KR100840525B1 - 말 헤르페스바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 백신이 제공된다. 당해 백신은 통상적으로 불활성화된 EHV-1(예: 화학적으로 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스) 및 애쥬번트를 포함한다. 당해 애쥬번트는 생체흡착 특성을 가질 수 있는 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체를 포함할 수 있다. 또한, 당해 백신은 기타 말 병원체에 대한 항원, 예를 들면 불활성화된 EHV-4 및 말 인플루엔자 바이러스의 불활성화된 A1 및/또는 A2주를 포함한다. 또한, EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 방법 및 말 헤르페스바이러스 백신을 제조하는 방법이 제공된다.
EHV-1, EHV-4, 말 헤르페스바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 화학적 불활성화, 생체흡착

Description

말 헤르페스바이러스 백신{Equine herpesvirus vaccine}
호흡기 질환은 말 산업의 경제적 손실의 주요 원인이다. 말 헤르페스바이러스(EHV), 말 인플루엔자 바이러스(EIV), 세균 스트렙토코코스 에퀴(Streptococcus equi)는 말의 감염성 호흡기 질환과 가장 흔히 관련이 있는 병원체이다. 전세계적으로, 말 헤르페스바이러스는 호흡기 감염의 결과로서 말의 이환율과 관련된 주요 병원체이다. 말 헤르페스바이러스 1형(EHV-1) 및 4형(EHV-4)은 둘다 호흡기 질환을 유발할 수 있다. EHV-1은 또한 유산 및 신경학적 질환과 관련이 있다. 고도의 이환율 및 말 산업의 국제적 특성 때문에, 효험있는 백신이 당해 질환을 감소시키고 이들 병원체의 전파를 통제하는데 요구된다.
수 많은 EHV 백신은 시판되고 있다. 그러나, 어떠한 것도 일반적으로 장기간 지속적으로 보호를 제공할 수 없으며, 대부분은 EHV 감염에 대하여 상당한 수준의 보호를 달성하기 위하여는 빈번한 부스터 면역화를 요구한다. 많은 경우에 1차 감염 부위가 호흡계임에도 불구하고, 가장 통상적으로 권고되는 투여 경로는 근육내 주사를 통한 투여이다. 또한, 상업용 백신의 일부는 바람직하지 않은 부작용을 일으키는 것으로 보고되었다. EHV에 대한 재조합 백신을 개발하기 위한 수 많은 시도가 보고되었다. 그러나, 이러한 시도는 광범위하게 허용되는 상업용 재조합 백신의 도입을 초래하지 못했다.
문헌은 EHV-4주에 의한 감염에 대한 교차 보호를 제공하기 위해 일관되게 EHV-1주에 기초한 백신 능력의 고도의 다양성을 보고하였다. EHV-4주에 기초한 백신은 EHV-1 및 EHV-4 둘다에 대해 어느 정도의 보호를 제공하는 경향이 보다 강하다는 것을 보여주는 한편, EHV-4에 기초한 교차 보호도 또한 다양성을 보여주는 것으로 보고되었다.
따라서, EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련이 있는 질환에 대해 말을 보호할 수 있는 또 다른 백신을 개발하고자 하는 요구가 계속되고 있다. 또한, EHV-1 및/또는 EHV-4에 대해 효과적인, 비내 및 비경구(예: 근육내, 피하내, 또는 정맥내) 투여 방법으로 투여될 수 있는 백신을 개발하는 것이 유익할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 불활성화 형의 EHV-1를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련이 있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 백신을 제공한다. 당해 백신은 불활성화된 EHV-1(예: 화학적으로 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스)를 포함하고 또한 전형적으로 애쥬번트를 포함한다. 당해 백신은 또한 다른 성분, 예를 들면 방부제(들), 안정화제(들) 및 기타 말 병원체에 대한 항원을 포함할 수 있다. 전형적으로, 기타 말 병원체에 대한 항원은 또한 불활성화된 형, 예를 들면 EHV-4의 불활성화된 형 및 말 인플루엔자 바이러스("EIV")의 불활성화된 형으로 존재한다. 예를 들면, 당해 백신은 불활성화된 EHV-1에 추가하여 말 인플루엔자 바이러스의 A1 및/또는 A2 주의 불활성화된 형을 포함하는 혼합 백신일 수 있다. EIV에 대한 적합한 항원의 예로는 불활성화된 EIV A1 바이러스 항원 A/EQ1/Newmarket/77, 불활성화된 EIV A2 바이러스주 Newmarket/2/93, 및 불활성화된 EHV A2 바이러스주 Kentucky/95 등이 있다.
용어 "백신" 및 "면역원성 조성물"은 본원에서는 넓은 의미로 정의되어, 백신을 접종한 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있는 투여가능형의 생물학적 제제의 모든 유형을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 백신(면역원성 조성물)은 통상적으로 불활성화된 형의 바이러스 제제를 포함한다. 일반적으로 백신은 바이러스 자체 또는 바이러스의 면역원성(항원성) 성분을 기초로 한다. 본원에서, 백신과 관련하여 사용되는 용어 "보호"는 당해 질환 또는 상태와 관련있는 모든 증상의 호전(부분적 또는 전체적)을 의미한다. 따라서, 본 발명의 백신에 의한 EHV로 부터의 말의 보호는 일반적으로 바이러스 방출(virus shedding) 및/또는 EHV-1 및/또는 EHV-4에 의한 감염과 관련이 있는 하나 이상의 임상 증상(예: 고열, 콧물, 결막염, 기침, 호흡곤란, 우울증 및 2차 세균 감염에 대해 요구되는 항생제 치료)을 감소시킬 것이다.
일 태양에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 불활성화된 형의 EHV-1을 포함한다. 화학적으로 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스를 포함하는 백신이 특히 바람직할 것이다. 당업자에게 공지된 각종 화학적 불활성화제를 사용하여 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 에틸렌이민 및 관련 유도체, 예를 들면 이원 에틸렌이민("BEI") 및 아세틸에틸렌이민은 EHV-1 바이러스를 불활성화시키는데 사 용하기에 적합한 화학적 불활성화제의 예이다. 다른 화학적 불활성화제, 예를 들면 베타-프로피올락톤 또는 알데하이드(예: 포름알데하이드 및 글루타르알데하이드)도 또한 당해 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 백신은, 특히 당해 바이러스가 비내 투여될 수 있도록 계획된 경우, 바람직하게는 생체흡착 특성을 가질 수 있는 애쥬번트를 포함한다. 적합한 애쥬번트의 예로는 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체, 예를 들면 가교된 아크릴산 중합체가 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "가교된 아크릴산 중합체"는, 혼합물중에 우세 단량체로서 아크릴산을 포함하는 단량체 혼합물로 부터 형성되는 중합체 및 공중합체를 의미한다. 적당한 가교된 아크릴산 중합체의 예로는 상표명 CarbopolR 934P 및 CarbopolR 971(구입원: B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio)으로 시판되는 것들이 있다. 본 발명의 백신에 사용하기에 특히 적합한 애쥬번트는 약 20,000cPs 이하의 브룩필드(Brookfield) 점도(pH 7.5에서 1.0중량%의 수용액으로서 20rpm에서 측정)를 갖는 가교된 아크릴산 중합체이다. 생체흡착성 애쥬번트가 고려되는 경우, (U.S. 4,615,697에 기술된 과정에 의해 측정된 바와 같이) 새로이 잘라낸 토끼의 위 조직의 두 개의 박편사이에서 측정된 생체흡착 특성이 약 50dyne/cm2 이상인 애쥬번트를 사용하는 것이 유익할 수 있다.
EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련이 있는 질환에 대해 말을 보호하는 방법은 불활성화된 EHV-1을 함유하는 백신을 말에게 투여하는 단계를 포함한다. 당해 백신은 비내 및/또는 비경구(예: 근육내) 투여를 포함하는 각종 방법을 사용하여 투여할 수 있다. 본 방법의 일 태양에서, 불활성화된 EHV-1 함유 백신은 먼저 1회 이상(예를 들면 2 내지 4주 간격으로) 근육내로 투여된 후, 1회 이상(백신의 최종 비경구 투여 한지 2 내지 4주 후) 비내로 당해 백신이 투여된다. 당해 백신은 바람직하게는 6월령 이상의 말에게 투여된다. 이상적으로, 주어진 무리중의 모든 말은, 당해 질환의 호흡기 증상의 전염에 대해 보호하기 위하여, 매년 예방접종한다.
말 헤르페스바이러스 백신을 제조하는 방법도 또한 제공된다. 통상적으로, 당해 방법은 EHV-1 바이러스, 예를 들면 EHV-1 KyA 바이러스로 원숭이 세포를 접종하는 단계를 포함한다. 접종된 원숭이 세포를, 일반적으로 적어도 CPE가 관찰될 때(통상적으로 36℃에서 24 내지 120 시간 후)까지 항온처리한 다음, EHV-1 바이러스를 항온처리된 세포로 부터 수거한다(예를 들면, 배양 유액을 경사분리하고 여과하는 방법에 의함). 수거된 바이러스-함유 유액을 화학적 불활성화제, 예를 들면 이원 에틸렌이민으로 처리하여, 불활성화된 EHV-1 바이러스를 생성시킨다. 통상적으로, 불활성화된 바이러스는 추가로, 예를 들면 농축 및 다른 성분과의 혼합에 의해 처리하여 시판 제형을 제조한다. 예를 들면, 불활성화된 바이러스를 함유하는 유액을 농축시키고 애쥬번트 및/또는 하나 이상의 다른 말 병원체에 대한 항원(들)과 혼합한다.
또한, 본 출원은, (1) 말에게 백신을 투여할 수 있는 디스펜서; 및 (2) 화학적으로 불활성화된 EHV-1을 함유하는, EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련이 있는 질환에 대해 보호할 수 있는 백신을 함께 포함하는 키트에 관한 것이다. 당해 키트는, 디스펜서, 즉 이의 내용물을 소적, 예를 들면 에어로졸, 분무된 스프레이 및/또는 액 적으로서 분배할 수 있는 디스펜서, 및 적어도 부분적으로 비내 투여되는 경우 EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련이 있는 질환에 대해 보호할 수 있는 백신 형을 포함할 수 있다.
본 출원에 있어서, 본 명세서는 본 조성물 및/또는 관련 방법의 다양한 태양을 언급한다. 기술된 각종 태양은 다양한 예시를 제공하기 위한 것이고, 택일적 대상의 기술로서 간주되어서는 아니된다. 차라리, 본원에 기술된 각종 태양의 기술은 범위가 중복될 수 있음에 주목해야한다. 본원에 기술된 태양은 단지 예시적인 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 면역원성 조성물은 불활성화된 형의 EHV-1을 포함한다. 당해 백신은 EHV-1 및/또는 EHV-4와 관련이 있는 질환에 대해 말을 보호하기 위해 고안된 것이다. 통상적으로, 당해 백신은 화학적으로 불활성화된 형의 EHV-1을 포함하고, 화학적으로 불활성화된 형의 EHV-1 KyA 바이러스를 포함한 것들이 특히 바람직하다. 당업자에게 공지된 각종 화학적 불활성화제를 사용하여 당해 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 에틸렌이민 및 관련 유도체, 예를 들면 이원 에틸렌이민("BEI") 및 아세틸에틸렌이민은 EHV-1 바이러스를 불활성화시키는데 사용하기에 적합한 화학적 불활성화제이다. 기타 화학적 불활성화제, 예를 들면 베타-프로피올락톤, 알데하이드(예: 포름알데하이드) 및/또는 세제(예: TweenR 세제, TritonRX, 또는 알킬 트리메틸암모늄 염)를 사용하여 당해 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 불활성화는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 샘플을 주기적 간격으로 취하여 잔존하는 생존 바이러스에 대해 검정한다. 적당한 세포주에 미치는 세포병변 효과의 모니터링 및/또는 적당한 특이적 모노클로날 항체를 사용한 형광 염색을 사용하여, 잔존하는 생존 바이러스의 존재를 검출할 수 있다.
BEI를 사용한 불활성화는, BEI 원액(예: 0.1 내지 0.2M의 2-브로모-에틸아민 하이드로브로마이드를 0.1 내지 0.2N NaOH 수용액에 첨가함으로써 형성된 용액)을 약 1 내지 2mM BEI의 최종 농도로 바이러스 유액과 배합함으로써 달성될 수 있다. 불활성화는 통상적으로 BEI-바이러스 혼합물을 36 내지 72 시간 동안 일정하게 혼합하면서 35 내지 40℃(예: 37℃)에서 유지하는 방법으로 수행된다. 바이러스 불활성화는, 나트륨 티오설페이트 용액을 과도한 BEI 농도의 최종 농도로 첨가(예를 들면, 1 내지 2mM BEI 용액과 함께 2 내지 3mM 나트륨 티오설페이트)한 후, 수 시간 동안 혼합함으로써 정지될 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 면역원성 조성물은 애쥬번트, 및 경우에 따라, 불활성화된 EHV-1과 혼입된 하나 이상의 유화제, 예를 들면 TweenR 세제를 포함한다. 적합한 애쥬번트의 예로는 비타민 E 아세테이트 솔루빌리세이트, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, (무기) 오일 유제, 비-이온성 세제, 스쿠알렌 및 사포닌 등이 있다. 사용될 수 있는 기타 애쥬번트로는 오일계 애쥬번트, 예를 들면 프로인트(Freund) 완전 애쥬번트(FCA), 및 프로인트 불완전 애쥬번트(FIA) 등이 있다. 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체, 예를 들면 CarbopolR 971 중합체가, 본 발명의 불활성화된 EHV-1 면역원성 조성물에 사용하기에 특히 적합한 애쥬번트이다.
상기와 같은 애쥬번트의 일례는, 올레핀계 불포화 카복실산 단량체(예: 아크릴산 및/또는 메타크릴산) 및 가교제를 포함하는 단량체 혼합물의 반응에 의해 생성되는 올레핀계 불포화 카복실산 중합체이다. 통상적으로, 단량체 혼합물의 약 90중량% 이상은 올레핀계 카복실산 단량체이다. 생성된 중합체 생성물은 합당하게는 약 0.5중량% 이하, 바람직하게는 약 0.2중량% 이하의 미반응 올레핀계 불포화 카복실산 단량체를 함유한다. 중합 반응은, 지방족 케톤, 알킬 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함하는 용매의 존재하에서 단량체 혼합물의 반응에 의해 수행할 수 있다. 적합한 지방족 케톤은 탄소수가 3 내지 6인 것들, 예를 들면 아세톤 및 사이클로헥산(본원에서 사용된 용어 "지방족 케톤"은 환지방족 케톤을 포함한다)을 포함한다. 적합한 알킬 에스테르의 예로는 탄소수가 3 내지 6인 것들, 예를 들면 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 이소프로필 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 또는 이의 혼합물 등이 있다.
적합한 올레핀계 불포화 카복실산 중합체 애쥬번트는 바람직하게는 약 40, 000cPs 이하의 브룩필드 점도를 갖는다(pH 7.5에서 0.5중량% 수용액으로서 20rpm에서 측정). 특히 적합한 예로는 약 15,000cPs 이하의 점도, 보다 바람직하게는 약 4,000 내지 11,000cPs의 점도(pH 7.5에서 0.5중량% 수용액으로서 20rpm에서 측정)를 갖는 올레핀계 불포화 카복실산 중합체가 있다.
적합한 애쥬번트의 일례로는 아크릴산 및 가교제를 포함하는 단량체 혼합물로 부터 생성된 가교된 아크릴산 중합체가 있다. 가교제는 폴리알케닐 폴리에테르 가교제, 예를 들면 디비닐 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 디비닐 알코올의 예로는 알릴 수크로스, 알릴 펜타에리트리톨, 분자량이 1000 이하인 폴리알킬렌 디올 디알릴 에테르, 트리메틸롤프로판 디알릴 에테르, 및 이의 혼합물이 있다. 기타 유용한 가교제의 예로는 디비닐벤젠, N,N-디알릴아크릴아미드, 3,4-디하이드록시-1,5-헥사디엔, 2,5-디메틸-1,5-핵사디엔 등이 있다.
백신이 비내 투여되는 경우, 점막에 대해 생체흡착성이 있는 애쥬번트를 사용하는 것이 유익할 수 있다. 생체흡착성 중합체는 일반적으로 눈, 코, 입, 위장관, 질강 및 직장관의 점막에 흡착할 수 있는 성질을 지닌다. 생체흡착제는 살아있거나 최근에 사멸한 생물학적 표면, 예를 들면 점막 또는 피부 조직에 흡착하는 물질로서 폭넓게 정의된다. 본원에서 유용한 생체흡착제를 정의하기 위하여 사용되는 생체흡착은, 흡착제에 의해 서로 흡착되는 최근에 잘라낸 토끼 위 조직의 두 개 층을 분리하는데 요구되는 힘을 측정하는 방법에 의해 검정된다. 이러한 방법을 사용하여, 생체흡착제는, 본원에 참조로서 인용된 U.S. 4,615,697에 기술된 방법에 따라 토끼 위 조직의 최근 잘라낸 두 개의 흡착되는 박편을 분리하는데 약 50dyne/cm2 이상의 힘을 요구하는 물질로서 정의될 수 있다. 최근 잘라낸 토끼 조직을 분리하는데 요구되는 힘의 상한치는 정확하게 알려지지 않았으나, 약 2000dyne/cm2 이상인 것으로 여겨진다.
애쥬번트의 적합한 예로는 생체흡착 성질을 지닌 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체[예: 가교된 아크릴산 중합체인 CarbopolR 971 중합체; 구입원: B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio]가 있다. 일반적으로, 이러한 유형의 폴리아크릴산은 특정량의 카복실 관능성 및 가교제를 함유하는 가교된 카복시-관능성 중합체이다. 이러한 중합체는 최근 잘라낸 토끼 위 조직의 두 개의 박편 사이의 50dyne/cm2 이상의 흡착(U.S. 4,615,697에 기술된 방식으로 측정하는 경우)을 나타내는 생체흡착제일 수 있다.
본 발명의 조성물을, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여, 투여량 단위형으로 제형하는 것이 일반적으로 유익할 것이다. 본원에서 사용된 투여량 단위형은 치료될 포유동물 대상에 대한 단일 투여량으로서 조정된 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 요구된 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 나타내기 위하여 계산된 활성 물질의 예정된 양을 함유한다. 불활성화된 EHV-1( 및 불활성화된 EHV-4 및/또는 불활성화된 EIV)의 투여량 단위형에 대한 세부 사항은 기타 요인 중에서 (a) 활성 물질 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과의 특유적 특징; (b) 질환의 치료를 위한 이러한 활성 물질을 배합하는데 있어서의 기술상의 제한; 및 (c) 투여량 단위형의 의도된 투여 방식에 의해 결정되거나 의존한다.
통상적으로 주요 활성 성분은, 본원에 기술된 바와 같이 투여량 단위형속에 약제학적으로 허용되는 적합한 담체와 함께 편리하고 효과적인 투여를 위한 유효량으로 배합된다. 단위 투여형은, 예를 들면 1 내지 약 5의 상대적 효능 단위("RPU")범위에 해당하는 양의 EHV-1 항원을 함유할 수 있다. 당해 항원의 이러한 양은 일반적으로 약 1 내지 약 25ml의 담체속에 존재한다. 보충적 활성 성분(예: 불활성화된 EIV 및/또는 불활성화된 EHV-4)을 함유하는 조성물의 경우에, 투여량은 보충적 활성 성분의 통상적 투여량 및 투여 방식을 참조하여 결정한다.
본 발명의 백신은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 불활성화된 EHV-1을 포함한다. 주사용으로 적합한 약제학적 형은 통상적으로 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균성 주사용 용액 또는 분산액의 임시 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 당해 제형은 바람직하게는 멸균성이어야 하고, 주사사용이 용이하도록 유동성이어야 한다. 당해 투여형은 제조 및 보관 조건하에서 안정해야하며, 통상적으로 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 당해 담체는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이의 혼합물 및 식물성 기름을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 한가지 가능한 담체는 생리학적염 용액이다. 당해 용액의 적당한 유동성은, 예를 들면 레시틴과 같은 피복재의 사용, 분산의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살(나트륨 에틸머큐리-티오살리실레이트), 데오마이신, 겐타마이신 등에 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 등장성제, 예를 들면 당류 또는 염화나트륨를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 경우에 따라, 주사용 조성물의 연장된 흡착은 흡착 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물중에 사용함으로써 달성될 수 있다.
멸균성 주사용 용액은, 적당한 용매중에 원하는 양의 불활성화된 바이러스를, 필요한 경우, 위에서 열거된 다양한 기타 성분과 함께 혼입한 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 기본 분산 매질 및 위에서 열거된 것중 요구된 기타 성분을 함유하는 멸균성 비히클중에 각종 활성 성분을 혼입합으로써 제조될 수 있다. 멸균성 주사용 용액의 제조용 멸균성 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은, 상기 멸균-여과된 용액으로 부터 활성 성분의 분말 + 추가로 요구되는 임의의 성분을 추출하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.
또한, 불활성화된 바이러스의 안정성을 향상시키기 위하여, 본 발명의 조성물에 안정화제를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 적당한 안정화제의 예로는 글리세롤/EDTA, 탄수화물(예: 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 수크로스, 덱스트란 또는 글루코스), 단백질(예: 알부민 또는 카제인) 및 단백질 분해 산물(예: 부분적으로 가수분해된 젤라틴) 등이 있다. 경우에 따라, 당해 제형은 알칼리 금속 포스페이트, 예를 들면 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소칼륨 및/또는 인산이수소칼륨과 같은 시약을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 완충시킬 수 있다. 기타 용매, 예를 들면 에탄올 또는 프로필렌 글리콜을 사용하여, 백신 제형내 성분의 가용성 및/또는 용액의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 제형에 사용될 수 있는 첨가제는 통상의 산화방지제 및 통상의 킬레이트화제, 예를 들면 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)를 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 후술되는 실시예에 의해 예시될 수 있으며, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하고 본 발명을 제조하고 사용하는 방법을 당업자에게 교시하는데 도움을 주고자 제공된 것이다. 이들 실시예는 어떤식으로든 본 발명의 범위를 협소하게 하거나 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
불활성화된 EHV-1주를 함유하는 유액의 제조
말 비폐렴 백신, 사멸된 바이러스를 제조하기 위하여, 먼저 EHV-1의 마스터 시드(master seed) 배양물을 제조하였다. 이러한 마스터 시드로 부터, EHV-1의 배양물을 증식시킨 후 불활성화시켰다. 이어서, 불활성화된 바이러스 배양물을 애쥬번트와 혼합하여 말 비폐렴 백신을 제조하였다. 아래의 방법은 말 비폐렴 백신을 제조하는데 사용되었다.
EHV-1 마스터 시드 바이러스 배양물("EHV-1-MSV")을 제조하기 위하여, 말 헤르페스바이러스 1형 KyA주(EHV-1 KyA)를 Vero A139 세포에서 4회 계대배양하고 EVero 세포에서 4회 계대배양하였다. 4번째 계대배양물을 EHV-1 KyA, MSV Lot 001-dil로 명명된 마스터 시드 바이러스로서 사용하였다.
상기 마스터 시드 바이러스로 부터, EHV-1의 배양물을, 0 내지 5% 혈청을 함유하는 최소 필수 배지("MEM")에서 EVero 세포를 EHV-1 MSV로 감염시켜 제조하였다. 세균 성장을 억제하기에 충분한 양의 겐타마이신을 당해 배양 배지에 첨가하였다. 통상적으로, EVero 세포를 EHV-1 MSV를 사용하여 0.001의 표적 감염중복도("MOI")로 감염시켰다. 이러한 배양물을 유리 롤러(roller) 병속에서 또는 미세담체 비이드상에서 성장시킬 수 있다. 당해 배양물을, 세포병변 효과("CPE")가 관찰될 때까지, 36℃±2℃에서 24 내지 120 시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 동안에, 당해 배양물을 EHV-유도된 CPE에 대해 모니터하여, 순수한 EHV주를 확인하였다. 비전형적인 CPE가 관찰되거나 육안 또는 현미경하에 오염 증거가 보이는 경우, 당해 배양물을 폐기하였다. 순수한 바이러스 배양물을 무균처리하에 멸균 유리 카보이, 멸균 플라스틱 카보이, 또는 멸균 스테인레스강 탱크속에 수거하고, 8마이크론 이상의 필터를 통해 여과하여 정화하였다. 불활성화 전에 , 벌크 바이러스 수거 유액을 시험하여 미코플라스마의 부존재를 확인하였다. 즉시 불활성되지 않은 수거된 유액을 -40℃ 이하에서 보관하였다.
수거 후, 당해 바이러스 배양물을 불활성화하여, 사멸된 백신을 제조하였다. 바이러스를 불활성화시키기 위하여, 배양 온도를 36℃±2℃로 설정하였다. 다음, 0.2M 용액의 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드를 0.15M NaOH중에서 이원 에틸렌이민("BEI")로 폐환시키고, 당해 배양물에 첨가하여 2mM BEI의 최종 농도를 수득하였다. 수득된 혼합물을 36℃±2℃에서 48시간 동안 계속하여 교반하였다.
BEI로 처리한 후, 당해 배양물을 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 EHV의 전형적인 CPE를 유도할 수 있는 능력에 대해 시험하여, 당해 바이러스의 불활성화를 확인하였다. 이러한 작업은, BEI-처리된 바이러스 유액을 EVero 세포에 통과시 키고 모든 바이러스 감염에 대해 EVero 세포를 검사함으로써 달성된다. 불활성화 검정이 완료될 때 까지, BEI-처리된 배양 유액을 통상적으로 2 내지 7℃ 이하에서 보관하였다. 바이러스 감염을 나타내지 않는 만족스러운 불활성화 시험 후, 6mM의 최종 농도를 수득하기에 충분한 양의 1.0M 나트륨 티오설페이트 냉(4℃±2℃) 용액을 첨가하여, 과잉 BEI를 중화시켰다.
불활성화 및 EHV-1 배양물의 시험 후, 불활성화된 배양물을, 필요한 경우, 한외여과로 농축하여, 본원의 실시예 6에 기술된 EHV 역가 방출(potency release) 검정에 의해 측정한 경우, 1.0 이상의 EHV-1에 대한 상대적 역가("RP")를 지닌 백신으로서의 제형을 가능케하는 농도를 수득하였다.
불활성화된 바이러스를, 불활성화된 EHV-1 배양물을 염수 및 애쥬번트 CarbopolR 971의 0.5% 원액과 철저히 혼합하여 벌크 시리얼(bulk serial)을 제조함으로써 애쥬번트화 보강된 백신으로서 제형화되었다. 전형적인 60L 시리얼은, 3.5 내지 4.0L 불활성화된 EHV-1 배양 유액, 12L CarbopolR 971 원액 및 44 내지 44.5L 염수를 혼합함으로써 제조되었다. 당해 벌크 시리얼을, 1 내지 10회 투여량(@ 2.2ml/용량)을 함유하는 바이알로 옮겨질 때까지 2 내지 8℃에서 유지하였다. 불활성화된 백신의 각 투여량은 1.0RP 값 이상의 불활성화된 EHV-1, 2mg CarbopolR 971 및 잔여량의 겐타마이신을 함유하였다.
실시예 2
불활성화된 말 인플루엔자 바이러스를 함유하는 유액의 제조
말 인플루엔자 바이러스- A/EQ1/Newmarket/77, 아유형 A1
말 인플루엔자의 MSV Rec ER1K 아유형 A1을 제조원(Wellcome Foundation Ltd., Beckenham, Kent, U.K)에서 개발하였다. 본래의 말 주를 단독으로 또는 A/Puerto Rico/8/34 바이러스와 함께 특이적 병원체 부존재(SPF) 부화란에서 10회 계대배양하였다. 재편된 ER1K를 Vero 조직 배양물에서 추가로 7회 계대배양하여 A/E/Newmarket/77(Equi)(H7N7) Rec ER1K로 명명된 MSV 바이러스를 수득하였다. 당해 바이러스를 본 출원인(Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.)(BIVI)은 공급원(Coopers Animal Health, Inc., Est. Lic. No. 107)로 부터 구입하였다. 당해 바이러스를 EVero 세포주[상기 회사(Coopers Animal Health)로 부터 구입된 Vero 세포는 BIVI에서 EVero로 명명되었다]에서 1회 계대배양하여 새로운 마스터 시드 바이러스를 확립하였다. 당해 마스터 시드 바이러스는 Lot 111795로서 명명되었다.
말 인플루엔자 바이러스- Newmarket/2/93, 아유형 A2
말 인플루엔자의 Newmarket/2/93 아유형 A2를 뭄포드 제이 에이 박사(Dr. J. A. Mummford)[Animal Health Trust(P.O. Box 5 Newmarket, Suffolk CB8 8JH, England)에 근무]로 부터 구입하였다. 당해 바이러스를 비염에 걸린 말로 부터 분리하였다. 당해 바이러스를 특이적 병원체 부존재(SPF) 부화란에서 5회 계대배양한 다음, Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포주에서 5회 계대배양하였다. MDCK 세포에서의 5번째 계대배양물을 MSV로서 명명하였다. 당해 MSV는 EIV NM/2/93, MSV Lot 001-dil로서 명명되었다.
말 인플루엔자- Kentucky/95, 아유형 A2
말 인플루엔자의 Kentucky/95 아유형을 공급원[Gluck Equine Research Center, Lexington, KY]로 부터 구입하였다. 당해 바이러스를 비염에 걸린 말로 부터 분리하였다. 당해 바이러스를 특이적 병원체 부존재(SPF) 부화 계란에서 2회 계대배양하였다. 이어서, 당해 바이러스를 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포주에서 3회 계대배양하고 EVero 세포에서 3회 계대배양하였다. EVero 세포에서의 3번째 계대배양물을 MSV로서 명명하였다. 당해 MSV는 EIV K95, MSV Lot 001-dil로서 명명되었다.
아래의 방법을 사용하여, 3종의 말 인플루엔자 성분을 각각, 유사한 방법으로 제조하였다. Newmarket/77 바이러스의 각 생산분을, EVero 세포에서 EIV에 의해 유도된 특징적 세포병변 효과(CPE)를 관찰하여 말 인플루엔자 바이러스(EIV)로서 확인하였다. Newmarket/2/93 및 Kentuck/95 바이러스의 각 생산분을, MDCK 세포에서 EIV에 의해 유도된 특징적 CPE를 관찰하여 EIV로서 확인하였다. Newmarket/77 및 Kentucky/95는 원숭이 신장 세포 배양물에서 세포파괴적이고 단층 배양물중에 전형적인 EIV CPE를 나타내었다. Newmarket/2/93는 MDCK 세포 배양물에서 세포파괴적이고 단층 배양물중에 전형적인 EIV CPE를 나타내었다. 말에서의 바이러스 독성은 어떠한 바이러스에서도 평가되지 않았다. 당해 마스터 시드 바이러스를 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28 및 113.55에 따라 순도에 대해 시험하였다. Newmarket/77 마스터 시드 바이러스는 돼지 폐포 질환(Swine Vesicular Disease), 아카반(Akabane), 소 일시 열, 청색설(Bluetongue), 및 강독형 내장기관 뉴캐슬 병(Velogenic Viscerotrophic Newcastle disease)에 대한 것이다. 벌크 바이러스 수거 유액을 불활성화 전에 9 C.F.R. 113.28에 따라 미코플라스마에 대해 시험하였다. 당해 마스터 시드 바이러스를 아래의 방법을 사용하여 면역원성에 대하여 시험하였다.
각 시리얼로 부터의 완성된 생성물의 벌크 또는 최종 용기 샘플을, 기니아 피그 역가 시험에 의해 역가에 대해 시험하였다. 중량이 300 내지 500g인 10 마리 이상의 기니아 피그 각각에 근육내 주사하였다. 각 기니아 피그 투여량은 말용 백신의 단위 투여량으로 권고된 투여량의 절반이다. 제2 투여량을 제1 투여한지 14 내지 21일 후에 주사하였다. 동일한 공급원으로 부터 두 마리의 또 다른 기니아 피그를 대조군으로서 확보하였다. 제2 주사한지 14 내지 21일 후, 각 백신접종 기니아 피그 및 대조군 기니아 피그로 부터의 혈청 샘플을 혈구응집 억제(HAI)에 의해 Newmarket/77, Newmarket/2/93 및 Kentucky/95 항체에 대해 시험하였다. 백신중의 EIV 분획의 역가를 프로토콜[National Veterinary Services Laboratories Testing Protocol, Supplemental Assay Method for Conducting the Hemagglutination Inhibition Assay for Equine Influenza Antibody (MVSAM0124.01, 1998. 10. 2)]를 사용하여 측정하였다.
시험하에서 대조군이 EIV 분획에 대해 1:10에서 혈청음성을 유지하지 않는 경우, 당해 시험을 무시하고, 반복하였다. 유효 시험하에서 10마리의 백신접종동물중 8마리가 Newmarket/77 분획에 대해 80 이상의 HAI 항체 역가를 나타내지 않고 Newmarket/2/93 및 Kentucky/95 분획에 대해 40 이상의 역가를 나타내지 않는 경우, 당해 샘플은 불만족스러운 것으로 간주된다. 불활성화된 EIV를 함유하는 백신은 바람직하게는 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 Al의 단위 투여량 당 약 64 HAU 이상 및/또는 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A2의 단위 투여량 당 약 256 HAU 이상을 포함하도록 제형화된다.
마스터 시드 바이러스로 부터의 제1 계대배양물 내지 제4 계대배양물을 작업 및 생산 시드로 이용하였다. 백신은 마스터 시드 바이러스로 부터의 제1 계대배양물 내지 제4 계대배양물로 부터 제조되었다. 말 인플루엔자, Newmarket/77 주, 아유형 Al, 및 말 인플루엔자, Kentucky/95 주, 아유형 A2를 EVero 세포주 배양물에서 증식시켰다.
Newmarket/2/93을 증식하는데 사용된 MDCK 세포주를 계대배양물 71 내지 91 사이에 한정하였다. 계대배양물 71을 동결하고 마스터 세포 스톡(Master Cell Stock)으로서 명명하였다. MDCK 세포 배양물을 5 내지 10% 태아 소 혈청을 함유하는 MEM에서 증식시켰다. Newmarket/2/93의 시드 및 생산 배양물을 mL당 트립신 10단위가 보충된 MEM에서 증식시켰다. 세포 배양물을 1, 3, 10, 30, 50, 또는 140 리터 세포 배양 용기내의 미세담체 비이드, 9 L 유리 롤러 병, 또는 플라스틱 롤러 병에서 성장시킨다. 마스터 및 작업 시드 바이러스를 -60℃ 이하에서 보관하였다.
MDCK 세포 배양물을 멸균 유리 또는 플라스틱 용기에서 성장시켰다. 당해 배양물을 40 내지 100mL의 배지를 함유하는 75cm2 또는 150cm2 플라스틱 플라스크에서 성장시켰다. 증대 배양물을 100 내지 1000ml 배지에서 롤러 병 배양으로 성장시킨 다음, 또한 롤러 병 배양으로 계대배양하였다. 우선 액체 질소 저장소에서 나온 경우 세포주의 부착 및 성장을 고려하여, 75cm2 또는 150cm2 표면 부착 면적이 선택되었다. 액체 질소 저장의 스트레스 때문에, 어떤 경우에는 더 작은 표면적에서 세포 성장을 개시하는 것이 유익하고, 성장이 달성된 경우 세포를 150cm2 T-플라스크속에 계대한다.
바이러스로 접종하기 전에, 세포 성장 배지를 배양 용기로 부터 경사분리하였다. 혈청이 부존재하는 최소 필수 배지(MEM)를 배양 용기에 첨가하고 당해 세포를 30 내지 45분간 세정하였다. 세정 배지의 양은 사용된 배양 용기에 의존적이다. 세정 배지를 경사분리하고, MEM 1ml당 정제된 트립신 10단위를 함유하는 혈청 부존재 MEM을 첨가하고, 이에 시드 바이러스를 첨가하여, 상기 배양 용기를 접종하였다. 세포 배양물을, Newmarket/77, Newmarket/2/93 및 Kentucky/95 주에 대해 0.001의 표적 감염중복도(MOI)로 감염시켰다.
당해 세포 배양물을, 유액이 수거될 때까지, 36℃±2℃에서 유지하였다. 접종 후, 단층을 EIV-유도된 특징적인 세포 형태 변화에 대해 관찰하였다. CPE는 단층 표면으로 부터 분리된 환형 및 굴절형 세포를 포함한다. 통상적으로 CPE는 접종 후 24 내지 96 시간 동안 명백하다. 당해 배양물을 항온처리 기간 동안 계속하여 육안 및/또는 현미경하에 오염 또는 비전형적인 세포 형태 변화의 증거에 대해 검사하였다. 미생물 오염 또는 비특이적 세포병변의 증거를 나타내는 모든 배양물을 폐기하였다.
수거 전에, 각 배양물을 육안 및 현미경으로 검사하였다. 오염 또는 비전형적 CPE의 증거를 나타내는 모든 배양물을 폐기하였다. 배양 용기(들)로 부터의 유액을 접종한지 1 내지 4일 후 수거하였다. 배양 용기내의 바이러스 배양 유액을 무균하에 멸균 유리 또는 플라스틱 카보이 또는 멸균 스테인레스강 텡크 속에 수거하기전에 8 마이크론 이상의 필터를 통해 여과하여 정화하였다. 모아진 유액을 즉시 불활성화하거나 또는 나중에 불활성화하기 위하여 -40℃ 이하에서 보관하였다. 불활성화 후, 샘플을 멸균 및 항원 시험을 위해 수집하였다.
배양 유액의 양을 측정하고 유액의 온도를 36℃±2℃로 조정하였다. 0.15M NaOH중에서 이원 에틸렌이민(BEI)으로 폐환되는 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드 0.2M 용액을 배양 유액에 첨가하여, 2mM의 최종 BEI 농도를 수득하였다. 불활성화된 바이러스 유액을, 불활성화 시험이 완료될 때까지 4 내지 8℃에서 보관하거나 ≤-40℃에서 동결 보관하였다.
Newmarket/77 및 Kentucky/95의 각 해당분을 Vero A139 세포에서의 계대하여 불활성화에 대해 시험하였다. Newmarket/2/93의 각 해당분을 MDCK 세포에서의 계대배양에 의해 불활성화에 대해 시험하였다. 적당한 세포 배양 단층(150ml)을 1.0ml의 불활성화된 EIV 유액으로 접종하고 2회 이상의 계대배양으로 14일 동안 36℃±2℃에서 유지하였다. 유지 기간의 말엽에, 세포 단층을 EIV의 전형적 CPE에 대해 검사하였다. 양성 바이러스 대조군의 경우에, EVero 세포의 배양 플라스크를 각각 참조용 Newmarket/77 및 Kentucky/95 바이러스로 각각 접종하고, MDCK 세포의 하나의 배양물을 참조용 Newmarket/2/93 바이러스로 접종하였다(각각 0.01의 표적 MOI로 접종). EVero 세포의 하나의 플라스크 및 MDCK 세포의 하나의 플라스크는 음성 대조군으로서 접종하지 않은 상태로 남겨둔다. 항온처리 및 계대 후, BEI-처리된 바이러스 유액중의 바이러스-감염된 세포는 불활성화에 대한 만족스러운 시험을 제공한다. 참조용 바이러스로 접종한 대조군 세포는 EIV의 전형적인 CPE를 나타내고, 접종하지 않은 플라스크는 EIV CPE의 증거를 나타내지 않았다.
만족스러운 불활성화 시험 후, 1.0M 나트륨 티오설페이트의 냉(4℃±2℃) 용액을 첨가하여 잔존 BEI를 중화시켜, 6mM의 최종 농도를 수득하였다. 불활성화된 유액을 최종 생성물의 벌킹 때까지 4℃±2℃ 이하에서 보관하였다. 불활성화 시험이 불만족스러운 경우, 당해 유액을 상기 방법을 사용하여 BEI로 재처리하고 불활성화에 대해 재시험할 수 있다.
필요한 경우, 불활성화 벌크 바이러스 유액의 각 해당분을 한외여과에 의해 2X 내지 50X로 농축하여 목적하는 농도를 수득하였다. 불활성화된 벌크 바이러스 유액의 하나 이상의 벌크 해당분을 농축을 위해 통상적으로 수집하였다. 농축된 벌크 바이러스를 벌킹때 까지 4 내지 8℃에서 유지하였다.
불활성화 및 농축 후 수득된 생성물은, 바이러스 수거 유액의 제조에 사용되는 배지로 부터의 잔여 양의 겐타마이신을 함유하였다. 이들 수준은 제품의 투여량당 허용되는 수준을 넘지 않았다. 당해 백신을, 백신의 투여량당 2mg의 CarbopolR 971을 함유하도록 제형화하였다.
벌킹을 위한 성분을 무균하에 사이펀 또는 양의 압력(멸균-여과된 질소)을 이용하여 유리, 플라스틱 또는 스테인레스강 용기에 첨가하였다. 당해 시리얼을 철저히 혼합한 다음, 최종 용기에 충전시킬 때까지 2 내지 8℃에서 유지하였다. 다음은 예시적인 불활성화된 EIV 백신 조성물을 제공한다:
Newmarket/77 3,000 ml
Newmarket/2/93 6,000 ml
Kentucky/95 6,000 ml
CarrbopolR 971(0.5% 원액) 12,000 ml
염수 33,000 ml
경우에 따라, 염수 또는 이의 부분을, 불활성화된 EHV-1 및 임의로 불활성화된 EHV-4를 함유하는 용액으로 대체하여, EHV/EIV 혼합 백신을 제조할 수 있다.
벌킹 후, 당해 시리얼을 멸균 플라스틱 또는 스테인레스강 용기속에 넣고 최종 용기에 충전시키기 위해 멸균 충전 영역으로 옮기거나, 또는 당해 벌크 시리얼을 샘플링하여 멸균 플라스틱 카보이속에 넣었다. 당해 시리얼을 카보이에 넣는 경우, 이를 4 내지 8℃에서 보관하였다. 벌크 백신을 2 이상의 카보이에 일시에 충전시켜야 하는 경우, 충전이 요구되는 때에 당해 생성물을 수집하여 멸균 스테인레스강 용기속에 넣었다. 백신의 각 투여분을, 충분히 불활성화된 바이러스 수거 유액을 함유하여 적어도 64 혈구응집 단위(HAU)의 Newmarket/77, 128 HAU의 Newmarket/2/93, 및 128 HAU의 Kentucky/95가 제공되도록 제형화하였다.
실시예 3
바이러스의 불활성화를 모니터하는 방법
EHV-1, EHV-4, EIV Newmarket/77, 및 EIV Kentucky/95의 각 해당분을 EVero 세포에서 계대하여 불활성화에 대해 시험하였다. EIV Newmarket/2/93의 각 해당분을 MDCK 세포에서 계대하여 불활성화에 대해 시험하였다. EVero 세포 배양 단층의 150cm2을 1.0ml의 불활성화된 EHV 또는 EIV 유액으로 접종하여, 2회 이상 계대하여 14일간 36℃±2℃에서 유지하였다. 유지 기간의 말엽에, 세포 단층을 EHV 또는 EIV의 전형적인 CPE에 대해 검사하였다. EHV 대조군의 경우, EVero 세포의 배양 플라스크를 참조용 EHV-1 또는 EHV-4 (양성 대조군)으로 접종하여 0.001의 표적 감염중복도(MOI)를 수득하였다. EIV 대조군의 경우, EVero 세포의 배양 플라스크를 참조용 EIV Newmarket/77 또는 EIV Kentucky/95 바이러스 (양성 대조군)으로 접종하여 0.01의 표적 MOI를 수득하였다. EIV Newmarket/2/93 시험의 경우, MDCK 세포의 배양 플라스크를 참조용 EIV Newmarket/2/93으로 접종하여 0.01의 표적 MOI를 수득하였다. 음성 대조군으로서, EVero 세포 또는 MDCK 세포를 접종하지 않은 플라스크를 시험 배양과 동일한 조건하에 항온처리하였다. 항온처리 및 계대 후, BEI-처리된 바이러스 유액에서 바이러스-감염된 세포가 부존재하는 것은 만족스러운 불활성화 시험을 제공한다. 참조용 바이러스로 접종한 대조군 세포는 EHV 또는 EIV의 전형적인 CPE를 나타내었다. 접종하지 않은 플라스크는 EHV 또는 EIV CPE의 증거를 나타내지 않았다. 만족스러운 불활성화 시험 후, 냉 나트륨 티오설페이트를 첨가하여 잔존 BEI를 중화시키고, 불활성화된 유액을 최종 생성물의 벌크 혼합 전에 4℃±2℃ 이하에서 보관하였다.
실시예 4
EHV 역가 방출 검정
EHV-1 mAb 또는 EHV-4 mAb를 사용한 96-웰 플레이트의 피복
EHV-1 분획의 역가를 시험하는데 사용된 96-웰 플레이트를 EHV-1 모노클로날 항체로 피복하였다. EHV-4 함유 샘플의 역가를 측정하는데 사용된 96-웰 플레이트를 EHV-4 모노클로날 항체로 피복하였다. EHV-1 모노클로날 항체("EHV-1 mAb"), 16H9, IgG 분획을 피복 완충액으로 1:10,000로 희석하였다. EHV-4 모노클로날 항체 ("EHV-4 mAb"), 20F3, IgG 분획을 피복 완충액으로 1:10,000으로 희석하였다. mAb의 분액(100㎕)을 칼럼 1의 웰을 제외하고는 NUNC MAXISORP 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 당해 플레이트를 플레이트 밀봉 덮개로 밀봉하였다. 이어서, 다중웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 및 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
시험 샘플중의 EHV-1 또는 EHV-4의 정량화
시험 샘플중의 EHV-1 또는 EHV-4 항원을, 각각의 mAb로 피복된 미세역가 플레이트를 사용하여 정량화하였다. ELISA에서 시험하기 전에, 원뿔형 소형원심분리기 튜브(micorfuge tube)에서 시험 샘플(예: 애쥬번트-보강된 벌크 백신 또는 최종 용기 백신)의 1mL 분액을 최소 18시간 동안 -40℃ 이하에서 동결하였다. 1일째에 ELISA를 수행하였고, 소형원심분리기 튜브내의 시험 백신의 동결된 샘플(들) 및 참조 백신의 동결된 바이알을 37℃ 수욕에서 신속히 해동시키고 와동시켜 침전된 물질을 재현탁시켰다. TRITONR X-100의 분액 2.5㎕를 참조 백신의 소형원심분리기 튜브 및 시험 백신의 소형원심분리기 튜브에 첨가하였다. 당해 소형원심분리기 튜브를 와동시키고 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 튜브를 15분 마다 와동시켰다. EHV-1 외부 참조 대조군 (또는 EHV-4 외부 참조 대조군)의 분액 100㎕를 900㎕의 항원 희석제에 첨가하였다. TRITONR X-100의 분액(2.5㎕)를 희석된 EHV-1 외부 참조물에 첨가하였다. 당해 외부 참조 유액을 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고 15분 마다 와동시켰다.
이러한 1 시간의 항온처리 동안, EHV mAb-피복된 플레이트를 PBS-TweenR로 3회 세척하였다. 당해 웰내의 잔여 반응 부위는, 웰당 200㎕의 차단 완충액으로 모든 웰을 피복시킨 후 차단되었다. 플레이트를 최소 30분간 37℃에서 차단 완충액으로 항온처리하였다. 1시간의 항온처리 후, 참조 백신 및 시험 샘플 500㎕를 항원 희석제 500㎕를 함유하는 시험 튜브로 옮겨, 참조 백신 및 시험 백신의 2배 연속 희석물을 제조하였다.
피복 후 플레이트를 PBS-TweenR 용액으로 3회 세척하였다. 표 IV-1에 제시된 바와 같이, 참조 및 시험 백신의 미희석물 내지 1:32 희석물의 분액(50㎕)을 EHV-1 mAb 및 EHV-4 mAb 피복된 플레이트의 중복 웰에 첨가하였다. 표 IV-1에 제시된 바와 같이, 적당한 외부 참조 대조군의 분액 50㎕를 각 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이러한 1 시간의 항온처리 동안, 말 항-EHV-1 혈청 (말 항-EHV-4 혈청)을 항체 희석제로 1:1,000로 희석시키고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다.
1 시간의 항온처리 후, 다중웰 플레이트를 PBS-TweenR 용액으로 3회 세척하였다. 희석된 말 항-EHV-1 혈청 (또는 희석된 말 항-EHV-4 혈청)의 분액(50㎕)을 칼럼 1내의 웰을 제외하고는 적당한 플레이트의 모든 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이러한 1 시간의 항온처리 동안, 양(sheep) 항-말 IgG·HRP 접합체를 항체 희석제로 1:2,500로 희석시키고 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다.
1 시간의 항온처리 후, 플레이트를 재차 PBS-TweenR 용액으로 3회 세척하였다. 양(sheep) 항-말 IgG·HRP 접합체의 분액(50㎕)를 칼럼 1의 웰을 제외하고는 당해 플레이트의 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 1 시간의 항온처리 후, 플레이트를 재차 PBS-TweenR 용액으로 3회 세척하였다.
TMB 기질을 제조자의 지침에 따라 제조하였다. TMB 기질 용액의 분액(100㎕)을, 다중채널 피펫을 사용하여 당해 플레이트의 A열에 있는 모든 웰에 첨가한 다음, 순차적으로 B 내지 H열의 모든 웰에 첨가하였다. 당해 웰들의 광학 밀도를, 650nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기상의 플레이트를 판독하여 측정하였다. 칼럼 1의 대조군 웰은 블랭크로서 사용되었다. EHV-1 항원의 정량화에 사용된 플레이트는, TMB의 기질을 첨가한지 35±10분 후에 판독하였다. EHV-1 외부 참조물을 함유하는 웰의 광학 밀도는 0.500 내지 1.200이어야 한다. EHV-4 항원의 정량화에 사용된 플레이트는 TMB의 기질을 첨가한지 45±10분 후에 판독하였다. EHV-4 외부 참조물을 함유하는 웰의 광학 밀도는 0.500 내지 1.200이어야 한다. 시험 백신 샘플의 상대적 역가 값("RPV")을, EHV-1 외부 참조 대조군 (또는 EHV-4 외부 참조 대조군)에 대한 값을 표준화하여 광학 밀도 판독치로 부터 결정하였다.
III. 유효 시험에 대한 기준
EHV-1 외부 참조물(또는 EHV-4 외부 참조물)을 함유하는 웰의 광학 밀도는, TMB의 기질을 첨가한지 30±5분 후에, 0.500 내지 1.200이어야 한다. 음성 대조군의 광학 밀도는 0.250 이하이여야 한다. 이들 유효성 기준을 만족시키지 못하는 경우, 당해 검정은 없었던 것으로 간주되어야 하며, 당해 검정을 선입관 없이 반복할 수 있다. 시험 샘플의 단위 투여량의 RPV(불활성화된 EHV-1 및/또는 불활성화된 EHV-4의 경우)가 1.0 이상인 경우, 당해 검정의 상대적 역가 결과는 만족스러운 것으로 간주되었다.
IV. 시약
EHV-1 특이적 모노클로날 항체, IgG 분획. 하이브리도마 16H9를 연구기관[Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington, KY]에 근무하는 알렌 조지(George Allen) 박사로 부터 구입하였다. 마우스 복수 기원 의 IgG 분획은 상업적으로 제조되었다. 정제된 항체는 EHV-1 mAb 16H9-IgG, Lot 001, 11-11-98, Exp.11-11-03으로서 동정되었다. IgG 항체 분획을 4 내지 8℃에서 보관하였다.
EHV-4 특이적 모노클로날 항체, IgG 분획. 하이브리도마 20F3을 연구기관[Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, Lexington, KY]에 근무하는 알렌 조지(George Allen) 박사로 부터 구입하였다. 마우스 복수 기원의 IgG 분획은 상업적으로 제조되었다. 정제된 항체는 EHV-4 mAb 20F3-IgG, Lot 001/11-11-98, Exp.11-11-03으로서 동정되었다. IgG 항체 분획을 4 내지 8℃에서 보관하였다.
말 항-EHV-1 폴리클로날 혈청. 혈청의 수집물을, EHV 면역원성 연구, 623-510-98E-015에서 독성 EHV-1을 챌린지한 후 21일째에 백신접종되지 않은 대조군 말로 부터 수집된 혈액으로 부터 수득하였다. 당해 항체는 말 항-EHV-1, Lot 001/030199, Exp.030104로서 동정되었다. 당해 혈청을 -40℃ 이하에서 동결하여 보관하였다.
말 항-EHV-4 폴리클로날 혈청. 혈청의 수집물을, EHV 면역원성 연구, 623-510-98E-015에서 독성 EHV-4를 챌린지한 후 21일째에 백신접종되지 않은 대조군 말로 부터 수집된 혈액으로 부터 수득하였다. 당해 항체는 말 항-EHV-4, Lot 001/030399, Exp.030304로서 동정되었다. 당해 혈청을 -40℃ 이하에서 동결하여 보관하였다.
양 항-말 IgG·HRP 접합체, 1mg/ml(제조원: Bethyl Laboratories, Inc. Catolog No. A70-121P). 당해 항체 접합체를 4 내지 8℃에서 보관하였다.
EHV-1 외부 참조 유액. EHV-1 유액을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였다. EHV-1 외부 참조 유액의 바이알은 EHV-1 Ext.Ref.Flds., Lot 001/040599. Exp. 040504로서 동정되었다. 바이러스 유액을 -40℃ 이하에서 보관하였다.
EHV-4 외부 참조 유액. EHV-4 유액을 실시예 6에 기술된 방법에 따라 제조하였다. EHV-4 외부 참조 유액의 바이알은 EHV-4 Ext.Ref.Flds., Lot 001/040699. Exp. 040604로서 동정되었다. 바이러스 유액을 -40℃ 이하에서 보관하였다.
EHV-1/EHV-4 참조 백신. EHV-1/EHV-4 참조 백신은 실시예 8에 기술된 면역원성 연구(623-0510-98E-015)에서 사용된 것과 동일한 백신이다. 당해 백신은 EHV Imm. Vac, 623-510-98E-015, lot# 001,11-6-98. Exp. 110603로서 동정되었다. 당해 참조 백신을 -40℃ 이하에서 보관하였다.
아래의 시판 시약을 본 실험에서 사용하였다:
기질계. TMB (2 성분), Kirkegaard and Perry, catalog no. 50-76-00.
TritonR X-100. Sigma, catalog no. 1043.
송아지 혈청. Hyclone Laboratories, Inc., catalog no. A-2151-L.
아래의 표준 용액을 본 실험에서 사용하기 위하여 제조하였다:
피복 완충액(각 시험을 위해 새로이 제조되고 pH 9.6로 조정됨)
g/리터(탈이온된 H20)
a. Na2CO3·무수물......................1.59
b. NaHCO3............................. 2.93
PBS (pH 7.3으로 조정됨)
g/리터(탈이온된 H20)
a. Na2HPO4·무수물...................... 1.18
b. NaH2PO4·무수물....................... 0.23
c. NaCl..................................8.50
PBS-TweenR 용액
g/리터(탈이온된 H20)
a. Na2HPO4·무수물...................... 1.18
b. NaH2PO4·무수물....................... 0.23
c. NaCl..................................8.50
d. TweenR 20.............................0.05 ml
차단 완충액(시험 1일째에 새로이 제조됨)
a. PBS..................................75 ml
b. 송아지 혈청...........................25ml
항체 희석제(차단 완충액과 동일; 시험 1일째에 새로이 제조됨)
항원 희석제(시험 1일째에 새로이 제조됨)
a. PBS....................................50ml
b. TritonR X-100..........................0.05ml
실시예 5
불활성화된 EHV-1를 사용한 말의 접종 및 독성 EHV-4를 사용한 후속적인 챌린지
본 연구의 목적은, 독성 EHV-4를 챌린지한 백신접종한 말의 교차 보호에 대해 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스의 면역원성을 입증하는 것이다. 본 연구에서 사용된 백신은 CarbopolR 971로 애쥬번트 보강된 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스를 포함하였다. 말을 두 개의 상이한 백신접종 방법으로 백신접종하였다. 한가지 백신접종 방법은 3회 근육내 백신접종하는 것이고, 다른 한가지 백신접종 방법은 2회 근육내 백신접종하고 1회 비내 투여하는 것이다. 말을 2 내지 4주 간격으로 백신접종하였다. 백신접종하지 않은 말은 대조군으로서 사용하였다. 최종 백신접종 후 3주째에, 백신접종한 말 및 백신접종하지 않은 대조군 말에 독성 EHV-4를 챌린지하였다.
심한 호흡기 질환이, EHV-4로 챌린지한 후, 백신접종하지 않은 대조군 말에서 관찰되었다. 근육내 또는 근육내/비내 투여법에 의해 EHV-1 KyA 백신을 백신접종한 말은, 백신접종하지 않고 챌린지된 대조군 말에 비해, EHV-4에 의해 발병된 호흡기 질환의 임상 증상의 현저한 감소를 보여주었다. 백신접종되지 않은 대조군 말에 비해, 상기 백신접종법중 어느 하나에 의해 백신접종된 말에서 바이러스 방출(virus shedding)이 현저히 감소하였다. 본 연구의 결과로 부터, 독성 EHV-4에 의해 발병된 호흡기 질환에 대한 당해 백신의 불활성화된 EHV-1 KyA 분획의 면역원성이 입증되었다. 또한, 본 연구로 부터, 불활성화된 EHV-1 KyA 분획이, 비경구 및 비경구/비내 경로에 의해 투여된 경우, 면역원성이라는 것이 입증되었다.
4 내지 9개월된 건강한 암컷 및 수컷 말을 선택된 공급원으로 부터 구입하였다. 말은 굴레 꼬리표 번호 및 마이크로칩 번호로 확인되었다. 모든 말은 연구 개시시에는 건강상태가 양호하였다. 1차 백신접종시에, 말은 EHV-1 및 EHV-4에 대한 바이러스 중화(VN) 역가가 ≤2 였다. 말을, 주머니 부터 말 인식 번호를 뽑는 방식으로 무작위 그룹으로 나누었다. 백신접종 및 챌린지 기간 동안, 말을 개방 우리에서 함께 사육하고, 말에게 무제한으로 낙농용 알팔파 건초, Sweet 14 사료 보충물, 말 바이오-미네랄, 및 물을 임의로 공급하였다.
말을, 주머니로 부터 말 인식 번호를 뽑는 방식으로 무작위 그룹으로 나누었다. 말을 백신접종 기간 동안 전반적 건강상태 및 모든 비정상적 행동에 대해 관찰하였다. 백신접종 후 어떠한 말에서도 비정상적 행동 또는 불리한 건강상태가 관찰되지 않았고, 백신접종 후 어떠한 말에서도 불리한 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다. 백신접종 기간 동안에 어떠한 말에서도 호흡기 질환의 임상 증상이 관찰되지 않았다.
당해 백신에 사용하기 위한 EHV-1 유액을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 모든 바이러스 유액은 마스터 시드 바이러스로 부터의 5번째 계대시에 존재하였으며, 마스터 세포 스톡으로 부터 20번째 계대시의 세포에서 생성되었다. 당해 백신은, 투여량 2ml당 EHV-1 및 EIV Newmarket/77, Al 아유형, EIV Kentucky 95, A2 아유형, 및 Newmarket 2/93, A2 아유형을 함유하도록 제형화되었다(실시예 2에 기술된 방법에 따라 제조됨). 당해 백신을 EHV-1 Imm Vac, 623-510-99E-116, lot# 001(1999년 12월 19일)로서 명명하였다.
불활성화된 EHV-1을 함유하는 면역원성 조성물을 두가지 백신접종 방법에 의해 말에 투여하였다. 한가지 백신접종 방법은 3주 간격으로 3회 근육내 백신접종하는 것이다. 다른 방법은 2 내지 4주 간격으로 2회 근육내 백신접종한 다음, 2 내지 4주 후에 비내 경로로 3번째 접종하는 것이다. 각각의 백신접종된 그룹은 11 마리 이상의 말을 포함하였다. 18마리 말의 그룹을 백신접종하지 않은 대조군으로서 사용하였다. 최종 백신접종한 후 3주째에, 말에게 독성 EHV-4를 챌린지하였다. EHV-4에 의해 발병된 호흡기 질환의 임상 증상에 대해 말을 모니터하고, 당해 질환의 중증도를 아래의 표 V-1에 기재된 스코어기록 시스템에 의해 기록하였다. 백신접종 전 백신접종 후 선택된 시기에, 혈청학적 분석을 위해 혈액 및 코로 부터 샘플을 취하고, 바이러스의 분리를 위해 비강 면봉(nasal swab)을 이용하였다.
임상 증상 스코어기록 시스템
임상 증상 증상을 나타내는 각각의 날에 대해 주어진 스코어
콧물
장액성, 소량 장액성, 다량 점액농성, 소량 점액농성, 다량 1 2 3 4
발열
102.5 내지 103.9℉ 104.0 내지 104.9℉ ≥105.0℉ 1 2 3
기타 증상
결막염 기침 호흡곤란 우울증 2차 세균 감염에 요구되는 항생제 치료 1 2 3 4 5
EHV-4 챌린지 바이러스, 405주의 5회 반복 역가측정을 Vero 세포에서 수행하였다. 당해 역가측정에 대한 역가는 5회 역가측정의 각각에 대해 4.63 TCID50 Log10/1ml 이었다. 챌린지를 위해 2ml를 투여하여 4.9 TCID50 Log10/투여량을 수득하였다. 독성 바이러스의 이러한 투여량은 백신접종하지 않은 대조군 말에서 심각한 임상적 호흡기 질환을 일으키기에 충분하였다.
EHV-4 405주를 수탁기관(American Type Culture Collection)으로 부터 수득하여 Vero 세포에서 증식시켰다. 이러한 바이러스는 비폐렴에 걸린 말로 부터 분리되었고, EHV 및 EHV에 의해 발병되는 질환에 관한 익히 인정된 과학자인 스투더트 엠(M. Studdert) 박사에 의해 특성이 규명되었다. 당해 바이러스가 EHV-4의 관련된 대표적 예로서 ATCC에 제츨되었고, 예전에 NVSL에 의해 EHV-4 챌린지 주로서 추천되었다.
챌린지에 사용되는 EHV-4의 동결된 스톡을 해동시키고 5.0 TCID50 Log10/ml의 표적 농도를 함유하도록 희석시키고, -70℃에서 동결시켰다. 챌린지 바이러스의 샘플을 해동시키고 역가를 측정하였다. 챌린지 시에, 바이러스 유액을 해동시키고 2ml의 EHV-4를 21 게이지 바늘이 있는 3ml 주사기로 회수하였다. 당해 바늘을 제거하고 당해 챌리지 바이러스를 백신접종한 말 및 백신접종하지 않은 말의 적당한 그룹에 비내 투여하였다.
챌린지 후, 말을 EHV-4에 의해 발병되는 호흡기 질환의 임상 증상, 예를 들어 발열, 콧물, 결막염, 기침, 호흡곤란, 우울증, 및 기타 2차 세균 감염에 요구되는 항생제 치료에 대해 모니터하였다. 말을 임상 질환에 대해 매일 관찰하고 질환의 중증도를 기록하였다.
바이러스 챌린지 후 선택된 날에, EHV의 분리를 위해 비강 면봉을 이용하여 샘플을 채취하여, -70℃에서 보관하였다. 동결된 샘플을 해동시키고, 당해 면봉을 수송 배지로 부터 제거하였다. 당해 샘플을 19 내지 22℃에서 20분간 2500x g로 원심분리하였다. 원심분리한 샘플의 분액 0.1ml를, Vero 세포의 24 시간 단층을 함유하는 48-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. 배양 플레이트를 7일간 CO2항온처리기에서 37℃에서 항온처리하였다. 웰을 EHV의 전형적 세포병변(CPE)의 존재에 대해 규칙적으로 관찰하였다. 세포독성을 나타내는 웰을, 7일간의 항온처리 기간 후 당해 웰로 부터 0.2ml를 Vero 세포의 24시간 단층을 함유하는 48-웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮겨 계대배양하였다. 배양 플레이트를 7일간 CO2 항온처리기에서 37℃에서 항온처리하고 CPE에 대해 관찰하였다. CPE에 대해 양성인 처리된 비강 샘플내의 EHV의 역가를, 96-웰 조직 배양 플레이트상에서 표준 역가 측정 방법에 의해 측정하였다.
백신접종 전 및 후 및 독성 바이러스의 챌린지 후, 말의 혈청 VN 항체 역가를 측정하였다. 혈액 샘플을 채취하여 당해 연구에서 사용된 말을 스크리닝하는 경우, 말 번호 13(EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 역가= 8)을 제외하고는, 모든 말이 EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 항체 역가가 ≤2 였다. 1차 백신접종시에, EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 역가는 각각 2 및 4로 낮아졌다. 근육내 투여 그룹중의 또 다른 한 마리 말은 VN 역가가 2로 부터 8로 증가하였으며, 비경구/비내 투여 그룹중의 2마리 말은 VN 역가가 2로 부터 16으로 증가하였다. 어떠한 말도 호흡기 감염의 증거를 전혀 나타내지 않았다. 1차 백신접종 후, EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 역가의 증가는 다를 수 있지만, 모든 말에서 VN 역가가 백신접종 전 역가에 비해 증가하였다. 2차 및 3차 백신접종 후, VN 역가는 1차 백신접종 후와 실질적으로 동일하게 유지되었다. EHV-1에 대한 VN 역가가 EHV-4에 대한 VN 역가에 보다 크며, EHV-1에 대한 VN 역가는 EHV-4 VN 역가 보다 2배 이상, 4배 이하로 크다. 비경구 백신접종 그룹에서 EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 역가는 비경구/비내 그룹 보다 크지만, 그 차이가 2배 미만이다. 독성 EHV-4를 챌린지한 후 21일째에, EHV-1 및 EHV-4 둘다에 대한 VN 항체 역가는 백신접종한 말에서 다소 증가하거나 동일하게 유지되었다. 그러나, 백신접종되지 않은 대조군 말에서, VN 항체 역가는 한 마리의 접종하지 않은 대조군 말을 제외한 모든 말에서 EHV-1 및 EHV-4 둘다에 대해 32 내지 128배 증가하였다. EHV-1에 대한 VN 항체 역가는, EHV-4 챌린지 후 백신접종한 말 및 대조군 말에서 EHV-4에 대한 VN 항체 역가와 유사하였다.
백신접종 전 및 후 및 독성 바이러스의 챌린지 후에 말로 부터 수집된 비강 샘플중의 VN 항체 역가를 혈청중의 항체 역가를 측정하는데 사용된 것과 동일한 VN 검정으로 측정하였다. 백신접종 후 혈청중의 VN 활성과 유사하게도, 비강 분비물중의 VN 활성은 백신접종 후 증가하였으나, 그 정도가 낮았다. EHV-4를 챌린지한 후, VN 항체 역가는 단지 몇몇 말에서만 단지 약간 증가하였다. VN 항체 역가 데이터는 당해 보고서에 제시되지 않았다.
말에 독성 EHV-4를 비내 챌린지하였다. 챌린지 후, 말의 체온을 매일 측정하고, 호흡기 질환의 임상 증상, 예를 들면 콧물, 결막염, 기침, 호흡곤란, 발열 및 우울증을 기록하였다.
EHV-4 챌린지 후 말에서의 발열을 모니터하였다. 발열은 백십접종 그룹 및 대조군 그룹 둘다에서 산발적이고 단기적이였다. 발열을 나타내는 말의 대부분에서, 단지 1일 또는 2일 동안만 체온의 증가가 관찰되었다. 비경구/비내 그룹중의 한마리의 백신접종 말이 4일 연속하여 발열을 나타내었다. 챌린지 후 5일 내지 8 일, 10일 또는 13일 동안 백신접종 그룹 및 대조군 그룹 사이에서 발열 분포의 유의적 차이가 존재한다는 증거가 없었다. 통계학적 분석은 1 내지 4, 9, 11, 12 및 14 내지 21일째에 수행하였는데, 그 이유는 2마리 미만의 동물이 0이 아닌 발열 스코어를 나타냈기 때문이다. 분산 분석을 이용하여 체온을 날마다 별도로 분석하는 경우, 백신접종 동물과 대조군 동물 사이에서 체온이 현저히 감소한 증거가 존재하였으나, 이는 몇몇 개별적인 날에만 해당하는 것이다.
또한, 말에서 콧물을 관찰하였다. 콧물을 정상, 장액성 소량, 장액성 다량, 점액농성 소량, 및 점액농성 다량으로 평가하고, 각각 0, 1, 2, 3 및 4로 스코어를 기록하였다. 비경구 백신접종 그룹중의 3마리의 말이 단지 하루 동안 콧물을 나타냈다. 백신접종 그룹에서 모든 다른 콧물 스코어는, 주로 1 내지 2일로 제한되는 소량의 장액성 콧물이었다. 반대로, 접종하지 않은 대조군 말은 수일 연속하여 점액농성 및 장액성 콧물을 나타내었다, 챌린지 후 3 내지 9일 및 11 내지 15일 동안 백신접종 그룹 및 대조군사이에서 유의적 차이(≤0.0479)가 존재한다는 증거가 있었다. 챌린지 후 4, 5, 6, 8, 9 및 11일 동안 비경구 백신접종 그룹과 대조군 그룹사이에서 및 챌린지 후 3 내지 8일 및 11일 동안 비경구/비내 백신접종 그룹과 대조군 그룹사이에서, 콧물 스코어 분포의 유의적 차이(p≤0.0259)가 존재한다는 증거가 있었다.
챌린지 후, 결막염, 기침, 호흡곤란 및 우울증의 임상 증상의 관찰이 표 4에 제시된다. 결막염은 백신접종 그룹에서 관찰되는 1차 증상이고 2 내지 3일간 기록되었다. 한 마리의 백신접종 동물은 1일간 호흡곤란을 나타내었고, 한 마리의 백신접종 동물은 3일 연속하여 기침을 나타내었다. 모든 다른 동물에서는 기침이 단지 하루 동안만 관찰되었다. 비경구 및 비경구/비내 백신접종 그룹에서 각각 한 마리의 말, 8% 및 9%가 각각 단지 하루 동안만 임상 질환의 2가지 증상을 나타내었다. 우울증은 어떤 백신접종 그룹에서도 관찰되지 않았다. 백신접종 동물과는 달리, 백신접종하지 않은 대조군 말의 80%가, 챌린지 후 3일 이상 연속하여 기침 및 우울증의 심각한 임상 증상을 나타내었다. 임상 증상을 0= 부재 및 1= 존재로서 분석하는 경우, 챌린지 후 3일 및 6 내지 13일 동안 비경구(p≤0.0313) 및 비경구/비내((p≤0.0391) 백신접종 그룹과 백신접종하지 않은 대조군 그룹사이에서 결막염을 나타내는 동물의 수에 있어 유의적 차이가 존재한다는 증거가 있다. 백신접종하지 않은 대조군에 비해 비경구 및 비경구/비내 백신접종 그룹 둘다의 경우 챌린지 후 6일째에 우울증을 나타내는 동물의 감소에 있어서 유의적 차이(p≤0.0156)가 존재한다는 증거가 있다. 호흡곤란에 대하여는 백신접종 그룹과 대조군 사이에 유의적 차이가 존재한다는 증거가 없었다.
매일 나타난 임상 증상의 수를 집계하는 경우, 챌린지 후 6 내지 9일 및 11일째에 비경구(p≤0.0242) 및 비경구/비내(p≤0.0259) 백신접종 그룹과 백신접종하지 않은 대조군 말 사이에서 임상 증상의 수의 분포에 있어 유의적 차이가 존재한다는 증거가 있었다. 결막염, 기침, 호흡곤란 및 우울증의 임상 증상의 스코어는 표 V-1에 기술된 바와 같이 각각 1, 2, 3 및 4로 기록되었다. 복합 임상 스코어는 콧물 및 임상 증상 스코어의 합계로 계산하였다. 체온은 복합 스코어의 계산에 포함되지 않았다. 복합 임상 스코어는 챌린지 후 매일 각각의 말에 대해 계산되었다. 총 복합 임상 스코어는 챌린지 후 모든 날에 대한 임상 스코어의 합계이다. 챌린지 후 3 내지 9일 및 11 내지 15일째에 비경구 그룹과 백신접종하지 않은 대조군 그룹사이에서 복합 임상 스코어의 유의적 차이(p≤0.0331)가 존재한다는 증거가 있고, 총 복합 스코어에 대해 유의적 차이(p≤0.0001)가 존재한다는 증거가 있었다. 챌린지 후 3 내지 9일 및 11 내지 15일째에 비경구/비내 그룹과 백신접종하지 않은 대조군 그룹사이에서 복합 임상 스코어의 유의적 차이(p≤0.0241)가 존재한다는 증거가 있고, 총 복합 스코어에 대해 유의적 차이(p≤0.0001)가 존재한다는 증거가 있었다.
바이러스 방출(virus shedding)를, 독성 EHV-4를 챌린지한 후 말에서 모니터하였다. 비강 샘플을 챌린지 후 1 내지 7일째 및 18일 까지 하루 걸러 말로 부터 수집하였다. EHV-4 챌린지 바이러스를, 백신접종하지 않은 한 마리의 대조군 말을 제외한 모든 말로 부터의 비강 샘플로 부터 회수하였다. 10-2 희석도에서 백신접종하지 않은 대조군 말의 대부분으로 부터 바이러스가 검출되었다. 3 내지 5일이 바이러스 방출이 검출되는 주요 일이다. 챌린지 6일째에 일부 접종하지 않은 대조군 말에서 낮은 수준으로 바이러스가 검출되었다. 챌린지 바이러스는 챌린지 후 백신접종한 말로 부터는 회수되지 않았다.
결론
불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스를 함유하는 백신은, 비경구 및 비경구/비내 경로로 투여되는 경우, 전신 체액성 면역 반응을 일으켰다. EHV-1 함유 백신으로 말에게 백신접종하는 경우, EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 항체가 고수준으로 생성되었다. EHV-1 및 EHV-4에 둘다에 대한 항체 역가는 백신접종한 동물로 부터 수득된 비강 샘플에서 검출되었으나, 비교적 낮은 역가였다. 따라서, 불활성화된 EHV-1 KyA 함유 백신은 EHV-1에 대해 말을 면역화시킬 수 있고 EHV-4에 대해 말을 교차-면역화시킬 수 있었다. 백신접종 또는 주사 부위 반응에 대한 비정상적 반응이 백신접종 후 모든 말에서 전혀 관찰되지 않았다.
장액성 및 점액농성 콧물, 결막염, 기침 및 우울증의 장기간의 에피소드로 이루어진 심각한 호흡기 질환이, 독성 EHV-4를 챌린지한 백신접종하지 않은 대조군 말에서 관찰되었다. 대조적으로, EHV-4 호흡기 질환의 임상 증상의 수, 임상 증상의 중증도 및 임상 증상을 나타내는 백신접종 동물의 수는 백신접종한 말에서 현저하게 감소하였다. 비경구 또는 비경구/비내 경로로 백신접종된 말은 EHV-4 감염으로 인한 호흡기 질환의 임상 증상의 현저한 감소를 보여주었다. 임상 질환의 감소는, 비경구 및 비경구/비내 백신접종된 말이 EHV-4 챌린지 후 바이러스를 방출하지 않았음을 정립하는 데이터에 의해 지지되었다. 백신접종하지 않은 대조군 말로 부터 수집된 비강 샘플은 EHV-4 챌린지 후 여러 날에 고수준의 바이러스를 함유하였다.
백신내에 함유된 불활성화된 EHV-1 KyA 항원은, 비경구 및 비경구/비내 경로로 투여되는 경우, EHV-4에 의해 발병된 호흡기 질환에 대해 말을 교차 보호하기 위한 면역원이었다. 요약하면, 본 연구의 결과로 부터, 불활성화 EHV-1 KyA 바이러스를 함유하는 백신은 EHV-1에 대한 VN 항체 뿐만 아니라 EHV-4에 대한 교차 중화 항체를 생성시킨다는 것이 입증되었다. 불활성화된 EHV-1 KyA 함유 바이러스는 , 비경구 또는 비경구/비내 투여방법을 사용하여 투여된 경우, 독성 EHV-4에 의해 발병되는 호흡기 질환에 대해 말을 교차 보호할 수 있었다.
실시예 6
불활성화 EHV-1를 사용한 말의 접종 및 독성 EHV-1을 사용한 후속적인 챌린지
본 실시예에 기술된 연구의 목적은, 근육내 또는 근육내/비내 경로로 투여되는 경우, 독성 EHV-1에 의해 발병되는 질환에 대해 말을 교차 보호하기 위한 EHV-1 분획의 면역원성을 입증하는 것이다. 추가적 목적은 EIV 분획의 존재가 EHV-1의 면역원성에 대해 영향을 주지 않음을 입증하는 것이다.
본 연구의 목적은, 독성 EHV-1을 챌린지한 백신접종 말의 보호를 위한 사멸 바이러스인, 비폐렴 백신의 EHV-1 분획의 면역원성을 입증하는 것이다. 본 연구에서 사용된 백신은, 불활성화된 EHV-1을 함유하고 CarbopolR 971로 면역보강되도록 제형화되었다. 말을 두가지 상이한 백신접종 방법으로 백신접종하였다. 한가지 백신접종 방법은 3회 근육내 백신접종하는 것이고, 다른 한가지 백신접종 방법은 2회 근육내 백신접종하고 1회 비내 투여하는 것이다. 말을 2 내지 4주 간격으로 백신접종하였다. 백신접종하지 않은 말은 대조군으로서 사용하였다. 최종 백신접종 후 6주째에, 백신접종한 말 및 백신접종하지 않은 대조군 말에 독성 EHV-1을 챌린지하였다. 심각한 호흡기 질환의 임상 증상, 예를 들면 점액농성 콧물, 기침, 호흡곤란 및 우울증이 EHV-1의 챌린지 후 백신접종하지 않은 대조군 말에서 관찰되었다.
말
3 내지 4개월된 상이한 품종의 건강한 숫컷 및 암컷 말을 여러 공급원으로 부터 구입하였다. 말은 굴레 꼬리표 번호 및 마이크로칩 번호로 확인되었다. 모든 말은 연구 개시시에 EHV에 의한 호흡기 질환이 발병한 적이 없는 양호한 건강상태였다. 말을, 주머니로 부터 말 인식 번호를 뽑는 방식으로 무작위 그룹으로 나누었다. 백신접종 및 챌린지 기간 동안, 말을 개방 우리에서 함께 사육하고, 말에게 무제한으로 낙농용 알팔파 건초, Sweet 14 사료 보충물, 말 바이오-미네랄, 및 물을 임의로 공급하였다.
말을, 주머니로 부터 말 인식 번호를 뽑는 방식으로 무작위 그룹으로 나누었다. 말을 백신접종 기간 동안 전반적 건강상태 및 모든 비정상적 행동에 대해 관찰하였다. 모든 말은 연구 개시시에 양호한 건강상태 였다. 백신접종 후 어떠한 말에서도 비정상적 행동 또는 불리한 건강상태가 관찰되지 않았고, 백신접종 후 어떠한 말에서도 불리한 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다. 백신접종 기간 동안에 어떠한 말에서도 EHV에 의해 발병되는 호흡기 질환의 임상 증상이 관찰되지 않았다.
독성 EHV-1을 말에게 챌린지하기로 된 날 약 3주 전에, 말에게서 선역(Strangles)이 발병하였다. 팽윤된 림프절로 부터 채취한 샘플을 실험실[Montana State University diagnostic laboratory]에 제출하였고, 스트렙토코코스 에퀴(Streptococcus equi)가 당해 샘플로 부터 분리되었다. 페니실린을 말에게 투여하고, 말을 살아있는 약독화된 스트렙토코코스 에퀴 백신, Pinnacle로 백신접종하였다. 말이 독성 EHV-1을 챌린지하기 전 3주 동안 선역으로 부터 회복할 수 있도록 하였다. EHV-1을 챌린지 한 당일에 본 연구로 부터 백신접종하지 않은 말을 제거하였다. 약간의 우울증 및 호흡곤란이 관찰되었고, 거친 흡입소리가 검사시에 들렸다. 근육내 백신접종 그룹중의 또 다른 말은 EHV-1 챌린지 5주전인 2000년 9월 21일에 사망하였다. 사망 원인은 폐렴이였다. 근육내 백신접종 그룹중의 제3의 말은 챌린지 후 1일째인 2000년 10월 28일에 사망하였다. 사망 원인은 파열된 장간막 농양 및 후속적인 중독증이였다. 스트렙토코코스 에퀴가 상기 농양으로 부터 분리되었다. EHV-1을 챌린지한 모든 말은 건강하였고, 스트렙토코코스 에퀴 감염 증거가 나타나지 않았다. 본 연구로 부터 제거된 말로 부터의 모든 데이터는 본 보고서에 포함되지 않았다.
백신
당해 백신에 사용하기 위한 EHV-1 유액을 실시예 1 및 2에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 모든 바이러스 유액은 마스터 시드 바이러스로 부터의 5번째 계대시에 존재하였으며, 마스터 세포 스톡으로 부터 20번째 계대시의 세포에서 생성되었다. 당해 백신은, 투여량 2ml당 EHV-1 및 EIV Newmarket/77, Al 아유형, EIV Kentucky 95, A2 아유형, 및 Newmarket 2/93, A2 아유형을 함유하도록 제형화되었다. 당해 백신을 EHV-1 Imm Vac, Lot #001, 6129-0510-OOE-045,03-Aug-00로서 명명하였다.
연구 고안
백신을 2가지 백신접종 방법에 따라 말에게 투여하였다. 한가지 백신접종 방법은 2 내지 4주 간격을 두고 3회 근육내 백신접종하는 것이었다. 다른 한가지 방법은 2 내지 4주 간격을 두고 2회 근육내 백신접종하고 2 내지 4주 후에 비내 경로로 3번째 백신접종하는 것이다. 각각의 백신접종 방법 그룹은 19 내지 20 마리 말을 포함시켰다. 20 마리 말을 포함한 그룹을 백신접종되지 않은 대조군으로서 사용하였다. 최종 백신접종후 6주째에 말들을 독성 EHV-1으로 챌린지하였다. EHV-1에 의해 발병되는 호흡기 질환의 임상적 징후에 대하여 말들을 모니터하고 질환의 중증도를 기록하였다. 혈청학적 평가를 위해 혈액 및 코의 샘플과 바이러스의 분리를 위한 비강 면봉을 백신접종 이전 및 이후의 선택된 시간에 취한다. 혈액, 코 샘플 및 비강 면봉의 수집물은 동물 연구 프로토콜에서 기술한다.
EHV-1 및 EHV-4에 대한 혈청 VN 항체 역가
백신접종 및 독성 EHV-1로 챌린지하기 전후 말에서의 혈청 VN 항체 역가를 측정하였다. 근육내 및 근육내/비내 백신접종한 그룹 둘다의 모든 말들의 VN 항체 역가는 1차 백신접종시 EHV-1에 대해서 2 또는 4 이하였다. 근육내 백신접종 그룹에서 한마리 말과 비내 백신접종 그룹에서 5마리 말은 첫번째 백신접종시 EHV-4에 대한 VN 항체 역가가 8 또는 16이었다. 백신접종되지 않은 대조군 말의 VN 항체 역가는 1차 백신접종시 2 내지 16 이하로서, 대부분 2 또는 4 이하였다. 어떠한 말도 호흡기 감염의 증거도 나타내지 않았고 이전에 EHV에 노출된적이 없었다. 1회 백신접종후, EHV-1 및 EHV-4에 대한 VN 역가가 거의 또는 전혀 증가하지 않았다. 백신접종되지 않은 대조군 말에서의 항체 역가는 변함없이 유지되었고, 사실상, 몇몇 대조군에서의 항체 역가는 백신접종 이전 역가로부터 약간 감소되었다. 2차 백신접종후, EHV-1에 대한 VN 항체 역가는 근육내 및 근육내/비내 백신접종 그룹에서 증가하였다. EHV-4에 대한 항체 역가는 어떠한 백신접종 그룹에서도 증가하지 않았다. 백신접종되지 않은 대조군 그룹에서의 항체 역가는 변함없이 유지되거나 지속적으로 감소하였다. 3차 백신접종 후, EHV-1에 대한 VN 역가는 지속적으로 증가했다. EHV-4에 대한 항체 역가 또한 세번째 백신접종후 증가하였다. 근육내 백신접종 그룹에서 EHV-1 및 EHV-4에 대한 기하학적 평균 VN 항체 역가는 각각 86 및 19이고, 근육내/비내 그룹에서는 EHV-1 및 EHV-4에 대해 각각 69 및 20 이었다. 백신접종되지 않은 대조군 말중 3마리를 제외하고, EHV-1 및 EHV-4에 대한 항체 역가는 세번째 백신접종 기간의 끝까지 변함없이 유지되거나 감소되었다. 독성 EHV-1으로 챌린지한 후 21일째에, EHV-1 및 EHV-4 모두에 대한 VN 항체 역가는 몇몇 백신접종 그룹에서 극적으로 증가하였고 다른 백신접종 그룹에서는 약간 증가하거나 동일하게 유지되었다. 하지만, 백신접종되지 않은 대조군 말에서, VN 항체 역가는 4마리의 백신접종되지 않은 대조군 말을 제외하고 모든 말에서 EHV-1 및 EHV-4 모두에 대해 100배 이상으로 증가하였다. 일반적으로, VN 항체 역가는 EHV- 4 보다 EHV-1에 대해 보다 컸다.
EHV-1 챌린지 바이러스의 역가측정
EHV-1 챌린지 바이러스, KyD주의 5회 반복 역가측정을 Vero 세포상에서 수행하였다. 5회 반복 역가측정의 결과는 4.4, 4.4, 4.4, 4.4, 및 4.5 TCID50 Log10/ml 였다. 평균 역가는 4.4 TCID50 Log10/ml 였다. 챌린지를 위해 각각의 말에게 2ml를 투여하면, 4.7 TCID50 Log10/2ml(투여량)이 수득되었다. 챌린지를 위해 말에게 투여되는 바이러스의 표적 투여량은 4.0 TCID50 Log10/2ml(투여량) 이상이었다.
독성 EHV-1을 사용한 말의 챌린지
EHV-1 KyD 주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하여 Vero 세포 상에서 증식시켰다. 챌린지용으로 사용되는 EHV-1의 스톡은 4.0 TCID50 Log10/ml 이상의 표적 농도를 함유하였다. 스톡을 -70℃ 에서 동결시켰다. 챌린지 바이러스의 샘플을 해동시키고 역가를 측정하였다. 챌린지시, 바이러스 유액을 해동시키고 2ml의 EHV-1을 21게이지 바늘이 있는 3ml 주사기로 수거하였다. 바늘을 제거하고 챌린지 바이러스를 적절한 백신접종된 그룹 및 백신접종되지 않은 그룹의 말에게 비내 투여하였다. 백신접종된 말 및 백신접종되지 않은 대조군 말을 챌린지 후 21일 기간 동안 개방된 우리내에서 함께 수용하였다.
챌린지 후, 말들을 발열 및 EHV-1에 의해 발병되는 호흡기 질환의 임상적 징후, 예를 들면 콧물, 결막염, 기침, 호흡곤란, 우울증, 및 2차 세균 감염에 요구되는 항생제 치료와 같은 것들에 대해 모니터하였다. 임상적 질환에 대해 매일 말들을 관찰하고 질환의 중증도를 기록하였다.
EHV-1 챌린지 후 말에서 발열을 모니터하였다. 발열은 산발적이었고 챌린지 기간의 지속 동안 확산되었다. 백신접종되지 않은 대조군 그룹과 백신접종된 그룹 모두에서 2 내지 3일 연속해서 체온이 상승한 말들이 있었지만, 발열과 호흡기 질환의 임상적 징후간에 상관관계가 있는 것으로 보이지는 않았다. 각각의 백신접종 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에서 발열 분포의 유의적 차이가 존재한다는 증거는 없었다.
말들의 콧물을 관찰하였다. 콧물을 정상, 장액성 소량, 장액성 다량, 점액농성 소량 및 점액농성 다량으로 기록하고, 동물 프로토콜에 따라 각각 0, 1, 2, 3, 및 4로 스코어를 기록하였다. 챌린지 후 장액성 콧물은 근육내 백신접종 그룹의 말들 모두에서 관찰되었는데, 소량 및 다량의 장액성 콧물을 흘리는 말들은 거의 동수로 관찰되었다. 405번 및 423번 말은 이틀 연속적으로 점액농성의 콧물을 흘렸고 420번 및 469번 말은 하루만 점액농성의 콧물을 흘렸다. 백신접종되지 않은 대조군 말은 여러날 연속해서 주로 점액농성 콧물을 흘렸다. 콧물 스코어를 동물 프로토콜에서 스코어링 시스템에 따라 분석하는 경우, 챌린지 후 5-7일 및 10일째 근육내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에서 콧물 스코어 분포의 유의적 차이(p≤0.0018)가 존재한다는 증거가 있다. 장액성 콧물의 유사한 결과도 챌린지 후 근육내/비내 그룹에서 관찰되었는데, 두 백신접종 그룹에서 1 또는 2일 동안 점액농성 콧물이 기록되었다. 챌린지 후 4-7일, 10일 및 19일째에 근육내/비내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에 콧물 스코어의 분포에 있어서 유의적 차이(p≤0.0463)가 존재한다는 증거가 있다
콧물 스코어를 정상=0, 장액성 콧물=1 및 점액농성=2의 시스템에 따라 분석하는 경우, 챌린지 후 5-7일, 10일 및 17일째에 근육내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에 유의적 차이(p≤0.0463)가 존재한다는 증거가 있었다. 또한 챌린지 후 4-7일 및 10일째에 근육내/비내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에 콧물 스코어의 분포에 있어서 유의적 차이(p≤0.0092)가 존재한다는 증거가 있었다.
챌린지 후 결막염, 기침, 호흡곤란 및 우울증의 임상적 징후에 대해 관찰하였다. 챌린지 후 3일 내지 11일은 말들에게서 질환의 가장 심각한 징후가 관찰되는 날이었다. 질환의 임상적 징후는 챌린지 후 3일 내지 11일째에 가장 빈번하게 발생하였다. 백신접종 그룹 및 대조군 그룹에서 관찰되는 임상적 징후의 2차 국면이 있는 것으로 보인다. 하지만, 이것은 백신접종 그룹에서는 단지 하룻동안만 관찰되었고 대조군 그룹에서는 수일 동안 관찰되었다. 기침 및 결막염은 근육내 투여방법 그룹의 백신접종 그룹에서 관찰되는 임상적 질환의 1차 징후였다. 결막염 및 기침은 백신접종 그룹에서 3일 이하로 연속하여 관찰되었다. 챌린지 후 6일 및 7일째에 백신접종되지 않은 대조군에 비해 근육내 그룹에서 결막염을 나타내는 동물의 비율이 유의적으로 감소(p≤0.0197)되었다는 증거가 있으며, 챌린지 후 4일 내지 8일째에 백신접종되지 않은 대조군에 비해 근육내 그룹에서 기침을 나타내는 동물의 비율이 유의적으로 감소(p≤0.0463)되었는다는 증거가 있다. 기침과 결막염은 근육내/비내 백신접종 그룹에서 관찰되는 질환의 가장 흔한 임상적 징후이다. 챌린지 후 6일 및 7일째에 백신접종되지 않은 대조군에 비해 근육내/비내 그룹에서 결막염을 나타내는 동물의 비율이 유의적으로 감소(p≤0.0197)되었다는 증거가 있으며, 챌린지 후 5일 및 6일째에 백신접종되지 않은 대조군에 비해 근육내 그룹에서 기침을 나타내는 동물의 비율이 유의적으로 감소(p≤0.0044)되었다는 증거가 있다. 우울증은 챌린지 후 어떠한 근육내 백신접종된 그룹에서도 관찰되지 않았고 챌린지 후 근육내/비내 백신접종 그룹중 두마리에서만 관찰되었다. 다수의 백신접종되지 않은 대조군 말들에서는 수일동안 우울증이 관찰되었다. 백신접종 그룹과는 달리, 백신접종되지 않은 대조군 말들은 일반적으로 연속적으로 4일 동안 및 7일 또는 8일 동안이나 지속되는 질환의 다중 징후를 나타냈다. 백신접종된 어떠한 말들에서도 호흡곤란이 관찰되지 않았으나 2마리 대조군 말들에서는 수일동안 관찰되었다. 동일한 두마리 백신접종되지 않은 대조군 말들은 2차 세균 감염에 대한 항생제 치료를 필요로하였다. 동물 프로토콜 당 계산되는 임상적 질환 스코어는 근육내 백신접종 그룹 대 대조군에 대해 및 근육내/비내 백신접종 그룹 대 대조군에 대해 표 7 및 표 8에 각각 제시되어있다.
임상적 징후의 수를 날마다 집계하여, 0, 1, 2 또는 3으로 기록하였다. 날마다 나타난 임상적 징후의 수를 집계하는 경우, 4일 내지 8일 동안 근육내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에 임상적 징후의 수의 분포에 있어서 유의적 차이(p≤0.0206)가 존재한다는 증거가 있다. 5일 내지 7일 동안 근육내/비내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에 임상적 징후의 수의 분포에 있어서 유의적 차이(p≤0.0159)가 존재한다는 증거가 있다.
복합 임상 스코어를 콧물 스코어와 임상적 징후 스코어의 합계에 의해 계산하였다. 2-그룹 위콕신(Wicoxins) 시험의 다중 그룹 연장인 크루스칼-월리스 시험 (Kruskal-Wallis test)을 사용하여 그룹사이의 스코어의 동일성 가설을 시험하였다. 위콕신 시험을 사용하여 대조군 그룹에 비해 각각의 백신접종 그룹에서 스코어 감소의 가설을 시험하고(1면 시험), 백신접종 그룹간의 스코어의 동일성 가설을 시험하였다(2면 시험). 챌린지 후 4 내지 7일 및 11일 동안에 근육내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에서 복합 임상 스코어의 유의적 차이(p≤0.0372) 및 총 복합 임상 스코어의 유의적 감소(p≤0.0001)가 존재한다는 증거가 있다. 챌린지 후 4 내지 7일 및 11일 동안에 근육내/비내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에서 복합 임상 스코어의 유의적 차이(p≤0.0408) 및 총 복합 임상 스코어의 유의적 감소(p≤0.0002)가 존재한다는 증거가 있다.
발열을 제외한 임상 관찰 스코어와 콧물 스코어의 합계인 변형된 복합 임상 스코어를 또한 계산하였다. 챌린지 후 3 내지 8일 및 10, 11, 및 19일 동안에 근육내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에서 변형된 복합 임상 스코어의 유의적 차이(p≤0.0383) 및 총 복합 임상 스코어의 유의적 감소(p≤0.0001)가 존재한다는 증거가 있었다. 챌린지 후 3 내지 7일 및 10, 11, 및 19일 동안 근육내/비내 그룹과 백신접종되지 않은 대조군 그룹 사이에서 복합 임상 스코어의 유의적 차 이(p≤0.0487) 및 총 복합 임상 스코어의 유의적 감소(p≤0.0001)가 존재한다는 증거가 있었다.
챌린지 후 말로부터 바이러스의 방출
EHV-1 챌린지 바이러스를 EHV-1으로 챌린지한 후 바이러스를 방출하는 백신접종되지 않은 모든 대조군 말의 비강 샘플으로부터 회수하여, -70 ℃에 보관하였다. 동결된 샘플을 해동시키고 면봉을 수송 배지로부터 제거하였다. 샘플을 19 내지 22 ℃에서 20분 동안 2500 x g로 원심분리하였다. 이와같이 처리된 샘플의 분액 0.1 ㎖를 Vero 세포의 24 내지 48 시간 단층을 함유하는 48-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. 배양 플레이트를 7일 동안 CO2 항온처리기에서 37 ℃에서 항온처리하였다. 웰을 EHV의 전형적인 세포병변효과(CPE)의 존재에 대해 규칙적으로 관찰하였다. 세포독성을 나타내는 웰을 7일간의 항온처리 기간 후 당해 웰에서 0.2 ㎖을 Vero 세포의 24 시간 단층을 포함하는 48- 웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮겨, 계대 배양하였다. 배양 플레이트를 7일 동안 CO2 항온처리기에서 37 ℃에서 항온처리하고 CPE에 대해 관찰하였다. CPE에 대해 양성인 상기와 같이 처리된 비강 샘플에서 EHV의 역가를 96-웰 조직 배양 플레이트의 세포에서 표준 역가측정 방법에 의해서 측정하였다.
EHV-1 챌린지 바이러스를 EHV-1로 챌린지한 후 바이러스를 방출하는 백신접종되지 않은 모든 대조군 말의 비강 샘플로부터 회수하였다. 비강 면봉에서 검출 된 바이러스는 EHV-1 특이적 모노클로날 항체를 사용한 면역형광검정법(immunofluorescence assay)에 의해 EHV-1으로 확인되었다. 바이러스는 10-2 내지 10-3의 희석도에서 백신접종되지 않은 대조군 말로 부터 검출되었다. 바이러스 방출은 2일 내지 5일 동안 주로 검출되었다. 챌린지 바이러스를 근육내 백신접종 그룹중의 5 마리의 말 및 근육내/비내 백신접종 그룹중의 3 마리의 말로 부터 챌린지 후 회수하였다. 2일 내지 5일 동안 백신접종하지 않은 대조군에 비해 근육내 그룹에서 바이러스의 존재를 나타내는 동물 비율의 유의적 감소(p ≤ 0.0001)가 존재한다는 증거가 있고, 2일 내지 5일 동안 백신접종하지 않은 대조군에 비해 근육내/비내 그룹에서 바이러스의 존재를 나타내는 동물 비율의 유의적 감소(p ≤ 0.0003)가 존재한다는 증거가 있다.
만족스러운 연구를 위한 기준
아래의 기준은 만족스러운 EHV 면역원성 연구를 위해서 충족되어야만 한다 :
백신접종되지 않은 대조군 말은 백신접종 기간 동안 EHV-1 및 EHV-4에 대해 음성혈청반응 상태를 유지해야 하고/하거나 독성 야생 바이러스에 대한 실험 말의 노출의 지시인자로서 질환의 어떠한 임상적 징후도 나타내지 않아야 한다.
독성 EHV-1로 챌린지 후, 백신접종되지 않은 대조군 동물에서의 질환의 임상적 징후에 비해 백신접종된 동물에서의 질환의 임상적 징후에 있어서 통계적으로 유의적인 감소가 존재하여야 한다.
결론
본 연구에서, 3 내지 4개월된 수컷 및 암컷 새끼 말의 그룹을, 근육내 또는 근육내/비내 경로 중 하나에 의해 백신을 3회 투여하여 백신접종하였다. 백신을 3회 투여한 후에, 모든 백신접종된 동물은 VN 항체를 나타내었다. 전신 체액성 반응의 진행은 근육내 및 근육내/비내 백신접종 방법에 의해 백신접종된 동물에서 유사하였다. EHV-1 함유 백신으로 말을 백신접종하면, EHV-1 및 EHV-4에 대해 고수준의 VN 항체가 생성되었다. 그러므로, EHV-1 함유 백신은 EHV-1에 대해 말을 면역시킬 수 있고, EHV-4에 대해 말을 교차-면역시킬 수 있다. 백신접종에 대한 비정상 반응 또는 주사 부위 반응은 백신접종 후 말에서 관찰되지 않았다.
EHV-1 함유 백신이 EHV-1에 의해 발병되는 호흡기 질환에 대해 말을 보호할 수 있는 능력을 평가하기 위하여, 백신접종된 말에서의 호흡기 질환의 임상적 징후를 EHV-1 KyD주의 독성 바이러스주로 챌린지한 후 백신접종되지 않은 대조군 말에서의 임상적 질환과 비교하였다. EHV-1 함유 백신으로 3차 백신접종한 후 대략 6주째에, 백신접종된 말 및 백신접종되지 않은 대조군 말에 독성 EHV-1를 비내 챌린지하였다. 장액성 및 점액농성의 콧물, 결막염, 기침, 우울증 및 호흡 곤란의 장기간의 에피소드로 이루어진 심각한 호흡기 질환은 독성 EHV-1을 챌린지한 백신접종되지 않은 대조군 말에서 관찰되었다. 대조군 동물과는 달리, EHV-1 호흡기 질환의 임상적 징후의 수, 임상적 징후의 중증도 및 임상적 징후를 나타내는 백신접종 동물의 수는 백신접종된 말에서 유의적으로 감소하였다. 백신접종의 근육내 및 근육내/비내 경로 모두는 EHV-1 감염에 기인한 호흡기 질환의 임상적 징후의 감소에 있어서 유사하였다. 백신접종된 동물에서 임상적 질환의 감소는, 근육내 및 근육내/비내 백신접종된 더 적은 수의 말이 EHV-1 챌린지 후 바이러스를 방출하였고 보다 짧은 기간 동안 바이러스를 방출하였다는 데이터에 의해 지지된다.
본 연구의 결과로 부터, VN 항체를 생성하는 불활성화된 EHV-1을 함유하는 백신이, 근육내 또는 근육내/비내 경로중 하나에 의해 투여되는 경우, EHV-1에 의해 발병되는 호흡기 질환에 대해 말을 보호하기 위한 면역원성이 있다는 것이 입증되었다.
실시예 7
불활성화된 EHV-1 및 EHV-4 균주를 함유하는 면역원성 조성물의 제조
혼합 백신을 제조하기 위해서, 먼저 EHV-1 및 EHV-4의 마스터 시드 배양물을 제조하였다. 이들 마스터 시드로부터, EHV-1 및 EHV-4의 배양물을 각각 성장시킨 다음 불활성화시켰다. 이어서, 불활성화된 바이러스 배양물을 애쥬번트와 혼합하여 혼합 백신을 제조하였다. 불활성화 EHV-1/EHV-4 혼합 백신을 제조하기 위해서 사용된 방법은 아래에 기술되어 있다.
EHV-1 KyA, MSV Lot 001-dil로 명명된 마스터 시드 바이러스 배양 유액으로부터의 불활성화된 EHV-1 KyA를 함유하는 유액을 실시예 1에 기술된 방법에 따라서 제조하였다.
말 헤르페스바이러스 4형 (EHV-4)의 마스터 시드 바이러스를 제조하기 위해 서, 베링거 잉겔하임 베트메디카 사의 연구원은 비염에 감염된 말로부터 바이러스를 분리하였다. 분리된 바이러스를 Vero A139 세포에서 5회 계대배양하고 EVero 세포에서 3회 계대배양하였다. 3번째 계대배양물을 마스터 시드 바이러스로서 사용하였고, EHV-4, MSV Lot 001-dil로 명명되었다.
EHV-4의 배양물을, 0 내지 5 % 혈청을 갖는 최소 필수 배지(MEM)에 함유된 시드 바이러스로 EVero 세포를 감염시켜 제조하였다. 이어서, 배양물을 36℃ ±2℃에서 24 내지 120 시간 동안 유리 롤러 병속 또는 미세담체 비드상에서 항온처리 하였다. 항온처리 동안, 배양물을 EHV-유도된 세포병변 효과(CPE)에 대해 검사하여, EHV주의 순도를 확인하였다. 비전형적인 CPE가 존재하거나 또는 육안 또는 현미경하에 오염의 증거가 존재하는 경우, 당해 배양물을 폐기하였다. 순수한 바이러스 배양물을 무균하에 멸균 유리 카보이(carboy), 멸균 플라스틱 카보이 또는 멸균 스테인레스강 탱크 속에 수거하고, 8 마이크론 이상의 필터를 통해 여과시켜 정화하였다. 수거 후, 바이러스 배양물을, 실시예 1에서 EHV-1에 대해 기술된 방법을 사용하여 사멸된 백신을 제조하기 위하여, 불활성화시켰다.
불화성화 후, 실시예 5에서 기술된 방법을 사용하여 바이러스의 불활성화를 확인하기 위하여 배양물을 EHV의 전형적인 CPE에 대해 시험하였다. 본 작업은, EVero 세포에 대해서 BEI-처리된 바이러스 유액을 통과시키고 모든 바이러스 감염에 대하여 Vero 세포를 검사함으로써 성취되었다. 바이러스 감염이 전혀 보이지 않는 만족스런 불활성화 시험 후, 1.0 M의 나트륨 티오설페이트의 냉(4℃ ±2℃) 용액을 6mM의 최종 농도가 수득되도록 첨가하여, BEI를 중화시켰다.
불활성화 및 EHV-1 및 EHV-4 배양물의 시험 후에, 배양물을 애쥬번트와 혼합하여 최종 생성물, 불활성화된 EHV-1/EHV-4 혼합 백신을 수득하였다. 최종 생성물은 EHV-1 유액, EHV-4 유액, 애쥬번트 원액 (0.5 % CarbopolR 971) 및 염수를 3.75 : 3.00 : 12.00 : 41.19의 비율로 함유하였다. 일반적으로, 하나의 배취가 EHV-1 3.750 ㎖, EHV-4 3,000 ㎖, 애쥬번트 용액 12,000 ㎖, 및 염수 41,190 ㎖를 함유하므로, 총 용적이 60L인 벌크 시리얼이 수득되었다.
실시예 8
EHV-1 및 EHV-4 혼합 백신을 사용한 말의 접종 및 독성 EHV-4를 사용한 후속적 챌린지
본 실험은 수행하여, 불활성화된 EHV-1/EHV-4 백신 배합물의 면역원성을 입증하였다. 4 내지 7개월된 수컷 및 암컷 말의 여섯 그룹 및 EHV-1 및 EHV-4에 대해 중성인 바이러스를 본 실험에서 사용하였다. 아래의 표 Ⅷ-1에서 예시되는 바와 같이, 3 그룹을 독성 EHV-1로 챌린지하고, 다른 3 그룹은 독성 EHV-4로 챌린지하였다. EHV-1로 챌린지한 말중, 한 그룹은 3회의 근육내 ("IM") 주사로 백신접종하고, 한 그룹은 2회 근육내 주사한 후에 1회 비내 ("IN") 투여하여 백신접종하고, 한 그룹은 백신접종하지 않았다. 유사하게, EHV-4로 챌린지된 말중, 한 그룹은 전적으로 근육내 주사로 백신접종하였고, 한 그룹은 2회 근육내 주사한 후에 1회 비내비내여 백신접종하였고, 한 그룹은 백신접종하지 않았다.
말을, 불활성화된 EHV-1의 투여량당 1.0의 PRV 및 불활성화된 EHV-4의 투여당 1.0의 RPV를 갖는 혼합 백신 2 ㎖를 3주 간격으로 투여하여, 백신접종하였다. 시험 중에, 말을 호흡기 질환의 징후에 대해 모니터하였다. 백신접종 기간 동안 어떤 말에서도 호흡기 질환의 임상적 징후가 관찰되지 않았다.
EHV-1/EHV-4 혼합 백신 시험의 요약
그룹 동물 수 백신접종 방법 챌린지
Ⅳ- 1 그룹 10 IM, IM, IM, EHV-1
Ⅳ- 2 그룹 10 IM, IM, IN EHV-1
Ⅳ- 3 그룹 10 없음 (대조군) EHV-1
Ⅳ- 4 그룹 10 IM, IM, IM EHV-4
Ⅳ- 5 그룹 10 IM, IM, IN EHV-4
Ⅳ- 6 그룹 10 없음 (대조군) EHV-4

동물을, 독성 EHV-1 또는 독성 EHV-4중 하나로 백신접종한 후 3주째에 5.0 TCID50 Log10/2 ㎖의 표적 투여량으로 챌린지하였다. 구체적으로, EHV-1 Kentucky D 주 (대락 4.5 TCID50 Log10/2㎖의 투여량) 및 EHV-4 405주 (대략 4.0 TCID50 Log10/2 ㎖의 투여량)를 챌린지 바이러스로서 사용하였고, 2 ㎖ 투여량(콧구멍 당 1 ㎖ 용량이 투여됨)을 비내 투여하였다. 백신의 보호는, 호흡기 질환의 임상적 징후, 예를 들면 발열, 콧물, 결막염, 기침, 호흡 곤란 및 우울증에 관하여 말을 모니터하여 판정하였다. 부가적으로, 혈액 및 비강 샘플은 채취하여 바이러스 방출량을 측정하였다.
바이러스 챌린지 후, EHV-1 또는 EHV-4중 하나로 챌린지된 백신접종된 모든 그룹의 말은 호흡기 질환의 징후에 있어서 유의적 감소를 보여주었으나, 비경구 백신접종 그룹과 비경구/비내 백신접종 그룹 사이에는 거의 차이가 없었다. 구체적으로, 백신접종된 동물은 콧물, 결막염, 기침, 호흡 곤란 및 우울증에 있어서 유의적 감소를 나타내었다. 이러한 결과로 부터, 불활성화된 EHV-1/EHV-4 혼합 백신중에 함유된 EHV-1 및 EHV-4 항원은 비경구 또는 비경구/비내 경로중 하나에 의해서 투여되는 경우 면역원성임이 입증되었다.
백신접종된 말이 호흡기 질환의 감소를 보여주는 것 외에, 백신접종된 말은 또한 바이러스 방출의 감소도 나타내었다. EHV-1로 챌린지한 백신접종된 말중, 1일 내지 3일동안 1 내지 2.5 log10 TCID50/㎖에서의 바이러스 방출이 비경구 백신접종 그룹의 30 % 및 비경구/비내 그룹의 40 %에서만 관찰되었다. 대조적으로, 백신접종되지 않은 대조군의 90 %가 2일 내지 7일 동안 2.5 내지 3.5 log10 TCID50/㎖에서 바이러스를 방출하였다. 유사하게, 독성 EHV-4주로 챌린지한 백신접종된 말중, 1일 내지 3일동안 1 내지 2.5 log10 TCID50/㎖에서의 바이러스 방출이 비경구 백신접종 그룹의 40 % 및 비경구/비내 그룹의 50 %에서만 관찰하였다. 다시, 백신접종되지 않은 말은 훨씬 많은 바이러스의 방출을 나타내었는데, 백신접종되지 않은 대조군 그룹의 100 %가 2일 내지 7일동안 1 내지 5.25 log10 TCID50/㎖에서 바이러스를 방출하였다. 이러한 통계는 백신접종되지 않은 말에 비해 백신접종된 말이 바이러스를 방출하는 양 및 일수에 있어서 유의적 감소가 존재한다는 증거이다. 이러한 증거로 부터, 불활성화된 EHV-1/EHV-4 혼합 백신중에 함유된 EHV-1 및 EHV-4 항원 이 비경구 또는 비경구/비내 경로중 하나에 의해서 투여된 경우 면역원성임이 확립되었다.
실시예 9
EHV-1/EHV-4/말 인플루엔자 혼합 백신을 사용한 말의 접종 및 독성 말 인플루엔자 바이러스를 사용한 후속적 챌린지
본 실험을 수행하여 숙주 동물에서 EIV A1 및 A2 아그룹에 대한 혈청학적 반응을 평가하는 방법으로 EIV 백신 분획의 면역원성을 평가하였다. 또한, 본 연구는 숙주 동물에서의 혈청학적 평가에 의해 비폐렴-인플루엔자 혼합 백신, 사멸된 바이러스중에서 EIV 및 EHV 성분간의 비간섭성을 입증하기 위하여 고안되었다. 세 번째 목표는 인플루엔자 백신 및 비폐렴-인플루엔자 혼합 백신중의 EIV A1 아그룹 및 EIV A2 아그룹이 비경구 및 비경구/비내 경로에 의해서 투여되는 경우 면역원성임을 입증하는 것이었다.
연구 설계
백신 A를 2가지 백신접종 방법으로 말에게 투여하였다. 한가지 백신접종 방법은 3주 간격으로 3회 근육내 백신접종하는 것이었다. 다른 한가지 방법은 3주 간격으로 2회 근육내 백신접종하고 3주 후 비내 경로로 3번째 백신접종을 하는 것이었다. 각각의 백신접종 방법의 그룹은 20 마리의 말을 포함하였다. 5마리의 말 그룹은 백신접종되지 않은 대조군으로서 사용하였다. 혈액 샘플 및 비강 세척물 을, 3개의 EIV 백신주 각각에 대한 혈청학적 반응을 평가하기 위하여 백신접종 전 및 후의 선택적 시기에 채취하였다. 혈액 및 비강 세척물을 주기적 간격으로 말로부터 수집하였다. 말을 63일간의 실험 기간 동안 전반적인 건강, 모든 비정상적 행동 또는 건강 상태에 대해 관찰하였다.
말
7 내지 9개월된 건강한 수컷 및 암컷 말을 선택된 공급원으로부터 구입하였다. 말은 마이크로칩 번호로 확인하였고, 주머니로 부터 말의 인식 번호를 뽑는 방식으로 무작위 그룹으로 나누었다. 실험 기간 동안, 말을 개방 우리에서 사육하고, 말에게 무제한으로 낙농용 알팔라 건초, Sweet 114 사료 보충물, 말의 바이오-미네랄, 및 물을 임의로 공급하였다. 말을 실험 기간 동안 전반적 건강상태 및 머든 비정상적 행동에 대하여 관찰하였다. 비정상적 행동 또는 불리한 건강 상태는 백신접종 후 어떠한 말에서도 관찰되지 않았고, 불리한 주사 부위 반응은 백신접종 후 어떠한 말에서도 관찰되지 않았다. 1차 백신접종 시에, 백신 A로 백신접종된 말은 EIV A1 및 A2 아그룹에 대한 혈구응집 억제반응(HAI) 항체 역가가 10 이하였다.
백신
백신은 EIV A1 아그룹 및 항원적으로 관련된 EIV A2 아그룹 주를 함유하는 EIV 사멸된 바이러스를 포함하였다. 북미에서의 A2 아그룹은 유럽에서의 A2 아그룹과 상이하기 때문에, 백신은, 각각, 북미 및 유럽에서 A2 아그룹으로 대표되는, Kentucky/95 및 Newmarket/2/93로 명명된 바이러스주를 함유하였다. 당해 백신에 사용하기 위한 EIV 및 EHV 바이러스 유액을 실시예 7에서 기술된 방법에 따라서 제조하였다. 바이러스 유액은 마스터 시드 바이러스로부터 5번째 계대된 것이며 마스터 세포 스톡으로 부터 20번째 계대한 세포에서 제조되었다. 백신 A는, 2㎖ 투여량 당 EIV A2 아그룹의 64 HA 단위, 두 개의 EHV A2 아그룹 각각의 128 HA 단위, EHV-1의 3.0 이상의 상대적 역가(RP) 단위, 및 EHV-4의 3.0 이상의 상대적 역가(RP) 단위가 포함되도록 제형화되었다. 백신을 EIV/EHV Imm/Intfr, 623-0856-98E-107, Vaccine A Lot 001, 12-15-98로 명명하였다.
백신 A의 EIV 및 EHV 분획의 역가 측정
백신중의 EIV 분획의 역가를 프로토콜[National Veterinary Services Laboratories Testing Protocol, Supplemental Assay Method for Conducting the Hemagglutination Inhibition Assay for Equine Influenza Antibody (MVSAM0124.01, 1998. 10. 2)]를 사용하여 측정하였다. 백신 A중의 EHV-1 및 EHV-4 분획의 상대적 역가 값은 실시예 4에 기술된 EHV ELISA 역가 방출 분석에 의해서 측정하였다. 백신 A의 역가는 EIV 분획에 대해서 만족스러웠다. 10마리의 기니아 피그는 A1 아그룹에 대해 80 이상의 HAI 항체 역가를 가졌고, 10 마리의 기니아 피그 는 백신중의 각각의 A2 아그룹에 대해 40 이상의 HAI 항체 역가를 가졌다. 상대적역가 값은 EHV-1 및 EHV-4 분획 각각에 대해 4.73 및 3.31 이었다.
백신접종 후 EIV A1 및 A2 아그룹에 대한 혈청 HAI 항체 역가
백신 A로 백신접종 후 말에서 HAI 항체 역가를 측정하였다. 모든 백신접종 동물은 1차 백신접종 시에 3개의 모든 EIV 바이러스주에 대해 음성혈청반응을 나타내었다. 백신접종 전 시기에, 백신접종되지 않은 대조군 말중 두 마리는 EIV A1에 대해 20의 HAI 항체 역가를 가지고, 다른 세 마리의 대조군 말은 EIV A1에 대해 음성혈청반응을 나타내었다. 5마리의 백신접종되지 않은 대조군 말 모두는 두 개의 EIV A2에 대해 음성혈청반응을 나타내었다. 실험 기간 동안, 백신접종되지 않은 대조군 말은 두 개의 EIV A2 아그룹에 대해서 음성혈청반응 상태를 유지하였고, EIV A1 아그룹에 대한 HAI 항체 역가에 있어서 두 배 이상의 변이를 나타내지 않았다. 실험 기간 동안 야생 EIV에 노출된 징후는 없었다. 1차 백신접종 후 3주째에, 대부분의 말은 EIV A1 아그룹 및 EIV A2 NM 아그룹에 대한 혈청학적 반응을 나타내었다. 1회 백신접종 후, 4 마리의 말만 EIV A2 K 아그룹에 대한 혈청학적 반응을 나타내었다. EIV A2 K 아그룹에 대한 혈청학적 반응을 나타내는 말의 수는 2차 백신접종 후에 증가하였다. 3차 백신접종 후, 근육내 백신접종한 20 마리의 말 중 19 마리(95 %)가 EIV A1 아그룹에 대해 40 이상의 HAI 항체 역가를 나타내었다. 3회의 근육내 주사 후, 20 마리의 말 중 18 마리(90 %) 및 20 마리의 말 중 20 마리(100 %)가 EIV A2 K 아그룹 및 EIV A2 NM 아그룹에 대해, 각각, 20 이상의 HAI 항체 역가를 나타내었다. 유사하게, 2회 근육내 백신접종하고 1회 비내 백신접종한 20 마리의 말 중 17 마리(85 %)가 EIV A1 아그룹에 대한 40 이상의 HAI 항체 역가를 나타내었다. 2회의 근육내 백신접종 및 1회의 비내 백신접종 후, 20 마리의 말 중 18 마리(90 %) 및 20 마리의 말 중 20 마리(100 %)가 EIV A2 K 아그룹 및 EIV A2 NM 아그룹에 대해, 각각, 20 이상의 HAI 항체 역가를 나타내었다. 3번째 백신접종 후 기하학적 평균 항체 역가는 3회 근육내 백신접종힌 말에서, EIV A1, A2 K 및 A2 NM 아그룹 각각에 대해서 45, 35 및 61이었다. 2회 근육내 백신접종하고 1회 비내 백신접종한 말에서 기하학적 평균 항체 역가는 EIV A1, A2 K 및 A2 NM 아그룹 각각에 대해서 39, 24 및 51이었다.
백신접종 후 EIV A1 및 A2 아그룹에 대한 점막의 HAI 항체 역가
백신 A로 백신접종한 후 말의 비강 샘플에서 HAI 항체 역가를 측정하였다. 1차백신접종 시에, 두 개의 EIV A2 아그룹에 대한 AHI 항체는 말의 비강 샘플중에서 전혀 검출되지 않았다. EIV A1 아그룹에 대한 혈구응집 억제반응 역가는 1차 백신접종시 백신접종된 말 및 백신접종되지 않은 대조군 말의 일부에서 검출되었다. 1차 및 2차 백신접종 후, 콧물에서의 HAI 항체의 수준은 다양하였다. 최종 근육내 또는 비내 백신접종 후, HAI 항체 수준은 두 개의 A2 아그룹에 비해 EIV A1 아그룹에서 최고였다. 근육내 또는 비내 경로중 하나에 의한 3번째 백신접종후 말의 비강 샘플에서 EIV A2 K 아그룹에 대한 HAI 항체는 거의 없거나 전혀 없었다. 흥미롭게도, EIV A1 아그룹 및 A2 NM 아그룹에 대한 HAI 항체 수준은 비내 경로에 의한 3번째 백신접종을 받은 말에서 보다 낮았다.
토의
본 연구의 목적은, 각각의 백신접종 방법에 의한 투여시, 백신중의 EIV A1 및 A2 분획의 면역원성을 입증하기 위한 것이었다. 면역원성은 최종 백신접종 후 3개의 EIV주에 대한 혈청 HAI 항체 반응의 측정에 의해 평가되었다. 당해 결과로 부터, 모든 백신접종 방법의 그룹의 말중 80 % 이상이 최종 백신접종 후 EIV A1 아그룹에 대해 40 이상의 혈청 HAI 항체 역가를 나타내고, 모든 백신접종 방법의 그룹의 말중 80 % 이상이 최종 백신접종 후 EIV A2 아그룹 모두에 대해 20 이상의 혈청 HAI 항체 역가를 나타내었다. 또한, EIV A1 및 A2 아그룹에 대한 HAI 항체 수준은 백신접종 후 선택된 시기에 비강 샘플에서 측정되었다. 점막의 HAI 항체 역가는 모든 백신접종 방법의 말로 부터 수득된 비강 샘플에서 혈청 HAI 항체 역가보다 낮았고, 혈청 HAI 역가와 대조적으로, 점막의 HAI 역가는 각 백신접종 후 거의 증가하지 않았다. 혈구응집 억제반응 검정법이 비강 샘플에서 가장 우세한 항체의 이소형을 검출할 수 없다는 것이 가능하다. 본 실험으로 부터, 인플루엔자 백신, 사멸된 바이러스 및 비폐렴-인플루엔자 백신, 사멸된 바이러스중에서 EIV A1 아그룹 및 A2 아그룹이, 비경구 및 비경구/비내 경로 모두에 의해서 투여되는 경우, 면역원성임이 입증되었다. 특히, 본 연구로 부터, EIV NM/77 A1 아그룹 및 K95 A2 아그룹 및 NM/2/93 A2 아그룹이 면역원성임이 입증되었다.
본 실험의 다른 목적은 EIV 및 EHV 백신 분획이 서로 비간섭성임을 입증하는 것이었다. 본 실험에서 사용된 백신 A는, EIV A1 및 A2 분획 각각에 대해 64 및 128 HA의 최소 방출 용량으로 제형화되었고, EHV-1 및 EHV-4 분획에 대해 3배 이상의 상대적 역가 값을 갖도록 제형화되었다. 본 실험의 결과로 부터, 최소 EHV 항원 용량보다 EIV 분획의 최소 항원 용량을 함유하는 백신은 숙주 동물에서 EIV A1 및 A2 아그룹에 대해 만족스러운 혈청학적 반응을 나타낼 수 있다는 것이 입증되었. 그러므로, EHV-1 및 EHV-4 분획은 EIV 백신 분획의 면역원성을 간섭하지 않았다. 마찬가지로, EHV 분획은 기니아 피그 모델에서 불만족스러운 역가 시험을 초래하지 않았다.
본 실험은 다양하고 구체적이며 예시적인 태양 및 기술을 참고로 하여 기술되어졌다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위를 유지하면서 많은 변형 및 변경이 가해질 수 있음이 이해되어져야 한다. 각종 태양은 본원에서 보다 상세히 논의되었으며, 본 발명은 구체적 상황에서의 다양하게 구현될 수 있는 발명적 개념을 제공한다고 여겨져야 한다. 본원에서 논의되는 구체적 태양은 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하고 사용하는 구체적 방법을 단지 설명하는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 예시적인 태양의 다양한 변형 및 조합뿐 아니라 본 발명의 다른 태양은 본원의 기술내용을 참조하여 당업자에게 명백할 것이다.
Figure 112003034811127-pct00001

Claims (36)

  1. 화학적으로 불활성화된 말 헤르페스바이러스(EHV)-1 켄터키(Kentucky) A (KyA) 바이러스; 및
    가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체를 포함하는 애쥬번트
    를 포함하는, EHV-1, EHV-4 또는 이의 배합물과 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 백신.
  2. 제1항에 있어서, EHV-1 KyA 바이러스가 에틸렌이민, 이원 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물을 포함하는 화학적 불활성화제로 처리함으로써 화학적으로 불활성화된 백신.
  3. 제2항에 있어서, EHV-1 KyA 바이러스가 이원 에틸렌이민으로 처리함으로써 화학적으로 불활성화된 백신.
  4. 제1항에 있어서, 불활성화된 EHV-4를 추가로 포함하는 백신.
  5. 제1항에 있어서, 불활성화된 말 인플루엔자 바이러스 (EIV)를 추가로 포함하는 백신.
  6. 제5항에 있어서, 불활성화된 말 인플루엔자 바이러스 (EIV)가 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A1을 포함하는 백신.
  7. 제6항에 있어서, 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A1이 불활성화된 EIV Al 바이러스주 A/EQl/Newmarket/77을 포함하는 백신.
  8. 제5항에 있어서, 불활성화된 말 인플루엔자 바이러스 (EIV)가 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A2를 포함하는 백신.
  9. 제8항에 있어서, 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A2가 불활성화된 EIV A2 바이러스주 Newmarket/2/93, 불활성화된 EIV A2 바이러스주 Kentucky/95 또는 이의 혼합물을 포함하는 백신.
  10. 제5항에 있어서, 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 Al 및 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A2를 포함하는 백신.
  11. 제10항에 있어서, 불활성화된 EIV Al 바이러스주 A/EQ1/Newmarket/77, 불활성화된 EIV A2 바이러스주 Newmarket/2/93, 및 불활성화된 EIV A2 바이러스주 Kentucky/95을 포함하는 백신.
  12. 제1항에 있어서, EHV-1 및 EHV-4에 대해 말을 보호할 수 있는 백신.
  13. 제1항에 있어서, 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체가 가교된 아크릴산 중합체를 포함하는 백신.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 에틸렌이민, 이원 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이의 혼합물을 포함하는 화학적 불활성화제로 처리함으로써 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스; 및
    가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체를 포함하는 생체흡착성 애쥬번트
    를 포함하는, EHV-1, EHV-4 또는 이의 배합물과 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 백신.
  17. 제16항에 있어서, 화학적 불활성화제가 이원 에틸렌이민을 포함하는 백신.
  18. 삭제
  19. 제1항에 있어서,
    화학적으로 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스; 및
    pH 7.5의 0.5중량% 수용액으로서 20rpm에서 측정시 점도가 4,000 내지 11,000cPs인 가교된 아크릴산 중합체를 포함하는 애쥬번트
    를 포함하는, EHV-1, EHV-4 또는 이의 배합물과 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 백신.
  20. 삭제
  21. 화학적으로 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스 및 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체를 포함하는 애쥬번트를 포함하는 백신을 말에게 투여함을 포함하여, EHV-1, EHV-4 또는 이의 배합물과 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 위한 방법.
  22. 제21항에 있어서, 말에 대한 백신의 투여가 백신의 비경구 투여 및 백신의 비내 투여를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 말에 대한 백신의 투여가 제1단계에서 1회 이상의 백신의 비경구 투여 및 후속 단계에서 백신의 비내 투여를 포함하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 백신이 불활성화된 EHV-4를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 백신이 불활성화된 말 인플루엔자 바이러스를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 백신이 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A1 및 불활성화된 EIV 바이러스 아유형 A2를 포함하는 방법.
  27. (a) 원숭이 세포를 EHV-1 KyA 바이러스로 접종하는 단계;
    (b) 접종된 원숭이 세포를 항온처리하는 단계;
    (c) 항온처리된 세포로 부터 EHV-1 KyA 바이러스를 수거하는 단계;
    (d) 수거된 세포를, 에틸렌이민, 이원 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 또는 이의 혼합물을 포함하는 화학적 불활성화제로 처리하여 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스를 생성시키는 단계; 및
    (e) 가교된 아크릴산 중합체를 포함하는 애쥬번트를 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스에 첨가하는 단계
    를 포함하여, 말 헤르페스바이러스 백신을 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 원숭이 세포가 Vero 세포인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 화학적 불활성화제가 이원 에틸렌이민을 포함하는 방법.
  30. 삭제
  31. (1) 백신을 말에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    (2) 화학적으로 불활성화된 EHV-1 KyA 바이러스; 및 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체를 포함하는 애쥬번트를 포함하는 EHV-1, EHV-4 또는 이의 배합물과 관련있는 질환에 대해 말을 보호하기 조성물
    을 함께 포함하는 키트.
  32. 제31항에 있어서, 디스펜서가 이의 내용물을 소적으로서 분배할 수 있고; 조성물이 비내 투여되는 경우 EHV-1, EHV-4 또는 이의 배합물과 관련있는 질환에 대해 말을 보호할 수 있는 키트.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
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