DE2159588C2

DE2159588C2 - Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs für Rinder

Info

Publication number: DE2159588C2
Application number: DE2159588A
Authority: DE
Inventors: Judson Donald Overland Park Kan. Todd; Frank Jerry Volenec
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1970-12-03
Filing date: 1971-12-01
Publication date: 1985-07-04
Also published as: IL38213A0; DK135546C; FR2116501B1; DE2159588A1; CA960586A; SE397365B; DK135546B; NL7116196A; BE776079A; ZA717834B; CH571065A5; IE35826L; IL38213A; NL177182B; IE35826B1; FR2116501A1; NL177182C; JPS5531123B1; GB1373104A

Description

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der infektiöse Rinder-Rhinotrachealkatarrh (infectious bovine-rhinotracheitis=IBR) gilt als äußerst ansteckende, bei Rindern auftretende Viruserkrankung, die sich durch starke Entzündung der oberen Atmungswege und der Trachea äußert- Sie wird verursacht durch ein Virus, das mittels in der Luft befindlicher Tröpfchen in die Atmungswege der Tiere gelangt. Infiziertes Rindvieh kann Körpertemperaturen von 40° bis 41,7° C haben und an starker schleimiger Nasenabsonderung, an Depressionen, Appetitlosigkeit, erhöhter Atmungsfrequenz, schwerer Atmung und Husten leiden. Durch eine sekundäre Bronchopneumonie wird der Krankheitszustand gelegentlich noch kompliziert. Eine weitere schwerwiegende Folgeerscheinung einer solchen Infektion ist der Abort bei während der Trächtigkeit infizierten Tieren. Das IBR-Virus führt auch zu der als infektiöse pustulöse Vulvoganitis bekannten Erkrankung.

Wenn auch die Mortalität gering ist, d. h. nicht oft mehr als 5% beträgt, so ist doch die Morbidität relativ hoch, und da das IBR-Virus äußerst infektiös ist, kann eine ganze Herde dafür empfänglicher Rinder infiziert werden. Einen wichtigen Aspekt dieser Erkrankung bilden Gewichtsverlust und Zustandsverschlechterung von Mastvieh als Folge von Depressionen und Appetitlosigkeit, so daß diese Tiere viel länger gefüttert v. erden müssen, bevor sie auf den Markt gebracht werden können. Ein Ausfall der Milchproduktion bei Milchkuhherden ist eine weitere ernste Folge dieser Krankheit.

Man verfügt derzeit über mehrere wirksame Vakzine zur Immunisierung von Rindern gegen das IBR-Virus. und es wurden eine Reihe von Patentschriften auf Verfahren zur Herstellung solcher Vakzine erteilt. So beschreibt z.B. die US-PS 29 34 473 ein Verfahren zur Modifizierung des IBR-Virus durch rasches serienweises Einbringen des Virus in Rindergewebekulturen, bis das Virus so modifiziert ist. daß es nach Injektion in normale Rinder keine Erkrankungen mehr hervorrufen soll.

Die US-PS 29 41 925 offenbart ein Verfahren zur Modifizierung des IBR-Virus durch Passagieren in Schweinenierenge*vebekulturen, wodurch ein Vakzin gewonnen wird, das nach parenteraler Inokulation empfängliche Kälber gegen die Krankheit schützt.

Die US-PS 30 48 524 beschreibt ein· Verfahren zur Attenuierung des IBR-Virus durch serienweisen, mindestens zehnmaligen Durchgang dieses Virus durch Hundegewebekulturen. Das aus diesem abgeschwächten Virus hergestellte Vakzin soll nach Injektion in Rinder stimulierend auf die Antikörperreaktion wirken.

In der US-PS 33 66 543 wird eine zweimalige Passage des Virus in Rindemierenzellkulturen, gefolgt von 6 bis 16 Passagen in Kaninchennierengewebekulturen gelehrt, wobei eine Vakzine erhalten wird, deren Anwendung zu einer schlechteren Abort-Rate führt als diejenige, die bei virulenten IBR-Feldstämmen gefunden wird. Ein Vergleich dieses Impfstoffes mit dem der vorliegenden Erfindung wird weiter unten beschrieben.

Wenn auch die obengenannten abgeschwächten IBR-Virusstämme nach intramuskulärer Injektion die Ausbildung von schützenden Antikörpern bei Rindern stimulieren und wenn sie auch wirksame Vakzine zur Verhütung erkennbarer Erkrankungen bei ■c-mdsrn, die Feldstämmen des IBR-Virus ausgesetzt sind, darstellen, so sind doch die daraus hergestellten Impfstoffe nicht ohne Nachteile. So wurde beispielsweise gefunden, daß das Vakzinvirus nicht ausreichend attenuiert sein kann und also dann auch keine vollkommene Sicherheit bei der intrasmuskulären Injektion bei Rindern zu bieten vermag und daß es für die intranasale Verabreichung wegen seines pathogenen Potentials kontraindiziert ist. Im Anschluß an eine intramuskuläre Injektion kann das Vakzinvirus im Sekret des Atmungstraktes geimpfter Tiere erscheinen, und dieses Virus kann in den Atmungstrakt nichtimmuner Rinder übertragen werden, die daraufhin eine Infektion mit den erwarteten klinischen Anzeichen dieser Erkrankung erleiden können. Es wird erwartet, daß ein Schutz gegen eine Bedrohung durch IBR-Viren 10 bis 14 Tage nach der intramuskulären Verabreichung des Impfstoffes eintritt, wobei ein solcher Schutz durch die Ausbildung spezifischer, zirkulierender Antikörper gewährt wird. Die Möglichkeit eines Aborts bei trächtigen Kühen ist so groß, daß Etiketten auf dem handelsüblichen Vakzin den Tierarzt vor der Verabreichung desselben an trächtige Tiere warnen. Daher ist es einleuchtend, daß ein Verfahren zum Herstellen eines stärker attenuierten, aber Sicherheit bietenden und wirksamen IBR-Impfstoffes verfügbar sein sollte. Dies ist Ziel und Zweck der Erfindung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffes für Rinder zum Schutz von Rindern gegen pathogene Stämme vom infektiösen Rinder-Rhinotrachealkatarrh-Virus (IBR-Virus) durch Passagieren des Virus in Rindemierenzellkulturen und Kaninchennierenzellkulturen und Aufbereiten .'js derart attenuierten Virus zu einem nasal verabreichbaren Lebend-ίπ'/ifstoff besteht nun darin, daß man pathogene Stämme vom IBR-Virus in mindestens 54 Reihenpassagen in Rindemierenzellkulturen, gefolgt von mindestens 23 Reihenpassagen in Kaninchennierenzellkulturen züchtet.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung geht man so vor. daß die aus der Virussuspension der Kaninchennierenpassage 18 attenuierten Viren bei der weiteren Attenuierung durch Klonierung ausgewählt wurden=

In der Regel werden Rinder auf intranasalem Weg mit den IBR-Viren infiziert, doch können, wie bereits ausgeführt, derzeit erhältliche Vakzine nicht in dieser Weise verwendet werden, da sie noch immer ein pathogenes Potential aufweisen. Derart geimpfte Rinder entwickeln sehr leicht klinische Anzeichen dieser Erkrankung mit all ihren schwerwiegenden Folgen einschließ-

lieh der InFizierung nichtimmuner Tiere, mit denen sie in Kontakt kommen. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte attenuierte Impfstoff führt nicht zu klinischen Krankheitszeichen, bewirkt aber dennoch die Induktion eines IBR-Antikörpertiters, der ebenso hoch oder gewöhnlich höher ist als bei intramuskulärer Impfung der Tiere mit den gegenwärtig verfügbaren, abgeschwächten IBR-Virusvakzinen.

Es werden auch eine Reihe anderer bedeutender Vorteile mit dem erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff erzielt So wird z. B. das Abortrisiko bei trächtigen Kühen durch dessen Verwendung ausgeschaltet oder wesentlich vermindert

Der erfindungsgemäß erhaltene Impfstoff bewirkt daß intranasal geimpftes Rindvieh durchschnittlich etwa 11 Tage lang Viren im Nasensekret ausscheidet wodurch nichtimmune Rinder, mit denen die geimpften Tiere in Berührung kommen, immunisiert werden. In dieser Weise infizierte Rinder entwickeln immune Antikörper und sind -"»sistent gegen einen Befall durch Feldstämme pathogener IBR-Viren. doch entwickeln sie keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung als Folge des Kontaktes mit intranasal geimpften Rindern. Kälber können bei ihren frisch geimpften Mutterkühen oder anderen geimpften Tieren belassen werden und können nach einem solchen Kontakt immun werden. Dies wäre nicht möglich, würden die Tiere mu einem der gegenwärtig erhältlichen, weniger stark abgeschwächten IBR-Vakzinen intramuskulär geimpft

Das mittels Kaninchennieren attenuierte IBR-Virus des erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffes kann mindestens fünfmal hintereinander von Rindern aufgenommen werden, ohne pa%hogen ^u werden und zur Erkrankung zu führen. Der Iiupfstoff behält dabei seine immunisierende Eigenschaft bei; Kä!' sr, die mit fünfmal hintereinander von Rindern aufgenommenen Viren intranasal geimpft wurden, waren infiziert, ohne jedoch klinische Erkrankungserscheinungen zu zeigen, und der Virustiter in ihrem Nasensekret war hoch. Die so geimpften Kälber entwickelten iO bis 14 Tage nach der Impfung hohe Titer zirkulierender Antikörper.

Es konnte nun festgestellt werden, daß die Schutzreaktion auf eine Virusinfektion nicht auf die Bildung von Antikörpern beschränkt ist, denn diese werden erst recht spät im Krankheitsverlauf nachweisbar. Es wurde gefunden, daß zusätzliche Abwehrmechanismen eintreten, die an den primären Infektionsstellen eingreifen, bei einer IBR-Infektion also an den Nasengangmembranen, und die einen unmittelbaren und direkteren Schutz bieten im Vergleich zu den Antikörpern, die einige Tage nach der Infektion gebildet werden. Zwei Mechanismen spielen sich am Infektionsort ab, nämlich das lokale Antikörpersystem und der lnferferonmecharismus. Zu den sekretorischen Antikörpern gehört die IgA-Reihe des Immunoglobulins: diese Antikörper werden lokal im Atmunpstrakt synthetisiert. Die Bildung dieser sekretorischen Antikörper wird nicht leicht durch parenterale Injektion eines Antigens aktiviert, wird aber durch lokale Verabreichung von IBR-Viren rasch herbeigeführt. Demnach antwortet der sekretorische Immunitätsmechanismus beim Rind nach einer lokalen Antigenstimu· lierung wirksamer als bei einer Antigeninjektion an einer entfernten Stelle. Die Freisetzung von Interferon gilt als eine der am frühesten nachweisbaren bilogischen Reaktionen auf eine Virusinfektion. Das Interferon unterdrückt die Virusreplikation. Eine frühe InterferonbÜ-dung am Ort der Infektion ist daher wichtig für die Zeit vor der Ausbildung ndäquater Mengen an schützenden Antikörpern im ganzen System des Tieres, Es wurde gefunden, daß eine intranasals Impfung der Rinder mit dem erfindungsgemäßen, durch Kaninchengewebekulturen geschwächten Virusvakzin zu einer frühzeitigen Interferonbildung in den Geweben des Atmungstrakts des entsprechenden Tieres führt und somit einen vorläufigen Schutz gegen Infektion bietet. Dies zeigte sich am Auftreten hoher Interferonspiegel im Nasensekret der Tiere innerhalb von 40 bis 72 Stunden nach der Imnfung.

Im Serum tritt ein niedrigerer Interferonspiegel auf. Man findet das Interferon in Flüssigkeiten des Atmungstrakts bis etwa 8 Tage nach erfolgter Impfung. Die intranasale Vakzination beim Rind führt um den 10. Tag zu einem feststellbare:) Titer an IBR-neutralisierenden Antikörpern im Serum und um den 14. Tag zu einem hohen Titer. Neutralisierende Antikörper zeigten sich um den 14. Tag im Nasensekret.

Die Interferonbildung nach Infizierung des Nasentraktes von Rindern mit IBR-Viren ist ein bedeutender Vorteil, den der erfindungsgemäße Impfstoff erbringt. Kälber, die intramuskulär mit einem durch Rindernieren abgeschwächten IBR-Virusvakzin geimpft wurden, entwickelten hingegen keine erkennbaren Mengen an Interferon im Nasensekret und nur wenig oder kein Interferon im Serum.

Die frühzeitige Interferonbildung, wie sie bei Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes eintritt, hat den besonderen Vorteil, daß sie einen Schutz für Kälber bietet, die zur Aufzucht mit vielen anderswoher stammenden Kälbern zusammengebracht werden. Die geimpften Kälber sind nicht nur gegen eine Infektion durch virulente Stämme des IBR-Virus geschützt, die die nichtgeimpften Kälber, mit denen Kontakt möglich ist, tragen können, sondern sie sind auch gegen andere Virusinfektionen geschützt, da nämlich das Interferon einen Schutz gegen Viren anderer Krankheiten ausübt.

Die mit dem erfindungsgemäßen Vakzin geimpften Kälber entwickeln also aktive Immunität gegen IBR und sind dadurch auch gegen eine Infektion durch Feldstämme von IBR und in einer gewissen \V.^vise auch gegen andere Viren geschützt Keinen solchen Schutz erfahren intramuskulär geimpfte Kälber. Wie vorstehend ausgeführt, liegt natürlich ein weiterer Vorteil darin, daß die hinzukommenden, nicht geimpften Kälber durch das mit der Nasenabsonderung der geimpften Kälber ausgeschiedene nichtpathogene IBR-Virus immunisiert werden können.

Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff wurde mit einer gemäß d*r US-PS 33 66 543 hergestellten Vakzine wie folgt verglichen:

1. Es wurde nach dem in der US-PS 33 6b 543 beschriebenen Verfahren eine verdünnte IBR-Virus-Vakzine wie folgt hergestellt: Ein Feldisolat von virulentem IBR-Virus wurde in seiner /weiten Passage in Zellkulturen von primärer Rinderniere (BK) von Dr. B. C. Easterday, Dept. of Vet. Science, Univ. of Wisconsin. Madison. Wisconsin, USA. erhalten. Der Virus wurde von Dr. Easterday aus nasalen Abstrichen von einer Kuh mit den klinischen Zeichen der Erkrankung der Atmungswege an IBR isoliert. Diese Kuh stammte aus einer kleinen Herde von etwa 30 Milchkühen, in der IBR ausgebrochen war, wobei die meisten der Kühe erkrankten, und etwa 20% davon abortierten. Dieser Virus wurde dann in primäre Kaninchennierenzellkulturen geimpft. Die Passagen wurden in primärer Kaninchenniere bis zur Beendigung der 16. Reihen-

passage fortgesetzt. Die Zeit des Auftretens eines zytopathischer Effekts in den IBR-infizierten Kaninchennierenzellkulturen wurde allmählich bis auf 2 bis 3 Tage nach der Beimpfung für Reihenpassagen herabgesetzt. Eine Prüfung der Passage !6 ergab einen Titer von 10"TCID50 von Kaninchenadaptiertem IBR-Virus pro Milliliter. Die gewonnene Flüssigkeit wurde in gefrorenem Zustand bei -70⁰C gelagert und als IBR-BK2-RK16 bezeichnet.

. Es wurde eine verdünnte IBR-Virus-Vakzine gemäß der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung P 21 59 588.0-41 in den ursprünglichen Unterlagen, Seite 9. Zeile 5, bis Seite 16, Zeile 21, hergestellt. Dieser Virus wurde dann eine zusätzliche Zeit in Kaninchennierenzellkulturen passagiert und stellte dann einen IBR-Virus dar. der 54 Passagen in Rindernierenzellkulturen und 23 Passagen in Kaninchennierenzellkulturen erfahren hatte. Diese gewonnene Flüssigkeit wurde bei -70⁰C gelagert und mit der Bezeichnung IBR-BK54-RK24 versehen.

Vier IBR-empfindliche (antikörpernecative), trächtige Kühe in ihrem dritten Trimester der Trächtigkeit wurden per Rektum untersucht, um die Gegenwart eines lebensfähigen Fötus nachzuweisen und das angenäherte Älter desselben zu bestimmen. Es wurde bei jeder Kuh festgestellt, daß sie einen lebenden Fötus mit einem Alter von annähernd 6 Monaten hatte. Jede Kuh wurde intranasal mit !.OmI von IBR-BK2-RK16-Virus unter Verwendung einer Spritze und nasaler Kunststoffröhren geimpft. Eine aus diesen vier Kühen abortierte z9 Tage nach der Impfung einen weiblichen Fötus von 35 Pfund. Eine zweite der Gruppe abortierte 32 Tage nach der Impfung einen männlichen Fötus von 40 Pfund. Eine dritte der Gruppe abortierte 41 Tage nach der Impfung einen männlichen Fötus von 51 Pfund. Die vierte Kuh brachte 85 Tage nach der Impfung ein normales Kalb zur Welt. Die Autopsie /--gab bei allen abortierten Föten einen erheblichen Gehalt an serös-blutiger Flüssigkeit in den Brusträumen, den Perikardial- und Bauchhöhlen, ferner kollabierte, nichtbeatmete Lungen und ieweils eine kupferfarbene bröckelige Leber mit einigen wenigen weißen Herden auf der Oberfläche. Die fötalen Gewebe wurdei. verarbeitet und für eine versuchte Virusisolierung in Rindernierenzeil kulturen eingeimpft, und es wurde ein typischer IBR-Virus-zytopathischer Effekt in Kulturen erhalten, die mit (1) Nhgenflüssigkeit von dem ersten abortierten Fötus und (2) Brustraumflüssigkeit von dem zweiten abort.erten Fötus beimpft worden waren. Die Identität des Virusisolats wurde als IBR durch Neutralisation mit spezifischem IBR-Immunserum bestä.igt. IBR-Virus wurde durch zwei Passagen von Brustraumflüssigkeit. Magenflüssigkeit und Milz-, Leber- und Lungengewebe des dritten abortierten Fötus nicht isoliert.
Einhundertsiebenundfünfzig (157) trächtige Kühe, von denen 132 IBR-ernpfindlich waren, wurden in allen Stufen der Trächtigkeit per Rektum untersucht, um das annähernde Alter des Fötus zu bestimmen. Jede Kuh wurde intranasal mit 0,1 ml IBR-BK54-RK24-Virus mittels einer Spritze und nasalen Kunststoffröhren in beide Nüstern geimpft. Von 157 trächtigen Kühen in der Gruppe denen man das IBR-BK54-RK24-Virus-Vakzin verab-

reicht hatte, abortierten 4 Stück innerhalb von 90 Tagen nach der Impfung. Kulturen der Inhalte der Blättermägen ergaben keine pa:hogenen Organismen. Bei der Autopsie wurden keine Makroschäden in den Föten festgestellt. Von den vier Tieren, die innerhalb von 90 Tagen nach der Impfung abortierten, waren 3 seronegativ für IBR, nachdem sie geimpft waren, und entwickelten anschließend An tikörper. Eines hatte IBR-Antikörper. nachdem es geimpft war.

Nachfolgend wird die Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes im einzelnen geschildert. Hierbei werden übliche Gewebekulturmethoden herangezogen,

wobei die Zusammensetzung der Kulturmedien, der Züchtungsmethoden und dergleichen variiert werden können. Beispielsweise werden Nierengewebe bevorzugt als Zellen, auf denen das IBP.-Virus gezüchtet und atturemert wird, herangezogen, doch können auch ZeI-

len von anderen Organen dieser Tiere verwendet werden. Für Gewebekulturverfahrer
doch am besten geeignet, da

ind Nierenzellen jes..'h unter in vitro-Sc-

I^T <J - - — -» — —· w . w v**«· UIIkWI IAl VIII \J LJ \^

dingungen besser als die meisten anderen Zellen zu entwickeln scheinen.

Das im folgenden Verfahren verwendete IBR-Virus wurde von Dr. Charles York, Veterinary Research Laboraiory, Agricultural Experiment Station, Montana State College. Bozeman, Montana, erhalten. Dieses Virus war serienmäßig 41 mal durch Rindernierenzellkultüren hindurchgegangen.

Nach Anwendung dieses Virus auf den Nasengang von Kälbern entwickelten letztere klinische Anzeichen des infektiösen Rinder-Rhinotrachealkararrhs. Es eignete sich nicht zur Verwendung als intranasaler Impfstoff

ohne eine weitere Modifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung.

Dem Fachmann ist bekannt, daß zahlreiche Stämme des pathogenen IBR-Virus. die sich in Rindergewebekulturen entwickeln, leicht erhältlich sind. Diese verschiedenen Stämme können im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Propagation des IBR-Virus in Rinderzellen

Zellkulturen boviner embryonaler Nieren wurden nach folgenden Standardverfahren hergestellt: Drei bis sechs Monate alten Embryos aus gesunden Kühen wur den die Nieren aseptisch entnommen, und Nierenrinde und Mark wurden in kleine Segmente zerkleinert. Unter ständigem Rühren wurden diese Segmente einer Lösung von 0.:>5% Trypsin in Earles basischer Salzlösung bei einer Temperatur von 37⁰C ausgesetzt, bis die Zellen ditpergiert waren. Die Suspension wurde 10 Minuten bei 4°C mit 1000 Umdrehungen/Min, zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die sedimeritierten Zellen wurden in einem FntwicklungMnedium nachstehender Zusammensetzung auf eine Endvolumenkonzentration von 1 : 200 erneut suspendiert:

Im Gleichgewicht befindliche
Salzlösung nach Earle
Lactalbumin-hydrolysat,
5%ige (Gew./Vol.)
wäßrige Lösung
Filtriertes Rinderserum
Polymyxin B
Neomycinsulfat
Amphotericin B

80%

10%

100 Einheiten/ml 100μg/ml 1 μg/ml

In eine Reihe von Poviisky-Gewebekulturflaschen wurden jeweils 500 ml dieser Zellsuspension gebracht. Die Flaschen wurden bei 37° inkubiert, bis zusammenwachsende Monoschichten von Zellen die Bodenfläche bedeckten (4 bis 6 Tage). Dann wurde das Entwicklungsmedium (maintenance medium) entfernt und durch ein Erhaltungsmedium folgender Zusammensetzung ersetzt:

Bestandteile

mg/Liter

Im Gleichgewicht befindliche
Salzlosung nach Earle
Lactalbumin-hydrolysat.
5%ige(GewVVol.)
wäßrige Lösung
Filtriertes Rinderserum
Polymyxin B
Neomycinsulfat
Amphotericin B

88%

10%
2%

100 Einheiten/ml 100 ng/ml
1 us/ml

Eagles Minimum Essential	80%
Medium*)
Lactalbumin-hydrolysat,
5°/oige(Gew./VoI.)	10%
wäßrige Lösung	10%
Fötales Rinderserum**)	100 Einheiten/ml
Penicillin	100μg/mI
Streptomycinsulfat	1 ug/ml
Amphotericin B

*) üteraturhmweis — Eagle, H : Science 130:432.1959.
**) Das fötale Rinderserum wurde eine Stunde bei 56° C wärmeinaktiviert und durch Filtration durch ein 220-n^-MembranfiIter sterilisiert

In eine Reihe von Povitsky-Gewebekulturflaschen wurden je 300 ml Zellsuspension gebracht Die Flaschen wurden dann bei 37° C inkubiert, bis sich auf den Bodenfiächen zusammenwachsende Monoschichten der Zellen bildeten (5 bis 6 Tage). Zu diesem Zeitpunkt wurde das Entwicklungsmedium entfernt und durch 50 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung ersetzt:

NaCI

KCI

Dextrose

NaHCOj

Trypsin (1 :250)

EDTA

Anschließend wurde jede dieser Flaschen mit einer 1 :80 bis 1 : 500-Verdünnung des in Rinderniercngewebekulturen propagierten IBR-York-Virus (US-Patentschrift 29 23 473) beimpft und inkubiert, bis 95—100% der Zellen Veränderungen aufwiesen, wie sie für eine Infektion charakteristisch sind (drei bis fünf Tage). Dann wurden Flüssigkeiten gewonnen, die den Durchgang beendeten. Dieses Verfahren wurde dreizehnmal wiederholt.

Präparation von Kaninchennierenzellen

4 bis 6 Wochen alten weißen Neu-Seeland-Kaninchen wurden die Nieren aseptisch entnommen. Rinde und Mark wurden aseptisch in kleine Segmente zerteilt; diese brachte man in eine Lösung, die 0,25% Trypsin in im Gleichgewicht befindlicher Salzlösung nach Earle enthielt. Dieses Gemisch wurde unter ständigem Rühren bei 37° C inkubiert, bis die Zellen dispergiert waren. Die Zellsuspension wurde dann 10 Minuten bei 4°C mit 1000 Umdrehungen/Min, zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die sedimentierten Zellen wurden mit einer Volumen-Konzentration von 1 :200 in einem Kaninchennieren-Entwicklungsmedium folgender Zusammensetzung erneut suspendiert:

8000,0 400,0

1000,0 580,0 500,0 200,0

Die Flaschen wurden 30 Minuten bei 37 C inkubiert, wodurch eine Abtrennung von Zellen von der Glasfläche und eine Zelldispersion erreicht wurden. Die Zellsuspension wurde 10 Minuten bei 4"C mit 1000 Umdrehungen/Min. zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die sedimentierten Zellen wurden mit einer Volumenkonzentration von 1 :400 in Kaninchennieren-Entwicklungsmedinm (wir nh?n formui'er!) erneu! suspendiert. In mehrere, für Gewebekultur vorgesehene 1-1-Rollflaschen (roller bottles) wurden jeweils 150 ml dieser Suspension gebracht. Die Flaschen wurden bei 37° C auf einer Rollentrommel-Vorrichtung, die alle zwei Minuten eine Umdrehung ausführte, inkubiert. Die Inkubation wurde fortgesetzt, bis sich zusammenwachsende Monoschichten von Zellen bildeten (2 bis 3 Tage). Zu diesem Zeitpunkt wurde das Entwickiungsmedium entfernt und lurch ein Erhaltungsmedium aus im Gleichgewicht befindlicher Salzlösung nach Earle mit 0.5% Lactalbumin-hydrolysat und 2% fötalem Serum, ergänzt durch 100 Einheiten Penicillin. 100 Mikrogramm (meg) Streptomycinsulfat und 1 μg Amphotericin B pro Milliliter, ersetzt. Anschließend wurde das Virus-Inokulum in einer Verdünnung von 1 :100 dem Erhaltungsmedium in den Rollflaschen zugesetzt, um die Zellen damit zu infizieren.

Beimpfung von Kaninchennierenzellen
mit IBR-Virus

Die erste Rollflasche mit Kaninchennierenzellen wurde mit der 54. IBR-Viruspassage durch Rindernierenzellkulturen beimpft. Das Volumen des Inokulums betrug 1,0 ml, worin etwa logio 6,5 Mittelgewebekultur-Erregerteilchen/ml enthalten waren. Zwei Tage später wurde die Virusausbeute aus diesem Inoculum gewonnen. Der Gewinnungszeitpunkt für diese sowie für alle weiteren Passagen wurde anhand der Stärke des cytophatischen Effektes (CPE), den man in den Zellen der Kaninchennieren-Monoschicht feststellte, ermittelt. Die Viren wurden gewonnen (harvested), als sich 95—100% der Zellen von der Glasfläche gelöst hatten und/oder morphologische Veränderungen zeigten, wie sie für eine fortschrittene Infektion mit IBR-Viren charakteristisch sind. Diese Bedingungen waren normalerweise 48 bis 72 Stunden nach Inokulation des Virus in die Rollflaschen erfüllt Somit erfolgte die Gewinnung 48 bis 72 Stunden nach der Inokulation bei allen aufeinanderfolgenden Passagen mit Ausnahme der Passagen 19 und 20. Diese beiden Passagen wurden etwa 30 Stunden nach der Inokuiation gewonnen. Es lag kein bedeutender Unterschied vor zwischen den Virusausbeuten bei 30,48 oder 72 Stunden nach erfolgter Inokulation, solange die obengenannten Kriterien für die CPE-Ermittlung erfüllt waren.

Die Passagen 1 bis 4 (Kaninchennieren 1 bis 4) erfolgten hintereinander, wobei die Kaninchennierenzellen einer Rollflasche für die nächste Passage direkt mit dem aus der vorangehenden Passage gewonnenen Material

geimpft wurden. Das Volumen des Inokulums war für jede Passage dasselbe, nämlich 5,0 ml.

Das aus der Kaninchennieren-Passage 4 gewonnene Virusmaterial wurde in Mengen von 4,0 ml in Glasphiolen gebracht, dicht verschlossen und bei —65°C eingefroren. Das Material wurde 60 Tage in diesem gefrorenen Zustand gehalten, dann aufgetaut und als Inokulum für Kaninchenniere 5 verwendet. Die serienmäßigen Passagen der Kaninchennieren 5 bis 17 erfolgten wie vorstehend für diejenigen der Kaninchennieren 1 bis 4 beschrieben. Das Virus aus der Kaninclionnieren-Passage 17 wurde nach obiger Beschreibung eingefroren und 7 Wochen in diesem Zustand gehalten, dann aufgetaut und zur Beimpfung einer Rollflaschen-Kultur von Kaninchennierenzellen zur Herstellung der Kaninchennieren-Passage 18 verwendet. Die so erhaltene Kaninchennieren-Passage 18 wurde gewonnen und wie oben beschrieben eingefroren.

Gewinnung von Klonen in Endverdünnung
(terminal dilution cloning)

Aus der Virussuspension der Kaninchennieren-Passage 18 wurden serienmäßige Zehnfachverdünnungen von logio (- 1) bis log,₀ (-8) hergestellt. Mit je 0,1 ml jeder Verdünnung von logio (-4) bis logio (-8) wurden zehn für die Gewebekultur verwendete, lbxlSOmm messende Glasröhrchen beimpft, die Monoschichten aus Kaninchennierenzellen enthielten, die wie die Zellen in den Rollflaschen hergestellt worden waren, nur wurden die Röhrchen in stationär angeordneten Ständern mit einem von der Horizontalen aus gemessenen Winkel von 5° inkubiert. Die beimpften Röhrchen wurden 6 Tage bei 37° C inkubiert. Danach wurde ein Röhrchen, das bei der höchsten, zu Röhrchen mit positiven Werten (tubes) führenden Verdünnung (logio (-5)) charakteristische cytophatische Zeüvsränderungen zeigte, gewonnen, und die gewonnene Flüssigkeit wurde in vorstehend beschriebener Weise in serienmäßigen Zehnfachverdünnungen verdünnt, wobei jede Verdünnung von logio ( -4) bis logio (- 8) in einer Menge von 0,1 ml zur Inokulierung von je einem von zehn 16 χ 150mm-Röhrchen, die Monoschichten von Kaninchennierenzellen enthielten, verwendet wurde. Die erste Gewinnung des Virus aus dem einen Röhrchen (bei 10"⁵) ergab Klon Nr. 1 in Endverdünnung, der die Bezeichnung Virus der Kaninchennieren-Passage 19 erhielt Das Verfahren zur Klongewinnung in Endverdünnung wurde dreimal hintereinander durchgeführt Das Klonvirus Nr. 2 in Endverdünnung wurde nach einer im Anschluß an die Inokulation durchgeführten fünftägigen Inkubation gewonnen und als IBR-Virus der Kaninchennieren-Passage 20 bezeichnet Nach Wiederholung des Verfahrens erhielt man das Klonvirus Nr. 3 in Endverdünnung, also das Virus der Kaninchennieren-Passage 21.

Vakzinherstellung

Das Virus der Kaninchennieren-Passage 21 (Klon Nr. 3 in Endverdünnung) wurde in einem 1,0 ml-Volumen in eine Gewebekulturflasche aus Polystyrol, die eine wie vorstehend beschrieben hergestellte Monoschicht aus Kaninchennierenzellen enthielt, inokuliert Die Bodenfläche der Flasche betrug 75 cm², das Volumen des Gewebekulnir-Erhaltungsmediums betrug 30 ml. Die Virusausbeute aus dieser Inokulation wurde nach 48 Stunden Inkubation bei 37° C gewonnen und als IBR-Virus der Kaninchennieren-Passage 22 bezeichnet Mit 10 ml des IBR-Virus der Kaninchennieren-Passage 22 wurde eine 10 I-Rollflasche inokuliert, die eine Monoschicht aus Kaninchennierenzellen enthielt, die wie diejenigen der I I-Rollflaschen hergestellt worden war, wobei allerdings für das Auswachsen 1000 ml suspendierte Kaninchennierenzellen anstelle der für die 1 I-Flaschen verwendeten 150 ml verwendet wurden. Die Virusausbeute aus dieser Inokulation wurde nach 30 Stunden Inkubation auf der Rollentrommelvorrichtung bei 37°C gewonnen. Es handelt sich hierbei um das IBR-Virus, das 54 Passagen in Rindernierenzellkulturen und 23 Passagen in Kaninchennierenzellkulturen erfahren hatte. Obiges Produkt, das den abgeschwächten Virus enthält, stellt das erfindungsgemäße Vakzin dar.

Stabilisierung des Virus

Das in vorstehend beschriebener Weise hergestellte Virus kann in aliquoter. Mengen verschiedene'' firöße in verschlossenen Glas- oder Polypropylenbehältern bei einer Temperatur von unter —40⁰C aufbewahrt oder durch Gefriertrocknung nach Zusatz eines Stabilisierungsgemisches geschützt werden. Stabilisierungskomponenten und Einzelheiten über die Gefriertrocknung {Lyophilisierung) werden nachstehend angegebett:

Stabilisator
Bestandteile

g/l

N-ZAminAS 100,0

Lactose 100,0

Dextran 40,0

Monokalium-L-Glutamat (Monohydrat) 1,0

Rinderalbumin V 10,0

Glutathion 0,4 Destilliertes Wasser, auffüllen auf 1,01

Ein Teil Stabilisator wurde mit drei Teilen Virussuspension vermischt

Der Ansatz mit stabilisiertem Virus wurde anschließend durch eine automatische Vorrichtung in Ampullen entsprechender Größe (z. B. Ampulle Nr. 103 mit 2 ml Füllung, Nr. 111 mit 4 ml Füllung oder Nr. 118 mit 8 ml Füllung) abgefüllt. Jede Ampulle wurde mit zur Lyophilisierung geeigneten Verschlüssen versehen, und dann wurden die Ampullenständer im Lyophilisierungsschrank auf unter —40° C gefroren. Haben Produkt und Schrank eine Temperatur von unter —40° C erreicht, dann wurde die Vakuumleitung zwischen der bei — 55° C arbeitenden Kühlvorrichtung und dem Schrank geöffnet, so daß die Lyophilisierung erfolgen kann. War das Gleichgewicht hergestellt und betrug der Dampfdruck im Schrank weniger als 100 μ, so wurde die Schranktemperatur allmählich stufenweise erhöht, wobei darauf zu achten war, daß diese Dampfdrücke 100 u nicht überschritten. Der vollständige Zyklus war beendet sobald die Produkt-Temperatur eine Stunde lang bei 25° C blieb. Der ganze Zyklus dauerte etwa 24 Stunden. Anschließend wurden Ampullenverschlüsse eingesetzt das Vakuum wurde entfernt und das Iyophilisierte Produkt entfernt Die Ampullen wurden dann automatisch mit Kappen versehen und gelagert

Impfverfahren

Dieses Vakzin wurde dadurch verabreicht daß etwa 0,5 bis 2,0 mi (more or less) Virussuspension, die minde-

11 12 I

stens Iogio4,0 Mittelgewebekultur-Erregerteilchen ent- gewebe — in 18 Kaninchennierengewebekulturen aushält (median tissue culture infective particles), direkt in reicht, um das Virus so abzuschwächen, daß es unbedie Nüstern (Schleimhäute der Nasengänge) einzelner denklich in den Nasentrakt von Kälbern instilliert wer-Rinder instilliert werden. Niedrigere Konzentrationen den kann, ohne daß diese die schwerwiegenderen klinides abgeschwächten Virus führten zu einer Immunitäts- 5 sehen Anzeichen der Krankheit entwickeln. Es ist möginduktion, nachdem sie auf den Nasentrakt von Kälbern lieh, daß weniger Passagen des Virus, so z. B. 15 serienängewendet wurden, doch entwickelten alle derart, also mäßige Passagen, ausreichend sein können. Andererz. B. mit 10³^²TCIDso-Konzentrationen des Virus, ge- seits kann eine fortgesetzte Passage des Virus in Kaninimpften Kälber keine ausreichenden Antikörper, um ei- chennieren-Gewebe zu einer Schwächung der Antigennem Befall durch virulente Feldstämme des IBR-Virus 10 Eigenschaften des Virus führen, so daß es sich nicht widerstehen zu können. Diese intranasale Instillation mehr für die Verwendung zur Vakzinherstellung eignet, kann mit Hilfe einer medizinischen für subkutane injek- Die Höchstzahl der serienmäßigen Passagen ist jedoch tion verwendete Standardspritze erfolgen, an der eine derzeit noch nicht genau ermittelt worden.
50,8 mm lange, am Ende mit drei winzigen Löchern versehene Wegwerfkanüle aus Kunststoff befestigt ist. 15
Nach anderen, wahlweise anzuwendenden Impfverfahren wird z. B. ein Aerosolspray in die Nüstern gesprüht
oder auch in einem Raum versprüht, in dem die Tiere
diesem dann so lange ausgesetzt werden, bis sie ausreichende Vn uMiiciigcii in die Nabciigäiige mhuiien haben. 20

Das modifizierte Virus kann in Form einer wäßrigen Suspension auf beide Nüstern des Rindes angewendet werden.

Im Hinblick auf die nachgewiesene Interferoninduktion, die in einem hohen Interferonspiegel im Nasensekret und mäßiger Konzentration im Serum resultiert, sollte eine Behandlung mit diesem Impfstoff eine Schutzwirkung unterschiedlicher Größenordnung gegenüber Viren aller Haupt-Virusgruppen erzielen. Viren der Gruppenklassifikationen arbovirus und myxovirus sprechen im allgemeinen sehr auf die Wirkungen von Interferon an. Rinderviren, die durch den Almungstrakt Zugang finden, sollten durch die im Atmungstraktsekret vorhandenen hohen Interferonspiegel am wirksamsten bekämpft werden. Hierzu gehören außer dem IBR-Virus Parainfluenza-Viren, Rhinoviren, Reoviren, das Virusdiarrhoe bei Rindern auslösende Virus, Adenoyirpn hei Rindern und möglicherweise die Maul- und Klauenseuche hervorrufende Viren. Es ist anzunehmen, daß ein derartiger Schutz so lange anhält, wie in Sekret und Serum Interferonspiegel bestehen, was etwa 6 bis 8 Tage der Fall ist.

Nach Abschwächung durch die oben beschriebene, serienmäßige Passage in Kaninchennierenzellkulturen kann das IBR-Virus mit anderen, in geeigneter Weise abgeschwächten Viruserregern (viral agents), die für die intranasale Impfung von Rindern Sicherheit bieten und wirksam sind, wie z. B. Parainfluenza 3, bovine Adenoviren, Reoviren und andere Viruserreger, gemischt werden, so daß ein multivalenter Impfstoff vorliegt, der nach intranasaler Anwendung auf die Nasengangmembranen von Rindern die Ausbildung von schützenden Antikörpern gegen die verschiedenen, im multivalenten Impfstoff enthaltenen Viruserreger einleitet

Die serienmäßige (serial) Passage von virulentem IBR-Virus in Rindergewebekulturen ist kein kritiscner Teil der Erfindung, und es ist kein Grund vorhanden, das Virus durch 50 oder mehr serienmäßige Passagen hindurchzuführen. Dadurch, daß das virulente Virus einer Reihenpassage in Rindergewebekulturen unterzogen wird, widersteht es leichter dem anschließenden Gewebezüchtungsprozeß im Kaninchengewebe. Auch geht während des Züchtungsprozesses im Rindergewebe etwas von der Virulenz verloren, und es ist wahrscheinlich, daß anschließend weniger Reihenpassagen in Kaninchengewebe erforderlich sind.

Es wurde gefunden, daß eine serienmäßige Passage des IBR-Virus — nach Züchtungsverfahren im Rinder-

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffes für Rinder zum Schutz von Rindern gegen pathogene Stämme von infektiösen Rinder-Rhinotrachealkatarrh-Virus (IBR-Virus) durch Passagieren des Virus in Rindemierenzellkulturen und Kaninchennierenzellkukuren und Aufbereiten des derart altenuierten Virus zu einem nasal verabreichbaren Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man pathogene Stämme vom IBR-Virus in mindestens 54 Reihenpassagen in Rindemierenzellkulturen, gefolgt von mindestens 23 Reihenpassagen in Kaninchennierenzellkulturen züchtet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus der Virurssuspension der Kaninchennierenpassage 18 attenuierten Viren bei der weiteren Attenuierung durch Klonierung ausgewählt wurden.