispiel 1, 5. Gänseeipassage, Titer 5,5 · 10⁵·⁵ ELDw). Jeweils 15 Gänse wurden mit 1 ml Virussuspension intramuskulär infiziert, während 6 Gänse als Kontaktkontrollen dazugesetzt wurden. Die nichtinfizierten Tiere blieben in strikter Isolierung.

Alter der Gänse- Zahl der klinisch Zahl der Todesfälle

küken zum sichtlich erkrankten

-° Zeitpunkt der Tiere
Infektion

(Tage

infiziert Kontakt- infiziert Kontaktkontrolle kontrolle

2	15	6	15	6
8	15	6	15	6
15	15	6	10	4
22	10	2	5	1
29	3	0	2	0
35	0	0	0	0

Anm.: Die Todesfälle beziehen sich auf die gesamte Versuchsdauer (3 Monate). Uei allen verendeten Tieren konnte die Diagnose Gänseiiepatitis gesichert werden.

Versuch Nr. 2 (Immunisierungsversuch)

5 Gänse, davon 2 legende Altgänse und 3 männliche Gänse (8 Wochen alt), wurden mit 4 ml Lebendvirus nach Beispiel 1 intramuskulär geimpft. Die Inokulation wurde am 12. und am 21. Tage wiederholt. Das Serum der Tiere wurde am 28. Tage nach der ersten Impfung gesammelt. Von 2 männlichen Tieren wurde das Serutr mit Fluoreszin-lsothiocyanat konjugiert und im lmmu nofluoreszenztest verwendet. Das Serum zeigte spezifi sehe Fluoreszenz in Gegenwart von Gänschepiititisvi rus.

Die Eier der weiblichen Tiere wurden weiterhii gesammelt und gebrütet Die geschlüpften Gänsekükei wurden am 2. Lebenstage mit Gänsehepatitisvirus nasa infiziert Bis zu einer Beobachtungszeit von 3 Wochei konnten keine Krankheitserscheinungen beobachte

werden. Da die ersten Eier dieser Gänse (vor de Immunisierung) für Viruskulturen verwendet wurdei und 4 Gänseküken dieser Altgänse bei einer früherei Inokulation empfänglich waren, ist die Resistenz de späteren Gänseküken auf eine mütterliche Immunitä

»ο die auf das Ei übertragen wurde, zurückzuführen. Dies Untersuchung wurde auch durch Feldbeobachtungei bestätigt

Versuch Nr. 3

*>■> Serum nach Beispiel 3a wurde steril filtriert und fü eine Inokulation in das embryonierte Gänseei mit 500 IE Penicillin und 40 mg Streptomycin pro ecm versetz Von diesem Serum wurden 5 embryonierte bebrütet

Gänseeier (8 Tage nach Einlage in die Brutmaschine) mit 0,5 ml Serum und 5 mit 1 ml Serum in den Dottersack des Embryos inokuliert. 5 Eier wurden nicht infiziert und blieben als Kontrolle. Die Gänsekiiken schlüpften in getrennten Kästen und wurden sofort markiert und bis zum 18. Lebenstage in strikter Isolierung gehalten.

Danach wurden alle Tiere am 18. Tage mit 4 ecm Gänsehepatitis in die Blutbahn infiziert (intravenös) (Virusdosis: 2,0 · 10⁷·⁵ ELDw). Dabei handelt es sich um ι ο eine sehr hohe Dosis und damit um einen maximalen Belastungsversuch. 8 Tage nach der Infektion waren bereits 3 der nichtinokulierten Kontrolltiere (nichtinokulierte Eier) an typischen Zeichen der Gänsehepati-

tis gestorben. Die beiden anderen zeigten deutliche Krankheitserscheinungen. Die mit 0,5 ecm inokulierten Tiere zeigten zu einem Teil klinische Erscheinungen, wie in der Einleitung unter 2 und 3 beschrieben. Nur ein Tier verendete aus dieser Gruppe, während sich die mit 1 ecm Hyperimmunserum im Ei inokulierten Junggänse ohne Krankheitserscheinungen in einem absolut normalen Wachstumsprozeß weiterentwickelten.

Der Versuch zeigte, daß bei dieser Art dei Immunisierung des sich entwickelten Embryos wahr scheinlich neben einer humoralen Immunität auch eine zellulare Immunität besteht, da normalerweise eit Großteil der mütterlichen Antikörper zu diesen Zeitpunkt aus dem Blute eliminiert sein müßte.

Claims

<f Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur aktiven Immunisierung von mindestens 4 Wochen alten Gänsen gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) Leber, Milz oder Pankreas von an Gänsehepatitis erkrankten Gänsen mit steriler Pufferlösung zu einem Homogenisat verrührt und mit Antibiotika versetzt, das Homogenisat nach 30minütigem Stehenlassen bei Zimmertemperatur abzentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit auf die Chorioallantoismembran vorbebrüteter Gänseembryonen inokuliert und als Virusträger die Amnion-Allantoisflüssigkeit, die Chorioallantoismembran und die Embryonen, bei denen der spezifische Embryotod zwischen dem 5. und 15. Bebrütungstag eingetreten ist, sammelt, gegebenenfalls eine erneute Passage über 25tägig vorbebrütete Gänseembryonen durchführt und (b) entweder auf 15tägig vorbebrüteten Gänseeiern oder auf Wassergeflügel-Fibroblastenkulturen vermehrt und |[c) das Zellmaterial zerkleinert und durch Zentrifugieren abtrennt und die überstehende Flüssigkeit in üblicher Weise konfektioniert.

2. Verfahren zur Herstellung einer Totvakzine gegen Gänsehepatitis bei Wassergeflügel, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Anspruch 1 erhaltene virushaltige Flüssigkeit durch Zentrifugieren auf die zehnfache Konzentration bringt und durch Zusatz von /9-Propiolacton inaktiviert.

3. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur passiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß man Gänse mit dem nach Anspruch 1 erhaltenen Impfstoff immunisiert und das Serum gewinnt, mit Konservierungsstoffen versetzt und anschließend steril filtriert.

4. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur passiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß man Geflügel oder Säugetiere mit einem Viruskonzentrat immunisiert, das durch Mischen der klarzentrifugierten virushaltigen Suspension nach Anspruch 1 mit einem niederen Chlorfluorkohlenwasserstoff im Verhältnis 1 :1, Zentrifugieren und Präzipitieren des Virus aus der wäßrigen Phase erhalten worden ist, und daß man das Serum gewinnt, mit Konservierungsstoffen versetzt und steril filtriert.

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