DE60226218T2

DE60226218T2 - Impfstoff gegen pferdeherpesvirus

Info

Publication number: DE60226218T2
Application number: DE60226218T
Authority: DE
Inventors: Mark W. St. Joseph MELLENCAMP
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2001-03-20
Filing date: 2002-01-23
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2022-01-24
Also published as: JP2007197470A; ATE392903T1; DK1372712T3; EP1923071B1; AR091235A2; ES2428664T3; WO2002074335A2; JP4668951B2; US7226604B2; US6803041B2; MXPA03008287A; EP1372712A2; WO2002074335A3; PT1372712E; AR032984A1; US20030206924A1; JP2004525923A; US20070196390A1; DE60226218D1; EP1923071A1

Description

Hintergrund
Respiratorische Krankheiten stellen die Hauptursache von wirtschaftlichen Verlusten in der Pferdehaltung dar. Equine Herpesviren (EHV), equine Influenzaviren (EIV) und das Bakterium Streptococcus equi sind Pathogene, die sehr häufig in Verbindung mit infektiösen respiratorischen Krankheiten bei Pferden auftreten. Weltweit stellen equine Herpesviren die hauptsächlichen Pathogene in Verbindung mit der Morbidität bei Pferden als Folge einer respiratorischen Infektion dar. Sowohl equines Herpesvirus vom Typ 1 (EHV-1) als auch vom Typ 4 (EHV-4) können eine respiratorische Krankheit verursachen. EHV-1 steht auch in Verbindung mit Aborten und neurologischen Krankheiten. Aufgrund der weitgehenden Mobilität und der internationalen Ausrichtung in der Pferdeindustrie werden wirksame Impfstoffe benötigt, um die Krankheit einzudämmen und die Ausbreitung dieser Pathogene zu bekämpfen.
Eine Anzahl von EHV-Vaccinen sind im Handel erhältlich. Jedoch ist kein Impfstoff allgemein dazu in der Lage, einen lang anhaltenden Schutz zu verleihen. Bei den meisten Impfstoffen sind häufige Auffrischungsimmunisierungen erforderlich, um einen signifikanten Schutz gegen EHV-Infektionen zu erreichen. Der am häufigsten empfohlene Verabreichungsweg ist eine intramuskuläre Injektion, obgleich in zahlreichen Fällen das respiratorische System die primäre Infektionsstelle darstellt. Ferner wurde berichtet, dass bei einigen handelsüblichen Impfstoffen unerwünschte Nebenwirkungen hervorgerufen werden. Es wird über eine Anzahl von Versuchen zur Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffes für EHV berichtet. Dieser Weg hat jedoch noch nicht zur Einführung eines im Handel erhältlichen rekombinanten Impfstoffes geführt, der breite Anerkennung gefunden hätte.
In der Literatur wird übereinstimmend über einen hohen Grad der Variabilität in Bezug auf das Vermögen von Impfstoffen, auf der Grundlage von EHV-1-Stämmen eine Kreuzschutzwirkung gegen Infektionen durch EHV-4-Stämme zu erzielen, berichtet. EP-0 978 286 und EP-0 532 833 beschreiben Impfstoffzusammensetzungen, die den inaktivierten, zytopathischen EHV-1-Stamm AB69 bzw. den virulenten EHV-1-Stamm DA35 enthalten, und zwar jeweils unter Verwendung eines vernetzten, olefinisch ungesättigten Carbonsäurepolymeren als Adjuvans. Die Verwendung von durch Wärmeeinwirkung abgetötetem EHV-1-KyA-Virus ist aus Zhang et al. (Virology, Bd. 268 (2000), S. 482–492) bekannt. Während von Impfstoffen auf der Grundlage von EHV-4-Stämmen gezeigt worden ist, dass sie eine größere Eignung zur Erzielung eines gewissen Schutzes sowohl gegen EHV-1- als auch gegen EHV-4-Stämme zeigen, wurde auch berichtet, dass die Kreuzschutzwirkung auf der Grundlage von EHV-4-Stämmen sich als variabel erweist.
Demzufolge besteht nach wie vor ein Bedürfnis zur Entwicklung von weiteren Impfstoffen, die zum Schutz von Pferden gegen Krankheiten in Verbindung mit EHV-1 und/oder EHV-4 befähigt sind. Ferner wäre es vorteilhaft, einen Impfstoff zu entwickeln, der gegen EHV-1 und/oder EHV-4 wirksam ist und der intranasal sowie durch parenterale Verfahren (z. B. intramuskulär, subkutan oder intravenös) verabreicht werden kann.
Zusammenfassende Darstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft immunogene Zusammensetzungen, die chemisch inaktiviertes EHV-1-KyA-Virus und ein Adjuvans, das ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres umfasst, enthalten. Insbesondere wird anmeldungsgemäß ein Impfstoff zum Schutz von Pferden gegen Krankheiten in Verbindung mit EHV-1 und/oder EHV-4 bereitgestellt. Der Impfstoff kann auch weitere Komponenten enthalten, z. B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren und Antigene gegen andere equine Pathogene. Typischerweise sind die Antigene gegen andere equine Pathogene ebenfalls in inaktivierter Form vorhanden, z. B. inaktivierte Formen von EHV-4 und inaktivierte Stämme von equinem Influenza-Virus ("EIV"). Beispielsweise kann es sich beim Impfstoff um einen Kombinationsimpfstoff handeln, der inaktivierte Formen von A1- und/oder A2-Stämmen von equinem Influenzavirus neben dem inaktivierten EHV-1 enthält. Zu Beispielen für geeignete Antigene gegen EIV gehören der inaktivierte EIV-A1-Virusstamm A/EQ1/Newmarket/77, der inaktivierte EIV-A2-Virusstamm Newmarket/2/93 und der inaktivierte EIV-A2-Virusstamm Kentucky/95.
Die Ausdrücke "Impfstoff" und "immunogene Zusammensetzung" sind hier weit auszulegen und beziehen sich auf beliebige Typen von biologischen Mitteln in verabreichungsfähiger Form, die dazu befähigt sind, bei einem mit dem Impfstoff inokulierten Tier eine Immunantwort zu stimulieren. Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Impfstoff (immunogene Zusammensetzung) typischerweise das virale Agens in inaktivierter Form. Impfstoffe können im Allgemeinen entweder auf dem Virus selbst oder auf einer immunogenen (antigenen) Komponente des Virus beruhen. Der hier in Verbindung mit einem Impfstoff verwendete Ausdruck "Schutz" bezieht sich auf eine Besserung (entweder partiell oder vollständig) beliebiger Symptome in Verbindung mit den in Frage stehenden Krankheiten oder Zuständen. Somit führt ein Schutz von Pferden vor EHV durch die vorliegenden Impfstoffe im Allgemeinen zu einer Verringerung des Virusausstoßes und/oder zu einer Verringerung von einem oder mehreren der klinischen Symptome in Verbindung mit Infektionen durch EHV-1 und/oder EHV-4 (z. B. Pyrexie, nasale Absonderungen, Konjunktivitis, Husten, Atemnot, Mattheit und antibiotische Behandlungen, die bei sekundären bakteriellen Infektionen erforderlich sind).
Die vorliegenden immunogenen Zusammensetzungen umfassen chemisch inaktiviertes EHV-1-KyA-Virus. Verschiedene chemische Inaktivierungsmittel, die dem Fachmann geläufig sind, können zur Inaktivierung des Virus verwendet werden. Ethylenimin und verwandte Derivate, wie binäres Ethylenimin ("BEI") und Acetylethylenimin, stellen Beispiele für geeignete chemische Inaktivierungsmittel zur Verwendung bei der Inaktivierung des EHV-1-Virus dar. Weitere chemische Inaktivierungsmittel, z. B. β-Propiolacton oder Aldehyde (wie Formaldehyd und Glutaraldehyd) können ebenfalls zur Inaktivierung des Virus verwendet werden.
Die vorliegenden Impfstoffe umfassen ein Adjuvans, bei dem bioadhäsive Eigenschaften erwünscht sind, insbesondere wenn das Virus so konzipiert ist, dass es für die intranasale Verabreichung geeignet ist, wobei es sich bei den Adjuvantien um vernetzte, olefinisch ungesättigte Carbonsäure-Polymere, wie vernetzte Acrylsäure-Polymere, handelt. Der hier verwendete Ausdruck "vernetztes Acrylsäure-Polymeres" bezieht sich auf Polymere und Copolymere, die aus einem Monomergemisch gebildet worden sind, das Acrylsäure als überwiegendes Monomeres im Gemisch enthält. Zu Beispielen für geeignete vernetzte Acrylsäure-Polymere gehören die handelsüblichen Produkte mit den Handelsbezeichnungen Carbopol^R 934P und Carbopol^R 971 (erhältlich von der Fa. B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio). Ein für die Verwendung in den vorliegenden Impfstoffen besonders geeignetes Adjuvans ist das vernetzte Acrylsäure-Polymere mit einer Brookfield-Viskosität von nicht mehr als etwa 20 000 cPs (gemessen bei 20 U/min in Form einer 1,0 gew.-%igen wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,5). Sofern ein bioadhäsives Adjuvans erwünscht ist, kann es vorteilhaft sein, ein Adjuvans zu verwenden, das eine bioadhäsive Beschaffenheit von mindestens etwa 50 dyn/cm² aufweist, und zwar gemessen zwischen zwei Stücken von frisch herausgeschnittenem Kaninchen-Magengewebe (bestimmt gemäß dem im US-4 615 697 beschriebenen Verfahren).
Es wird die Verwendung des erfindungsgemäßen Impfstoffes zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz von Pferden gegen Krankheiten, die mit EHV-1 und/oder EHV-4 assoziiert sind, beschrieben, wobei der Impfstoff den Pferden zu verabreichen ist. Der Impfstoff kann unter Anwendung einer Vielzahl von Verfahren verabreicht werden, wozu die intranasale und/oder parenterale (z. B. intramuskuläre) Verabreichung gehören. Bei einer Ausführungsform der Verwendung wird der das inaktivierte EHV-1 enthaltende Impfstoff zunächst 1-mal oder mehrmals (z. in Abständen von 2–4 Wochen) intramuskulär verabreicht, woran sich eine mindestens einmalige intranasale Verabreichung des Impfstoffes anschließt (z. B. 2–4 Wochen nach der letzten parenteralen Verabreichung des Impfstoffes). Es wird empfohlen, den Impfstoff Pferden zu verabreichen, die ein Alter von 6 Monaten oder mehr aufweisen. Idealerweise werden sämtliche Pferde, die in einer Herde gehalten werden, jährlich geimpft, um sie gegen die Ausbreitung von respiratorischen Symptomen der Krankheit zu schützen.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines equinen Herpes-Virus-Impfstoffes bereitgestellt. Das Verfahren umfasst typischerweise das Inokulieren von Affenzellen mit EHV-1-KyA-Virus. Die inokulierten Affenzellen werden inkubiert, und zwar allgemein mindestens so lange, bis ein CPE beobachtet wird (üblicherweise nach 24 bis 120 Stunden bei 36°C). Anschließend wird das EHV-1-Virus aus den inkubierten Zellen geerntet (z. B. durch Dekantieren und Filtrieren der Kulturflüssigkeiten). Die geernteten, virushaltigen Flüssigkeiten werden mit einem chemischen Inaktivierungsmittel, wie binärem Ethylenimin, behandelt, um inaktiviertes EHV-1-Virus zu bilden, und das vernetzte Acrylsäure-Polymere wird als Adjuvans zugesetzt. Typischerweise wird das inaktivierte Virus weiter behandelt, z. B. durch Einengen und Vermischen mit anderen Komponenten, um eine kommerzielle Zubereitung herzustellen. Beispielsweise können die das inaktivierte Virus enthaltenden Flüssigkeiten eingeengt und mit Antigenen gegen ein oder mehr andere equine Pathogene vermischt werden.
Die vorliegende Anmeldung ist auch auf ein Kit abgestellt, das eine Kombination folgender Bestandteile enthält: (1) eine Abgabeeinrichtung, die zur Verabreichung eines Impfstoffes an ein Pferd befähigt ist; und (2) einen Impfstoff, der chemisch inaktiviertes EHV-1-KyA-Virus und ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres enthält und der zum Schutz gegen Krankheiten, die mit EHV-1 und/oder EHV-4 assoziiert sind, befähigt ist. Das Kit kann eine Abgabeeinrichtung umfassen, die zum Abgeben ihres Inhalts in Form von Tröpfchen befähigt ist, z. B. in Form eines Aerosols, eines zerstäubten Sprühmittels und/oder von Flüssigkeitströpfchen, sowie eine Form des Impfstoffes, die zum Schützen gegen Krankheiten, die mit EHV-1 und/oder EHV-4 assoziiert sind, wenn die Verabreichung zumindest teilweise intranasal erfolgt.
In der gesamten Anmeldung bezieht sich der Text auf verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Zusammensetzungen und/oder der damit verwandten Verfahren. Die verschiedenen beschriebenen Ausführungsformen ergeben eine Vielzahl von erläuternden Beispielen und sind nicht als eine Beschränkung in Bezug auf andere Spezies anzusehen.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegenden immunogenen Zusammensetzungen umfassen eine chemisch inaktivierte Form von EHV-1-KyA-Virus. Die Impfstoffe sind so konzipiert, dass sie einen Schutz von Pferden gegen Krankheiten, die mit EHV-1 und/oder EHV-4 assoziiert sind, ergeben. Eine Vielzahl von chemischen Inaktivierungsmitteln, die dem Fachmann geläufig sind, können zur Inaktivierung des Virus verwendet werden. Ethylenimin und verwandte Derivate, wie binäres Ethylenimin ("BEI") und Acetylethylenimin, stellen Beispiele für geeignete chemische Inaktivierungsmittel zur Verwendung bei der Inaktivierung des EHV-1-Virus dar. Weitere chemische Inaktivierungsmittel, wie beta-Propiolacton, Aldehyde (wie Formaldehyd) und/oder Detergentien (z. B. Tween^R-Detergens, Triton^R X oder Alkyltrimethylammoniumsalze) können ebenfalls zur Inaktivierung des Virus verwendet werden. Die Inaktivierung kann nach üblichen Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, vorgenommen werden. Proben können in periodischen Zeitabständen entnommen und auf verbleibendes lebendes Virus getestet werden. Die Überwachung des zytopathischen Effekts auf eine geeignete Zelllinie und/oder eine Fluoreszenzfärbung mit einem geeigneten, spezifischen, monoklonalen Antikörper können zum Nachweis des Vorliegens von verbleibendem lebendem Virus herangezogen werden.
Die Inaktivierung mit BEI kann durch Vereinigen einer BEI-Vorratslösung (z. B. eine Lösung, die durch Zusetzen von 0,1–0,2 M 2-Bromethylamin-hydrobromid zu 0,1–0,2 N wässriger NaOH-Lösung gebildet worden ist) mit viralen Flüssigkeiten bis zu einer Endkonzentration von etwa 1–2 mM BEI erreicht werden. Die Inaktivierung wird üblicherweise durchgeführt, indem man das BEI-Virus-Gemisch unter konstantem Mischen 36–72 Stunden bei 35–40°C (z. B. 37°C) hält. Die Inaktivierung des Virus kann gestoppt werden, indem man eine Natriumthiosulfatlösung bis zu einer Endkonzentration, die über der BEI-Konzentration liegt (z. B. 2–3 mM Natriumthiosulfat bei 1–2 mM BEI-Lösungen), zusetzt, wonach man mehrere Stunden mischt.
Die vorliegenden immunogenen Zusammensetzungen umfassen ein Adjuvans und gegebenenfalls einen oder mehrere Emulgatoren, wie Tween^R-Detergens, die zusammen mit inaktivertem EHV-1 zugesetzt werden. Vernetzte, olefinisch ungesättigte Carbonsäure-Polymere, wie Carbopol^R 971-Polymer, werden als Adjuvantien in den vorliegenden immunogenen Zusammensetzungen mit inaktiviertem EHV-1 verwendet.
Ein Beispiel für ein derartiges Adjuvans ist ein olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres, das durch Umsetzung eines Monomergemisches, das ein oder mehr olefinisch ungesättigte Carbonsäure-Monomere (wie Acrylsäure und/oder Methacrylsäure) umfasst, mit einem Vernetzungsmittel hergestellt worden ist. Typischerweise handelt es sich bei mindestens etwa 90 Gew.-% des Monomergemisches um ein olefinisch ungesättigtes Carboxylmonomeres. Das erhaltene Polymerprodukt enthält vorzugsweise nicht mehr als etwa 0,5 Gew.-% und insbesondere nicht mehr als etwa 0,2 Gew.-% nicht-umgesetztes, olefinisch ungesättigtes Carboxylmonomeres. Die Polymerisationsreaktion kann durch Umsetzung des Monomergemisches in Gegenwart eines Lösungsmittels, das aliphatische Ketone, Alkylester oder Gemische davon umfasst, durchgeführt werden. Zu geeigneten aliphatischen Ketonen gehören solche mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Aceton und Cyclohexanon (der hier verwendete Ausdruck "aliphatisches Keton" umfasst cycloaliphatische Ketone). Zu Beispielen für geeignete Alkylester gehören solche mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Ethylacetat, Ethylformiat, Isopropylacetat, n-Propylacetat, Butylacetat oder ein Gemisch davon.
Geeignete, olefinisch ungesättigte Adjuvanzien auf der Basis des Carbonsäure-Polymeren weisen vorzugsweise eine Brookfield-Viskosität von nicht mehr als etwa 40 000 cPs auf (bei 20 U/min in Form einer 0,5 gew.-%igen wässrigen Lösung vom pH-Wert 7,5). Zu besonders geeigneten Beispielen gehören olefinisch ungesättigte Carbonsäure-Polymere mit einer Viskosität von nicht mehr als etwa 15 000 cPs und insbesondere von etwa 4 000–11 000 cPs (bei 20 U/min in Form einer 0,5 gew.-%igen Lösung vom pH-Wert 7,5).
Ein Beispiel für ein geeignetes Adjuvans umfasst ein vernetztes Acrylsäure-Polymeres, das aus einem Monomergemisch, das Acrylsäure und ein Vernetzungsmittel umfasst, gebildet worden ist. Das Vernetzungsmittel kann ein Polyalkenylpolyether-Vernetzungsmittel, wie Divinylglycol, umfassen. Zu Beispielen für geeignete Divinylalkohole gehören Allylsaccharose, Allylpentaerythrit, Polyalkylendioldiallylether mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 1 000, Trimethylolpropandiallylether und Gemische davon. Zu Beispielen für weitere geeignete Vernetzungsmittel gehören Divinylbenzol, N,N-Diallylacrylamid, 3,4-Dihydroxy-1,5-hexadien, 2,5-Dimethyl-1,5-hexadien und dergl.
Wenn der Impfstoff intranasal zu verabreichen ist, kann es vorteilhaft sein, ein Adjuvans zu verwenden, das in Bezug auf Schleimhautmembranen bioadhäsiv ist. Bioadhäsive Polymere weisen im Allgemeinen die Eigenschaft auf, dass sie an einer Schleimhautmembran in Augen, Nase, Mund, Magendarmtrakt, Vaginalhöhle und Rektumkanal haften können. Der Ausdruck "bioadhäsiv" kann breit als die Beschaffenheit eines Materials definiert werden, das an einer lebenden oder frisch abgetöteten biologischen Oberfläche, wie einer Schleimhautmembran oder einem Hautgewebe, haftet. Der hier verwendete Ausdruck "Bioadhäsion" wird zur Definition eines geeigneten bioadhäsiven Mittels herangezogen, das durch ein Verfahren getestet wird, bei dem die Kraft gemessen wird, die erforderlich ist, um zwei Schichten von frisch exzidiertem Kaninchen-Magengewebe, die mittels eines Klebstoffes aneinander haften, zu trennen. Unter Anwendung dieses Verfahrens kann ein bioadhäsives Mittel als ein Material definiert werden, bei dem eine Kraft von mindestens etwa 50 dyn/cm² erforderlich ist, um zwei aneinander haftende, frisch exzidierte Stücke von Kaninchen-Magengewebe zu trennen, wobei man sich des im US-Patent 4 615 697 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschriebenen Verfahrens bedient. Die Obergrenze für die Kraft, die zur Trennung von frisch exzidiertem Kaninchengewebe erforderlich ist, ist nicht genau bekannt, es wird aber angenommen, dass sie mindestens etwa 2 000 dyn/cm² beträgt.
Zu geeigneten Beispielen für Adjuvantien gehören vernetzte, olefinisch ungesättigte Carbonsäure-Polymere mit bioadhäsiven Eigenschaften (z. B. das Carbopol^R 971-Polymere, ein vernetztes Acrylsäure-Polymeres, Produkt der Fa. B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio). Bei Polyacrylsäuren dieses Typs handelt es sich im Allgemeinen um vernetzte, carboxyfunktionelle Polymere, die bestimmte Mengen an funktionellen Carboxylgruppen und Vernetzungsmittel enthalten. Derartige Polymere können ein bioadhäsives Mittel in der Weise darstellen, dass die Polymeren eine Haftung zwischen zwei Stücken von frisch exzidiertem Kaninchen-Magengewebe von mindestens 50 dyn/cm² (bei Messung gemäß US-4 615 697 ) aufweisen.
Im Allgemeinen ist es vorteilhaft, die vorliegenden Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheitsformen zuzubereiten, um eine einfache Verabreichung und eine gleichmäßige Dosierung zu erreichen. Der hier verwendete Ausdruck "Dosiseinheitsform" bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen für zu behandelnde Säugetiersubjekte geeignet sind. Jede Einheit enthält eine vorgegebene Menge des aktiven Materials, die so berechnet ist, dass die angestrebte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem benötigten pharmazeutischen Träger erzielt wird. Die Spezifikation für die Dosiseinheitsformen von inaktiviertem EHV-1 (sowie von inaktiviertem EHV-4 und/oder inaktiviertem EIV) werden unter anderem in Abhängigkeit von den folgenden Faktoren festgelegt: (a) die besonderen Eigenschaften des Wirkstoffes und der zu erzielende spezielle therapeutische Effekt; (b) die auf dem Gebiet der Zubereitung eines derartigen Wirkstoffes zur Behandlung der Krankheit naturgegebenen Einschränkungen; und (c) die Art der vorgesehenen Verabreichung der Dosiseinheitsform.
Der Hauptwirkstoff wird typischerweise für eine zweckmäßige und wirksame Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Träger zu einer Dosiseinheitsform gemäß den hier gemachten Angaben vermischt. Eine Dosiseinheitsform kann beispielsweise das EHV-1-Antigen in Mengen von 1 bis etwa 5 relativen Wirkungsstärkeeinheiten ("RPUs") enthalten. Diese Menge des Antigens ist im Allgemeinen in etwa 1 bis etwa 25 ml Träger enthalten. Im Fall von Zusammensetzungen mit einem Gehalt an zusätzlichen Wirkstoffen (z. B. inaktiviertem EIV und/oder inaktiviertem EHV-4) werden die Dosierungen unter Bezugnahme auf die übliche Dosis und die übliche Verabreichungsart der ergänzenden Wirkstoffe festgelegt.
Die vorliegenden Impfstoffe umfassen typischerweise inaktiviertes EHV-1, das mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zubereitet ist. Die pharmazeutischen Formen, die sich für Injektionszwecke eignen, umfassen üblicherweise sterile wässrige Lösungen (sofern Wasserlöslichkeit vorliegt) oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporierte Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Die Zubereitung soll vorzugsweise steril und so flüssig sein, dass sie leicht mit einer Spritze verabreicht werden kann. Die Dosierungsform soll unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und wird typischerweise gegen eine Verunreinigung durch Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, konserviert. Beim Träger kann es sich um ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium handeln, das beispielsweise Wasser, Ethanol, ein Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol und dergl.), geeignete Gemische davon und pflanzliche Öle enthält. Physiologische Kochsalzlösung stellt einen möglichen Träger dar. Die geeignete Fluidität der Lösung kann aufrechterhalten werden, indem man beispielsweise einen Überzug, wie Lecithin verwendet, indem man im Fall einer Dispersion die erforderliche Teilchengröße aufrechterhält und indem man oberflächenaktive Mittel verwendet. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel erreicht werden, z. B. durch Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal (Natriumethylquecksilberthiosalicylat), Deomycin, Gentamicin und dergl. In zahlreichen Fällen kann es bevorzugt sein, isotone Mittel, z. B. Zucker oder Natriumchlorid, zuzusetzen. Gegebenenfalls kann eine verzögerte Resorption der injizierbaren Zusammensetzungen erreicht werden, indem man in den Zusammensetzungen Mittel verwendet, die die Resorption verzögern, z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem man das inaktivierte Virus in der erwünschten Menge einem geeigneten Lösungsmittel je nach Bedarf zusammen mit verschiedenen anderen Bestandteilen, die vorstehend aufgeführt wurden, einverleibt, wonach sich eine Sterilfiltration anschließt. Im allgemeinen lassen sich Dispersionen herstellen, indem man die verschiedenen Wirkstoffe einem sterilen Träger einverleibt, der das Grunddispersionsmedium und die erforderlichen übrigen Bestandteile, die aus den vorenwähnten Bestandteilen ausgewählt sind, enthält. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen bestehen die bevorzugten Herstellungsverfahren in einer Vakuumtrocknungstechnik und einer Gefriertrocknungstechnik, durch die man aus einer vorher steril filtrierten Lösung ein Pulver aus dem Wirkstoff und etwaigen zusätzlichen erwünschten Bestandteilen erhält.
Ferner kann es vorteilhaft sein, den vorliegenden Zusammensetzungen einen Stabilisator zuzusetzen, um die Stabilität des inaktivierten Virus zu verbessern. Zu geeigneten Stabilisatoren gehören beispielsweise Glycerin/EDTA, Kohlenhydrate, wie Sorbit, Mannit, Trehalose, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glucose), Proteine (wie Albumin oder Casein) und Protein-Abbauprodukte (z. B. partiell hydrolysierte Gelatine). Gegebenenfalls kann die Zubereitung durch bekannte Verfahren gepuffert werden, wobei man Reagenzien, wie Alkalimetallphosphate, z. B. Natriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat und/oder Kaliumdihydrogenphosphat, verwendet. Weitere Lösungsmittel, wie Ethanol oder Propylenglycol, können verwendet werden, um die Löslichkeit von Wirkstoffen in der Impfstoffzubereitung und/oder die Stabilität der Lösung zu erhöhen. Weitere Additive, die in der vorliegenden Zubereitung verwendet werden können, umfassen herkömmliche Antioxidationsmittel und herkömmliche chelatbildende Mittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren werden durch die folgenden Beispiele erläutert, die dem Fachmann die Lehre bezüglich der Herstellungs- und Verwendungsverfahren erleichtern.
Beispiel 1 – Herstellung von Flüssigkeiten mit einem Gehalt an inaktiviertem EHV-1-Stamm
Zur Herstellung des equinen Rhinopneumonitis-Impfstoffes mit abgetötetem Virus wurde zunächst eine Master-Anzuchtkultur von EHV-1 hergestellt. Aus dieser Master-Anzuchtkultur wurde eine Kultur von EHV-1 gezüchtet und anschließend inaktiviert. Die inaktivierte Viruskultur wurde zur Herstellung des equinen Rhinopneumonitis-Impfstoffes mit einem Adjuvans vermischt. Das folgende Verfahren wurde zur Herstellung des equinen Rhinopneumonitis-Impfstoffes herangezogen.
Zur Herstellung der EHV-1-Master-Anzuchtviruskultur ("EHV-1 MSV") wurde der equine Herpesvirus-Stamm vom Typ 1 KyA (EHV-1-KyA) einer 4-maligen Passage an Vero-A139-Zellen und einer 4-maligen Passage an EVero-Zellen unterworfen. Die vierte Passage wurde als ein Master-Anzuchtvirus mit der Bezeichnung EHV-1-KyA, MSV-Charge 001-dil verwendet.
Aus dem Master-Anzuchtvirus wurde eine Kultur von EHV-1 durch Infektion von EVero-Zellen mit EHV-1-MSV in minimalem Essentialmedium ("MEM") mit einem Gehalt an 0 bis 5% Serum hergestellt. Das Kulturmedium wurde mit Gentamicin in einer zur Hemmung von Bakterienwachstum ausreichenden Menge versetzt. Die EVero-Zellen wurden typischerweise mit der EHV-1-MSV-Kultur mit einem angestrebten MOI-Wert ("multiplicity of infection") von 0,001 infiziert. Derartige Kulturen können in Glas-Rollflaschen oder an Mikroträgerperlen gezüchtet werden. Die Kultur wurde 24 bis 120 Stunden bei 36 ± 2°C gezüchtet, bis ein zytopathischer Effekt ("CPE") beobachtet wurde. Während der Inkubation wurde die Kultur auf EHV-induzierten CPE überwacht, um die Bildung eines reinen EHV-Stammes zu gewährleisten. Wenn ein atypischer CPE beobachtet wurde oder makroskopische oder mikroskopische Anzeichen einer Verunreinigung auftraten, wurde die Kultur verworfen. Die reine Viruskultur wurde aseptisch geerntet und in sterile Glasballons, sterile Kunststoffballons oder sterile Behälter aus rostfreiem Stahl gebracht und durch Filtration mit Filtern von 8 μm oder mehr geklärt. Flüssigkeiten mit der geernteten Virusmasse wurden getestet, um die Abwesenheit von Mycoplasma vor der Inaktivierung zu gewährleisten. Die geernteten Flüssigkeiten, die nicht sofort inaktiviert wurden, wurden bei –40°C oder darunter aufbewahrt.
Nach der Ernte wurde die Viruskultur inaktiviert, um einen abgetöteten Impfstoff herzustellen. Zur Inaktivierung des Virus wurde die Kulturtemperatur auf 36 ± 2°C gebracht. Anschließend wurde eine 0,2 M Lösung von 2-Bromethylenamin-hydrobromid zu binärem Ethylenimin ("BEI") in 0,15 M NaOH cyclisiert und zu der Kultur in einer Endkonzentration von 2 mM BEI gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde kontinuierlich 48 Stunden bei 36 ± 2°C gerührt.
Nach Behandlung mit BEI wurde die Kultur auf ihre Fähigkeit zur Induktion eines für EHV typischen CPE getestet, um die Inaktivierung des Virus zu gewährleisten, wobei man sich der in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehensweise bediente. Diese Aufgabe wurde erreicht, indem die mit BEI behandelten viralen Flüssigkeiten einer Passage über EVero-Zellen unterzogen wurden und die EVero-Zellen auf eine etwaige virale Infektion geprüft wurden. Die mit BEI behandelten Kulturflüssigkeiten wurden typischerweise bei 2–7°C oder darunter aufbewahrt, bis der Inaktivierungstest beendet war. Nachdem ein zufriedenstellender Inaktivierungstest keine virale Infektion mehr zeigte, wurde überschüssiges BEI durch Zugabe einer ausreichenden Menge einer kalten (4 ± 2°C) 1,0 M Natriumthiosulfatlösung in einer Endkonzentration von 6 mM neutralisiert.
Nach Inaktivieren und Testen der EHV-1-Kultur wurde die inaktivierte Kultur gegebenenfalls durch Ultrafiltration auf eine Konzentration eingeengt, die die Zubereitung eines Impfstoffes mit einer relativen Wirkungsstärke ("RP") für EHV-1 von mindestens 1,0, bestimmt durch den EHV-Wirkungsfreisetzungstest gemäß dem vorliegenden Beispiel 6, ermöglichte.
Das inaktivierte Virus wurde als ein mit Adjuvans versetzter Impfstoff zubereitet, indem man die inaktivierte EHV-1-Kultur gründlich mit Kochsalzlösung und einer 0,5% Vorratslösung des Adjuvans Carbopol^R 971 unter Bildung eines Serienmaterials vermischte. Ein typisches 60 Liter umfassendes Serienprodukt wurde hergestellt, indem man 3,5–4,0 Liter inaktivierte EHV-1-Kulturflüssigkeit, 12 Liter Carbopol^R 971-Vorratslösung und 44–44,5 Liter Kochsalzlösung vermischte. Das Serienmaterial wurde bei 2–8°C gehalten, bis es in Fläschchen mit einem Gehalt an entweder 1 oder 10 Dosen (2,2 ml pro Dosis) übertragen wurde. Jede Dosis des inaktivierten Impfstoffes enthielt mindestens einen 1,0 RP-Wert von inaktiviertem EHV-1, 2 mg Carbopol^R 971 und eine Restmenge an Gentamicin.
Beispiel 2 – Herstellung der Flüssigkeiten mit einem Gehalt an inaktivierten, equinen Influenza-Virus
Equiner Influenza-Virus – A/EQ1/Newmarket/77, Subtyp A1
Der MSV-Rec-ER1K-Subtyp A1 von equinem Influenza-Virus wurde bei der Wellcome Foundation Ltd., Beckenham, Kent, U. K., entwickelt. Der originale equine Stamm wurde einer 10-fachen Passage unterworfen, und zwar allein oder in Kombination mit A/Puerto Rico/8/34-Virus in speziellen, pathogenfreien (SPF) embryonisierten Eiern. Das erhaltene ER1K wurde weitere 7-mal in Vero-Gewebekultur passagiert, um MSV mit der Bezeichnung A/E/Newmarket/77 (Equi) (H7N7) RecER1K zu erhalten. Die Fa. Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (BIVI) erhielt das Virus von der Fa. Coopers Animal Health, Inc., Est. Lic. No. 107. Das Virus wurde 1-mal in der EVero-Zelllinie (Vero-Zelllinie, erhalten von Coopers Animal Health, wurde bei BIVI als EVero bezeichnet) bei BIVI passagiert, um das neue Master-Anzuchtvirus bereitzustellen. Das Master-Anzuchtvirus erhielt die Bezeichnung Lot 111795.
Equines Influenza-Virus – Newmarket/2/93, Subtyp A2
Der Newmarket/2/93-Subtyp A2 von equinem Influenza-Virus wurde von Dr. J. A. Mummford vom Animal Health Trust, P. O. Box 5, Newmarket, Suffolk, CB8 8JH, England, erhalten. Das Virus wurde von einem Pferd mit Rhinitis isoliert. Das Virus wurde 5-mal in speziellen, pathogenfreien (SPF) embryonisierten Hühnereiern passagiert und anschließend 5-mal in der Madin-Darby-Hundenieren (MDCK)-Zelllinie passagiert. Die fünfte Passage in MDCK-Zellen wurde als MSV bezeichnet. Das MSV wurde als EIV-NM/2/93, MSV Lot 001-dil bezeichnet.
Equines Influenza-Virus – Kentucky/95, Subtyp A2
Der Kentucky/95-Subtyp A2 von equinem Influenza-Virus wurde vom Gluck Equine Research Center, Lexington, KY, bezogen. Das Virus wurde von einem Pferd mit Rhinitis isoliert. Das Virus wurde 2-mal in spezifischen, pathogenfreien (SPF) embryonisierten Hühnereiern passagiert. Anschließend wurde das Virus 3-mal in der Madin-Darby-Hundenieren (MDCK)-Zelllinie und 3-mal in EVero-Zellen passagiert. Die dritte Passage in EVero-Zellen erhielt die Bezeichnung MSV. Das MSV wurde als EIV-K95, MSV Lot 001-dil bezeichnet.
Die folgenden Verfahren wurden zur getrennten Herstellung von drei Stämmen von equinen Influenza-Komponenten verwendet, wobei man sich ähnlicher Verfahren bediente. Jede Produktionscharge von Newmarket/77-Virus wurde durch Beobachtung charakteristischer EIV-induzierter, zytopathischer Effekte (CPE) in EVero-Zellen als equines Influenza-Virus (EIV) identifiziert. Jede Produktionscharge von Newmarket/2/93- und Kentucky/95-Virus wurde durch Beobachtung charakteristischer EIV-induzierter CPE in MDCK-Zellen als EIV identifiziert. Newmarket/77 und Kentucky/95 sind zytozid für Affennieren-Zellkulturen und erzeugten typische EIV-CPE in Monolayerkulturen. Newmarket/2/93 ist zytozid für MDCK-Zellkulturen und erzeugt typische EIV-CPE in Monolayerkulturen. Die Virulenz in Pferden wurde bei keiner der Viren bewertet. Die Master-Anzuchtviren wurden gemäß 9 C. F. R. 113.27 (c), 113.28, und 113.55 auf Reinheit getestet. Das Newmarket/77-Master-Anzuchtvirus diente für vesikuläre Schweinekrankheit, Akabane, ephemeres Rinderfieber, Blauzungenkrankheit und velogene, viszerotrophe Newcastle-Krankheit. Virus-Ernteflüssigkeiten wurden vor Inaktivierung gemäß 9 C. F. R. 113.28 auf Mycoplasma getestet. Die Master-Anzuchtviren wurden unter Anwendung des folgenden Verfahrens auf Immunogenizität getestet.
Bulk-Proben oder Proben in endgültigen Behältern mit fertiggestelltem Produkt einer jeden Serie wurden auf ihre Wirkungsstärke durch den Meerschweinchen-Wirkungstest getestet. Jedes der mindestens 10 Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300–500 g erhielt eine intramuskuläre Injektion. Jede Meerschweinchendosis betrug die Hälfte der Dosis, die als Einheitsdosis des Impfstoffes für ein Pferd empfohlen ist. Eine zweite Dosis wurde 14 bis 21 Tage nach der ersten Dosis injiziert. Zwei weitere Meerschweinchen aus der gleichen Quelle wurden als Kontrollen herangezogen. 14 bis 21 Tage nach der zweiten Injektion wurden Serumproben von jedem geimpften Tier und von jedem Kontrolltier auf Newmarket/77-, Newmarket/2/93- und Kentucky/95-Antikörper durch Hemmung der Hämagglutination (HAI) getestet. Die Wirkungsstärke der EIV-Fraktionen im Impfstoff wurde unter Anwendung des National Veterinary Services Laborstories Testing Protocol, Supplemental Assay Method for Conducting the Hemagglutination Inhibition Assay for Equine Influenza Antibody (MVSAM0124.01, 2. Oktober 1998) bestimmt.
Wenn die Kontrollen bei 1:10 für die EIV-Fraktion beim Test seronegativ blieben, blieb der Test unberücksichtigt und wurde wiederholt. Wenn 8 von 10 geimpften Tieren bei einem gültigen Test keinen HAI-Antikörpertiter von 80 oder mehr für die Newmarket/77-Fraktion und keinen Titer von 40 oder mehr für die Newmarket/2/93- und Kentucky/95-Fraktionen entwickelten, wurde die Probe als nicht zufriedenstellend angesehen. Impfstoffe mit einem Gehalt an inaktiviertem EIV werden vorzugsweise so zubereitet, dass sie mindestens etwa 64 HAU/Einheitsdosis von inaktiviertem EIV-Virus Subtyp A1 und/oder mindestens etwa 256 HAU/Einheitsdosis von inaktiviertem EIV-Virus Subtyp A2 enthalten.
Die erste bis vierte Passage des Master-Anzuchtvirus wurden für Arbeits- und Produktionsanzuchtmaterialien verwendet. Impfstoff wurde aus der ersten bis fünften Passage aus dem Master-Anzuchtvirus erzeugt. Equines Influenza-Virus, Stamm Newmarket/77, Subtyp A1 und equines Influenza-Virus, Stamm Kentucky/95, Subtyp A2 wurden in EVero-Zelllinienkulturen vermehrt.
Die MDCK-Zelllinie, die für die Vermehrung von Newmarket/2/93 verwendet wurde, wurde auf die Passagen 71 bis 91 begrenzt. Die Passage 71 wurde eingefroren und als Master-Zellvorratsmaterial bezeichnet. Die MDCK-Zellkulturen wurden in MEM mit einem Gehalt an 5–10% fötalem Kälberserum vermehrt. Die Anzucht- und Produktionskultur von Newmarket/2/93 wurden in MEM, das mit 10 Einheiten Trypsin/ml ergänzt war, vermehrt. Zellkulturen werden auf Mikroträgerperlen in 1, 3, 10, 30, 50 oder 140 Liter fassenden Zellkulturgefäßen, 9 Liter fassenden Glasrollflaschen oder Kunststoffrollflaschen gezüchtet. Master- und Arbeitsanzuchtviren werden bei –60°C oder darunter aufbewahrt.
MDCK-Zellkulturen wurden in sterilen Glas- oder Kunststoffbehältern gezüchtet. Die Kulturen wurden in 75 cm²- oder 150 cm²-Kunststoffflaschen mit 40 bis 100 ml Medium gezüchtet. Expansionskulturen wurden in Rollflaschenkulturen in 100–1 000 ml Medium gezüchtet und anschließend einer Subkultur ebenfalls in Rollflaschenkulturen unterzogen. Eine Oberflächenhaftfläche von entweder 75 cm² oder 150 cm² wurde ausgewählt, und zwar aufgrund der Haftung und des Wachstums der Zelllinie, wenn diese erstmals aus dem Ruhebehälter unter flüssigem Stickstoff kam. Aufgrund der Belastung bei der Lagerung mit flüssigem Stickstoff war es in einigen Fällen vorteilhaft, das Zellwachstum auf einer geringeren Oberfläche zu beginnen, und wenn das Zellwachstum erreicht war, wurden die Zellen einer Subkultur in einer 150 cm²-T-Flasche unterzogen. Wenn die Zellen aus dem Vorratsbehälter mit flüssigem Stickstoff kamen und eine gesunde Monolager von Zellen, die für eine Expansion in einer 150 cm²-T-Flasche ausreichten, erzeugten, wurde die Stufe mit der 75 cm²-T-Flasche weggelassen und die Zellen wurden direkt in die 150 cm²-T-Flasche gegeben.
Vor der Inokulation mit dem Virus wurde das Zellwachstumsmedium vom Kulturgefäß dekantiert. Minimales Essentialmedium (MEM) ohne Serum wurde in das Kulturgefäß gegeben und die Zellen wurden 30 bis 45 Minuten gespült. Das Volumen des Spülmediums hing vom verwendeten Kulturgefäß ab. Die Kulturgefäße wurden inokuliert, indem Spülmedium dekantiert wurde und MEM ohne Serum mit einem Gehalt an 10 Einheiten gereinigtem Trypsin/ml MEM, das mit Anzuchtvirus versetzt worden war, zugegeben wurde. Zellkulturen wurden mit einem Zielwert der Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 für die Newmarket/77-, Newmarket/2/93- und Kentucky/95-Stämme infiziert.
Die Zellkulturen wurden bei 36 ± 2°C gehalten, bis die Flüssigkeit geerntet wurde. Monolagers wurden nach der Inokulation in Bezug auf charakteristische, EIV-induzierte Veränderungen der Zellmorphologie überwacht. CPE umfassten gerundete und refraktile Zellen, die sich von der Monolayer-Oberfläche ablösten. CPE traten üblicherweise 24–96 Stunden nach der Inokulation auf. Die Kultur wurde während der gesamten Inkubationsdauer auf makroskopische und/oder mikroskopische Anzeichen einer Verunreinigung oder von atypischen Veränderungen der Zellmorphologie geprüft. Kulturen, die Anzeichen einer mikrobiellen Verunreinigung oder einer nicht-spezifischen zellulären Degeneration zeigten, wurden verworfen.
Vor der Ernte wurden die einzelnen Kulturen makroskopisch und mikroskopisch untersucht. Kulturen mit Anzeichen einer Verunreinigung oder atypischen CPE wurden verworfen. Die Flüssigkeit aus dem oder den Kulturgefäßen wurde 1 bis 4 Tage nach der Inokulation geerntet. Die Virus-Kulturflüssigkeit im Kulturgefäß wurde aseptisch in sterile Glas- oder Kunststoffballons oder in sterile Behälter aus rostfreiem Stahl geerntet, nachdem sie unter Filtration durch Filter von 8 μm oder mehr geklärt worden waren. Vereinigte Flüssigkeiten wurden entweder sofort inaktiviert oder bei –40°C oder darunter für eine spätere Inaktivierung aufbewahrt. Proben wurden nach der Inaktivierung gewonnen und auf Sterilität und antigene Beschaffenheit getestet.
Das Volumen der Kulturflüssigkeiten wurde bestimmt und die Temperatur der Flüssigkeiten wurde auf 36 ± 2°C gebracht. Eine 0,2 M Lösung von 2-Bromethylenamin-hydrobromid, das zu binärem Ethlylenimin (BEI) cyclisiert worden war, in 0,15 M NaOH wurde zu den Kulturflüssigkeiten unter Erzielung einer BEI-Endkonzentration von 2 mM gegeben. Die Flüssigkeit mit dem inaktivierten Virus wurde entweder bei ≤ –40°C eingefroren oder bei 4–8°C aufbewahrt, bis der Inaktivierungstest beendet war.
Jede Charge von Newmarket/77 und Kentucky/95 wurde auf Inaktivierung durch Passage in Vero-A139-Zellen getestet. Jede Charge von Newmarket/2/93 wurde auf Inaktivierung durch Passage in MDCK-Zellen getestet. Eine entsprechende Zellkultur-Monolager (150 ml) wurde mit 1,0 ml inaktivierten EIV-Flüssigkeiten inokuliert und 14 Tage bei 36 ± 2°C unter mindestens zwei Passagen aufrechterhalten. Am Ende der Aufrechterhaltungsperiode wurden die Zellmonolayer auf für EIV typische CPE geprüft. Für positive Viruskontrollen wurde jeweils eine Kulturflasche von EVero-Zellen mit Referenzvirus Newmarket/77 bzw. Kentucky/95 inokuliert und eine Kultur von MDCK-Zellen wurde mit dem Referenzvirus Newmarket/2/93 inokuliert (angestrebter MOI-Wert jeweils 0,01). Eine Flasche von EVero-Zellen und eine Flasche von MDCK-Zellen blieben als negative Kontrollen ohne Inokulation. Nach Inkubation und Passage stellte das Fehlen von mit Virus infizierten Zellen in den mit BEI behandelten viralen Flüssigkeiten einen zufriedenstellenden Test auf Inaktivierung dar. Die mit dem Referenzvirus inokulierten Kontrollzellen zeigten für EIV typische CPE und die nicht-inokulierte Flasche zeigte keine Anzeichen von EIV-CPE.
Nach einem zufriedenstellenden Inaktivierungstest wurde restliches BEI durch Zugabe einer kalten (4 ± 2°C) Lösung von 1,0 M Natriumthiosulfat unter Erzielung einer Endkonzentration von 6 mM neutralisiert. Die inaktivierten Flüssigkeiten wurden bei 4 ± 2°C oder darunter aufbewahrt, bis das Endprodukt bereitgestellt wurde. Wenn der Inaktivierungstest unbefriedigend war, konnten die Flüssigkeiten erneut mit BEI unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens behandelt und erneut auf Inaktivierung getestet werden.
Gegebenenfalls wurde jede Charge von inaktivierter Virusflüssigkeit durch Ultrafiltration 2- bis 50-fach eingeengt, um die erwünschte Konzentration zu erhalten. Für den Konzentrationsvorgang wurden üblicherweise eine oder mehrere Chargen von inaktivierter Virusflüssigkeit vereinigt. Bis zur Produktbildung wurde das eingeengte Virusprodukt bei 4–8°C gehalten.
Das nach Inaktivierung und Einengung erhaltene Produkt enthielt Gentamicin in Restmengen, die aus dem für die Herstellung der Virus-Ernteflüssigkeiten verwendeten Medium stammten. Die Konzentrationen überstiegen das pro Produktdosis zulässige Maß nicht. Der Impfstoff wurde so zubereitet, dass er 2 mg Carbopol^R 971 pro Impfstoffdosis enthielt.
Die Komponenten für die Produktbildung wurden aseptisch durch Absaugen oder mittels positivem Druck (Sterilfiltration unter Stickstoff) in einen Behälter aus Glas, Kunststoff oder rostfreiem Stahl gegeben. Die Serie wurde gründlich vermischt und sodann bei 2–8°C gehalten, bis sie zur Abfüllung in die endgültigen Behälter bereitstand. Nachstehend ist ein Beispiel für eine inaktivierte EIV-Impfstoffzusammensetzung angegeben:

Newmarket/77 3 000 ml

Newmarket/2/93 6 000 ml

Kentucky/95 6 000 ml

Carbopol^R 971 (0,5% Vorratslösung) 12 000 ml

Kochsalzlösung 33 000 ml
Gegebenenfalls kann die Kochsalzlösung oder ein Teil davon durch eine Lösung ersetzt werden, die inaktiviertes EHV-1 und gegebenenfalls inaktiviertes EHV-4 enthält, um einen EHV/EIV-Kombinationsimpfstoff herzustellen.
Nach der Produktbildung wurde die Produktserie in sterile Behälter aus Kunststoff oder rostfreiem Stahl gebracht, um sie zur Abfüllung in endgültige Behälter in einen sterilen Abfüllbereich zu bringen, oder aus der Produktserie wurden Proben genommen und in sterile Kunststoffballons abgezogen. Wenn die Produktserie in Ballons abgezogen wurde, wurde sie bei 4–8°C gelagert. Wenn zwei oder mehr Ballons mit Impfstoffprodukt auf einmal zu füllen waren, wurde das Produkt in einem sterilen Behälter aus rostfreiem Stahl vereinigt, wenn es für die Abfüllung benötigt wurde. Jede Impfstoffdosis wurde so zubereitet, dass sie eine ausreichende Menge an inaktivierten Virus-Ernteflüssigkeiten enthielt, so dass sich mindestens 64 Hämagglutinierungseinheiten (HAU) von Newmarket/77 und 128 HAU von Newmarket/2/93 und 128 HAU von Kentucky/95 ergaben.
Beispiel 3 – Verfahren zur Überwachung der Inaktivierung von Viren
Jede Charge von EHV-1, EHV-4, EIV-Newmarket/77 und EIV-Kentucky/95 wurde durch Passage in EVero-Zellen inaktiviert. Jede Charge von EIV-Newmarket/2/93 wurde auf Inaktivierung durch Passage in MDCK-Zellen getestet. 150 cm² der EVero-Zellkultur-Monolager wurde mit 1,0 ml inaktivierten EHV- oder EIV-Flüssigkeiten inokuliert und 14 Tage bei 36 ± 2°C unter Durchführung von mindestens zwei Passagen gehalten. Am Ende der Aufrechterhaltungsdauer wurden die Zellmonolayers auf für EHV oder EIV typische CPE geprüft. Für EHV-Kontrollen wurde eine Kulturflasche von EVero-Zellen mit Referenz-EHV-1 oder -EHV-4 (positive Kontrolle) inokuliert, wobei ein Zielwert der Multiplizität (MOI) von 0,001 erzielt wurde. Für EIV-Kontrollen wurde eine Kulturflasche von EVero-Zellen mit Referenzvirus EIV-Newmarket/77 oder EIV-Kentucky/95 (positive Kontrolle) unter Bildung eines Ziel-MOI-Werts von 0,01 inokuliert. Für die EIV-Newmarket/2/93-Tests wurde eine Kulturflasche von MDCK-Zellen mit Referenzvirus EIV-Newmarket/2/93 unter Bildung eines Ziel-MOI-Werts von 0,01 inokuliert. Als negative Kontrolle wurde eine nicht-inokulierte Flasche von EVero-Zellen oder MDCK-Zellen unter den gleichen Bedingungen wie die Testkulturen inkubiert. Nach Inkubation und Passage stellte das Fehlen von mit Virus infizierten Zellen in den mit BEI behandelten viralen Flüssigkeiten einen zufriedenstellenden Inaktivierungstest dar. Die mit dem Referenzvirus inokulierten Kontrollzellen sollten für EHV oder EIV typische CPE zeigen. Die nicht-inokulierte Flasche sollte keine Anzeichen von EHV- oder EIV-CPE zeigen. Nach einem zufriedenstellenden Inaktivierungstest wurde restliches BEI durch Zugabe einer kalten Lösung von Natriumthiosulfat neutralisiert und die inaktivierten Flüssigkeiten wurden vor dem Vermischen unter Bildung des Endprodukts bei 4 ± 2°C oder darunter aufbewahrt.
Beispiel 4 – EHV-Wirkungsstärke-Freisetzungstest
Beschichtung von Platten mit 96 Mulden mit EHV-1-mAb oder EHV-4-mAb
Platten mit 96 Mulden wurden zum Testen der Wirkungsstärke von EHV-1-Fraktionen mit monoklonalem EHV-1-Antikörper beschichtet. Platten mit 96 Mulden zum Testen der Wirkungsstärke von EHV-4 enthaltenden Proben wurden mit dem monoklonalen EHV-4-Antikörper beschichtet. Der monoklonale EHV-1-Antikörper ("EHV-1-mAb"), 16H9, IgG-Fraktion, wurde in Beschichtungspuffer im Verhältnis von 1:10 000 verdünnt. Der monoklonale EHV-4-Antikörper ("EHV-4-mAb"), 20F3, IgG-Fraktion, wurde in Beschichtungspuffer im Verhältnis von 1:10 000 verdünnt. Aliquotmengen (100 μl) der mAb-Lösungen wurden in sämtliche Mulden der NUNC-MAXISORP-Platten gegeben, ausgenommen die Mulden in Spalte 1. Die Platten wurden mit Plattenabdeckungen verschlossen. Die Platten mit den mehrfachen Mulden wurden sodann 1 Stunde bei 37°C und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Quantitative Bestimmung von EHV-1- oder EHV-4-Antigen in Testproben
EHV-1- oder EHV-4-Antigene in Testproben wurden unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die mit dem entsprechenden mAb beschichtet waren, quantitativ bestimmt. Vor dem Test durch das ELISA-Verfahren wurden 1 ml-Aliquotanteile der Testproben (mit Adjuvans versehenes Impfstoffprodukt oder im endgültigen Behälter befindlicher Impfstoff) in konischen Mikrozentrifugenröhrchen mindestens 18 Stunden auf –40°C oder darunter eingefroren. Am Tag der Durchführung des ELISA-Tests wurden die eingefrorenen Proben des Testimpfstoffes in Mikrozentrifugenröhrchen und die eingefrorenen Fläschchen des Referenzimpfstoffes in einem Wasserbad von 37°C aufgetaut und zum Resuspendieren von abgesetztem Material aufgewirbelt. Eine Aliquotmenge von 2,5 μl Triton^R X-100 wurde in das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Referenzimpfstoff und in jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit Testimpfstoff gegeben. Die Mikrozentrifugenröhrchen wurden aufgewirbelt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden alle 15 Minuten aufgewirbelt. Eine 100 μl-Aliquotmenge der externen EHV-1-Referenzkontrolle (oder der externen EHV-4-Referenzkontrolle) wurde zu 900 μl Antigen-Verdünnungsmittel gegeben. Eine Aliquotmenge (2,5 μl) Triton^R X-100 wurde zu der verdünnten externen EHV-1-Referenz gegeben. Die externen Referenzflüssigkeiten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und alle 15 Minuten aufgewirbelt.
Während dieser 1-stündigen Inkubation wurden mit EHV-mAb beschichtete Platten 3-mal mit PBS-Tween^R gewaschen. Verbleibende reaktive Stellen in den Mulden wurden durch Nachbeschichtung sämtlicher Mulden mit 200 μl/Mulde Blockierungspuffer blockiert. Die Platten wurden mindestens 30 Minuten mit Blockierungspuffer von 37°C inkubiert. Nach der 1-stündigen Inkubation wurden 2-fache Reihenverdünnungen des Referenzimpfstoffes und des Testimpfstoffes durch Übertragung von 500 ml Referenzimpfstoff und Testprobe in ein Teströhrchen mit einem Gehalt an 500 μl Antigen-Verdünnungsmittel hergestellt.
Die nachträglich beschichteten Platten wurden 3-mal mit PBS-Tween^R-Lösung gewaschen. Aliquotanteile (50 μl) der unverdünnten bis zu 1:32-verdünnten Lösungen des Referenzimpfstoffes und des Testimpfstoffes wurden im Doppelversuch in Mulden von mit EHV-1-mAb und EHV-4-mAb beschichteten Platten gemäß den Angaben in Tabelle IV-1 gegeben. Aliquotanteile von 50 μl der entsprechenden externen Referenzkontrolle wurden gemäß den Angaben in Tabelle IV-1 in die Mulden der einzelnen Platten gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Während dieser 1-stündigen Inkubation wurde Pferde-anti-EHV-1-Serum (oder Pferde-anti-EHV-4-Serum) 1:1 000 in Antikörper-Verdünnungsmittel verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der 1-stündigen Inkubation wurden die Platten mit mehrfachen Mulden 3-mal mit PBS-Tween^R-Lösung gewaschen. Aliquotanteile (50 μl) des verdünnten Pferde-anti-EHV-1-Serums (oder verdünnten Pferde-anti-EHV-4- Serums) wurden in sämtliche Mulden der entsprechenden Platte gegeben, ausgenommen die Mulden in Spalte 1. Anschließend wurden die Platten 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Während dieser 1-stündigen Inkubation wurde Schaf-anti-Pferd-IgG·HRP-Konjugat 1:2 500 in Antikörper-Verdünnungsmittel verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der 1-stündigen Inkubation wurden die Platten erneut 3-mal mit PBS-Tween^R-Lösung gewaschen. Aliquotanteile (50 μl) des Schaf-anti-Pferd-IgG·HRP-Konjugats wurden in sämtliche Mulden der Platte gegeben, ausgenommen die Mulden in Spalte 1. Die Platten wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der 1-stündigen Inkubation wurden die Platten erneut 3-mal mit PBS-Tween^R-Lösung gewaschen.
TMB-Substrat wird gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Aliquotanteile (100 μl) der TMB-Substratlösung wurden mit einer Mehrkanalpipettiervorrichtung in sämtliche Mulden in Reihe A und dann hintereinander in die Reihen B bis H der Platte gegeben. Die Platten mit mehrfachen Mulden wurden sodann bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte der Mulden wurde durch Ablesen der Platte an einem Mikroplatten-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 650 nm bestimmt. Die Kontrollmulden in Spalte 1 dienten als Leerwerte. Die für die quantitative Bestimmung von EHV-1-Antigen verwendeten Platten wurden 35 ± 10 Minuten nach Zugabe von TMB-Substrat abgelesen. Die optische Dichte in Mulden, die die externe EHV-1-Referenz enthielten, sollte zwischen 0,500 und 1,200 liegen. Platten, die für die quantitative Bestimmung von EHV-4-Antigen verwendet wurden, wurden 45 ± 10 Minuten nach Zugabe des TMB-Substrats abgelesen. Die optische Dichte in den Mulden mit einem Gehalt an der externen EHV-4-Referenz sollte zwischen 0,500 und 1,200 liegen. Die Werte für die relative Wirkungsstärke ("RPV") von Testimpfstoffproben wurden aus den Ablesungen der optischen Dichte durch Normieren der Werte gegen die externe EHV-1-Referenzkontrolle (oder externe EHV-4-Referenzkontrolle) bestimmt.
III. Kriterien für einen aussagekräftigen Test
Die optische Dichte in den Mulden, die die externe EHV-1-Referenz (oder die externe EHV-4-Referenz) enthielten, sollte 30 ± 5 Minuten nach Zugabe von TMB-Substrat zwischen 0,500 und 1,200 liegen. Die optische Dichte in den negativen Kontrollmulden sollte nicht mehr als 0,250 betragen. Wenn keines dieser Validitätskriterien erfüllt wurde, sollte der Test als ungültiger Test angesehen werden. Dieser Test kann unvoreingenommen wiederholt werden. Die Ergebnisse der relativen Wirkungsstärke eines Tests wurden als zufriedenstellend angesehen, wenn der RPV-Wert (für inaktiviertes EHV-1 und/oder inaktiviertes EHV-4) einer Einheitsdosis der Testprobe 1,0 oder mehr betrug.
IV. Reagenzien
Spezifischer monoklonaler EHV-1-Antikörper, IgG-Fraktion. Hybridom 16H9 wurde von Dr. George Allen, Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington, KY, erhalten. Bei der IgG-Fraktion von Mäuse-Aszites handelte es sich um ein gewerbliches Produkt. Der gereinigte Antikörper wurde als EHV-1-mAb-16H9-IgG, Charge 001, 11-11-98, Exp. 11-11-03 bezeichnet. Die IgG-Antikörperfraktion wurde bei 4–8°C gelagert.
Spezifischer monoklonaler EHV-4-Antikörper, IgG-Fraktion. Hybridom 20F3 wurde von Dr. George Allen, Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington, KY, erhalten. Bei der IgG-Fraktion von Mäuse-Aszites handelte es sich um ein gewerbliches Produkt. Der gereinigte Antikörper wurde als EHV-4-mAb-20F3-IgG, Charge 001/11-11-98, Exp. 11-11-03 bezeichnet. Die IgG-Antikörper-Fraktion wurde bei 4–8°C gelagert.
Polyklonales Pferde-anti-EHV-1-Serum. Ein Serumpool wurde aus Blut von ungeimpften Kontrollpferden in der EHV-Immunogenizitätsstudie 623-510-98E-015 21 Tage nach Belastung mit virulentem EHV-1 gewonnen. Der Antikörper wurde als Pferde-anti-EHV-1, Charge 001/030199, Exp. 030104 bezeichnet. Das Serum wurde auf –40°C oder darunter eingefroren.
Polyklonales Pferde-anti-EHV-4-Serum. Ein Serumpool wurde aus Blut von ungeimpften Kontrollpferden bei der EHV-Immunogenizitätsstudie 623-510-98E-015 21 Tage nach Belastung mit virulentem EHV-4 gewonnen. Der Antikörper wurde als Pferde-anti-EHV-4, Charge 001/030399, Exp. 030304 bezeichnet. Das Serum wurde auf –40°C oder darunter eingefroren und gelagert.
Schaf-anti-Pferde-IgG·HRP-Konjugat, 1 mg/ml, Bethyl Laborstories, Inc., Kat. Nr. A70-121P. Das Antikörper-Konjugat wurde bei 4–8°C gelagert.
Externe EHV-1-Referenzflüssigkeiten. EHV-1-Flüssigkeiten wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Fläschchen von externer EHV-1-Referenzflüssigkeiten wurden als EHV-1-Ext. Ref. Flds., Charge 001/040599, Exp. 040504 bezeichnet. Die Virusflüssigkeiten wurden bei –40°C oder darunter gelagert.
Externe EHV-4-Referenzflüssigkeiten. EHV-4-Flüssigkeiten wurden gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt. Fläschchen von externen EHV-4-Referenzflüssigkeiten wurden als EHV-4-Ext. Ref. Flds., Charge 001/040699, Exp. 040604 bezeichnet. Die Virusflüssigkeiten wurden bei –40°C oder darunter gelagert.
EHV-1/EHV-4-Referenzimpfstoff. Beim EHV-1/EHV-4-Referenzimpfstoff handelte es sich um den gleichen Impfstoff, der bei der in Beispiel 8 beschriebenen Immunogenizitätsstudie (623-0510-98E-015) verwendet wurde. Der Impfstoff wurde als EHV-Imm. Vac., 623-510-98E-015, Charge # 001,11-6-98, Exp. 110603 bezeichnet. Der Referenzimpfstoff wurde bei –40°C oder darunter gelagert.
Die folgenden handelsüblichen Reagenzien wurden in diesem Experiment hergestellt:
Substratsystem: TMB (zwei Komponenten), Kirkegaard and Perry, Kat. Nr. 50-76-00.
Triton^R X-100: Sigma, Kat. Nr. 1043.
Kälberserum: Hyclone Laborstories, Inc., Kat. Nr. A-2151-L.
Die folgenden Standardlösungen wurden zur Verwendung im Experiment hergestellt: Beschichtungspuffer (für jeden Test frisch hergestellt und auf pH-Wert 9,6 eingestellt)

g/Liter entionisiertes H₂O

a. Na₂CO₃, wasserfrei 1,59

b. NaHCO₃ 2,93

PBS (eingestellt auf pH-Wert 7,3)

g/Liter entionisiertes H₂O

a. Na₂HPO₄, wasserfrei 1,18

b. NaH₂PO₄, wasserfrei 0,23

c. NaCl 8,50

PBS-TweenR-Lösung

g/Liter entionisiertes H₂O

a. Na₂HPO₄, wasserfrei 1,18

b. NaH₂PO₄, wasserfrei 0,23

c. NaCl 8,50

d. Tween^R 20 0,05 ml

Blockierungspuffer (am Testtag frisch hergestellt)

a. PBS 75 ml

b. Kälberserum 25 ml

Antikörper-Verdünnungsmittel (wie der Blockierungspuffer; am Testtag frisch hergestellt) Antigen-Verdünnungsmittel (am Testtag frisch hergestellt)

a. PBS 50 ml

b. Triton^R X-100 0,05 ml
Beispiel 5 – Inokulation von Pferden mit inaktiviertem EHV-1 und anschließende Belastung mit virulentem EHV-4
Der Zweck dieser Studie bestand darin, die Immunogenizität eines inaktivierten EHV-1-KyA-Virus zum Kreuzschutz von geimpften Pferden, die mit virulentem EHV-4 belastet wurden, nachzuweisen. Der in der Studie verwendete Impfstoff umfasste inaktiviertes EHV-1-KyA-Virus mit Carbopol^R 971 als Adjuvans. Pferde wurden gemäß zwei verschiedenen Impfschemata geimpft. Ein Impfschema bestand aus drei intramuskulären Impfungen und das andere aus zwei intramuskulären Impfungen und einer intranasalen Verabreichung. Die Pferde wurden im Abstand von 2 bis 4 Wochen geimpft. Ungeimpfte Pferde dienten als Kontrollen. 3 Wochen nach der letzten Impfung wurden die geimpften Pferde und die ungeimpften Kontrollpferde mit virulentem EHV-4 belastet.
Eine schwere Erkrankung der Atemwege wurde bei ungeimpften Kontrollpferden nach der Belastung mit EHV-4 beobachtet. Pferde, die entweder nach dem intramuskulären oder dem intramuskulären/intranasalen Schema mit dem EHV-1-KyA-Impfstoff geimpft worden waren, zeigten eine signifikante Verringerung der klinischen Anzeichen einer durch EHV-4 verursachten Erkrankung der Atemwege, verglichen mit den ungeimpften und belasteten Kontrollpferden. Es ergab sich eine signifikante Verringerung des Virusausstoßes zwischen den nach beiden Impfschemata geimpften Pferden und den ungeimpften Kontrollpferden. Die Ergebnisse der Studie belegten die Immunogenizität der inaktivierten EHV-1-KyA-Fraktion des Impfstoffes gegen Erkrankungen der Atemwege, die durch virulentes EHV-4 verursacht werden. Außerdem belegte die Studie, dass die inaktivierte EHV-1-KyA-Fraktion bei Verabreichung sowohl auf parenteralem als auch auf parenteralem/intranasalem Weg immunogen war.
Gesunde männliche und weibliche Pferde im Alter von 4 bis 9 Monaten wurden von ausgewählten Quellen erhalten. Die Pferde wurden durch Halfter-Markierungsnummern und Mikrochipnummern identifiziert. Sämtliche Pferde waren zu Beginn der Studie in einem guten Gesundheitszustand. Zum Zeitpunkt der ersten Impfung wiesen die Pferde Virus-Neutralisationstiter (VN) von ≤ 2 gegen EHV-1 und EHV-4 auf. Die Pferde wurden durch Ziehung der Identifikationsnummern der Pferde aus einem Beutel willkürlich in Gruppen eingeteilt. Während der Impfungs- und Belastungsperioden wurden die Pferde zusammen in offenen Pferchen gehalten und erhielten freien Zugang zu Luzernenheu von Milchviehqualität, Sweet 14-Futterergänzungsmittel, Pferde-Biomineralien und Wasser nach Belieben.
Durch Ziehung der Pferdeidentifikationsnummern aus einem Beutel wurden die Pferde willkürlich in Gruppen eingeteilt. Die Pferde wurden auf ihren allgemeinen Gesundheitszustand und etwaiges abnormales Verhalten während der Impfungsperiode beobachtet. Bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung ein abnormales Verhalten oder ein schlechter Gesundheitszustand beobachtet und bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung nachteilige Reaktionen an der Injektionsstelle festgestellt. Bei keinem der Pferde wurden während der Impfperiode klinische Anzeichen einer Erkrankung der Atemwege festgestellt.
EHV-1-Flüssigkeiten zur Verwendung im Impfstoff wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Sämtliche Virusflüssigkeiten befanden sich im Stadium der 5. Passage des Master-Anzuchtvirus und wurden auf Zellen im Stadium der 20. Passage des Master-Zellvorratsmaterials hergestellt. Der Impfstoff wurde so zubereitet, dass er EHV-1 und EIV-Newmarket/77, Untergruppe A1, EIV Kentucky 95, Untergruppe A2 und Newmarket 2/93, Untergruppe A2 pro Dosis von 2 ml enthielt (hergestellt gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren). Der Impfstoff erhielt die Bezeichnung EHV-1 Imm. Vac., 623-510-99E-116, Charge # 001, 19. Dezember 1999.

Die immunogene Zusammensetzung, die inaktiviertes EHV-1 enthielt, wurde den Pferden nach zwei Impfschemata verabreicht. Ein Impfschema bestand aus drei intramuskulären Impfungen in Abständen von 3 Wochen. Das andere Schema bestand aus zwei intramuskulären Inokulationen im Abstand von 4 Wochen, gefolgt von einer dritten Inokulation auf intranasalem Weg nach 2 bis 4 Wochen. Jede Impfschemagruppe umfasste 11 oder mehr Pferde. Eine Gruppe von 18 Pferden diente als ungeimpfte Kontrolle. 3 Wochen nach der letzten Impfung wurden die Pferde mit virulentem EHV-4 belastet. Die Pferde wurden auf klinische Anzeichen einer Erkrankung der Atemwege durch EHV-4 überwacht. Die Schwere der Krankheit wurde durch ein in der nachstehenden Tabelle V-1 beschriebenes Bewertungssystem bewertet. Blut- und Nasenschleimproben für die serologische Bewertung und nasale Abstriche für die Isolierung von Virus wurden vor der Impfung und zu ausgewählten Zeitpunkten danach gewonnen. Tabelle V-1 Bewertungssystem für klinische Symptome

Klinisches Symptom	Bewertung für jeden Tag, an dem diese Symptome auftreten
Nasenausfluss
serös, geringe Menge	1
serös, reichliche Menge	2
mucopurulent, geringe Menge	3
mucopurulent, reichliche Menge	4
Pyrexie
102,5–103,9°F	1
104,0–104,9°F	2
≥ 105,0°F	3
Weitere Symptome
Konjunktivitis	1
Husten	2
Atemnot	3
Mattheit	4
Antibiotische Behandlung für die	5
sekundäre bakterielle Infektion
erforderlich

Fünf Wiederholungstitrationen von EHV-4-Belastungsvirus, Stamm 405, wurden an Vero-Zellen durchgeführt. Der Titer für die Titrationen betrug für jede der fünf Titrationen jeweils 4,63 TCID₅₀ Log₁₀/1 ml. 2 ml wurden für die Belastung zur Erzielung einer 4,9 TCID₅₀ Log₁₀/Dosis verabreicht. Diese Dosis von virulentem Virus reichte aus, um eine schwere klinische Atemwegserkrankung bei ungeimpften Kontrollpferden hervorzurufen.
Der EHV-4-405-Stamm wurde von der American Type Culture Collection erhalten und an Vero-Zellen vermehrt. Dieses Virus wurde von einem Pferd mit Rhinopneumonitis isoliert und von Dr. M. Studdert, einem anerkannten Wissenschaftler auf dem Gebiet von EHV und durch EHV verursachten Krankheiten, charakterisiert. Das Virus wurde bei der ATCC als einschlägiges und repräsentatives Beispiel von EHV-4 hinterlegt und wurde von NVSL als EHV-4-Belastungsstamm empfohlen.
Eingefrorene EHV-4-Materialien zur Verwendung für die Belastung wurden aufgetaut und so verdünnt, dass sich eine Zielkonzentration von 5,0 TCID₅₀ log₁₀/ml ergab, und bei –70°C eingefroren. Eine Probe des Belastungsvirus wurde aufgetaut und der Titer wurde bestimmt. Zum Zeitpunkt der Belastung wurden die Virusflüssigkeiten aufgetaut und 2 ml EHV-4 wurden mit einer 3 ml-Spritze mit einer Nadel Nr. 21 entnommen. Die Nadel wurde entfernt und das Belastungsvirus wurde intranasal entsprechenden Gruppen von geimpften und ungeimpften Pferden verabreicht.
Nach der Belastung wurden die Pferde auf klinische Symptome einer durch EHV-4 verursachten Atemwegserkrankung überwacht, wozu Pyrexie, nasaler Ausfluss, Konjunktivitis, Husten, Atemnot, Mattheit und andere Merkmale, z. B. das Erfordernis einer antibiotischen Behandlung einer sekundären bakteriellen Infektion, gehörten. Die Pferde wurden täglich in Bezug auf die klinische Krankheit begutachtet und die Schwere der Krankheit wurde festgehalten.
Nasale Abstriche zur Isolierung von EHV wurden an ausgewählten Tagen nach der Belastung mit dem Virus genommen und bei –70°C aufbewahrt. Eingefrorene Proben wurden aufgetaut und der Abstrich wurde vom Transportmedium entnommen. Die Probe wurde durch 20-minütige Zentrifugation mit 2500 × g bei 19–22°C verarbeitet. Eine Aliquotmenge von 0,1 ml der verarbeiteten Probe wurde in die Mulde einer Gewebekulturplatte mit 48 Mulden, die 24-stündige Monolagers von Vero-Zellen enthielt, gegeben. Die Kulturplatten wurden 7 Tage bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Die Mulden wurden regelmäßig auf das Vorliegen des für EHV typischen zytopathischen Effekts (CPE) begutachtet. Mulden, die Zytotoxizität zeigten, wurden nach der 7-tägigen Inkubationsdauer einer Subkultur unterzogen, indem 0,2 ml aus der Mulde auf eine Gewebekulturplatte mit 48 Mulden, die eine 24-stündige Monolayer von Vero-Zellen enthielt, übertragen wurden. Die Kulturplatten wurden 7 Tage bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert und auf CPE begutachtet. Der EHV-Titer in den bearbeiteten nasalen Proben, die in Bezug auf CPE positiv waren, wurden durch übliche Titrationsverfahren an Zellen in Gewebekulturplatten mit 96 Mulden bestimmt.
Serum-VN-Antikörpertiter in Pferden vor und nach Impfung und nach Belastung mit virulentem Virus wurden bestimmt. Bei Entnahme von Blutproben zum Screening von Pferden zum Einsatz in der Studie wiesen sämtliche Pferde VN-Antikörpertiter von ≤ 2 für EHV-1 und EHV-4 auf, ausgenommen das Pferd Nr. 13, das einen VN-Titer von 8 für EHV-1 und EHV-4 zeigte. Zum Zeitpunkt der ersten Impfung waren die VN-Titer für EHV-1 und EHV-4 auf 2 bzw. 4 abgefallen. Ein weiteres Pferd in der intramuskulären Gruppe wies einen VN-Titer auf, der von 2 auf 8 anstieg, und 2 Pferde in der parenteralen/intranasalen Gruppe wiesen VN-Titer auf, die von 2 auf 16 gestiegen waren. Keines der Pferde zeigte Anzeichen einer Infektion der Atmungsorgane. Nach der ersten Impfung war der Anstieg im VN-Titer für EHV-1 und EHV-4 variabel, wobei aber der VN-Titer bei sämtlichen Pferden relativ zum Titer vor der Impfung zunahm. Nach der zweiten und dritten Impfung blieben die VN-Titer im Wesentlichen gleich wie nach der ersten Impfung. Der VN-Titer war für EHV-1 größer als für EHV-4, obgleich der VN-Titer für EHV-1 mehr als 2-fach, jedoch weniger als 4-fach größer als der EHV-4-VN-Titer war. Die VN-Titer für EHV-1 und EHV-4 waren in der parenteralen Impfgruppe größer als in der parenteralen/intranasalen Gruppe, wobei die Differenz aber geringer als 2-fach war. 21 Tage nach der Belastung mit virulentem EHV-4 hatten die VN-Antikörpertiter sowohl für EHV-1 als auch für EHV-4 bei den geimpften Pferden leicht zugenommen oder blieben unverändert. Dagegen stiegen bei den ungeimpften Kontrollpferden die VN-Antikörpertiter auf das 32- bis 128-fache sowohl für EHV-1 als auch für EHV-4 bei sämtlichen ungeimpften Kontrollpferden mit Ausnahme von einem Pferd. Die VN-Antikörpertiter für EHV-1 waren bei geimpften und Kontrollpferden nach der EHV-4-Belastung ähnlich wie die VN-Antikörpertiter für EHV4.
VN-Antikörpertiter in nasalen Proben, die von Pferden vor und nach Impfung und nach Belastung mit virulentem Virus gewonnen worden waren, wurden mit dem gleichen VN-Test, der zur Bestimmung der Antikörpertiter in Serum herangezogen worden war, bestimmt. Ähnlich wie die VN-Aktivität in Serum nach der Impfung nahm die VN-Aktivität in nasalen Sekreten nach der Impfung zu, jedoch in geringerem Ausmaß. Nach der Belastung mit EHV-4 nahm der VN-Antikörpertiter nur geringfügig zu und nur bei einigen Pferden. Daten über den VN-Antikörpertiter werden in dem Bericht nicht vorgelegt.
Pferde wurden intranasal mit virulentem EHV-4 belastet. Nach der Belastung wurde bei den Pferden täglich die Temperatur gemessen und klinische Symptome für eine Atemwegserkrankung, wozu nasaler Ausfluss, Konjunktivitis, Husten, Atemnot und Mattheit gehörten, wurden aufgezeichnet.
Die Pyrexie in Pferden nach der EHV-4-Belastung wurde überwacht. Pyrexie trat sporadisch und in kurzer Dauer sowohl bei den geimpften Gruppen als auch in der Kontrollgruppe auf. Bei der Mehrzahl der Pferde, die Pyrexie zeigten, war die erhöhte Temperatur nur für ein oder zwei Tage festzustellen. Ein geimpftes Pferd in der parenteralen/intranasalen Gruppe zeigte Pyrexie an vier aufeinanderfolgenden Tagen. Es gab keine Anzeichen für signifikante Unterschiede in der Verteilung der Pyrexie-Bewertungen unter Impf- und Kontrollgruppen an den Tagen 5 bis 8, 10 oder 13 nach der Belastung. Eine statistische Analyse wurde an den Tagen 1 bis 4, 9, 11, 12 und 14 bis 21 nicht durchgeführt, da weniger als zwei Tiere eine von Null abweichende Pyrexie-Bewertung erhielten. Bei getrennter Analyse der Temperaturen pro Tag unter Anwendung von Varianzanalyse ergab sich ein Anzeichen für eine signifikante Temperaturverringerung unter Impf- und Kontrollgruppen, jedoch nur an wenigen Einzeltagen.
Ferner wurden die nasalen Ausflüsse der Pferde beobachtet. Der nasale Ausfluss wurde als normal, als serös in geringer Menge, als serös in reichlicher Menge, als mucopurulent in geringer Menge und als mucopurulent in reichlicher Menge ermittelt und mit 0, 1, 2, 3 bzw. 4 bewertet. Drei Pferde in der parenteralen Impfgruppe zeigten nur an einem Tag einen mucopurulenten nasalen Ausfluss. Sämtliche anderen Ausflussbewertungen in den Impfgruppen betrafen eine geringe Menge an serösem Ausfluss, der vorwiegend auf 1 oder 2 Tage begrenzt war. Im Gegensatz dazu zeigten ungeimpfte Kontrollpferde einen mucopurulenten und serösen Ausfluss an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen. Es gab Anzeichen für signifikante Unterschiede unter Impf- und Kontrollgruppen (≤ 0,0479) an den Tagen 3 bis 9 und 11 bis 15. Es gab Anzeichen für signifikante Unterschiede in der Verteilung der Bewertungen des nasalen Ausflusses zwischen der parenteralen Impfgruppe und der Kontrollgruppe (p ≤ 0,0398) für die Tage 4, 5, 6, 8, 9 und 11 nach der Belastung und zwischen der parenteralen/intranasalen Impfgruppe und der Kontrollgruppe (p ≤ 0,0259) an den Tagen 3 bis 8 und 11 nach der Belastung.
Nach der Belastung gemachte Beobachtungen in Bezug auf klinische Symptome von Konjunktivitis, Husten, Atemnot und Mattheit sind in Tabelle 4 aufgeführt. Konjunktivitis war das bei geimpften Tieren beobachtete Hauptsymptom und wurde für 2 bis 3 Tage festgestellt. Ein geimpftes Tier zeigte einen Tag lang Atemnot und ein geimpftes Tier litt an drei aufeinanderfolgenden Tagen an Husten. Sämtliche übrigen Feststellungen von Husten traten nur einen Tag lang auf. Jeweils ein Pferd in der parenteralen und parenteralen/intranasalen Impfgruppe (8% bzw. 9%) zeigte zwei Symptome einer klinischen Erkrankung für nur einen Tag. Bei keinem geimpften Tier wurde Mattheit festgestellt. Im Unterschied zu geimpften Tieren zeigten 80% der ungeimpften Kontrollpferde schwere klinische Krankheitssymptome in Bezug auf Husten und Mattheit an drei oder mehr aufeinanderfolgenden Tagen nach der Belastung. Bei Analyse der klinischen Symptome mit 0 = abwesend und 1 = vorhanden gab es Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Tiere mit Konjunktivitis zwischen der parenteralen (p ≤ 0,0313) und der parenteralen/intransalen (p ≤ 0,0391) Impfgruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe an den Tagen 3 und 6 bis 13 nach der Belastung. Es gab Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Verringerung der Anzahl von Tieren mit Mattheit (p ≤ 0,0156) am Tag 6 nach der Belastung sowohl für die parenterale als auch für die parenterale/intranasale Impfgruppe, verglichen mit ungeimpften Kontrolltieren. Es gab keine Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in Bezug auf Atemnot zwischen geimpften Tieren und Kontrolltieren.
Bei Untersuchung der Anzahl von klinischen Symptomen, die an jedem Tag auftraten, gab es Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Verteilung der Anzahl von klinischen Symptomen zwischen parenteralen (p ≤ 0,0242) und parenteralen/intranasalen (p ≤ 0,0259) Impfgruppen und ungeimpften Kontrollpferden an den Tagen 6 bis 9 und 11 nach der Belastung. Die klinischen Symptome Konjunktivitis, Husten, Atemnot und Mattheit wurden wie bei den Angaben zu Tabelle V-1 mit 1, 2, 3 bzw. 4 bewertet. Klinische Mischbewertungen ergaben sich durch Berechnung der Summe der Bewertungen für nasalen Ausfluss und klinische Symptome. Bei der Berechnung der Mischbewertung war die Temperatur nicht enthalten. Die klinische Gesamtbewertung wurde für jedes Pferd für jeden Tag nach der Belastung berechnet. Die gesamte klinische Mischbewertung ist die Summe der Bewertungen für die klinischen Symptome für sämtliche Tage nach der Belastung. Es gab Anzeichen für signifikante Unterschiede in der klinischen Mischbewertung zwischen der parenteralen und der ungeimpften Kontrollgruppe (p ≤ 0,0331) an den Tagen 3 bis 9 und 11 bis 15 nach der Belastung und signifikante Unterschiede für die gesamte Mischbewertung (p ≤ 0,0001). Es gab Anzeichen für signifikante Unterschiede in der klinischen Mischbewertung zwischen der parenteralen/intranasalen und ungeimpften Kontrollgruppe (p ≤ 0,0241) an den Tagen 3 bis 9 und 11 bis 15 nach der Belastung und signifikante Unterschiede für die gesamte Mischbewertung (p ≤ 0,0001).
Das Abstoßen von Viren wurde bei den Pferden nach der Belastung mit virulentem EHV-4 überwacht. Nasale Proben wurden von den Pferden an den Tagen 1 bis 7 und sodann jeden 2. Tag bis zum Tag 18 nach der Belastung gewonnen. EHV-4-Belastungsvirus wurde von nasalen Proben sämtlicher ungeimpfter Kontrollpferde mit Ausnahme von einem Pferd gewonnen. Das Virus wurde beim Großteil der ungeimpften Kontrollpferde bei der 10^–2-Verdünnung nachgewiesen. An den Tagen 3 bis 5 wurde die stärkste Abstoßung von Viren festgestellt. Das Virus wurde bei einigen ungeimpften Kontrolltieren am 6. Tag nach der Belastung, jedoch in geringen Konzentrationen, nachgewiesen. Belastungsvirus wurde nicht aus geimpften Tieren nach der Belastung gewonnen.
Schlussfolgerungen
Der Impfstoff mit einem Gehalt an inaktiviertem EHV-1-KyA-Virus erzeugte eine systemische, humorale Immunreaktion bei Verabreichung sowohl auf parenteralem als auch auf parenteralem/intranasalem Weg. Die Impfung von Pferden mit dem EHV-1 enthaltenden Impfstoff erzeugte hohe Konzentrationen an VN-Antikörper gegen EHV-1 und EHV-4. Antikörpertiter sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 wurden in nasalen Proben geimpfter Tiere festgestellt, jedoch war der Titer relativ gering. Somit war der Impfstoff mit einem Gehalt an inaktiviertem EHV-1-KyA befähigt, Pferde gegen EHV-1 zu immunisieren, und ferner befähigt, eine Kreuzimmunisierung von Pferden gegenüber EHV-4 herbeizuführen. Bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung abnormale Impfreaktionen oder Reaktionen an der Injektionsstelle festgestellt.
Eine schwere Atemwegserkrankung, die aus längeren Episoden eines serösen und mucopurulenten nasalen Ausflusses, Konjunktivitis, Husten und Mattheit bestand, wurde bei ungeimpften Kontrollpferden, die mit virulentem EHV-4 belastet waren, festgestellt. Im Gegensatz dazu waren die Anzahl von klinischen Symptomen der EHV-4-Atemwegserkrankung, die Schwere der klinischen Symptome und die Anzahl der geimpften Tiere, die klinische Symptome aufwiesen, bei den geimpften Pferden erheblich verringert. Pferde, die entweder auf parenteralem oder auf parenteralem/intranasalem Weg geimpft worden waren, zeigten eine signifikante Verringerung der klinischen Symptome der Atemwegserkrankung aufgrund der EHV-4-Infektion. Eine Verringerung der klinischen Erkrankung wurde durch Daten gestützt, die zeigten, dass sowohl parenteral als auch parenteral/intranasal geimpfte Pferde nach der EHV-4-Belastung keine Abstoßung von Virus aufwiesen. Nasale Proben, die aus ungeimpften Kontrollpferden gewonnen worden waren, enthielten hohe Konzentrationen an Virus, und zwar an mehreren Tagen nach der EHV-4-Belastung.
Das inaktivierte EHV-1-KyA-Antigen, das im Impfstoff enthalten war, war immunogen in Bezug auf einen Kreuzschutz von Pferden gegen die durch EHV-4 hervorgerufene Atemwegserkrankung, und zwar bei Verabreichung auf parenteralem und auf parenteralem/intranasalem Weg. Insgesamt belegen die Ergebnisse dieser Studie, dass ein Impfstoff mit einem Gehalt an inaktiviertem EHV-1-KyA-Virus VN-Antikörper nicht nur gegen EHV-1 erzeugte, sondern auch einen Kreuzneutralisationsantikörper gegen EHV-4. Der Impfstoff mit einem Gehalt an inaktiviertem EHV-1-KyA war zu einem Kreuzschutz von Pferden gegen die durch virulentes EHV-4 hervorgerufene Atemwegserkrankung befähigt, wenn er auf parenteralem oder parenteralem/intranasalem Weg verabreicht wurde.
Beispiel 6 – Inokulation von Pferden mit inaktiviertem EHV-1 und anschließende Belastung mit virulentem EHV-1
Das Ziel der in diesem Beispiel beschriebenen Studie bestand darin, die Immunogenizität der EHV-1-Fraktion bei Verabreichung auf intramuskulärem oder intramuskulärem/intranasalem Weg zur Erzielung eines Kreuzschutzes von Pferden gegen die durch virulentes EHV-1 verursachte Krankheit nachzuweisen. Ein weiteres Ziel bestand darin, den Nachweis zu erbringen, dass die vorhandenen EIV-Fraktionen die Immunogenizität von EHV-1 nicht stören.
Das Ziel der Studie bestand im Nachweis der Immunogenizität der EHV-1-Fraktion des Rhinopneumonitis-Impfstoffes mit abgetötetem Virus zum Schutz von geimpften Pferden bei Belastung mit virulentem EHV-1. Der in dieser Studie verwendete Impfstoff wurde mit inaktiviertem EHV-1 unter Verwendung von Carbopol^R 971 als Adjuvans zubereitet. Pferde wurden mit zwei verschiedenen Impfschemata geimpft. Ein Impfschema bestand aus drei intramuskulären Impfungen und das andere Impfschema bestand aus zwei intramuskulären Impfungen und einer intranasalen Verabreichung. Pferde wurden in Abständen von 2–4 Wochen geimpft. Ungeimpfte Pferde dienten als Kontrollen. 6 Wochen nach der letzten Impfung wurden geimpfte Pferde und ungeimpfte Kontrollpferde mit virulentem EHV-1 belastet. Klinische Anzeichen einer schweren respiratorischen Krankheit, zu denen ein mucopurulenter nasaler Ausfluss, Husten, Atemnot und Mattheit gehörten, wurden bei ungeimpften Kontrollpferden nach der Belastung mit EHV-1 beobachtet.
Pferde
Gesunde männliche und weibliche Pferde aus unterschiedlichen Zuchtungen im Alter von 3 bis 4 Monaten wurden von verschiedenen Quellen bezogen. Die Pferde wurden durch Halfter-Markierungsnummern und Mikrochipnummern identifiziert. Sämtliche Pferde befanden sich bei Studienbeginn in einem guten Gesundheitszustand, wobei kein früheres Auftreten einer durch EHV verursachten respiratorischen Krankheit bekannt war. Die Pferde wurden durch Ziehen der Pferde-Identifikationsnummern aus einem Beutel willkürlich in Gruppen eingeteilt. Während der Impfungs- und Belastungsperioden wurden die Pferde zusammen in offenen Pferchen gehalten. Sie hatten freien Zugang zu Luzernenheu von Milchviehqualität, zu Sweet 14-Futterergänzung, zu Pferde-Biomineralstoffen und Wasser nach Belieben.
Die Pferde wurden durch Ziehen der Pferde-Identifikationsnummern aus einem Beutel willkürlich in Gruppen eingeteilt. Die Pferde wurden einer Beobachtung auf ihren allgemeinen Gesundheitszustand und auf etwaiges abnormales Verhalten während der Impfperiode beobachtet. Sämtliche Pferde befanden sich zu Beginn der Studie in einem guten Gesundheitszustand. Bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung ein abnormales Verhalten oder ein ungünstiger Gesundheitszustand festgestellt und bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung Reaktionen an der Injektionsstelle festgestellt. Bei keinem der Pferde wurden während der Impfperiode klinische Symptome einer durch EHV verursachten respiratorischen Krankheit festgestellt.
Etwa 3 Wochen vor dem vorgesehenen Datum der Belastung der Pferde mit virulentem EHV-1 trat bei den Pferden die Krankheit Druse auf. Proben von geschwollenen Lymphknoten wurden dem diagnostischen Labor der Montana State University übergeben. Aus den Proben wurde Streptococcus equi isoliert. Den Pferden wurde Penicillin verabreicht und sie wurden mit einem lebenden attenuiertem S. equi-Impfstoff, Pinnacle, geimpft. Man ließ die Pferde sich 3 Wochen von der Druse erholen, bevor die Belastung mit virulentem EHV-1 vorgenommen wurde. Ein Pferd, nämlich ein ungeimpftes Kontrollpferd, wurde am Tag der Belastung mit EHV-1 aus der Studie abgezogen. Eine geringfügige Matteit und Atemnot wurden festgestellt und beim Abhören trat ein Pfeifgeräusch beim Einatmen auf. Ein weiteres Pferd aus der intramuskulär geimpften Gruppe ging am 21. September 2000 ein, d. h. 5 Wochen vor der EHV-1-Belastung. Als Todesursache wurde Pneumonie festgestellt. Ein drittes Pferd in der intramuskulär geimpften Gruppe ging am 28. Oktober 2000 einen Tag nach der Belastung ein. Todesursache war ein aufgebrochener mesenterischer Abszess und eine anschließende Toxämie. S. equi wurde aus dem Abszess isoliert. Alle mit EHV-1 belasteten Pferde waren gesund und zeigten keine Anzeichen einer S. equi-Infektion. Sämtliche Daten der aus der Studie zurückgezogenen Pferde wurden nicht in den Bericht aufgenommen.
Impfstoff
EHV-1-Flüssigkeiten zur Verwendung im Impfstoff wurden gemäß den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Sämtliche Virusflüssigkeiten stammten aus der 5. Passage von einem Master-Anzuchtvirus und wurden auf Zellen in der 20.Passage aus einem Master-Zellvorratsmaterial erzeugt. Der Impfstoff wurde so zubereitet, dass er in einer 2 ml-Dosis EHV-1 und EIV Newmarket/77, A1-Untergruppe, EIV-Kentucky 95, A2-Untergruppe und Newmarket 2/93, A2-Untergruppe enthielt. Der Impfstoff wurde als EHV-1 Imm Vac, Charge #001, 6129-0510-00E-045, 03.Aug.00 bezeichnet.
Studienkonzept
Der Impfstoff wurde den Pferden gemäß zwei Impfschemata verabreicht. Ein Impfschema bestand aus drei intramuskulären Impfungen in Abständen von 2–4 Wochen. Das andere Impfschema bestand aus zwei intramuskulären Impfungen in einem Abstand von 2–4 Wochen und einer dritten Impfung auf intranasalem Weg 2–4 Wochen später. Die Gruppe der einzelnen Impfschemata umfasste 19–20 Pferde. Ein Gruppe von 20 Pferden diente als ungeimpfte Kontrolle. 6 Wochen nach der letzten Impfung wurden die Pferde mit virulentem EHV-1 belastet. Die Pferde wurden auf klinische Symptome einer durch EHV-1 verursachten respiratorischen Krankheit überwacht und die Schwere der Krankheit wurde aufgezeichnet. Blutproben und nasale Proben für die serologische Bewertung und nasale Abstriche zur Isolierung von Virus wurden vor der Impfung und zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Impfung gewonnen. Die Entnahme der Blutproben, der nasalen Proben und der nasalen Abstriche ist im Protokoll der Tierstudie beschrieben.
Serum-VN-Antikörpertiter gegen EHV-1 und EHV-4
Die Serum-VN-Antikörpertiter in Pferden vor und nach Impfung und nach Belastung mit virulentem EHV-1 wurden bestimmt. Sämtliche Pferde der intramuskulären und intramuskulären/intranasalen Impfgruppen wiesen zum Zeitpunkt der ersten Impfung VN-Antikörpertiter von ≤ 2 oder 4 gegen EHV-1 auf. Ein Pferd in der intramuskulären Impfgruppe und 5 Pferde in der intranasalen Impfgruppe wiesen zum Zeitpunkt der ersten Impfung VN-Antikörpertiter gegen EHV-4 von 8 oder 16 auf. Die VN-Antikörpertiter der ungeimpften Kontrollpferde betrugen zum Zeitpunkt der ersten Impfung ≤ 2 bis 16, wobei die Mehrzahl einen Titer von ≤ 2 oder 4 aufwiesen. Keines der Pferde zeigte irgendwelche Anzeichen einer respiratorischen Infektion und es bestand keine bekannte frühere Belastung mit EHV. Nach einer Impfung ergab sich ein geringfügiger bis gar kein Anstieg des VN-Titers gegen EHV-1 und EHV-4. Die Antikörpertiter der ungeimpften Kontrollpferde blieben unverändert und tatsächlich nahmen die Antikörpertiter bei einigen Kontrolltieren gegenüber den Titern vor der Impfung geringfügig ab. Nach der zweiten Impfung stiegen die VN-Antikörpertiter gegen EHV-1 in der intramuskulären Impfgruppe und in der intramuskulären/intranasalen Impfgruppe an. Die Antikörpertiter gegen EHV-4 stiegen in keiner der Impfgruppen an. Die Antikörpertiter der ungeimpften Kontrolltiere in der ungeimpften Kontrollgruppe blieben unverändert oder sanken weiter. Nach der dritten Impfung nahmen die VN-Titer gegen EHV-1 weiter zu. Die Antikörperfiter gegen EHV-4 nahmen nach der dritten Impfung ebenfalls zu. Der geometrische Mittelwert der VN-Antikörpertiter gegen EHV-1 und EHV-4 in der intramuskulären Impfgruppe betrug 86 bzw. 19 und in der intramuskulären/intranasalen Gruppe betrug der Wert 69 bzw. 20 für EHV-1 und EHV-4. Mit Ausnahme von drei ungeimpften Kontrollpferden blieben die Antikörpertiter gegen EHV-1 und EHV-4 am Ende der dritten Impfperiode unverändert oder hatten abgenommen. 21 Tage nach der Belastung mit virulentem EHV-1 nahmen die VN-Antikörpertiter sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 bei einigen geimpften Tieren drastisch zu, während die gleichen Werte bei anderen geimpften Tieren nur geringfügig anstiegen oder unverändert blieben. Jedoch nahmen bei den ungeimpften Kontrollpferden die VN- Antikörpertiter sowohl gegen EHV-1 als auch gegen EHV-4 bei sämtlichen Tieren (ausgenommen 4 ungeimpfte Kontrollpferde) auf mehr als das 100-fache zu. Im allgemeinen waren die VN-Antikörpertiter gegen EHV-1 größer als die gegen EHV-4.
Titration von EHV-1-Belastungsvirus
Fünf Wiederholungstitrationen des EHV-1-Belastungsvirus Stamm KyD wurden an Vero-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse der fünf Wiederholungstitrationen waren 4,4, 4,4, 4,4, 4,4 und 4,5 TCID₅₀ Log₁₀/ml. Der durchschnittliche Titer betrug 4,4 TCID₅₀ Log₁₀/ml. 2 ml wurden jedem Pferd zur Belastung unter Erzielung von 4,7 TCID₅₀ Log₁₀/2 ml-Dosis verabreicht. Die Zieldosis des den Pferden zur Belastung zu verabreichenden Virus betrug ≥ 4,0 TCID₅₀ Log₁₀/2 ml-Dosis.
Belastung von Pferden mit virulentem EHV-1
Der EHV-1-KyD-Stamm wurde von der American Type Culture Collection erhalten und an Vero-Zellen vermehrt. Vorratsmaterialien des EHV-1 zur Verwendung für die Belastung sollten eine Zielkonzentration von ≥ 4,0 TCID₅₀ Log₁₀/ml enthalten. Die Vorratsmaterialien wurden bei –70°C eingefroren. Eine Probe des Belastungsvirus wurde aufgetaut und der Titer wurde bestimmt. Zum Belastungszeitpunkt wurden die Virusflüssigkeiten aufgetaut und 2 ml EHV-1 wurde mit einer 3 ml fassenden Spritze mit einer Nadel Nr. 21 entnommen. Die Nadel wurde entfernt und das Belastungsvirus wurde intranasal an entsprechende Gruppen von geimpften und ungeimpften Pferden verabreicht. Geimpfte Pferde und ungeimpfte Kontrollpferde wurden zusammen in offenen Pferchen während der 21-tägigen Periode nach der Belastung gehalten.
Nach der Belastung wurden die Pferde auf Pyrexie und klinische Symptome einer durch EHV-1 verursachten respiratorischen Erkrankung überwacht, wozu nasaler Ausfluss, Konjunktivitis, Husten, Dyspnoe, Mattheit und andere Merkmale, z. B. eine zur Bekämpfung einer sekundären bakteriellen Infektion erforderliche antibiotische Behandlung gehörten. Die Pferde wurden täglich in Bezug auf das Auftreten einer klinischen Krankheit beobachtet und die Schwere der Krankheit wurde aufgezeichnet.
Die Pyrexie bei Pferden nach der EHV-1-Belastung wurde überwacht. Pyrexie trat sporadisch auf und verteilte sich über die Dauer der Belastungsperiode. Sowohl in der ungeimpften Kontrollgruppe als auch in beiden Impfgruppen gab es Pferde, die an zwei und drei aufeinanderfolgenden Tagen erhöhte Temperaturen aufwiesen, es bestand aber offensichtlich keine Korrelation der Pyrexie mit klinischen Symptomen der respiratorischen Krankheit. Es gab keine Anzeichen für signifikante Unterschiede in der Verteilung der Pyrexiebewertungen zwischen den Impfgruppen und der ungeimpften Kontrollgruppe.
Bei den Pferden wurden die nasalen Ausscheidungen beobachtet. Die nasale Ausscheidung wurde als normal, serös in geringer Menge, serös in reichlicher Menge, mucopurulent in geringer Menge und mucopurulent in großer Menge bezeichnet und mit den Bewertungen 0, 1, 2, 3 bzw. 4 versehen, und zwar entsprechend dem Tierprotokoll. Seröse nasale Ausscheidungen wurden nach der Belastung bei sämtlichen Pferden in der intramuskulären Impfgruppe festgestellt, wobei die Anzahl an Pferden mit geringen und reichlichen Mengen der serösen Ausscheidung in etwa gleich war. Bei den Pferden 405 und 423 zeigte sich an zwei aufeinanderfolgenden Tagen eine mucopurulente Ausscheidung und bei den Pferden 420 und 469 zeigte sich an einem Tag eine mucopurulente Ausscheidung. Ungeimpfte Kontrollpferde wiesen an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen vorwiegend eine mucopurulente Ausscheidung auf. Bei Analyse der Bewertungen der nasalen Ausscheidung gemäß dem Bewertungssystem des Tierprotokolls gab es Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Verteilung der Bewertungen der nasalen Ausscheidung zwischen der intramuskulären Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe an den Tagen 5–7 und 10 nach der Belastung (p ≤ 0,0018). Ähnliche Ergebnisse der serösen nasalen Ausscheidung wurden in der intramuskulären/intranasalen Gruppe nach der Belastung beobachtet, wobei für beide Impfgruppen eine mucopurulente Ausscheidung an einem oder zwei Tagen festgestellt wurde. Es gab Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Verteilung der Bewertung der nasalen Ausscheidungen zwischen der intramuskulären/intranasalen Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe an den Tagen 4–7, 10 und 19 nach der Belastung (p ≤ 0,0463).
Bei Analyse der Bewertungen der nasalen Ausscheidung gemäß dem System: normal = 0, serös = 1 und mucopurulent = 2, ergab sich offensichtlich ein signifikanter Unterschied zwischen der intramuskulären Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe an den Tagen 5–7, 10 und 17 nach der Belastung (p ≤ 0,0463). Ferner bestand offensichtlich ein signifikanter Unterschied in der Verteilung der Bewertungen der nasalen Ausscheidung zwischen der intramuskulären/intranasalen Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe an den Tagen 4–7 und 10 nach der Belastung (p ≤ 0,0092).
Ferner wurden nach der Belastung Beobachtungen von klinischen Symptomen in Bezug auf Konjunktivitis, Husten, Atemnot und Mattheit durchgeführt. An den Tagen 3–11 nach der Belastung wurden die schwersten Krankheitssymptome bei Pferden beobachtet. Die klinischen Krankheitssymptome traten besonders häufig an den Tagen 3–11 nach der Belastung auf. Ferner schien es eine zweite Phase von klinischen Symptomen zu geben, die bei geimpften Tieren und bei Kontrolltieren festgestellt wurde. Sie wurde jedoch bei geimpften Tieren nur an einzelnen Tagen und bei Kontrolltieren an mehreren Tagen festgestellt. Husten und Konjunktivitis waren die primären Symptome einer klinischen Krankheit, die bei geimpften Tieren in der Gruppe mit der intramuskulären Verabreichung beobachtet wurden. Konjunktivitis und Husten wurden bei den geimpften Tieren an nicht mehr als 3 aufeinanderfolgenden Tagen festgestellt. In der intramuskulären Gruppe gab es Anzeichen für eine signifikante Verringerung des Anteils an Tieren mit Konjunktivitis, verglichen mit ungeimpften Kontrolltieren, und zwar an den Tagen 6 und 7 nach der Belastung (p ≤ 0,0197). Ferner gab es in der intramuskulären Gruppe Anzeichen für eine signifikante Verringerung des Anteils an Tieren mit Husten im Vergleich zu ungeimpften Kontrolltieren, und zwar an den Tagen 4 bis 8 nach der Belastung (p ≤ 0,0463). Konjunktivitis und Husten stellten die häufigsten klinischen Krankheitssymptome bei der intramuskulären/intranasalen Impfgruppe dar. In der intramuskulären/intranasalen Gruppe gab es Anzeichen für eine signifikante Verringerung des Anteils an Tieren mit Konjunktivitis im Vergleich zu ungeimpften Kontrolltieren, und zwar an den Tagen 6 und 7 nach der Belastung (p ≤ 0,0197). Ferner gab es in der intramuskulären Gruppe Anzeichen für eine signifikante Verringerung des Anteils an Tieren mit Husten im Vergleich zu ungeimpften Kontrolltieren, und zwar an den Tagen 5 und 6 nach der Belastung (p ≤ 0,0044). Bei keinem der Tiere in der intramuskulären Impfgruppe wurde nach der Belastung Mattheit festgestellt und nur bei zwei Tieren in der intramuskulären/intranasalen Impfgruppe nach der Belastung. Mattheit wurde bei mehreren ungeimpften Kontrolltieren über mehrere Tage hinweg festgestellt. Im Gegensatz zu den geimpften Pferden zeigten ungeimpfte Kontrollpferde mehrere Krankheitssymptome, die im Allgemeinen auf 4 aufeinanderfolgenden Tagen und bis zu 7 oder 8 Tage anhielten. Atemnot wurde bei keinem der geimpften Pferde festgestellt, jedoch bei 2 Kontrollpferden an mehreren Tagen. Die gleichen beiden ungeimpften Kontrollpferde benötigten eine antibiotische Behandlung einer sekundären bakteriellen Infektion. Die Bewertungen der klinischen Krankheit, die gemäß dem Tierprotokoll berechnet wurden, sind in den Tabellen 7 und 8 für die intramuskulär geimpften Tiere im Vergleich zu Kontrolltieren bzw. für die intramuskulär/intranasal geimpften Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren aufgeführt.
Die Anzahl der klinischen Symptome wurde täglich bestimmt und mit 0, 1, 2 oder 3 wiedergegeben. Bei der Bestimmung der Anzahl der an jedem Tag auftretenden klinischen Symptome gab es Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Verteilung der Anzahl von klinischen Symptomen zwischen der intramuskulären Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe, und zwar an den Tagen 4 bis 8 (p ≤ 0,0206. Ferner gab es Anzeichen für einen signifikanten Unterschied in der Verteilung der Anzahl an klinischen Symptomen zwischen der intramuskulären/intranasalen Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe, und zwar an den Tagen 5 bis 7 (p ≤ 0,0159).
Eine zusammengesetzte klinische Bewertung wurde durch Bildung der Summe aus nasaler Ausscheidung und Bewertung der klinischen Symptome berechnet. Der Kruskal-Wallis-Test, eine für zahlreiche Gruppen geltende Erweiterung des Zweigruppen-Wilcoxon-Tests, wurde zum Test der Hypothese der Gleichwertigkeit von Bewertungen unter den Gruppen herangezogen. Der Wilcoxon-Test wurde zum Test der Hypothese einer Verringerung von Bewertungen für jede Impfgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (einseitiger Test) und zum Test der Hypothese der Gleichwertigkeit von Bewertungen zwischen Impfgruppen (zweiseitiger Test) herangezogen. Es gab Anzeichen für eine signifikante Verringerung der zusammengesetzten klinischen Bewertungen zwischen der intramuskulären Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe für die Tage 4 bis 7 und 11 nach der Belastung (p ≤ 0,0372) und für die gesamte zusammengesetzte klinische Bewertung (p ≤ 0,0001). Es gab Anzeichen für eine signifikante Verringerung der zusammengesetzten klinischen Bewertungen zwischen der intramuskulären/intranasalen Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe für die Tage 4 bis 7 und 11 nach der Belastung (p ≤ 0,0408) und für die gesamte zusammengesetzte klinische Bewertung (p ≤ 0,0002).
Eine modifizierte zusammengesetzte klinische Bewertung, nämlich der Summe der Bewertung der klinischen Beobachtungen und der Bewertung der nasalen Ausscheidung, jedoch nicht der Pyrexie, wurde ebenfalls berechnet. Es gab Anzeichen für eine signifikante Verringerung der modifizierten zusammengesetzten klinischen Bewertungen zwischen der intramuskulären Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe für die Tage 3 bis 8 und 10, 11 und 19 nach der Belastung (p ≤ 0,0383) und für die gesamte zusammengesetzte klinische Bewertung (p ≤ 0,0001). Ferner gab es Anzeichen für eine signifikante Verringerung der zusammengesetzten klinischen Bewertungen zwischen der intramuskulären/intranasalen Gruppe und der ungeimpften Kontrollgruppe für die Tage 3 bis 7 und 10, 11 und 19 nach der Belastung (p ≤ 0,0487) und für die gesamte zusammengesetzte klinische Bewertung (p ≤ 0,0001).
Virus-Abstoßung von Pferden nach der Belastung
EHV-1-Belastungsvirus wurde aus nasalen Proben von allen ungeimpften Kontrollpferden, die Virus nach der Belastung mit EHV-1 abstießen, gewonnen und bei –70°C aufbewahrt. Die eingefrorenen Proben wurden aufgetaut und der Tupfer wurde aus dem Transportmedium entfernt. Die Probe wurde durch 20-minütige Zentrifugation mit 2 500 × g bei 19–22°C verarbeitet. Eine Aliquotmenge von 0,1 ml der verarbeiteten Probe wurde in eine Mulde einer Gewebekulturplatte mit 48 Mulden, die Monolagers von Vero-Zellen im Alter von 24–48 Stunden enthielten, gegeben. Die Kulturplatten wurden 7 Tage bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Die Mulden wurden regelmäßig auf das Vorliegen des für EHV typischen zytopathischen Effekts (CPE) geprüft. Mulden, die Zytotoxizität zeigten, wurden nach 7-tägiger Inkubationsdauer durch Übertragung von 0,2 ml aus der Mulde auf eine Gewebekulturplatte mit 48 Mulden, die eine Monolager von Vero-Zellen mit einem Alter von 24 Stunden enthielten, einer Subkultur unterzogen. Die Kulturplatten wurden 7 Tage bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert und auf CPE geprüft. Der EHV-Titer in den verarbeiteten nasalen Proben, die in Bezug auf CPE positiv waren, wurde durch übliche Titrationsverfahren an Zellen in Gewebekulturplatten mit 96 Mulden bestimmt.
EHV-1-Belastungsvirus wurde aus den nasalen Proben sämtlicher ungeimpfter Kontrollpferde, die Virus nach der Belastung mit EHV-1 abstießen, gewonnen. Das in den nasalen Abstrichen festgestellte Virus wurde durch den Immunofluoreszenztest unter Verwendung von EHV-1-spezifischen monoklonalen Antikörpern als EHV-1 identifiziert. Das Virus wurde von ungeimpften Kontrollpferden in Verdünnungen von 10^–2 bis 10^–3 nachgewiesen. Die Tage 2 und 5 waren die hauptsächlichen Tage, an denen die Abstoßung von Virus festgestellt wurde. Das Belastungsvirus wurde nach der Belastung von 5 Pferden in der intramuskulären Impfgruppe und von 3 Pferden in der intramuskulären/intranasalen Impfgruppe gewonnen. In der intramuskulären Gruppe gab es Anzeichen für eine signifikante Verringerung des Anteils an Tieren, die das Virus aufwiesen, im Vergleich zur ungeimpften Kontrollgruppe, und zwar an den Tagen 2 bis 5 (p ≤ 0,0001). Ferner gab es in der intramuskulären/intranasalen Gruppe Anzeichen für eine signifikante Verringerung des Anteils an Tieren, die die Anwesenheit von Virus zeigten, im Vergleich zur ungeimpften Kontrollgruppe, und zwar an den Tagen 2 bis 5 (p ≤ 0,0003).
Kriterien für eine befriedigende Studie
Für eine zufriedenstellende EHV-Immunogenizitätsstudie müssen die folgenden Kriterien erfüllt sein:
Ungeimpfte Kontrollpferde müssen während der Impfperiode seronegativ in Bezug auf EHV-1 und EHV-4 bleiben und/oder dürfen keine klinischen Krankheitssymptome als Indikator für eine Belastung von Testpferden mit virulentem Feldvirus zeigen.
Nach der Belastung mit virulentem EHV-1 muss eine statistisch signifikante Verringerung der klinischen Krankheitssymptome bei den geimpften Tieren im Vergleich zu den klinischen Krankheitssymptomen bei den ungeimpften Kontrolltieren auftreten.
Schlussfolgerungen
In dieser Studie wurden Gruppen von männlichen und weiblichen Fohlen im Alter von 3 bis 4 Monaten mit drei Impfstoffdosen bei Verabreichung auf intramuskulärem oder intramuskulärem/intranasalem Weg geimpft. Nach der Verabreichung von drei Impfstoffdosen entwickelten sämtliche geimpften Tiere VN-Antikörper. Die Entwicklung der systemischen humoralen Reaktion war bei auf intramuskulärem Weg geimpften Tieren ähnlich wie bei auf intramuskulärem/intranasalem Weg geimpften Tieren. Die Impfung von Pferden mit dem EHV-1 enthaltenden Impfstoff erzeugte hohe Konzentrationen an VN-Antikörper gegen EHV-1 und gegen EHV-4. Somit war der EHV-1 enthaltende Impfstoff zur Immunisierung von Pferden gegen EHV-1 befähigt und ferner dazu befähigt, eine Kreuzimmunisierung von Pferden gegen EHV-4 herbeizuführen. Bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung abnormale Reaktionen auf die Impfung oder Reaktionen an der Injektionsstelle beobachtet.
Zur Bewertung der Fähigkeit des EHV-1 enthaltenden Impfstoffes zum Schutz von Pferden gegen die durch EHV-1 hervorgerufene respiratorische Erkrankung wurden die klinischen Symptome der respiratorischen Erkrankung bei geimpften Pferden mit der klinischen Erkrankung bei ungeimpften Kontrollpferden nach Belastung mit einem virulenten Stamm von EHV-1-Stamm KyD verglichen. Etwa 6 Wochen nach der dritten Impfung mit dem EHV-1 enthaltenden Impfstoff wurden geimpfte Pferde und ungeimpfte Kontrollpferde intranasal mit virulentem EHV-1 belastet. Eine schwere respiratorische Erkrankung, die aus längeren Episoden einer serösen und mucopurulenten nasalen Ausscheidung, Konjunktivitis, Husten, Mattheit und Atemnot bestanden, wurde bei den ungeimpften Kontrollpferden nach Belastung mit virulentem EHV-1 beobachtet. Im Gegensatz zu den Kontrolltieren waren bei den geimpften Pferden die Anzahl der klinischen Symptome einer respiratorischen EHV-1-Erkrankung, die Schwere der klinischen Symptome und die Anzahl an geimpften Tieren mit klinischen Symptomen signifikant verringert. Die Impfung auf intramuskulärem Weg und die Impfung auf intramuskulärem/intranasalem Weg bewirkte eine ähnliche Verringerung der klinischen Symptome der respiratorischen Erkrankung aufgrund der EHV-1-Infektion. Die Verringerung der klinischen Krankheit bei den geimpften Tieren wird durch die Daten gestützt, dass weniger Pferde, die auf intramuskulärem und intramuskulärem/intranasalem Weg geimpft worden waren, nach der EHV-1 Belastung Virus abstießen und das Virus nur für kürzere Zeitspannen abstießen.
Die Ergebnisse der Studie belegten, dass der Impfstoff mit einem Gehalt an durch inaktiviertes EHV-1 erzeugtem VN-Antikörper sich als immunogen in Bezug auf einen Schutz von Pferden gegen die durch EHV-1 hervorgerufene respiratorische Erkrankung erwiesen, und zwar bei Verabreichung entweder auf intramuskulärem Weg oder auf intramuskulärem/intranasalem Weg.
Beispiel 7 – Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an inaktivierten EHV-1- und EHV-4-Stämmen
Zur Herstellung des Kombinationsimpfstoffes wurden zunächst Master-Anzuchtkulturen von EHV-1 und EHV-4 hergestellt. Aus diesen Master-Anzuchtkulturen wurden getrennte Kulturen von EHV-1 und EHV-4 gezüchtet und anschließend inaktiviert. Die inaktivierten Viruskulturen wurden sodann zur Herstellung des Kombinationsimpfstoffes mit Adjuvans vermischt. Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung des inaktivierten EHV-1/EHV-4-Kombinationsimpfstoffes beschrieben.
Flüssigkeiten mit einem Gehalt an inaktiviertem EHV-1-KyA aus der Master-Anzuchtviruskultur-Flüssigkeit mit der Bezeichnung EHV-1-KyA, MSV Charge 001-dil wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Zur Herstellung des Master-Anzuchtvirus von equinem Herpesvirus Typ 4 (EHV-4) wurde bei der Fa. Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., Virus von einem mit Rhinitis infizierten Pferd isoliert. Das isolierte Virus wurde einer 5-maligen Passage an Vero-A 139-Zellen und einer 3-maligen Passage an EVero-Zellen unterworfen. Die dritte Passage wurde als Master-Anzuchtvirus verwendet und mit EHV-4, MSV Charge 001-dil bezeichnet.
Kulturen von EHV-4 wurden durch Infektion von EVero-Zellen mit Anzuchtvirus, das in minimalem essentiellem Medium (MEM) mit einem Gehalt an 0 bis 5% Serum enthalten war, hergestellt. Die Kulturen wurden sodann 24 bis 120 Stunden in gläsernen Rollflaschen oder an Mikroträgerperlen inkubiert. Während der Inkubation wurden die Kulturen auf durch EHV induzierte zytopathische Effekte (CPE) geprüft, um die Reinheit des EHV-Stammes zu gewährleisten. Wenn sich atypische CPE oder etwaige makroskopische oder mikroskopische Anzeichen für eine Verunreinigung ergaben, wurde die Kultur verworfen. Reine Viruskulturen wurden aseptisch in sterilen Glasballons, sterilen Kunststoffballons oder sterilen Behältern aus rostfreiem Stahl geerntet und durch Filtration durch Filter mit 8 μm oder mehr geklärt. Nach der Ernte wurde die Viruskultur inaktiviert, um einen abgetöteten Impfstoff herzustellen, wobei man sich des für EHV-1 in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bediente.
Nach der Inaktivierung wurden die Kulturen auf für EHV typische CPE getestet, um die Inaktivierung des Virus zu gewährleisten, wobei man sich des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens bediente. Dieses Ziel wurde erreicht, indem die mit BEI behandelten viralen Flüssigkeiten über EVero-Zellen geleitet wurden und die EVero-Zellen auf eine etwaige virale Infektion geprüft wurden. Nach einem zufriedenstellenden Inaktivierungstest, der keine virale Infektion ergab, wurde das BEI durch Zugabe einer kalten (4 ± 2°C) Lösung von 1,0 M Natriumthiosulfat unter Erzielung einer Endkonzentration von 6 mM neutralisiert.
Nach der Inaktivierung und nach dem Test der EHV-1- und EHV-4-Kulturen wurden die Kulturen mit Adjuvans zur Bildung des Endprodukts, nämlich des inaktivierten EHV-1/EHV-4-Kombinationsimpfstoffes, vermischt. Das Endprodukt enthielt EHV-1-Flüssigkeit, EHV-4-Flüssigkeit, Adjuvans-Vorratslösung (0,5% Carbopol^R 971) und Kochsalzlösung in einem Verhältnis von 3,75:3,00:12,00:41,19. Typischerweise enthielt ein Ansatz 3 750 ml EHV-1, 3 000 ml EHV-4, 12 000 ml Adjuvanslösung und 41 190 ml Kochsalzlösung, woraus sich ein Gesamtvolumen von 60 Liter einer Serie ergab.
Beispiel 8 – Inokulation von Pferden mit EHV-1- und EHV-4-Kombinationsimpfstoff und anschließende Belastung mit virulentem EHV-4
Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Immunogenizität des inaktivierten EHV-1/EHV-4-Impfstoffes nachzuweisen. Sechs Gruppen von männlichen und weiblichen Pferden im Alter von 4–7 Monaten, die gegenüber EHV-1 und EHV-4 virusneutral waren, wurden in diesem Experiment eingesetzt. Wie in der nachstehenden Tabelle VIII-1 dargelegt, wurden drei Gruppen mit virulentem EHV-1 und drei Gruppen mit virulentem EHV-4 belastet. Von den mit EHV-1 belasteten Pferden wurde eine Gruppe mit drei intramuskulären ("IM") Injektionen geimpft, eine Gruppe wurde mit zwei intramuskulären Injektionen unter einer anschließenden intranasalen ("IN") Verabreichung geimpft und eine Gruppe blieb ungeimpft. Gleichermaßen wurde von den mit EHV-4 belasteten Pferden eine Gruppe mit rein intramuskulären Injektionen geimpft, eine Gruppe wurde mit zwei intramuskulären Injektionen und einer anschließenden intranasalen Verabreichung geimpft und eine Gruppe blieb ungeimpft.
Die Pferde wurden im Abstand von 3 Wochen mit 2 ml-Dosen des Kombinationsimpfstoffes mit einem RPV-Wert von 1,0 pro Dosis an inaktiviertem EHV-1 und 1,0 pro Dosis an inaktiviertem EHV-4 geimpft. Während der Studie wurden die Pferde auf Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung überwacht.

Bei keinem der Pferde wurden während der Impfperiode klinische Symptome einer respiratorischen Erkrankung beobachtet. Tabelle VIII-1 Zusammenfassung des EHV-1/EHV-4-Kombinationsimpfstofftests

Gruppe	Anzahl der Tiere	Impfverfahren	Belastung
Gruppe IV-1	10	IM, IM, IM	EHV-1
Gruppe IV-2	10	IM, IM, IN	EHV-1
Gruppe IV-3	10	Keines (Kontrollgruppe)	EHV-1
Gruppe IV-4	10	IM, IM, IM	EHV-4
Gruppe IV-5	10	IM, IM, IN	EHV-4
Gruppe IV-6	19	Keines (Kontrollgruppe)	EHV-4

Die Tiere wurden 3 Wochen nach der Impfung entweder mit virulentem EHV-1 oder virulentem EHV-4 mit einer Zieldosis von 5,0 TCID₅₀ Log₁₀/2 ml belastet. Speziell wurden EHV-1-Kentucky D-Stamm (ungefähre Dosis von 4,5 TCID₅₀ Log₁₀/2 ml) und EHV-4-405-Stamm (ungefähre Dosis von 4,0 TCID₅₀ Log₁₀/2 ml) als Belastungsviren verwendet und intranasal in 2 ml-Dosen (verabreicht als 1 ml-Dosis pro Nüster) verabreicht. Der Schutz durch den Impfstoff wurde gemessen, indem die klinischen Symptome einer respiratorischen Erkrankung, wie Pyrexie, nasale Ausscheidung, Konjunktivitis, Husten, Atemnot und Mattheit überwacht und die Schwere der Krankheit bestimmt wurde. Ferner wurden Blut- und nasale Proben zur Messung der Menge des Virusausstoßes entnommen.
Nach der Virusbelastung zeigten sämtliche Gruppen von geimpften Tieren, die mit EHV-1 oder EHV-4 belastet worden waren, eine signifikante Verringerung der Symptome einer respiratorischen Erkrankung, wobei sich ein geringer Unterschied zwischen der parenteralen Impfgruppe und der parenteralen/intranasalen Impfgruppe ergab. Speziell ergab sich bei den geimpften Tieren eine signifikante Verringerung in Bezug auf nasale Ausscheidung, Konjunktivitis, Husten, Atemnot und Mattheit. Diese Ergebnisse belegen, dass die im inaktivierten EHV-1/EHV-4-Kombinationsimpfstoff enthaltenen EHV-1 und EHV-4-Antigene immunogen sind, wenn sie auf parenteralem oder parenteralem/intranasalem Weg verabreicht werden.
Zusätzlich zu der Tatsache, dass die geimpften Pferde eine Verminderung der respiratorischen Erkrankung zeigten, ergab sich bei den geimpften Pferden auch eine Verringerung des Virusausstoßes. Unter den mit EHV-1 belasteten geimpften Pferden wurde ein Virusausstoß von 1 bis 2,5 Log₁₀ TCID₅₀/ml für 1–3 Tage bei nur 30% der parenteralen Impfgruppe und bei 40% der parenteralen/intranasalen Gruppe beobachtet. Im Gegensatz dazu ergab sich bei 90% der ungeimpften Kontrollgruppe ein Virusausstoß von 2,5 bis 3,75 Log₁₀ TCID₅₀/ml für 2–7 Tage. Gleichermaßen wurde bei den geimpften Pferden, die mit dem virulenten EHV-4-Stamm belastet worden waren, ein Virusausstoß von 1 bis 2,5 Log₁₀ TCID₅₀/ml an 1 bis 3 Tagen nur bei 40% der parenteralen Impfgruppe und bei 50% der parenteralen/intranasalen Gruppe beobachtet. Auch hier war bei den ungeimpften Pferden der Virusausstoß erheblich größer, und zwar 100% der ungeimpften Kontrollgruppe zeigten einen Virusausstoß von 1 bis 5,25 Log₁₀ TCID₅₀/ml an 2 bis 7 Tagen. Diese statistischen Daten stellen einen Beleg für eine signifikante Verringerung der Menge des Virusausstoßes und der Anzahl der Tage mit Virusausstoß bei den geimpften Pferden im Vergleich zu ungeimpften Pferden dar. Dies belegt, dass die im inaktivierten EHV-1/EHV-4-Kombinationsimpfstoff enthaltenen EHV-1- und EHV-4-Antigene immunogen sind, wenn die Verabreichung parenteral oder parenteral/intranasal erfolgt.
Beispiel 9 – Inokulation von Pferden mit dem EHV-1/EHV-4/Pferdegrippe-Kombinationsimpfstoff und anschließende Belastung mit virulentem Pferdegrippe-Virus
Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die Immunogenizität der EIV-Impfstofffraktionen zu bewerten, wobei die serologische Reaktion auf EIV-A1- und A2-Untergruppen im Wirtstier bewertet wurde. Die Studie diente auch zum Nachweis dafür, dass sich die EIV- und EHV-Komponenten in einem Rhinopneumonitis-Influenza-Kombinationsimpfstoff mit abgetötetem Virus gegenseitig nicht störten. Dieser Nachweis wurde durch die serologische Bewertung im Wirtstier geführt. Ein drittes Ziel bestand darin, den Nachweis zu erbringen, dass die EIV-A1-Untergruppe und die EIV-A2-Untergruppen im Grippeimpfstoff und den Rhinopneumonitis-Influenza-Kombinationsimpfstoffen bei parenteraler und parenteraler/intranasaler Verabreichung immunogen sind.
Konzeption der Studie
Der Impfstoff A wurde gemäß zwei Impfschemata an Pferde verabreicht. Ein Impfschema bestand aus drei intramuskulären Impfungen im Abstand von 3 Wochen. Das andere Schema bestand aus zwei intramuskulären Impfungen im Abstand von 3 Wochen und einer dritten Impfung auf intranasalem Wege 3 Wochen später. Jede Impfgruppe umfasste 20 Pferde. Eine Gruppe von 5 Pferden diente als ungeimpfte Kontrolltiere. Blutproben und Nasenspülungen wurden vor der Impfung und zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Impfung zur Bewertung der serologischen Reaktion auf jeden der drei EIV-Impfstämme entnommen. Blutproben und Nasenspülungen der Pferde wurden in periodischen Abständen gewonnen. Die Pferde wurden auf ihren allgemeinen Gesundheitszustand und auf ein etwaiges abnormales Verhalten oder abnormale Gesundheitsbedingungen während der 63-tägigen Versuchsdauer beobachtet.
Pferde
Gesunde männliche und weibliche Pferde im Alter von 7–9 Monaten wurden von ausgewählten Quellen bezogen. Die Pferde wurden durch Mikrochipnummern durch Ziehen der Identifikationsnummern der Pferde aus einem Beutel willkürlich in Gruppen eingeteilt. Während der Versuchsdauer wurden die Pferde in offenen Pferchen gehalten und nach freier Wahl mit Luzernenheu für die Milchviehzucht, Sweet 14-Futterergänzung, Pferde-Biomineralien und Wasser nach Belieben versorgt. Die Pferde wurden während der Versuchsdauer auf ihren allgemeinen Gesundheitszustand und etwaiges abnormales Verhalten beobachtet. Bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung ein abnormales Verhalten oder nachteilige Gesundheitszustände festgestellt und bei keinem der Pferde wurden nach der Impfung Reaktionen an der Injektionsstelle festgestellt. Zum Zeitpunkt der ersten Impfung wiesen Pferde, die mit dem Impfstoff A geimpft worden waren, Antikörperfiter der Hämagglutinationshemmung (HAI) von 510 gegenüber EIV-A1- und A2-Untergruppen auf.
Impfstoff
Der Impfstoff umfasste abgetötetes EIV-Virus, der die EIV-Untergruppe A1 und antigenrelevante EIV-A2-Untergruppenstämme enthielt. Da sich die A2-Untergruppen in Nordamerika von den A2-Untergruppen in Europa unterscheiden, enthielt der Impfstoff die Stämme mit den Bezeichnungen Kentucky/95 und Newmarket/2/93, die repräsentativ für die A2-Untergruppen für Nordamerika bzw. Europa sind. EIV- und EHV-Virusflüssigkeiten zur Verwendung im Impfstoff wurden gemäß den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Virusflüssigkeiten stammten aus der 5. Passage von Master-Anzuchtvirus und wurden auf Zellen in der 20.Passage des Master-Zellvorratsmaterials hergestellt. Der Impfstoff A wurde so zubereitet, dass er 64 HA-Einheiten der EIV-A1-Untergruppe, 128 HA-Einheiten jeweils der beiden EIV-A2-Untergruppen und ≥ 3,0 relative Wirkungsstärke (RP)-Einheiten von EHV-1 und ≥ 3,0 relative Wirkungsstärke (RP)-Einheiten von EHV-4 pro 2 ml-Dosis enthielt. Der Impfstoff wurde als EIV/EHV-Imm/Intfr, 623-0856-98E-107, Impfstoff A Charge 001, 12-15-98, bezeichnet.
Bestimmung der Wirkungsstärke von EIV- und EHV-Fraktionen von Impfstoff A
Die Wirkungsstärke der EIV-Fraktionen im Impfstoff wurde gemäß dem National Veterinary Services Laborstories Testing Protocol, Supplemental Assay Method for Conducting the Hemagglutination Inhibition Assay for Equine Influenza Antibody (MVSAM0124.01, vom 2. Oktober 1998) bestimmt. Die Werte für die relative Wirkungsstärke der EHV-1- und EHV-4-Fraktionen im Impfstoff A wurden durch den in Beispiel 4 beschriebenen EHV-ELISA-Potency Release Assay bestimmt. Die Wirkungsstärke von Impfstoff A war für die EIV-Fraktionen zufriedenstellend. 10 von 10 Meerschweinchen wiesen HAI-Antikörpertiter von 80 oder mehr für die A1-Untergruppe auf und 10 von 10 Meerschweinchen wiesen HAI-Antikörpertiter von 40 oder mehr für jede A2-Untergruppe im Impfstoff auf. Der Wert für die relative Wirkungsstärke betrug 4,73 bzw. 3,31 für die EHV-1- bzw. EHV-4-Fraktionen.
Serum-HAI-Antikörpertiter für die EIV-Untergruppen A1 und A2 nach der Impfung
Die HAI-Antikörpertiter in Pferden nach Impfung mit Impfstoff A wurden bestimmt. Sämtliche geimpften Tiere waren zum Zeitpunkt der ersten Impfung in Bezug auf alle drei EIV-Stämme seronegativ. Während der Periode vor der Impfung wiesen zwei der ungeimpften Kontrollpferde HAI-Antikörpertiter von 20 gegenüber EIV-A1 auf und die drei übrigen Kontrollpferde waren in Bezug auf EIV-A1 seronegativ. Sämtliche fünf ungeimpften Kontrollpferde waren in Bezug auf die beiden EIV-A2 seronegativ. Während der Versuchsdauer blieben die ungeimpften Kontrollpferde gegenüber den beiden EIV-Untergruppe A2-Stämmen seronegativ und zeigten nicht mehr als eine 2-fache Variation der HAI-Antikörpertiter gegenüber der EIV-Untergruppe A1. Es gab keine Anzeichen einer Belastung gegenüber Feld-EIV während der Versuchsdauer. 3 Wochen nach der ersten Impfung zeigte die Mehrheit der Pferde eine serologische Reaktion auf die EIV-A1-Untergruppe und auf die EIV-A2-NM-Untergruppe. Nach einer Impfung wiesen nur vier Pferde eine serologische Reaktion auf die EIV-A2-K-Untergruppe auf. Die Anzahl an Pferden mit einer serologischen Reaktion auf die EIV-A2-K-Untergruppe stieg nach der zweiten Impfung an. Nach der dritten Impfung wiesen 19 von 20 Pferden (95%), die drei intramuskuläre Impfungen erhalten hatten, HAI-Antikörpertiter von 40 oder mehr gegenüber der EIV-A1-Untergruppe auf. Nach drei intramuskulären Injektionen wiesen 18 von 20 (90%) und 20 von 20 (100%) der Pferde HAI-Antikörpertiter von 20 oder mehr gegenüber der EIV-A2-K- bzw. der EIV-A2-NM-Untergruppe auf. Gleichermaßen wiesen 17 von 20 Pferden (85%), die zwei intramuskuläre Impfungen und eine intranasale Impfung erhalten hatten, HAI-Antikörpertiter von 40 oder mehr gegenüber der EIV-A1-Untergruppe auf. 18 von 20 (90%) und 20 von 20 (100%) der Pferde wiesen HAI-Antikörpertiter von 20 oder mehr gegenüber der EIV-A2-K- bzw. EIV-A2-NM-Untergruppe auf, und zwar nach zwei intramuskulären und einer intranasalen Impfung. Die geometrischen Mittelwerte der Antikörpertiter nach der dritten Impfung betrugen 45, 35 bzw. 61 für die EIV-A1-, A2-K- bzw. A2-NM-Untergruppe, und zwar bei Pferden, die drei intramuskuläre Injektionen erhalten hatten. Die geometrischen Mittelwerte der Antikörpertiter bei Pferden, die zwei intramuskuläre und eine intranasale Impfung erhalten hatten, betrugen 39, 24 bzw. 51 für die EIV-A1-, A2-K- bzw. A2-NM-Untergruppen.
Mucosale HAI-Antikörpertiter gegenüber den EIV-Untergruppen A1 und A2 nach der Impfung
Die HAI-Antikörpertiter in nasalen Proben der Pferde nach Impfung mit Impfstoff A wurden bestimmt. Zum Zeitpunkt der ersten Impfung wurden HAI-Antikörper gegen die beiden EIV-A2-Untergruppen in keiner der nasalen Proben der Pferde festgestellt. Die Titer der Hämagglutinationshemmung in Bezug auf die EIV-Untergruppe A1 wurden bei einigen der geimpften Pferde und der ungeimpften Kontrollpferde bei der ersten Impfung festgestellt. Nach der ersten und zweiten Impfung waren die HAI-Antikörper in nasalen Sekreten variabel. Nach der letzten intramuskulären oder intranasalen Impfung waren die HAI-Antikörperkonzentrationen für die EIV-A1-Untergruppe höher als für die beiden A2-Untergruppen. Es lag wenig oder gar kein HAI-Antikörper gegen die EIV-A2-K-Untergruppe in nasalen Proben von Pferden nach der dritten Impfung entweder auf intramuskulärem oder auf intranasalem Weg vor. Interessanterweise waren die HAI-Antikörperkonzentrationen in Bezug auf die EIV-A1-Untergruppe und die -A2-NM-Untergruppe bei Pferden, die die dritte Impfung auf intranasalem Weg erhalten hatten, geringer.
Diskussion
Ein Ziel dieser Studie bestand darin, die Immunogenizität der EIV-A1- und -A2-Fraktionen im Impfstoff bei Verabreichung durch beide Impfschemata nachzuweisen. die Immunogenizität wurde durch Bestimmung der Serum-HAI-Antikörperreakion auf die drei EIV-Stämme nach der letzten Impfung ermittelt. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr als 80% der Pferde in beiden Impfschemagruppen Serum-HAI-Antikörpertiter von 40 oder mehr gegenüber der EIV-A1-Untergruppe nach der letzten Impfung aufwiesen und mehr als 80% der Pferde in beiden Impfschemagruppen Serum-HAI-Antikörpertiter von 20 oder mehr gegenüber beiden EIV-A2-Untergruppen nach der letzten Impfung aufwiesen. Die HAI-Antikörperkonzentrationen gegen die EIV-A1- und -A2-Untergruppen wurden ferner in nasalen Proben zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Impfung bestimmt. Die mucosalen HAI-Antikörperfiter waren in nasalen Proben von Pferden in beiden Impfschemata niedriger als die Serum-HAI-Antikörpertiter und im Gegensatz zu Serum-HAI-Titern nahmen die mucosalen HAI-Titer nach jeder Impfung nur geringfügig zu. Es ist möglich, dass der Test auf Hämagglutinationshemmung nicht den Isotyp von Antikörper nachweist, der in nasalen Proben vorherrscht. Die Experimente zeigen, dass die EIV-A1-Untergruppe und die A2-Untergruppen im Grippeimpfstoff, abgetötetes Virus, und im Rhinopneumonitis-Grippe-Impfstoff, abgetötetes Virus, bei Verabreichung sowohl auf parenteralem als auch auf parenteralem/intranasalem Weg immunogen waren. Insbesondere belegte die Studie, dass die EIV-NM/77-A1-Untergruppe und die K95-A2-Untergruppe sowie die NM/2/93-A2-Untergruppen immunogen waren.
Ein weiteres Ziel der Studie bestand in dem Nachweis, dass sich die EIV- und EHV-Impfstofffraktionen gegenseitig nicht störten. Der in dieser Studie verwendete Impfstoff A wurde mit der minimalen Freisetzungsdosis von 64 bzw. 128 HA-Einheiten der EIV-A1- bzw. A2-Fraktionen zubereitet. Die Zubereitung erfolgte mit einer relativen Wirkungsstärke, die dem 3-fachen oder mehr für die EHV-1- und EHV-4-Fraktionen entsprach. Die Ergebnisse der Studien belegten, dass ein Impfstoff, der die minimale Antigendosis der EIV-Fraktionen und mehr als die minimale EHV-Antigendosis enthielt, dazu in der Lage ist, eine zufriedenstellende serologische Reaktion auf die EIV-A1- und A2-Untergruppen im Wirtstier zu erzeugen. Somit störten die EHV-1- und EHV-4-Fraktionen nicht die Immunogenizität der EIV-Impfstofffraktionen. Gleichermaßen führten die EHV-Fraktionen nicht zu einem unbefriedigenden Test der Wirkungsstärke im Meerschweinchenmodell.
Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf spezielle und erläuternde Ausführungsformen und Techniken beschrieben. Es ist jedoch ersichtlich, dass zahlreiche Variationen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Geist und den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. Hier wurden ausführlich verschiedene Ausführungsformen erörtert, es ist jedoch ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung erfinderische Konzepte bereitstellt, die in unterschiedlichen Zusammenhängen realisiert werden können. Die speziell hier erörterten Ausführungsformen dienen lediglich der Erläuterung spezieller Möglichkeiten zur Herstellung und Verwendung der vorliegenden immunogenen Zusammensetzungen und sind nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung anzusehen. Verschiedene Modifikationen und Kombinationen der erläuternden Ausführungsformen sowie weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich für den Fachmann beim Studium der Beschreibung.

Claims

Impfstoff zum Schutz eines Pferdes gegen Krankheiten, die mit equinem Herpesvirus (EHV)-1, EHV-4 oder einer Kombination davon assoziiert sind, umfassend: chemisch inaktiviertes EHV-1-Kentucky A (KyA)-Virus; und ein Adjuvans, das ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das EHV-1-KyA-Virus chemisch durch Behandlung mit einem chemischen Inaktivierungsmittel inaktiviert ist, das eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ethylenimin, Derivaten von Ethylenimin und Gemischen davon besteht.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das EHV-1-KyA-Virus chemisch durch Behandlung mit binärem Ethylenimin inaktiviert ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, ferner umfassend inaktiviertes EHV-4.
Impfstoff nach Anspruch 1, ferner umfassend inaktiviertes equines Influenza-Virus (EIV).
Impfstoff nach Anspruch 5, wobei das inaktivierte equine Influenza-Virus inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp A1 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 6, wobei das inaktivierte EIV-Virus-Subtyp-A1 den inaktivierten EIV-A1-Virus-Stamm von A/EQ1/Newmarket/77 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 5, wobei das inaktivierte equine Influenza-Virus inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp-A2 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei das inaktivierte EIV-Virus-Subtyp A2 den inaktivierten EIV-A2-Virusstamm Newmarket/2/93, den inaktivierten EIV-A2-Virusstamm Kentucky/95 oder ein Gemisch davon umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 5, umfassend inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp A1 und inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp A2.
Impfstoff nach Anspruch 10, umfassend den inaktivierten EIV-A1-Virusstamm A/EQ1/Newmarket/77, den inaktivierten EIV-A2-Virusstamm Newmarket/2/93 und den inaktivierten EIV-A2-Virusstamm Kentucky/95.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Impfstoff zum Schutz von Pferden gegen EHV-1 und EHV-4 in der Lage ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das vernetzte, olefinisch ungesättigte Carbonsäure-Polymere ein vernetztes Acrylsäure-Polymeres umfasst.
Impfstoff zum Schutz eines Pferdes gegen Krankheiten, die mit EHV-1, EHV-4 oder einer Kombination davon assoziiert sind, umfassend: EHV-1-KyA-Virus, das durch Behandlung mit einem chemischen Inaktivierungsmittel inaktiviert ist, das Ethylenimin, ein Derivat von Ethylenimin oder ein Gemisch davon umfasst; und ein bioadhäsives Adjuvans, das ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei das chemische Inaktivierungsmittel binäres Ethylenimin umfasst.
Verwendung eines EHV-1-KyA-Virus, das durch Behandlung mit einem chemischen Inaktivierungsmittel inaktiviert ist, das Ethylenimin, ein Derivat von Ethylenimin oder ein Gemisch davon umfasst, und eines bioadhäsiven Adjuvans, das ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres umfasst, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung von Pferden gegen equines Herpes-Virus.
Verwendung eines chemisch inaktivierten EHV-1-KyA-Virus und eines Adjuvans, das ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres umfasst, zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz eines Pferdes gegen Krankheiten, die mit EHV-1, EHV-4 oder einer Kombination davon assoziiert sind, wobei der Impfstoff dem Pferd verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Verabreichung des Impfstoffes an das Pferd folgendes umfasst: die parenterale Verabreichung des Impfstoffes; und die intranasale Verabreichung des Impstoffes.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Verabreichung des Impfstoffes an das Pferd folgendes umfasst: die parenterale Verabreichung des Impfstoffes mindestens einmal in einer ersten Stufe; und die intranasale Verabreichung des Impfstoffes in einer anschließenden Stufe.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Impfstoff ferner inaktiviertes EHV-4 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Impfstoff ferner inaktiviertes equines Influenza-Virus umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Impfstoff inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp-A1 und inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp-A2 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines equinen Herpes-Virus-Impfstoffes, umfassend: (a) das Inokulieren von Affenzellen mit EHV-1-KyA-Virus; (b) das Inkubieren der inokulierten Affenzellen; (c) das Ernten von EHV-1-KyA-Virus aus den inkubierten Zellen; (d) das Behandeln der geernteten Virus-enthaltenden Flüssigkeiten mit einem chemischen Inaktivierungsmittel, das Ethylenimin, ein Derivat von Ethylenimin oder ein Gemisch davon umfasst, um inaktiviertes EHV-1-KyA-Virus zu bilden; und (e) das Zugeben eines Adjuvans zum inaktivierten EHV-1-KyA-Virus, wobei das Adjuvans ein vernetztes Acrylsäure-Polymeres umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei den Affenzellen um Vero-Zellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das chemische Inaktivierungsmittel binäres Ethylenimin umfasst.
Kit, umfassend in Kombination (1) eine Abgabeeinrichtung, die zur Verabreichung eines Impfstoffes an ein Pferd befähigt ist; und (2) eine Zusammensetzung zum Schützen gegen Krankheiten, die mit EHV-1, EHV-4 oder einer Kombination davon assoziiert sind, wobei die Zusammensetzung folgendes umfasst: chemisch inaktiviertes EHIV-1-KyA-Virus; und ein Adjuvans, das ein vernetztes, olefinisch ungesättigtes Carbonsäure-Polymeres umfasst.
Kit nach Anspruch 26, wobei die Abgabeeinrichtung zum Abgeben ihres Inhalts in Form von Tröpfchen befähigt ist; und die Zusammensetzung zum Schutz gegen Krankheiten, die mit EHV-1, EHV-4 oder einer Kombination davon bei intranasaler Verabreichung befähigt ist.
Impfstoff nach Anspruch 14, wobei der Impfstoff folgendes umfasst: inaktiviertes EHV-4-Virus; inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp A1; und inaktiviertes EIV-Virus-Subtyp A2.