MXPA03008287A - Vacuna de herpesvirus equino. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una vacuna para proteger a un caballo contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4. La vacuna incluye comunmente EHV-1 inactivado (e.g., virus de EHV-1 KyA quimicamente inactivado) y un adyuvante. El adyuvante puede incluir un polimero de acido carboxilico olefinicamente insaturado, reticulado, el cual puede tener propiedades bioadhesivas. La vacuna puede tambien incluir antigenos contra otros patogenos equinos, tal como EHV-4 inactivado y cepas A1 y/o A2 inactivadas del virus de influenza equina. Tambien se proporcionan metodos para proteger caballos contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4 y metodos para producir la vacuna del herpesvirus equino.

Description

VACUNA DE HERPESVIRUS EQUINO Las enfermedades respiratorias son una causa principal de pérdidas económicas en la industria equina. Los herpesvirus equinos (EHV, por sus siglas en inglés), los virus de influenza equina (EIV, por sus siglas en inglés), y la bacteria, Streptococcus equi, son patógenos en la mayoría de las veces asociados con enfermedad respiratoria infecciosa en los caballos. Universalmente, los herpesvirus equinos son principalmente patógenos asociados con morbosidad en caballos como un resultado de infección respiratoria. Tanto el herpesvirus equino del tipo 1 (EHV-1, por sus siglas en inglés) como del tipo 4 (EHV-4, por sus siglas en inglés) pueden causar enfermedad respiratoria. El EHV-1 también está asociado con enfermedad de aborto y neurológica. Debido al alto grado de movilidad y la naturaleza internacional de la industria equina, se necesitan vacunas eficaces para reducir la enfermedad y controlar la propagación de estos patógenos. Un número de vacunas de EHV están comercialmente disponibles. Sin embargo, ninguna generalmente es capaz de conferir protección de larga duración y la mayoría requiere de inmunizaciones de refuerzo frecuentes para lograr un nivel significante de protección contra la infección por EHV. La ruta más comúnmente recomendada de administración es vía una inyección intramuscular, a pesar de que el sistema respiratorio es un ciclo primario de la infección en muchos casos. Además, algunas de las vacunas comerciales han sido reportadas que provocan efectos colaterales indeseables. Se han reportado un número de intentos en desarrollar una vacuna recombinante para EHV. Esta propuesta, sin embargo, todavía no ha resultado en la introducción de una vacuna recombinante comercial que haya logrado aceptación muy difundida . La literatura reporta haber consistentemente documentado un alto grado de variabilidad en la capacidad de vacunas a base de cepas de EHV-1 para proporcionar protección cruzada contra la infección por cepas de EHV-4. Mientras las vacunas a base de cepas EHV-4 han mostrado una gran propensión a proporcionar alguna protección contra tanto las cepas de EHV-1 como de EHV-4, la protección cruzada a base de cepas de EHV-4 también ha sido reportada que muestra variabilidad. Por consiguiente existe una continua necesidad de desarrollar vacunas adicionales capaces de proteger a los caballos contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4. Podría también ser ventajoso desarrollar una vacuna que sea efectiva contra EHV-1 y/o EHV-4, que pudiera ser administrada vía intranasal así como métodos por vía parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea o intravenosamente) .

LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que incluyen una forma inactivada de EHV-1. En particular, la solicitud proporciona una vacuna para proteger caballos contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4. La vacuna incluye EHV-1 inactivado (e.g., virus de EHV-1 KyA químicamente inactivado) y típicamente también incluye un adyuvante. La vacuna puede también incluir otros componentes, tal como preservativo (s) , estabilizador (es) , y antígenos contra otros patógenos equinos. Típicamente, los antígenos contra otros patógenos equinos están también presentes en una forma inactivada, tal como formas inactivadas de EHV-4 y cepas inactivadas de virus de influenza equina ("EIV", por sus siglas en inglés). Por ejemplo, la vacuna puede ser una vacuna de combinación que incluye formas inactivadas de cepas de Al y/o A2 de virus de influenza equino, adicional al EHV-1 inactivado. Ejemplos de antígenos adecuados contra EIV incluyen cepa de virus EIV Al inactivada A/EQl/Newmarket/77, cepa de virus EIV A2 inactivada Newmarket/2/93, y cepa de virus EIV A2 Kentucky/95. Los términos "vacuna" y "composición inmunogénica" están definidos en la presente en un sentido amplíe, para referirse a cualquier tipo de agente biológico en una forma administrable capaz de estimular una respuesta inmune en un animal inoculado con la vacuna. Para propósito de esta invención, la vacuna (composición inmunogénica) típicamente incluye el agente viral en una forma inactivada. Las vacunas en general pueden estar basadas en ya sea el virus mismo o un componente inmunogénico (antigénico) del virus. En la presente, el término "protección" cuando se utiliza en referencia a una vacuna se refiere al mejoramiento (ya sea parcial o completo) de cualquiera de los síntomas asociados con la enfermedad o condición en cuestión. Por consiguiente, la protección de caballos de EHV por medio de las presentes vacunas, generalmente resulta en una disminución de la emisión o liberación de virus y/o uno o más de los síntomas clínicos asociados con la infección por EHV-1 y/o EHV-4 (e.g., pirexia, descarga nasal, conjuntivitis, expectoración, disnea, depresión y tratamiento con antibiótico requerido para infección bacteriana secundaria) . En una modalidad, las presentes composiciones inmunogénicas incluyen una forma químicamente inactivada de EHV-1. Las vacunas que incluyen virus de EHV-1 KyA químicamente inactivados, son particularmente deseables. Una variedad de agentes de inactivación química conocidos por aquellos diestros en la técnica, puede ser empleada para inactivar el virus. Etilenimina y derivados relacionados, tal como etilenimina binaria ("BEI", por sus siglas en inglés) y acetiletilenenimina, son ejemplos de agentes de inactivación química adecuados para utilizarse en la inactivación del virus de EHV-1. Otros agentes de inactivación química, e.g., beta-propiolactona o aldehidos (tal como formaldehído y glutaraldehído) , pueden también ser utilizados para inactivar el virus. las presentes vacunas generalmente incluyen un adyuvante que en forma deseable puede tener propiedades bioadhesivas, particularmente en donde el virus está diseñado para ser capaz de administración intranasal. Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen polímeros de ácido carboxílico olefínicamente insaturados, reticulados, tal como polímeros de ácido acrílico reticulados . Como se utiliza en la presente, el término "polímero de ácido acrílico reticulado" se refiere a polímero y co-polímeros formados a partir de una mezcla de monómero que incluye ácido acrílico como el monómero predominante en la mezcla. Ejemplos de polímeros de ácido acrílico reticulados adecuados incluyen aquellos comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales Carbopol® 934P y Carbopol© 971 (disponibles de B.F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio) . ün adyuvante particularmente adecuado para utilizarse en las presentes vacunas es un polímero de ácido acrílico reticulado que tiene una viscosidad Brookfield de no más de aproximadamente 20,000 cPs (como se midió a 20 rpm como una solución acuosa al 1.0% en peso a un pH de 7.5). En donde un adyuvante bioadhesivo es deseado, podría ser ventajoso utilizar un adyuvante que tiene una propiedad bioadhesiva de al menos aproximadamente 50 dinas/cm2 como se midió entre dos piezas de tejido estomacal de conejo recientemente cortado (como se determinó por el procedimiento descrito en la patente estadounidense 4,615,697). Los métodos para proteger caballos contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4, incluyen administrar una vacuna que contiene EHV-1 inactivada a los caballos. La vacuna puede ser administrada utilizando una variedad de métodos que incluyen administración intranasal y/o parenteral (e.g., intramuscular) . En una modalidad del método, la vacuna que contiene el EHV-1 inactivado se administra primero en forma intramuscular una o más veces (e.g., a intervalos de 2-4 semanas), seguida por la administración de la vacuna al menos una vez en forma intranasal (e.g., 2-4 semanas después de la última administración parenteral de la vacuna) . La vacuna es deliberadamente administrada a caballos con una edad de 6 meses o más viejos. En forma ideal, todos los caballos en manada son vacunados anualmente a fin de protegerlos contra la propagación de síntomas respiratorios de la enfermedad. También se proporciona un método para producir una vacuna contra herpesvirus equino. El método típicamente incluye inocular células simiescas con virus de EHV-1, e.g., con virus de EHV-1 KyA. Las células simiescas inoculadas son incubadas, generalmente al menos hasta que se observa CPE (comúnmente después de 24 a 120 horas a 36°C) , y después el virus de EHV-1 se cosecha de las células incubadas (e.g., al decantar y filtrar los fluidos de cultivo) . Los fluidos que contienen el virus cosechado pueden ser tratados con un agente de inactivación químico, tal como una etilenimina binaria, para formar el virus de EHV-1 inactivado. Típicamente, el virus inactivado es además procesado, e.g., por concentración y mezclado con otros componentes, para producir una formulación comercial. Por ejemplo, los fluidos que contienen el virus inactivado pueden ser concentrados y mezclados con un adyuvante y/o antígeno(s) para uno o más de otros patógenos equinos. La presente solicitud también está dirigida a un kit (equipo) que incluye en combinación, (1) un surtidor capaz de administrar una vacuna a un caballo; y (2) una vacuna que contiene EHV-1 químicamente inactivado capaz de proteger contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4. El kit puede incluir un surtidor que es capaz de distribuir sus contenidos como gotas, e.g., como aerosol, pulverizado atomizado y/o gotas líquidas, y una forma de la vacuna que sea capaz de proteger contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4, cuando se administra al menos en parte en forma intranasal . A través de esta solicitud, el texto se refiere a diferentes modalidades de las presentes composiciones y/o métodos relacionados. Las diferentes modalidades descritas significan proporcionar una variedad de ejemplos ilustrativos y no deberán ser interpretadas como descripciones de especies alternativas. Más bien, deberá de señalarse que las descripciones de las diferentes modalidades provistas en la presente invención pueden ser de alcance superpuesto. Las modalidades discutidas en la presente, son meramente ilustrativas y no significa que sean limitativas del alcance de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las presentes composiciones inmunogénicas incluyen una forma inactivada de EHV-1. Las vacunas están diseñadas para proteger a los caballos contra enfermedades asociadas con EHV-1 y/o EHV-4. Las vacunas típicamente incluyen una forma de EHV-1 químicamente inactivada y aquéllas que incluyen virus de EHV-1 KyA químicamente inactivado, son particularmente deseables. üna variedad de agentes de inactivación química conocidos por aquellos diestros en la técnica pueden ser empleados para inactivar el virus. Etilenimina y derivados relacionados, tal como etilenimina binaria ("BEI") y acetiletilenimina, son ejemplos de agentes de inactivación química adecuados para utilizarse en inactivar el virus de EHV-1. Otros agentes de inactivación química, e.g., beta-propiolactona, aldehidos (tal como formaldehído) y/o detergentes (e.g., detergentes Tween®, Tritón® X, o sales de alquiltrimetilamonio) , pueden también ser utilizados para inactivar el virus. La inactivación se puede llevar a cabo utilizando métodos estándares conocidos por aquellos diestros en la técnica. Pueden ser tomadas muestras en intervalos periódicos de tiempo y ensayados para virus vivo residual. El control o verificación del efecto citopático en una línea de célula apropiada y/o manchado fluorescente con un anticuerpo monoclonal específico apropiado, puede ser utilizado para detectar la presencia de virus vivo residual. La inactivación con BEI puede complementarse al combinar una solución de BEI de materia prima (e.g., una solución formada al adicionar bromohidrato de 2-bromo-etilamina 0.1-0.2 M a NaOH acuoso 0.1-0.2 N) con fluidos virales a una concentración final de aproximadamente de 1-2 mM de BEI . La inactivación comúnmente se lleva cabo al retener la mezcla del virus de BEI a 35-40°C (e.g., 37°C) con mezclado constante durante 36-72 horas. La inactivación del virus puede ser detenida mediante la adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final en exceso de la concentración de BEI (e.g., tiosulfato de sodio 2-3 mM con soluciones de BEI 1-2 mM) seguida por el mezclado durante varias horas. Las presentes composiciones inmunogénicas usualmente incluyen un adyuvante y, si se desea, uno o más emulsificadores tal como detergentes de Tween® incorporado con el EHV-1 inactivado. Adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, solubilizado de acetato de vitamina E, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, emulsiones de aceite (mineral) , detergentes no-iónicos, escualeno y saponinas . Otros adyuvantes que pueden ser utilizados incluyen adyuvantes a base de aceite, tal como el adyuvante completo de Freund (FCA, por sus siglas en inglés) , adyuvante incompleto de Freund (FIA, por sus siglas en inglés) . Se ha encontrado que los polímeros de ácido carboxílico olefínicamente insaturados, reticulados, tal como el polímero de Carbopol® 971, son adyuvantes particularmente adecuados para utilizarse en las presentes composiciones inmunogénicas de EHV-1 inactivado. Un ejemplo de dicho adyuvante es un polímero de ácido carboxílico olefínicamente insaturado producido mediante la reacción de una mezcla de monómero que incluye uno o más monómeros de ácido carboxílico olefínicamente insaturados (tal como ácido acrílico y/o ácido metacrílico) y un agente de reticulación. Típicamente, al menos aproximadamente 90% en peso de la mezcla de monómero es monómero carboxílico olefinicamente insaturado. El producto de polímero resultante contiene en forma deseable no más de aproximadamente 0.5% en peso y, preferiblemente, no más de aproximadamente 0.2% en peso de monómero carboxílico olefinicamente insaturado sin reaccionar. La reacción de polimerización se puede llevar a cabo mediante la reacción de la mezcla de monómero en presencia de solvente que incluye cetona alifática, alquiléster o una mezcla de los mismos. Cetonas alifáticas adecuadas incluyen aquellas que tienen de 3 a 6 átomo de carbono, tal como acetona y ciclohexanona (como se utiliza en la presente el término "cetona alifática" incluye cetona cicloalifáticas) . Ejemplos de alquilésteres adecuados incluyen aquéllos que tienen de 3 a 6 átomos de carbono, tal como acetato de etilo, formato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de n-propilo, acetato de butilo o una mezcla de los mismos. Los adyuvantes de polímero de ácido carboxílico olefinicamente insaturado adecuados, en forma deseable tienen una viscosidad Brookfield de no máts de aproximadamente 40,000 cPs (a 20 rpm como una solución acuosa al 0.5% en peso a pH de 7.5). Particularmente, ejemplos adecuados incluyen polímeros de ácido carboxílico olefinicamente insaturados con una viscosidad de no más de aproximadamente 15,000 cPs y más deseablemente de aproximadamente 4,000-11,000 cPs, (a 20 rpm como una solución acuosa al 0.5% en peso a un pH de 7.5). Un ejemplo de un adyuvante adecuado incluye un polímero de ácido acrílico reticulado formado a partir de una mezcla de monómero que incluye ácido acrílico y un agente de reticulación. El agente de reticulación puede incluir un agente de reticulación de polialquenilpoliéter, tal como glicol de divinilo. Ejemplos de alcoholes de divinilo adecuados incluyen sacarosa de alilo, pentaeritritol de alilo, polialquilen diol dialil éter que tiene un peso molecular de no más de 1000, trimetilolpropano dialil éter, y mezclas de los mismos. Ejemplos de otros agentes de reticulación útiles son divinilbenceno, N,N-dialilacrilamida, 3, -dihidroxi-l, 5-hexadieno, 2,5-dirnetil-1, 5-hexadieno y similares. En donde la vacuna se va administrar en forma intranasal, puede ser ventajoso utilizar un adyuvante que sea bioadhesivo con respecto a membranas mucosas. Los polímeros bioadhesivos generalmente tienen la propiedad de ser capaces de adherirse a una membrana mucosa en los ojos, nariz, boca, tracto gastrointestinal, cavidad vaginal y canal rectal. La palabra bioadhesivo puede ser ampliamente definida como un material que se adhiere a una superficie biológica viva o recientemente muerta, tal como membrana mucosa o tejido de piel. La bioadhesión como aquella frase que se utiliza en la presente, define un bioadhesivo útil que se prueba mediante un procedimiento que mide la fuerza requerida para separar dos capas de tejido estomacal de conejo recientemente cortado que son adheridas juntas por un adhesivo. Utilizando este procedimiento, un bioadhesivo puede ser definido como un material que requiere una fuerza de al menos de aproximadamente 50 dinas/cm. su .2 para separar 2 piezas adheridas, recientemente cortadas, de tejido estomacal de conejo, después de seguir el procedimiento descrito en la patente estadounidense número 4,615,697, descripción que se incorpora en la presente para referencia. Los · límites superiores por las fuerzas requeridas para separar el tejido de conejo recientemente cortado, no son precisamente conocidos, pero se cree que son de por lo menos de aproximadamente 2000 dinas/cm. sup.2. Ejemplos adecuados de adyuvantes incluyen polímeros de ácido carboxílico olefínicamente insaturados, reticulados, con propiedades de bioadhesivo (e.g., polímero de Carbopol® 971, un polímero de ácido acrílico reticulado disponible de B.F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio) . Ácidos poliacrílicos de este tipo son generalmente polímeros con grupo funcional carboxi reticulados que contienen cantidades especificadas de funcionalidad carboxilo y agente de reticulación. Tales polímeros pueden ser bioadhesivos de tal manera que los polímeros exhiban una adhesión entre dos piezas de tejido estomacal de conejo recientemente cortado de al menos 50 dinas/cm. sup.2 (cuando se mide en la manera descrita en U.S. 4,615,697). Generalmente es ventajoso formular las presentes composiciones en forma de dosis unitarias para fácil administración y uniformidad de la dosis. La forma dosis unitaria como se utiliza la presente, se refiere a unidades físicamente discretas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de EHV-1 inactivado (así como EHV-4 inactivado y/o EIV inactivado) está dictada por y depende de entre otros factores (a) las características únicas del material activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado; (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos tal como material activo para el tratamiento de enfermedad; y (c) la manera de administración propuesta de la forma de dosis unitaria. El ingrediente activo principal está típicamente compuesto para administración conveniente y efectiva en cantidades efectivas con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado en forma de dosis unitaria, como se describe en la presente. Una forma de dosis unitaria puede, por ejemplo, contener el antigeno EHV-1 en cantidades que se encuentran en el intervalo de desde 1 a aproximadair.ente 5 respecto de las unidades de potencia ("RPüs", por sus siglas en inglés) . Esta cantidad del antigeno generalmente está presente en desde aproximadamente 1 a aproximadamente 25/ml de portador. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos complementarios (e.g., EIV inactivado y/o EHV-4 inactivado) , las dosis están determinadas por referencia a la dosis usual y la manera de administración de los ingredientes activos complementarios . Las presentes vacunas típicamente incluyen EHV-1 inactivado formulado con un portador farmacéuticamente aceptable. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso en forma de inyección, comúnmente incluyen soluciones acuosa estériles (en donde sea soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables o dispersiones estériles. La formulación debe de ser en forma deseable estéril y fluida hasta el punto que sea fácilmente manejable con la jeringa. La forma de dosis debe de ser estable bajo las condiciones de manufactura y almacenaje y típicamente ser preservada contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Un posible portador es una solución de sal fisiológica. La fluidez apropiada de la solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por medio del uso de agentes tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos puede ser llevada aproximadamente por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal (etilmercuri-tiosalicilato de sodio), deomicina, gentamicina y similares. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Absorción prolongada de las composiciones inyectables, si se desea, se puede llevar aproximadamente por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas al incorporar el virus inactivado en la cantidad deseada en un solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, conforme sea requerido, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones pueden ser preparadas al incorporar los diferentes ingredientes activos en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado por vacío y la técnica de secado por congelación, la cual produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente estéril-filtrada del mismo . También puede ser ventajoso el adicionar un estabilizador a las presentes composiciones para mejorar la estabilidad del virus inactivado. Estabilizadores adecuados incluyen, por ejemplo, glicerol/EDTA, carbohidratos (tal como sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa) , proteínas (tal como albúmina o caseina) y productos de degradación de proteína (e.g., gelatina parcialmente hidrolizada) . Si se desea, la formulación puede ser amortiguada mediante métodos conocidos en la técnica, utilizando reactivos tal como fosfatos de metal álcali, e.g., fosfato hidrógeno de sodio, fosfato dihidrógeno de sodio, fosfato hidrógeno de potasio y/o fosfato dihidrógeno de potasio. Otros solventes, tal como etanol o propilenglicol, pueden ser utilizados para incrementar la solubilidad de los ingredientes en la formulación de vacuna y/o la estabilidad de la solución. Aditivos adicionales pueden ser utilizados en la presente formulación incluyendo antioxidantes convencionales y agentes de quelación convencionales, tal como ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) . Las composiciones y métodos de la presente invención pueden ser ilustradas mediante los siguientes ejemplos, los cuales se presentan para ilustrar la presente invención y para asistir en la enseñanza a un experto ordinario como hacer y utilizar la misma. Estos ejemplos no se proponen en manera alguna para reducir o de alguna manera limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1- Producción de los Fluidos que Contienen Cepa de EHV-1 Inactivada Para producir la vacuna Rinopneumonitis Equino (Equine Rhinopneumonitis) , un cultivo de siembra madre, virus muerto, de un EHV-1 fue primero producido. ? partir de esta siembra madre, un cultivo de EHV-1 se hizo crecer y después se inactivo. El cultivo del virus inactivado fue después mezclado con un adyuvante a fin de producir la vacuna de Rinopneumonitis Equina {Equine Rhinopneumonitis) . El siguiente método se utilizó para producir la vacuna de Rinopneumonitis Equina {Equine Rhinopneumonitis) . A fin de producir el cultivo de virus de siembra madre de EHV-1 ("EHV-1 MSV", por sus siglas en inglés), la cepa tipo 1 del herpesvirus equino KyA (EHV-1 KyA, por sus siglas en inglés) se pasó cuatro veces sobre células Vero A139 y cuatro veces sobre células EVero. El cuarto pasaje se utilizó como un virus de siembra madre designado como EHV-1 KyA, MSV Lot 001-dil. A partir del virus de siembra madre, un cultivo de EHV-1 se produjo al infectar células EVero con EHV-1 MSV en un medio minimo esencial ("MEM", por sus siglas en inglés) que tiene suero de 0 a 5%. Se adicionó gentamicina al medio de cultivo en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento bacteriano. Las células EVero típicamente fueron infectadas con el EHV-1 MSV con una multiplicidad objetivo de infección ("MOI", por sus siglas en inglés) de 0.001. Tales cultivos pueden crecer en botellas cilindricas de vidrio o sobre perlas microportadoras . Se observó El cultivo se incubó a 36°C ± 2°C durante de 24 a 120 horas hasta el efecto citopático ("CPE", por sus siglas en inglés) . Durante la incubación, el cultivo se verificó para CPE inducido por EHV para asegurar una cepa de EHV pura. Si CPE atípico se observó o cualquier evidencia macroscópica o microscópica de contaminación existía, el cultivo se desecha. El cultivo de virus puro se cosechó en forma aséptica en bombonas de vidrio estériles, bombonas de plástico estériles o tanques de acero inoxidable estériles y se clarificó por medio de filtración a través de filtros de 8 mieras o más. Los fluidos de cosecha del virus a granel se probaron para asegurar la ausencia de micoplasma previo a la inactivación. Los fluidos cosechados que no fueron inmediatamente inactivados se almacenaron a -40 °C o menos. Después de haber sido cosechado, el cultivo del virus fue inactivado a fin de producir una vacuna muerta o inactiva. Para inactivar el virus, la temperatura de cultivo se llevó hasta 36°C ± 2°C. Después, una solución de 0.2M de bromohidrato de 2-bromoetilenamina se ciclizó a etilenimina binaria ("BEI", por sus siglas en inglés) en NaOH 0.15M y se adicionó al cultivo para dar una concentración final de BEI 2mM. La mezcla resultante se agitó en forma continua durante 48 horas a 36°C ± 2°C. Después del tratamiento con BEI, el cultivo se probó para su capacidad de inducir CPE típico de EHV para asegurar la inactivación del virus utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Esta tarea se complementó al pasar los fluidos virales tratados de BEI sobre células EVero y verificando las células EVero para cualquier infección viral. Los fluidos de cultivo tratados de BEI típicamente se almacenaron a 2-7 °C o menos hasta que la prueba de inactivación se haya completado. Después de una prueba de inactivación satisfactoria que no mostró infección viral, el exceso de BEI se neutraliza al adicionar una cantidad suficiente de una solución fría (4°C ± 2°C) de tiosulfato de sodio 1.0M para dar una concentración final de 6mM. Siguiendo la inactivación y la prueba del cultivo de EHV-1, el cultivo inactivado se concentró, si es necesario, mediante ultrafiltración para una concentración que pudiera permitir a la formulación como una vacuna con una potencia relativa ("RP", por sus siglas en inglés) para EHV-1 de al menos 1.0 como se determinó por el ensayo de liberación de potencia de EHV descrito en el ejemplo 6 en la presente. El virus inactivado se formuló como una vacuna con adyuvante al mezclar completamente el cultivo de EHV-1 inactivado con una solución salina y una solución madre al 0.5% del adyuvante Carbopol® 971 para formar un serial a granel. Un serial tipico 60L se hizo al mezclar 3.5-4.0 L de fluidos de cultivo EHV-1 inactivado, una solución madre de Carbopol® 971 y 44-44.5 L de solución salina. El serial a granel se mantuvo a 2-8 °C hasta que se transfirió en frascos pequeños que contenían ya sea una o diez dosis (@2.2 mi por dosis) . Cada dosis de la vacuna inactivada contenía por lo menos un valor de 1.0 RP de EHV-1 inactivado, 2 mg de Carbopol® 971 y una cantidad residual de gentamicina.

Ejemplo 2- Producción de los Fluidos que Contienen Virus de Influenza Equino Inactivado Virus de influenza equino-A/EQ/Newmarket/77 , subtipo Al El subtipo Al de MSV Rec ERIK de influenza equino se desarrolló en la Wellcome Foundation Ltd. , Beckenham, Kent, U.K. La cepa de equino original se pasó diez veces, sola o en combinación con virus de A/Puerto Rico/8/34, en huevos con embrión libres de patógeno especifico (SPF, por sus siglas en inglés) . ERIK reclasificado se pasó unas siete veces adicionales en cultivo de tejido Vero para producir MSV designado A/E/Newmarket/77 (Equi) (H7N7)Rec ERIK. El virus se recibió por Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (BIVI, por sus siglas en inglés) de Coopers Animal Health, Inc., Est . Lic. No. 107. El virus se pasó una vez en la linea celular de EVero [linea celular Vero recibida de Coopers Animal Health ha sido designada como EVero en BIVI] en BIVI para establecer el nuevo virus de siembra madre. El virus de siembra madre está designado como Lot 111795.

Virus de Influenza Equina-Newmarket/2/93, subtipo A2 El Newmarket/2/93 subtipo A2 de influenza equina, se obtuvo de Dr. J.A. Mummford en la Animal Health Trust, P.O. Box 5 Newmarket, Suffolk CB8 8JH, Inglaterra. El virus se aisló de un caballo con rinitis. El virus se pasó cinco veces en huevos de pollo con embrión libres de patógeno especifico (SPF, por sus siglas en inglés) y después se pasó cinco veces en la linea celular de riñon canino Madin-Darby (MDCK, por sus siglas en inglés) . El quinto paso en células MDCK se designó como MSV. El MSV está designado como EIV NM/2/93, MSV Lot 001-dil. Influenza Equina-Kentucky/95, subtipo A2 El Kentucky/95 subtipo A2 de influenza equina se obtuvo a partir de Gluck Equina Research Center, Lexington, KY. El virus se aisló a partir de un caballo con rinitis. El virus se pasó dos veces en huevos de pollo con embrión libres de patógeno especifico (SPF) . El virus se pasó después tres veces en linea celular de riñon canino Madin-Darby (MDCK) y tres veces en células EVero. El tercer paso en células Evero se designó como MSV. El MSV está designado como EIV K95, MSV Lot 001-dil. Los siguientes procedimientos se utilizaron para producir las tres cepas de componentes de influenza equina en forma separada, pero por métodos similares. Cada lote de producción virus Newmarket/77 se identificó como virus de influenza equina (EIV) al observar efectos citopáticos inducidos por EIV característicos (CPE) en células EVero. Cada lote de producción de virus Newmarket/2/93 y Kentucky/95 se identificó como EIV al observar CPE inducido con EIV característico en células MDCK. El Newmarket/77 y el Kentucky/95 son citocidales para cultivos de célula de riñon de mono y producidos por CPE de EIV típico en cultivos de irtonocapa. El Newmarket/2/93 es citocidal para cultivos de célula de MDCK y producido por CPE de EIV típico en cultivos de monocapa. La virulencia en caballos no fue evaluada para ninguno de los virus. Los virus de siembra madres se probaron para pureza de acuerdo con 9 C.F.R. 113.27 (c) , 113.28, y 113.55. El virus de siembra madre Newmarket/77 fue para Enfermedad Vesicular de Cerdo (Swine) , ñkabane, Fiebre Efímera Bovina (Bovine Ephemeral Fever) , Bluetongue y enfermedad de Velogenic Viscerotrophic Newcastle. Los fluidos de cosecha de virus a granel se probaron para micoplasma previo a la inactivación de acuerdo con la 9 C.F.R. 113.28. Los virus de siembra madres se probaron para inmunogenicidad utilizando el siguiente procedimiento. Las muestras del recipiente a granel o finales del producto completado de cada serial se probaron para potencia por medio de una prueba de potencia de cobayo. Cada uno de al menos 10 cobayos, que pesaban 300-500 gramos, se inyectó en forma intramuscular. Cada dosis de cobayo fue una mitad de la dosis recomendada como una dosis unitaria de la vacuna en la etiqueta para un caballo. Una segunda dosis se inyectó de 14 a 21 días después de la primera dosis. Dos cobayos adicionales de la misma fuente se mantuvieron como controles. 14 a 21 días después de la segunda inyección, muestras de suero de cada una de las vacunas y de cada control se probaron para los anticuerpos de Newmarket/77, Newmarket/2/93 y Kentucky/95 por medio de inhibición de hemoaglutinación (HAI) . La potencia de las fracciones de EIV en la vacuna se determinaron utilizando el protocolo de Nacional Veterinary Services Laboratories Testing Protocol, Supplemental Assay Method for Conducting the Hemagglutination Inhibition Assay for Equine Influenza Antibody ( VSAM0124.01, fechado en Octubre 2, 1998). Si los controles no permanecieron seronegativos a 1:10 para la fracción de EIV bajo prueba, la prueba se consideró como no prueba y se repitió. Si ocho de las diez vacunas en una prueba válida no desarrollaron títulos de anticuerpo HAI de 80 o mayor para la fracción de Newmarket/77 y un titulo de 40 o mayor para las fracciones de Newmarket/2/93 y Kentucky/95, la muestra se consideró como no satisfactoria. Las vacunas que contenían EIV inactivado deseablemente son formuladas para incluir al menos aproximadamente 64 HAU/dosis unitaria de virus de EIV inactivado subtipo Al y/o por lo menos aproximadamente 256 HAU/dosis unitaria de virus de EIV inactivado subtipo A2. El primer paso al cuarto paso del virus de siembra madre se utilizaron para trabajar y la semilla de producción. La vacuna se produjo a del primer paso al quinto paso del virus de siembra madre. Influenza equina, cepa Newmarket/77, subtipo Al e Influenza Equina, cepa Kentucky/95, subtipo A2 se propagaron en los cultivos de linea celular EVero. La linea celular de MDCK utilizada para la propagación de Newmarket/2/93 fue confinada entre los pasos 71 y 91. Los pasos 71 se congeló y se designó como el Patrón de Célula Maestro. Los cultivos celulares de MDCK se propagaron en MEM que contiene de 5-10% de suero de bovino fetal. El cultivo de semilla y producción de Newmarket/2/93 se propagó en MEM suplementado con 10 unidades de tripsina/mL. Los cultivos celulares se hicieron crecer en perlas microportadoras en recipientes de cultivo de células de 1, 3, 10, 30, 50 o 140 litros, botellas cilindricas de vidrio de 9 L o botellas cilindricas de plástico. Los virus de siembra madres y de trabajo se almacenaron a -60°C o menos . Cultivos de células MDCK se hicieron crecer en recipientes de plástico o vidrio estériles. Los cultivos se hicieron crecer en frascos de plástico con capacidad de 75 cm2 o 150 cm2 con de 40 a 100 mL del medio. Se hicieron crecer cultivos de expansión en cultivos de botellas cilindricas en medio de 100-1000 mL y después se subcultivaron también en cultivos de botellas cilindricas. Ya sea un área de unión de superficie de 75 cm2 o 150 cm2 se selecciono, en base a la unión y el crecimiento de la linea celular cuando llegó el primer depositario de nitrógeno liquido. Debido a la resistencia del almacenaje de nitrógeno liquido, en algunas ocasiones es ventajoso iniciar el crecimiento de la célula en una área de superficie más pequeña, y cuando se ha logrado el crecimiento, el subcultivo de la células adicional en un frasco en T de 150 cm2. Si las células llegan del almacenaje de nitrógeno liquido y se produce una monocapa sana de células suficiente para expansión en un frasco en T de 150 cm2, entonces la etapa del frasco en T de 75 cm2 se omite y las células se plantan directamente en el frasco en T de 150 cm2. Previo a la inoculación con virus, el medio de crecimiento de célula se decantó del recipiente de cultivo. El medio esencial mínimo (MEM) sin suero se adicionó al recipiente de cultivo y las células se enjuagaron durante 30 a 45 minutos. El volumen del medio de enjuague dependió del recipiente de cultivo a ser utilizado. El recipiente de cultivo se inoculó para decantar el medio de enjuague y se adicionó MEM sin suero que contiene 10 unidades de tripsina/ml de MEM purificadas y a la cual se le ha adicionado virus de semilla. Cultivos de células se infectaron con una multiplicidad de objetivos de infección (MOI) de 0.01 para las cepas de Newmarket/7 , Newmarket/2/93 y Kentucky/95. Los cultivos de célula se mantuvieron a 36° C ± 2°C hasta que el fluido se cosechó. Se observaron monocapas seguido de la inoculación por cambios inducidos con EIV característicos en la morfología de la célula. El CPE se incluyó en las células circundantes y refráctiles que se desunieron de la superficie de la monocapa. El CPE usualmente fue aparente de 24-96 horas después de la inoculación. El cultivo se examinó a través de un periodo de incubación para evidencia macroscópica y/o microscópica de contaminación o por cambios atípicos en la morfología de la célula. Cualquier cultivo que exhibió evidencia de contaminación microbiana o degeneración celular no específica, fue desechado. Previo a la cosecha, cada cultivo se examinó en forma macroscópica y microscópica. Cualquier cultivo que exhibió evidencia de contaminación o el CPE atípico fue desechado. El fluido de los recipientes de cultivo se cosechó de uno a cuatro días después de la inoculación. El fluido de cultivo de virus en el recipiente de cultivo se cosechó en forma aséptica en bombonas de plástico o de vidrio estériles o un tanque de acero inoxidable estéril después de la clarificación por medio de filtración a través de filtros de 8 mieras o más . Los fluidos reunidos fueron ya sea inactivados en forma inmediata o se almacenaron a -40 °C o menos para inactivación en un tiempo más tarde. Se recolectaron las muestras para esterilidad y la prueba de antígeno después de la inactivación.

El volumen de fluidos de cultivo se determinó y la temperatura de los fluidos se llevó a 36°C ± 2°C. Una solución 0.2M de bromohidrato de 2-bromoetilenamina que había sido ciclisada a etilenimina binaria (BEI) en NaOH 0.15M se adicionó a los fluidos de cultivo para dar una concentración de BEI final de 2mM. El fluido de virus inactivado se almacenó ya sea congelado a = -40 °C o a 4-8 °C hasta complementar la prueba de inactivación. Cada lote de Newmarket/77 y Kentucky/95 se probó para inactivación mediante el paso en células Vero A139. Cada lote de Newmarket/2/93 se probó para inactivación por medio del paso en células de MDCK. La monocapa de cultivo de célula apropiada (150 mi) se inoculó con 1.0 mi de fluidos de EIV inactivados y se mantuvo a 36°C ± 2°C durante 14 días con al menos dos pasos . Al final del periodo de mantenimiento, las monocapas de célula se examinaron para CPE típico de EIV. Para controles de virus positivo, se inoculó un frasco de cultivo de cada una de las células EVero con referencia a los virus Newmarket/77 y Kentucky/95, respectivamente y un cultivo de células MDCK se inoculó con una referencia de virus de Newmarket/2/93 (cada uno a un objetivo de MOI de 0.01) . Un frasco de células EVero y un frasco de células de MDCK permanecieron sin inocular como controles negativos. Después de la incubación y el paso, la ausencia de células infectadas por virus en los fluidos virales tratados con BEI constituyo una prueba satisfactoria para inactivación. Las células control inoculadas con el virus de referencia mostrado de CPE típico de EIV y el frasco sin inocular no mostraron evidencia de EIV de CPE. Después de una prueba de inactivación satisfactoria, el BEI residual se neutralizó por medio de la adición de una solución fría (4°C ± 2°C) de tiosulfato de sodio 1.0M para dar una concentración final de 6m . Los fluidos inactivados se almacenaron a 4°C ± 2°C o menos hasta el aumento de volumen del producto final. Si la prueba de inactivación fue insatisfactoria, los fluidos pueden ser tratados nuevamente con BEI utilizando el procedimiento descrito anteriormente y probados nuevamente para inactivació . Si es necesario, cada lote de fluido de virus a granel inactivado se concentra de 2X a 50X mediante ultrafiltración para lograr la concentración deseada. Uno o más lotes a granel de fluidos de virus a granel inactivados usualmente se unieron para concentración. El virus a granel concentrado se retiene a 4-8 °C hasta aumento de volumen. El producto resultante después de la inactivación y concentración contenia gentamicina en cantidades residuales del medio utilizado en la producción de los fluidos de cosecha de virus. Estos niveles no excedieron el nivel permitido por dosis de producto. La vacuna se formuló para contener 2 mg de Carbopol® 971 por dosis de vacuna. Los componentes para aumentar el volumen se adicionaron en forma aséptica a un recipiente de acero inoxidable, de plástico o de vidrio por medio de efecto sifón, o por medio de presión positiva (nitrógeno filtrado estéril) . El serial se mezcló completamente y después se mantuvo a 2-8 °C hasta que estuvo listo para llenarse en los recipientes finales. Lo siguiente proporciona una composición de vacuna de EIV inactivada.

Newmarket/77 3,000 mi. Newmarket/2/93 6,000 mi Kentucky/95 6,000 mi Carbopol® 971 (solución madre 0.5%) 12,000 mi Solución salina 33,000 mi Si se desea, la solución salina o una porción de la misma puede ser sustituida por una solución que contiene EHV-1 inactivado y, opcionalmente, EHV-4 inactivado para producir una combinación de vacuna EHV/EIV. Después de aumentar el volumen, el serial se retiró en recipientes de acero inoxidable o de plástico, estériles para transferirse a un área de llenado estéril para llenar los recipientes finales, o el serial a granel se muestreo y retiró en bombonas de plástico estériles. Si el serial se retira en bombonas, ésta se almacena a 4-8 °C. Si dos o más bombonas de vacuna a granel fueron llenadas en un solo tiempo, el producto se reúne en un recipiente de acero inoxidable estéril cuando se requiere' para llenado. Cada dosis de vacuna se formuló para contener suficientes fluidos de cosecha de virus ináctivados para proporcionar al menos 64 unidades de hemoaglutinación (HAU, por sus siglas en inglés) de Newmarket/77 y 128 HAU de Newmarket/2/93 y 128 HAU de Kentucky/95.

Ejemplo 3- Método de Verificación de la Inactivación de los Virus Cada lote de EHV-1, EHV-4, el EIV Newmarket/77 y EIV Kentucky/95 se probó para inactivación al pasar en células EVero. Cada lote de EIV Newmarket/2/93 se probó para inactivación al pasar en células de MDCK. Ciento cincuenta (150) cm2 de monocapa de cultivo de célula EVero se inocularon con 1.0 mi de fluidos de EHV o EIV ináctivados y se mantuvieron a 36°C ± 2°C durante 14 días con al menos dos pasos. Al final del periodo de mantenimiento, las monocapas de célula se examinaron para CPE típico de EHV o EIV. Para controles de EHV, un frasco de cultivo de células EVero se inoculó con referencia a EHV-1 o EHV-4 (control positivo) para dar una multiplicidad de objetivos (MOI) de 0.001. Para controles de EIV, un frasco de cultivo de células Evero se inoculo con EIV Newmarket/77 referencia o virus de EIV Kentucky/95 (control positivo) para dar un objetivo de MOI de 0.01. Para las pruebas de EIV Newmarket/2/93, se inoculó un frasco de cultivo de células de MDCK con referencia a EIV Newmarket/2/93 para dar un objetivo MOI de 0.01. Como un control negativo, un frasco sin inocular con células EVero o células de MDCK se incubó bajo las mismas condiciones que los cultivos de prueba. Después de la incubación y el paso, la ausencia de células infectadas por virus en los fluidos virales tratados de BEI constituyó una prueba de inactivación satisfactoria. Las células control inoculadas con el virus de referencia deberían de mostrar CPE típico de EHV o EIV. El frasco sin inocular no mostró evidencia de CPE de EHV o EIV. Después de una prueba de inactivación satisfactoria, el BEI residual se neutralizó mediante la adición de una solución de tiosulfato de sodio fría y los fluidos inactivados se almacenaron a 4°C + 2°C o menos, previo a la mezcla a granel del producto final.

Ejemplo 4- Ensayo de Liberación de Potencia de EHV Revestimiento de placas de 96 pozos con EHV-1 mAb o EHV-4 mAb Placas de 96 pozos utilizadas para probar la potencia de fracciones EHV-1, se revistieron con el anticuerpo monoclonal EHV-1. Placas de 96 pozos utilizadas para probar la potencia de muestras que contienen EHV-4, se revistieron con el anticuerpo monoclonal EHV- . El anticuerpo monoclonal EHV-1 ("EHV-1 mAb", por sus siglas en inglés), 16H9, fracción IgG, se diluyó 1:10,000 en un amortiguador de revestimiento. El anticuerpo monoclonal EHV-4 ("EHV-4 mAb"), 20F3, fracción IgG, se diluyó 1:10,000 en un amortiguador de revestimiento. Alícuotas (???µ?) de las soluciones de mAb se adicionaron a todos los pasos de las placas de NÜNC MAXISORP excepto los pasos en la columna 1 y las placas se sellaron con cubiertas de sellado de placa. Las placas de múltiples pozos fueron después incubadas durante una hora a 37 °C y durante toda la noche a 4°C.

Cuantificación de antigenos EHV-1 o EHV-4 en muestras de prueba Antígenos de EHV-1 o EHV-4 en muestras de prueba se cuantificaron utilizando placas de microtitulación revestidas con el respectivo mAb. Previo a la prueba en la ELISA, un mL de alícuotas de muestras de prueba (e.g., vacuna a granel con adyuvante o vacuna de recipiente final) en tubos de microfuga cónicos, se congeló a -40°C o menos durante un mínimo de 18 horas. Durante el día la ELISA se lleva a cabo, las muestras congeladas de la vacuna de prueba en tubos de microfuga y el frasco pequeño congelado de la referencia de vacuna se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y con efecto vortex para el material asentado resuspendido. Una alícuota de 2.5 µ? de Tritón® X-100 se adicionaron al tubo de microfuga de la referencia de vacuna y cada tubo de microfuga de la vacuna prueba. Los tubos de microfuga se les aplico un vortex y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. A los tubos se les aplicó un vortex cada quince minutos. Una alícuota de ???µ? del control de referencia externo de EHV-1 (o control de referencia externo EHV-4) se adicionó a 900µ1 de diluyente de antígeno. Una alícuota de Tritón® X-100 se adicionó a la referencia externa de EHV-1 diluida. Los fluidos de referencia externa se incubaron a temperatura ambiente durante una hora y se les aplicó un vortex cada quince minutos. Durante esta una hora de incubación, las placas revestidas de EHV mAb se lavaron tres veces con PBS-Tween®. Los sitios reactivos restantes en los pozos se bloquearon por medio de un pos-revestimiento de todos los pozos con 200µ1/???? de amortiguador de bloqueo. Las placas se incubaron con amortiguador de bloqueo a 37 °C durante un mínimo de 30 minutos. Después de un periodo de incubación de una hora, diluciones seriales dobles de la referencia de vacuna y la vacuna de prueba se prepararon al transferir de 500µ1 de referencia de vacuna y muestra de prueba a un tubo de prueba que contiene 500µ1 de diluyente de antigeno. Las placas pos-revestidas se lavaron tres veces con solución de PBS-Tween®. Alícuotas (50µ1) de las diluciones sin diluir a 1:32 de la vacuna de referencia y prueba se adicionaron a los pozos duplicados de las placas revestidas de EHV-1 mAb y EHV-4 mAb como se muestra en la tabla IV-1. Alícuotas de 50µ1 del control de referencia externo apropiado se adicionaron a los pozos de cada una de las placas como se muestra en la tabla IV-1. Las placas se incubaron a 37 °C durante una hora. Durante esta una hora de incubación, el suero de anti-EHV-1 de caballo (o suero de anti-EHV-4 de caballo) se diluyó, 1:1,000 en diluyente de anticuerpo y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora de incubación, las placas de múltiples pozos se lavaron tres veces con una solución de PBS-Tween®. Alícuotas (50µ1) del suero de anti-EHV-1 de caballo diluido (o suero de anti-EHV-4 de caballo diluido) se adicionaron a todos los pozos de la placa apropiada excepto los pozos en la columna 1. Las placas fueron después incubadas a 37 °C durante 1 hora. Durante esta una hora de incubación, el conjugado de anti-IgG»HRP de caballo ovejero se diluyó, 1:2,500 en un diluyente de anticuerpo y se incubó durante una hora a temperatura ambiente.

Después de una hora de incubación, las placas fueron nuevamente lavadas tres veces con solución de PBS-Tween®. Alícuotas (50µ1) del conjugado de anti-IgG«HRP de caballo ovejero se adicionaron a todos los pozos de la placa excepto aquellos en la columna 1. Las placas se incubaron a 37 °C durante una hora. Después de una hora de incubación, las placas fueron nuevamente lavadas tres veces con solución de PBS-Tween®. El sustrato de TMB se preparó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Alícuotas (???µ?) de la solución de sustrato de TMB se adicionaron con una pipeta de canales múltiples a todos los pozos en la fila A y después en orden a las filas B a H de la placa. Las placas de pozos múltiples fueron después incubadas a temperatura ambiente. Las densidades ópticas de los pozos se determinaron mediante la lectura de la placa en un lector de microplaca a una longitud de onda de 600 nm. Los pozos control en la columna 1, sirvieron como blancos. Las placas utilizadas para cuantificación del antígeno EHV-1 fueron leídas 35 ± 10 minutos después de la división de sustrato de TMB. Las densidades ópticas en los pozos que contenían la referencia externa de EHV-1 deberían de estar entre 0.500 y 1.200. Las placas utilizadas para cuantificación del antígeno EHV-4 se leyeron a 45 ± 10 minutos después de la adición del sustrato de TMB. Las densidades ópticas en los pozos que contenían la referencia externa de EHV-4 deberían de estar entre 0.500 y 1.200. Los valores de potencia relativa ("RPV", por sus siglas en inglés) de las muestras de vacuna de prueba fueron determinados de las lecturas de densidad óptica mediante los valores normalizados contra el control de referencia externo de EHV-1 (o control de referencia externo de EHV-4) .

III . Criterio para una Prueba Válida La densidad óptica en los pozos que contenían la referencia externa de EHV-1 (o la referencia externa de EHV-4) deberían de estar entre 0.500 y 1.200, 30 + 5 minutos después de la adición del sustrato de TMB. La densidad óptica en los pozos de control negativo no fueron más de 0.250. Si ninguno de estos criterios válidos fueron satisfechos, el ensayo debió haberse considerado como una NO PRUEBA y el ensayo puede ser repetido sin prejuicio. Los resultados de potencia relativos de un ensayo fueron considerados satisfactorios si RPV (para EHV-1 inactivado y/o EHV-4 inactivado) de una dosis unitaria de la muestra de prueba, fue mayor que por igual a 1.0.

IV. Reactivos Anticuerpo monoclonal específico de EHV-1, fracción IgG. Hibridoma 16H9 se obtuvo de DR. George Alien, Gluck Equine Research Center, üniversity of Kentucky, Lexington, KY. La fracción IgG de ascitis de ratón fue comercialmente preparada. El anticuerpo purificado se identificó como EHV-1 mAb 16H9 20F3-IgG, Lot 001, 11-11-98, Exp. 11-11-03. La fracción de anticuerpo IgG se almacenó a 4-8°C. Anticuerpo monoclonal específico EHV-4, fracción IgG. Hibridoma 20F3 se obtuvo de DR. George Alien, Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington, KY. La fracción IgG de ascitis de ratón fue comercialmente preparada. El anticuerpo purificado se identificó como EHV-4 mAb 20F3-IgG, Lot 001/11-11-98, Exp. 11-11-03. La fracción de anticuerpo de IgG se almacenó a 4-8 °C. Suero policlonal anti-EHV-1 de caballo. Una fuente o recurso de suero se preparó de la sangre recolectada de los caballos de control sin vacunar en el Estudio de Inmunogenicidad de EHV, 623-510-98E-015, a 21 días posterior al estímulo con EHV-1 virulento. El anticuerpo se identificó como anti-EHV-1 de caballo, Lot 001/030199, Exp. 030104. El suero se almacenó congelado a -40 °C o menos. Suero policlonal de anti-EHV-4 de caballo. Una fuente o recurso de suero se preparó a partir de la sangre recolectada de los caballos de control sin vacunar en el Estudio de Inmunogenicidad de EHV, 623-510-98E-015, a 21 días posterior al estímulo con EHV-4 virulento. El anticuerpo se identificó como anti-EHV-4 de caballo, Lot 001/030399, Exp. 030304. El suero se almacenó congelado a -40 °C o menos. Conjugado de anti-IgG*HRP de caballo ovejero, 1 mg/ml, Bethyl Laboratorios, Inc. Catalogo no. A70-121P. El conjugado de anticuerpo se almacenó a 4-8 °C. Fluidos de referencia externa de EHV-1. Fluidos de EHV-1 se produjeron de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 1. Frascos pequeños de fluidos de referencia externa de EHV-1 se identificaron como EHV-1 Ext. Ref. Flds., Lot 001/040599. Exp. 040504. Los fluidos de virus se almacenaron a -40 °C o menos. Fluidos de referencia externa de EHV-4. Fluidos de EHV-4 se produjeron de acuerdo procedimiento descrito en el ejemplo 6. Frascos pequeños de fluidos de referencia externa de EHV-4 se identificaron como EHV-4 Ext. Ref. Flds., Lot 001/040699. Exp. 040504. Los fluidos de virus se almacenaron a -40°C o menos. Vacuna de referencia de EHV-l/EHV-4. La vacuna de referencia de EHV-l/EHV-4 es la misma vacuna utilizada en el Estudio de Inmunogenicidad descrito en el ejemplo 8 (623-0510-98E-015) . La vacuna se identificó como EHV Imm. Vac, 623-510-98E-015, lot# 001, 11-6-98. Exp. 110603. La referencia de vacuna se almacenó a -40 °C o menos. Los siguientes reactivos comercialmente disponibles se utilizaron en el experimento: Sistema de sustrato. TMB (dos componentes), Kirkegaard and Perry, catálogo no. 50-76-00. Tritón® X-100. Sigma, catálogo no. 1043. Suero de ternero de bovino. Hyciclone Laboratorios, Inc., catalogo no. A-2151-L. Las siguientes soluciones estándar se prepararon para utilizarse en el experimento: Amortiguador de revestimiento (preparado recientemente para cada prueba y ajustado a un pH de 9.6) g/litro de H20 desionizada a . Na2C03 - anhidro 1.59 b. NaHC03 2.93 PBS (ajustado a pH 7.3) g/litro de ¾0 desionizada a . Na2HP04 · anhidro 1.18 b. Na¾P04- anhidro 0,23 c. NaCl 8.50 Solución de PBS-Tween® g/litro de ¾0 desionizada a. Na2HP04 «anhidro 1.18 b. NaH2P04' anhidro 0.23 c. NaCl 8.50 d. Tween® 20 0,05 ml Amortiguador de bloqueo (Preparado recientemente en el dia de la prueba) . a. PBS 75 ml b. Suero de ternero de bovino 25 ml Diluyente de anticuerpo (Aame como amortiguador de bloqueo; preparado recientemente en el dia de la prueba) . Diluyente de anticuerpo (Preparado recientemente en el dia de la prueba) a. PBS 50ml b. Tritón® X-100 0.05 ml Ejemplo 5 - Inoculación de Caballos con EHV-1 Inactivado y Estimulo subsecuen-be con EHV-4 virulento El propósito del estudio fue demostrar inmunogenicidad de un virus de EHV-1 Kya inactivado para protección cruzada de caballos vacunados estimulados con EHV-4 virulento. La vacuna utilizada en el estudio incluyó virus de EHV-1 KyA inactivado con adyuvante, con Carbopol® 971. Caballos fueron vacunados con dos diferentes regímenes de vacunación. Un régimen de vacunación fue de tres vacunas intramusculares y el otro régimen de vacunación fue de dos vacunas intramusculares y una administración intranasal. Los caballos fueron vacunados a intervalos de dos a cuatro semanas. Los caballos sin vacunar sirvieron como controles. En la tercera semana después de la última vacunación, los caballos control sin vacunar y vacunados se estimularon con EHV-4 virulento. Enfermedad respiratoria severa se observó en los caballos de control sin vacunar estimulados posteriormente con EHV-4. Los caballos vacunados por ya sea regímenes intramuscular o intramuscular/intranasal con la vacuna de EHV-1 KyA mostraron una reducción significante en signos clínicos de enfermedad respiratoria causada por el EHV-4 comparado con los caballos de control sin vacunar y estimulados. Existió una reducción significante en el vertido del virus entre los caballos vacunados por cada régimen de vacunación contra caballos de control sin vacunar. Los resultados del estudio demostraron la inmunogenicidad de la fracción de EHV-1 KyA inactivado de la vacuna contra la enfermedad respiratoria causada por EHV-4 virulento. Además, el estudio demostró que la fracción de EHV-1 KyA inactivada fue inmunogénica cuando se administró por ambas rutas parenteral y parenteral/intranasal. Caballos hembra y machos saludables que estaban en el intervalo de edad de cuatro a nueve meses se obtuvieron de fuentes seleccionadas. Los caballos fueron identificados por números de etiqueta de cabestro y números de micropastill (microchips) . Todos los caballos tenían buena salud al inicio del estudio. Al tiempo de la primera vacunación, los caballos tenían títulos de neutralización de virus (VN, por sus siglas en inglés) de = 2 para EHV-1 y EHV-4. Los caballos fueron agrupados aleatoriamente en grupos al sortear los números de identificación de los caballos de una bolsa. Durante la vacunación y los periodos de estímulo, los caballos se mantuvieron juntos en corrales abiertos y se alimentaron con heno de alfalfa de calidad láctea de elección libre, suplemento dietético S eet 14, Bio-minerales de equino y agua ad libum. Los caballos se agruparon en forma aleatoria en grupos por medio del sorteo de los números de identificación del caballo de una bolsa. Los caballos observaban salud general y sin ningún comportamiento anormal durante el periodo de vacunación. Ningún comportamiento anormal o adverso en las condiciones de salud se observaron en ninguna de las vacunaciones posteriores del caballo y ningunas reacciones en el sitio de inyecciones adversas se observó en ninguna de las vacunaciones posteriores del caballo. Ningún signo clínico de enfermedad respiratoria se observó en ninguno de los caballos durante el periodo de vacunación. Fluidos EHV-1 para utilizarse en la vacuna se produjeron de acuerdo al procedimiento descrito el ejemplo 1. Todos los fluidos de virus estaban en el quinto paso del virus de siembra madre y se produjeron en células en el 20avo. paso del patrón de la célula madre. La vacuna se formuló para contener EHV-1 y EIV Newmarket/77 , subgrupo Al, EIV Kentucky/95, subgrupo ?2 y Newmarket 2/93, subgrupo A2, por dos mi de dosis (producida de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 2) . La vacuna se etiquetó como EHV-1 Imm Vac, 623-510-99E-116, lot # 001, Diciembre 19/ 1999. La composición inmunogénica que contenia EHV-1 inactivado se administró a caballos para dos regímenes de vacunación. Un régimen de vacunación fue tres vacunas intramusculares en intervalos de tres semanas . El otro régimen fue de dos inoculaciones intramusculares en dos o cuatro semanas de separación seguidas por una tercera inoculación por la ruta intranasal, dos o cuatro semanas más tarde. Cada grupo de régimen de vacunación contenía 11 o más caballos . Un grupo de 18 caballos sirvió como controles sin vacunar. A tres semanas después de la última vacunación, los caballos se estimularon con EHV-4 virulento. Los caballos fueron monitoreados o revisados por los signos clínicos de enfermedad respiratoria causada por EHV-4 y la severidad de la enfermedad se registró mediante un sistema de tanteo o puntuación descrito enseguida en la tabla V-l. Muestras de sangre y nasal para evaluación serologica e hisopos nasales para aislamiento del virus, fueron tomadas antes y a tiempos seleccionados posterior a la vacunación.

Tabla V-l Sistema de Puntuación de Signos Clínicos Signo clínico Puntuación dada para cada día de exhibición de signo Descarga Nasal seroso, cantidad ligera 1 seroso, cantidad abundante 2 mucopurulento, cantidad ligera 3 mucopurulento, cantidad abundante 4 Pirexia 102.5-103.9°F 1 104.0-104.9°F 2 =105.0°F 3 Otros síntomas Conjuntivitis 1 Expectoración 2 Disnea 3 Depresión 4 Tratamiento con antibiótico requerido para infección 5 bacteriana secundaria Cinco valoraciones replicadas de virus de estímulo de EHV-4, cepa 405 se llevaron a cabo sobre células Vero. El título para las valoraciones fue de 4.63 TCID50Logio/l mi para cada una de las cinco valoraciones. Dos mi se administraron para el estimulo para dar 4.9 TCID50Logi0/dosis . Esta dosis de virus virulento fue suficiente para provocar enfermedad respiratoria clínica severa en caballos de control sin vacunar. La cepa de EHV-4 405 se obtuvo de la American Type Culture Collection y se propagó sobre células Vero. Este virus se aisló de un caballo con rinopneumonitis y se caracterizó por Dr. M. Studdert, un científico bien reconocido en el EHV y enfermedades causadas por EHV. El virus se presentó en ATCC como uno relevante y el ejemplo representativo de EHV-4 y había sido previamente recomendado por NVSL como una cepa de estímulo de EHV-4. Patrones congelados de EHV-4 a ser utilizados para la estimulación se descongelaron y se diluyeron para contener una concentración objetivo de 5.0 TCIDsoLogLo ml y se congelaron a -70 °C. Una muestra de virus de estímulo se descongeló y se determinó el título. Al tiempo del estímulo, los fluidos del virus fueron descongelados y dos mi de EHV-4 se retiraron con una jeringa de tres mi y una aguja calibre 21. La aguja se retiró y el virus de estímulo se suministro en forma intranasal a grupos apropiados de caballos vacunados y sin vacunar. Posterior al estímulo, los caballos se revisaron o verificaron para signos clínicos de enfermedad respiratoria causada por EHV-4 que incluía pirexia, descarga nasal, conjuntivitis, expectoración, disnea, depresión y otras tal como el tratamiento con antibiótico requerido para infección bacteriana secundaria. Se observaron los caballos diariamente para la enfermedad clínica y se registró la severidad de la enfermedad. Hisopos nasales para el aislamiento de EHV se tomaron en días seleccionados posteriores al estímulo del virus y se almacenaron a -70°C. Muestras congeladas fueron descongeladas y el hisopo se retiró del medio de transporte. La muestra se procesó mediante centrifugación a 2500 x g durante 20 minutos a 19-22 °C. Una alícuota de 0.1 mi de la muestra procesada se adicionó a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 48 pozos que contenía ittonocapas de 24 horas de células Vero. Las placas de cultivo se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 durante siete días. Los pozos fueron observados sobre una base regular para la presencia de efecto citopático (CPE) típico de EHV. Los pozos que exhibieron citotoxicidad fueron subcultivados después del período de incubación de siete días al transferir de 0.2 mi del pozo a una placa de cultivo de tejido de 48 pozos que contiene una monocapa de 24 horas de células Vero. Las placas de cultivo se incubaron a 37 °C en un incubador de CO2 durante siete días y se observó para CPE. El título de EHV en las muestras nasales procesadas que fueron positivas para CPE, se determinó mediante métodos de valoración estándar sobre células en placas de cultivo de tejido de 96 pozos. Títulos de anticuerpo de VN de suero en caballos antes y después de la vacunación y después del estímulo con virus virulento, se determinaron. Cuando las muestras de sangre se tomaron a caballos de protección para utilizarse en el estudio, todos los caballos tenían título de anticuerpo de VN de = 2 para EHV-1 y EHV-4, excepto el número 13 de caballo, que tienen título de VN de 8 a EHV-1 y EHV-4. Al tiempo de la primera vacunación, el título de VN para EHV-1 y EHV-4 había declinado a 2 y 4, respectivamente. Un caballo adicional en el grupo intramuscular tuvo un título de VN que- había incrementado de 2 a 8 y dos caballos en el grupo parenteral/intranasal tuvieron títulos de VN que habían incrementado de 2 a 16. Ninguno los caballos mostraron evidencia alguna de una infección respiratoria. Posterior a la primera vacunación, el incremento en el título de VN para EHV-1 y EHV-4 fue variable pero el título de VN en todos los caballos se incrementó respecto al título de la pre-vacunación. Después de la segunda y tercera vacunas, el título de VN permaneció esencialmente idéntico como después de la primera vacunación posterior. El título de VN fue mayor a EHV-1 que a EHV un 4, aunque el título de VN a EHV-1 fue mayor que dos veces pero menor que 4 veces mayor que el título de VN de EHV-4. Los títulos de VN para EHV-1 y EHV-4 fueron mayores en el grupo de vacunación parenteral que en el grupo parenteral/intranasal pero menor que una diferencia de dos veces. A 21 dias posteriores al estimulo con EHV-4 virulento, los títulos de anticuerpo para tanto EHV-1 como EHV-4, hablan incrementado ligeramente o permanecido idénticos en los caballos vacunados. Sin embargo, en caballos de control sin vacunar, los títulos del anticuerpo de VN se incrementaron de 32 a 128 veces para tanto EHV-1 como EHV-4 en casi todos de cada uno de los caballos de control sin vacunar. Los títulos de anticuerpo de VN para EHV-1 fueron similares para títulos de anticuerpo de VN para EHV-4 en caballos vacunados y de control posterior al estímulo con EHV-4. Los títulos de anticuerpo de VN en muestras nasales recolectadas de caballos antes y después de la vacunación y después del estímulo con virus virulento, fueron determinados con el mismo ensayo de VN utilizado para determinar los títulos de anticuerpo en suero. Similar a la actividad de VN en la vacunación posterior de suero, la actividad de VN en secreciones nasales se incrementó después de la vacuna pero a una extensión más baja. El estímulo posterior con EHV-4, el título del anticuerpo VN se incrementó pero solamente en forma ligera y solamente en unos pocos caballos. Los datos de título del anticuerpo VN no se presentan en el reporte.

. Los caballos fueron estimulados en forma intranasal con EHV-4 virulento. Posterior al estimulo, se tomó la temperatura de los caballos diariamente y los signos clínicos de enfermedad respiratoria incluían descarga nasal, incluyendo conjuntivitis, expectoración, disnea y depresión, fueron registrados. Se verificó la pirexia en caballos estimulados posteriormente con EHV-4. La pirexia fue esporádica y de duración corta en tanto grupos de vacuna como en grupos de control. En la mayoría de los caballos que exhibieron pirexia, se observó temperatura elevada durante solamente uno o dos días . Un caballo vacunado en el grupo parenteral/intranasal exhibió pirexia durante cuatro días consecutivos. No existió evidencia de diferencias significantes en la distribución de los puntos de pirexia entre los grupos de vacuna y de control durante 5 a 8,10 o 13 días posterior al estímulo. Análisis estadístico no se llevó a cabo en los días 1 a 4, 9, 11, 12, y 14 a 21, debido a que menos de dos animales no tuvieron puntos de pirexia distintos de cero. Cuando las temperaturas se analizaron en forma separada por día utilizando análisis de varianza, existió evidencia de reducción significante de temperatura entre los grupos de vacuna y control pero solamente durante unos pocos días individuales.

Observaciones de descarga nasal en caballos también fueron hechas . La descarga nasal fue valorada como normal, cantidad ligeramente serosa, cantidad abundante serosa, cantidad ligeramente mucopurulenta y cantidad abundante mucopurulenta y se tanteadas como 0, 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Tres caballos en el grupo de vacuna parenteral exhibieron descarga nasal mucopurulenta durante solamente un dia. Todos los otros puntos de descarga en los grupos de vacuna tuvieron ligera cantidad de descarga serosa que fue principalmente limitada a uno o dos dias. En contraste, caballos de control sin vacunar exhibieron descarga mucopurulenta y serosa durante múltiples días consecutivos. Existió evidencia de diferencias significantes entre ambos grupos de vacuna y de control (= 0.0479) durante 3 a 9 y 11 a 15 días posteriores al estímulo. Existió evidencia de diferencias significantes en la distribución de puntos de descarga nasal entre los grupos de vacuna parenteral y los grupos de control (p= 0.0398) durante los días 4, 5, 6, 8, 9 y 11 posterior al estímulo y entre los grupos de vacunación parenteral/intranasal y los de control (p= 0.0259) durante los días 3 a 8 y 11, posteriores al estímulo. Observaciones posteriores al estímulo de signos clínicos de conjuntivitis, expectoración, disnea, y depresión, se presentan en la tabla 4. La conjuntivitis fue el principal signo observado en los vacunados y se registró durante dos a tres días. Uno vacunado exhibió disnea durante un día y uno vacunado exhibió expectoración durante tres días consecutivos. Todas las otras observaciones de expectoración fueron durante un día solamente. Un caballo de cada uno o de los grupos de vacuna parenteral y parenteral/intranasal, 8% y 9%, respectivamente, exhibieron dos signos de enfermedad clínica durante solamente un día. No se observó depresión en ningún vacunado. En distinción a los vacunados, 80% de los caballos de control sin vacunar exhibieron signos clínicos severos de enfermedad de expectoración y depresión durante tres o más días consecutivos posteriores al estímulo. Cuando los signos clínicos se analizaron como 0= ausente y 1= presente, existió evidencia de una diferencia significante en el número de animales que exhibieron conjuntivitis entre los grupos de vacuna parenteral (p= 0.0313) y los de vacuna parenteral/intranasal (p< 0.0391) y los grupos de control sin vacunar durante 3 y 6 a 13 días posteriores al estímulo. Existe evidencia de una diferencia significante en la reducción de animales que exhibieron depresión (p= 0.0156) en el día 6 posterior al estímulo para tanto los grupos de vacuna parenteral como parenteral/intranasal comparado con los controles sin vacunar. No existe evidencia de una diferencia significante entre los vacunados y los controles para la disnea. Cuando el número de signos clínicos exhibidos cada día fue totalizado, existió evidencia de diferencia significante en la distribución del número de signos clínicos entre los grupos de vacuna parenteral (p=0.0242) y los de vacuna parenteral/intranasal (p=0.0259) y los caballos de control sin vacunar en los días 6 a 9 y el día 11 posterior al estímulo. Los puntos de signos clínicos de conjuntivitis, expectoración, disnea y depresión se tanteados como 1, 2, 3 y 4, respectivamente, como se describe en la tabla V-l. Una puntuación clínica compuesta se calculó por medio de la suma de la descarga nasal y los puntos de signos clínicos . No se incluyeron temperaturas en el cálculo de los puntos compuestos. La puntuación clínico compuesta se calculó para cada caballo durante cada día posterior al estímulo. La puntuación clínica compuesta total es la suma de los puntos clínicos durante todos los días posteriores al estímulo. Existe evidencia de diferencias significantes en los puntos clínicos compuestos entre el grupo parenteral y el grupo control sin vacunar (p<0.0331) durante los días 3 a 9 y 11 a 15 posterior al estímulo y diferencias significantes para los puntos compuestos totales (p=0.0001) . Existe evidencia de diferencias significantes en puntos clínicos compuestos entre el grupo de control parenteral/intranasal y el control sin vacunar (p=0.0241) durante los dias 3 a 9 y 11 a 15 posterior al estimulo y diferencias significantes para los puntos compuestos totales (p<0.0001) . El vertido de virus se monitoreo o verificó en caballos después del estimulo con EHV-4 virulento. Muestras nasales se recolectaron de los caballos en los dias 1 a 7 y cada uno de los otros dias hasta los dias 18 posteriores al estimulo. El virus de estimulo de EHV-4 se recuperó de las muestras nasales de casi todos de uno de los caballos de control sin vacunar. Los virus se detectaron de la mayoría de los caballos de control sin vacunar en la dilución 10-2. Los días 3 a 5 fueron los días principales cuando el vertido de virus se detectó. El virus se detectó de algunos de los caballos de control sin vacunar en el día 6 posterior al estímulo pero a bajos niveles. El virus de estímulo no se recuperó de los caballos vacunados posterior al estímulo.

Conclusión La vacuna que contiene virus de EHV-1 KyA inactivado genera una respuesta inmune humoral sistémica cuando se administra por ambas rutas parenteral y parenteral/intranasal. La vacunación de caballos con la vacuna que contiene EHV-1 genera altos niveles de anticuerpo de VN para EHV-1 y para EHV-4. Los títulos de anticuerpo para tanto EHV-1 como EHV-4 fueron detectados en muestras nasales de animales vacunados pero a un titulo relativamente bajo. Por consiguiente, la vacuna que contiene EHV-1 KyA inactivado fue capaz de inmunizar caballos contra EHV-1 y fue capaz de cruzar inmunización de caballos contra EHV-4. No se observó ninguna respuesta anormal a la vacuna o inyecciones del sitio de reacción en alguno de los caballos posteriormente vacunados . La enfermedad respiratoria severa que consistió de episodios prolongados de descargas nasales serosas y mucopurulentas, conjuntivitis, expectoración y depresión se observó en caballos de control sin vacunar estimulados con EHV-4 virulento. En contraste, el número de signos clínicos de enfermedad respiratoria por EHV-4, la severidad de los signos clínicos y el número de vacunas que exhibieron signos clínicos fue significativamente reducido en caballos vacunados . Caballos vacunados por ya sea las rutas parenteral o parenteral/intranasal mostraron una reducción significante en signos clínicos de enfermedad respiratoria debido a la infección por EHV- . La reducción en enfermedad clínica fue soportada por los datos que establecen que tanto los caballos vacunados por la vía parenteral y parenteral/intranasal no vertieron virus posterior al estímulo con EHV-4. Muestras nasales recolectadas de caballos de control sin vacunar contenían altos niveles de virus en días múltiples posterior al estímulo con EHV-1. El antige.no EHV-1 Kya inactivado contenido en la vacuna fue inmunogénico para protección cruzada de caballos contra enfermedad respiratoria causada por EHV-4 cuando se administró por las rutas parenteral y parenteral/intranasal. En resumen, los resultados de éste estudio demostraron que una vacuna que contenía virus EHV-1 KyA inactivado generó anticuerpo de VN no solamente para EHV-1 sino para anticuerpo de neutralización cruzada para EHV-4. La vacuna que contiene EHV-1 KyA inactivado fue capaz de protección cruzada de caballos contra enfermedad respiratoria causada por EHV-4 virulento cuando se administra utilizando ya sea un régimen parenteral o parenteral/intranasal.

Ejemplo 6 - Inoculación de Caballos con el EHV-1 Inactivado y Estimulo Subsecuente con EHV-1 Virulento El objetivo del estudio descrito en este ejemplo fue demostrar la inmunogenicidad de la fracción EHV-1, cuando se administra por cualquiera de las dos rutas intramuscular o intramuscular/intranasal, para protección cruzada de caballos contra enfermedad causada por EHV-1 virulento. ün objetivo adicional fue demostrar la no interferencia de las fracciones EHV-1 presentes en la inmunogenicidad de EHV-1.

El propósito del estudio fue demostrar inmunogenicidad de la fracción EHV-1 de la vacuna de rinopneumonitis, virus muerto para protección de caballos vacunados estimulados con EHV-1 virulento. La vacuna utilizada en el estudio fue formulada con EHV-1 inactivado y adyuvada con Carbopol® 971. Los caballos fueron vacunados mediante dos diferentes regímenes de vacunación. Un régimen de vacunación fue tres vacunas intramusculares y el otro régimen de vacunación fue dos vacunas intramusculares y una administración intranasal. Los caballos fueron vacunados a intervalos de dos a cuatro semanas. Los caballos sin vacunar sirvieron como controles. En la sexta semana después de la última vacunación, los caballos de control vacunados y sin vacunar fueron estimulados con EHV-1 virulento. Signos clínicos de enfermedad respiratoria severa que incluían descarga nasal mucopurulenta, expectoración, disnea y depresión se observaron en caballos de control sin vacunar posterior a la estimulación con EHV-1.

Caballos. Caballos hembra y machos sanos de diferentes grasas, de tres a cuatro meses de edad, se obtuvieron de diferentes fuentes. Los caballos fueron identificados por los números de tarjeta de cabestro y números de microchips. Todos los caballos estaban en buena salud al inicio del estudio con desconocimiento de incidencia previa de enfermedad respiratoria causada por EHV. Los caballos fueron agrupados en forma aleatoria en grupos al sortear los números de identificación de los caballos de una bolsa. Durante la vacunación y los periodos de estimulo, los caballos se mantuvieron- juntos en corrales abiertos y fueron alimentados con heno de alfalfa de calidad láctea de elección libre. El complemento dietético Sweet 14, Bio-mineral equino, y agua ad libum. Los caballos fueron agrupados en forma aleatoria en grupos al sortear los números de identificación del caballo de una bolsa. Los caballos observaban salud general y ningún comportamiento anormal durante el periodo de. vacunación. Todos los caballos estaban en buena salud al inicio del estudio. No se observaron condiciones de comportamiento anormal o salud adversa en ninguno de los caballos posterior a la vacuna y no se observaron reacciones adversas en los sitios de inyección en ninguno de los caballos posterior a la vacuna. No se observaron signos clínicos de enfermedad respiratoria causada por EHV en ninguno de los caballos durante el periodo de vacunación. En aproximadamente tres semanas antes de la fecha propuesta del estimulo de los caballos con EHV-1 virulento, una erupción como estallido de papera equina (Strangles) ocurrieron en los caballos. Muestras tomadas de los nodos de linfo hinchados fueron presentadas al laboratorio de diagnóstico de Montana State University y Streptococcus equi fue aislado de las muestras. Se administró penicilina a los caballos y los caballos fueron vacunados con una vacuna de S. equi atenuada viva, Pinnacle. Se les permitió a los caballos recuperarse de paperas equina (Strangles) durante tres semanas antes del estimulo con EHV-1 virulento. Un caballo, un caballo de control sin vacunar, se retiró del estudio en el dia del estimulo con EHV-1. Depresión y disnea ligeras se observaron y chillidos de inspiración se escucharon durante el examen. Otro caballo, en el grupo de vacuna intramuscular, murió en septiembre 21,2000, cinco semanas antes de la estimulación con EHV-1. La causa de la muerte fue pneumonía. Un tercer caballo, en el grupo de vacuna intramuscular, murió en octubre 28,2000, un día posterior al estímulo. La causa de la muerte fue un absceso mesenterio roto y toxemia subsecuente. S. equi se aisló del absceso. Todos los caballos estimulados con EHV-1 estaban saludables y no mostraron evidencias de infección por S. equi. Todos los datos de los caballos retirados del estudio no fueron incluidos en el reporte.

Vacuna Fluidos de EHV-1 para utilizarse en la vacuna fueron producidos de acuerdo al procedimiento descrito en los ejemplos 1 y 2. Todos los fluidos de virus estaban en el quinto paso del virus de siembra madre y fueron producidos sobre células en el 20avo. paso del patrón de célula maestro. La vacuna fue formulada para contener EHV-1 y EIV Newmarket/77, subgrupo Al, EIV Kentucky/95, subgrupo A2 y Newmarket 2/93, subgrupo A2, por dos mi de dosis. La vacuna fue etiquetado como EHV-1 Imm Vac, Lot#001, 6129-0510-00E-045, 03-Aug-00. Diseño estudio La vacuna se suministro a caballos para dos regímenes de vacunación. Un régimen de vacunación fue tres vacunas intramusculares en intervalos de dos a cuatro semanas. El otro régimen fue dos vacunas intramusculares a dos-cuatro semanas de separación y la tercera vacunación por la ruta intranasal de dos a cuatro semanas más tarde. Cada grupo de régimen de vacunación contenía 19-20 caballos. Un grupo de 20 caballos sirvió como controles sin vacuna. A las seis semanas después de la última vacunación, los caballos fueron estimulados con EHV-1 virulento. Los caballos fueron monitoreados para signos clínicos de enfermedad respiratoria causada por EHV-1 y la severidad del enfermedad fue registrada. Las muestras sanguíneas y nasal para evaluación serológica y los hisopos nasales para aislamiento del virus, fueron tomadas antes y a tiempos seleccionados . La recolección de las muestras de sangre, nasal e hisopos nasales, están descritas en el protocolo del estudio del animal .

Títulos de anticuerpo de VN en el suero para EHV-1 y EHV-4. Se determinaron títulos de anticuerpo de VN de suero en caballos antes y después de la vacunación y el estímulo con EHV-1 virulento. Todos los caballos tanto de los grupos de vacunación intramuscular e intramuscular/intranasal tuvieron títulos de anticuerpo de VN de =2 o 4 para EHV-1 al tiempo de la primera vacuna. Un caballo en el grupo de vacunación intramuscular y cinco caballos en el grupo de vacunación intranasal tuvieron título de anticuerpo de VN para EHV-4 de 8 o 16 al tiempo de la primera vacunación. Los títulos de anticuerpo de VN en los caballos de control sin vacuna fueron =2 a 16 con la mayoría en =2 o 4 en el tiempo de la primera vacunación. Ninguno de los caballos mostró evidencia alguna de una infección respiratoria y no existió conocimiento previo a la exposición al EHV. Después de la vacunación, no existió poco incremento en el título de VN para EHV-1 y EHV-4. Los títulos de anticuerpo en los caballos de control sin vacunar permanecieron sin cambiar y, de hecho, los títulos de anticuerpo en algunos controles disminuyeron ligeramente a partir de los títulos de pre-vacunación. Después de la segunda vacuna, los títulos de anticuerpo de VN para EHV-1 se incrementaron en los grupos de vacunación intramuscular e intramuscular/intranasal . Los títulos de anticuerpo para EHV-4 no se incrementaron en ninguno de los dos grupos de vacuna. Los títulos de anticuerpo en los controles sin vacunar permanecieron sin cambiar o continuaron disminuyendo 0 declinando en el grupo de control sin vacunar. En una tercera posterior vacunación, los títulos de VN para EHV-1 continuaron incrementándose. Los títulos de anticuerpo para EHV-4 también se incrementaron después de la tercera vacuna. Los títulos de anticuerpo de VN medios geométricos para EHV- 1 y EHV-4 en el grupo de vacuna intramuscular fueron de 86 y 19, respectivamente y fueron de 69 y 20 para EHV-1 y EHV-4, respectivamente en el grupo intramuscular/intranasal. Con la excepción de tres caballos de control sin vacunar, los títulos de anticuerpo para EHV-1 y EHV-4 permanecieron sin cambiar o declinaron al final del tercer período de vacunación. A 21 días posteriores al estímulo con EHV-1 virulento, los títulos de anticuerpo de VN para ambos EHV-1 y EHV-4 se incrementaron dramáticamente en algunas vacunas y se incrementaron sólo ligeramente o permanecieron idénticos en otras vacunas. Sin embargo, en caballos de control sin vacunar, los títulos de anticuerpo de VN se incrementaron por arriba de 100 veces tanto para EHV-1 como para EHV-4 en casi todos los cuatro caballos de control sin vacunar. En general, los títulos de anticuerpo de VN fueron mayores para EHV-1 que para EHV- .

Valoración de virus de estímulo de EHV-1 Cinco valoraciones replicadas de virus de estímulo de EHV-1, cepa KyD, se llevaron a cabo sobre células Vero. Los resultados de las cinco valoraciones de replicación fueron 4.4, 4.4, 4.4, 4.4, y 4.5 TCID5oLogi0/ml . La valoración media fue de 4.4 TCID5oLogi0/ml. Dos mililitros fueron administrados a cada caballo para estímulo, para dar una dosis de 4.7 TCID5oLogi0/2 mi. La dosis objetivo del virus a ser administrado a caballos para estímulo fue =4.0 de dosis TCID50Logio/2 mi.

Estímulo de caballos con EHV-1 virulento Se obtuvo una cepa EHV-1 KyD de la American Type Culture Collection y se propagó sobre células Vero. Patrones del EHV-1 a ser utilizado para estímulo, estaban contenidos a una concentración objetivo de =4.0 TClD50Logi0/ml . Los patrones fueron congelados a -70°C. Una muestra de virus de estímulo fue descongelado y se determinó el título. Al tiempo del estímulo, los fluidos del virus fueron descongelados y dos mililitros del EHV-1 fueron retirados con una eringa de tres mi y una aguja calibre 21. La aguja fue retirada y el virus de estímulo fue administrado en forma intranasal a los grupos apropiados de los caballos vacunados y sin vacunar. Los caballos de control vacunados y sin vacunar fueron alojados juntos en corrales abiertos durante el dia 21 posterior al periodo de estimulo. Posterior al estimulo, los caballos fueron monitoreados para pirexia y signos clínicos de enfermedad respiratoria causados por EHV-1 que incluía, descarga nasal, conjuntivitis, expectoración, disnea, depresión y otros, tal como tratamiento con antibiótico requerido para infección bacteriana secundaria. Los caballos observaron diariamente para enfermedad clínica y la severidad de la enfermedad fue registrada . Pirexia en caballos posterior al estímulo con EHV-1 fue monitoreada. La pirexia fue esporádica y se dispersó durante la duración del periodo de estímulo. Se encontraron caballos en el grupo de control sin vacunar así como tanto en los grupos vacunados que tuvieron temperaturas elevadas durante 2 y 3 días consecutivos pero no parecían tener una correlación de pirexia con signos clínicos de enfermedad respiratoria. No existió evidencia de diferencias significantes en la distribución de puntos de pirexia entre cada uno de los grupos de vacunación y el grupo de control sin vacunar. Se hicieron observaciones de descarga nasal en caballos. Se registró la descarga nasal como normal, cantidad ligera serosa, cantidad abundante serosa, cantidad ligera mucopurulenta, y cantidad abundante mucopurulenta y puntos como 0, 1, 2, 3 y 4, respectivamente, de acuerdo al protocolo del animal. Se observaron descargas nasales serosas posterior al estimulo en todos los caballos en el grupo de vacuna intramuscular con aproximadamente un número igual de caballos que exhibieron cantidades ligeras y abundantes de descarga de suero. Los caballos 405 y 423 tuvieron dos dias consecutivos de descarga mucopurulenta y los caballos 420 y 469 tuvieron un dia de descarga mucopurulenta. Los caballos de control sin vacunar exhibieron principalmente descarga mucopurulenta durante múltiples dias consecutivos. Cuando los puntos de descarga nasal se analizaron de acuerdo al sistema de puntuación en el protocolo del animal, se encontró evidencia de una diferencia significante en la distribución de los puntos de descarga nasal entre el grupo intramuscular y el grupo de control sin vacunar durante los dias 5-7 y 10 posterior al estimulo (p=0.0018). Resultados similares de descarga nasal serosa se observaron en el grupo intramuscular/intranasal posterior al estimulo con descarga mucopurulenta registrada para las dos vacunas durante uno o dos dias. Se encontró evidencia de una diferencia significante en la distribución de puntos de descarga nasal entre el grupo intramuscular/intranasal y los grupos controles sin vacunar en los días 4-7r 10 y 19 posterior al estimulo (p=0.0463) . Cuando los puntos de descarga nasal se analizaron de acuerdo a un sistema de normal=0, seroso=l y mucopurulento=2 , se encontró evidencia de una diferencia significante entre el grupo intramuscular y los grupos de control sin vacunar en los dias 5-7, 10 y 17 posterior al estimulo (p=0.0 63) . También se encontró evidencia de una diferencia significante en la distribución de los puntos de descarga nasal entre el grupo intramuscular/intranasal y los grupos de control sin vacunar en los dias 4-7 y 10 posterior al estimulo (p<0.0092). También fueron hechas observaciones posteriores al estimulo de signos clínicos de conjuntivitis, expectoración, disnea, y depresión. Los días 3 a 11 posterior al estímulo, fueron los días cuando la mayoría de signos severos de la enfermedad se observaron en los caballos. Signos clínicos de enfermedad ocurrieron más frecuentemente en los días 3 a 11 posterior al estímulo. También pareció ser una fase secundaria de signos clínicos que fueron observados en vacunas y controles. Sin embargo, esto se observó en vacunas para solamente días simples y no en controles para días múltiples. La expectoración y conjuntivitis fueron los principales signos de enfermedad clínica observados en las vacunas en el grupo de régimen intramuscular. Conjuntivitis y expectoración se observaron en las vacunas durante no más de tres dias consecutivos. Se encontró evidencia de una reducción significante en proporción de animales que exhibieron con untivitis en el grupo intramuscular coraparado con los controles sin vacuna en los dias 6 y 7 posterior al estimulo (p=0.0197) y se encontró evidencia de una reducción significante en la proporción de animales que exhibieron expectoración en el grupo intramuscular comparado con los controles sin vacunar en los dias 4 a 8 posterior al estímulo (p=0.0463). Conjuntivitis y expectoración fueron los signos clínicos más comunes de la enfermedad observada en el grupo de vacunación intramuscular/intranasal . Se encontró evidencia de una reducción significante en la proporción de animales que exhibieron conjuntivitis en el grupo intramuscular/intranasal comparado con los controles sin vacunar en los días 6 y 7 posterior al estímulo (p=0.0197) y se encontró evidencia de una reducción significante en la proporción de animales exhibían expectoración en el grupo intramuscular comparado con los controles sin vacunar en los días 5 y 6 posterior al estímulo (p=0.0044). No se observó depresión en ninguno de las vacunas intramusculares posterior al estímulo y se observó en solamente dos vacunas intramuscular/intranasal posterior al estímulo. Se observó depresión en los caballos de control múltiples sin vacunar durante días múltiples. En contraste a las vacunas, los caballos de control sin vacunar demostraron signos múltiples de enfermedad que en general persistían durante cuatro días consecutivos y durante siete u ocho largos días. No se observó disnea en ningún caballo vacunado pero se observó en dos caballos control durante múltiples días. Los mismos dos caballos de control sin vacunar requirieron tratamiento con antibiótico para infección bacteriana secundaria. las puntuaciones de enfermedad clínica, como se calcularon por el protocolo del animal, se presentan en las tablas 7 y 8 para vacunas intramusculares versus controles y vacunas intramuscular/intranasal versus controles, respectivamente. El número de signos clínicos fue registrado para cada día y se reportó como 0, 1, 2 o 3. Cuando el número de signos clínicos exhibido cada día fue registrado, se encontró evidencia de diferencia significante en la distribución del número de signos clínicos entre el grupo intramuscular y el grupo de control sin vacunar durante 4 a 8 días (p=0.0206). Existió evidencia de diferencia significante en la distribución del número de signos clínicos entre el grupo intramuscular/intranasal y grupos de control sin vacunar ato durante 5 días a 7 (p=0.0159) . Una puntuación clínica compuesta se calculó mediante la suma de la descarga nasal y las puntuaciones de signos clínicos. La prueba de Kruskal-Wallis, una extensión de múltiples grupos de los dos grupos de prueba de Wicoxins se utilizó para probar la hipótesis de igualdad de puntos entre los grupos. La prueba de Wilcoxons fue utilizada para probar la hipótesis de igualdad de reducción en los puntos para cada grupo de vacuna comparado con el grupo de control (una prueba de un solo lado) y para probar la hipótesis de igualdad de puntos entre los grupos de vacuna (una prueba bi-lateral) . Existió evidencia de reducción significante en los puntos clínicos compuestos entre el grupo intramuscular y el grupo de control sin vacunar durante los días 4 a 7 y el día 11 posterior al estímulo (p=0.0372) y para el total de puntos clínicos compuestos (p=0.0001). Existió evidencia de reducción significante en los puntos clínicos compuestos entre el grupo intramuscular/intranasal y el grupo de control sin vacunar durante los días 4 a 7 y el día 11 posterior al estímulo (p=0.0408) y para la puntuación clínica compuesta total (p=0.002). Un punto clínico compuesto modificado, la suma de la puntuación observada clínica y los puntos de descarga nasal pero sin pirexia, también fue calculado. Existió evidencia de reducción significante en los puntos clínicos compuestos modificados entre el grupo intramuscular y el grupo de control sin vacunar durante los días 3 a 8 y los días 10, 11 y 19 posterior al estímulo (p=0.0383) y para el punto clínico compuesto total (p<0.0001) . Existió también evidencia de reducción significante en la puntuación clínica compuesta entre el grupo intramuscular/intranasal y el grupo de control sin vacunar durante los días 3 a 7 y los días 10, 11 y 19 posterior al estímulo (p=0.0487) y para la puntuación clínica compuesta total (p=0.0001) .

Vertido del virus de los caballos posterior al estímulo El virus de estímulo de EHV-1 se recuperó de las muestras nasales de todos los virus vertidos de los caballos control sin vacunar posterior al estímulo con EHV-1 y se almacenaron a -70 °C. Muestras congeladas fueron descongeladas y los hisopos se retiraron del medio de transporte. La muestra fue procesada mediante centrifugación a 2500 x g durante 20 minutos a 19-22 °C. Una alícuota de 0. lml de la muestra procesada se adicionó a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 48 pozos que contenía monocapas de 24-48 horas de células Vero. Las placas de cultivo se incubaron a 37 °C en un incubador de C02 durante siete días. Se observaron los pozos sobre una base regular para la presencia de efecto citopático (CPE) típico de EHV. Los pozos que exhibieron citotoxicidad fueron subcultivados después del período de incubación de siete días al transferir 0.2ml del pozo a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 48 pozos que contenía una monocapa de 24 horas de células Vero. Las placas de cultivo se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 durante siete días y se observaron para CPE. El título de EHV en las muestras nasales procesadas que fueron positivas para CPE, se determinó por medio de métodos de valoración estándar sobre células en placas de cultivo de tejido de 96 pozos. El virus de estímulo de EHV-1 se recuperó de las muestras nasales de todos los virus vertidos de los caballos de control sin vacunar posterior al estímulo con EHV-1. El virus detectado en los hisopos nasales fue identificado como EHV-1 por medio del ensayo de inmunofluorescencia utilizando anticuerpo monoclonal específico de EHV-1. El virus fue detectado de los caballos de control sin vacunar a las diluciones 10~2 a 1CT3. De dos a cinco días fueron los días principales cuando se detectó el virus vertido. El virus de estímulo se recuperó posterior al estímulo de los cinco • caballos en el grupo de vacuna intramuscular y de tres caballos en el grupo de vacuna intramuscular/intranasal . Existió evidencia de una reducción significante en la proporción de animales que exhibieron la presencia de virus en el grupo intramuscular comparado con el grupo de control sin vacunar durante dos a cinco días (p=0.0001) y se . encontró evidencia de una reducción significante en la proporción de animales que exhibieron la presencia del virus en el grupo intramuscular/intranasal comparado con el grupo de control sin vacunar durante de 2 a 5 días (p=0.0003).

Criterio para un estudio satisfactorio El siguiente criterio debe cumplirse para un estudio satisfactorio de inmunogenicidad de EHV: Los caballos de control sin vacunar deben permanecer seronegativos para EHV-1 y EHV-4 durante el período de vacunación y/o no mostrar ningún signo clínico de enfermedad como un indicador de exposición de los caballos de prueba a virus de campo virulento. El estímulo posterior con EHV-1 virulento, debe ser una reducción estadísticamente significante en signos clínicos de enfermedad en animales vacunados comparados con signos clínicos de enfermedad en animales de control sin vacunar .

Conclusiones En el estudio, grupos de potros hembras y machos de tres a cuatro meses de edad fueron vacunados con tres dosis de vacuna administrada por cualquiera de las rutas intramuscular o intramuscular/intranasal . Siguiendo la administración de tres dosis de vacuna, todos los animales vacunados desarrollaron anticuerpo de V . El desarrollo de la respuesta humoral sistémica fue similar en animales vacunados mediante los regímenes de vacunación intramuscular e intramuscular/intranasal . La vacunación de caballos con la vacuna que contiene EHV-1 generó altos niveles de anticuerpo de VN para EHV-1 y para EHV-4. Por consiguiente, la vacuna que contiene EHV-1 fue capaz- de inmunizar caballos contra EHV-1 y fue capaz de cruzar inmunización de caballos contra EHV-4. No se observó respuesta anormal para la vacunación o inyecciones del sitio de reacción en uno de los caballos posterior a la vacunación. Para evaluar la capacidad de la vacuna que contiene EHV-1 para proteger caballos contra enfermedad respiratoria causada por EHV-1, se compararon los signos clínicos de la enfermedad respiratoria en los caballos vacunados con la enfermedad clínica en caballos de control sin vacunar después del estimulo de una cepa virulenta de una cepa de EHV-1 KyD. En aproximadamente seis semanas posterior a la tercera vacunación con la vacuna que contiene EHV-1, los caballos control sin vacunar y vacunados fueron estimulados en forma intranasal con el EHV-1 virulento. La enfermedad respiratoria severa que consistió de episodios prolongados de descargas serosas y nasal mucopurulenta, conjuntivitis, expectoración, depresión y disnea se observó en caballos de control sin vacunar estimulados con EHV-1 virulento. En contraste a los animales control, el número de signos clínicos de enfermedad respiratoria por EHV-1, la severidad de los signos clínicos y el número de vacunas que exhibieron signos clínicos, fueron reducidas en forma significante en caballos vacunados. Tanto las rutas intramuscular como la intramuscular/intranasal de vacunación fueron similares en la reducción de los signos clínicos de enfermedad respiratoria debido a infección por EHV-1. La reducción en enfermedad clínica en las vacunas está soportada por los datos que los virus de vertido de los caballos vacunados intramuscular e intramuscular/intranasal que fueron menos posterior al estímulo con EHV-1 y el virus vertido durante periodos más cortos de tiempo. Los resultados del estudio demostraron que la vacuna que contiene el anticuerpo de VN generado por EHV-1 inactivado fue inmunogénica para protección de caballos contra enfermedad respiratoria causada por EHV-1 cuando se administra por ya sea la ruta intramuscular o la ruta intramuscular/intranasal.

Ejemplo 7- Producción de Composiciones Inm nogénicas que Contienen Cepas de EHV-1 y EHV-4 inactivadas Para producir la vacuna combinada, cultivos de semillas maestras de EHV-1 y EHV-4 fueron primeramente producidos. A partir de estas semillas maestras, los cultivos separados de EHV-1 y EHV-4 se hicieron crecer y después se inactivaron. Los cultivos de virus inactivado son después mezclados con adyuvante para producir la vacuna combinada. El método utilizado para producir la vacuna de EHV-l/EHV-4 inactivada, combinada, esta descrita en seguida. Fluidos que contenían EHV-1 KyA inactivado del fluido de cultivo del virus de siembra madre designado como EHV-1 KyA, MSV Lot 001-dil, se produjo de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 1. Para crear el virus de siembra madre del herpesvirus equino tipo 4 (EHV-4) , personal de Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., aisló virus de un caballo infectado con rinitis. El virus aislado se pasó cinco veces sobre células Vero A139 y tres veces sobre células EVero. El tercer paso fue utilizado como un virus de siembra madre y se designó como EHV-4, MSV Lot 001-dil. Cultivos de EHV-4 fueron producidos al infectar células EVero con virus de semilla contenido en un medio mínimo esencial (MEM) que tenía de 0 a 5% de suero. Los cultivos fueron después incubados a 36°C + 2°C durante de 24 a 120 horas en botellas cilindricas de vidrio o en perlas microportadoras . Durante la incubación, los cultivos fueron revisados para efectos citopáticos (CPE) inducidos por EHV para asegurar la pureza de la cepa EHV. Si CPE atípico estuviera presente o cualquier evidencia macroscópica o microscópica de contaminación existiera, el cultivo se desecho. Los cultivos de virus puros fueron cosechados en forma aséptica en bombonas de vidrio estériles, bombonas de plástico estériles o tanques de acero inoxidable estériles y fueron clarificados por medio de filtración a través de filtros de 8 mieras o más. Después de que es cosechado, el cultivo de virus se inactiva a fin de producir una vacuna muerta o inactiva utilizando el procedimiento descrito para EHV-1 en el ejemplo 1. Después de la inactivación, los cultivos fueron probados para CPE tipico de EHV para asegurar la inactivación del virus utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 5. Esta tarea se complementó al pasar los fluidos virales tratados con BEI sobre células EVero y verificando las células EVero para cualquier infección viral. Después de una prueba de inactivación satisfactoria que no mostró infección viral, el BEI se neutralizó al adicionar una solución fría (4°C ± 2°C) de tiosulfato de sodio 1.0M para dar una concentración final de 6mM. Siguiendo la inactivación y la prueba de los cultivos de EHV-1 y EHV-4, los cultivos se mezclaron con un adyuvante para formar el producto final, la vacuna de EHV-l/EHV-4 inactivada, combinada. Este producto final contenia fluidos de EHV-1, fluidos de EHV-4, solución madre de adyuvante (0.5% de Carbopol® 971), y solución salina en una proporción de 3.75:3.00:12.00:41.19. En forma típica, un lote contenía 3,750 mL de EHV-1, 3,000 mL de EHV-4, 12,000 mL de solución adyuvante y 41,190 mi de solución salina, produciendo un volumen total de 60 L de un serial a granel .

Ejemplo 8- Inoculación de Caballos con la Vacuna Combinada de EHV-1 y EHV-4 y Estimulo Subsecuente con EHV-4 Virulento Se llevó a cabo un experimento para demostrar la inmunogenicidad de la vacuna de combinación EHV-1/EHV-4 inactivada. Seis grupos de caballos machos y hembras que estaban en el intervalo de edad de cuatro a siete meses y eran neutros al virus de EHV-1 y EHV-4, se utilizaron en el experimento. Como se ilustra en la tabla VIII-1 siguiente, tres grupos fueron estimulados con EHV-1 virulento mientras tres grupos fueron estimulados con EHV-4 virulento. De los caballos estimulados con el EHV-1, un grupo fue vacunado con tres inyecciones intramusculares ("IM"), un grupo fue vacunado con dos inyecciones intramusculares seguidas por una administración intranasal ("IN"), y un grupo no fue vacunado. En forma similar, de los caballos estimulados con el EHV-4, un grupo fue vacunado en forma completa con inyecciones intramusculares, un grupo fue vacunado con dos inyecciones intramusculares seguidas por una administración intranasal, y un grupo no estaba vacunado. Los caballos fueron vacunados a intervalos de tres semanas con dosis de 2 mi de la vacuna combinada que tenia un RPV de 1.0 por dosis de EHV-1 inactivado y 1.0 por dosis de EHV-4 inactivado. Durante la prueba, los caballos fueron monitoreados para signos de enfermedad respiratoria. No se observaron signos clínicos de enfermedad respiratoria en ninguno de los caballos durante el periodo de vacunación.

Tabla VIII-1 Resumen de prueba de vacuna de EHV-l/EHV-4 combinada Grupo No. de animales Método de vacunación Estímulo Grupo IV-•1 10 IM, IM, IM EHV-1 Grupo IV-•2 10 IM, IM, IN EHV-1 Grupo IV-•3 10 Ninguno (grupo de control) EHV-1 Grupo IV-¦4 10 IM, IM, IM EHV-4 Grupo IV-¦5 10 IM, IM, IN EHV-4 Grupo IV-¦6 10 Ninguno (grupo de control) EHV-4 Animales fueron estimulados a tres semanas después de la vacunación con ya sea EHV-1 virulento o EHV-4 virulento a una dosis objetivo de 5.0 TCID50 Logi0/2 mi. Específicamente, la cepa EHV-1 Kentucky D (dosis aproximada de 4.5 TCID50Logio/2ml) y cepa de EHV-4 405 (dosis aproximada de 4.0 TCID50Logio/2ml) se utilizaron como el virus de estímulo y fueron administradas en forma intranasal en dosis de 2 mi (administrada como una dosis de 1 mi por nariz) . La protección de la vacuna se midió al monitorear los caballos por signos clinicos de enfermedad respiratoria, tal como pirexia, descarga nasal, conjuntivitis, expectoración, disnea, y depresión, y se midió la severidad de la enfermedad. En forma adicional, muestras de sangre y nasal se tomaron para medir la cantidad de virus vertido. Posterior al estimulo por el virus, todos los grupos de caballos vacunados estimulados con ya sea EHV-1 o EHV-4 mostraron una reducción significante en los signos de enfermedad respiratoria, con pequeña diferencia exhibida entre los grupos de vacuna parenteral y los grupos de vacuna parenteral/intranasal. Específicamente, los animales vacunados experimentaron una significante disminución en la descarga nasal, conjuntivitis, expectoración, disnea, y depresión. Estos resultados demostraron que los antigenos EHV-1 y EHV-4 contenidos en la vacuna combinada de EHV-1/EHV-4 inactivada son inmunogénicos cuando se administran por ya sea la ruta parenteral o parenteral/intranasal. Además los caballos vacunados mostraron una reducción en enfermedad respiratoria, los caballos vacunados también exhibieron una reducción en el vertido del virus. De los caballos vacunados estimulados con EHV-1, vertido del virus a 1 a 2.5 logioTCID5D/ml durante de uno a tres días, solamente se observó con sólo 30% del grupo de vacuna parenteral y 40% del grupo parenteral/intranasal. En contraste, 90% del grupo control sin vacunar vertió el virus en 2.5 a 3.75 logi0 TCID50/ml durante dos a siete dias. En forma similar, de los caballos vacunados estimulados con la cepa de EHV-4 virulento, el vertido del virus a 1 a 2.5 log10 TCIDso/ml durante uno a tres dias, fue solamente observado con 40% del grupo de vacuna parenteral y 50% del grupo parenteral/intranasal . Nuevamente, los caballos sin vacunar exhibieron mucho mayor vertido del virus con 100% del grupo de control sin vacunar que vertió el virus a de 1 a 5.25 logio TCID50/ml durante dos a siete dias. Estas estadísticas son evidencias de una reducción significante en la cantidad y el número de días en el que los caballos vacunados vertieron el virus comparado con los caballos sin vacunar. Tal evidencia establece que los antígenos EHV-1 y EHV-4 contenidos en la vacuna combinada de EHV-l/EHV-4 inactivada son inmunogénicos cuando se administran ya sea por la ruta parenteral o parenteral/intranasal.

Ejemplo 9- Inoculación de Caballos con la Vacuna de Influenza Equina de EHV-l/EHV-4 Combinada y Estimulo Subsecuente con Virus de Influenza Equina Virulenta Se llevó a cabo un experimento para evaluar la inmunogenicidad de las fracciones de la vacuna de EIV por medio de la evaluación de la respuesta serológica a los subgrupos de EIV Al y A2 en el animal hospedero. El estudio fue también diseñado para demostrar la no interferencia del EIV y los componentes de EHV en una combinación de vacuna de rinopneumonitis-influenza, virus muerto por evaluación serológica en el animal hospedero. El tercer objetivo fue demostrar que el subgrupo de EIV Al y los subgrupos de EIV A2 en la vacuna de influenza y las vacunas de . combinación de rinopneumonitis-influenza son inmunogénicos cuando se administran por la ruta parenteral y parenteral/intranasal.

Diseño de estudio La vacuna A se administró a caballos mediante dos regímenes de vacunación. Un régimen de vacunación fue tres vacunas intramusculares a intervalos de tres semanas. El otro régimen fue dos vacunas intramusculares con separación de tres semanas y la tercera vacuna por la ruta intranasal tres semanas más tarde. Cada grupo de régimen de vacunación contenía 20 caballos. Un grupo de cinco caballos sirvió como controles sin vacunar. Muestras de sangre y lavados nasales se tomaron antes y a tiempos seleccionados posterior a la vacunación para la evaluación de la respuesta serológica a cada una de las tres cepas de vacuna de EIV. Lavados de sangre y nasal fueron recolectados de los caballos a intervalos periódicos . Los caballos observaban salud general y ningún comportamiento o condiciones de salud anormal durante los 63 días del periodo experimental.

Caballos Caballos hembra y machos saludables en el intervalo de edad de 7 a 9 meses se obtuvieron de fuentes seleccionadas. Los caballos fueron identificados mediante números de microchip y fueron agrupados aleatoriamente en grupos al sortear los números de identificación de los caballos de un saco. Durante el periodo experimental, los caballos se mantuvieron en corrales abiertos y se alimentaron con heno de alfalfa de calidad láctea de elección libre, complemento dietético Sweet 14, Bio-mineral equino y agua ad libum. Se observó que los caballos por lo general eran saludables y sin ningún comportamiento anormal durante el periodo experimental. Ninguna condición de comportamiento anormal o de salud adversa se observó en ninguno de los caballos posterior a la vacunación y no se observaron reacciones adversas en el sitio de inyección en ninguno de los caballos posterior a la vacunación. Al tiempo de la primera vacunación, los caballos vacunados con la vacuna A tenían títulos de anticuerpo de inhibición de hemoaglutinación (HAI) de = 10 a subgrupos EIV Al y A2.

Vacuna La vacuna incluía virus muerto de EIV que contenía subgrupo de EIV Al y cepas del subgrupo de EIV A2 antigénicamente relevante. Debido a que los subgrupos A2 en Norteamérica difieren de los subgrupos A2 en Europa, la vacuna contenia cepas, designadas como entucky/95 y Newmarket/2/93, que son representativas de los subgrupos A2 en Norteamérica y Europa, respectivamente. Los fluidos del virus de EIV y EHV para utilizarse en la vacuna fueron producidos de acuerdo a los procedimientos descritos en el ejemplo 7. Los fluidos del virus fueron en el quinto paso del virus de siembra madre y fueron producidos sobre células en el 20avo paso del patrón de célula madre. La vacuna A fue formulada para contener 64 unidades de HA del subgrupo de EIV Al, 128 unidades de HA de cada uno de los dos subgrupos de EIV A2 y >3.0 unidades de potencia relativa (RP) de EHV-1 y =3.0 de unidades de potencia relativa (RP) de EHV-4 por dos mi de dosis. La vacuna fue etiquetada como EIV/EHV Imm/Intfr, 623-0856-98E-107, vacuna A Lot 001, 12-15-98.

Determinación de la potencia de las fracciones EIV y EHV de la Vacuna A. La potencia de las fracciones de EIV en la vacuna fueron determinadas por la National Veterinary Services Laboratorios Testing Protocol, Supplemental Assay ethod for Conducting the Hemagglutination Inhibition Assay for Equine Influenza Antibody (MVSAM012 .01, fechada el 2 de octubre de 1998) . Los valores de potencia relativa de las fracciones EHV-1 y EHV-4 en la Vacuna A, se determinaron por medio del ensayo de liberación de potencia ELISA de EHV descrita en el ejemplo 4. La potencia de la Vacuna A fue satisfactoria para las fracciones de EIV. Diez de diez cobayos tenían títulos de anticuerpo de HAI de 80 o más para cada subgrupo Al y diez de diez cobayos tenían títulos de anticuerpo de HAI de 40 o más para cada subgrupo A2 en la vacuna. El valor de potencia relativa fue de 4.73 y 3.31 para las fracciones de EHV-1 y EHV-4, respectivamente.

Títulos de anticuerpo de HAI de suero para los subgrupos de EIV Al y A2 posterior a la vacunación. Los títulos de anticuerpo de HAI en los caballos después de la vacunación con la Vacuna A fueron determinados. Todas las vacunas fueron seronegativas para todas las tres cepas de EIV al tiempo de la primera vacunación. En el periodo de tiempo de pre-vacunación, dos de los caballos control sin vacunar tuvieron títulos de anticuerpo de HAI de 20 para el EIV Al y los otros tres caballos de control fueron seronegativos para el EIV Al. Todos los cinco caballos de control sin vacuna fueron seronegativos para los dos EIV A2. Durante el periodo experimental, los caballos de control sin vacunar permanecieron seronegativos para los dos subgrupos de EIV A2 y no mostraron más de 2 veces la variación en el título del anticuerpo de HAI para el subgrupo EIV Al. No existió indicación de exposición al campo de EIV durante el periodo experimental. A tres semanas posteriores a la primera vacunación, la mayoría de los caballos mostró una respuesta serológica al subgrupo de EIV Al y al subgrupo de EIV A2 NM. Después de una vacunación, solamente cuatro caballos tenían una respuesta serológica para el subgrupo de EIV A2 K. El número de caballos con una respuesta serológica para el subgrupo de EIV A2 K se incrementó después de la segunda vacuna. Después de la tercera vacuna, 19 de 20 caballos (95%) que recibieron las tres vacunas intramusculares tenían títulos de anticuerpo de HAI de 40 o más para el subgrupo de EIV Al. Después de tres inyecciones intramusculares, 18 de 20 (90%) y 20 de 20 (100%) de los caballos tenían títulos de anticuerpo de HAI de 20 o más, para los subgrupos de EIV A2 K y de EIV A2 NM, respectivamente. En forma similar, 17 de 20 caballos (85%) que recibieron dos vacunas intramusculares y una vacuna intranasal tenían títulos de anticuerpo de HAI de 40 o más para el subgrupo EIV Al. Dieciocho de 20 (90%) y 20 de 20 (100%) de los caballos tenían títulos de anticuerpo de HAI de 20 o más para los subgrupos de EIV A2 K y EIV A2 NM, respectivamente, después de dos vacunas intramusculares y una intranasal. Lo títulos de anticuerpo medios geométricos después de la tercera vacuna fueron 45, 35 y 61 para los subgrupos EIV Al, A2K y A2 NM, respectivamente, en caballos que recibieron tres inyecciones intramusculares.

Los títulos de anticuerpo medios geométricos en caballos que recibieron dos vacunas intramusculares y una intranasal fueron 39, 24, y 51 para los subgrupos EIV Al, A2 K y A2 NM, respectivamente .

Títulos de anticuerpo de HAI mucosal para subgrupos de EIV Al y A2 posterior a la vacunación. Los títulos de anticuerpo de HAI en muestras nasales de caballos después de vacunación con la Vacuna A fueron determinados. Al tiempo de la primera vacuna, el anticuerpo de HAI para los dos subgrupos EIV A2 no fue detectado en ninguna de las muestras nasales de los caballos. Los títulos de inhibición de hemoaglutinación para el subgrupo EIV Al fueron detectados en algunos de los caballos control vacunados y sin vacunar en la primera vacunación. Después de la primera y segunda vacunas, los niveles del anticuerpo de HAI en secreciones nasales fueron variables. Después de la vacunación final intramuscular o intranasal, los niveles del anticuerpo de HAI fueron mayores para el subgrupo EIV Al comparado con los dos subgrupos A2. No existió poco del anticuerpo sin HAI para el subgrupo EIV A2 K en las muestras nasales de los caballos posterior a la tercera vacuna por ya sea la ruta intramuscular o intranasal. En forma interesante, los niveles del anticuerpo de HAI para el subgrupo EIV Al y el subgrupo A2 NM fueron menores en caballos que recibieron la tercera vacuna por la ruta intranasal. Discusión Un propósito de éste estudio fue demostrar la inmunogenicidad de las fracciones de EIV Al y A2 en la vacuna, cuando se administraron por cualquier régimen de vacunación. La inmunogenicidad fue valorada por medio de la determinación de la respuesta del anticuerpo de HAI de suero para las tres cepas de EIV después de la vacunación final. Los resultados demostraron que más del 80% de los caballos en ambos grupos de régimen de vacunación tenían títulos de anticuerpo de HAI de suero de 40 o más para el subgrupo EIV Al después de la vacunación final y más del 80% de los caballos en ambos grupos de régimen de vacunación tenían títulos de anticuerpo de HAI de suero de 20 o más para ambos subgrupos de EIV A2 después de la vacunación final. Los niveles de anticuerpo de HAI para los subgrupos EIV Al y A2 fueron también determinados en muestras nasales a tiempos seleccionados posteriores a la vacunación. Los títulos de anticuerpo de HAI mucosal fueron menores que los títulos del anticuerpo de HAI en muestras nasales de caballos en ambos regímenes de vacunación y, en contraste a los títulos de HAI de suero, los títulos de HAI de suero se incrementaron muy poco después de cada vacunación. Es posible que el ensayo de inhibición de hemoaglutinación no detecte el isotipo del anticuerpo que es más prevaleciente en las muestras nasales. Los experimentos demostraron que el subgrupo de EIV Al y los subgrupos A2 en la vacuna de influenza, virus muerto y la vacuna de rinopneumonitis-influenza, virus muerto, fueron inmuogénicos cuando se administraron por ambas rutas parenteral y parenteral/intranasal . En particular, el estudio demostró que el subgrupo EIV NM/77 Al y el subgrupo K95 A2 y subgrupos NM/2/93 A2 fueron inmunogénicos . Otro propósito para el estudio fue demostrar la no interferencia de las fracciones de vacuna de EIV y EHV entre si. La vacuna A utilizada en el estudio fue formulada con la dosis de liberación mínima de 64 y 128 HA unidades de las fracciones EIV Al y A2, respectivamente, y formulada con un valor de potencia relativa de tres veces o mayor, para las fracciones de EHV-1 y EHV-4. Los resultados del estudio demostraron que una vacuna que contenía la dosis de antígeno mínima de las fracciones de EIV y mayor que la dosis mínima de antígeno de EHV, es capaz de generar una respuesta serológica satisfactoria para los subgrupos de EIV Al y A2 en el animal hospedero. Por consiguiente, las fracciones EHV-1 y EHV-4 no interfirieron con la inmunogenicidad de las fracciones de vacuna de EIV. De la misma manera, las fracciones EHV no resultaron en una prueba de potencia insatisfactoria en el modelo de cobayo.

La invención ha sido descrita con referencia a diferentes modalidades especificas e ilustrativas y técnicas. Sin embargo, deberá entenderse que diferentes variaciones y modificaciones pueden ser hechas mientras permanezcan dentro del espíritu de alcance de la invención. Mientras diferentes modalidades están discutidas en cierto detalle en la presente, deberá de apreciarse que la presente invención proporciona conceptos inventivos que pueden ser incorporados en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas discutidas en la presente son meramente ilustrativas de modos específicos para hacer y utilizar las presentes composiciones inmunogénicas y no deben significar limitantes del alcance de la invención. Diferentes modificaciones y combinaciones de las modalidades ilustrativas, así como otras modalidades de la invención, serán aparentes para aquellos diestros en la técnica en referencia a la descripción de la presente invención.

Tabla IV- 1 PLANTILLA DE PLACA PARA ELISA DE EHV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna Vacuna de Ref. de Ref. Prueba Prueba 1 Prueba 2 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 4 1 B Blanco Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Sin diluir Referencia Externa C Blanco 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 Referencia Externa D Blanco 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 Referencia Externa E Blanco 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 1:8 Control Negativo F 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 Control Negativo G 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 Control Negativo H

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES 1. Una vacuna para proteger un caballo contra enfermedades asociadas con EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos que comprende: virus de EHV-1 KyA químicamente inactivado; y un adyuvante que incluye un polímero de ácido carboxílico olefinicamente insaturado, reticulado.
2. 2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el virus de EHV-1 KyA es químicamente inactivado mediante el tratamiento con un agente de inactivación químico que incluye un compuesto seleccionado del grupo que consiste de etilenimina, derivados de etilenimina y mezclas de los mismos.
3. 3. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el virus de EHV-1 KyA es químicamente inactivado mediante tratamiento con etilenimina binaria.
4. 4. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende EHV-4 inactivado.
5. 5. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende virus de influenza equina inactivado.
6. 6. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el virus de influenza equina inactivado incluye virus de EIV inactivado del subtipo Al.
7. 7. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el virus de EIV inactivado del subtipo Al incluye cepa de virus de EIV Al inactivado A/EQl/Newmarket/77.
8. 8. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el virus de influenza equina inactivado incluye virus de EIV inactivado del subtipo A2.
9. 9. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el virus de EIV inactivado del subtipo A2 incluye en cepa de virus de EIV A2 inactivado Newmarket/2/93, cepa de virus de EIV A2 inactivado Kentucky/95 o una mezcla de los mismos.
10. 10. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende virus de EIV inactivado del subtipo Al y virus de EIV inactivado del subtipo A2.
11. 11. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende cepa de virus de EIV Al inactivado A/EQl/Newmarket/77, cepa de virus de EIV A2 inactivado Newmarket/2/93, y cepa de virus de EIV A2 inactivado Kentucky/95.
12. 12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la vacuna es capaz de proteger caballos contra EHV-1 y EHV-4.
13. 13. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero de ácido carboxílico olefínicamente insaturado, reticulado, incluye polímero de ácido acrílico reticulado .
14. 14. Uso de la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para la manufactura de un medicamento para inmunizar caballos contra herpesvirus equino .
15. 15. Uso de la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-11, para la manufactura de un medicamento para inmunizar caballos contra herpesvirus equino y virus de influenza equina.
16. 16. Una vacuna para proteqer un caballo contra enfermedades asociadas con EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos, que comprende: virus de EHV-1 KyA inactivado por medio del tratamiento con un agente de inactivación químico el cual incluye etilenimina, un derivado de etilenimina o una mezcla de los mismos; y un adyuvante bioadhesivo que incluye un polímero de ácido carboxílico olefínicamente insaturado, reticulado.
17. 17. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el agente de inactivación químico incluye etilenimina binaria.
18. 18. Uso de la vacuna de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, para la manufactura de un medicamento para inmunizar caballos contra herpesvirus equino .
19. 19. Una vacuna para proteger un caballo contra enfermedades asociadas con EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos, que comprende: EHV-1 inactivado; y un adyuvante que incluye un polímero de ácido acrílico reticulado que tiene una viscosidad no mayor de aproximadamente 20,000 cPs a 20 rpm como una solución acuosa al 1% en peso a pH 7.5.
20. 20. Uso de la vacuna de acuerdo con la reivindicación 19, para la manufactura de un medicamento para inmunizar caballos contra herpesvirus equino.
21. 21. Un método para proteger un caballo contra enfermedades asociadas con EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos, que comprende: administrar al caballo una vacuna que comprende virus de EHV-1 KyA químicamente inactivado y un adyuvante que incluye un polímero de ácido carboxilxco olefínicamente insaturado, reticulado.
22. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la administración de la vacuna al caballo comprende : administrar en forma parenteral la vacuna; y administrar en forma intranasal la vacuna.
23. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la administración de la vacuna al caballo comprende : administrar en forma parenteral la vacuna al menos una vez en una primera etapa; y administrar en forma intranasal la vacuna en un etapa subsecuente.
24. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la vacuna además comprende EHV-4 inactivado.
25. 25. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la vacuna además comprende virus de influenza equina inactivado.
26. 26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la vacuna comprende virus de EIV inactivado del subtipo Al y virus de EIV inactivado del subtipo A2.
27. 27. Un método para producir una vacuna de herpesvirus equino que comprende: (a) inocular células simiescas con un virus de EHV-1 KyA; (b) incubar las células simiescas inoculadas; (c) cosechar el virus de EHV-1 KyA de las células incubabas; y (d) tratar las células cosechadas con un agente de inactivación químico el cual incluye etilenimina, un derivado de etileniraina o una mezcla los mismos para formar un virus de EHV-1 KyA inactivado .
28. 28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde las células simiescas son células Vero.
29. 29. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el agente de inactivación químico incluye etilenimina binaria.
30. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 27, que además comprende adicionar un adyuvante al virus de EHV-1 KyA inactivado, en donde el adyuvante incluye un polímero de ácido acrílico xeticulado.
31. 31. Un equipo o kit que comprende en combinación, (1) un surtidor capaz de administrar una vacuna a un caballo; y (2) una composición para proteger contra enfermedades asociadas con EHV-1, EHV un 4 o una combinación de los mismos, en donde la composición comprende: virus de EHV-1 KyA químicamente inactivado; y un adyuvante que incluye un polímero de ácido carboxilxco olefínicamente insaturado, reticulado.
32. 32. El kit de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el surtidor es capaz de surtir sus contenidos como gotas; y la composición es capaz de proteger contra enfermedades asociadas con EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos, cuando se administra en forma intranasal.
33. 33. Una vacuna para proteger un caballo contra enfermedades asociadas con herpesvirus equino y virus de influenza equina, que comprende: virus de EHV-1 KyA químicamente inactivado; virus de EHV-4 inactivado; virus de EIV inactivado del subtipo Al; virus de EIV inactivado del subtipo ?2; y un adyuvante.
34. 34. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el virus de EIV inactivado del subtipo Al incluye cepa de virus de EIV Al inactivado A/EQl/Newmarket/77; y el virus de EIV inactivado del subtipo A2 incluye una cepa de virus de EIV A2 inactivado Newmarket/2/93 y cepa de virus de EIV A2 inactivado Kentucky/95.
35. 35. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el adyuvante comprende un adyuvante bioadhesivo que incluye un polímero de ácido acrilico reticulado.
36. 36. Uso de la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, para la manufactura de un medicamento para inmunizar caballos contra herpesvirus equino y virus de influenza equina.