KR20030065556A

KR20030065556A - 개선된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신

Info

Publication number: KR20030065556A
Application number: KR10-2003-7008293A
Authority: KR
Inventors: 추흐시엔-주(스티브); 리우민; 쉬즈창
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2003-08-06
Also published as: KR100874119B1; US7666439B2; PL211174B1; DE60127994T2; US20100119471A1; PL363220A1; EP1343525B1; BR0116249A; CN1296095C; HRP20030585B1; AU2899302A; ZA200305545B; HUP0400687A2; BRPI0116249B1; ATE359813T1; PT1343525E; US20120213816A1; ME00570B; CN1489472A; WO2002049666A3

Abstract

본 발명은 개선된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신 조성물을 제공하는 것이고 이것은 1회 투여한 후 감염에 대한 면역을 유리하게 제공한다. 조성물은 불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 및 보조제 혼합물을 포함하고 이들의 공동 작용으로 1회 투여 후 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염에 대한 면역을 제공하여 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린에 특이적인 면역 반응을 유발하며 이러한 면역은 세포 매개 면역 및 국부(분비 IgA) 면역을 포함한다. 바람직한 양태에서, 보조제 혼합물은 아크릴산 중합체, 가장 바람직하게는 카보폴, 및 대사가능한 오일(예를 들어, 하나 이상의 불포화 테르펜 탄화수소, 바람직하게는 스쿠알렌 또는 스쿠알란)과 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체(예를 들어, 플루로닉^R)의 혼합물을 포함한다. 백신 조성물은 임의로 방부제, 바람직하게는 티메로솔 및/또는 EDTA를 함유할 수 있다.

Description

개선된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신{Improved Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine}

마이코플라스마 하이오뉴모니애는 돼지 마이코플라스마성 폐렴의 병인 제제이다. 당해 질환은 체중 증가를 감소시키고 사료 공급 효율성을 저하시켜 돼지 가축 산업에 경제적 손실의 주요 원인이다. 당해 질환은 만성 감기, 둔탁한 모피, 성장의 지연 및 몇주 지속적인 비경제적인 체형을 야기시킨다. 특히, 복부 선단 및 심장엽에서 심홍색 내지 회색 공동 영역의 특징적인 병변이 감염된 동물에서 관찰된다. 당해 질환의 치사율은 낮지만 감염된 돼지는 흔히 기회주의적 병원균에의해 2차 감염되는 경향이 있어 결국 사망하거나 스트레스가 된다. 경제적 손실만 해도 연간 2억 내지 2억 5천만 달러에 달한다.

마이코플라스마 하이오뉴모니애는 증식이 느리고 세포벽이 없는 배양하기 어려운 세균이다. 이것은 흔히, 호흡계로부터 분리하기가 어려운데 그 이유는 호흡계에 또한 위치하는 일반적인 2차 감염균인 마이코플라스마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis)때문이다. 당해 질환은 기침에 의해 생성된 에어로졸 및 감염되었거나 회복기의 보균 돼지와의 직접적인 접촉에 의해 전염된다. 감염된 동물과 감염되지 않은 동물의 동반 수용은 조기에 및 자주 재감염을 일으킨다. 흔히 감염은 보균 암퇘지의 분만에 의한 새끼 돼지의 감염으로 개시된다. 무리의 관리 기술로 인해 생존 후반때까지 감염이 명백하지 않을 수 있다. 보통 추가의 감염은 돼지가 무리를 지어 있을때 이유(weaning)시킨 후에 관찰된다. 명백한 질환은 보통 생후 6주 또는 그 이상되었을때 돼지에서 관찰된다. 성장 속도 및 사료 전환 속도가 감염된 동물에서 현저하게 감소된다. 항생제를 사용한 치료는 비싸고 지속적인 사용을 요구한다. 재감염이 또한 문제이다. 현재 감염 및 이에 의한 영향력을 회피하기 위해 가장 효과적인 방법은 백신이다.

제조원[Fort Dodge Animal Health(FDAH)]은 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 임상적 증후로부터 건강한 돼지를 보호하기 위한 백신으로서 사용하기 위해, 상표명[Suvaxyn^RRespifend^RMH]하에 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 시판하고 있다. 백신은 보조제로서 카보폴을 함유하고 생후 1주일 이상된 돼지에게2회 투여용 백신으로서 추천되고 두번째 투여는 첫번째 백신화한지 2주 내지 3주째에 수행한다. 그러나 2회 투여용 백신은 질환에 대해 완전한 보호를 제공하기 위해서는 동물을 2번 취급해야 하는 명백한 단점을 갖고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 백신을 1회 투여하여 보호 면역을 유도하고 당해 유기체에 의한 질환을 예방하는, 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 효과적인 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염 및 질환에 대해 돼지에 사용하기에 적합하고 또 다른 박테린 및/또는 독소와 배합되어 사용될 수 있는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 박테린의 면역원성을 증진시켜 백신 1회 투여로 보호 면역을 유도하는 보조제를 사용함에 의해, 원인 유기체가 마이코플라스마 하이오뉴모니애인 질환을 예방하거나 개선하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적 및 특징은 하기에 제공된 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

발명의 요약

본 발명은 불성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역량; 아크릴산 중합체 및 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 보조제 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염에 대해 동물을 면역화시키기 위한 백신 조성물에 관한 것이고 당해 백신 조성물은 1회 투여로서 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호 면역을 유도한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 보조제 혼합물과 배합된 불활성화된 마이 코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 및 약제학적으로 허용되는 안정화제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염에 대해 동물을 면역화하기 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것이다. 보조제는 일반적으로 백신 조성물중에서 최종 농도가 약 1 내지 25%(v/v)이고 바람직하게는 약 5 내지 12%(v/v)이다. 조성물은 또한 하나 이상의 병원균(예를 들어, 해몬필러스 파라수이스(Haemonphilus parasuis), 파스테렐라 멀티오시다(Pasteurella multiocida), 스트렙토코컴 수이스(Streptococcum suis), 액티노바시러스 플레로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis) 및 렙토스피라(leptospira)) 기원의 불활성화된 박테린 또는 정제된 독소를 포함하여, 기타 백신 성분을 포함할 수 있고 근육내, 피하, 경구, 에어로졸 또는 비강 경로로 투여될 수 있다.

여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 및 보조제 혼합물을 포함하는 당해 백신의 1회 투여량을 투여하여 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 질환에 대해 동물을 보호하는 방법을 제공한다.

본 출원은, 참조로서 본원에 인용된 2000년 12월 19일자로 출원된 공계류중인 가출원 번호 제60/256,637호의 우선권을 주장한다.

본 발명은 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)에 대한 보호 면역을 유도하기 위한 개선된 방법에 관한 것으로서 특히, 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 감염에 대한 감수성 동물을 1회 투여로 면역화시키는 유효량으로 불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 사용한다.

본원에 인용된 모든 특허, 특허원 및 기타 문헌은 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 인용된다. 일치하지 않는 경우에, 본원의 기재가 신빙성이 있다.

본원에 사용된 바와같은 "박테린"은 불활성화되고 특정 보조제와 배합되어 동물에게 투여되는 경우 질환 또는 감염을 예방하기 위해 보호 면역을 유도할 수 있는 세균 수거물이다.

"보조제"는 면역원성을 증진시키고 백신 조성물중의 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 효능을 증진시키는 하나 이상의 물질로 이루어진 조성물을 의미한다.

본원 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같이, 용어 MHDCE는 마이코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 상당물을 나타낸다.

"면역량"은 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 면역을 제공할 박테린의 양이다. "면역량"은 종, 품종, 나이, 크기, 건강 상태 및 동물이 이전에 동일한 유기체에 대해 백신을 투여받았는지의 여부에 의존한다.

본 발명은 1회 투여 면역화를 위해 적합한 마이코플라스마 뉴모니애에 대한 백신을 제공한다. 본 발명의 백신은 박테린의 면역원성을 증진시켜 1회 투여로도 보호 면역을 유도하는 보조제 혼합물을 포함한다.

백신은 당해 기술 분야의 표준 방법[예를 들어, 미국 특허 제5,338,543호 또는 미국 특허 제5,565,205호 및 하기 실시예 2에 기재된 방법]에 의해 새롭게 수거된 배양물로부터 제조된다. 즉, 유기체는 PPLO(플레로뉴모니애와 같은 유기체) 완전 배지[Difco. Laboratories]와 같은 배양 배지에서 증식시킬 수 있다. 유기체의증식은 색 변화 단위(CCU)를 측정하는 것과 같은 표준 기술로 모니터하고 충분히 높은 역가가 성취된 경우 수거된다. 스톡은 제형화를 위해 백신에 포함되기 전에 통상적인 방법에 의해 추가로 농축되거나 동결건조시킬 수 있다. 문헌[참조:Thomas, et al., Agri-Practice, Vol. 7 No. 5, pp. 26-30]에 기재된 기타 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 백신은 보조제 혼합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된 불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 포함한다. 사용하기에 적합한 담체는 수성 매질, 예를 들어, 식염수, 인산 완충 식염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액의 MEM을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 보조제 혼합물은 면역 반응을 증진시키고 대사가능한 오일, 예를 들어, 불포화된 테르펜 탄화수소 또는 이의 수소화 생성물, 바람직하게는 스쿠알란(2,3,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산) 또는 스쿠알렌 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물과 혼합된 아크릴산 중합체의 혼합물을 포함한다. 당해 아크릴산 중합체는 단독중합체 또는 공중합체일 수 있다. 아크릴산 중합체는 바람직하게 카보머이다. 카보머는 카보폴(Carbopol)의 상표명 하에 시판되고 있다. 아크릴산 중합체는 예를 들어, 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제2,909,462호 및 제3,790,665호에 기재되어 있다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체는 계면활성제, 바람직하게, 고체 및 액체 성분의 현탁을 보조하는 액체 계면활성제이다. 계면활성제는 플루로닉(Pluronic)^R의 상표명하에 중합체로서 시판되고 있다. 바람직한 계면활성제는 플루로닉^RL121의 상표명하에 시판되고 있는 폴록사머(poloxamer) 401이다.

면역학적 자극 보조제 혼합물은 본 발명의 백신 조성물중에 약 1% 내지 25%, 바람직하게는 약 2% 내지 15%, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 12% v/v의 양으로 존재한다. 사용되는 보조제 혼합물의 양과 보조제중 2개의 성분의 비율은 기타 박테린 또는 정제된 독소가 첨가되었는지의 여부에 따라 다양할 수 있다. 보조제 혼합물은 일반적으로 수성 매질중에 에멀젼으로서 제형화된 대사가능한 오일, 아크릴산 중합체 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체를 포함한다

당해 보조제 혼합물에 존재하는 대사가능한 오일 및 아크릴산 중합체의 범위는 각각 약 10 내지 150ml/L 및 약 0.5 내지 10g/L의 양일 수 있다. 보조제 혼합물의 바람직한 양태에서, 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 성분의 혼합물은 스쿠알란 및 플루로닉^RL121(폴록사머 401)(이것은 약 50 내지 100ml/L의 양으로 존재할 수 있다)의 혼합물이고 카복시메틸렌 중합체는 약 2ml/L의 양으로 존재할 수 있는 카보폴 934P(카바머(Carbamer)934P)이다. 통상적으로, 보조제 혼합물은 약 1:25 내지 1:50의 비율로 아크릴산 중합체 대 대사 가능한 오일/폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체 혼합물을 포함한다.

바람직한 아크릴산 중합체는 폴리알릴슈크로스와 가교 결합된 아크릴산의 중합체이고 화학식이 CH₂CHOOOH)_n인 카보폴 934 P NF 및 941NF로서, 제조원[B.FGoodrich]에서 시판된다. 이들 중합체는 수성 담체와 적합하게 제형화하는 수성 겔을 형성한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체는 플루로닉^RL121, L61, L81 또는 L101로서 BASF에 의해 시판되는 비이온성 계면활성제이다

본 발명의 백신은 근육내, 피하, 비강내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 백신은 일반적으로 수중유 에멀젼 형태로서 불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애, 대사 가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체 및 아크릴산 중합체를 함유한다. 백신은 바람직하게 0.5 내지 10g/L의 농도 범위로 아크릴산 중합체를 함유한다. 백신은 바람직하게 2 내지 6ml/L의 농도 범위로 대사가능한 오일을 함유한다. 백신은 바람직하게 1 내지 3ml/L의 농도 범위로 폴리옥시에틸렌-프로필렌 블록 공중합체를 함유한다.

1회 용량 투여를 위해, 백신은 바람직하게 약 1 x 10⁸내지 3 x 10¹¹MHDCE/ml, 바람직하게는 약 1 x 10⁹내지 3 x 10⁹MHDCE/ml에 상응하는 양으로 마이코플라스마 뉴모니애 박테린을 함유해야만 한다. 약 1 내지 5ml, 바람직하게는 2ml이 동물에 근육내, 피하내 또는 복막내로 투여될 수 있다. 1 내지 10ml, 바람직하게는 2 내지 5ml이 경구 또는 비강내로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위한 것이지 이의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린

백신 조성물의 제조

바이러스 스톡에 대한 기재. 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 용이하게 접근가능한 다수의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 한 양태에서, 마이코플라스마 하이오뉴모니애 균주 P-5722-3을 사용할 수 있다. 배양물은 암스트롱 씨(Armstrong C.)(Purdue University, West Lafayette, Indiana)로부터 구입하였다. 마이코플라스마 하이오뉴모니애 배양물을 입수한 후 마이코플라스마 하이오뉴모니애 액체 배양물중에서 7회 계대하여 마스터 씨드(Master Seed)를 확립하였다.

세포 배양. 마이코플라스마 하이오뉴모니애를, 박토 PPLO 분말, 효모 추출물, 글루코스, L-시스테인 하이드로클로라이드, 앰피실린, 탈륨 아세테이트, 페놀 레드, 소포제, 정상적인 멸균 돼지 혈청 및 물을 포함하는 배지에서 18 내지 144시간에 걸친 기간동안 증식시킨다. 불활성화를 위해, 이원 에틸렌이민(BEI)를 발효 용기내 생산 배양물에 직접 첨가한다. pH를 7.4로 조정하고 이어서 통상적인 방법에 따라 수거하여 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 수득한다.

백신 조성물의 제조

방부제의 조성 및 사용되는 비율. 수거된 박테린은 티메로살 및 에틸렌 디아미네테 테트라-아세트산, 사나트륨염(EDTA)을 각각 0.01% 및 0.07% 이하로 첨가하여 보존시킨다. 앰피실린 U.S.P.는 증식 배지에 0.250g/l로 존재한다. 잔여 앰피실린의 농도는 최종 생성물중에 수거된 유체의 용적에 따라 다양할 것이고 완료된생성물중의 잔여 앰피실린 농도는 30㎍/ml을 초과하지 않는다.

생성물의 표준화 . 마이코플라스마 농도를 DNA 형광측정 분석으로 정량한다.

하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체의 혼합물, 예를 들어, 스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물을, 1000ml로 적정되는 900mL의 정제수중에 염화나트륨 10g, 염화칼륨 0.25g, 이염기성 인산나트륨 2.72, 일염기성 인산칼륨 0.25, 플루로닉 L121(BASF Corporation) 20ml, 스쿠알란(Kodak) 40ml, 트윈 80 3.2ml을 용해시켜 제조한다. 혼합 후, 성분들을 고온고압살균(autoclaving)한다. 이어서 혼합물을 안정한 에멀젼이 형성될 때까지 균질화한다. 최종 농도가 0.2%가 되도록 포르말린을 첨가하거나 최종 농도가 1:10,000이 되도록 티메로살을 첨가할 수 있다.

시리얼을 제조하기 위한 단위의 어셈블리 . 만족할만한 마이코플라스마 하이오뉴모니애 농축물을 무균적으로 보조제, 방부제 및 희석제와 배합하여 교반기를 장착한 멸균 컨테이너에 첨가하고 30분 이상동안 혼합한다.

1,000,000 용량(각각 2mL)에 대한 양: %vol/vol

마이코플라스마 농축물(> 1.0 x 10¹⁰MHDCE/mL	400,000 mL	20.0
스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물	100,000 mL	5.0
카보폴(수중 2% w/v)	200,000 ml	10.0
수중의 티메로살 용액 1% w/v 및 EDTA(사나트륨 염) 7 w/v%	18,000 ml	0.9
멸균 식염수	1,282,000 ml	64.1

시리얼의 pH를 7.0 ±0.2로 조정한다.

MHDCE = 마이코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 상당물

최종 컨테이너의 충전 및 밀봉 방법 및 기술 .

생성물 전체를 멸균된 200 내지 500 마이크론 필터 장치로 여과하고 9 CFR 114.6에 명시된 조건하에 충전 작업을 위해 지정된 장소에서 멸균 최종 컨테이너에 충전한다. 유리 또는 플라스틱 컨테이너를 고무 마개로 폐쇄하고 알루미늄 밀봉재로 주름지게 하여 밀봉한다. 각각 2.0ml 용량은 마이코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 상당물 2 x 10⁹이상을 함유한다.

효능 시험 . 완제품의 벌크 또는 최종 컨테이너 샘플은 하기와 같이 효능 시험할 수 있다:

효능 시험을 위한 분석 방법: 공급원[Harlan Sprague Dawley 또는 기타 허가된 공급업체]으로부터 구입한 하나로 탁송된 생후 6주 내지 7주의 ICR 암컷 마우스를 사용한다. 미지의 박테린 및 표준 박테린 각각으로 면역화하는데 최소 20마리의 마우스가 요구된다. 비접종 대조군으로서 최소 5마리의 마우스가 유지된다. 시험 및 표준 박테린을 각각 완전히 혼합한다. 5/8인치의 바늘이 장착된 25-게이지의 멸균된 1회용 주사기를 사용하여 마우스의 서혜 영역의 피하내로 숙주 동물 용량의 10분의 1(0.2ml)을 사용하여 접종한다. 각각의 마우스 그룹을 개개의 단위로서 수용하고 14일동안 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 한다. 이어서 각각의 마우스를 마취시킨다. 마취된 마우스를 뒤집어 위치시킨다. 한 손을 사용하여 머리를 누르고 하나의 앞다리를 몸으로부터 잡아당긴다. 외과용 메스를 사용하여 잡아당긴 앞다리와 흉부사이에 약 1/2 인치의 길이로 피부를 절개하고 상완 동맥을 절단한다. 바늘이 없는 3.0ml의 주사기를 사용하여 절개 부위에 모인 혈액을 수거한다. 혈액을 표지된 시험 튜브에 넣고 응고시킨다. 응고된 튜브를 1,000 x g에서 원심분리하여 응고체로부터 혈청을 분리한다. 각각의 혈청을 시험될때까지 -20℃ 이하로 냉각시켜 저장한다.

혈청학적 검사 : ELISA 방법을 사용하여 표준 박테린 및/또는 미지의 박테린에 대한 마우스의 항체 반응을 측정한다. ELISA 방법은 제조원[Dynatech]의 1회용 임뮬론 II 평저(Disposable Immulon II Flat-Bottom) 미세역가 플레이트 또는 이의 유사 기구 및 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 수행한다.

시험 시약:

인산 완충 식염수-트윈(PBST)(pH는 5N NaOH 또는 5N HCl을 사용하여 7.2 내지 7.4로 조정함)

리터당 양

성분	리터
NaCl	8.50g
NaH₂PO₄	0.22g
Na₂HPO₄	1.19g
트윈-20	0.50ml
충분량의 탈이온수	1,000.00ml

글라이신 완충 식염수(GBS)(pH는 5N NaOH 또는 5N HCl을 사용하여 9.5 내지 9.7로 조정됨)

성분	리터당 양
글라이신	0.75g
NaCl	8.50g
충분량의 탈이온수	1,000.00ml

포지티브 대조군 혈청: 포지티브 대조군 혈청은 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린으로 백신화된 마우스 기원 혈청의 풀이다.

결합체 및 기질

친화적으로 정제된 항 마우스 IgG 퍼옥시다제 표지된 결합체를 공급원[Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.(카탈로그 번호. 074-1802)]로부터 구입한다. 결합체의 최적의 희석액을 결정하기 위한 과정은 하기에 상세히 설명한다. 퍼옥시다제 기질 용액(ABTS)는 공급원[Kirkegaard and Perry, Inc.]으로부터 구입한다.

결합체의 적정: 임뮬론 II 평저 플레이트를 웰당 100㎕로 10mM GBS중에 희석된 mL당 20㎍의 마이코플라스마 하이오뉴모니애 완전한 세포 항원으로 피복한다. 플레이트를 1시간 이상 37℃+2℃에서 항온처리하고 18시간 내지 1주일 동안 2 내지 7℃로 이전한다. 사용하기 전에, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 각 세척 사이에 1분동안 적시고 털어서 건조시킨다. PBST중의 양성 대조군 혈청의 1:40 희석액을 제조하고 희석된 포지티브 혈청(웰당 100㎕)을 플레이트내 절반의 웰에 첨가한다. PBST를 나머지 절반의 웰에 첨가한다. 플레이트를 1시간동안 실온에서 항온처리함에 이어서 플레이트를 3회 세척한다. 결합된 혈청을 PBST로 2배 희석하고 1:100 희석으로 시작하여 최종적으로 1:10,240까지 희석한다. 각각의 결합체 희석액 100㎕를 포지티브 혈청의 4개의 웰 및 PBST의 4개의 웰에 첨가하고 실온에서 30분동안 반응시킨다. 플레이트를 4회 세척하고 퍼옥시다제 기질 용액(abts) 100㎕를 웰당 첨가한다. 플레이트를 Tλ=450으로 설정된 이중파장에서 판독한다. PBST 대조군의 값을 포지티브 대조군 혈청 값으로부터 공제하는 경우 포지티브 대조군 혈청에 대한 판독이 0.850 내지 1.050인 결합체의 희석액을 선택한다.

시험 항원:

마이코플라스마 하이오뉴모니애 항원은 전체 세포에 대한 제제이고 공급원[Fort Dodge Animal Heath]으로부터 공급된다.

ELISA는 하기와 같이 수행한다: 제조원[Dynatech]의 임뮬론 II 평저 미세역가 플레이트를 사용한다. 동결건조된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 전체 세포 항원이 있는 하나의 바이엘에 글라이신 완충 식염수(GBS)을 10ml까지 채운다. 재구성된 마이코플라스마 단백질의 농도는 20㎍/ml이다. 이어서 희석된 항원 100㎕(2㎍)을 플레이트의 모든 웰에 첨가한다. 플레이트를 1시간 이상동안 37℃ ±2℃에서 항온처리함에 이어서 최소 18시간 내지 최대 1주일동안 2 내지 7℃로 이전한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 각 세척간에 1분동안 적시고 이어서 털어서 건조시킨다. 혈청을 PBST중에서 1:40으로 희석한다. 포지티브 대조군 혈청은 플레이트 마다 4배로 포함된다. 웰당 샘플 용적은 100㎕이다. 일련의 시험 혈청 샘플 및 표준 혈청 샘플을 동일한 플레이트상에서 2회 시험한다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하고 PBST로 3회 세척한다. PBST중에 희석된 항마우스 IgG 퍼옥시다제-표지된 결합체(Kirkegaard and Perry) 100㎕를 모든 웰에 첨가하고 웰을 실온에서 30분동안 항온처리한다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한다. 퍼옥시다제 기질 용액(ABTS) 100㎕를 모든 웰에 첨가하고 기기가 PBST 대조군 웰에 대해 블랭크될때 포지티브 혈청 대조군의 OD₄₀₅(450)가 0.850 내지 1.050에 도달할때까지 당해 플레이트를 항온처리한다. 플레이트를 판독하고 PBST 웰에 대해 블랭크한다. 유효 시험이 되기 위해서, 표준 박테린으로 접종된 마우스 혈청은 최소 평균값 0.500을 나타내야만 하고 백신화되지 않은 대조군 마우스의 혈청은 최대 평균 값 0.100을 초과하지 말아야 한다. 또한, 표준 박테린으로 접종된 마우스 혈청의 평균값과 백신화되지 않은 대조군 마우의 혈청의 평균값간의 차이는 0.400이상이어야 한다.

일련의 백신, 표준 백신 및 대조군에 대한 평균값을 하기와 같이 계산하고 평가한다: 만족할 정도로 인정되기 위해서, 시험 박테린은 표준 값 이상의 평균 광학 밀도 값을 입증해야만 한다. 또한, 원-테일드 스튜던스 T-시험(one-Tailed Student's T-Test)을 사용한 시험에서 시험 박테린은 표준 박테린 보다 훨씬 낮지 말아야 한다(p ≤0.05 신뢰수준). 임의의 계산된 T-값이 1.686 이상인 경우 표준 박테린과 시험 박테린간에 상당한 차이가 있음을 나타내고 당해 시험 박테린은 제외된다. 임의의 계산된 T-값이 1.686 이하인 경우는 만족할 만한 결과임을 나타낸다. 생성물 효능과 관련이 없는 임의의 이유 때문에 시험에 의해 만족하지 못한 것으로 결정된 임의의 시험 박테린은 재시험하고 초기 시험은 무효인 것으로 간주한다.

실시예 2

시험 백신:

시험용 백신은 보조제로서 하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체의 혼합물(스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물)5% 및 아크릴산 중합체(카보폴) 0.2% 및 투여당 2 x 10⁹의 엠. 하이오뉴모니애 DNA 세포 상당물(MHDCE)을 사용하여 실시예 1에 상세하게 기재된 과정에 따라 제조한다.

실시예 3

당해 연구는 생후 3주에서 실시예 2의 백신을 1회 투여하는 백신화에 의해 유도되는, 돼지에서의 면역 지속기간(DOI)이 4개월임을 입증하기 위해 계획되어 있다.

2개의 별도의 동물 실험을 당해 연구를 위해 수행한다. 2개의 실험에서 모든 돼지는 백신화 시점에 혈청 음성(항체 역가 10 미만)이고 이것은 동물이 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 감수성임을 지적한다. 대조군 그룹의 모든 돼지는 투여전에 혈청 음성이다. 이것은 백신화된 돼지에서 면역 반응이 백신에 의한 것이지 임의의 환경 노출에 의한 것이 아님을 지적한다.

제1 시험에서, 고수준의 독성 엠. 하이오뉴모니애(0.4 x 10⁶의 유기체)를 사용하여 제조원[Boehringer Ingelheim(BI)]에 의해 제조되고 시판되는 인겔백 엠. 하이오^R(Ingelvac M. hyo^R)로서 시판되는 제품과 함께 실시예 2의 백신을 평가한다. 생후 18일 내지 21일된 22마리의 돼지를 실시예 2의 백신을 사용하여 근육내(IM)로 백신화하고 8마리의 돼지를 인겔백 엠. 하이오^R[시리얼 271 032]로 백신화한다. 22마리의 돼지를 실험 대조군으로서 사용하고 10마리의 돼지를 비-실험 대조군으로서사용한다. 백신화된 돼지와 실험 대조군 그룹의 돼지에게 백신화 후 4개월 시점에 독성 엠. 하이오뉴모니애를 투여한다. 실시예 2의 백신으로 백신화된 돼지는 평균 15.9%의 폐 병변을 나타내고 실험 대조군 돼지는 평균 19.6%의 폐 병변을 나타낸다. 돼지가 아이오와(Iowa) 주립 대학(ISU)이 추천한 것 보다 고용량으로 투여받았지만 실시예 2의 백신으로 백신화된 그룹내 평균 폐 병변이 대조군 보다 적었다. 그러나 약간의 차이가 있었다(p = 0.19). 또한, 시판되는 제품인 인겔백 엠. 하이오^R가 동일 투여 용량으로 동일 그룹의 동물로 평가되는 경우, 유사한 수준의 폐 병변이 관찰되었다(14.6%). 또한 인겔백 엠. 하이오^R과 대조군 그룹간의 차이(p = 0.27)와 인겔백 엠. 하이오^R과 실시예 2의 백신으로 백신화된 그룹간의 차이는 별로 없었다.

제2 실험에서, 백신화후 4개월 시점에서 ISU가 제안한 수준(1.0 x 10⁶유기체)에서 독성 엠. 하이오뉴모니애를 투여하여 실시예 2의 백신을 평가한다. 23마리의 돼지를 생후 21일에서 1회 투여 용량의 백신으로 백신화하고 25마리의 돼지를 실험 대조군으로서 사용하고 7마리의 돼지를 비-실험 대조군으로서 사용한다. 백신화된 돼지 및 실험 대조군 그룹의 돼지에게 백신화 후 4개월 시점에서 독성 엠. 하이오뉴모니애를 투여한다. 대조군 그룹은 평균 10.4%의 폐 병변을 갖고 백신화된 그룹은 평균 5.5%의 폐 병변을 갖는다. 백신화된 그룹과 대조군 그룹간의 차이(p = 0.031)는 상당히 높다 이것은 실시예 2의 백신이 보호 면역을 자극하는데 효능적임을 지적하고 이러한 효능은 돼지를 1회 투여 용량으로 백신화한 후 4개월 이상 지속할 수 있다.

2개의 실험에서 실시예 2의 백신과 관련된 데이터를 종합 분석하는 경우, 백신화된 그룹의 평균 폐 병변이 대조군 그룹의 폐 병변보다 상당히 낮다.

결론적으로, 실시예 2의 백신이 생후 3주된 돼지에게 1회 투여 용량으로 백신화 한후 4개월 시점에서 독성 엠. 하이오뉴모니애에 대해 보호 면역을 유도한다.

실험 데이터

2개의 별도의 실험을 당해 연구에서 수행한다. 하나의 실험에서, 67마리의 돼지를 마이크로소프트 엑셀 무작위 프로그램을 사용하여 4개의 그룹에 할당한다. 24마리의 돼지를 실시예 2에 따라 제조된 1회 투여 용량의 백신을 사용하여 생후 18일 내지 21일에 근육내(IM)로 백신화시킨다. 24마리의 돼지는 실험 대조군으로서 사용하여 10마리의 돼지는 비-실험 대조군으로서 사용한다. 9마리의 돼지는 시판되는 제품인 인겔백 엠. 하이오^R[베링거 인겔하임(BI)로부터 제조된 시리얼 271 032]을 사용하여 표지 지시에 따라 IM에 백신화한다. 5마리의 돼지(이중에서 2마리는 실시예 2의 백신으로 백신화하고 1마리는 BI 백신으로 백신화하고 2마리는 대조군이다)는 백신화 효력 기간동안에 백신화와는 관계없는 이유로 죽었다. 백신화된 그룹에 및 실험 대조군 그룹내 잔류하는 돼지에게 백신화후 4개월 시점에서 독성 엠. 하이오뉴모니애 14ml(1.4 x 10⁶유기체)을 투여한다. 모든 4개의 그룹의 돼지는 투여한지 30일 후에 안락사시키고 당해 시험에서 각각의 돼지에 대한 폐 병변의 점수를 매긴다.

제2 시험에서, 25마리의 돼지를 생후 21일에 실시예 2에 따라 제조된 1회 투여 용량의 백신으로 IM으로 투여한다. 25마리의 돼지를 실험 대조군으로서 사용하고 10마리의 돼지를 비실험 대조군으로서 사용한다. 2마리의 돼지가 백신화와 관련 없는 이유로 죽고 1마리의 돼지가 백신화 유효 기간동안에 실수로 판매되었다. 백신화된 그룹 및 실험 대조군 그룹에서 잔류하는 돼지에게 백신화 후 4개월 시점에서 독성 엠. 하이오뉴모니애 10ml(1.0 x 10⁶유기체)을 투여한다. 2마리의 돼지가 실험후 관찰 기간동안에 백신화/투여와 관련이 없는 이유로 죽었다. 모든 3개의 그룹에 잔류하는 돼지는 투여한지 30일 후에 안락사시키고 당해 시험에서 각각의 돼지에 대한 폐 병변의 점수를 매긴다.

백신화:

백신화 그룹에서 각각의 돼지에게 목 측면에 시험 백신 2ml의 투여량을 IM으로 투여한다.

투여 및 검시

독성 엠. 하이오뉴모니애 투여 스톡인 동결(-70℃) 폐 파쇄물을 이이오와 주립 대학(ISU)의 에일린 택커 박사가 제조하였다. 투여 스톡은 순수한 것으로 확인되었고 mL당 10⁷의 엠. 하이오뉴모니애 유기체를 포함한다. 추천된 투여 용량은 1:100 희석된 스톡 10ml(즉, 1.0 x 10⁶의 유기체)이다.

제1 실험에서 백신화된 그룹 및 투여 대조군 그룹의 돼지에게 1:100 희석된스톡 14ml(즉, 1.4 x 10⁶유기체)을 투여한다. 제2 실험에서 돼지에게 추천된 바와 같이 1:100 희석된 스톡 10ml(즉, 1.0 x 10⁶유기체)을 투여한다.

투여한 날에, 파쇄물을 온수하에 급속히 해동하고 멸균된 엠. 하이오뉴모니애 증식 배지를 사용하여 ISU가 추천한 바에 따라 희석한다. 돼지를 크실라진 50mg/ml, 케타민 50mg/ml 및 텔라졸 100mg/ml로 이루어진 크실라진-케타민-텔라졸^TM의 혼합물로 진정시킨다. 마취 혼합물을 체중 Ib당 0.01 내지 0.02 mL로 IM에 투여한다. 각각의 돼지에게 투여 물질 14ml(제1 실험) 또는 10ml 투여량(제2 실험)을 기관지내에 투여한다. 바늘 위치를 올바르게 하기 위해 투여량을 투여하기 전에 주사기에 공기를 흡입한다. 비백신화된 비투여된 대조군 돼지를 별도의 방에 유지하고 투여하지 않는다.

투여 후 30일 시점(DPC)에 모든 돼지를 안락사시킨다. 폐를 제거하고 시험 그룹을 알지 못하는 개인이 총 폐 병변에 대해 점수를 매긴다.

샘플 수거 및 시험:

백신화한 날에(0 DPV), 백신화 후 1개월 후에(1MVP) 및 30DPC 후에 모든 돼지로부터 혈액 샘플을 수거하고 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체를 경쟁 ELISA 키트(제조원: DAKO Co.)에 의해 검출한다. 혈청 샘플을 시험하기 전에 -20℃에 저장한다.

데이타 분석:

변수 분석(ANOVA)에 의해 백신화된 그룹과 비백신화된 그룹간의 폐 병변 점수를 비교한다. 폐 점수는 아크사인으로 전환시켜 잉여 분포를 개선한다.

결과 및 검토

혈청학: 2개의 실험에서 모든 돼지는 모든 시험에 대해 1:10의 혈청 희석액을 사용하여 시판되는 ELISA 키트에 의해 엠. 하이오뉴모니애에대한 혈청 항체에 대해 시험한다. 모든 돼지는 백신화 시점에 혈청 음성(항체 역가 < 10)이고 이것은 동물이 엠. 하이오뉴모니애에 대해 감수성임을 지적한다. 대조군 그룹내 모든 돼지는 투여 전에 혈청 음성이다. 이것은 백신화된 돼지에서 면역 반응이 백신에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 지적한다. 백신화된 그룹에서 모든 돼지 및 투여 대조군 그룹에서 대부분의 돼지(제1 실험에서 22마리의 돼지중 18마리 및 제2 실험에서 25마리의 돼지중 15마리)가 투여 후 엠. 하이오뉴모니애에 대해 혈청이 전환되는 반면 모든 비투여 동물은 혈청 음성인채로 남아있다. 이것은 투여가 엠. 하이오뉴모니애에 특이적임을 의미한다. 시험 동물의 혈청 상태는 표 1에 요약되어 있다.

제1 실험에서 면역원성 시험:

실시예 2의 백신이 백신화 후 4개월 시점에서 ISU에 의해 추천된 것 보다 고준의 투여에 대해 보호될 수 있는 강한 면역을 자극할 수 있는지를 결정하기 위해 제1 실험을 수행한다. 당해 실험은 또한 백신화 후 4개월 시점에서 보호 면역을 자극하는 이의 능력에 대해 실시예 2의 백신과 시판되는 인겔백 엠. 하이오^R을 비교한다.

FDAH 수백신(Suvaxyn) MH-원(one)으로 백신화된 22마리의 돼지와 허가된 제품인 인겔백 엠. 하이오^R시리얼 271,032로 백신화된 8마리의 돼지에게 투여 물질을 돼지 당 1.4 x 10⁶의 유기체(ISU는 돼지 당 1.0 x 10⁶유기체를 추천한다. 섹션 5.5. 참조)를 투여한다. 22마리의 돼지는 투여 대조군으로서 사용하고 10마리의 돼지는 비투여 대조군으로서 사용한다. 폐 병변의 %는 표 2에 요약되어 있다. 실시예 2의 백신으로 백신화된 돼지는 평균 폐 병변이 15.9%이고 투여된 대조군 그룹은 평균 폐 병변이 19.6%이다. 돼지에게 고용량의 엠. 하이오뉴노미애를 투여하는 경우에도 실시예 2의 백신으로 백신화된 그룹내 폐 병변이 대조군보다 적다. 그러나. 당해 차이는 유의적이지 않다(p = 0.19). 또한, 시판되는 인겔백 엠. 하이오^R를 동일 그룹의 동물에서 동일한 투여량으로 평가하는 경우, 유사한 수준의 폐 병변(14.6%)이 수득된다. 인겔백 엠. 하이오^R백신화된 그룹과 대조군 그룹간의 차이(p = 0.27)와 인겔백 엠. 하이오^R백신화된 그룹과 실시예 2의 백신으로 백신화된 그룹간의 차이(p = 0.88)는 유의적이지 않다.

병변에서 수치의 감소가 실시예 2의 백신을 투여받은 그룹에서 상당한 것으로 나타나지는 않지만 당해 실험에서 수득된 데이타는 당해 실험에 사용된 고용량의 투여(1.4 x 10⁶유기체)가 아마도 시판되는 인겔백 제품에 의해 자극되는 돼지의 면역 보다 압도적임을 제안한다. 당해 투여 수준은 아마도 20 내지 25마리의 그룹크기의 동물을 사용한 백신화/투여 연구 평가에 적당하지 않지만 보다 큰 크기의 그룹을 사용하는 경우 상당한 차이가 입증될 수 있다.

제2 실험에서 면역원성 시험:

2개의 실험에서 백신화된 그룹과 투여 대조군 그룹의 돼지를 백신화 후 4개월 시점에서 투여량(1.0 x 10⁶유기체)으로 평가하여 4개월 DOI를 입증한다. 폐 병변의 %는 표 3에 요약되어 있다. 대조군 그룹은 평균 폐 병변이 10.4%이다. 백신화된 그룹은 평균 폐 병변이 5.5%이다. 백신화된 그룹과 대조군 그룹간에는 상당한 차이(p = 0.031)가 있다. 이것은 실시예 2의 백신이 보호 면역을 자극하는데 효능적임을 지적하고 이러한 효능이 생후 3주된 돼지에게 1회 투여 백신화후 4개월 이상동안 지속할 수 있다.

2개의 실험의 종합된 결과에 대한 평가:

2개의 실험이 상당한 차이가 있지만 그룹에 대한 실험의 효과는 상당하지 않다. 그룹의 효과 정도는 2개의 실험간에 유사하다. 따라서, 그룹의 효과는 실험과 무관하게 평가될 수 있다. 완전한 모델의 분석은 그룹과 실험간의 상호작용이 유의적이지 못함을 보여주고 이것은 그룹의 효과가 양 실험에서 동일하다는 개념을 지지해주고 2개의 실험에 대한 데이타를 단일 분석으로 종합시킴을 정당화한다. 이와 같이 2개의 실험으로부터 실시예 2의 백신과 관련된 데이타를 종합하고 폐 병변에 대해 아크사인 전환된 변수가 독립적인 변수(감소된 모델)로서 그룹 및 실험으로 분석되는 경우 그룹은 통계적으로 상당하다(p = 0.013).

대조군 및 백신화 돼지에서 엠. 하이포뉴모니애에 대한 혈청학적 상태의 요약

제1 실험
양성/음성(1:10)
그룹	돼지 수	ODPV	-1DPC	30DPC
FDAH 백신	22	0/22	0/22	22/22
BI 백신	8	0/8	4/8	8/8
투여 대조군	22	0/22	0/22	18/22
비투여 대조군	10	0/10	0/10	0/10

제2 실험
양성/음성(1:10)
그룹	돼지 수	ODPV	-3DPC	30DPC
FDAH 백신	23	0/23	6/23	23/23
대조군	25	0/25	0/25	14/25
비투여 대조군	7	0/7	0/7	0/7

제1 실험(과투여량)^*에서 폐 병변 %에 대한 요약

그룹	돼지 수	폐 병변의 평균%	P 값
FDAH 백신	22	15.90%	0.19^**
BI 백신	8	14.60%	0.27^***
대조군	22	19.60%
비투여 대조군	10	0%	0.88^****
^돼지에게 돼지당 1.4 x 10⁶의 유기체를 투여한다(ISU는 돼지당 1.0 x 10⁶유기체의 투여를 추천하였다)^FDAH 백신 그룹 및 대조군 그룹간의 비교^BI 백신 그룹과 대조군 그룹간의 비교^**BI 백신 그룹과 FDAH 백신 그룹간의 비교

제2 실험에서 폐 병변 %에 대한 요약(추천된 투여량)

그룹	돼지 수	폐 병변의 평균%	P값
FDAH 백신	23	5.50%	0.031^**
대조군	25	10.40%
비투여 대조군	7	0.77%
^돼지에게 ISU 추천된 투여량(돼지당 1.0 x 10⁶의 유기체)^*FDAH 백신 그룹과 대조군 그룹간의 비교

실시예 4

1회 투여량을 투여한지 6개월 후 본 발명의 백신 조성물에 의해 유도된 독성 투여에 대한 장기 면역의 평가

필수적으로 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법 및 하기에 나타낸 양을 사용하여 시험 백신 A를 제조한다.

시험 백신 A

1,000,000 용량에 대한 양(각각 2ml) % 용량/용량

마이코플라스마 농도(> 1.0 x 10¹⁰MHDCE/ml)	1200,000 mL	60.0
스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물	200,000mL	10.0
카보폴(수중 2% w/v)	200,000mL	10.0
수중 티메로살 용액 1% w/v 및 EDTA(사나트륨 염)7 w/v%)	18,000ml	0.9
멸균 식염수	382,000mL	19.1

시리얼의 pH를 7.0 ± 0.2로 조정한다.

MHDCE = 마이코플라스마 하이포뉴모니애 DNA 세포 상당물

요약

33마리의 생후 21일 돼지를 당해 평가에 사용한다. 20마리의 돼지를 생후 3주된 시점에서 근육내(IM)로 1회 투여량의 백신화된 대조군으로 백신화한다. 10마리의 돼지를 비백신화된 대조군으로 사용하고 3마리의 돼지는 비투여 환경적 대조군으로서 사용한다.

모든 돼지는 백신화 시점에서 혈청 음성(항체 역가 < 10)이고 이것은 동물이 엠. 하이오뉴모니애에 대해 감수성임을 지적한다. 대조군 그룹의 모든 돼지는 투여전에 혈청 음성이다. 이것은 백신화된 돼지내 면역 반응이 백신에 의한 것이지 임의의 환경 노출에 의한 것이 아님을 지적한다.

백신화한지 6개월 후에, 20마리의 백신화된 돼지 및 10마리의 비백신화된 대조군 돼지에게 독성 엠. 하이오뉴모니애(돼지당 1.0 x 10⁶의 유기체)를 투여한다. 백신화된 돼지는 평균 폐 병변 점수가 3.6%이고 투여된 대조군 돼지는 평균 폐 병변 점수가 14.6%이다. 백신화된 그룹에서 폐 병변은 대조군 보다 상당히 적다(p= 0.0215).

당해 평가에서 수득한 데이타는 시험 백신 A가 1회 투여 백신화한지 6개월 후에 독성 엠. 하이오뉴모니애 투여에 대해 장기 보호 면역을 유도함을 입증한다.

실험 디자인

리터에 의한 마이크로소프트 엑셀 무작위 프로그램을 사용하여 33마리의 생후 21일된 돼지를 3개의 그룹(백신화된 그룹, 투여 대조군 그룹 및 비투여 환경 대조군 그룹)으로 무작위로 할당한다. 20마리의 돼지를 생후 3주된 시점에서 1회 투여량의 시험 백신 A를 근육내로 투여하여 백신화한다. 10마리의 돼지를 투여 대조군으로서 사용하고 3마리의 돼지를 비투여 환경 대조군으로서 사용한다. 백신화 그룹 및 투여 대조군의 돼지에게 백신화후 6개월 시점에서 돼지당 독성 엠. 하이오뉴모니애 10ml(1.0 x 10⁶유기체)을 투여한다. 3마리의 비백신화된 돼지를 비투여 대조군으로서 사용한다. 투여한 돼지 및 비투여한 대조군을 투여한자 26일 후에 안락사시키고 각각의 돼지의 폐 병변의 점수를 매긴다.

백신화 그룹내 돼지 각각에 목 측면에 1회 투여량(2ml)의 시험 백신을 IM으로 투여한다.

투여 및 검시

독성 엠. 하이오뉴모니애 투여 스톡인 동결(≤-70℃) 폐 파쇄물을 이이오와 주립 대학(ISU)의 에일린 택커 박사가 제조하였다. 투여 스톡은 순수한 것으로 확인되었고 mL당 10⁷의 엠. 하이오뉴모니애 유기체를 포함한다.

돼지에게 1:100 희석된 스톡 10mL(즉, 약 1.0 x 10⁶유기체)을 투여한다.

투여한 날에, 파쇄물을 온수하에 급속히 해동하고 멸균된 엠. 하이오뉴모니애 증식 배지를 사용하여 ISU가 추천한 바에 따라 희석한다. 돼지를 크실라진 50mg/ml, 케타민 50mg/ml 및 텔라졸 100mg/ml로 이루어진 크실라진-케타민-텔라졸^TM의 혼합물로 진정시킨다. 마취 혼합물을 체중 Ib당 0.01 내지 0.02 mL로 IM에 투여한다. 각각의 돼지에게 투여 물질 1회 투여량 10mL을 기관지내에 투여한다. 바늘 위치를 올바르게 하기 위해 투여량을 투여하기 전에 주사기에 공기를 흡입한다.비백신화된 비투여된 대조군 돼지를 별도의 방에 유지하고 투여하지 않는다.

투여 후 26일 시점(DPC)에 모든 돼지를 안락사시킨다. 폐를 제거하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 전체 폐 병변의 점수를 매긴다.

샘플 수거 및 시험:

백신화한 날에(0 DPV), 35 DPV, -1DPC 및 26DPC 후에 모든 돼지로부터 혈액 샘플을 수거하고 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체를 측정하기 위해 경쟁 ELISA 키트(제조원: DAKO Co.)에 의해 검출한다. 혈청 샘플을 시험하기 전에 -20℃ 이하에 저장한다.

데이타 분석:

일방 ANOVA에 의해 백신화된 그룹과 대조군 그룹간의 폐 병변 점수를 비교한다. 폐 점수는 아크사인으로 전환시켜 잉여 분포를 개선한다. 폐 병변 점수에 대한 정상적인 추측이 의문시될 수 있기 때문에 폐 병변 점수 및 아크사인 전환된 폐 병변 점수는 윌콕슨 등급 총계 시험(Wilcoxon Rank Sum test)으로 분석한다. 유의적 수준은 p < 0.05로 설정한다. 비계수 윌콕슨 등급 총계 시험을 보고 목적으로 사용한다.

결과 및 검토

혈청학: 모든 돼지는 모든 시험에 대해 1:10의 혈청 희석액을 사용하여 시판되는 ELISA 키트에 의해 엠. 하이오뉴모니애에대한 혈청 항체에 대해 시험한다. 키트 지시당 시험 결과가 의심스러운 샘플을 데이타 분석에 양성으로서 처리한다. 모든 돼지는 백신화 시점에 혈청 음성(항체 역가 < 10)이고 이것은 동물이 엠. 하이오뉴모니애에 대해 감수성임을 지적한다. 대조군 그룹내 모든 돼지는 투여 전에 혈청 음성이다. 백신화 후 백신화된 20마리중 15마리(15/20)은 일단 적어도 엠. 하이오뉴모니애에 대해 혈청 양성이된다(샘플은 35DPV 및 -1DPC에서 수거된다). 이것은 백신화된 돼지에서 면역 반응이 백신에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 지적한다. 백신화된 그룹에서 모든 돼지 및 투여 대조군 그룹에서 10마리의 돼지중 4마리가 투여 후 엠. 하이오뉴모니애에 대해 혈청 양성인 반면 모든 비투여 동물은 혈청 음성인채로 남아있다. 시험 동물의 혈청 상태는 표 4에 요약되어 있다.

폐 병변 점수

시험 백신 A로 백신화된 20마리의 돼지 및 10마리의 비백신화된 대조군 돼지에게 백신화후 6개월 시점에서 독성 엠. 하이오뉴모니애(돼지당 1.0 x 10⁶유기체)를 투여한다. 2마리의 돼지를 비투여 대조군으로서 사용한다. 20마리의 백신화된 돼지중 8마리(40%)는 투여 후 폐 병변이 발생하지 않는 반면 대조군 그룹에서는 10마리의 돼지당 1마리만(10%)이 폐 병변을 갖지 않았다. 폐 병변 %는 표 5에 요약되어 있다. 백신화된 돼지는 평균 폐 병변 점수가 3.6%이고 투여된 대조군 돼지는 평균 폐 병변 점수가 14.6%이다. 백신화된 그룹중에서 폐 병변은 대조군보다 상당히 적다(p = 0.0215).

당해 연구에서 돼지 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청학적 상태^*

					전체중 양성(1:10)의 수
그룹	처리	돼지 수	0 DPV^**	35 DPV	-1 DPC^***	26 DPC
1	백신/투여	20	0/20	9/20	12/20	20/20
2	대조군/투여	10	0/10	0/10	0/10	4/10
3	대조군/비투여	3	0/3	0/3	0/3	0/3
^혈청 샘플을, 시판 키트를 사용하여 ELISA에 의해 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체에 대해 시험한다.모든 샘플은 혈청 희석액 1:10에서 시험한다. 결과는 키트 지시에 따라 해석한다.1:10에서 의심되는 샘플은 양성으로서 간주한다.^DPV = 백신화후 일수^**DPC = 투여 후 일수

엠. 하이오뉴모니애를 투여한 돼지 및 비투여된 대조군에서 폐 병변 점수(%)의 요약

그룹	처리	돼지 수	폐 병변 점수평균 %	표준 편차	평균 보다 낮은 95% CL^*	평균 보다 높은 95% CL	P값^**
1	백신/투여	20	3.6	7.6	0.07	7.19	0.0215
2	대조군/투여	10	14.6	20.0	0.33	28.94
3	대조군/비투여	3	1.8	1.8	-2.67	6.27
^CL = 신뢰 수준^*P 값은 그룹 1과 2를 비교한 것이다.

표 4 및 5에서 나타낸 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 백신 A는 생후 3주된 시점에서 백신화된 돼지에게 1회 투여량으로 투여된 후 6개월동안 독성 엠. 하이오뉴모니애에 대해 보호 면역을 유도한다.

Claims

마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 면역량,

아크릴산 중합체, 및 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 보조제 혼합물 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염에 대해 동물을 면역화시키는, 1회 투여 후 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호 면역을 유도하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 보조제 혼합물이 아크릴산 중합체, 및 하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체의 혼합물로 구성되고 아크릴산 중합체 대 대사가능한 오일/폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체 혼합물의 비가 약 1:25 내지 1:50인 백신 조성물.
제1항에 있어서, 보조제 혼합물이 백신 조성물의 약 1 내지 25% v/v인 백신 조성물.
제3항에 있어서, 아크릴산 중합체가 1% v/v의 최종 농도로 존재하고 테르펜 탄화수소/폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체 혼합물이 약 5% 내지 10% v/v의 최종 농도로 존재하는 백신 조성물.
제3항에 있어서, 보조제 혼합물이 백신 조성물의 약 2% 내지 15% v/v인 백신 조성물.
제5항에 있어서, 보조제 혼합물이 백신 조성물의 약 5% 내지 12% v/v인 백신 조성물.
제1항에 있어서, 대사가능한 오일이 스쿠알란 또는 스쿠알렌인 백신 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 아크릴산 중합체가 카보폴인 백신 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 해몬필러스 파라수이스(Haemonphilus parasuis), 파스테렐라 멀티오시다(Pasteurella multiocida), 스트렙토코컴 수이스(Streptococcum suis), 액티노바시러스 플레로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis) 및 렙토스피라(leptospira) 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 박테린을 추가로 함유하는 백신 조성물.
마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 면역량,

아크릴산 중합체, 및 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 보조제 혼합물 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고 1회 투여후 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호면역을 유도하는 백신 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 의해 발병되는 질환으로부터 동물을 보호하는 방법.
제10항에 있어서, 세균의 면역량이 약 1 x 10⁸내지 3 x 10¹¹MHDCE/ml인 방법.
제11항에 있어서, 세균의 면역량이 약 1 x 10⁹내지 3 x 10⁹MHDCE/ml인 방법.
제10항에 있어서, 투여 단계에서 투여 방식이 근육내, 피하, 복막내, 에어로졸, 경구 또는 비강내 투여인 방법.
제10항에 있어서, 보조제 혼합물이 아크릴산 중합체, 및 하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체의 혼합물로 이루어지고 최종 농도가 약 1 내지 25% v/v인 방법.
제14항에 있어서, 보조제 혼합물의 아크릴산 중합체가 카보폴인 방법.
제14항에 있어서, 보조제 혼합물의 대사가능한 오일이 스쿠알렌 및 스쿠알란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 테르펜 탄화수소인 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 해몬필러스 파라수이스, 파스테렐라 멀티오시다, 스트렙토코컴 수이스, 액티노바시러스 플레로뉴모니애, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스 및 렙토스피라 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 박테린을 동시에 투여함을 추가로 포함하는 방법.
불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애, 대사가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체 및 아크릴산 중합체를 수중유 에멀젼 형태로 함유하는 백신.