BR122015028489B1 - Vacina de combinação multivalente contra pcv2, bem como uso de uma proteína orf2 na preparação da mesma - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "vacina de combinação multivalente contra pcv2, bem como uso de uma proteína orf2 na preparação da mesma". é proporcionado um método aprimorado para recuperar a proteína expressada pela estrutura de leitura aberta 2 de circovírus porcino tipo 2. também é proporcionada proteína de orf2 de pcv2 recombinante, e composições imunogênicas compreendendo proteína de orf2 de pcv2. além disso, são proporcionadas vacinas de combinação multivalentes as quais incluem um agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por pcv2, preferencialmente proteína de orf2 de pcv2, ou uma composição imunogênica compreendendo proteína de orf2 de pcv2, e no mínimo um componente ativo imunogênico de outro organismo causador de doença em suíno.

Description

[001] Dividido do PI0620859-2, depositado em 28.12.2006

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

[002] Este requerimento contém uma listagem de seqüência em formato de papel e em formato legível por computador, cujos ensinamentos e conteúdo são por este incorporados por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Um aspecto da presente invenção refere-se à recuperação de uma proteína expressada por estrutura de leitura aberta 2 (ORF2) de circovírus porcino tipo 2 (PCV2). Mais particularmente, a proteína é uma proteína recombinante expressada por um vírus transfectado contendo seqüências codificantes recombinantes para circovírus porcino tipo 2, estrutura de leitura aberta 2. Ainda mais particularmente, deixa- se o vírus transfectado infectar células em meio de crescimento e a proteína expressada por estrutura de leitura aberta 2 é recuperada no sobrenadante, ao invés de do interior das células. Ainda mais particularmente, o método envolve as etapas de amplificar o gene da estrutura de leitura aberta 2 de circovírus porcino tipo 2, clonar esta porção amplificada em um primeiro vetor, excisar a porção da estrutura de lei-tura aberta 2 deste primeiro vetor e clonar esta em um vetor de transferência, cotransfectar o vetor de transferência com um vetor viral em células em meio de crescimento, fazer com que as células se tornem infectadas pelo vetor viral e deste modo expressar estrutura de leitura aberta 2, e recuperar a proteína recombinante expressada codificada por estrutura de leitura aberta 2 no sobrenadante. i. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica eficaz para induzir uma reação imune contra PCV2, e métodos para produzir estas composições imunogênicas. Mais particu-larmente, a presente invenção refere-se a uma composição imunológi- ca eficaz para proporcionar uma reação imune quer protege um animal recebendo a composição e reduz, ou minora a gravidade, dos sintomasclínicos associados com infecção por PCV2. Ainda mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma composição imunológi- ca à base de proteína que confere proteção eficaz contra infecção por PCV2. Ainda mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma composição imunológica compreendendo ORF2 de PCV2, em que a administração de PCV2-ORF2 resulta em proteção contra infecção por PCV2. O mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma composição imunológica eficaz para conferir imunidade eficaz a um suíno recebendo a composição imunológica, e em que a composição compreende a proteína expressada por ORF2 de PCV2.

[004] Em outro aspecto da presente invenção, são proporcionadas vacinas de combinação ou vacinas multivalentes. Mais particularmente, a presente invenção proporciona composições imunogênicas eficazes na indução de uma reação imune contra infecção por PCV2 e no mínimo um outro organismo causador de doença para suínos.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

[005] Circovírus porcino tipo 2 (PCV2) é um pequeno vírus de DNA não-envelopado (17 a22 nm de diâmetro), icosaédrico, o qual contém um genoma circular de filamento único. PCV2 partilha aproximadamente 80% de identidade de seqüência com circovírus porcino tipo 1 (PCV1). No entanto, em contraste com PCV1, o qual é geralmente não-virulento, suínos infectados com PCV2 apresentam uma síndrome comumente referida como síndrome debilitante multisistêmi- ca pós-desmame (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS). PMWS é clinicamente caracterizada por debilitação, palidez da pele, desgaste, insuficiência respiratória, diarréia, icterícia, e Icterí- cia. Em alguns suínos afetados, uma combinação de todos os sintomasserá evidente ao passo que outros suínos terão somente um ou dois destes sintomas. Durante a necropsia, também aparecerão lesões microscópicas e macroscópicas sobre múltiplos tecidos e órgãos, com órgãos linfóides sendo o sítio mais comum para lesões. Foi observada uma forte correlação entre a quantidade de antígeno ou ácido nucléico PCV2 e a gravidade de lesões linfóides microscópicas. Os índices de mortalidade para suínos infectados com PCV2 podem ser próximos de 80%. Além de PMWS, PCV2 tem sido associado com várias infecções diferentes incluindo pseudoraiva, síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS), doença de Glasser, meningite estreptocóccica, sal- monelose, colibacilose pós-desmame, hepatose dietética, e broncopneumonia supurativa.

[006] Proteína de PCV2 de estrutura leitura aberta 2 (ORF2), tendo um peso molecular aproximado de 30 kDa quando deslisa SDS- PAGE em gel, tem sido utilizado no passado como um antigenic componente in vacinas for PCV2. Métodos típicos para obter ORF2 para uso em semelhantes vacinas geralmente consistem de amplificar o PCV2 DNA codificando para ORF2, transfectar um vetor viral com o DNA de ORF2, infectar células com o vetor viral contendo o DNA de ORF2, permitir que o vírus expresse proteína ORF2 dentro da célula, e extrair a proteína ORF2 da célula através de lise celular. Estes procedimentos geralmente duram até cerca de quatro dias depois de infecção das células pelo vetor viral. No entanto, estes procedimentos têm uma desvantagem em que os procedimentos de extração são tanto caros quanto consomem tempo. Adicionalmente, a quantidade de ORF2 recuperada das células não é muito elevada; conseqüentemen- te, precisa ser infectado um grande número de células por um grande número de vetores virais de modo a obter quantidades suficientes da proteína expressada recombinante para uso em vacinas e semelhan- tes.

[007] As abordagens correntes para imunização contra PCV2 incluem vacinas à base de DNA, tais como as descritas na Patente dos Estados Unidos N°. 6.703.023. No entanto, as vacina s referidas têm sido ineficazes para conferir imunidade protetora contra infecção por PCV2 e os sinais clínicos associados com a mesma.

[008] Síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS) é causada por um vírus o qual foi primeiro isolado e classificado como um arterivírus tão recentemente quanto 1991. A síndrome da doença foi primeiro reconhecida nos Estados Unidos em meados dos anos 80 e foi denominada "doença suína misteriosa". Também foi denominada doença da orelha azul. O nome arterivírus porcino foi proposto recentemente. O vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina tem uma afinidade particular para os macrófagos particularmente os encontrados nos pulmões. Macrófagos são parte das defesas do corpo. Os presentes nos pulmões são denominados macrófagos alveolares. Eles ingerem e removem bactérias e vírus invasores, mas não no caso do vírus PRRS. Ao invés, o vírus se multiplica dentro dos mesmos produzindo mais vírus e mata os macrófagos. Uma vez que tenha ingressado em um rebanho tende a permanecer presente e ativo indefinidamente.Até 40% dos macrófagos são destruídos, o que remove uma parte importante do mecanismo de defesa dos corpos e possibilita que bactérias e outros vírus proliferem e causem dano. Um exemplo comum disto é o notável aumento na gravidade da pneumonia enzoó- tica em unidades de produtores/acabadores quando se tornam infectadas com vírus PRRS. Pode tomar até um ano para todo o estoque de reprodução, particularmente em grandes rebanhos, se tornar infectado pela primeira vez e embora o vírus parece se disseminar rapidamente em um rebanho, talvez alguns 4 a 5 meses antes de no mínimo 90% das porcas se tornarem soro-positivas. Algumas porcas perma- necem naive. Além disso, não é incomum para rebanhos de porcas 1 a 2 anos depois da infecção conterem menos de 20% de animais soro- positivos. No entanto, isto não significa necessariamente que eles aindanão estão imunees nem significa que pararam de transferir imunidade para sua prole. Animais adultos espalham vírus por períodos de tempo muito mais curtos (14 dias) comparados com porcos em crescimento os quais podem excretar vírus por 1 a 2 meses. O quadro clínico pode variar tremendamente de um rebanho para outro. Via de regra, para cada três rebanhos que são expostos a PRRS pela primeira vez, um não apresentará doença reconhecível, o segundo apresentará doença branda, e o terceiro apresentará doença moderada a grave. As razões para isto não são entendidas claramente. No entanto, quanto melhor o estado de saúde do rebanho, menos graves os efeitos da doença. Pode ser que o vírus esteja mudando, enquanto se multiplica, abandonando algumas cepas que são altamente virulentas e algumas que não são. PRRS infecta todos os tipos de rebanhos, incluindo com estado de saúde ótimo ou regular e tanto unidades internas quanto externas, independente do tamanho.

[009] Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) é uma pequena bactéria (400 a 1200 nm) classificada na família mycoplasmataceae. M hyoestá associada com Pneumonia Enzoótica, uma doença respiratóriasuína vista comumente em porcos em crescimento e acabamento. M hyo ataca os cílios de células epiteliais da traquéia e dos pulmões, fazendo com que os cílios parem de bater (ciliostase) e eventualmente provocando o colapso de áreas dos pulmões. Dependendo da extensão da doença, o ganho de peso readiário do suíno infectado pode ser reduzido por até 17%. A Pneumonia Enzoótica é disseminada em populações suínas e está presente em quase todo rebanho suíno. M hyo é considerado um patógeno primário que facilita o ingresso de PRRSV e outros patógenos respiratórios nos pulmões. Três cepas isoladas, 232, J e 7448, tiveram seus genomas seqüenciados (Minion et al., J. Bacteriol. 186: 7123-33, 2004; Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187: 5568-77, 2005).

[0010] Enterite proliferativa porcinaé uma doença diarréica comum de porcos em crescimento-acabamento e reprodução jovens caracterizada por hiperplasia e inflamação do íleo e cólon. Freqüente- mente é branda e autolimitante, mas algumas vezes causa diarréia persistente, grave enterite necrótica, ou enterite hemorrágica com alta mortalidade. A etiologia é a bactéria intracelular classificada recentementeLawsonia intracellularis. O organismo foi cultivado somente em culturas celulares, e falharam as tentativas de propagação em meio livre de células. Os postulados de Koch foram satisfeitos por inoculaçãode culturas puras de L intracellularis em porcos criados convencionalmente; foram produzidas lesões típicas da doença, e L intracellula- ris foi reisolado das lesões. A forma não hemorrágica mais comum da doença freqüentemente afeta porcos de 18 a 36 kg e é caracterizada por início súbito da diarréia. As fezes são aquosas a pastosas, amar- ronzadas, ou tenuamente tingidas de sangue. Depois de ~2 dias, os porcos podem passar cálculos fibrinonecróticos amarelos que se formaram no íleo. A maioria dos porcos afetados se recupera espontaneamente, mas um número significativo desenvolve enterite necrótica crônica com emaciação progressiva. A forma hemorrágica é caracterizada por palidez cutânea, fraqueza, e passagem de fezes hemorrágicas ou pretas, alcatroadas. Porcas grávidas podem abortar. Podem ocorrer lesões em qualquer lugar na metade inferior do intestino delgado, ceco, ou cólon mas são mais freqüentes e óbvias no íleo. A parede do intestino é espessada, e o mesentério pode ser edematoso. Os linfonodos mesentéricos são dilatados. A mucosa intestinal aparece espessada e rugosa, mas pode ser coberta com uma membrana fibrinonecrótica amarronzada ou amarela, e algumas vezes tem he- morragias petequiais. Cálculos necróticos amarelos podem ser encontrados no íleo ou passando através do cólon. Necrose mucosa difusa e completa em casos crônicos faz com que o intestino seja rígido, se assemelhando a uma mangueira de jardim. As lesões mucosas prolifera- tivas são freqüentemente no cólon, mas são detectadas somente por cuidadosa inspeção na necropsia. Na forma profusamente hemorrágica,são fezes alcatroadas vermelhas ou pretas, no cólon e sangue coagulado no íleo.

[0011] Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVD) e Doença de Border são dois vírus, os quais são do mesmo grupo de pestivírus que o vírus da febre suína (peste suína), mas os quais infectam essencialmente gado vacum e carneiros respectivamente. Podem penetrar em rebanhos de reprodução de porcos e provocar problemas reprodutivos. A doença não é uma causa comum de infertilidade na porca e seria considerada baixa na lista de possibilidades de um ponto de vista de diagnóstico.

[0012] Leptospiroseé uma doença contagiosa de animais, incluindo homem, causada por vários serovars leptospirais imunologicamente distintos, a maior parte dos quais são considerados subgrupos do Leptospira interrogans. Há cinco serovars e grupos os quais são importantes em suíno: pomona, australis, tarassovi, canicola, icterohaemorrha- gicae, e grippotyphosa. As infecções podem ser assintomáticas ou causar vários sinais, incluindo anorexia, pirexia, apatia, icterícia, abortamentos, partos de natimortos e outros problemas reprodutivos indefinidos, e morte. Depois da infecção aguda, os leptospiras freqüente- mente se localizam nos rins ou nos órgãos reprodutivos consistindo em focos cinzentos pequenos disseminados de uma nefrite intersticial focal, e são disseminados na urina, algumas vezes em grandes números por meses ou anos. Como os organismos sobrevivem em águas de superfície por períodos prolongados, a doença pe freqüentemente transportada pela água. Nos Estados Unidos, a doença é essencialmente devido aos serovars Leptospira hardjo, Leptospira pomona, e Leptospira grippotyphosa. O diagnóstico pode ser difícil por que os títulos de anticorpos podem ser transitórios, durando menos de um mês. Além disso, também podem ser encontrados Leptospiras em animais saudáveis. L. australis serovar bratislava é mais comumente associado com problemas reprodutivos. Rebanhos cronicamente infectados apresentam abortamentos, partos de natimortos e leitões fracos.

[0013] Brucelose é causada por bactérias do gênero Brucella e é caracterizada por abortamento, retenção placentária, infertilidade, or- quite em porco não-castrado, e grave metrite em porcas. Em leitões, a doença é caracterizada por paralisia posterior e coxeadura. A doença em porcos é causada quase exclusivamente por Brucella suis biovars 1, 2, e 3. Uma série de outros mamíferos pode carregar e transmitir Brucella suis aos porcos. A infecção se espalha rapidamente e causa muitos abortamentos em rebanhos não vacinados. A transmissão ocorre essencialmente por contato com outro porco, embora seja possível transmissão venérea. O diagnóstico sorológico pode ser difícil devido a um organismo relativamente comum, Yersinia enterocolitica O:9 o qual partilha um antígeno comum com Brucella e freqüentemen- te causa resultados falso positivos. Lesões pós-morte geralmente incluem metrite e orquite, e podem incluir abscesso, algumas vezes com focos de necrose no fígado.

[0014] Clostridiumé uma bactéria Gram-positiva ubíquo, da família clostridiaceae, geralmente encontrada no solo, mas também ocorre naturalmente no intestino da maioria dos animais. Infecções por C. difficile em suíno são caracterizadas por grave edema mesocolônico, diarréia e edema em outros tecidos tais como o hidrotórax. Enterite por Clostridium em suíno é causada por C. perfringens, e é caracterizada por enterite crônica, a qual é acompanhada por diarréia, perda de peso e febre. Infecção com C perfringens tipos A, B e C causa grave enterite, desinteria, toxemia, e alta mortalidade em bezerros jovens. Ambos os tipos B e C produzem a toxina β altamente necrotizante e letal que é responsável pelo grave dano intestinal. Esta toxina é sensível a enzimasproteolíticas, e a doença é associada com inibição de proteólise no intestino. O colostro da porca, o qual contém um inibidor de tripsina, foi sugerido como um fator na suscetibilidade de leitões jovens. A doença pode causar morte súbita em leitões de menos de uma semana de idade, e é mais comum dentro de 3 dias do nascimento. Em leitões mais velhos, enterite por Clostridium causa um espessamento do intestino delgado tornando difícil a absorção de alimentos e nutrientes. Os leitões geralmente morrem em conseqüência de uma combinação da infecção e falta de nutrientes. Pode ocorrer morte em umas poucas horas, porém casos menos graves sobrevivem por uns poucos dias, e é possível recuperação durante um período de poucos dias. Enterite hemorrágica com ulceração da mucosa é a principal lesão em todas as espécies. A grosso modo, a porção afetada do intestino é púrpura azulada profunda e parece à primeira vista ser um enfarte associado com torsão mesentérica. Esfregaços dos conteúdos intestinais podem ser examinados para grandes números de bactérias Gram-positivas, em forma de bastão, e preparados filtrados para detecção de toxina e subseqüente identificação por neutralização com anti-soro específico.

[0015] Clostridium novyi tem sido suspeitado, mas ainda não confirmado como uma causa de morte súbita em gado vacum e porcos alimentados com dietas de alto nível de grãos, e nos quais não foram detectáveis lesões preexistentes do fígado. As toxinas letais e necroti- zantes (essencialmente α toxina) danificam o parênquima hepático, deste modo permitindo que as bactérias multipliquem e produzam uma quantidade letal de toxina. Geralmente, a morte é súbita sem sinais bem definidos. Os animais afetados tendem a andar devagar atrás do rebanho, assumem posição deitada esternal, e morrem dentro de umas poucas horas. A maioria dos casos ocorre no verão e no início do outono quando a infecção por fascíola hepática está em seu máximo. A doença é mais prevalente em carneiros de 1 a 4 anos de idade e é limitada a animais infectados com fascíolas hepáticas. A diferenciação de fasciolíase aguda pode ser difícil, mas mortes peragudas de animais que apresentam lesões típicas na necropsia deve provocar suspeita de hepatite necrótica infecciosa. As lesões mais característicassão os focos necróticos amarelo acinzentados no fígado que fre- qüentemente seguem os cursos migratórios das fascíolas jovens. Outros achados comuns são um saco pericardial dilatado preenchido com fluido cor de palha, e excesso de fluido dentro das cavidades peritoneal e torácica. Geralmente, há extensiva ruptura dos capilares no tecido subcutâneo, o que faz com que a pele adjacente fique preta (portanto o nome comum, doença preta).

[0016] Clostridium septicumé encontrado no solo e no conteúdo intestinal de animais (inclusive homem) em todo o mundo. A infecção geralmente ocorre através de contaminação de ferimentos contendo tecido desvitalizado, solo, ou algum outro debilitante de tecido. Ferimentos causados por acidente, castração, amputação de cauda, vacinação insalubre, e parto podem se tornar infectado. Desenvolvem-se sinais gerais, tais como anorexia, intoxicação, e febre alta, bem como lesões locais, dentro de umas poucas horas até uns poucos dias depois da lesão predisponente. As lesões locais são tumefações moles que descem sob pressão e se estendem rapidamente devido à forma-ção de grandes quantidades de exsudato que infiltra o tecido conjunti-vosubcutâneo e intramuscular das áreas afetadas. São incomuns acúmulos de gás. Edema maligno associado com lacerações é caracterizado por acentuado edema, grave toxemia, e morte em 24 a 48 ho- ras.

[0017] Toxemia tetânica é causada por uma neurotoxina específica produzida por Clostridium tetani em tecido necrótico. Quase todos os mamíferos, incluindo suíno, são suscetíveis a esta doença. Embora o tétano seja de distribuição mundial, há algumas áreas, tais como a seção setentrional das Montanhas Rochosas dos Estados Unidos, onde o organismo é raramente encontrado no solo e onde o tétano é quase desconhecido. Em geral, a ocorrência de C tetani no solo e a incidência de tétano no homem é maior nas partes mais quantes dos vários continentes. Clostridium tetani, um anaeróbio com esporos esféricos terminais, é encontrado no solo e nos tratos intestinais. Na maioria dos casos, é introduzido nos tecidos através de ferimentos, particularmente ferimentos de perfuração profunda, que proporcionam um ambiente anaeróbico adequado.

[0018] Infecção com Salmonella spp pode produzir diarréia em animais de todas as idades, especialmente aqueles que estão estressados, armazenados estreitamente, ou expostos a um suprimento de água ou alimento fortemente contaminado. A Salmonelose é causada por muitas espécies de salmonelas e se caracteriza clinicamente por uma ou mais de três síndromes principais — septicemia, enterite aguda, e enterite crônica. A incidência tem aumentado com a intensificação da produção de criação. Embora vários tipos de Salmonellapossam causar infecções em porcos as salmonelas clássicas encontradas em suíno são S. choleraesuis e S. typhimurium. Seus padrões clínicos resultantes da maioria das salmonelas não são espécies de salmone- las distintas e diferentes tendem a diferir em sua epidemiologia. O perfil de plasmídeo e padrões de resistência a fármacos são algumas vezes marcadores úteis para estudos epidemiológicos. A salmonelose septicêmica freqüentemente está associada com S choleraesuis. Leitões infectados demonstram uma relutância para mover, anorexia, uma febre alta de 40,5C a 41,6C, e podem ter uma tosse superficial. Os leitões também podem ser encontardos mortos com extremidades cianóticas. S choleraesuisé uma das raras doenças que podem causar tanto pneumonia quanto diarréia e a mortalidade de leitões infectadoé freqüentemente elevada. Enterocolite é geralmente associada com a S typhimurium mais comum. Infecções são caracterizadas por diarréia amarela ou aquosa que pode conter sangue ou muco à medida que a infecção progride. A mortalidade é baixa e freqüentemente associada com desidratação e deficiência de potássio devidas à diarréia. As fezes de animais infectados podem contaminar o alimento e a água, carnes frescas e processadas de abatedouros, produtos vegetais e animais usados como fertilizantes ou gêneros alimentícios, a pastagem e a extensão de terra, e muitos materiais inertes. Embora raramente seja encontrada S choleraesuis em alimento. Também pode ser passada diretamente através de contato com um animal infectado. A Salmonella pode sobreviver por meses em áreas úmidas e quentes tais como em alimentador de currais de porcos ou em águas subterrâ-neas. Roedores e aves selvagens também são fontes de infecção. A prevalência de infecção varia entre as espécies e países e é muito maior do que a incidência de doença clínica, a qual é comumente precipitada por situações estressantes tais como súbita privação de alimento, transporte, estiagem, aglomeração, parto, e a administração de alguns fármacos.

[0019] Escherichia colié uma bactéria da família enterbacteriace- ae e é um dos principais tipos de bactérias que ocorrem naturalmente nos intestinos delgados de todos os mamíferos. Embora geralmente inofensivas, algumas cepas de E coli podem produzir uma série de exo- e endotoxinas que causam infecção e doença. Exotoxinas termo- lábeis (LT) e termoestáveis (ST) são ativamente produzidas por algumas cepas e são responsáveis por causar diarréia. A doença de edema por verotoxina e toxina semelhante a Shigela tipo II variante (SLT- IIe), Stx2e agem sobre a parede das pequenas artérias resultando em edema. Endotoxinas, tais como Lipídeo A, desempenham um papel em mastite e em infecções do trato urinário. A infecção por E. coli se caracteriza por uma série de diferentes sintomas dependendo da cepa em particular envolvida, incluindo diarréia, olhos encovados, desgaste, perda de peso visível, crescimento interrompido, depressão, edema intestinal, mastite, cistite, pielonefrite e morte. E. coli pode ser classificada e codificada por sua parede celular (antígenos O) e fímbrias (an- tígenos F). Por exemplo, diarréia é freqüentemente associada com E. coli Abbotstown: O147, F4, F5, ao passo que edema intestinal é asso-ciado com fímbrias F18. Identificar corretamente o código é essencial para a seleção da vacina correta. Infecções por E. coli comprometem o sistema imune de um porco e freqüentemente o resultado de infecções secundárias e doença é a morte.

[0020] Pox Suína é uma doença a qual provoca lesões da pele, paules, pústulas e sarnas.

[0021] Eperitrozoonoseé uma doença Rickettsial (hemotrófica) causada por Eperythrozoon suis, um organismo bacteriano extracelu- lar que adere às membranas dos eritrócitos dos porcos, induzindo sua deformação e lesão. A doença é caracterizada por anemia e icterícia (descoloração amarela de membranas mucosas, esclerótica e ouvidos internos). Pode levar a baixas taxas de concepção, outros problemas indefinidos de reprodução, e mesmo morte.

[0022] Peste suína também conhecida como Febre Suína Clássica (CSF) ou Febre Suína Africana (ASF) é uma doença causada por um vírus Flaviviridae, o qual é um vírus de RNA envelopado, ou no caso da Febre Suína Africana, um vírus de DNA envelopado que é relacionado com os Pox vírus. Clinicamente, a Febre Suína Clássica e a Febre Suína Africana são indistinguíveis. Os primeiros sintomas são uma redução na atividade e sonolência com alguma anorexia e o suíno po- de parecer resfriado. Dentro de dias, os porcos apresentam uma febre acentuada (41 a 42 graus Celsius), a qual algumas vezes é acompanhada por um avermelhamento da pele. Em seguida, os porcos desenvolvem uma conjuntivite e constipação levando a diarréia amarelada. Em rebanhos, os porcos parecerão resfriados e freqüentemente se ajuntarão confusamente. Uns poucos porcos podem ter convulsões antes de morrer. Os porcos começam a morrer com uma descoloração púrpura da pele se espalhando e freqüentemente a morte ocorre dentro de 10 a 20 dias pós-infecção. Os porcos sobreviventes algumas vezes serão afetados por um grave retardo de seu crescimento e dorsos arqueados. Em rebanhos estabelecidos, leitões infectados por suasmães durante a gravidez podem resultar em abortamento, mumifi- cação, malformações, partos de natimortos e leitões nascidos fracos. Leitões nascidos de mães infectadas com Febre Suína Clássica podem permanecer saudáveis mas continuamente espalham a doença por toda a sua vida.

[0023] Pasteurelose pneumônicae Estreptococos são causados por Pasteurella multocida e várias espécies de estreptococos, tipicamenteS. suis. Infecção pelo agente causal geralmente representa o estágio final da síndrome respiratória pós-desmame. Os sinais clínicos aparecem em três formas, a forma aguda é mais comumente associada com P. multocida sorotipo B. Os animais se apresentam com dispnéia, respiração penosa, palpitação, febre alta (42,2°C), prostração, e finalmente morte. Em alguns casos o abdômen se torna púrpura com descoloração. Uma segunda forma é uma forma subaguda caracterizada por pleurite, tosse, e dificuldade para respirar. Os porcos podem perder quantidades significativas de peso e podem ter pouco ou nenhum crescimento com sérias conseqüências sobre a circulação do porco. A forma crônica se apresenta com a tosse ocasional, palpitação, e pouca ou nenhuma febre. Esta forma geralmente afeta porcos de 10 a 16 semanas de idade.

[0024] Meningite Estreptocóccicacausa inflamação das meninges as quais são as membranas que recobrindo o cérebro. No leitão não desmamado geralmente é causada por Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, ou algumas vezes bactérias tais como E. coli e outros estreptococos. S. suis tem muitos sorotipos. Na maioria dos países S. suis tipo 1 é o principal sorotipo em leitões não desmamado, mas isto pode não ser verdade em outros países. Por exemplo, na Dinamarca é tipo 7. S. suistambém provoca problemas articulares, particularmente tipos 1 e 14. S. suisé carregado por longos períodos nas amídalas e pode ser transmitido para o leitão não desmamado pela porca ou a partir de outros leitões. A porca também proporciona um nível de imunidadevariável no colostro. A meningite estreptocóccica em leitões não desmamado é esporádica em leitões individuais. A meningite es- treptocóccica pode ser pior em porcos não desmamados quando o organismo foi introduzido no rebanho pela primeira vez, ou onde é secundária a infecção com PRRS.

[0025] Pseudorabies,também conhecido como vírus da raiva porcina, Suid herpes vírus no qual o agente causal é um vírus de DNA da herpes envelopado. Em rebanhos naive, porcos neonatais se apresentam com uma série de sinais nervosos centrais graves desde espasmos a grave em coordenação. Pode resultar paralisia posterior em leitões sentando em uma maneira que se assemelha aos cachorros. Adicionalmente, a mortalidade é elevada. Em porcos desmamados, os sinais nervosos centrais podem ser reduzidos, mas podem ser acompanhados por um aumento nos sinais respiratórios. Freqüentemente, as doenças respiratórias são associadas com infecções secundárias. Porcos desmamados podem definhar e sofrer doença de desenvolvimento e freqüentemente têm o desenvolvimento interrompido. Em porcos em crescimento, os sinais nervosos centrais continuam a reduzir, enquanto os sinais respiratórios aumentam. O grau da doença respiratória depende da presença e da gravidade de infecções secundárias. Em adultos, predominam os sinais reprodutivos. As porcas podem abortar e animais infectados próximos do termo têm a probabilidade de parir natimortos ou leitões fracos. Em rebanhos estabelecidos, podem haver poucos sinais clínicos.

[0026] O Vírusda Influenza Suínacausa gripe suína e pertence ao grupo do vírus da influenza Tipo A. Em rebanhos naive, os sinais clínicos podem se apresentar em surtos explosivos com todos ou muitos animais adoecendo ao mesmo tempo. Os animais podem se apresentar com inatividade, depressão, amontoados/empilhados e com anorexia. Os animais freqüentemente estão respirando pela boca e a respiração é laboriosa. Pode resultar tosse com o movimento. Outros sinais clínicos incluem uma secreção nasal e olhos inchados com temperaturasretais entre 40,5 a 41,5°C. As temperaturas elevadas em um estoque de reprodução podem resultar em abortamentos, infertilidade, produção de ninhadas fracas e pequenas, e aumento de partos de natimortos. Em rebanhos estabelecidos, aparece reinfecção anual.

[0027] Colite por espiroqueta é causada pelas bactérias Brachyspi- ra pilosicoli. Esta infecção geralmente afeta produtores/acabadores de 10 a 20 semanas de idade. Caracteriza-se por uma diarréia debilitante não fatal de porcos em crescimento que resulta em um número aumentado de dias necessários para acabar. A diarréia também resulta em redução na eficiência alimentar e produz diarréia aquosa a fezes moles. Cerca da metade dos porcos podem apresentar diarréia transitóriaa persistente a aquosa a verde mucóide a amarronzada sem sangue. Os sinais clínicos são mais comuns 10 a 14 dias depois de misturação e troca da ração.

[0028] A desinteria suína é causada pelas bactérias Brachyspira hyodysentheriae. Há doze sorotipos conhecidos atualmente. Os sinais clínicos em rebanho estabelecido incluem diarréia, uma rápida perda da condição em alguns porcos, um aspecto peludo, desidratação, abdômen doloroso, e a morte de um ou dois porcos antes de outros porcos apresentarem quaisquer sinais. Em um surto chave em rebanhos naive, todos os grupos etários desde leitões em aleitamento a porcas adultas podem ser afetados.

[0029] Gastroenterite transmissível é uma doença dos intestinos causada por um coronavírus. É da mesma família que o coronavírus respiratório porcino, o vírus da diarréia epidêmica, e o vírus da encefa- lomielite hemaglutinante. Sinais clínicos iniciais são diarréia aquosa, vômito, e anorexia. Leitões de menos de 21 dias de idade geralmente morrem, leitões desmamados se tornam inúteis, ao passo que produtores, acabadores, e adultos geralmente são afetados moderadamente e sobreviverão caso lhes seja proporcionada água adequada.

[0030] Parvovirus é uma doença caracterizada por problemas reprodutivos em porcos. O agente causal é um pequeno vírus de DNA não-envelopado. Os fetos são o único grupo afetado e o efeito sobre o feto depende da idade na qual se torna infectado. Aos 10 a 30 dias de idade, a infecção resulta e morte e reabsorção do feto. Entre 30 a 70 dias de idade, a infecção resulta em morte e mumificação. E a partir de 70 dias até o termo, as infecções resultam no nascimento de leitões fracos e mumificação. A doença tem a capacidade de cruzar a placenta e em seguida mover para cada feto ao longo do útero. Na porca, os sinais clínicos são partos de natimortos, leitões mumificados, mortes embrionárias, infertilidade, e a produção de um número significativa-mente reduzido de filhotes nascidos vivos. O abortamento não é um aspecto característico da infecção por parvovírus.

[0031] Actinobacillus pleuropneumonia, também conhecida como APP e pleuropneumonia por Haemophilus, é causada pelas bactérias Actinobacillus pleuopneumonia. Há 15 sorovírus correntemente descri- tos e a gravidade dos sinais clínicos difere entre os diferentes soroví- rus e a presença de outros fatores. Os sorovírus 1, 5, 9, 10, e 11 são considerados os mais virulentos. Adicionalmente, os sorovírus 1, 9, e 11; 2, 6, e 8; e 4 e 7 podem ter reação cruzada. Porcos de todas as idades são suscetíveis. Os sinais clínicos são uma doença súbita que resulta nos animais deitando muito e apresentando uma temperatura retal elevada de 41,5° Celsius. Geralmente, os animais são anoréxicos e não bebem, suas extremidades se tornam cianóticas e frias ao toque. A cianose pode se espalhar para todo o corpo e graves dificuldades de respiração, freqüentemente com respiração pela boca, se desenvolvem antes da morte. Espuma cor de sangue pode ser vista na boca e narinas e geralmente ocorre a morte dentro de 24 a 48 horas. Sinais clínicos agudos incluem uma alta percentagem de animais em um grupo sendo deprimido e deitando, temperaturas retais elevadas de 40,5 a 41° Celsius, anorexia, sem beber, com angústia respiratória severa, tosse, respiração pela boca, cianose, vômito, e abortamento. Sinais clínicos subagudos incluem tosse intermitente em um grupo de porcos, uma falta geral de apetite, e uma redução no crescimento. Cyrovar tipo 3 se apresenta com artrite, endocardite, e abscessos. Em rebanhos cronicamente afetados, o ganho de peso diário pode não ser afetado, mas pode ser ouvida uma tosse intermitente.

[0032] Doença de Glassers é causada pela bactéria Haemophilus parasuis (Hps), das quais há no mínimo quinze tipos diferentes. É encontrada em todo o mundo e os organismos estão presentes mesmo em rebanhos com boa saúde. Se semelhantes rebanhos são estabelecidos usando técnicas de SPF ou MEW e são livres de Hps, podem ser devastadores quando se tornam contaminados pela primeira vez, produzindo uma doença semelhante a antrax com alta mortalidade em porcas. Na maioria dos rebanhos nos quais a bactéria é endêmica, as porcas produzem uma forte imunidade materna a qual normalmente persiste em sua prole até 8 a 12 semanas de idade. Em conseqüência, os efeitos da infecção em leitões desmamados são geralmente nulos ou mínimos. No entanto a doença pode ser vista em porcos em aleitamento. Geralmente, os porcos se tornam infectados subclinicamente quando ainda protegidos por anticorpo materno e em seguida estimulam sua própria reação imune. Se, no entanto, a imunidade materna desaparece antes deles se tornarem infectados, eles podem desenvolver doença grave. Isto geralmente é um pouco depois do desmame. Também pode agir como um patógeno secundário a outras doenças importantes particularmente pneumonia enzoótica (EP) (Mycoplasma hyopneumoniae). Surtos de doença são às vezes experimentados em porcos não desmamados, particularmente em rebanhos de porcas. Hps ataca as superfícies lisas das articulações, revestimentos dos intestinos,pulmões, coração e cérebro causando pneumonia, infecção da bolsa cardíaca, peritonite e pleurisia. É disseminada por via respiratória. Doença provocada por Hps é rara em porcas a menos que a porca a seco seja naive. Coxeadura ou enrijecimento, ligeiras tumefa- ções sobre as articulações e tendões, e raramente meningite, são vistos ocasionalmente em porcas. Em leitões, a doença aguda se apresenta com porcos rapidamente deprimidos com temperatura elevada, inapetência, e uma relutância para levantar. Um aspecto característico é uma tosse curta de 2 a 3 episódios. Não é incomum morte súbita em leitões que mamam bem. Também se sabe que Hps causa casos individuais de artrite e coxeadura com febre e inapetência. A doença crônica se caracteriza por porcos pálidos e com crescimento sinsuficiente. Também pode ocorrer morte súbita. Para leitões desmamados e produtores, porcos com doença de Glassers se tornam rapidamente deprimidos ou podem ser encontrados mortos. Outros sintomas incluem temperatura elevada, anorexia, uma relutância para levantar, sinais nervosos tais como espasmos e convulsões incluindo meningite, e fre- qüentemente resultam porcos abatidos, que se encontram enfraquecidos e peludos. Em porcos jovens em crescimento, os seguintes sintomassão os mais comuns: febre, meningite moderada, artrite, coxeadu- ra, pneumonia, infecção da bolsa cardíaca, peritonite e pleurisia. Novamente, um aspecto característico é uma tosse curta de somente 2 a 3 episódios.

[0033] Epidermite exudativa é causada pela bactéria Staphylococcus hyicus a qual vive normalmente sobre a pele sem causar doença. Não se sabe porque algumas vezes subitamente inflama-se e causa uma dermatite a qual exsuda fluido graxo. Produz toxinas as quais são absorvidas no sistema e danificam o fígado e os rins. No leitão não desmamado a doença geralmente é confinada a animais individuais, mas pode ser um problema importante em novos rebanhos de porcas e porcos desmamados. Durante os dias imediatamente precedentes à parição, a bactéria se multiplica profusamente dentro da vagina da porca de modo que os leitões são infectados durante o processo do parto ou logo depois disso. Sintomas em porcas incluem lesões inco- muns, porém localizadas podem ser vistas particularmente atrás da face e dos olhos. Leitões gravemente afetados morrerão. Em leitões, os sintomas incluem lesões localizadas sobre os flancos e atrás das orelhas. As lesões geralmente começam com pequenas áreas de infecção escuras e localizadas em torno da face ou sobre as pernas. E pele ao longo dos flancos, o abdômen e entre as pernas muda para uma cor marrom, envolvendo gradualmente todo o corpo. A pele se torna enrugada com descamação de grandes áreas e tem uma sensa-ção graxa. Em casos graves, a pele se torna preta devido à necrose e os leitões morrem. Um quadro mais localizado é visto se a porca tiver passado alguma imunidade para o leitão, com pquenas lesões circunscritas de aproximadamente 5 a 10 mm de diâmetro que não se espalham. Para leitões desmamados e produtores, os sintomas geral- mente começam cerca de 3 dias depois do desmame com áreas marrons localizadas de infecção ou dermatite em torno da face ou sobre as pernas, onde a pele tenha sido danificada. Pode ulcerar. A pele ao longo dos flancos, o abdômen e entre as pernas muda para uma cor marrom envolvendo gradualmente todo o corpo. A pele se torna enrugada com descamação de grandes áreas e progride para uma textura graxa escura e em casos graves se torna preta. Estes casos geralmente morrem devido às toxinas produzidas pelos organismos estafi- lococos. Em criadouros até 15% da população pode estar envolvida e a desidratação é comum.

[0034] A erisipela suína é provocada por uma bactéria, Erysipe- lothrix rhusiopathiae que é encontrada na maioria das fazendas de porcos, se não em todas. Até 50% dos animais podem ser portadores da erisipela suína em suas amídalas. Está sempre presente ou no porco ou noambiente porque é excretada através da saliva, das fezes ou da urina. Também é encontrada em muitas outras espécies, incluindo aves e carneiros, e pode sobreviver fora do porco por umas poucas semanas e por mais tempo em solos iluminados. Portanto é impossível eliminá-la de um rebanho. Fezes infectadas são provavelmente a principal fonte de infecção, particularmente em pocilgas de crescimento e acabamento. A bactéria sozinha pode causar a doença, mas infecções virais simultâneas, tais como PRRS ou influenza, podem disparar surtos. A doença é relativamente incomum em porcos abaixo de 8 a 12 semanas de idade devido à proteção proporcionada por anticorpos maternos a partir da porca através do colostro. Os animais mais suscetíveis são porcos em crescimento, porcas não vacinadas, e porcas até a 4a. paridade. O organismo se multiplica no corpo, e invade a correntesangüínea para produzir uma septicemia. A rapidez da multiplicação e o nível de imunidade no porco então determina os sintomas clínicos.

[0035] Eperitrozoonose (Epe) é uma doença causada por uma bactéria denominada Eperythrozoonosis suis a qual ataca a superfície das hemácias e algumas vezes as destrói. O porco pode então ficar anêmico e os produtos deixados depois da destruição das células podem causar icterícia. A doença clínica é vista mais comumente em porcos jovens em crescimento. No entanto, também pode causar problemas reprodutivos no rebanho de reprodução. Uma porca pode carregar Epe e ainda permanecer bastante saudável, no entanto, esta pode cruzar a placenta resultando em porcos pálidos e fracos ao nascer. Epe está presente na maioria se não em todos os rebanhos, mas são desconhecidos os mecanismos que permitem que se torne patogênica e produza doença em algumas populações e não em outras. A incidência da doença é baixa.

[0036] Encefalomiocardite, ou EMC, infecta e causa doença em uma ampla gama de animais vertebrados mais os porcos parecem ser as mais suscetíveis das espécies de animais de criação. O vírus é mundial, mas difere em patogenicidade e virulência em diferentes países e regiões. Na maioria dos países da Europa, particularmente os na União Européia, tende a ser relativamente brando ou não patogênico e a doença em porcos raramente é diagnosticada. Na Austrália as cepas parecem ser muito mais virulentas para os porcos do que as na Nova Zelândia. Cepas virulentas na Flórida, no Caribe e provavelmente na América Central danificam o coração e causam a morte ao passo que as cepas no Meio Oeste dos Estados Unidos tendem a causar problemas reprodutivos. A doença clínica em porcos tende a ocorrer quando os números de ratos aumentam para níveis de praga. Os porcos podem ser infectados por ratos ou por ração ou água contaminada por rato. Não parece se disseminar muito prontamente entre porcos. Em rebanhos afectados geralmente não há sinais clínicos em porcos desmamados e em crescimento.

[0037] Doença de Aujeszky, ou AD, é uma importante doença de porcos causada por um herpes vírus. O vírus pode permanecer oculto nos nervos do porco em um estado de portador por longos períodos de tempo e em seguida ser reativado. Uma vez introduzido em um rebanho, o vírus geralmente aí permanece e pode afetar continuamente a performance reprodutiva em níveis variáveis. O vírus pode sobreviver por até três semanas fora do porco. Surtos agudos de doença ocorrem quando cepas virulentas do vírus infectam primeiro um rebanho suscetível não vacinado. O vírus cruza o útero e a placenta e infecta os fetos. O porco é o principal hospedeiro. No entanto, cães e gado vacuum também podem ser tornar infectados, apresentar sinais nervosos, e morrer.

[0038] Infecção por Cytomegalovirus Porcino (PCMV) é causada por um herpes vírus encontrados nos tecidos em todo o corpo incluindo o nariz de leitões recém-nascidos onde causa inflamação (rinite). PCMV está presente em todo o mundo e existe na maioria se não em todas as populações de porcos, mas a maioria das infecções são sub- clínicas e é rara a doença clínica. Sorologia realizada no Reino Unido, por exemplo, indica que mais de 90% dos rebanhos foram expostos a infecção. A rinite produzida por este vírus é incomum e ocorre essencialmente em porcos recém-nascidos e não tem relação com rinite atrófica causada pelas bactérias produtoras de toxina Pasteurella mul- tocidia. Na maioria dos rebanhos, portanto a infecção é insignificante e além de às vezes provocar um espirro moderado não tem efeito importante sobre a saúde do porco.

[0039] A Doença dos Olhos Azuis é uma doença viral que causa sintomas nervosos, falência reprodutiva e opacidade ou azulamento da córnea. É vista essencialmente no México mas também foi reportada em outros países. Não é vista na Europa. Os sintomas incluem inapetência,opacidade corneal - conjuntivite, sinais nervosos tais como es- pasmos e convulsões, uma tendência a sentar como um cachorro, febre, aumento de recaídas, aumento de desmame a intervalos de acasalamento, partos de natimortos, leitões mumificados, alta mortalidade em leitões, testículos inchados, e perda da libido.

[0040] Vírusda B Encefalite Japonesa (JE) é um vírus disseminado por mosquitos e somente é importante em países onde os insetos são prevalentes. A maioria dos animais domésticos é afetada. Provoca uma encefalite no homem. O porco é uma importante fonte de infecção. Os sintomas incluem leitões mumificados ou natimortos, sinais nervosos em leitões tais como espasmos e convulsões, e fluido de edema em leitões. Também pode causar infertilidade e testículos inchados em porcos não-castrados.

[0041] Diarréia Epidêmica Porcina (PED) é causada por um coro- navírus um tanto similar ao que causa TGE. Este vírus está disseminado na Europa. O vírus danifica os vilos nos intestinos deste modo reduzindo a superfície absortiva, com perda de fluido e desidratação. Depois da introdução do vírus em um rebanho de reprodução suscetível, desenvolve-se uma forte imunidade durante duas a três semanas. A imunidade colostral então protege os leitões. O vírus geralmente desaparece espontanemente de rebanhos de reprodução particularmente pequenos (< 300 porcas). Ocorrem surtos agudos de diarréia quando o vírus é introduzido pela primeira vez em uma população suscetível. Em tais casos até 100% das porcas podem ser afetados, apresentando uma diarréia branda a muito aquosa. São reconhecidos dois quadrosclínicos: PED Tipo I somente afeta porcos em crescimento ao passo que PED Tipo II afeta todas as idades incluindo porcos não desmamados e porcas maduras. O período de incubação é de aproximadamente 2 dias e a diarréia dura por 7 a 14 dias. Em porcos não desmamados, a doença pode ser branda ou grave com mortalidades de até 40%. Em grandes rebanhos de reprodução, particularmente se mantidas extensivamente, nem todas as fêmeas podem se tornar infectadas em torno da primeira vez e pode haver recrudescência. Isto somente ocorre em leitões em aleitamento de porcas sem anticorpos maternos e portanto é esporádico.

[0042] A Infecção por Corona Vírus Respiratório Porcino (PRCV) apareceu primeiro em porcos na Europa há uns dez anos atrás ou mais. Está relacionada com mas é distinta do vírus TGE, o qual é outro corona vírus. Imagina-se que se dissemine entre as fazendas no vento e portanto é extremamente difícil de manter os rebanhos livres da mesma. Freqüentemente ocorre infecção no porco não desmamado com 2 a 3 semanas de idade, mas não é importante. Pode ter um efeito sobre o tecido pulmonar quando outros patógenos respiratórios estão presentes em complexos de doenças respiratórias crônicas. As porcas geralmente não apresentam sintomas, mas pode ocorrer tosse na presença de outros agentes respiratórios em que a tosse possa ser associada. Em leitões, pode estar presente uma tosse transitória. Em leitões desmamados e produtores, rebanhos expostos pela primeira vez têm nenhum ou poucos sinais de doença. O sintoma mais comum é uma tosse transitória durando somente umas poucas horas.

[0043] Infecção por Rotavírus é uma infecção viral que é muito difundida em populações de porcos. Está presente na maioria se não em todos os rebanhos de porcos com virtualmente uma soro- conversão de 100% no estoque adulto. Uma característica epidemio- lógica adicional é sua persistência fora do porco onde é resistente a alterações ambientais e muitos desinfetantes. Os anticorpos maternos persistem por 3 a 6 semanas depois das quais os porcos se tornam suscetíveis a infecção, mas a exposição não resulta necessariamente em doença. Estima-se que somente 10 a 15% das diarréias em porcos sejam iniciadas por uma infecção por rotavírus primária. Em um rebanho maduro, a doença aparece depois dos leitões terem 7 a 10 dias de idade. Torna-se progressivamente menos importante com a idade. No entanto se estiverem presentes cepas patogênicas de E. coli, pode ocorrer doença grave com alta mortalidade.

[0044] Raiva é causada por um vírus e é considerada uma doença rara em porcos. Invariavelmente é fatal em todas as espécies incluindo o homem - portanto sua importância. A raiva está ausente do Reino Unido, porém presente em muitos outros países em todo o mundo. A infecção em leitões e porcas é rara. Em porcas, leitões desmamados, e produtores, o início da doença é súbito com sintomas que incluem uma contração nervosa dos músculos da face, espasmos e convulsões, rápida mastigação, salivação, músculos que podem chegar ao espasmo, e pode ocorrer paralisia posterior. Geralmente a morte ocorre dentro de 3 dias.

[0045] Doença Vesicular Suína (SVD) é um vírus diferente do vírus que causa doença de pés e boca (FMD). No entanto, produz uma doença em porcos que é clinicamente indistinguível da FMD. Esta doença deve ser sempre considerada se aparecer coxeadura súibita disseminada com vesículas ou bolhas sobre o focinho, a língua e parte de cima das patas.

[0046] Tuberculose afeta mamíferos, incluindo pessoas, aves, e suínos. O organismo causal, Mycobacterium tuberculosis, é subclassi- ficado em tipos, humano, bovino e avícola. O tipo avícola é referido como M. avium ou mais freqüentemente o complexo avium/intracellulare porque não é uma espécie uniforme. O próprio M. avium infecta essencialmente aves mas também é encontrado no ambiente junto com M. intracellulare o qual é predominantemente saprofí- tico ou de vida livre. Os porcos são raramente infectados pelos tipos humano ou bovino, mas são comumente infectados pelo complexo avian/intracellulare. O complexo avian/intracellularetambém causa infecção subclínica não-progressiva em pessoas saudáveis. A principal preocupação é que pode causar doença mais grave em pessoas imu- nossuprimidas e pessoas com AIDS. Na maioria dos países, se são encontradas lesões no pescoço durante o abate, toda a cabeça é condenada e se são encontradas nos linfonodos mesentéricos os quais drenam os intestinos, as vísceras são condenadas. Se estiverem mais disseminados no corpo, o que é raro, toda a carcassa pode ser condenada ou cozida. Caso pequenas lesões não forem vistas pelo inspetor de carne o cozimento na cozinha normal destrói o organismo. Em todos os porcos, infecção causa pequenos nódulos nos linfonodos do pescoço e os que drenam o intestino delgado. Na grande maioria de casos as lesões são não-progressivas, não se espalham pelo corpo, não tornam o porco doente e não são excretadas. Não há sintomas clínicos e não há diferença na performance entre porcos infectados e não-infectados.

[0047] O vírus deo exantema vesicular do suíno(VES) é diferente dos que causam a doença dos pés e da boca (FMD) e a doença vesicular suína (SVD), mas produz uma doença em porcos que é clinicamenteindistinguível de FMD e SVD. Diferentemente de FMD, somente afeta porcos. Os sintomas incluem baixa mortalidade, mas pode haver algumas mortes em leitões em aleitamento. Outros sintomas incluem salivação, inapetência, e vesículas em torno da boca, nariz, língua e pés.

[0048] Estomatite Vesicular (VS) causa uma doença que ocorre essencialmente na América do Sul e Central, ocasionalmente nos Estados Unidos e raramente como epidemias se estendendo tão ao Norte quanto o Canadá e tão ao Sul quanto a Argentina. O vírus da esto- matite vesicular produz uma doença em porcos que é clinicamente indistinguível FMD, SVD e VES. O mais freqüentemente, no entanto, a infecção de porcos é subclínica. Em todos os porcos, a infecção se caracteriza por babar saliva, lesões das patas e coxeadura, uma redu- ção na taxa de crescimento, um aumento na temperatura corporal para 40 a 41°C (106 a 107°F), o aparecimento de vesícula s (bolhas) até 30 mm de diâmetro no nariz, lábios, e tetas e em torno das coroas das patas que pode fazer os porcos mancar. A mortalidade geralmente é baixa e a maioria dos porcos se recupera em uma a duas semanas.

[0049] Rinite Atrófica, Doença Progressiva e Não progressiva a qual causa inflamação do nariz e pode ser causada por uma variedade de bactérias e substâncias irritantes. Durante o processo de infecção, as delicadas estruturas ou ossos turbinados no nariz se tornam danificadas e atrofiam ou desaparecem. Rinite atrófica progressiva descreve uma doença específica onde os tecidos do nariz atrofiam permanentemente.É causada por cepas de Pasteurella multocidia (PMt) produtoras de toxina específicas. Há dois tipos A e D. Em porcos não desmamados, espirro, defluxo e uma secreção nasal são os primeiros sintomas, mas em surtos agudos onde há pouco anticorpo materno, a rinite pode ser tão grave até a extensão de que haja hemorragia do nariz. Por volta de três a quatro semanas de idade e do desmame em diante, há evidência de manchamento da lágrima e malformação do nariz associada com deformação e encurtamento. Porcos gravemente afetados podem ter problemas para comer. Há ganho de peso diário consideravelmente reduzido. Em vários surtos os porcos podem não crescer até o peso do mercado.

[0050] Vírus da Encefalomielite Eqüina Oriental (EEEV) são membros do gênero Alphavirus, família Togaviridae. EEEV pode ser transmitido para eqüinos e seres humanos durante a mordida de um mosquito infectado. Além de cavalos e seres humanos, EEEV pode produzirdoença grave em espécies de criação comum tais como suíno e gado vacuum. EEEV, ou anticorpos vírus-específicos, têm sido recuperados de aves tais como o peru, faisão, codorna, avestruz, e casuar, entre outros.

[0051] Artrite por Mycoplasma é provocada por infecção por Mycoplasma hyosynoviae. Esta artrite, é caracterizada por inflamação de uma ou mais articulações e é comum em todos os porcos não desmamados e em crescimento e porcas. No entanto, é rara em leitões.

[0052] Infecção em suíno também é provocada por adenovíruse vírus da encefalomielite hemaglutinante.

[0053] Por conseguinte, o que é necessário na técnica é um método para obter proteína ORF2, o qual não requer extração da proteína ORF2 de dentro das células infectadas. O que é adicionalmente necessário são métodos para obter proteína ORF2 recombinante em quantidades suficientes para preparar de modo eficaz composições de vacina. O que é ainda adicionalmente necessário são métodos para obter proteína ORF2 os quais não requerem os métodos complicados e de trabalho intensivo necessários para os protocolos correntes de extração de proteína ORF2. Finalmente, com respeito a composições, o que é necessário na técnica é uma composição imunogênica a qual confere imunidade protetora contra infecção por PCV2 e reduz a gravidade de ou previne os sinais clínicos associados com a mesma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0054] A presente invenção supera os problemas inerentes na técnica anterior e proporciona um distinto avanço no estado da técnica. Especificamente, um aspecto da presente invenção proporciona métodos aprimorados para produzir e/ou recuperar proteína recombinante de ORF2 de PCV2, i) permitindo infecção de células suscetíveis em cultura com um vetor viral recombinante contendo seqüências codifi- cantes de DNA de ORF2 de PCV2, em que proteína ORF2 é expressada pelo vetor viral recombinante, e ii) depois disso recuperar a ORF2 no sobrenadante. Foi inesperadamente descoberto que ORF2 é liberado no sobrenadante em grandes quantidades se a infecção e in- cubação subseqüente das células infectadas é deixada para progredir além do último processo de recuperação de ORF2 de PCV2 anterior típico, o qual extrai o ORF2 de PCV2 de dentro das células. Além disso foi visto surpreendentemente que proteína ORF2 de PCV é forte contra degradação prototípica fora das células de produção. Ambos os achados juntos permitem uma recuperação de altas quantidadeds de proteína de ORF2 de PCV2 do sobrenadante de culturas celulares infectadas com vetores virais recombinantes contendo um DNA de ORF2 de PCV2 e expressando a proteína de ORF2 de PCV2. Altas quantidades de proteína de ORF2 de PCV2 significa mais de cerca de 20 μg/mL de sobrenadante, preferencialmente mais de cerca de 25 μg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 30 μg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 40 μg/mL, ainda mais pre-ferencialmente mais de cerca de 50 μg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 60 μg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 80 μg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 100 μg/mL, ainda mais preferencialmente mais de cerca de 150 μg/mL, o mais preferencialmente mais de cerca de 190 μg/mL. Estes índices de expressão também podem ser obtidos, por exemplo, pelos métodos conforme descrito nos Exemplos 1 a 3.

[0055] Culturas celulares preferenciais têm uma contagem celular entre cerca de 0,3 a 2,0 x 106 células/mL, mais preferencialmente de cerca de 0,35 a 1,9 x 106 células/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,4 a 1,8 x 106 células/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,45 a 1,7 x 106 células/mL, e o mais preferencialmente de cerca de 0,5 a 1,5 x 106 células/mL. Células preferenciais são determináveis pelos versados na técnica. Células preferenciais são os suscetíveis para infecção com um vetor viral recombinante apropriado, contendo um DNA de ORF2 de PCV2 e expressando a proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente as células são células de inseto, e mais preferencialmente, incluem as células de inseto vendidas sob a marca registrada células de inseto Sf+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT).

[0056] Meio de crescimento apropriado também será determinável pelos versados na técnica com um meio de crescimento preferencial sendo meio de células de inseto livre de soro tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) e semelhantes. Vetores virais preferenciais incluem baculovírus tais como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), em particular se as células de produção forem células de inseto. Embora o sistema de expressão de baculoví- rus seja preferencial, é entendido pelos versados na técnica que outros sistemas de expressão funcionarão para os fins da presente invenção, a saber a expressão de ORF2 de PCV2 no sobrenadante de uma cultura celular. Os sistemas de expressão diferentes referidos requerem o uso de uma seqüência de sinal de modo a provocar expressão de ORF2 no meio. Foi descoberto surpreendentemente que quando ORF2 é produzido por um sistema de expressão de baculovírus, não requer qualquer seqüência de sinal ou modificação adicional para causar expressão de ORF2 no meio. Acredita-se que esta proteína pode formar independentemente partículas semelhantes a vírus (Journal of General Virology Vol. 81, pp. 2281-2287 (2000) e ser secretada no sobrenadante da cultura. O vetor viral recombinante contendo as seqüências de DNA de ORF2 de PCV2 tem uma multiplicidade preferencial de infecção (MOI) de entre cerca de 0,03 a 1,5, mais preferencialmente de cerca de 0,05 a 1,3, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,09 a 1,1, e o mais preferencialmente de cerca de 0,1 a 1,0, quando usado para a infecção das células suscetíveis. Preferencialmente as MOIs mencionadas acima refere-sem a um mL de fluido de cultura celular. Preferencialmente, o método descrito aqui, neste re-querimento de patente, compreende a infecção de 0,35 a 1,9 x 106cé- lulas/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,4 a 1,8 x 106cé- lulas/mL, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,45 a 1,7 x 106 células/mL, e o mais preferencialmente de cerca de 0,5 a 1,5 x 106cé- lulas/mL com um vetor viral recombinante contendo um DNA de ORF2 de PCV2 e expressando a proteína PCV2 ORF tendo uma MOI (multiplicidade de infecção) de entre cerca de 0,03 a 1,5, mais preferencialmente de cerca de 0,05 a 1,3, ainda mais preferencialmente de cerca de 0,09 a 1,1, e o mais preferencialmente de cerca de 0,1 a 1,0.

[0057] As células infectadas são em seguida incubadas por um período de até dez dias, mais preferencialmente de cerca de dois dias a cerca de dez dias, ainda mais preferencialmente de cerca de quatro dias a cerca de nove dias, e o mais preferencialmente de cerca de cinco dias a cerca de oito dias. Condições de incubação preferenciais incluem uma temperatura entre cerca de 22 a 32°C, mai s preferencialmente de cerca de 24 a 30°C, ainda mais preferencia lmente de cerca de 25 a 29°C, ainda mais preferencialmente de cerca de 26 a 28°C, e o mais preferencialmente cerca de 27°C. Preferencia lmente, as células Sf+ são observadas depois de inoculação para alterações induzidas por baculovírus características. A observação referida pode incluir monitoramento das tendências da densidade celular e a redução na viabilidade durante o período de pós-infecção. Foi visto que o pico do título viral é observado 3 a 5 dias depois de infecção e pico de liberação de ORF2 das células no sobrenadante é obtido entre os dias 5 e 8, e/ou quando a viabilidade celular diminui para menos de 10%.

[0058] Portanto, um aspecto da presente invenção proporciona um método aprimorado para produzir e/ou recuperar proteína recombinan- te de ORF2 de PCV2, preferencialmente em quantidades descritas acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressar proteína de ORF2 de PCV2 pelo vetor viral recombinante, e iii) depois disso recuperar o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%. Preferencialmente, o vetor viral recombinante é um baculovírus recombinan- te contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 de PCV2 e as células são células Sf+. Adicionalmente, é preferencial que a cultura seja periodicamente examinada para evidência macroscópica e microscópica de contaminação ou para alterações atípicas na morfologia celular durante o período pós-infecção. Qualquer cultura apresentando qualquer contaminação deve ser descartada. Preferencialmente, a proteína recombinante ORF2 expressada é secretada pelas células no meio de crescimento vizinho que mantém a viabilidade celular. O ORF2 é em seguida recuperado no sobrenadante vizinho às células ao invés das próprias células.

[0059] O processo de recuperação preferencialmente se inicia com a separação de debris celulares do ORF2 expressado no meio através de uma etapa de separação. Etapas de separação preferenciais incluemmétodos de filtração, centrifugação em velocidades até cerca de 20.000 xg, centrifugação de fluxo contínuo, separação cromatográfica usando troca iônica ou filtração por gel, e imunoafinidade convencional. Estes métodos são de conhecimento de pessoas versadas na técnica, por exemplo, por (Harris and Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL press Oxford 1995). Os métodos de separação mais preferenciais incluem centrifugação em velocidadesaté cerca de 20.000 xg e filtração. Métodos de filtração preferenci-ais incluem microfiltração de ponta morta e filtração de fluxo tangencial (ou fluxo cruzado) incluindo microfiltração de ponta morta de filtração de fibra oca. Destes, é preferencial microfiltração de ponta morta. Tamanhos de poro preferenciais para microfiltração de ponta morta são entre cerca de 0,30 a 1,35 μm, mais preferencialmente entre cerca de 0,35 a 1,25 μm, ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,40 a 1,10 μm, and o mais preferencialmente entre cerca de 0,45 a 1,0 μm. Acredita-se que qualquer membrana de filtração convencional funcionará para os fins da presente invenção e são preferenciais membranas de polietersulfona. Quaisquer espécies de ácido nucléico de baixo peso são removidas durante a etapa de filtração.

[0060] Portanto, um aspecto adicional da presente invenção proporciona um método aprimorado para produzir e/ou recuperar proteína recombinante de ORF2 de PCV2, preferencialmente em quantidades descritas acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressando proteína ORF2 de PCV pelo vetor viral recombinante, iii) recuperando o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%, e, iv) separando debris celulares do ORF2 de PCV2 expressado através de uma etapa de separação. Preferencialmente, o vetor viral recombinan- te é um baculovírus contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 e as células são células SF+. Etapas de separação preferenciaissão as descritas acima. A mais preferencial é uma microfiltração de ponta morta usando uma membrana tendo um tamanho de poro entre cerca de 0,30 a 1,35 μm, mais preferencialmente entre cerca de 0,35 a 1,25 μm, ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,40 a 1,10 μm, e o mais preferencialmente entre cerca de 0,45 a 1,0 μm.

[0061] Para recuperação de ORF2 de PCV2 que será usado em uma composição imunogênica ou imunológica tal como uma vacina, a inclusão de uma etapa de inativação é preferencial de modo a inativar o vetor viral. Uma "composição imunogênica ou imunológica"refere-se a uma composição de substância que compreende no mínimo um an- tígeno o qual provoca uma reação imunológica no hospedeiro de uma reação imune celular e/ou mediada por anticorpos para a composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "reação imunológica"inclui mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células yd T, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferencialmente, o hospedeiro apresentará ou uma reação imunológica terapêutica ou protetora tal que a resistência a nova infecção será reforçada e/ou a gravidade clínica da doença será reduzida. A proteção referida será demonstrada ou por uma redução ou falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título viral reduzido no hospedeiro infectado. Portanto, a presente invenção também refere-se a método para produzir e/ou recuperar proteína recom- binante de ORF2 de PCV2, preferencialmente em quantidades descrito acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressando proteína ORF2 de PCV pelo vetor viral recombinante, iii) recuperando o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%, iv) separação de debris celulares do ORF2 de PCV2 expressado através de uma etapa de separação, e v) inativando o vetor viral recombinante.

[0062] Preferencialmente, esta inativação é feita ou logo antes ou logo depois da etapa de filtração, com depois da etapa de filtração sendo o momento preferencial para inativação. Qualquer método de inativação convencional pode ser usado para os fins da presente invenção. Portanto, pode ser realizada inativação por tratamentos químicos e/ou físicos. Em formas preferenciais, o volume dos fluidos colhidosé determinado e a temperatura é trazida para entre cerca de 32 a 42°C, mais preferencialmente entre cerca de 34 a 40°C, e o mais preferencialmente entre cerca de 35 a 39°C. Métodos de inativação preferenciais incluem a adição de etilenimina binária ciclizada (BEI), preferencialmente em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 20 mM, mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM, e o mais preferencialmente de cerca de 5 mM. Por exemplo, a inativação inclui a adição de uma solução de bromidrato de 2-bromoetilenoamina, preferencialmente de cerca de 0,4 M, a qual foi ciclizada para 0,2 M de etilenimina binária (BEI) em 0,3 N de NaOH, aos fluidos para dar uma concentração final de cerca de 5 mM de BEI. Preferencialmente, os fluidos são em seguida agitados continuamente por 72 a 96 horas e os fluidos colhidos inativados podem ser armazenados congelados a -40°C ou abaixo ou entre cerca de 1 a 7°C. Depois da inativa ção ser completada, uma solução de tiossulfato de sódio tiossulfato de sódio, preferen-cialmente a 1,0 M é adicionada para neutralizar qualquer BEI residual. Preferencialmente, o tiossulfato de sódio é adicionado em quantidade equivalente comparado com a BEI adicionada antes para inativação. Por exemplo, no caso de BEI ser adicionada para uma concentração final de 5 mM, uma solução a 1,0 M de tiossulfato de sódio é adicionada para dar uma concentração mínima final de 5 mM para neutralizar qualquer BEI residual.

[0063] Portanto, um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método para produzir proteína recombinante de ORF2 de PCV2, preferencialmente em quantidades descrito acima, i) permitindo infecção de uma série de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI conforme definido acima, ii) expressar proteína de ORF2 de PCV pelo vetor viral recom- binante, iii) recuperar o ORF2 de PCV2 no sobrenadante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%, iv) separar debris celulares do ORF2 de PCV2 expressado através de uma etapa de separação, e v) inativar o vetor viral recombinante. Preferencialmente, o vetor viral recombi- nante é um baculovírus contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 e as células são células SF+. Etapas de separação preferenciaissão as descritas acima, a mais preferencial é a etapa de filtração. Etapas de inativação preferenciais são as descritas acima. Preferencialmente,é realizada inativação entre cerca de 35 a 39°C e na presença de 2 a 8 mM de BEI, e ainda mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI. Foi visto surpreendentemente que maiores concentrações de BEI afetam negativamente a proteína de ORF2 de PCV2.

[0064] De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o método descrito acima também inclui uma etapa de neutralização depois da etapa v). Esta etapa vi) compreende a adição de uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução. Preferencialmente, se o agente de inativação for BEI, é preferencial a adição de tiossulfato de sódio a uma quantidade equivalente. Portanto, de acordo com um aspecto adicional, a etapa vi) compreende adicionar uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM o mais preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.

[0065] Em formas preferenciais e especialmente em formas que usarão a proteína recombinante de ORF2 de PCV2 em uma composição imunogênica tal como uma vacina, cada lote de ORF2 colhido será testado para inativação por passagem nas células Sf+ suscetíveis a baculovírus, dependentes de ancoragem. Em uma forma preferencial deste experimento, 150 cm2 de monocamada de cultura celular apropriadaé inoculada com 1,0 mL de fluidos de PCV2 inativado e mantido em 25 a 29°C por 14 dias com no mínimo duas passage ns. Ao final do período de manutenção, as monocamadas celulares são examinadsa para efeito citopatogênico (CPE) típico de baculovírus de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, também são usados controles virais positivos. Os controles referidos podem consistir em uma cultura de células Sf+ inoculada com um baculovírus de ORF2 de PCV2 de referência não-inativado e um frasco de células Sf+ que permanecem não inoculadas. Depois de incubação e passagem, a ausência de células infectadas com vírus nos fluidos virais tratados com BEI constituiriam um teste de inativação satisfatório. As células controle inoculadas com o vírus de referência devem apresentar CPE típica de baculovírus de ORF2 de PCV2 e o frasco não inoculado não apresentraria qualquer evidência de CPE de baculovírus de ORF2 de PCV2. Alternativamen-te, ao final do período de manutenção, as amostras de sobrenadante podem ser coletadas e inoculadas sobre uma placa de 96 cavidades de Sf+, a qual foi carregada com células Sf+, e em seguida mantida em 25 a 29°C por 5 a 6 dias. A placa é em seguida f ixada e corada com anticorpo anti-ORF2 de PCV2 conjugado a FITC. A ausência de expressão de CPE e ORF2, conforme detectado por micoscopia IFA, nos fluidos virais tratados com BEI constitui um teste de inativação satisfatório. As células controle inoculadas com o vírus de referência devem apresentar atividade de CPE e IFA e o frasco não inoculado não deve apresentar qualquer evidência de CPE de baculovírus de ORF2 de PCV2 e não deve conter atividade de IFA.

[0066] Portanto um aspecto adicional da presente invenção refere- se a um teste de inativação para determinar a eficácia da inativação do vetor viral de recombinação, compreendendo as etapas de: i) contactar no mínimo uma porção do fluido de cultura contendo o vetor viral re- combinante com um agente inativante, preferencialmente conforme descrito acima, ii) adicionar um agente de neutralização para neutralizar o agente de inativação, preferencialmente conforme descrito acima, e iii) determinar a infectividade residual pelos testes conforme descrito acima.

[0067] Um adicional aspecto da invenção refere-se a um método para construir um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2 em altas quantidades, quando infectado em células suscetíveis. Foi visto surpreendentemente que o vetor viral recombinante conforme proporcionado deste modo expressa altas quantidades, conforme definido acima, de ORF2 de PCV2 depois de infectar células suscetíveis. Portanto, a presente invenção também refere-se a um método aprimorado para produção e/ou recuperação de proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente compreendendo as etapas de: construir um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, o vetor viral é um baculorvírus recombi- nante. Detalhes do método para construir vetores virais recombinantes contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2, conforme proporcionado deste modo, são descritos para os seguintes: Em formas preferenciais o vetor viral recombinante contendo PCV2 ORF 2 DNA e expressando proteína de ORF2 de PCV2 usado para infectar as células é gerado transfectando um vetor de transferência que teve um gene ORF2 clonado no mesmo em um vetor viral. Preferencialmente, somente a porção do vetor de transferência, que contém o DNA de ORF2 é transfectado no vetor viral. O termo "trans- fectado em um vetor viral" significa, e é usado como um sinônimo para "introduzir" ou "clonar" um DNA heterólogo em um vetor viral, tal como, por exemplo, em um vetor de baculovírus. O vetor viral é preferencial- mente mas não necessariamente um baculovírus.

[0068] Portanto, de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o vetor viral recombinante é gerado por recombinação entre um vetor de transferência contendo o DNA heterólogo de ORF2 de PCV2 e um vetor viral, preferencialmente um baculovírus, ainda mais preferencialmente um baculovírus de replicação-deficiente linearizado (tal como Baculo Gold DNA). Um "vetor de transferência"significa uma molécula de DNA, que inclui no mínimo uma origem de replicação, o gene heterólogo, no presente caso ORF2 de PCV2, e seqüências de DNA as quais permitem a clonagem do gene heterólogo referido no vetor viral. Preferencialmente as seqüências as quais permitem a clonagem do gene heterólogo no vetor viral estão flanqueando o gene heterólogo. Ainda mais preferencialmente, as seqüências flanqueantes são no mínimo homólogcas em partes com seqüências do vetor viral. A homologia de seqüência em seguida possibilita recombinação de ambas as moléculas, o vetor viral, e o vetor de transferência para gerar um vetor viral recombinante contendo o gene heterólogo. Um vetor de transferência preferencial é o vetor pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen), o qual é designado para co-transfecção com o Baculo- Gold DNA na linhagem celular Sf+ preferencial. Preferencialmente, o referido vetor de transferência compreende um DNA de ORF2 de PCV2. O constructo co-transfectado tem aproximadamente 10.387 pares de bases de extensão.

[0069] Em formas mais preferenciais, os métodos da presente invenção se iniciarão com o isolamento de DNA de ORF2 de PCV2. Geralmente, este pode ser de uma cepa conhecida ou desconhecida uma vez que o DNA de ORF2 parece ser altamente conservado com no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüência entre diferentes isolados. Qualquer gene de ORF2 de PCV2 conhecido na técnica pode ser usado para os fins da presente invenção uma vez que cada seria expresso no sobrenadante. O DNA de ORF2 de PCV preferencialmenteé amplificado usando métodos de PCR, ainda mais preferencialmente junto com a introdução de uma seqüência de consenso de Kozak flanqueante 5' (CCGCCAUG) (SEQ ID NO 1) e/ou um sítio EcoR1 flanqueante 3' (GAATTC) (SEQ ID NO 2). A referida introdução de uma seqüência de consenso de Kozak 5' preferencialmente remove o códon de partida que ocorre naturalmente AUG de ORF2 de PCV2. O sítio EcoR1 3' preferencialmente é introduzido a jusante do códon de parada do ORF2 de PCV2. Mais preferencialmente é introduzido a jusante de uma seqüência de terminação de transcrição poly A, que é a própria localizada a jusante do códon de parada ORF2 de PCV2. Foi visto que o uso de uma seqüência de consenso de Kozak, em particular conforme descrito acima, aumenta o nível de expressão da proteína de ORF2 de PCV2 subseqüente. O DNA de ORF2 de PCV2 amplifica-do, com estas seqüências adicionais, é clonado em um vetor. Um vetor preferencial para esta etapa de clonagem inicial é o vetor pGEM-T- Easy Vector (Promega, Madison, WI). O DNA de ORF2 de PCV2 incluindo algumas seqüências de vetor pGEM (SEQ ID NO: 7) é preferencialmente excisado do vetor no sítio de restrição Not1. O DNA resultanteé em seguida clonado no vetor de transferência.

[0070] Portanto, em um aspecto da presente invenção, um método para construir um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 é proporcionado. Este método compreende as etapas de: i) clo- nar um ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor de transferência; e ii) transfectar a porção do vetor de transferência contendo o ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral, para gerar o vetor viral recom- binante. Preferencialmente, o vetor de transferência é o descrito acima ou é construído conforme descrito acima ou conforme mostrado exemplarmente na figura 1. Portanto de acordo com um aspecto adicional, o vetor de transferência, usado para a construção do vetor viral recombinante conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, contém a seqüência de SEQ ID NO: 7.

[0071] De acordo com um aspecto adicional, este método adicional compreende antes da etapa i) a seguinte etapa: amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas conforme descrito acima. Métodos in vitro parfa amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 e modificar as seqüências flanqueantes, clonar in vitro DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência e vetores de transferência adequados são descritos acima, mostrados exemplarmente na figura 1, ou de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Portanto, de acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para construir um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2 compreende as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombi- nante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante. Prefe-rencialmente, a modificação das seqüências flanqueantes do DNA de ORF2 de PCV2 é realizada conforme descrito acima, por exemplo, introduzindo uma seqüência de Kozak 5’ e/ou um sítio EcoR1, preferencialmente conforme descrito acima.

[0072] De acordo com um aspecto adicional, um método para produzir e/ou recuperar proteína recombinante expressada por estrutura de leitura aberta 2 de PCV2 é proporcionado. O método geralmente compreende as etapas de: i) clonar um ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor de transferência; ii) transfectar a porção do vetor de transferência contendo o ORF2 de PCV2 recombinante em um vírus; iii) infectar células em meios com o vírus transfectado; iv) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; v) separar células do sobrenadante; e vi) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante.

[0073] Métodos de como clonar um DNA de ORF2 de PCV2 re- combinante em um vetor de transferência são descritos acima. Preferencialmente, o vetor de transferência contém a seqüência de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 7. No entanto, o vetor de transferência pode conter qualquer DNA de ORF2 de PCV2, não modificado ou modificado, contanto que o DNA de ORF2 de PCV2, quando transfectado em um vetor viral recombinante, seja expressado em cultura celular. Preferencialmente, o vetor viral recombinante compreende a seqüência de SEQ ID NO: 8. Além disso, métodos de como infectar células, preferencialmente como infectar células de inseto com um número definido de baculovírus recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2, são descritos acima em detalhes. Além disso, etapas para separar células do sobre- nadante bem como etapas para recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada também são descritas acima em detalhes. Qualquer uma destas etapas do processo específicas, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, são parte do método para produzir e/ou recuperar proteína recombinante expressada por estrutura de leitura aberta 2 de PCV2 conforme descrito acima. Preferencialmente, as células são células SF+. Ainda mais preferencialmente, as culturas celularestêm uma contagem celular entre cerca de 0,3 a 2,0 x 106célu- las/mL, mais preferencialmente a partir de cerca de 0,35 a 1,9 x 106 células/mL, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,4 a 1,8 x 106células/mL, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,45 a 1,7 x 106células/mL, e o mais preferencialmente a partir de cerca de 0,5 a 1,5 x 106células/mL. Preferencialmente, o vetor viral re- combinante contendo o DNA de ORF2 de PCV2 tem uma multiplicidade de infecção preferencial (MOI) de entre cerca de 0,03 a 1,5, mais preferencialmente a partir de cerca de 0,05 a 1,3, ainda mais preferen-cialmente a partir de cerca de 0,09 a 1,1, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,1 a 1,0, e o mais preferencialmente até cerca de 0,5, quando usado para a infecção das células suscetíveis. Preferencialmente, a recuperação da proteína de ORF2 de PCV2 no sobrena- dante de células obtido entre os dias 5 e 8 depois de infecção e/ou reduções da viabilidade celular para menos de 10%. Preferencialmente, para produzir proteína de ORF2 de PCV2, as células são cultivadas em 25 a 29°C. Preferencialmente, a etapa de separação é uma etapa de centrifugação ou uma etapa de filtração.

[0074] Opcionalmente, este método pode incluir a etapa de amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 de uma cepa de PCV2 antes de clonar o DNA de ORF2 de PCV2 no vetor de transferência. Em formas preferenciais, uma seqüência de Kozak 5’, um sítio 3' EcoR1, e combinações dos mesmos também podem ser adicionados à seqüência amplificada, preferencialmente antes ou durante a amplificação. Uma se- qüência de Kozak 5’ preferencial compreende a SEQ ID NO: 1. Um sítio 3' EcoR1 preferencial compreende a SEQ ID NO: 2. DNA de ORF2 de PCV2 preferencial compreende a seqüência de nucleotídeos do Genbank Acesso N°. AF086834 (SEQ ID NO: 3) e SEQ ID NO: 4. Proteína recombinante de ORF2 de PCV2 preferencial compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, a qual é a proteína codificada por SEQ ID NO: 3 (Genbank Acesso N°. AF086834) e SEQ ID No: 6, a qual é a proteína codificada por SEQ ID NO: 4. Um meio preferencial compreende meio de células de inseto livre de soro, ainda mais preferencialmente meio Excell 420. Quando a etapa de amplificação opcional é realizada, é preferencial primeiro clonar a estrutura de leitura aberta 2 amplificado em um primeiro vetor, excisar a estrutura de leitura aberta 2 do primeiro vetor, e usar a estrutura de leitura aberta excisado para clonagem no vetor de transferência. Uma linhagem celular preferencial para cotransfecção é a linhagem celular SF+. Um vírus preferencial para cotransfecção é baculovírus. Em formas preferenciais deste método, a porção transfectada do vetor de transferência compreende a SEQ ID NO: 8. Finalmente, para este método, é preferencial recuperar a proteína da estrutura de leitura aberta 2 (ORF2) de PCV2 no sobrenadante da cultura celular no mínimo 5 dias depois de infectar as células com o vírus.

[0075] Portanto, um aspecto adicional da invenção refere-se a um método para produzir e/ou recuperar a estrutura de leitura aberta de PCV2 2, compreende as etapas de: i) amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, preferencialmente adicionando uma seqüência de Kozak 5’ e/ou adicionando um sítio de restrição 3’ EcoR1, ii) clonar o ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; iii) transfectar a porção do vetor de transferência contendo o ORF2 de PCV2 recombi- nante em um vírus; iv) infectar células em meios com o vírus transfec- tado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína re- combinante de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadante; e vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrena- dante.

[0076] Um adicional aspecto da presente invenção refere-se a um método para preparar uma composição compreendendo proteína de ORF2 de PCV2, e vetor viral inativado. Este método compreende as etapas de: i) clonar o ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; ii) transfectar a porção do vetor de transferência contendo o ORF2 de PCV2 recombinante em um vírus; iii) infectar células em meios com o vetor viral transfectado; iv) fazer com que o vetor viral transfectado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; v) separar células do sobrenadante; vi) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; e vii) inativar o vetor viral recom- binante. Preferencialmente, o vetor viral recombinante é um baculoví- rus contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 e as células são células SF+. Etapas de separação preferenciais são as descritas acima, a mais preferencial é a etapa de filtração. Etapas de inativação preferenciais são as descritas acima. Preferencialmente, é realizada inativação entre cerca de 35 a 39°C e na presença d e 2 a 8 mM de BEI, ainda mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI. Toi visto surpreendentemente que maiores concentrações de BEI afetam negativamente a proteína de ORF2 de PCV2, e menores concentrações não são eficazes para inativar o vetor viral dentro de 24 a 72 horas de inativação. Preferencialmente, inativação é realizada por no mínimo 24 horas, ainda mais preferencialmente por 24 a 72 horas.

[0077] De acordo com um aspecto adicional, o método para preparar uma composição compreendendo proteína de ORF2 de PCV2, e vetor viral inativado, conforme descrito acima, também inclui uma etapa de neutralização depois da etapa vii). Esta etapa viii) compreende adicionar uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução. Preferencialmente, se o agente de inativação for BEI, é preferencial a adição de tiossulfato de sódio a uma quantidade equivalente. Portanto, de acordo com um aspecto adicional, a etapa viii) compreende adicionar uma solução de tiossulfa- to de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais prefe-rencialmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM, o mais preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.

[0078] De acordo com um aspecto adicional, o método para preparar uma composição compreendendo proteína de ORF2 de PCV2, e vetor viral inativado, conforme descrito acima, compreende antes da etapa i) a seguinte etapa: amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas conforme descrito acima. Métodos in vitro para amplificar o DNA de ORF2 de PCV2 e modificar as seqüências flanqueantes, clonar in vitro DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência e vetores de transferência adequados são descritos acima, mostrados exemplarmente na figura 1, ou de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Portanto, de acordo com um aspecto adicional, este método compreende as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante, iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinan- te de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadante; vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; viii) inativar o vetor viral recombinante, preferencialmente, na presença de cerca de 1 a cerca de 20 mM de BEI, o mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI; e ix) adicionar uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução, preferencialmente, adição de uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.

[0079] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para preparar uma composição, preferencialmente uma composição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para provocar uma reação imune contra PCV2. Geralmente, este método inclui as etapas de transfectar um constructo em um vírus, em que o cons- tructo compreende i) DNA recombinante de ORF2 de PCV2, ii) infectar células em meio de crescimento com o vírus transfectado, iii) fazer com que o vírus expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2, iv) recuperar a proteína de ORF2 expressada do sobrenadante, v) e preparar a composição combinando a proteína recuperada com um adjuvante adequado e/ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.

[0080] "Adjuvantes" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, sa- poninas por exemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão de água-em-óleo, emulsão de óleo-em-água, emulsão de água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser à base de, em particular, óleo de parafina líquida leve (tipo da Farmacopéia Européia); óleo isoprenóide tal como óleo esqualano ou esqualeno resultante da teoli- gomerização de alquenos, em particular de isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquil linear, mais par-ticularmenteóleos vegetais, etil oleato, di-(caprilato/caprato) de propi- leno glicol, gliceril tri-(caprilato/caprato) ou dioleato de propileno glicol; ésteres de álcoois ou de ácidos graxos ramificados, em particular ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emulsi- ficantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferencialmente tensoativos não-iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manide (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglice- rol, de propileno glicol e de ácido oléico, isoesteárico, ricinoléico ou hidroxiesteárico, os quais são opcionalmente etoxilados, e blocos de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWil- ey and Sons, NY, pp51-94 (1995) e Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997).

[0081] Por exemplo, é possível usar a emulsão de SPT descrita à página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão MF59 descrita à página 183 deste mesmo livro.

[0082] Um caso adicional de um adjuvante é um composto escolhido entre os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolíme- ros de anidrido maléico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantesbenéficos são os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico os quais são reticulados, especialmente com éteres de polialquenila de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, N°. 2, June 1996). As pessoas versadas na técnica também podem consultar a Patente dos Estados Unidos N°. 2.909.462 a qual descreve os polímeros acrílicos referidos reticulados com um composto poliidroxilado tendo no mínimo 3 grupos oxidrila, preferencialmente não mais de 8, os átomos de hidrogênio de no mínimo três oxidrilas sendo substituídas por radicais alifáticos insa- turados tendo no mínimo 2 átomos de carbono. Os radicais preferenciaissão aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem os próprios conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol ; (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. São reticulados com uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre estes, podem ser mencionados Carbopol 974P, 934P e 971P. É mais preferencial o uso de Ca- bopol 971P. Entre os copolímeros de anidrido maléico e derivado de alquenila, os copolímeros EMA (Monsanto) os quais são copolímeros de anidrido maléico e etileno. A dissolução destes polímeros em água leva a uma solução ácida que será neutralizada, preferencialmente até pH fisiológico, de modo a dar a solução adjuvante na qual será incor- porada a própria composição imunogênica, imunológica ou de vacina.

[0083] Adjuvantes adequados adicionais incluem, mas não estão limitados a, o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero em bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lipídeo A, adjuvante de lipídeo-amina Avridine, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante ou diversa), toxina do cólera, IMS 1314 ou dipep- tídeo muramil entre muitos outros.

[0084] Preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 μg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 μg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose. O mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.

[0085] Portanto, de acordo com um aspecto adicional, o método para preparar uma composição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para provocar uma reação imune contra PCV2 compreende i) preparar e recuperar proteína de ORF2 de PCV2, e ii) misturar esta com um adjuvante adequado. Preferencialmente, o adjuvante é Carbopol 971P. Ainda mais preferencialmente, Carbopol 971P é adicionado em uma quantidade de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose. Preferencialmente, a etapa do processo i) inclui as etapas do processo conforme descrito para a preparação e recuperação de ORF2 de PCV2. Por exemplo, em formas preferenciais deste método, o constructo compreendendo DNA de ORF2 de PCV2 é obtido em um vetor de transferência. Vetores de transferência adequados e métodos para preparar os mesmos são descritos acima. Opcionalmente, o método pode incluir a etapa de amplificar o ORF2 de uma cepa de PCV2 através de PCR antes de clonar o ORF2 no vetor de transferência. Seqüências de estrutura de leitura aberta preferenciais, seqüências de Kozak, seqüências de sítio 3' EcoR1, seqüências de proteínas recombinantes, seqüências de cons- tructos transfectados, meios, células, e vírus são conforme descrito nos métodos anteriores. Outra etapa opcional para este método inclui clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um primeiro vetor, excisando o DNA de ORF2 deste primeiro vetor, e usando este DNA de ORF2 de PCV2 excisado para clonagem no vetor de transferência. Como com os outros métodos, é preferencial esperar por no mínimo 5 dias depois de infecção das células pelo baculovírus transfectado antes de recuperação de proteína de ORF2 recombinante do sobrena- dante. Preferencialmente, a etapa de recuperação deste método também inclui a etapa de separar os meios das células e debris celulares. Isto pode ser feito em uma variedade de modos, mas para facilidade e conveniência, é preferencial filtrar as células, debris celulares, e meio de crescimento através de um filtro tendo poros variando de tamanho de cerca de 0,45 μM a cerca de 1,0 μM. Finalmente, por este método, é preferencial incluir uma etapa de inativação viral antes de combinar a proteína recombinante de ORF2 de PCV2 recuperada em uma composição. Isto pode ser feito em uma variedae de modos, mas é preferencial na prática da presente invenção usar BEI.

[0086] Portanto, de acordo com um aspecto adicional, este método compreende as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante, iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfectado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadante; vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; viii) inativar o vetor viral recombinante, preferencialmente, na presença de cerca de 1 a cerca de 20 mM de BEI, o mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI; ix) adicionar uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução, preferencialmente, adicionar uma solução de tiossulfato de sódio a uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI, e x) adicionar uma quantidade adequada de um adjuvante, preferencialmente adicionar Carbopol, mais preferencialmente Carbopol 971P, ainda mais pre-ferencialmente em quantidades conforme descrito acima (por exemplo, de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose).

[0087] Adicionalmente, a composição pode incluir um ou mais veículos farmacêuticos aceitáveis. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "um veículo farmacêutico aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e anti- fúngicos, agentes isotônicos, agentes retardantes da adsorção, e semelhantes. O mais preferencialmente, a composição proporcionada deste modo, contém proteína de ORF2 de PCV2 recuperada do so- brenadante de células cultivadas in vitro, em que as células referidas foram infectadas com um vetor viral recombinante contendo DNA de ORF2 de PCV2 e expressando proteína de ORF2 de PCV2, e em que a referida cultura celular foi tratada com cerca de 2 a cerca de 8 mM de BEI, preferencialmente com cerca de 5 mM de BEI para inativr o vetor viral, e uma concentração equivalente de um agente de neutralização, preferencialmente solução de tiossulfato de sódio, para uma concentração final de cerca de 2 a cerca de 8 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, de Carbopol, mais preferencialmente Carbopol 971P, preferencialmente em quantidades de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose, e salina fisiológica, preferencialmente em uma quantidade de cerca de 50 a cerca de 90% (v/v), mais preferencialmente a cerca de 60 a 80% (v/v), ainda mais preferencialmente de cerca de 70% (v/v).

[0088] Portanto, um aspecto adicional refere-se a um método para preparar uma composição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para provocar uma reação imune contra PCV2 compreendendo as etapas de: i) amplificar DNA de ORF2 de PCV2 in vitro, em que as seqüências flanqueantes do referido DNA de ORF2 de PCV2 são modificadas, ii) clonar o DNA de ORF2 de PCV2 amplificado em um vetor de transferência; e iii) transfectar o vetor de transferência ou uma porção do mesmo contendo o DNA de ORF2 de PCV2 recombinante em um vetor viral para gerar o vetor viral recombinante, iv) infectar células em meios com o vírus transfectado; v) fazer com que o vírus transfec- tado expresse a proteína recombinante de ORF2 de PCV2; vi) separar células do sobrenadante; vii) recuperar a proteína de ORF2 de PCV2 expressada do sobrenadante; viii) inativar o vetor viral recombinante, preferencialmente, na presença de cerca de 2 a cerca de 20 mM de BEI, o mais preferencialmente na presença de cerca de 5 mM de BEI; ix) adicionar uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro da solução, preferencialmente, adicionar uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 0,5 a cerca de 20 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI, x) adicionar uma quantidade adequada de um adjuvante, preferencialmente adicionar Carbopol, mais preferencialmente Carbopol 971P, ainda mais preferencialmente em quantidades conforme descrito acima (por exemplo, de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose); e xi) adicionar salina fisiológica, preferencialmente em uma quantidade de cerca de 50 a cerca de 90% (v/v), mais preferencialmente a cerca de 60 a 80% (v/v), ainda mais preferencialmente de cerca de 70% (v/v). Opcionalmente, este método também pode incluir a adição de um protetor. Um protetor conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a um agente ativo antimicrobiológico, tal como, por exemplo, Gentamicina, Merthiolate, e semelhantes. Em particular adicionar um protetor é mais preferencial para a preparação de uma composição multidose. Os agentes ativos antimicrobiológicos são adicionados em concentrações eficazes para prevenir a composição de interesse para qualquer contaminação microbiológica ou para inibição de qualquer crescimento microbiológico dentro da composição de interesse.

[0089] Além disso, este método também pode compreender a adição de qualquer agente estabilizante, tal como, por exemplo, sacarí- deos, trealose, manitol, sacarose e semelhantes, para aumentar e/ou manter a vida útil do produto. No entanto, foi visto surpreendentemente, que a formulação resultante é imunologicamente eficaz por um período de no mínimo 24 meses, sem adicionar qualquer agente estabili- zante adicional.

[0090] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se aos produtos resultantes dos métodos conforme descrito acima. Em particular, a presente invenção refere-se a uma composição de substância compreendendo proteína de ORF2 de PCV2 expressada de modo re- combinante. Além disso, a presente invenção também refere-se a uma composição de substância que compreende proteína de ORF2 de PCV2 expressada de modo recombinante, recuperada do sobrenadan- te de uma cultura de células de inseto. Além disso, a presente invenção também refere-se a uma composição de substância compreen-dendoproteína de ORF2 de PCV2 expressada de modo recombinante, recuperada do sobrenadante de uma cultura de células de inseto. Preferencialmente, esta composição de substância também compreende um agente adequado para a inativação de vetores virais. Preferencialmente, o referido agente de inativação é BEI. Além disso, a presente invenção também refere-se a uma composição de substância que compreende proteína de ORF2 de PCV2 expressada de modo recom- binante, recuperada do sobrenadante de uma cultura de células de inseto, e compreende um agente, adequado para a inativação de vetores virais, preferencialmente BEI e um agente de neutralização para neutralização do agente de inativação. Preferencialmente, o agente de neutralização é tiossulfato de sódio, quando se usa BEI como um agente de inativação.

[0091] Em ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição imunogênica que induz uma reação imune e, mais preferencialmente, confere imunidade protetora contra os sinais clínicos de infecção por PCV2. A composição geralmente compreende o polipeptídeo, ou um fragmento do mesmo, expressado por Estrutura de Leitura Aberta 2 (ORF2) de PCV2, como o componente antigênico da composição.

[0092] DNA e proteína de ORF2 de PCV2, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, para a preparação das composições e também conforme usado dentro dos processos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, é um domínio altamente conservado dentro de isolados de PCV2 e deste modo, qualquer ORF2 de PCV2 seria eficaz como a fonte do DNA e/ou polipeptídeo de ORF2 de PCV conforme usado aqui, neste requerimento de patente. Uma proteína de ORF2 de PCV2 preferencial é a de SEQ ID N°. 11. Um polipeptídeo de ORF2 de PCV preferencial é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID N°. 5, mas é entendido pelo s versados na técnica que esta seqüência pode variar por tanto quanto 6 a 10% em homologia de seqüência e ainda conservar as características antigêni- cas que a tornam útil em composições imunogênicas. As característicasantigênicas de uma composição imunológica pode ser, por exemplo, estimada pelo experimento de ataque conforme proporcionado pelo Exemplo 4. Além disso, a característica antigênica de um antíge- no modificado ainda é conservada, quando o antígeno modificado confere no mínimo 70%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90% da imunidade protetora comparado com a proteína ORF2 de PCV2, codificada pela seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Uma "composição imunogênica"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa uma proteína de ORF2 de PCV2 a qual provoca uma "reação imunológica"no hospedeiro de uma reação imune celular e/ou mediada por anticorpos para a proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, esta composição imunogênica tem a capacidade de conferir imunidade protetora contra infecção por PCV2 e os sinais clínicos associados com a mesma. Em algumas formas, porções imunogênicas de proteína de ORF2 de PCV2 são usados como o componente antigênico na composição. O termo "porção imunogênica"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a formas truncadas e/ou substituídas, ou fragmentos de proteína e/ou polinucleotídeo de ORF2 de PCV2, respectivamente. Prefe- rencialmente, as formas truncadas e/ou substituídas referidas, ou fra-gmentoscompreenderão no mínimo 6 aminoácidos contíguos do poli- peptídeo ORF2 de extensão total. Mais preferencialmente, as formas truncadas ou substituídas, ou fragmentos terão no mínimo 10, mais preferencialmente no mínimo 15, e ainda mais preferencialmente no mínimo 19 aminoácidos contíguos do polipeptídeo ORF2 de extensão total. Duas seqüências preferenciais a este respeito são proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NOs. 9 e 10. É entendido adicionalmente que as seqüências referidas podem ser uma parte de fragmentos ou formas truncadas maiores. Um polipeptídeo de ORF2 de PCV2 preferencial adicional proporcionado aqui, neste requerimento de patente, é codificada pelas seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Mas é entendido pelos versados na técnica que esta seqüência pode variar por tanto quanto 6 a 20% em homologia de seqüência e ainda conservar as características antigênicas que a tornam útil em composições imunogênicas. Em algumas formas, uma forma truncada ou substituída, ou fragmento de ORF2 é usada como o componente antigênico na composição. Prefe-rencialmente, as formas truncadas ou substituídas referidas, ou frag-mentoscompreenderão no mínimo 18 nucleotídeos contíguos da se- qüência de nucleotídeos de ORF2 de extensão total, por exemplo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4. Mais preferencialmente, as formas truncadas ou substituídas, ou fragmentos terão no mínimo 30, mais preferencialmente no mínimo 45, e ainda mais preferencialmente no mínimo 57 nucleotídeos contíguos da seqüência de nucleotídeos de ORF2 de extensão total, por exemplo de SEQ ID NO: 3 ou de SEQ ID NO: 4.

[0093] "Identidade de Seqüência"como é conhecido na técnica refere-se a uma relação entre duas ou mais seqüências de polipeptí- deos ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeo, a saber uma se- qüência de referência e uma dada seqüência a ser comparada com a seqüência de referência. A identidade de seqüência é determinada comparando a seqüência dada com a seqüência de referência depois das seqüências terem sido alinhadas otimamente para produzir o maior grau de similaridade de seqüência, conforme determinada pela combinação entre filamentos das seqüências referidas. Em semelhante alinhamento, a identidade de seqüência é determinada em uma base de posição a posição, por exemplo, as seqüências são "idênticas"em uma posição em particular e nesta posição, os nucleotídeos ou resíduos aminoácidos são idênticos. O número total de semelhantes identidades de posição é em seguida dividido pelo número total de nu- cleotídeos ou resíduos na seqüência de referência para dar a% de identidade de seqüência. A identidade de seqüência pode ser prontamente calculada por meio de métodos conhecidos, incluindo mas não limitados, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Iniciador, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cujos ensinamentos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Os métodos preferenciais para determinar a identidade de se- qüência são designados para dar a maior combinação entre as se- qüências testadas. Os métodos para determinar a identidade de se- qüência são codificados em programas de computador disponíveis publicamente os quais determinam a identidade de seqüência entre se- qüências dadas. Exemplos de semelhantes programas incluem, mas não estão limitados a, o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está disponível publicamente na NCBI e em outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cujos ensinamentos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência). Estes programas alinham otimamenteseqüências usando pesos de gap default de modo a produzir o maiornível de identidade de seqüência entre as seqüências dadas e de referência. Como uma ilustração, por meio de um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeos tendo no mínimo, por exemplo, 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de "identidade de seqüência"com uma seqüência de nucleotídeos de referência, pretende-se que a seqüência de nucleotídeos do polinucleo- tídeo dado seja idêntica à seqüência de referência exceto que a se- qüência de polinucleotídeos dada pode incluir até 15, preferencialmenteaté 10, ainda mais preferencialmente até 5 mutações ponto por cada 100 nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, em um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nu- cleotídeos tendo no mínimo 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de identidade com relação à seqüência de nu- cleotídeos de referência, até 15%, preferencialmente 10%, ainda mais preferencialmente 5% dos nucleotídeos na seqüência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos até 15%, preferencialmente 10%, ainda mais preferencialmente 5% do total de nucleotídeos na seqüência de referência pode ser inserido na seqüência de referência. Estas mutações da seqüência de referência podem ocorrer nas posições do terminal 5' ou 3' da seqüência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência. De modo análogo, por meio de um polipeptídeo tendo uma dada seqüência de aminoácidos tendo no mínimo, por exemplo, 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de identidade de seqüência com uma se- qüência de aminoácidos de referência, pretende-se que a seqüência de aminoácidos dada do polipeptídeo seja idêntica à seqüência de referência exceto que a dada seqüência de polipeptídeos pode incluir até 15, preferencialmente até 10, ainda mais preferencialmente até 5 ami- noácidos alterações por cada 100 aminoácidos da seqüência de ami- noácidos de referência. Em outras palavras, para obter uma dada se- qüência de polipeptídeo tendo no mínimo 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácidos de referência, até 15%, preferencialmenteaté 10%, ainda mais preferencialmente até 5% dos resíduos aminoácidos na seqüência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outro aminoácido, ou uma série de aminoácidos até 15%, preferencialmente até 10%, ainda mais preferencialmente até 5% do número total de resíduos aminoácidos na seqüência de referência pode ser inserido na seqüência de referência. Estas alterações da se- qüência de referência podem ocorrer nas posições de terminal amino ou carbóxi da seqüência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre as posições terminais, intercaladas quer individualmente entre resíduos na seqüência de referência ou no um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência. Preferencialmente, posições de resíduos as quais não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. No entanto, substituições conservativas não são incluídas como uma combinação ao determinar a identidade de seqüência.

[0094] "Homologia de seqüência", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a um método para determina a relação de duas seqüências. Para determinar a homologia de seqüência, duas ou mais seqüências são alinhadas otimamente, e caso necessáriosão introduzidos gaps. No entanto, em contraste com "identidade de seqüência", substituições de aminoácidos conservativas são contadas como uma combinação ao determinar a homologia de seqüência. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo ou polinucleotídeo tendo 95% de homologia de seqüência com uma seqüência de referência, 85%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95% dos resíduos aminoácidos ou nucleotídeos na seqüência de referência devem combinar ou compreender uma substituição conservati- va com outro aminoácido ou nucleotídeo, ou uma série de aminoáci- dos ou nucleotídeos até 15%, preferencialmente até 10%, ainda mais preferencialmente até 5% do total de resíduos aminoácidos ou nucleo- tídeos, não incluindo substituições conservativas, na seqüência de referência pode ser inserido na seqüência de referência. Preferencialmente a seqüência homóloga compreende no mínimo um trecho de 50, ainda mais preferencialmente 100, ainda mais preferencialmente 250, ainda mais preferencialmente 500 nucleotídeos.

[0095] Uma "substituição conservativa" refere-se à substituição de um resíduo aminoácido ou nucleotídeo com outro resíduo aminoácido ou nucleotídeo tendo características ou propriedades similares incluindo tamanho, hidrofobicidade, e etc., de tal modo que a funcionalidade global não se altera significativamente.

[0096] "Isolado" significa alterado "pela mão do homem" a partir de seu estado natural, isto é, se ocorre na natureza, foi alterado ou removido de sem ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleo- tídeo ou polipeptídeo naturalmente presente em um organismo vivo não é "isolado," mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separa- do dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado", conforme o termo é empregado aqui, neste requerimento de patente.

[0097] Portanto, um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição imunogênica eficaz para reduzir a gravidade de sintomas clínicos associados com infecção por PCV2 compreendendoproteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, a proteína de ORF2 de PCV2 é qualquer uma destas, descritas acima. Preferencialmente, a referida proteína de ORF2 de PCV2 é i) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11; ii) qualquer polipeptídeo que é no mínimo 80% homólogo ao polipeptídeo de i), iii) qualquer porção imunogênica dos polipeptídeos de i) e/ou ii) iv) a porção imunogênica de iii), compreendendo no mínimo 10 aminoácidos contíguos incluídos nas seqüências de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, v) um polipeptídeo que é codificado por um DNA compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. vi) qualquer polipeptídeo que é codificado por um polinucle- otídeo que é no mínimo 80% homólogo ao polinucleotídeo de v), vii) qualquer porção imunogênica dos polipeptídeos codificados pelo polinucleotídeo de v) e/ou vi) viii) a porção imunogênica de vii), em que o polinucleotídeo codificando para a referida porção imunogênica compreende no mínimo 30 nucleotídeos contíguos incluídos nas seqüências de SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4.

[0098] Preferencialmente qualquer uma das porções imunogênicas terá as características imunogênica da proteína de ORF2 de PCV2 que é codificada pela seqüência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

[0099] De acordo com um aspecto adicional, proteína de ORF2 de PCV2 é proporcionada na composição imunológica em um nível de inclusão de antígeno eficaz para induzir a reação imune desejada, a saber reduzindo a incidência de ou reduzindo a gravidade de sinais clínicos resultantes de infecção por PCV2. Preferencialmente, o nível de inclusão da proteína de ORF2 de PCV2 é no mínimo 0,2 μg de an- tígeno/ml da composição imunogênica final (μg/ml), mais preferencialmente a partir de cerca de 0,2 a cerca de 400 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,3 a cerca de 200 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,35 a cerca de 100 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,4 a cerca de 50 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,45 a cerca de 30 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,6 a cerca de 15 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,75 a cerca de 8 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,0 a cerca de 6 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,3 a cerca de 3,0 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,4 a cerca de 2,5 μg/ml, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,5 a cerca de 2,0 μg/ml, e o mais preferencialmente cerca de 1,6 μg/ml.

[00100] De acordo com um aspecto adicional, o nível de inclusão de antígeno de ORF2 é no mínimo 0,2 μg de proteína de ORF2 de PCV2, conforme descrito acima, por dose da composição antigênica final (μg/dose), mais preferencialmente a partir de cerca de 0,2 a cerca de 400 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,3 a cerca de 200 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,35 a cerca de 100 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,4 a cerca de 50 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,45 a cerca de 30 μg/dose, ainda mais preferenci- almente a partir de cerca de 0,6 a cerca de 15 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 0,75 a cerca de 8 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca 1,0 a cerca de 6 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca 1,3 a cerca de 3,0 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca 1,4 a cerca de 2,5 μg/dose, ainda mais preferencialmente a partir de cerca de 1,5 a cerca de 2,0 μg/dose, e o mais preferencialmente cerca de 1,6 μg/dose.

[00101] O polipeptídeo ORF2 de PCV2 usado em uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção pode ser derivado de qualquer modo incluindo isolamento e purificação de ORF2 de PCV2, síntese de proteína de rotina, e metodologia recombinante. Métodos preferenciais para obter polipeptídeo ORF2 de PCV2 são descritos acima e também são proporcionados no Requerimento Serial de Patente dos Estados Unidos N°. 11/034.797, cujos ensi namentos e conteúdo são por este incorporados por meio de referência. Em resumo, células suscetíveis são infectadas com um vetor viral recombinante contendo seqüências codificantes de DNA de ORF2 de PCV2, polipep- tídeo ORF2 de PCV2 é expressado pelo vírus recombinante, e o poli- peptídeo ORF2 de PCV2 expressado é recuperado do sobrenadante por filtração e inativado por qualquer método convencional, preferencialmente usando etilenimina binária, a qual é em seguida neutralizado para parar o processo de inativação.

[00102] Portanto, de acordo com um aspecto adicional a composição imunogênica compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, e ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referidaproteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente de um baculovírus recombinante. Além disso, de acordo com um aspecto adicional, a composição imunogênica compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descrito acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente de um baculo- vírus recombinante, e iii) uma porção do sobrenadante da cultura celular.

[00103] De acordo com uma modalidade específica do processo de produção e recuperação para proteína de ORF2 de PCV2, o sobrena- dante da cultura celular é filtrado através de uma membrana tendo um tamanho de poro, preferencialmente entre cerca de 0,45 a 1 μm. Portanto, um aspecto adicional refere-se a uma composição imunogênica que compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, preferencialmente de um baculovírus recombinante, e iii) uma porção da cultura celular; em que cerca de 90% dos componentes têm um tamanho menor do que 1 μm.

[00104] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) e agente inativante para inativar o vetor viral recom- binante preferencialmente BEI, em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tamanho menor do que 1 μm. Preferencialmente, BEI está presente em concentrações eficazes para inativar o baculoví- rus. Concentrações eficazes são descritas acima.

[00105] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que compreende i) qualquer da proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente inativante para inativar o vetor viral re- combinante preferencialmente BEI, e v) um agente de neutralização para parar a inativação mediada pleo agente inativante, em que cerca de 90% dos componentes i) to iii) têm um tamanho menor do que 1 μm. Preferencialmente, se o agente inativante for BEI, a referida composição compreende tiossulfato de sódio em quantidades equivalentes a BEI.

[00106] O polipeptídeo é incorporado em uma composição que pode ser administrada a um animal suscetível a infecção por PCV2. Em formas preferenciais, a composição também pode incluir componentes adicionais de conhecimento dos versados na técnica (vide também Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). Adicionalmente, a composição pode incluir um ou mais veículos aceitáveis para uso veterinário. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "um veículo aceitável para uso veterinário" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes retardadores de adsorção, e semelhantes.

[00107] Em uma modalidade preferencial, a composição imunogê- nica compreende proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, preferencialmente em concentrações descritas acima como um componente antigênico, o qual é misturado com um adjuvante, preferencialmente Carbopol, e salina fisiológica.

[00108] Os versados na técnica entenderão que a composição aqui, neste requerimento de patente, pode incorporar soluções estéreis injetáveis, fisiologicamente aceitáveis conhecidas. Para preparar uma solução pronta-para-uso para injeção ou infusão parenteral, soluções iso- tônicas aquosas, tais como, por exemplo salina ou soluções de proteí- nas plasmáticas correspondentes estão prontamente disponíveis. Além disso, as composições imunogênicas e de vacina da presente invenção podem incluir diluentes, agentes isotônicos, estabilizantes, ou adjuvantes. Diluentes podem incluir água, salina, dextrose, etanol, glicerol, e semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumina e sais de áldali de ácido tetracético de diamina de etileno, entre outros. Adjuvantes adequados são os descritos acima. O mais preferencial é o uso de Carbopol, em particular o uso de Carbopol 971P, preferencialmente em quantidades conforme descrito acima (por exemplo, de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose, ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose e o mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose).

[00109] Portanto, a presente invenção também refere-se a uma composição imunogênica que compreende i) quaquer uma das proteínas ORF2 de PCV2 descritas acima, preferencialmente em concentrações descritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente inativante para inativar o vetor viral recombinan- te, preferencialmente BEI, e v) um agente de neutralização para parar a inativação mediada pelo agente inativante, preferencialmente tiossul- fato de sódio em quantidades equivalentes a BEI; e vi) um adjuvante adequado, preferencialmente Carbopol 971, em quantidades descritas acima; em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tama-nho menor do que 1 μm. De acordo com um aspecto adicional, esta composição imunogênica adicional compreende um sal farmacêutico aceitável, preferencialmente um sal de fosfato em concentrações fisio- logicamente aceitáveis. Preferencialmente, o pH da referida composição imunogênica é ajustada para um pH fisiológico, significando entre cerca de 6.5 e 7.5.

[00110] Portanto, a presente invenção também refere-se a uma composição imunogênica compreende por um ml i) no mínimo 1,6 μg de proteína de ORF2 de PCV2 descrita acima, ii) no mínimo uma porçãode baculovírus expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2 iii) uma porção da cultura celular, iv) cerca de 2 a 8 mM de BEI, v) ti- ossulfato de sódio em quantidades equivalentes a BEI; e vi) cerca de 1 mg de Carbopol 971, e vii) sal de fosfato em uma concentração fisiolo- gicamente aceitável; em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tamanho menor do que 1 μm e o pH da referida composição imunogênica é ajustado para cerca de 6.5 a 7.5.

[00111] As composições imunogênicas podem incluir adicionalmente um ou mais agentes imunomoduladores adicionais tais como, por exemplo, interleucinas, interferons, ou outras citocinas. As composições imunogênicas também podem incluir Gentamicina e Merthiolate. Enquanto as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser prontamente determinadas pelo técnico versado, a presente invenção contempla composiçõescompreendendo a partir de cerca de 50 μg a cerca de 2000 μg de adjuvante e preferencialmente cerca de 250 μg/ml de dose da composição de vacina. Em outra modalidade preferencial, a presente invenção contempla composições de vacina compreendendo a partir de cerca de 1 ug/ml a cerca de 60 μg/ml de antibióticos, e mais prefe-rencialmente menos de cerca de 30 μg/ml de antibióticos.

[00112] Portanto, a presente invenção também refere-se a uma composição imunogênica que compreende i) quaquer uma das proteínas ORF2 de PCV2 descritas acima, preferencialmente em concentraçõesdescritas acima, ii) no mínimo uma porção do vetor viral expressando a referida proteína de ORF2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente inativante para inativar o vetor viral recombinan- te preferencialmente BEI, e v) um agente de neutralização para parar a inativação mediada pelo agente inativante, preferencialmente tiossulfa- to de sódio em quantidades equivalentes a BEI; vi) um adjuvante adequado, preferencialmente Carbopol 971 em quantidades descritas acima; vii) uma concentração farmacêutica aceitável de um tampão de salina, preferencialmente de um sal de fosfato, e viii) um agente ativo antimicrobiológico; em que cerca de 90% dos componentes i) a iii) têm um tamanho menor do que 1 μm.

[00113] Foi visto surpreendentemente que a composição imunogê- nica proporcionada deste modo compreende foi altamente estável por um período de 24 meses. Também foi visto que as composições imu- nogênicas proporcionadas deste modo, compreendendo proteína de ORF2 de PCV2 expressada por baculovírus recombinante, conforme proporcionado deste modo são muito eficazes para reduzir os sintomasclínicos associados com infecções por PCV2. Foi visto surpreendentemente que as composições imunogênicas compreendendo a proteína de ORF2 de PCV2 expressada por baculovírus recombinante conforme proporcionado deste modo, são mais eficazes do que uma composição imunogênica compreendendo o vírus de PCV2 inteiro em uma forma inativada, ou antígeno de ORF2 de PCV2 viral isolado. Em particular, foi visto surpreendentemente, que a proteína de ORF2 de PCV2 expressada por baculovírus recombinante é eficaz em concentrações muito baixas, o que significa em concentrações até 0,25 μg/dose. Este potencial imunogênico elevado inesperado da proteína de ORF2 de PCV2 pode ser adicionalmente aumentado pela adição de Carbopol.

[00114] Um adicional aspecto refere-se a um recipiente compreendendo no mínimo uma dose da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, em que uma dose compreende no mínimo 2 μg de proteína de ORF2 de PCV2, pre- ferencialmente 2 a 16 μg de proteína de ORF2 de PCV2. O recipiente referido pode compreender a partir de 1 até 250 doses da composição imunogênica, preferencialmente contém 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, ou 250 doses da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente, cada um dos recipientes compreendendo mais de uma dose da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2 adicional compreende um agente ativo antimicrobiológico. Os agentes são, por exemplo, antibióticos incluindo Gentamicina e Merthiolate e semelhantes. Portanto, um aspecto da presente invenção refere-se a um recipiente que compreende de 1 a 250 doses da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2, em que uma dose compreende no mínimo 2 μg de proteína de ORF2 de PCV2, e Gentamicina e/ou Merthiolate, preferencialmente a partir de cerca de 1 μg/ml a cerca de 60 μg/ml de antibióticos, e mais preferencialmente menos de cerca de 30 μg/ml.

[00115] Um adicional aspecto refere-se a um kit, compreendendo qualquer um dos recipientes, descrito acima, e um manual de instruções, incluindo a informação para a aplicação intramuscular de no mínimo uma dose da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2 em leitões para reduzir a gravidade dos sintomas clínicos associados com infecção por PCV2. Além disso, de acordo com um aspecto adicional, o manual de instruções referido compreende a informação de uma segunda ou adicional administração(s) de no mínimo uma dose da composição imunogênica de ORF2 de PCV2, em que a segunda administração ou qualquer administração adicional é no mínimo 14 dias além da administração inicial ou qualquer administração anterior. Preferencialmente, o manual de instruções referido também inclui a informação, para administrar um estimulante imune. Preferencialmente, o estimulante imune referida será administrado no mínimo duas vezes. Preferencialmente, no mínimo 3, mais preferencialmente no mí- nimo 5, e ainda mais preferencialmente no mínimo 7 dias estão entre a primeira e a segunda ou qualquer administração adicional do estimulante imune. Preferencialmente, o estimulante imune é administrado no mínimo 10 dias, preferencialmente 15, ainda mais preferencialmente 20, e ainda mais preferencialmente no mínimo 22 dias além da administração inicial da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2. Um estimulante imune preferencial é, por exemplo, hemociani- na de keyhole limpet (KLH), preferencialmente emulsificada com adjuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA). No entanto, é entendido deste modo que também pode ser usado qualquer outro estimulante imune de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. "Estimulante imune" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa qualquer agente ou composição que pode dispar uma reação imune geral, preferencialmente sem iniciar ou aumentar uma reação imune específica, por exemplo, a reação imune contra um patógeno específico.É adicionalmente instruído para administrar o estimulante imune em uma dose adequada. Além disso, o kit também pode compreender um recipiente, incluindo no mínimo uma dose do estimulante imune, preferencialmente uma dose de KLH, ou KLH/ICFA.

[00116] Além disso, também foi visto surpreendentemente que o potencial imunogênico das composições imunogênicas compreendendoproteína de ORF2 de PCV2 expressada por baculovírus recombi- nante, preferencialmente em combinação com Carbopol, pode ser adicionalmentereforçado pela administração da vacina IngelVac PRRS MLV (vide o Exemplo 5). Os sinais clínicos de PCV2 e as manifestações da doença são bastante amplificados quando está presente infecção por PRRS. No entanto, as composições imunogênicas e as estratégias de vacinação conforme proporcionado deste modo reduziram muito este efeito, e mais do que o esperado. Em outras palavras, foi observado um efeito sinérgico inesperado quando animais, preferenci- almente porcos, são tratados com qualquer uma das composições imunogênicas de ORF2 de PCV2, conforme proporcionado deste modo, e a vacina Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

[00117] Portanto, um aspecto adicional da presente invenção refere-se ao kit conforme descrito acima, compreendendo a composição imunogênica de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo e o manual de instruções, em que o manual de instruções adicional inclui a informação para administrar a composição imunogênica de ORF2 de PCV2 junto, ou em torno da mesma hora, com uma composição imunogênica que compreende antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, preferencialmente antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina adjuvantado. Preferencialmente, o antíge- no da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

[00118] Um adicional aspecto da presente invenção também refere- se a um kit compreendendo i) um recipiente contendo no mínimo uma dose de uma composição imunogênica de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, e ii) um recipiente contendo uma composição imunogênica compreendendo antígeno de PRRS, preferencialmenteantígeno de PRRS adjuvantado. Preferencialmente o antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Mais preferencialmente, o kit adicional compreende um manual de instruções, incluindo a informação para administrar ambas as composições farmacêuticas. Preferencialmente, contém a informação que a composição contendo ORF2 de PCV2 é administrada temporalmente antes da composição contendo PRRS.

[00119] Um adicional aspecto, refere-se ao uso de qualquer uma das composições proporcionadas deste modo como um medicamento, preferencialmente como um medicamento veterinário, ainda mais pre-ferencialmente como uma vacina. Além disso, a presente invenção também refere-se ao uso de qualquer uma das composições descritas aqui, neste requerimento de patente, para a preparação de um medicamento para reduzir a gravidade dos sintomas clínicos associados com infecção por PCV2. Preferencialmente, o medicamento é para a prevenção de uma infecção por PCV2, ainda mais preferencialmente em leitões.

[00120] Um adicional aspecto refere-se a um método para (i) a prevenção de uma infecção, ou reinfecção com PCV2 ou (ii) a redução ou eliminação de sintomas clínicos causada por PCV2 em um sujeito, compreendendo administrar quaisquer das composições imunogênicas proporcionadas deste modo a um sujeito que necessite das mesmas. Preferencialmente, o sujeito é um porco. Preferencialmente, a composição imunogênica é administrada por via intramuscular. Preferencialmente, uma dose ou duas doses da composição imunogênica é/são administradas, em que uma dose preferencialmente compreende no mínimo cerca de 2 μg de proteína de ORF2 de PCV2, ainda mais preferencialmente cerca de 2 a cerca de 16 μg, e no mínimo cerca de 0,1 a cerca de 5 mg de Carbopol, preferencialmente cerca de 1 mg de Carbopol. Um aspecto adicional refere-se ao método de tratamento conforme descrito acima, em que uma segunda aplicação da composição imunogênica é administrada. Preferencialmente, a segunda administração é feita com a mesma composição imunogênica, preferencialmente tendo a mesma quantidade de proteína de ORF2 de PCV2. Preferencialmente a segunda administração também é feita por via intramuscular. Preferencialmente, a segunda administração é feita no mínimo 14 dias além da administração inicial, ainda mais preferencialmente no mínimo 4 semanas além da administração inicial.

[00121] De acordo com um aspecto adicional, o método de tratamento também compreende a administração de um estimulante imune. Preferencialmente, o referido estimulante imune é administrado no mí- nimo duas vezes. Preferencialmente, no mínimo 3, mais preferencialmente no mínimo 5 dias, ainda mais preferencialmente no mínimo 7 dias são entre a primeira e a segunda administração do estimulante imune. Preferencialmente, o estimulante imune é administrado no mínimo 10 dias, preferencialmente 15, ainda mais preferencialmente 20, ainda mais preferencialmente no mínimo 22 dias além da administração inicial da composição imunogênica de ORF2 de PCV2. Um estimulante imune preferencial é, por exemplo, é hemocianina de keyhole limpet (KLH), ainda preferencialmente emulsificado com adjuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA). No entanto, é entendido deste modo que qualquer outro estimulante imune de conhecimento de uma pessoa versada na técnica também pode ser usado. Está dentro do conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica como administrar o estimulante imune em uma dose adequada.

[00122] De acordo com um aspecto adicional, o método de tratamentos descrito acima também compreende a administração de antí- geno PRRS. Preferencialmente, o antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Preferencialmente, o referido antígeno da síndrome reprodutiva e respiratória porcina é administrado temporalmente além da administração da composição imunogênica de proteína de ORF2 de PCV2.

[00123] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma vacina de combinação multivalente a qual inclui um agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou diminuir a gravidade da infecção por PCV2, e no mínimo um componente ativo imunogênico contra outro organismo causador de doença em suíno.

[00124] Em particular, o agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por PCV2 é um antí- geno de PCV2. Preferencialmente, o antígeno de PCV2 referido é uma proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, ou qualquer composição imunogênica conforme descrito acima, que com-preendeproteína de ORF2 de PCV2.

[00125] No entanto, é entendido deste modo que um antígeno de PCV2 também refere-se a qualquer composição de substância que compreende no mínimo um antígeno que pode induzir, estimular ou reforçar a reação imune contra infecção por PCV2, quando administrado a um porco. Preferencialmente, o referido antígeno de PCV2 é o vírus de PCV2 inteiro, preferencialmente em uma forma inativada, um vírus de PCV2 vivo modificado ou atenuado, um vírus quimérico que compreende no mínimo uma seqüência de aminoácidos imunogênica de PCV2, qualquer outro polipeptídeo ou componente que compreende no mínimo uma seqüência de aminoácidos imunogênica de PCV2. Os termos "proteína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico"ou "se- qüência de aminoácidos imunogênica"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a qualquer seqüência de aminoáci- dos a qual provoca uma reação imune em um hospedeiro contra um patógeno compreendendo a referida proteína imunogênica, polipeptí- deo imunogênico ou seqüência de aminoácidos imunogênica. Uma "proteína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico"ou "seqüência de aminoácidos imunogênica"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui a seqüência de extensão total de quaisquer proteínas,análogos das mesmas, ou fragmentos imunogênicos das mesmas. Por "fragmento imunogênico"se indica um fragmento de uma proteína a qual inclui um ou mais epítopos e deste modo provoca a reação imunológica contra o patógeno relevante. Os fragmentos referidos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos de conhecimento geral na técnica. Vid por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando simultaneamente grandes números de peptí- deos sobre suportes sólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína, e reagir os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão fixados aos suportes. As técnicas referidassão conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N°. 4.708.871; Geysen et al. (19 84) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Similarmente, epítopos conformacionais são prontamente identificados determinando a conformação espacial de aminoácidos tais como, por exemplo, por cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Antígenos sintéticos também estão incluídos na definição, por exemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, e outros antí- genos recombinantes ou derivados sinteticamente. Vide, por exemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Genebra, Suíça, 28 de junho a 3 de julho de 1998.

[00126] De acordo com adicional modalidade, qualquer antígeno de PCV-2 é Ingelvac® CircoFLEX®, (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, EUA), CircoVac® (Merial SAS, Lyon, France), Circo- Vent (Intervet Inc., Millsboro, DE, EUA), ou Suvaxyn PCV-2 One Dose® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, EUA).

[00127] Uma "reação imunológica ou imune" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma reação imune celular e/ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "reação imune" inclui mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T cito- tóxicas e/ou células T yd, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferencialmente, o hospedeiro apresentará ou uma reação imunológica terapêutica ou protetora tal que a resistência a nova infecção será reforçada e/ou a gravidade clínica da doença será reduzida. Semelhante proteção será demonstratada ou por uma redução olu falta dos sintomas associados com infecções do hospedeiro conforme descrito acima.

[00128] Preferencialmente, o outro organismo causador de doença em suíno é selecionado entre o grupo consistindo em: Actinobacillus pleuropneumonia (1); Adenovírus (2); Alphavírus tais como o Vírus da Encefalomielite Eqüina Oriental (3); Bordetella bronchiseptica (4); Bra- chyspira spp. (5), preferencialmente B. hyodyentheriae (6); B. piosicoli (7), Brucella suis, preferencialmente biovars 1, 2, e 3 (8); vírus da febre suína clássica (9); Clostridium spp. (10), preferencialmente Cl. difficile (11), Cl. perfringens tipos A, B, e C (12), Cl. novyi (13), Cl.septicum (14), Cl. tetani (15); Coronavirus (16), preferencialmente Corona vírus Respiratório Porcino (17); Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rhsiopathiae (19) Escherichia coli (20); Haemophilus parasuis, preferencialmente subtipos 1, 7 e 14 (21) vírus da encefalomielite hemaglu- tinante (22); Vírus da Encefalite Japonesa (23); Lawsonia intracellula- ris(24) Leptospira spp. (25), preferencialmente Leptospira australis (26); Leptospira canicola (27); Leptospira grippotyphosa (28); Leptospira icterohaemorrhagicae (29); e Leptospira interrogans (30); Leptospira pomona (31); Leptospira tarassovi (32); Mycobacterium spp. (33) preferencialmente M. avium (34), M. intracellulare (35) e M.bovis (36); Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) (37) Pasteurella multocida (38); Porcine cytomegalovirus (39); Porcine Parvovirus (40); Vírus da Sín- drome Reprodutiva e Respiratória Porcina (PRRS) (41) Pseudorabies vírus (42); Rotavírus (43); Salmonella spp. (44), preferencialmente S. thyhimurium (45) e S. choleraesuis (46); Staph. hyicus (47); Staphylococcus spp. (48) preferencialmente Streptococcus spp. (49), preferen- cialmente Strep. suis (50); herpes vírus suíno (51); Vírus da Influenza suína (52); pox vírus suíno (53); pox vírus suíno (54); Vírus da estoma- tite Vesicular (55); Vírus do exantema vesicular de suíno (56); Leptospira Hardjo (57); e/ou Mycoplasma hyosynoviae (58).

[00129] Qualquer referência feita em conexão com um patógeno suíno a seguir pode ser feita nomeando o patógeno, por exemplo, M. hyo, ou fazendo referência ao número entre parênteses após o pató- geno, que é encontrado acima. Por exemplo, pode ser feita referência a M. hyo por M. hyo ou por (37).

[00130] Portanto, a presente invenção refere-se a uma vacina de combinação para o tratamento e/ou a profilaxia de suíno, que inclui um agente imunológico eficaz para reduzir a incidência de ou reduzir a gravidade de infecção por PCV2, preferencialmente um antígeno de PCV2, e adicionalmente um componente ativo imunológico eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas por qualquer um dos patógenos suínos (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53), (54), (55), (56), (57) e/ou (58), ou é um componente ativo imunológico do referido um ou mais patógenos suínos. [combo 1].

[00131] Um "componente ativo imunológico"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa um componente que induz ou estimula a reação imune em um animal ao qual o componente referido é administrado. De acordo com uma modalidade preferencial, a reação imune referida é dirigida para o componente referido ou para um microorganismo compreendendo o componente referido. De acordo com uma modalidade preferencial adicional, o componente ativo imunológi- co é um microorganismo atenuado, incluindo vírus vivo modificado (MLV), um microorganismo morto ou no mínimo uma parte ativa imu- nológica de um microorganismo.

[00132] "Parte ativa imunológica de um microorganismo" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa uma fração de um microorganismo contendo proteína, açúcar, e ou glicoproteína que compreende no mínimo um antígeno que induz ou estimula a reação imune em um animal ao qual o componente referido é administrado. De acordo com uma modalidade preferencial, a reação imune referida é dirigida para a parte ativa imunológica referida de um microorganismo ou para um microorganismo compreendendo a parte ativa imuno- lógica referida.

[00133] Preferencialmente o componente ativo imunológico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (41) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (41).

[00134] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (37) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (37).

[00135] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (1) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (1).

[00136] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (7) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (7).

[00137] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (24) ou é um compo- nente ativo imunológico do patógeno suíno (24).

[00138] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (38) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (38).

[00139] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (21) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (21).

[00140] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (40) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (40).

[00141] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (2) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (2).

[00142] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (44) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (44).

[00143] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (50) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (50).

[00144] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (19), preferencialmente (20) e/ou (21) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (19), preferencialmente (20) e/ou (21).

[00145] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelo patógeno suíno (22) ou é um componente ativo imunológico do patógeno suíno (22).

[00146] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (41) e (37), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (41) e (37).

[00147] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (1) e (41), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (1) e (41).

[00148] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (1) e (37), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (1) e (37).

[00149] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos, (1) (41) e (37), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos), (1), (41) e (37). Em uma forma preferencial, esta combinação é adjuvantada com Carbopol.

[00150] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (1) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (1) e (21).

[00151] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (21) e (41), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (21) e (41).

[00152] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (21) e (37), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (21) e (37).

[00153] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (21) e (38), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (21) e (38).

[00154] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (7) e (19), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (7) e (19).

[00155] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (38) e (33), preferencialmente (34), (35) e/ou (36), ou é um componente ativo imunoló- gico dos patógenos suínos (38) e (33) preferencialmente (34), (35) e/ou (36).

[00156] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), e (21), ou é um componente ativo imunológico dos pató- genos suínos (49) preferencialmente (50), e (21).

[00157] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) e (21).

[00158] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profila- xia de infecções causadas pelos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) e (21).

[00159] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38) e (21).

[00160] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20), (33) e (21), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (49) preferencialmente (50), (20) (33) e (21).

[00161] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38) (33) e (21), ou é um componente ativo imunoló- gico dos patógenos suínos (49), preferencialmente (50), (20), (38), (33) e (21).

[00162] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (41), (40), e (19), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (41), (40), e (19).

[00163] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (38), (4), e (19), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (38), (4), e (19).

[00164] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (38), (4), (21), e (19), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (38), (4), (21) e (19).

[00165] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (20), preferencialmente, (20), (31) e (38), ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (20), (31), (38).

[00166] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (5), preferencialmente, (5) e (24), ou é um componente ativo imunológico dos patóge- nos suínos (5), e (24).

[00167] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (1), preferencialmente, (1), e (5), ou é um componente ativo imunológico dos patóge- nos suínos (1), e (5).

[00168] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (41), preferencialmente, (40), (27), (28), (29), (31), (19) e (59), ou é um componente ativoimunológico dos patógenos suínos (41), (40), (27), (28), (29), (31), (19) e (57).

[00169] De acordo com outro aspecto, o componente ativo imuno- lógico adicional de [combo 1] é eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções causadas pelos patógenos suínos (6), preferencialmente, (6), (19), (38) e (58) ou é um componente ativo imunológico dos patógenos suínos (1), e (5).

[00170] De acordo com aspecto adicional, o componente ativo imu- nológico adicional da vacina de combinação é selecionado entre o grupo consistindo em Enterisol® Ileitis, Enterisol® Ileitis FF, Enterisol® SC-54, Enterisol® SC-54 FF, Enterisol® ERY-ALC, Ingelvac® APP ALC, Ingelvac® AR4, Ingelvac® HP-1, Ingelvac® HPE-1, Ingelvac® M. hyo, Ingelvac® PRRS MLV, Ingelvac® PRRS ATP, Ingelvac® PRV-G1, Reprocyc® PRRS PLE, Reprocyc® PLE, Tetguard®, Toxivac® AD+E, Toxivac® Plus Parsius, (todas da Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, EUA); Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY + PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilis APP, Porcilis AR-T, Porcilis AR-T DF, Porcilis Porcoli, Porcilis Porcoli Dilu- vac forte, Porcilis PRRS, Porcilis Porcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I.D.A.L., Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Myco Silencer® BPM, Myco Silencer® BPME, Myco Silencer® ME, Myco Silencer® M, Myco Silencer® Once, Myco Silencer® MEH, Rhinogen® BPE, Rhinogen® CTE 5000, Rhinogen® CTSE, Score, Sow Bac® E II, Sow Bac® CE II, Sow Bac® TREC, ProSystem® CE, ProSystem® RCE, ProSystem® TREC, ProSystem® Pillmune, ProSystem® Rotamune® com Imugan® II, ProSystem® Rota, ProSystem® Rotamune KV, ProSystem® TG- Emune® Rota com Imugan® II, ProSystem® TGE/Rota, ProSystem® TG-Emune® com Imugen®, ProSystem® TGE, MaGESTIC 7, Ma- GESTIC 8, MaGESTic® com Spur®, MaGESTic® 7 com Spur®, Ma- GESTic® 8 com Spur®, End-FLUence® com Imugen® Il, EndFLUence® 2, PRRomiSE®, PRV-Begonia com Dlluvac Forte®, Argus® SC/ST, Strep Bac, Strep Bac® com Imugen® II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (todas da Intervet Inc., Millsboro, DE, EUA); Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvo- suin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- (todas da Me- rial LTD, Duluth, GA); ER BAC® PLUS, ER BAC®, ER BAC® PLUS/LEPTOFERM-5®, ER BAC® Leptoferm-5®, Farrowsure®, Far- rowsure® B, FARROWSURE® PLUS B, FARROWSURE® PLUS, FARROWSURE® PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE®, FLU- SURE® RTU, FLUSURE®/ER BAC® PLUS, FLUSURE®/ER BAC PLus®, FLUSURE™/RESPISURE®, FLUSURE®/RESPISURE® RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE®/ER BAC® PLUS, FLUSU- RED/RespiSure 1 ONE®/ER BAC Plus®, FLUSURE™/RESPISURE ONE®, FLUSURE®/RESPISURE 1 ONE®, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD® LT-C, LITTERGUARD® LT, PleuroGuard® 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stel- lamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Myco-plasma, Respisure One, Respisure®, Respisure 1 ONE®, Respisure 1 One®/ER Bac Plus®, Enduracell T, Zylexis (formerly known como Baypamune), Atrobac® 3, BratiVac®, BratiVac®-B, Leptoferm- 5DDParvo-Vac®/Leptoferm-5®, PR-Vac®-Killed, PR-Vac®, PR-Vac Plus® (todas da Pfizer Inc., New York, NY, EUA); Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha + Diluent, Suvaxyn Aujeszky Bartha + o/w, Suvaxyn Aujeszky- Flu, Suvaxyn Aujeszky 783 + o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Su- vaxyn RespiFend® APP, Suvaxyn RespiFend® HPS, Suvaxyn Respi- Fend® MH/HPS, Suvaxyn RespiFend® MH, Suvaxyn® AR/T/E, Su- vaxyn® EC-4, Suvaxyn® E, Suvaxyn®-E, Suvaxyn® E-oral, Suvaxyn® PLE, Suvaxyn® PLE/PrV gpl-, Suvaxyn® LE+B, Suvaxyn® PLE + B, Suvaxyn® PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn® SIV, Suvaxyn® SIV/Mh-one, Suvaxyn® P, Suvaxyn® PrV gpl-, Suvaxyn® PCV-2 One Shot (todas da Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, EUA (Wyeth); SCOURMUNE®, SCOURMUNE®-C, SCOURMUNE®-CR, AR-PAC®- PD+ER, AR-PARAPAC®+ER, M+ Rhusigen®, M+PAC®, MaxiVac Ex- cell®3, MaxiVac® H1N1, MaxiVac® H3N2, MaxiVac®-FLU, MaxiVac®- M+, MaxiVac Excell®, MaxiVac Excell 3, PARAPAC®, PNEU PAC®, PNEU PAC®-ER, PNEU PAC®+ER, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®, PRV/Marker Gold®-MaxiVac® FLU, Rhusigen®, Gletvax 6, Co- vexin 8, M + PAC, Gletvax plus, M-Parapac™, SS PAC® (todas da Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, EUA); AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLÃSSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUI- PRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (todas da Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, Espanha); Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C- Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART + EP, RESPIPORC FLU, Respi- porc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmo- porc, Suisaloral, AK-vac MK35 (todas da IDT Impfstoffwerk DessaTor- nau, Tornau, Alemanha); Mypravac Suis, (Albrecht GmbH, Alemanha); Haemo Shield® P, Parapleuro Shield® P, Parapleuro Shield® P+BE, Rhinicell® FD, Rhini Shield® TX4, Prefarrow Shield® 9, Prefarrow Strep Shield®, Clostratox® BCD, Clostratox® C, Clostratox® Ultra C 1300, Porcine Ecolizer® 3 + C, Porcine Pili Shield ® +C, Porcine Pili Shield ™ , Porcine Ecolizer® 3, Ery Serum™, Ery Shield®, Ery Vac Oral, Ery Shield® +L5, PanSTAR® Ery, Erycell®, Parvo Shield® E, Parvo Shield® L5E, Parvo Shield® L5, Parvo Shield®, Para Shield®, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR® Myco, Lepto Shield® 5, Myco Shield®, Salmo Shield® 2, Salmo Shield® Live, Amitox Tet®, C. Perfin- gens Type A Toxoid (todas da Novartis Animal Health, Basel, Suíça); Nitro-Sal (Akro); ou qualquer antígeno o qual é incluído nas composições descritas acima. Alternativamente, quando antígeno PCV2 já está presente em qualquer uma destas vacinas, (i) antígeno PCV2, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é adicionado a qualquer um destas composições/antígenos, ou (ii) o antígeno PCV2 pre sente em qualquer uma destas vacinas é substituído pelo antígeno PCV2, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

FORMULAÇÕES

[00171] Um importante apecto da presente invenção é a preparação da uma ou mais vacinas de combinação. A pessoa versada na técnica conhece componentes adicionais os quais podem ser compreendidos na composição referida (vide também Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). O especialista pode usar soluções estéreis injetáveis, fisiologicamente aceitáveis, conhecidas. Para preparar uma solução pronta para uso para injeção ou infusão parenteral, soluções isotônicas aquosas, tais como, por exemplo salina ou soluções de proteínas plasmáticas correspondentes, estão prontamente disponíveis. As composições farmacêuticas podem estar presentes como liofilisados ou preparações a seco, as quais podem ser reconstituídas com uma solução injetável conhecida diretamente antes do uso sob condições estéreis, por exemplo como um kit de partes.

[00172] Além disso, as composições imunogênicas e de vacina da presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "um veículo veterinário aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes retardantes da adsorção, e semelhantes.

[00173] Diluentes podem incluir água, salina, dextrose, etanol, glice- rol, e semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumina e sais de álcali de ácido de tetracético de diamina de eti- leno, entre outros.

[00174] Adjuvantes preferenciais são aqueles conforme descrito acima. As composições imunogênicas podem incluir adicionalmente um ou mais agentes imunomoduladores diversos tais como, por exemplo, interleucinas, interferons, ou outras citocinas. As composições imunogênicas também podem incluir Gentamicina e Merthiolate. Enquanto as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser prontamente determinadas pelo técnico versado, a presente invenção contempla composições compreendendo a partir de cerca de 50 ug a cerca de 2000 ug de adjuvante e preferencialmente cerca de 250 ug/ml de dose da composição de vacina. Em outra modalidade preferencial, a presente invenção contempla composições de vacina compreendendo a partir de cerca de 1 ug/ml a cerca de 60 ug/ml de antibióticos, e mais preferencialmente menos de cerca de 30 ug/ml de antibióticos.

[00175] De acordo com uma adicional modalidade a vacina de combinação é primeiro desidratada. Se a composição for primeiro liofi- lizada ou desidratada por outros métodos, então, antes da vacinação, a composição referida é reidratada em soluções aquosas (por exemplo, salina, PBS (salina tamponada com fosfato)) ou não aquosas (por exemplo, emulsão em óleo (óleo mineral, ou à base de óleo vege- tal/metabolizável/à base de emulsão única ou dupla), à base de alumínio, adjuvante à base de carbômero).

DOSAGEM E ADMINISTRAÇÃO

[00176] De acordo com a presente invenção, uma quantidade eficaz de uma vacina de combinação administrada a porcos proporciona imunidade eficaz contra infecções microbiológicas causadas por PCV2 e no mínimo um patógeno adicional conforme listado acima. Combinações preferenciais de antígenos para o tratamento e a profilaxia de doenças microbiológicas em porcos são listadas acima.

[00177] De acordo com uma modalidade adicional, a vacina de combinação é administrada a porcos em uma ou duas doses em um intervalo de cerca de 2 a 4 semanas. Por exemplo, a primeira administração é realizada quando o animal é cerca de 2 a 3 semanas a cerca de 8 semanas de idade. A segunda administração é realizada cerca de 1 a cerca de 4 semanas depois da primeira administração da primeira vacinação. De acordo com uma adicional modalidade, revacinação é realizada em um intervalo de 3 a 12 meses depois da administração da segunda dose. A administração de doses de vacina subseqüentes é feita preferencialmente em uma base de 6 meses a anual. Em outra modalidade preferencial, animais vacinados antes da idade de cerca de 2 a 3 semanas devem ser revacinados. A administração de doses de vacina subseqüentes é feita preferencialmente em uma base anual.

[00178] A quantidade de vacina de combinação que é eficaz depende dos ingredientes da vacina e do esquema de administração. Tipicamente, quando um vírus inativado ou uma preparação de vírus vivo modificado é usada na vacina de combinação, uma quantidade da vacina contendo cerca de 102 a cerca de 109 TCID50 por dose, preferencialmente cerca de 103 a cerca de 108 TCID50 por dose, mais preferencialmente, cerca de 104 a cerca de 108 TCID50 por dose. Em geral, antígeno inativado é normalmente usado em quantidades maiores do que vírus modificados vivos. Tipicamente, quando se usa antígeno bacteriano na vacina de combinação, a vacina contendo uma quantidade de cerca de 103 a cerca de 109 unidades formadores de colônia (CFU) por dose, preferencialmente, cerca de 104 a cerca de 108 (CFU) por dose, mais preferencialmente cerca de 105 a cerca de 106 (CFU) por dose. Vacinas em subunidade são normalmente administradas com um nível de inclusão de antígeno de no mínimo 0,2 μg antígeno por dose, preferencialmente com cerca de 0,2 a cerca de 400 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 0,3 a cerca de 200 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 0,35 a cerca de 100 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 0,4 a cerca de 50 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 0,45 a cerca de 30 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 0,6 a cerca de 15 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 0,75 a cerca de 8 μg/dose, ainda mais preferencialmente com cerca de 1,0 a cerca de 6 μg/dose, e ainda mais preferencialmente com cerca de 1,3 a cerca de 3,0 μg/dose. Por exemplo, o nível de inclusão de antí- geno do antígeno de ORF2 de PCV, preferencialmente da proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, contém cerca de 2 μg a cerca de 150 μg, preferencialmente cerca de 2 μg a cerca de 60 μg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 μg a cerca de 50 μg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 μg a cerca de 40 μg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 μg a cerca de 30 μg, ainda mais prefe-rencialmente cerca de 2 μg a cerca de 25 μg, ainda mais preferencialmente cerca de 2 μg a cerca de 20 μg, ainda mais preferencialmente cerca de 4 μg a cerca de 20 μg, e ainda mais preferencialmente cerca de 4 μg a cerca de 16 μg. No caso de vacinas de combinação que incluem (37), é preferencial usar no mínimo 1 a 10 logs, mais preferencialmente, 5 a 10 logs, e o mais preferencialmente, 6 a 8 logs. No caso de vacinas de combinação que incluem (41), é preferencial usar no mínimo 1 a 10 logs, mais preferencialmente, 3 a 10 logs, e o mais preferencialmente, 5 a 6 logs.

[00179] A composição de acordo com a invenção pode ser aplicada por via intradérmica, por via intratraqueal, ou por via intravaginal. a composição preferencialmente pode ser aplicada por via intramuscular ou por via intranasal. Em um corpo animal, pode-se comprovar vantajoso aplicar as composições farmacêuticas conforme descrito acima através de uma injeção intravenosa ou por injeção direta em tecidos alvo. Para aplicação sistêmica, são preferenciais as vias intravenosa, intravascular, intramuscular, intranasal, intra-arterial, intraperitoneal, oral, ou intratecal. Uma aplicação mais local pode ser realizada por via subcutânea, por via intradérmica, por via intracutânea, intracardialmen- te, intralobalmente, intramedularmente, por via intrapulmonar ou diretamente dentro ou próximo do tecido a ser tratado (tecido conjuntivo, ósseo, muscular, nervoso, epitelial). Dependendo da duração desejada e da eficácia do tratamento, as composições de acordo com a invenção podem ser administradas uma vez ou várias vezes, também de modo intermitente, por exemplo, em uma base diária por vários dias, semanas ou meses, e em diferentes dosagens.

MÉTODOS PARA TRATAMENTO

[00180] Ainda outra modalidade importante da invenção é um método para a profilaxia ou o tratamento de doenças causadas por PCV2, e um ou mais microorganismos patogênicos suínos, em que um antí- geno de PCV2, preferencialmente uma proteína de ORF2 de PCV2 conforme proporcionado deste modo, e componentes ativos imunoló- gicos adicionais eficazes para o tratamento e/ou a profilaxia da infecção causada pelo referido microorganismo patogênico suíno adicional são administrados a um animal que necessite dos mesmos em uma dosagem adequada. De acordo com um aspecto adicional, a referida proteína de ORF2 de PCV2, é parte de uma composição antigênica, conforme descrito acima. Portanto, ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a uma vacina de combinação que compreende qualquer uma das composições antigênicas proporcionadas deste modo e que compreende proteína de ORF2 de PCV2, e outro componente ativo imunológico eficaz para o tratamento e/ou a profilaxia de uma infecção causada pelo outro microorganismo patogênico suíno referido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00181] A figura 1 é um fluxograma esquemático de uma construção preferencial de ORF2 de PCV2 baculovírus recombinante; e

[00182] As figuras 2a e 2b são cada uma um fluxograma esquemá- tico de como produzir uma composição de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[00183] Os exemplos seguintes estabelecem materiais e procedimentos preferenciais de acordo com a presente invenção. Deve ser entendido, no entanto, que estes exemplos são proporcionados a título de ilustração somente, e nada nos mesmos deve ser considerado uma limitação no âmbito geral da invenção.

EXEMPLO 1

[00184] Este exemplo compara as produções relativas de ORF2 usando métodos da presente invenção com métodos que são conhecidos na técnica anterior. Quatro frascos de spinner de 1000 mL foram cada um semeados com aproximadamente 1,0x106 células Sf+/ml em 300 mL de meio livre de soro de inseto, Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS). A cultura celular principal é identificada como estoque celular principal Master Cell Stock SF+ (Spodoptera frugiperda) Master Cell Stock, passagem 19, Lote N°. N112-095W. As células usadas para gerar o Master Cell Stock SF+ foram obtidas da Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT. A linhagem celular SF+ para este exemplo foi confinada entre as passagens 19 e 59. Outras passagens funcionarão para os fins da presente invenção, mas de modo a escalar o processo até produção em larga escala, provavelmente no mínimo 19 passagens serão necessárias e passagens além de 59 podem ter um efeito sobre a expressão, embora isto não tenha sido investigado. Em mais detalhes, as culturas celulares SF+ iniciais de armazenamento de nitrogênio líquido foram cultivadas em meio Excell 420 em suspensão dentro de frascos de spinner estéreis com constante agitação. As culturas foram cultivadas dentor de frascos de spinner de 100 mL a 250 mL com 25 a 150 mL de meio sem soro Excell 420. Quando as células tinham sido multiplicadas para uma densidade celu- lar de 1,0 a 8,0 x 106células/mL, foram divididas para novos recipientes com uma densidade de plantio de 0,5 a 1,5 x 106células/mL. Culturas de expansão subseqüentes foram cultivadas dentro de frascos de spinneraté 36 litros de tamanho ou em biorreatores de aço inoxidável de até 300 litros por um período de 2 a 7 dias em 25 a 29°C.

[00185] Depois da semeadura, os frascos foram incubados em 27°C por quatro horas. Subseqüentemente, cada frasco foi semeado com um baculovírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2 (SEQ ID NO: 4). O baculovírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2 foi gerado como se segue: o gene ORF2 de PCV2 de uma cepa Norte Americana de PCV2 foi amplificado por PCR para conter uma seqüência de Kozak 5' (SEQ ID NO: 1) e um sítio 3' EcoR1 (SEQ ID NO: 2), clonado no vetor pGEM-T-Easy (Promega, Madison, WI). Em seguida, foi em seguida excisado subclonado no vetor de transfe-rência pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). A porção subclonada é representada aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NO: 7. O plasmídeo pVL1392 contendo o gene ORF2 de PCV2 foi designado N47-064Y e em seguida co-transfectado com DNA de baculovírus BaculoGold® (BD Biosciences Pharmingen) em células de inseto Sf+ (Protein Sciences, Meriden, CT) para gerar o ba- culovírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2. O novo constructo é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NO: 8. O baculovírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2 foi purificado por placa e vírus de semente principal Master Seed Virus (MSV) foi propagado sobre a linhagem celular SF+, dividido em alíquotas, e armazenado em -70°C. O MSV foi identificado positivamente como baculovírus de ORF2 de PCV2 por PCR-RFLP usando iniciadores específicos para baculovírus. Células de insetos infectadas com baculovírus de ORF2 de PCV2 para gerar MSV ou vírus de semente de trabalho (WSV, Working Seed Virus) expressam antígeno de ORF2 de PCV2 conforme detectado por soro policlonal ou anticorpos monoclonais em um teste de anticorpos fluorescentes indiretos. Adicionalmente, a identidade do baculovírus de ORF2 de PCV2 foi confirmada por seqüenciamento de aminoácidos de N-terminal. O ba- culovírus de ORF2 de PCV2 MSV também foi testado para pureza de acordo com 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28, e 113.55. Cada baculovírus recombinante semeado dentro dos frascos de spinner tiveram multiplicidades de infecção (MOIs) variáveis. O frasco 1 foi semeado com 7,52 mL de semente de 0,088 MOI; o frasco 2 foi semeado com 3,01 mL de semente de 0,36 MOI; o frasco 3 foi semeado com 1,5 mL de semente de 0,18 MOI; e o frasco 4 foi semeado com 0,75 mL de se-mente de 0,09 MOI. Um fluxograma esquemático ilustrando as etapas básicas usadas para construir um baculovírus recombinante de ORF2 de PCV2 é proporcionado aqui, neste requerimento de patente, na figura 1.

[00186] Depois de serem semeados com o baculovírus, os frascos foram em seguida incubados em 27 ± 2°C por 7 dias e também foram agitados em 100 rpm durante este tempo. Os frascos usaram tampas ventiladas para permitir o fluxo de ar. Amostras de cada frasco foram tomadas a cada 24 horas pelos 7 dias seguintes. Depois da extração, cada amostra foi centrifugada, e tnato o pélete quanto o sobrenadante foram separados e em seguida microfiltrados através de uma membrana de 0,45 a 1,0 μm de tamanho de poro.

[00187] As amostras resultantes em seguida tiveram a quantidade de ORF2 presente dentro destas quantificadas através de um ensaio ELISA. O ensaio ELISA foi conduzido com anticorpo de capturo suíno anti-PCV2 Pab IgG Prot. G purificado (diluído a 1:250 em PBS) diluído para 1:6000 e, 0,05 M de tampão de Carbonato (pH 9.6). 100 μL do anticorpo foram em seguida colocados nas cavidades da placa de mi- crotitulação, selado, e incubado de um dia para o outro em 37°C. A placa foi em seguida lavada três vezes com uma solução de lavagem a qual consistiu de 0,5 mL de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100 mL de 10X D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) e 899,5 mL de água destilada. Subseqüentemente, 250 μL de uma solução de bloqueio (5 g de leite em pó sem gordura Carnation Non-fat (Nestle, Glendale, CA) em 10 mL de D-PBS QS para 100 mL com água destilada) foi adicionado a cada uma das cavidades. A etapa seguinte foi lavar a placa de teste e em seguida adicionar antígeno pré-diluído. O antígeno pré-diluído foi produzido adicionando 200 μL de solução de diluente (0,5 mL de Tween 20 em 999,5 mL de D-PBS) a cada uma das cavidades sobre uma placa de diluição. A amostra foi em seguida diluída em uma proporção a 1:240 e uma proporção a 1:480, e 100 μL de cada uma destas amostras de diluídas foi em seguida adicionado a uma das cavidades superiores sobre a placa de diluição (isto é, uma cavidade superior recebeu 100 μL da diluição a 1:240 e a outra recebeu 100 μL da diluição a 1:480). Em seguida foram feitas diluições seriais para o restante da placa removendo 100 μL de cada cavidade sucessiva e transferindo isto para a cavidade seguinte sobre a placa. Cada cavidade foi misturada antes de fazer a transferência seguinte. A lavagem da placa de teste incluiu lavar a placa três vezes com o tampão de lavagem. A placa foi em seguida selada e incubada por uma hora em 37°C antes de ser lavada três vezes mais co m o tampão de lavagem. O anticorpo de detecção usado foi anticorpo monoclonal para ORF2 de PCV. Foi diluído para 1:300 em solução de diluente, e 100 μL do anticorpo de detecção diluído foi em seguida adicionado às cavidades. A placa foi em seguida selada e incubada por uma hora em 37°C antes de ser lavada três vezes com o tampão de lavagem. Conjugado de diluente foi em seguida preparado adicionando soro de coelho normal (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) à solução de diluente até concentração de 1%. Conjugado de anticorpo de cabra anticamundongo (H+l)-HRP (Jackson Immunoresearch) foi diluído no conjugado de diluente para 1:10.000. 100 μL do conjugado de anticorpo diluído foram em seguida adicionados a cada uma das cavidades. A placa foi em seguida selada e incubada por 45 minutos em 37°C antes de ser lavada três vezes com o tampão de lavagem. 100 μL de substrato (TMB Peroxidase Substrate, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD), misturados com um volume igual de Substrato de Peroxidase B (KPL) foram adicionados a cada uma das cavidades. A placa foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos. 100 μL de solução a 1 N de HCL foi em seguida adicionado a todas as cavidades para parar a reação. A placa foi em seguida passada através de uma leitora ELISA. Os resultados deste teste são pro-porcionados na Tabela 1 abaixo: TABELA 1

[00188] Estes resultados indicam que quando o tempo de incubação é prolongado, a expressão de ORF2 no sobrenadante das células centrifugadas e meio é maior do que a expressão no pélete das células centrifugadas e meio. Por conseguinte, deixar a expressão de ORF2 prosseguir por no mínimo 5 dias e recuperar a mesma no so- brenadante ao invés de deixar a expressão prosseguir por menos de 5 dias e recuperar ORF2 das células, proporciona um grande aumento nas produções de ORF2, e uma melhora significativa em relação aos métodos anteriores.

EXEMPLO 2

[00189] Este exemplo proporciona dados quanto à eficácia da invenção reivindicada aqui, neste requerimento de patente. Um frasco de spinner de 1000 mL foi semeado com aproximadamente 1,0x106 células Sf+/ml em 300 mL de meio Excell 420. O frasco foi em seguida incubado em 27°C e agitado a 100 rpm. Subseqüenteme nte, o frasco foi semeado com 10 mL de semente de vírus ORF2 de PCV2/Bac p+6 (o baculovírus recombinante contendo o gene ORF2 de PCV2 passado 6 vezes adicionais nas células de inseto Sf9) com uma MOI de 0,1 depois de 24 horas de incubação.

[00190] O frasco foi em seguida incubado em 27°C po r um total de 6 dias. Depois da incubação, o frasco foi em seguida centrifugado e três amostras do sobrenadante resultante foram colhidas e inativadas. O sobrenadante foi inativado trazendo sua temperatura para 37 ± 2°C. À primeira amostra, uma solução a 0,4 M de bromidreto de 2- bromoetilenoamina o qual tinha sido ciclizado para 0,2 M de etilenimi- na binária (BEI) em 0,3 N de NaOH é adicionado ao sobrenadante para dar uma concentração final de BEI de 5 mM. À segunda amostra, 10 mM de BEI foi adicionado ao sobrenadante. À terceira amostra, não foi adicionada BEI ao sobrenadante. As amostras foram em seguida agitadas continuamente por 48 horas. Uma solução a 1,0 M de tiossulfato de sódio para dar uma concentração mínima final de 5 mM foi adicionada para neutralizar qualquer BEI residual. A quantidade de ORF2 em cada amostra foi em seguida quantificada usando o mesmo procedimento do ensaio ELISA conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados deste podem ser vistos na Tabela 2 abaixo: TABELA 2

[00191] Este exemplo demonstra que a neutralização com BEI não remove ou degrada quantidades significativas do produto de proteína recombinante de ORF2 de PCV2. Isto é evidenciado pelo fato de que não há grande perda de ORF2 no sobrenadante a partir da BEI ou temperaturas elevadas. Os versados na técnica reconhecerão que o ORF2 recuperado é um produto protéico estável.

EXEMPLO 3

[00192] Este exemplo demonstra que a presente invenção é esca- lável a partir de produção em pequena escala de ORF2 de PCV2 re- combinante até produção em larga escala de ORF2 de PCV2 recombinant. 5,0 x 105 células/ml de células SF+/ml em 7000 mL de meio ExCell 420 foi plantado em um biorreator Applikon Bioreactor de 20000 mL. O meio e as células foram em seguida incubados em 27°C e agitados a 100 RPM pelas próximas 68 horas. Na 68a hora, 41,3 mL de Baculovírus de ORF2 de PCV2 MSV+3 foi adicionado a 7000 mL de meio ExCell 420. A mistura resultante foi em seguida adicionada ao biorreator. Pelos próximos sete dias, a mistura foi incubada em 27°C e agitada a 100 RPM. Amostras do biorreator foram extraídas a cada 24 horas iniciando no dia 4, pós-infecção, e cada amostra foi centrifugada. O sobrenadante das amostras foram preservados e a quantidade de ORF2 foi em seguida quantificada usando densitometria SDS- PAGE. Os resultados disto podem ser visto na Tabela 3 abaixo: TABELA 3

EXEMPLO 4

[00193] Este exemplo testa a eficácia de sete vacinas candidatas de PCV2 e adicionalmente define os parâmetros de eficácia depois de exposição a uma cepa virulenta de PCV2. Cento e oito (108) leitões privados de colostro paridos por cesárea (CDCD), de 9 a 14 dias de idade, foram divididos aleatoriamente em 9 grupos de tamanho igual. A Tabela 4 estabelece o Design do Estudo Geral para este Exemplo. TABELA 4. Design do Estudo Geral

[00194] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada.

[00195] Sete dos grupos (Grupos 1 a 7) receberam doses de poli- peptídeo ORF2 de PCV2, um dos grupos agiu como um controle de ataque e não recebeu ORF2 de PCV2, e outro grupo agiu como o grupo controle negativo estrito e também não recebeu ORF2 de PCV2. No Dia 0, os Grupos 1 a 7 foram tratados com as vacinas atribuídas. Aos leitões no Grupo 7 foi administrado um tratamento de reforço no Dia 14. Os leitões foram observados para eventos adversos e reações no sítio de injeção depois da vacinação e no Dia 19, os leitões foram movidos para o segundo sítio de estudo. No segundo sítio de estudo, os Grupos 1 a 8 foram alojados em grupo em uma construção enquanto o Grupo 9 foi alojado em uma construção separada. Todos os porcos receberam hemocianina de keyhole limpet (KLH)/adjuvante de Freund incompleto (ICFA) nos Dias 21 e 27 e no Dia 24, os Grupos 1 a 8 foram testados com um PCV2 virulento.

[00196] Pré- e pós-ataque, foram coletadas amostras de sangue para sorologia de PCV2. Pós-ataque, foram coletados dados do peso corporal para determinação do ganho de peso diário médio (ADWG), e sintomas clínicos, bem como amostras de esfregaço nasal para determinareliminação nasal de PCV2. No Dia 49, todos oo porcos sobreviventes foram necropsiados, os pulmões foram classificados para lesões, e tecidos selecionados foram preservados em formalina para experimentação por Imuno-histoquímica (IHC) em uma data posterior.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00197] Este foi um estudo-cego parcialmente da viabilidade do ataque de vacinação conduzido em porcos CDCD, 9 a 14 dias de idade no Dia 0. Para serem incluídas no estudo, os títulos de PCV2 IFA das porcas foram <1:1000. Adicionalmente, o estado sorológico das porcas foram de um rebanho PRRS-negativo conhecido. Vinte e oito (28) porcas foram testadas para estado sorológico de PCV2. Quatorze (14) porcas tiveram um título de PCV2 de <1000 e foram transferidas para o primeiro sítio de estudo. Cento e dez (110) leitões foram paridos por cirurgias por corte cesareana e estavam disponíveis para este estudo no Dia -4. No Dia -3, 108 porcos CDCD no primeiro sítio de estudo foram pesados, identificados com etiquetas de orelha, bloqueados por peso e atribuídos aleatoriamente a 1 de 9 groups, conforme determinado acima na tabela 4. Se qualquer animal de teste satisfazendo os critérios de inclusão foi registrado no estudo e foi posteriormente excluído por qualquer razão, o Investigador e o Monitor consultado de modo a determinar o uso de dados coletados do animal na análise final. A data de quais leitões registrados foram estudados e a razão para a exclusão foi documentada. Inicialmente, nenhuma das porcas foi excluídas. Um total de 108 de 110 porcos disponíveis foi atribuído aleatoriamente a um de 9 grupos no Dia -3. Os dois menores porcos (No. 17 e 19) não foram atribuídos a um grupo e estavam disponíveis como extras, caso necessário. Durante o curso do estudo, foram removidos vários animais. O Porco 82 (Grupo 9) no Dia -1, o Porco N°. 56 (Grupo 6) no Dia 3, o Porco N°. 53 (Gr upo 9) no Dia 4, o Porco N°. 28 (Grupo 8) no Dia 8, o Porco N°. 69 (Gr upo 8) no Dia 7, e o Porco N°. 93 (Grupo 4) no Dia 9, foram cada um en contrados mortos antes do ataque. Estes seis porcos não foram incluídos nos resultados do estudo final. O Porco no 17 (um dos porcos extras) foi atribuído ao Grupo 9. O porco extra restante, N°. 19, foi excluído do estudo.

[00198] As formulações administrada a cada um dos grupos foram como se segue: o Grupo 1 foi designado para administrar 1 ml de ORF2 viral (vORF2) contendo 16 μg de ORF2/ml. Isto foi feito misturando 10,24 ml de ORF2 viral (256 μg/25 μg/ml = 10,24 ml de vORF2) com 3,2 ml de Carbopol a 0,5% e 2,56 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 16 ml de formulação para o grupo 1. O Grupo 2 foi designado para administrar 1 ml de vORF2 contendo 8 μg de vORF2/ml. Isto foi feito misturando 5,12 ml de vORF2 (128 μg/25 μg/ml = 5,12 ml de vORF2) com 3,2 ml de Carbopol a 0,5% e 7,68 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 16 ml de formulação para o grupo 2. O Grupo 3 foi designado para administrar 1 ml de vORF2 contendo 4 μg de vORF2/ml. Isto foi feito misturando 2.56 ml de vORF2 (64 μg/25 μg/ml = 2,56 ml de vORF2) com 3,2 ml de Carbopol a 0,5% e 10,24 ml de salina tampo- nada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 16 ml de formulação para o grupo 3. O Grupo 4 foi designado para administrar 1 ml de ORF2 recombinante (rORF2) contendo 16 μg de rORF2/ml. Isto foi fei-to misturando 2,23 ml de rORF2 (512 μg/230 μg/ml = 2,23 ml de rORF2) com 6,4 ml de Carbopol a 0,5% e 23,37 ml de salina tampona- da com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 32 ml de formulação para o grupo 4. O Grupo 5 foi designado para administrar 1 ml de rORF2 contendo 8 μg de rORF2/ml. Isto foi feito misturando 1,11 ml de rORF2 (256 μg/230 μg/ml = 1,11 ml de rORF2) com 6,4 ml de Carbopol a 0,5% e 24,49 ml de salina tamponada com fosfato em um pH de 7.4. Isto produziu 32 ml de formulação para o grupo 5. O Grupo 6 foi designado para administrar 1 ml de rORF2 contendo 8 μg de rORF2/ml. Isto foi feito misturando 0,56 ml de rORF2 (128 μg/230 μg/ml = 0,56 ml de rORF2) com 6,4 ml de 0,5% de Carbopol e 25,04 ml de salina tamponada com fosfato a um pH de 7.4. Isto produziu 32 ml de formulação para o grupo 6. O Grupo 7 foi designado para administrar 2 ml de vacina de célula morta inteira de PCV2 (PCV2 KV) contendo a MAX PCV2 KV. Isto foi feito misturando 56 ml de PCV2 KV com 14 ml de Carbopol a 0,5%. Isto produziu 70 ml de formulação para o grupo 7. Finalmente, o grupo 8 foi designado para administrar KLH a 0,5 μg/ml ou 1,0 μg/ml por dose de 2 ml. Isto foi feito misturando 40,71 ml de KLH (7,0 μg de proteína/ml a 0,5 μg/ml = 570 ml (7,0 μg/ml) (x) = (0,5) (570 ml)), 244,29 ml de salina tamponada com fosfato a um pH de 7.4, e 285 ml de adjuvante de Freund. A Tabela 5 descreve as janelas de tempo para as atividades chave deste Exemplo. Tabela 5. Atividades do Estudo

[00199] Depois do completamento da fase in-life do estudo, tecidos fixados em formalina foram examinados por Imuno-histoquímica (IHC) para detecção de antígeno de PCV2 por um patologista, as amostras de sangue foram avaliadas para sorologia por PCV2, amostras de es- fregaço nasal foram avaliadas para eliminação de PCV2, e foi determinado o ganho de peso diário médio (ADWG) do Dia 24 ao Dia 49.

[00200] Os animais foram alojados no primeiro sítio de estudo dentro de gaiolas individuais em cinco ambientes a partir do nascimento até aproximadamente 11 dias de idade (aproximadamente Dia 0 do estudo). Cada ambiente foi idêntico em disposição e consistiu de gaiolas de aço inoxidável individuais empilhadas com ar aquecido e filtrado suprido separadamente a cada unidade de isolamento. Cada ambiente tinha calor e ventilação separados, deste modo evitando a contaminação cruzada do ar entre os ambientes. Os animais foram alojados em duas construções diferentes no segundo sítio de estudo. O Grupo 9 (O grupo controle Estrito negativo) foi alojados separadamente em uma construção de acabamento convertida e os Grupos 1 a 8 foram alojados em construção de criadouro convertido. Cada grupo foi alojado em uma pocilga separada (11 a 12 porcos por pocilga) e cada pocilga pro-porcionou aproximadamente 0,28 m2 (3,0 pés quadrados) por porco. Cada pocilga estava sobre um piso elevado com pisos feito de ripas de plástico. Um buraco abaixo das pocilgas serviu como um tanque de contenção para excremento e resíduos. Cada construção tinha seus próprios sistemas de aquecimento e ventilação separados, com pouca probabilidade de contaminação cruzada de ar entre as construções.

[00201] No primeiro sítio de estudo, os leitões foram alimentados com uma ração de leite especialmente formulada a partir do nascimentoaté aproximadamente 3 semanas de idade. Todos os leitões estavam consumindo ração sólida, misturada especial pelo Dia 19 (aproximadamente 4 % semanas de idade). No segundo sítio de estudo, todos os leitões foram alimentados com uma ração de mistura comercial não-medicada customizada apropriada para sua idade e peso, à vontade. Água em ambos os sítios de estudo também estava disponível à vontade.

[00202] Todos os porcos de teste foram tratados com Vitamina E no Dia -2, com injeções de ferro no Dia -1 e com NAXCEL® (1,0 mL, IM, em pernas alternadas) nos Dias 16, 17, 18 e 19. Além disso, o Porco N°. 52 (Grupo 9) foi tratado com uma injeção de fer ro no Dia 3, o Porco 45 (Grupo 6) foi tratado com uma injeção de ferro no Dia 11, o Porco N°. 69 (Grupo 8) foi tratado com NAXCEL® no Dia 6, o Porco N°. 74 (Grupo 3) foi tratado com dexametazona e penicilina no Dia 14, e o Porco N°. 51 (Grupo 1) foi tratado com dexametazona e penicilina no Dia 13 e com NAXCEL® no Dia 14 por várias razões de saúde.

[00203] Enquanto em ambos os sítios de estudo, os porcos estavam sob cuidados veterinários. Foram conduzidos exames de saúde dos animal no Dia 0 e foram registrados no Formulário do Registro do Exame de Saúde (Health Examination Record Form). Todos os animais estavam em bom estado de saúde e nutricional antes da vacina- ção conforme determinado por observação no Dia 0. Foi observado que todos os animais de teste estavam em bom estado de saúde e nutricional antes do ataque. As carcaças e os tecidos foram descartados derretendo. A disposição final dos animais do estudo foi registrada no Registro de Disposição Animal (Animal Disposition Record).

[00204] No Dia 0, os porcos atribuídos aos Grupos 1 a 6 receberam 1,0 mL de PCV2 Vacinas 1-6, respectivamente, IM na região esquerda do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x ^". Porcos atribuídos ao Grupo 7 receberam 2,0 mL de PCV2 Vacina N°. 7 IM na região esquerda d o pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x ^". No Dia 14, os porcos atribuídos ao Grupo 7 receberam 2,0 mL de PCV2 Vacina N°. 7 IM na região direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x 1/2".

[00205] No Dia 21 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de KLH/ICFA IM na região da perna direita usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x1". No Dia 27 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de KLH/ICFA na região da perna esquerda usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x 1".

[00206] No Dia 24, porcos atribuídos aos Grupos 1 a 8 receberam 1,0 mL de material de ataque de PCV2 ISUVDL (5,11 log10 TCID50/mL) IM na região esquerda do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x 1". Um adicional de 1,0 mL do mesmo material foi administrado IN a cada porco (0,5 mL por narina) usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e cânula nasal.

[00207] Os porcos de teste foram observados diariamente para saúde global e eventos adversos no Dia -4 e do Dia 0 ao Dia 19. As observações foram registradas no Registro de Observações Clínicas. Todos os porcos de teste foram observados do Dia 0 ao Dia 7, e o Grupo 7 foi observado adicionalmente do Dia 14 ao 21, para reações no sítio de injeção. Foi determinado o ganho de peso diário médio pesando cada porco em uma balança calibrada nos Dias -3, 24 e 49, ou no dia que um porco foi encontrado morto depois do ataque. Os pesos corporais foram registrados no Formulário de Peso Corporal (Body Weight Form). Os pesos corporais do Dia -3 foram utilizados para bloquear os porcos antes da randomização. Os dados de peso do Dia 24 e do Dia 49 foram utilizados para determinar o ganho de peso diário médio (ADWG) para cada porco durante testes pontos do tempo. Para porcos que morreram depois do ataque e antes do Dia 49, o ADWG foi ajustado para representar o ADWG do Dia 24 até o dia da morte.

[00208] De modo a determinar a sorologia de PCV2, sangue total venoso foi colhido de cada leitão do seio venoso orbital nos Dias -3 e 14. Para cada leitão, foi colhido sandue do seio venoso orbital inserindo um tubo capilar estéril dentro do canto medial de um dos olhos e drenando aproximadamente 3,0 mL de sangue total para um tubo separador de soro (Serum Separator Tube, SST) de 4,0 mL. Nos Dias 24, 31, e 49, sangue total venoso de cada porco foi coletado da cava vena anterior usando uma agulha estéril de 18 g x 1 ^" Vacutainer (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), um suporte de agulha Vacutainer e um tubo separador de soro SST de 13 mL. As coletas de sangue em cada ponto de tempo foram registradas sobre o Relatório de Coleta de Amostra (Sample Collection Record). O sangue em cada tubo separador de soro foi deixado para coagular, cada tubo separador de soro foi em seguida centrifugado e o soro colhido. O soro colhido foi transferido para um tubo de encaixe de pressão estéril e armazenado a -70 ± 10°C até ser testa do em uma data posterior. As amostras de soro foram testadas para a presença de anticorpos de PCV2 pela equipe de BIVI-R&D.

[00209] Os porcos foram observados uma vez ao dia do Dia 20 ao Dia 49 para sintomas clínicos e as observações clínicas foram registradas no Registro de Observações Clínicas.

[00210] Para testar a eliminação nasal de PCV2, nos Dias 24, 25, e em seguida a cada segundo dia ímpar do estudo até e incluindo o Dia 49, um esfregaço de dácron estéril foi inserido por via intra nasal quer dentro da narina esquerda quer da direita de cada porco (um esfrega- ço por porco) tão asseticamente quanto possível, girado rapidamente por uns poucos segundos e em seguida removido. Cada esfregaço foi em seguida colocado dentro de um único tubo de tampa de encaixe de pressão estéril contendo 1,0 mL de meio EMEM com 2% de IFBS, 500 unidades/mL de Penicilina, 500 μg/mL de Estreptomicina e 2,5 μg/mL de Fungizone. O esfregaço foi cortado dentro do tubo, e o tubo de encaixe de pressão foi selado e etiquetado apropriadamente com número do animal, número do estudo, data de coleta, dia do estudo e "esfre- gaço nasal." Os tubos de encaixe de pressão selados foram armaze-nados a -40 ± 10°C até serem transportados de um di a para o outro sobre gelo para BIVI-St. Joseph. As coletas de esfregaço nasal foram registradas no Formulário de Coleta de Amostra de Esfregaço Nasal (Nasal Swab Sample Collection Form). BIVI-R&D conduziu teste de isolamento viral quantitativo (VI) para PCV2 sobre amostras de esfre- gaço nasal. Os resultados foram expressados em valores de log10. Um valor de 1,3 log ou menos foi considerado negativo e qualquer valor maior do que 1,3 logs foi considerado positivo.

[00211] Porcos que morreram (Nos. 28, 52, 56, 69, 82, e 93) no primeirosítio de estudo foram necropsiados ao nível necessário para determinar um diagnóstico. Lesões macroscópicas foram registradas e não foram conservados tecidos destes porcos. No segundo sítio de estudo, os porcos que morreram antes do Dia 49 (Nos. 45, 23, 58, 35), os porcos encontrados mortos no Dia 49 antes da eutanásia (Nos. 2, 43) e os porcos eutanizados no Dia 49 foram necropsiados. Foram observadas quaisquer lesões macroscópicas e as percentagens de lobos pulmonares com lesões foram registradas no Formulário do Relatório de Necropsia.

[00212] De cada um dos 103 porcos necropsiados no segundo local de estudo, uma amostra de tecido da amídala, pulmonar, de coração, do fígado, linfonodos mesentéricos, rins e linfonodos inguinais foi colocada dentro de um único recipiente com 10% de formalina tamponada; enquanto outra amostra de tecido dos mesmos órgãos supracitados foi colocado em um Whirl-pak (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) e cada Whirl-pak foi colocado sobre gelo. Cada recipiente foi adequadamente rotulado. As coletas de amostras foram registradas no Formulário do Relatório de Necropsia (Necropsy Report Form). Depois disso, amostras de tecido fixadas com formalina e um Formulário de Solicitação de Diagnóstico (Diagnostic Request Form) foram submetidasà experimentação por IHC. A experimentação por IHC foi conduzida de acordo com procedimentos laboratoriais ISU de rotina para técnicas de recebimento de amostras, preparação de amostra e placa, e de tingimento. Tecidos frescos em Whirl-paks foram despachados com sacos de gelo para o Monitor do Estudo para armazenamento (-70° ± 10°C) e possível uso futuro. Tecidos fixados com fo rmalina foram examinados por um patologista para detecção de PCV2 por IHC e classificados usando o seguinte sistema de classificação: 0 = Nenhuma; 1 = Tingimento positivo insuficiente, poucos sítios; 2 = Tingimento positivo moderado, múltiplos sítios; e 3 = Abundante tingimento positivo, difuso por todo o tecido. Devido ao fato de que o patologista não pode diferenciar positivamente linfonodo inguinal de linfonodo mesen- térico, os resultados para estes tecidos foram simpesmente etiqueta-dos como Linfonodo e o escore dado ao maior escore para cada um dos dois tecidos por animal.

RESULTADOS

[00213] Os resultados para este exemplo são dados abaixo. Observa-se que um porco do Grupo 9 morreu antes do Dia 0, e 5 porcos mais morreram depois da vacinação (1 porco do Grupo 4; 1 porco do Grupo 6; 2 porcos do Grupo 8; e 1 porco do Grupo 9). Exame pós- morte indicou que todos os seis morreram devido a infecções subjacentes que não foram associadas com vacinação ou PMWS. Adicionalmente, não foram observados eventos adversos ou reações no sítio de injeção com quaisquer grupos.

[00214] Os resultados do ganho de peso diário médio (ADWG) são apresentados abaixo na Tabela 6. O Grupo 9, o grupo controle estrito negativo, teve o maior ADWG [0,48 + 0,08 Kg/dia (1,06 ± 0,17 lb/dia), seguido pelo Grupo 5 [0,43 + 0,10 Kg/dia (0,94 ± 0,22 lb/dia)], o qual recebeu uma dose de 8 μg de rORF2. O Grupo 3, o qual recebeu uma dose de 4 μg de vORF2, teve o menor ADWG [0,22 + 0,09 Kg/dia (0,49 ± 0,21 lb/dia)], seguido pelo Grupo 7 [0,23 + 0,07 Kg/dia (0,50 ± 0,15 lb/dia)], o qual recebeu 2 doses de vacina de vírus morto. Tabela 6. Sumário do Ganho de Peso Diário Médio por Grupo (ADWG)

[00215] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada.

[00216] Os resultados da sorologia de PCV2 são apresentados abaixo na Tabela 7. Todos os nove grupos foram soronegativos para PCV2 no Dia -3. No Dia 14, Grupos recebendo vacinas de vORF2 tiveram os maiores títulos, os quais variaram de 187,5 a 529,2. Porcos recebendo vacina de vírus morto tiveram os maiores títulos seguintes, seguidos pelos grupos recebendo vacinas de rORF2. Os Grupos 8 e 9 permaneceram soronegativos neste momento. No Dia 24 e Dia 31, porcos recebendo vacinas de vORF2 continuaram a demonstrar uma forte resposta sorológica, seguidos de perto pelo grupo que recebeu duas doses de uma vacina de vírus morto. Porcos recebendo vacinas de rORF2 foram mais lentos para responder sorologicamente e os Grupos 8 e 9 continuaram a permanecer soronegativos. No Dia 49, porcos recebendo vacina de vORF2, 2 doses da vacina de vírus morto e a menor dose de rORF2 demonstrarm as respostas sorológicas mais fortes. Porcos recebendo 16 μg e 8 μg de vacinas de rORF2 tiveram títulos de IFA ligeiramente maiores do que os controles de ataque. O Grupo 9 no Dia 49 demonstrou uma forte resposta sorológica. Tabela 7. Sumário dos Títulos de PCV2 IFA por Grupo TÍTULO IFA MÉDIO

[00217] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00218] *Para fins de cálculo, um título IFA <100 foi designado como um título de "50"; um título IFA >6400 foi designado como um título de "12.800"

[00219] **Dia de Ataque

[00220] ***Dia de Necropsia

[00221] Os resultados das observações clínicas pós-ataque são apresentados abaixo na Tabela 8. Este sumário de resultados inclui observações para Compormentao Anormal, Respiração Anormal, Tosse e Diarréia. A Tabela 9 inclui os resultados do Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos por Grupo e a Tabela 10 inclui resultados do Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-ataque por Grupo. O sintoma clínico mais comum observado neste estudo foi comportamento anormal, o qual foi classificado como letargia branda a grave. Porcos recebendo as 2 menores doses de vORF2, porcos recebendo 16 μg de rORF2 e porcos recebendo 2 doses de vacina KV tiveram taxas de in- cidência de >27,3%. Porcos recebendo 8 μg de rORF2 e o grupo controle estrito negativo não teve comportamento anormal. Nenhum dos porcos neste estudo demonstrou qualquer respiração anormal. Não foi observada tosse freqüentemente em todos os grupos (0 a 25%), assim como diarréia (0 a 20%). Nenhum dos sintomas clínicos mencionados foram patognômicos para PMWS.

[00222] A incidência global de sintomas clínicos variou entre os grupos. Grupos recebendo quaisquer das vacinas de vORF2, o grupo recebendo 16 μg de rORF2, o grupo recebendo 2 doses de vacina KV e o grupo controle de ataque teve a maior incidência de sintomas clínicos globais (>36,4%). O grupo controle estrito negativo, o grupo recebendo 8 μg de rORF2 e o grupo recebendo 4 μg de rORF2 teve taxas de incidência global de sintomas clínicos de 0%, 8,3% e 9,1%, respectivamente.

[00223] As taxas de mortalidade globais entre os grupos variou da mesma forma. O grupo recebendo 2 doses de vacina KV teve a maior taxa de mortalidade (16,7%); enquanto grupos que receberam 4 μg de vORF2, 16 μg de rORF2, ou 8 μg de rORF2 e o grupo controle estrito negativo todo teve taxas de mortalidade de 0%. Tabela 8. Sumário das Observações para Comportamento Anormal, Respiração Anormal, Tosse, e Diarréia por Grupo

[00224] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00225] 1Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer comportamento anormal por no mínimo um dia

[00226] 2Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer respiração anormal por no mínimo um dia

[00227] 3Número total de porcos em cada grupo que demonstrou uma tosse por no mínimo um dia

[00228] 4Número total de porcos em cada grupo que demonstrou diarréia por no mínimo um dia Tabela 9. Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos por Grupo

[00229] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00230] 1Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer sintoma clínico por no mínimo um dia Tabela 10. Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-ataque por Grupo

[00231] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00232] Os resultados da eliminação nasal de PCV2 são apresentados abaixo na Tabela 11. Depois do ataque no Dia 24, 1 porco no Grupo 7 começa a eliminação de PCV2 no Dia 27. Nenhum dos outros grupos experimentou eliminação até o Dia 33. O volume de eliminação nasal foi observado do Dia 35 ao Dia 45. Grupos recebendo qualquer uma das três vacinas de vORF2 e os grupos recebendo ou 4 ou 8 μg de rORF2 tiveram a menor incidência de eliminação nasal de PCV2 (<9,1%). O grupo controle de ataque (Grupo 8) teve a maior taxa de eliminação (80%), seguido prlo grupo controle estrito negativo (Grupo 9), o qual teve uma taxa de incidência de 63,6%. Tabela 11. Sumário da Incidência de Eliminação Nasal de PCV2 por Grupo

[00233] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; vírus celular inteiro morto = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00234] O Sumário da Incidência de Icterícia por Grupo, da Incidência de Úlceras Gástricas por Grupo, os Escores de Lesões Pulmonares Médias por Grupo, e da Incidência de Lesões Pulmonares por Grupo são mostrados abaixo na Tabela 12. Seis porcos morreram no primeiro sítio de teste durante a fase de pós-vacinação do estudo (Grupo 4, N=1; o Grupo 6, N=1; o Grupo 8, N=2; o Grupo 9, N=2). Quatro de seis porcos tiveram lesões fibrinosas em uma ou mais cavidades corporais, um porco (Grupo 6) teve lesões consistentes com doença clostridial, e um porco (Grupo 9) não teve lesões macroscópicas. Nenhum dos porcos que morreu durante a fase pós-vacinação do estudo teve lesões consistentes com PMWS.

[00235] Porcos que morreram pós-ataque e porcos eutanizados no Dia 49 foram necropsiados. Na necropsia, icterícia e úlceras gástricas não estavam presentes em qualquer grupo. Com respeito a % média de lesões pulmonares, o Grupo 9 teve a menor% média de lesões pulmonares (0%), seguido pelo Grupo 1 com 0,40 ± 0,50% e o Grupo 5 com 0,68 ± 1,15%. Os Grupos 2, 3, 7 e 8 tiveram a maior% média de lesões pulmonares (>7,27%). Cada um destes quatro grupos continha um porco com% de lesões pulmonares >71,5%, os quais desviaram os resultados maiores para estes quatro grupos. Com a exceção do Grupo 9 com 0% de lesões pulmonares observadas, os 8 grupos restantes tiveram <36% de lesões pulmonares. Quase todas as lesões pulmo-nares observadas foram descritas como vermelhas/púrpura e consolidadas. TABELA 12. Sumário da Incidência de Icterícia por Grupo, da Incidência de Úlceras Gástricas por Grupo,% Média de Escores de Lesões Pulmonares por Grupo, e da Incidência de Lesões Pulmonares Mencionadas por Grupo

[00236] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00237] O Sumário dos Resultados da Incidência IHC Positiva por Grupo são mostrados na Tabela 13. O Grupo 1 (vORF2 - 16 μg) e o Grupo 5 (rORF2 - 8 μg) tiveram a menor taxa de resultados IHC positivos (16,7%). O Grupo 8 (Controles de Ataque) e o Grupo 9 (Controles Estritos Negativos) tiveram a maior taxa de resultados IHC positivos, 90% e 90,9%, respectivamente. TABELA 13. Sumário da Taxa de Incidência IHC Positiva por Grupo

[00238] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00239] Pós-ataque, o Grupo 5, o qual recebeu uma dose de 8 μg de antígeno rORF2, teve melhor performance do que os outros 6 grupos de vacina. O Grupo 5 teve o maior ADWG [0,43 + 0,10 kg/dia (0,94 ± 0,22 lb/dia)], a menor incidência de comportamento anormal (0%), a segunda menor incidência de tosse (8,3%), a menor incidência de sintomas clínicos globais (8,3%), a menor taxa de mortalidade (0%), a menor taxa de eliminação nasal de PCV2 (8,3%), a segunda menor taxa para% média de lesões pulmonares (0,68 ± 1,15%) e a menor taxa de incidência para tecidos positivos (16,7%). Os grupos recebendo vários níveis de antígeno rORF2 global tiveram melhor performance do que os grupos recebendo vários níveis de vORF2 e o grupo recebendo 2 doses de vacina de PCV2 de célula inteira morta tiveram o pior desempenho. As Tabelas 14 e 15 contêm sumários dos dados pós-ataque por grupo. TABELA 14. Sumário dos Dados Pós-Ataque por Grupo - Parte 1

[00240] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada Tabela 15. Sumário dos Dados Pós-Ataque por Grupo - Parte 2

[00241] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00242] Os resultados deste estudo indicam que todos os esforços de vacina adicionais devem se focalizar em uma vacina de rORF2. Além de tudo, eliminação nasal de PCV2 foi detectado pós-ataque e vacinação com uma vacina de PCV2 resultou em uma redução da eliminação. Imuno-histoquímica de tecidos linfóides selecionados também serviu como um bom parâmetro para eficácia da vacina, ao passo que grandes diferenças no ADWG, sintomas clínicos, e lesões ma- croscópicas não foram detectadas entre os grupos. Este estudo foi complicado pelo fato de que PCV2 extrínseco foi introduzido em algum ponto durante o estudo, conforme evidenciado por eliminação nasal de PCV2, soroconversão de PCV2 e tecidos IHC positivos no Grupo 9, o grupo controle estrito negativo.

DISCUSSÃO

[00243] Sete vacinas de PCV2 foram avaliadas neste estudo, as quais incluíram três níveis de doses diferentes de antígeno vORF2 administrado uma vez no Dia 0, três níveis de doses diferentes de an- tígeno rORF2 administrado uma vez no Dia 0 e um nível de dose de vacina PCV2 de célula inteira morta administrado uma vez Dia 0 e Dia 14. Além de tudo, o Grupo 5, o qual recebeu 1 dose de vacina contendo8 μg de antígeno rORF2, teve os melhores resultados. O Grupo 5 teve o maior ADWG, a menor incidência de comportamento anormal, a menor incidência de respiração anormal, a segunda menor incidência de tosse, a menor incidência de sintomas clínicos globais, a menor taxa de mortalidade, a menor taxa de eliminação nasal de PCV2, a se-gunda menor taxa para% média de lesões pulmonares e a menor taxa de incidência para tecidos IHC positivos.

[00244] Interessantemente, o Grupo 4, o qual recebeu uma maior dose de antígeno rORF2 do que o Grupo 5, não teve desempenho tão bom ou melhor do que o Grupo 5. O Grupo 4 teve um ADWG ligeiramente menor, uma maior incidência de comportamento anormal, uma maior incidência de sintomas clínicos globais, uma maior taxa de eliminação nasal de PCV2, uma maior% média de lesões pulmonares, e uma maior taxa para tecidos IHC positivos do que o Grupo 5. Análise estatística, a qual pode ter indicado que as diferenças entre estes dois grupos não foram estatisticamente significantes, não foi conduzida sobre estes dados, mas houve uma tendência observada de que o Grupo 4 não teve desempenho tão bom quanto o Grupo 5.

[00245] Depois da vacinação, 6 porcos morreram no primeiro sítio de estudo. Quatro dos seis porcos eram do Grupo 8 ou do Grupo 9, que não receberam vacina. Nenhum dos seis porcos demonstraram lesões consistentes com PMWS, não foram reportados eventos adversos e no total, todas as sete vacinas pareceram ser seguras quando administradas a porcos de aproximadamente 11 dias de idade. Durante a fase pós-vacinação do estudo, porcos recebendo qualquer um dos três níveis de dose de vacina de vORF2 ou vacina de célula inteira morta tiveram os maiores níveis de IFAT, enquanto o Grupo 5 teve os menores níveis de IFAT logo antes do ataque, dos grupos de vacina.

[00246] Embora não comprovado formalmente, acredita-se que a via de transmissão de PCV2 predominante para suíno jovem logo depois do desmame seja por contato direto oronasal e uma vacina eficaz que reduz a eliminação nasal de PCV2 em uma situação de produção ajudaria a controlar a disseminação da infecção. Grupos recebendo um de três níveis de antígeno vORF2 e o grupo recebendo 8 μg de rORF2 tiveram a menor taxa de incidência de eliminação nasal de PCV2 (8,3%). Supostamente, o grupo controle de ataque teve a maior taxa de incidência de eliminação nasal (80%).

[00247] Lesões macroscópicas em porcos com PMWS secundária a infecção por PCV2 consistem tipicamente de linfadenopatia generalizada em combinação com um ou um múltiplo dos seguintes: (1) pneumonia intersticial com edema interlobular, (2) palidez cutânea ou icterícia, (3) fígados atróficos mosqueados, (4) úlceras gástricas e (5) nefrite. Na necropsia, icterícia, hepatite, nefrite, e úlceras gástricas não foram observadas em quaisquer grupos e não foi especificamente examinada linfadenopatia. Os escores da% média de lesão pulmonar variaram entre os grupos. O grupo recebendo 16 μg de antígeno vORF2 teve o menor escore da% média de lesão pulmonar (0,40 ± 0,50%), seguido pelo grupo que receber 8 μg de rORF2 (0,68 ± 1,15%). Conforme esperado, o grupo controle de ataque teve o maior escore da% média de lesão pulmonar (9,88 ± 29,2%). Em todos os quatro grupos, os escores da% média de lesão pulmonar foram elevados devido a um porco em cada um destes grupos que teve escores de lesão pulmonar muito elevados. A maioria das lesões pulmonares foram descritas como vermelhas/púrpura e consolidadas. Tipicamente, lesões pulmonares associadas com PMWS são descritas como de cor castanha amarelada e não-flexíveis com edema interlobular. As lesões pulmonares observadas neste estudo foram ou não associadas com infecção por PCV2 ou um segundo agente pulmonar infeccioso pode ter estado presente. Dentro do contexto deste estudo, os escores da% de lesão pulmonar provavelmente não refletem uma medida verdadeira da quantidade de infecção pulmonar devido a PCV2.

[00248] Outros pesquisadores demonstraram uma direta correlação entre a presença de antígeno de PCV2 por IHC e histopatologia. Não foi conduzida histopatologia em tecidos selecionados com este estudo. O Grupo 1 (16 μg de vORF2) e o Grupo 5 (8 μg de rORF2) teve a menor taxa de incidência de porcos positiva para antígeno de PCV2 (8,3%), enquanto o Grupo 9 (o grupo controle estrito negativo - 90,9%) e o Grupo 8 (o grupo controle de ataque - 90,0%) teve as maiores taxas de incidência para porcos positivos para antígeno de PCV2. Devido à natureza não-subjetiva deste teste, os resultados da IHC são provavelmente um dos melhores parâmetros para julgar a eficácia da vacina. Portanto, em um aspecto da presente invenção, foi determinada a Dosagem Protetora Mínima (Minimum Portective Dosage, MPD) de um 1 ml/l dose de produto recombinante com antígeno de ORF2 de PCV2 (rORF2) extraído no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Dos três grupos que receberam níveis variáveis de antí- geno rORF2, o Grupo 5 (8 μg de antígeno rORF2) teve claramente o maior nível de proteção. O Grupo 5 ou teve os melhores resultados ou foi vinculado aos resultados mais favoráveis com respeito a todos os parâmetros examinados. Quando o Grupo 5 foi comparado com os outros seis grupos de vacina pós-ataque, o Grupo 5 teve o maior ADWG (0,94 ± 0,22 lb/dia), a menor incidência de comportamento anormal (0%), a segunda menor incidência de tosse (8,3%), a menor incidência de sintomas clínicos globais (8,3%), a menor taxa de mortalidade (0%), a menor taxa de eliminação nasal de PCV2 (8,3%), a segunda menor taxa para % média de lesões pulmonares (0,68 ± 1,15%) e a menor taxa de incidência para tecidos IHC positivos (16,7%).

[00249] Em outro aspecto da presente invenção, foi determinada a MPD de um 1 ml/l dose de produto convencional que é antígeno de ORF2 de PCV2 (vORF2) parcialmente purificado no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Dos três grupos que receberam níveis variáveis de antígeno vORF2, o Grupo 1 (16 μg de vORF2) teve o maior nível de proteção. O Grupo 1 superou os Grupos 2 e 3 com respeito a ADWG,% média de lesões pulmonares, e IHC. Os Grupos 1 e 2 (8 μg de antígeno vORF2) tiveram performance igual com respeito à incidência global de sintomas clínicos, o Grupo 3 (4 μg de antígeno vORF2) teve a menor taxa de mortalidade, e todos os três grupos tiveram performance igual com respeito à eliminação nasal. Além de tudo, vacinas de vORF não tiveram performance igual às vacinas de rORF.

[00250] Em ainda outro aspecto da presente invenção, foi determinada a eficácia de uma dose máxima de 2 ml/2 dose de vacina de PCV2 Morto Convencional no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Das sete vacinas avaliadas neste estudo, a vacina de PCV2 de célula inteira morta teve o pior desempenho. Leitões recebendo duas doses de vacina de PCV2 celular inteira morta teve o menor ADWG, a segunda maior taxa de comportamento anormal (58,3%), a segunda maior incidência global de sintomas clínicos (58,3%), a maior taxa de mortalidade (16,7%), a segunda maior incidência de eliminação nasal (41,7%), maior% média de lesões pulmonares (9,88 ± 29,2%), uma alta incidência de lesões pulmonares observadas (75%) e uma taxa de incidência por Imuno-histoquímica moderada nos tecidos (41,7%). No entanto, ainda foi eficaz para provocar uma reação imune.

[00251] Em ainda outro aspecto da presente invenção, a eliminação nasal de PCV2 foi avaliada como um parâmetro de eficácia e os parâmetros de eficácia de PCV2 prévios de estudos anteriores foram reconfirmados. Os resultados deste estudo indicam que ocorrer eliminação nasal de PCV2 depois de ataque intra nasal e que vacinas de PCV2 reduzem a eliminação nasal de PCV2 pós-ataque. Além disso, os resultados deste estudo e relatórios na literatura indicam que a Imuno-histoquímica também deve continuar a ser avaliada em provas futuras de vacinas de PCV2.

[00252] Algumas conclusões adicionais originárias deste estudo são que linfadenopatia é um dos sinais patognomônicos da PMWS. Outro dos sinais patognomônicos da PMWS é depleção linfóide e histiócitos multinucleados/gigantes. Adicionalmente, não foram observados eventos adversos ou reações no sítio de injeção para qualquer uma das 7 vacinas de PCV2 e todas as 7 vacinas de PCV2 pareceram ser seguras quando administradas a porcos jovens.

EXEMPLO 5

[00253] Este exemplo testa a eficácia de oito vacinas candidatas de PCV2 e reconfirma os parâmetros de ataque de PCV2 de estudos de ataque anteriores depois de exposição a uma cepa virulenta de PCV2. Cento e cinqüenta (150) leitões privados de colostro paridos por cesárea (CDCD), de 6 a 16 dias de idade, foram bloqueados por peso e divididos aleatoriamente em 10 grupos de tamanho igual. A Tabela 16 determina o Design do Estudo Geral para este Exemplo. Tabela 16. Design do Estudo Geral

[00254] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00255] A formulação de vacina administrada a cada grupo foi como se segue. PCV2 Vacina N°. 1, administrada a dose de 1 x 2 ml ao Grupo 1, foi uma alta dose (dose de 16 ug/2 ml) de antígeno ORF2 recombinante inativado adjuvantado com IMS 1314 (16 ug de rORF2 - IMS 1314). PCV2 Vacina N°. 2, administrada a dose d e 1 x 2 ml ao Grupo 2, foi uma alta dose (dose de 16 ug/2 ml) de um antígeno ORF2 de PCV2 gerado por VIDO R-1 parcialmente purificado adjuvantado com Carbopol (16 ug de vORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 3, administrada a dose de 1 x 2 ml ao Grupo 3, foi uma alta dose (dose de 16 ug/2 ml) de antígeno de ORF2 recombinante inativado adjuvantado com Carbopol (16 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 4, administrada a 1 x dose de 1 ml ao Grupo 4, foi uma alta dose (dose de 16 ug/1 ml) de um antígeno de ORF2 de PCV2 gerado por VIDO R-1 parcialmente purificado adjuvantado com Carbopol (16 ug de vORF2 - Carbopol). Vacina N°. 5, administrada a dose de 1 x 2 ml ao Grupo 5, foi uma dose de 4 ug/2 ml de um antígeno de ORF2 recombinante ina- tivado adjuvantado com Carbopol (4 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 6, administrada a dose de 1 x 2 ml ao Grupo 6, foi uma dose de 1 ug/2 ml de um antígeno de ORF2 recombinante inativado ad- juvantado com Carbopol (1 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 7, administrada a dose de 1 x 2 ml ao Grupo 7, foi uma dose baixa (dose de 0,25 ug/2 ml) de antígeno de ORF2 recombinante inativado adjuvantado com Carbopol (0,25 ug de rORF2 - Carbopol). PCV2 Vacina N°. 8, administrada a dose de 1 x 2 ml do Grup o 8, foi uma alta dose (título pré-inativação > 8,0 log/dose de 2 ml) de antígeno PCV2 Struve gerado por VIDO R-1 Convencional Inativado adjuvantado com Carbopol (>8,0 log KV - Carbopol). No Dia 0, os Grupos 1 a 8 foram tratados com suas vacinas atribuídas. Os Grupos 1 a 3 e 5 a 8 recebe-ramreforços de suas vacinas respectivas novamente no Dia 14. A efi-cácia de uma única dose de 16 μg de vORF2 - Carbopol foi testada sobre o Grupo 4 o qual não receber um reforço no Dia 14. Os leitões foram observados para eventos adversos e reações no sítio de injeção depois de ambas as vacinações. No Dia 21 os leitões foram movidos para um segundo sítio de estudo onde os Grupos 1 a 9 foram alojados em grupo em uma construção e o Grupo 10 foi alojado en uma construção separada. Todos os porcos receberam hemocianina de keyhole limpet emulsificada com adjuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA) nos Dias 22 e 28. No Dia 25, os Grupos 1 a 9 foram testados com aproximadamente 4 logs de vírus PCV2 virulento. Pelo Dia 46, tinham ocorrido muito poucas mortes no grupo controle de ataque. Em uma tentativa de imunoestimular os porcos e aumentar a virulência do material de ataque de PCV2, todos os Grupos foram tratados com IN- GELVAC® PRRSV MLV (Vacina Reprodutiva e Respiratória Porcina, Vírus Vivo Modificado) (Porcine Reproductive and Respiratory Vaccine, Modified Live Virus) no Dia 46.

[00256] Amostras de sangue pré- e pós-ataque foram colhidas para sorologia de PCV2. Foram colhidos dados de peso corporal pós- ataque para determinação do ganho de peso diário médio (ADWG) e observações de sinais clínicos. No Dia 50, todos os porcos sobreviven-tes foram necropsiados, lesões macroscópicas foram registradas, os pulmões foram classificados para patologia, e tecidos selecionados foram preservados em formalina para exame por Imuno-histoquímica (IHC) para detecção de antígeno de PCV2 em uma data posterior.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00257] Este foi um estudo-cego parcialmente da viabilidade do ataque de vacinação conduzido em porcos CDCD, de 6 a 16 dias de idade no Dia 0. Para serem incluídas no estudo, os títulos de PCV2 IFA de porcas foram <1:1000. Adicionalmente, o estado sorológico das porcas foram de um rebanho PRRS-negativo conhecido. Dezesseis (16) porcas foram testadas para estado sorológico de PCV2 e todas as dezesseis (16) tinham um título de PCV2 de <1000 e foram transferidas para o primeiro sítio de estudo. Cento e cinqüenta (150) leitões foram paridos por cirurgias por seção cesareana e estavam disponíveis para este estudo no Dia -3. No Dia -3, 150 porcos CDCD no primeiro sítio de estudo foram pesados, identificados com etiquetas de orelha, bloqueados por peso e atribuídos aleatoriamente a 1 de 10 grupos, conforme determinado acima na tabela 16. Foram colhidas amostras de sangue de todos os porcos. Se qualquer animal de teste satisfazendo os critérios de inclusão for registrado no estudo e foi posteriormente excluído por qualquer razão, o Investigador e Monitor consultados de modo a determinar o uso de dados colhidos do animal na análise final. Foi documentada a data de quais leitões registrados foram excluídos e a razão para exclusão. Não foram excluídas porcas satisfazendo os critérios de inclusão, selecionadas para o estudo e transportadas para o primeiro sítio de estudo. Nenhum leitão foi excluído do estudo, e nenhum animal de teste foi removido do estudo antes do término. A Tabela 17 descreve os frames de tempo para as atividades chave deste Exemplo. TABELA 17. Atividades do Estudo

[00258] Depois do completamento da fase in-life do estudo, tecidos fixados com formalina foraom examinados por Imuno-histoquímica (IHC) para detecção de antígeno de PCV2 por um patologista, amostras de sangue foram avaliadas para sorologia de PCV2, e foi determinado o ganho de peso diário médio (ADWG) do Dia 25 ao Dia 50.

[00259] Os animais foram alojados no primeiro sítio de estudo dentro de gaiolas individuais em sete ambientes a partir do nascimento até aproximadamente 11 dias de idade (aproximadamente Dia 0 do estudo). Cada ambiente foi idêntico em disposição e consistiu de gaiolas de aço inoxidável individuais empilhadas com ar aquecido e filtrado suprido separadamente para cada unidade de isolamento. Cada ambi- ente tinha calor e ventilação separados, deste modo prevenindo a con-taminação cruzada de ar entre os ambientes. Os animais foram alojados em dois prédios diferentes no segundo sítio de estudo. O Grupo 10 (o grupo controle Estrito negativo) foi alojado separadamente em um prédio de criadouro convertido e os Grupos 1 a 9 foram alojados em um prédio de parição convertido. Cada grupo foi alojado em uma pocilga separada (14 a 15 porcos por pocilga) e cada pocilga proporcionou aproximadamente 0,21 m2 (2,3 pés quadrados) por porco. Os Grupos 2, 4 e 8 foram encerrados em três pocilgas adjacentes sobre um lado da travessa e os Grupos 1, 3, 5, 6, 7, e 9 foram encerrados em seis pocilgas adjacentes sobre o outro lado da travessa. A separação dos Grupos foi devida a preocupação pelo Monitor do Estudo de que as vacinas administradas aos Grupos 2, 4, e 8 não tinham sido totalmente inativadas. Cada pocilga estava sobre um piso elevado com pisos feito de ripas de plástico. Um buraco abaixo das pocilgas serviu como um tanque de contenção para excremento e resíduos. Cada construção tinha seus próprios sistemas de aquecimento e ventilação separados, com pouca probabilidade de contaminação cruzada do ar entre as construções.

[00260] No primeiro sítio de estudo, leitões foram alimentados com uma ração de leite especialmente formulada a partir do nascimento até aproximadamente 3 semanas de idade. Todos os leitões estavam con-sumindoração mista especial sólida, pelo Dia 21 (aproximadamente 4 % semanas de idade). No segundo sítio de estudo, todos os leitões foram alimentados com uma ração de mistura comercial não-medicada personalizada apropriada para sua idade e peso, à vontade. Também estava disponível água em ambos os sítios de estudo à vontade.

[00261] Todos os porcos de teste foram tratados com 1,0 mL de NAXCEL®, IM, em pernas alternadas nos Dias 19, 20, e 21. Além disso, o Porco N°. 11 (Grupo 1) foi tratado com 0,5 mL de NAXCEL® IM no Dia 10, o Porco N°. 13 (Grupo 10) foi tratado co m 1 mL de Penicilina e 1 mL de PREDEF® 2X no Dia 10, o Porco N°. 4 (G rupo 9) foi tratado com 1,0 mL de NAXCEL® IM no Dia 11, e os Porcos 1 (Grupo 1), 4 e 11 foram cada um tratado com 1,0 mL de NAXCEL® no Dia 14 por várias razões de saúde.

[00262] Enquanto em ambos os sítios de estudo, os porcos estavam sob cuidado veterinário. Foram conduzidos exames de saúde dos animais no Dia -3 e foram registrados no Formulário de Registro de Exame de Saúde (Health Examination Record Form). Todos os animais estavam em bom estado de saúde e nutricional antes da vacinação conforme determinado por observação no Dia 0. Foi observado que todos os animais de teste estavam em bom estado de saúde e nutricional antes do ataque. As carcaças e os tecidos foram descartados derretendo. A disposição final dos animais do estudo foi registrada no Registro de Disposição Animal (Animal Disposition Record).

[00263] Nos Dias 0 e 14, porcos atribuídos aos Grupos 1 a 3 e 5 a 8 receberam 2,0 mL das Vacinas de PCV2 1-4 atribuídas, respectivamente, IM na região direita e esquerda do pescoço, respectivamente, usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x ^". Porcos atribuídos ao Grupo 4 receberam 1,0 mL de PCV2 Vacina N°. 2, IM na região direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x ^" no Dia 0 somente.

[00264] No Dia 22 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de KLH/ICFA IM na região esquerda do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x1". No Dia 28 todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de KLH/ICFA na região da perna direita usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x 1".

[00265] No Dia 25, porcos atribuídos aos Grupos 1 a 9 receberam 1,0 mL de material do ataque de PCV2 ISUVDL (3,98 log10 TCID50/mL) IM na região direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x 1". Um adicional de 1,0 mL do mesmo material foi administrado IN a cada porco (0,5 mL por narina) usando uma seringa estéril de 3,0 mL Luer-lock e cânula nasal.

[00266] No Dia 46, todos os porcos de teste receberam 2,0 mL de INGELVAC® PRRS MLV, IM, na região direita do pescoço usando uma seringa estéril de 3,0 mL de Luer-lock e uma agulha estéril de 20 g x 1". A PRRSV MLV foi administrada em uma tentativa para aumentar a virulência do material do ataque de PCV2.

[00267] Os porcos de teste foram observados diariamente para saúde global e eventos adversos no Dia -3 e do Dia 0 ao Dia 21. Cada um dos porcos foi clasificado para comportamento normal ou anormal, respiração ou tosse. Foram registradas observações sobre o Registro de Observações Clínicas. Todos os porcos de teste foram observados do Dia 0 ao Dia 7, e o Grupo 7 foi adicionalmente observado do Dia 14 ao 21, para reações no sítio de injeção. O ganho de peso diário médio foi determinado pesando cada porco em uma balança calibrada nos nos Dias -3, 25 e 50, ou no dia que um porco foi encontrado morto depois do ataque. Os pesos corporais foram registrados no Formulário de Peso Corporal. Os pesos corporais do Dia -3 foram utilizados para bloquear os porcos antes da randomização. Dados do peso do Dia 25 e Dia 50 foram utilizados para determinar o ganho de peso diário médio (ADWG) para cada porco durante estes pontos de tempo. Para porcos que morreram depois do ataque e antes do Dia 50, o ADWG foi ajustado para representar o ADWG do Dia 25 ao dia da morte.

[00268] De modo a determinar a sorologia de PCV2, sangue total venoso foi colhido de cada leitão do seio venoso orbital nos Dias -3 e 14. Para cada leitão, foi colhido sangue do seio venoso orbital inserindo um tubo capilar estéril no canto medial de um dos olhos e drenando aproximadamente 3,l0 mL de sangue total para dentro de um tubo se-parador de soro de 4,0 mL (SST). Nos Dias 25, 32, e 50, sangue total venoso de cada porco foi colhido da veia cava anterior usando uma agulha estéril de 20 g x 1 ^" Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), uma agulha Vaccutainer® holder e um tubo separador de soro de 13 mL. As coletas de sangue em cada ponto de tempo foram registradas no Registro de Coleta de Amostra (Sample Collection Record). O sangue de cada tubo separador de soro foi deixado para coagular, cada tubo SST foi em seguida centrifugado e o soro foi colhido. Soro colhido foi transferido para um tubo de encaixe de pressão estéril e armazenado a -70 ± 10°C até ser testado em uma data posterior. Amostras de soro foram testadas para a presença de anticorpos de PCV2 pela equipe da BIVI-R&D.

[00269] Os porcos foram observados uma vez ao dia do Dia 22 ao Dia 50 para sintomas clínicos e foram classificados para comportamento normal ou anormal, respiração ou tosse. As observações clínicas foram registradas no Registro de Observações Clínicas.

[00270] Os porcos Nos. 46 (Grupo 1) e 98 (Grupos 9) morreram no primeiro sítio de estudo. Ambas estas mortes foram classificadas como mortes por hemorragia e não foram conduzidas necrópsias sobre estes dois porcos. No segundo sítio de estudo, porcos que morreram depois do ataque e antes do Dia 50, e porcos eutanizados no Dia 50, foram necropsiados. Quaisquer lesões macroscópicas foram observadas e as percentagens de lobos pulmonares com lesões foram registradas no Formulário do Relatório de Necropsia.

[00271] De cada um dos porcos necropsiados no segundo sítio de estudo, uma amostra de tecido de amídala, pulmão, coração, e linofo- nodo mesentérico foi posta dentro de um único recipiente com formalina a 10% tamponada; enquanto outra amostra de tecido dos mesmos órgãos supracitados foi colocada dentro de um Whirl-pak® (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) e cada Whirl-pak® foi colocado sobre gelo. Cada recipiente foi adequadamente etiquetado. Coletas de amostra foram registradas no Formulário do Relatório de Necropsia. Depois disso, amostras de tecido fixadas com formalina e um Formulário de Solicitação de Diagnóstico foram submetidas a teste por IHC. Foi conduzido teste por IHC de acordo com procedimentos laboratoriais de rotina para técnicas de recebimento de amostras, preparação de amostras e placas, e de tingimento. Texidos frescos em Whirl- paks® foram despachados com sacos de gelo para o Monitor do Estudo para armazenamento (-70° ± 10°C) e possível uso futuro.

[00272] Tecidos fixados com formalina foram examinados por um patologista para detecção de PCV2 por IHC e classificados usando o seguinte sistema de classificação: 0 = Nenhuma; 1 = Tingimento positivo insuficiente, poucos sítios; 2 = Tingimento positivo moderado, múl-tiplossítios; e 3 = Abundante tingimento positivo, difuso por todo o tecido. Para fins analíticos, um escore de 0 foi considerado "negativo," e um escore de mais de 0 foi considerado "positivo."

RESULTADOS

[00273] Os resultados para este exemplo são dados abaixo. Observa-se os Porcos N°. 46 e 98 morreram nos dias 14 e 25 respectivamente. Estas mortes foram classificadas como mortes por hemorragia. O Porco N°. 11 (Grupo 1) estava ofegante com respiração rápida no Dia 15. De modo diverso, todos os porcos foram normais para comportamento, respiração e tosse durante este período de observação e não foram observados eventos adversos sistêmicos com quaisquer grupos. Não foram observadas reações no sítio de injeção depois de vacinação no Dia 0. Depois de vacinação no Dia 14, sete (7) de quatorze (14) porcos do Grupo 1 (50,0%) tiveram tumefação com um escore de "2" no Dia 15. Quatro (4) de quatorze (14) do Grupo 1 (28,6%) ainda tinham uma tumefação de "2" no Dia 16. Nenhum dos outros grupos experimentou reações no sítio de injeção depois de qualquer vacinação.

[00274] Os resultados do ganho de peso diário médio (ADWG) são apresentados abaixo na Tabela 18. Os Porcos N°. 46 e 98 que morreram de hemorragia foram excluídos dos resultados do grupo. O Grupo 4, o qual recebeu uma dose de 16 ug de vORF2 - Carbopol, teve o maior ADWG [0,53 + 0,12 kg/dia (1,16 ± 0,26 lb/dia)], seguido pelos Grupos 1, 2, 3, 5, 6, e 10 que tiveram ADWGs que variaram de 0,49 + 0,10 kg/dia (1,07 ± 0,23 lb/dia) a 0,50 + 0,12 kg/dia (1,11 ± 0,26 lb/dia). O Grupo 9 teve o menor ADWG [0,40 + 0,13 kg/dia (0,88 ± 0,29 lb/dia)], seguido pelos Grupos 8 e 7, os quais tiveram ADWGs de 0,42 + 0,15 kg/dia (0,93 ± 0,33 lb/dia) e 0,45 + 0,20 kg/dia (0,99 ± 0,44 lb/dia), respectivamente. TABELA 18. Sumário dos Ganhos de Peso Diário Médio dos Grupos (ADWG)

[00275] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00276] Os resultados da sorologia de PVC2 são apresentados abaixo na Tabela 19. Todos os dez (10) grupos foram soronegativos para PCV2 no Dia -3. No Dia 14, os títulos de PCV2 parmaneceram baixos para todos os dez (10) grupos (faixa de 50 a 113). No Dia 25, o Grupo 8, o qual recebeu a vacina do vírus morto de célula inteira, teve o maior título de PCV2 (4617), seguido pelo Grupo 2, o qual recebeu 16 ug de vORF2 - Carbopol, o Grupo 4, o qual recebeu como dose única de 16 ug de vORF2 - Carbopol, e o Grupo 3, o qual recebeu 16 ug de rORF2 - Carbopol, os quais tiveram títulos de 2507, 1920 e 1503 respectivamente. No Dia 32 (uma semana pós-ataque), os títulos para os Grupos 1 a 6 e o Grupo 8 variaram de 2360 a 7619; ao passo que os Grupos 7 (0,25 ug de rORF2 - Carbopol), 9 (Controle de Ataque), e 10 (Controle estrito negativo) tiveram títulos de 382, 129 e 78 respectivamente. No Dia 50 (dia da necropsia), todos os dez (10) grupos demonstraram altos títulos de PCV2 (>1257).

[00277] Nos Dias 25, 32, e 50, o Grupo 3, o qual recebeu duas doses de 16 ug de rORF2 - Carbopol teve títulos de anticorpos maiores do que o Grupo 1, o qual recebeu duas doses de 16 ug de rORF2 - IMS 1314. Nos Dias 25, 32 e 50, o Grupo 2, o qual recebeu duas doses de 16 ug de vORF2 teve maiores títulos do que o Grupo 4, o qual recebeu somente uma dose da mesma vacina. Os Grupos 3, 5, 6, 7, os quais receberam níveis decrescentes de rORF2 - Carbopol, de 16, 4, 1, e 0,25 ug respectivamente, demonstraram títulos de anticorpos correspondentemente decrescentes nos Dias 25 e 32. TABELA 19. Sumário dos Títulos IFA do Grupo de PCV2

[00278] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00279] *Para fins de cálculo, um título IFA <100 foi designado como um título de "50"; um título IFA >6400 foi designado como um título de "12.800".

[00280] ** Dia de Ataque

[00281] *** Dia de Necropsia

[00282] Os resultados das observações clínicas pós-ataque são apresentados abaixo. A Tabela 20 inclui observações para Comporta- mento Anormal, Respiração Anormal, Tosse e Diarréia. A Tabela 21 inclui os resultados do Sumário da Incidência Global de Sintomas Clí-nicos por Grupo e a Tabela 22 inclui resultados do Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-ataque por Grupo. A incidência de comportamento anormal, respiração e tosse pós-ataque foi baixa em porcos recebendo 16 ug de rORF2-IMS 1314 (Grupo 1), 16 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 3), 1 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 6), 0,25 ug de rORF2- Carbopol (Grupo 7), e em porcos no Grupo Controle de Ataque (Grupo 9). A incidência de comportamento anormal, respiração anormal e tossepós-ataque foi zero em porcos recebendo 16 ug de vORF2- Carbopol (Grupo 2), uma única dose de 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 4), 4 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 5), >8 log KV-Carbopol (Grupo 8), e em porcos no grupo controle estrito negativo (Grupo 10).

[00283] A incidência global de sintomas clínicos variou entre os grupos. Porcos recebendo 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 2), uma única dose de 16 ug de vORF2-Carbopol (Grupo 4), e porcos no grupo controle Estrito negativo (Grupo 10) tiveram taxas de incidência de 0%; porcos recebendo 16 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 3), e 1 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 6) tiveram taxas de incidência de 6,7%; porcos recebendo 16 ug de rORF2-IMS 1314 (Grupo 1) tiveram um taxa de incidência global de 7,1%; porcos recebendo 4 ug de rORF2- Carbopol (Grupo 5), 0,25 ug de rORF2-Carbopol (Grupo 7), e >8 log vacina KV tiveram taxas de incidência de 13,3%; e porcos no Grupo Controle de Ataque (Grupo 9) tiveram uma taxa de incidência de 14,3%.

[00284] As taxas de mortalidade global entre os grupos variou também. O Grupo 8, o qual recebeu 2 doses de vacina KV teve a maior taxa de mortalidade de 20,0%; seguido pelo Grupo 9, o grupo controle de ataque, e o Grupo 7, o qual recebeu 0,25 ug de rORF2-Carbopol e teve taxas de mortalidade de 14,3% e 13,3% respectivamente. O Gru- po 4, o qual recebeu uma dose de 16 ug de vORF2-Carbopol teve uma taxa de mortalidade de 6,7%. Todos os outros Grupos, 1, 2, 3, 5, 6, e 10 tiveram uma taxa de mortalidade de 0%. TABELA 20. Sumário de Observações por Grupo para Comportamento Anormal, Respiração Anormal, e Tosse Pós-Ataque

[00285] 1Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer comportamento anormal por no mínimo um dia

[00286] 2Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer respiração por no mínimo um dia

[00287] 3Número total de porcos em cada grupo que demonstrou uma tosse por no mínimo um dia TABELA 21. Sumário da Incidência Global de Sintomas Clínicos Pós-Ataque por Grupo

[00288] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00289] 1Número total de porcos em cada grupo que demonstrou qualquer sintoma clínico por no mínimo um dia TABELA 22. Sumário das Taxas de Mortalidade Pós-Ataque por Grupo

[00290] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00291] O Sumário da Percentagem Média de Lesões Pulmonares por Grupo e Diagnóstico Experimental é dado abaixo na Tabela 23. O Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve a maior percentagem de lesões pulmonares com uma média de 10,81 ± 23,27%, seguido pelo Grupo 7, o qual recebeu 0,25 ug de rORF2-Carbopol e teve uma média de 6,57 ± 24,74%, o Grupo 5, o qual recebeu 4 ug de rORF2- Carbopol e teve uma média de 2,88 ± 8,88%, e o Grupo 8, o qual recebeu a vacina KV e teve uma média de 2,01 ± 4,98%. os seis (6) grupos restantes tiveram menor percentagem média de lesões pulmonares que variaram de 0,11 ± 0,38% a 0,90 ± 0,15%.

[00292] O diagnóstico experimental de pneumonia variou entre os grupos. O Grupo 3, o qual recebeu duas doses de 16 ug de rORF2- Carbopol, teve o menor diagnóstico experimental de pneumonia, com 13,3%. O Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve 50% do grupo diagnosticado experimentalmente com pneumonia, seguido pelo Grupo 10, o grupo controle estrito negativo e o Grupo 2, o qual recebeu duas doses de 16 ug de vORF2-Carbopol, com 46,7% de 40% respectiva-mente, diagnosticado experimentalmente com pneumonia.

[00293] Os Grupos 1, 2, 3, 5, 9, e 10 teve 0% do grupo diagnosticado experimentalmente como infectado com PCV2; ao passo que o Grupo 8, o qual recebeu duas doses se vacina KV, teve a maior taxa por grupo de diagnóstico experimental de infecção por PCV2, a qual é 20%. O Grupo 7, o qual recebeu duas doses de 0,25 ug de rORF2- Carbopol, e o Grupo 4, o qual recebeu uma dose de 16 ug de vORF2- Carbopol teve diagnósticos experimental por grupo de infecção por PCV2 em 13,3% e 6,7% de cada grupo, respectivamente.

[00294] Úlceras gástricas foram diagnosticadas somente em um porco no Grupo 7 (6,7%); ao passo que os outros 9 grupos permaneceram livres de úlceras gástricas. TABELA 23. Sumário da% Média de Lesão Pulmonar por Grupo e Diagnóstico Experimental

[00295] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

[00296] O Sumário dos Resultados da Incidência IHC Positiva por Grupo são mostrados abaixo na Tabela 24. O Grupo 1 (16 ug de rORF2 - IMS 1314) teve a menor taxa por grupo de resultados IHC positivos com 0% dos porcos positivos para PCV2, seguido pelo Grupo 2 (16 ug de vORF2 - Carbopol) e o Grupo 4 (dose única de 16 ug de vORF2 - Carbopol), o qual teve taxas de IHC por grupo de 6,7% e 13,3% respectivamente. O Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve a maior taxa de incidência IHC positiva com 100% dos porcos positivos para PCV2, seguidos pelo Grupo 10, o grupo controle estrito negativo, e o Grupo 8 (vacina KV), com 93,3% e 80% dos porcos positivos para PCV2, respectivamente. TABELA 24. Sumáio do Taxa de Incidência IHC Positiva por Grupo

[00297] vORF2 = ORF2 viral isolado; rORF2 = ORF2 expressado por baculovírus recombinante; KV ou vírus de célula inteira morta = vírus PCV2 cultivado em cultura celular adequada

DISCUSSÃO

[00298] Sete vacinas PCV2 foram avaliadas neste exemplo, as quais incluíram uma alta dose (16 μg) de antígeno rORF2 adjuvantado com IMS 1314 administrado duas vezes, uma alta dose (16 μg) de an- tígeno vORF2 adjuvantado com Carbopol administrado uma vez a um grupo de porcos e duas vezes a um segundo grupo de porcos, uma alta dose (16 μg) de antígeno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, uma dose de 4 μg de antígeno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, uma dose de 1 μg de antí- geno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, uma baixa dose (0,25 μg) de antígeno rORF2 adjuvantado com Carbopol administrado duas vezes, e uma alta dose (> 8 log) de vacina de PCV2 de célula inteira morta adjuvantada com Carbopol. Além de tudo, o Grupo 1, o qual recebeu duas doses de 16 μg de rORF2 - IMS 1314, teve performance ligeiramente melhor do que os Grupos 2 a 7, o qual recebeu vacinas contendo vários níveis de ou antígeno vORF2 ou rORF2 adjuvantado com Carbopol e muito melhor do que o Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina de PCV2 de célula inteira morta. O Grupo 1 teve o terceiro maior ADWG [0,82 + 0,14 kg/dia (1,80 ± 0,30 lb/dia)], a menor incidência de comportamento anormal (0%), a menor incidência de respiração anormal (0%), uma baixa incidência de tosse (7,1%), uma baixa incidência de sintomas clínicos globais (7,1%), foi vinculado com três outros grupos para a taxa de mortalidade mais baixa (0%), a segunda taxa mais baixa para% média de lesões pulmonares (0,15 ± 0,34%), a segunda taxa mais baixa para pneumonia (21,4%) e a taxa de incidência mais baixa para tecidos IHC positivos (0%). O Grupo 1 foi, no entanto, o único grupo no qual foram observadas reações no sítio de injeção, que incluiu 50% dos vacinados 1 dia depois da segunda vacinação. As outras vacinas administradas aos Grupos 2 a 7 teveram performance melhor do que a vacina morta e quase tão boa quanto a vacina administrada ao Grupo 1.

[00299] O Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina de PCV2 morto adjuvantada com Carbopol, teve a pior série de resultados para qualquer grupo de vacina. O Grupo 8 teve o mair baixo ADWG [0,42 + 0,15 kg/dia (0,93 ± 0,33 lb/dia)], a segunda taxa mais alta de comportamento anormal (6,7%), a taxa mais alta de respiração anormal (6,7%), foi vinculado com três outros grupos para a taxa de incidência global mais alta de sintomas clínicos (13,3%), teve a taxa mais alta de mortalidade de todos os grupos (20%), e teve a taxa mais alta de IHC positiva (80%) de qualquer grupo de vacina. Houve preocupação de que a vacina de PCV2 de célula inteira morta pode não ter sido totalmente inativada antes de administração ao Grupo 8, o que pode explicar os pobres resultados deste grupo. Infelizmente, dados definitivos não estavam disponíveis para confirmar esta relação. Além de tudo, no contexto deste exemplo, uma vacina de PCV2 Morto Convencional não ajudou na redução de doença associada com PCV2.

[00300] Conforme previamente mencionado, não foram associados eventos adversos com as vacinas de teste com exceção da vacina ad- juvantada com IMS 1314. Foram observadas reações no sítio de injeção em 50,0% dos porcos 1 dia depois da segunda vacinação com a vacina formulada com IMS 1314 e em 28,6% dos porcos 2 dias depois da segunda vacinação. Não foram observadas reações em quaisquer porcos recebendo vacinas adjuvantadas com Carbopol. Quaisquer es-tudos adicional que incluem porcos vacinados com vacinas adjuvanta- das com IMS 1314 devem continuar a monitorar rigorosamente os porcos para reações no sítio de injeção.

[00301] Todos os porcos foram soro-negativos para PCV2 no Dia -3 e somente o Grupo 2 teve um título acima de 100 no Dia 14. No Dia 25 (dia do ataque), o Grupo 8 teve o maior título de anticorpos para PCV2 (4619), seguido pelo Grupo 2 (2507). Com a exceção do Grupos 7, 9 e 10, todos os grupos demonstraram uma forte resposta de anticorpos pelo Dia 32. Pelo Dia 50, todos os grupos incluindo os Grupos 7, 9 e 10 demonstraram uma forte resposta de anticorpos.

[00302] Um dos sinais patognomônicos da infecção por PCV2 em estágio tardio e subseqüente desenvolvimento de PMWS é retardo do crescimento em porcos desmamados, e em casos graves, observa-se perda de peso. O ganho de peso diário médio dos grupos é um método quantitativo para demonstrar retardo do crescimento ou perda de peso. Neste exemplo, não houve uma grande diferença no peso corporal diário médio entre os grupos. O Grupo 8 teve o menor ADWG de 0,40 + 0,13 kg/dia (0,88 ± 0,29 lb/dia), enquanto o Grupo 4 teve o maior ADWG de 0,53 + 0,12 kg/dia (1,16 ± 0,26 lb/dia). Dentro do contexto deste estudo não houve uma diferença suficiente entre os grupos para basear a eficácia da vacina futura no peso corporal diário médio.

[00303] Além de perda de peso - dispnéia, letargia, palidez da pele e algumas vezes icterícia são sintomas clínicos associados com PMWS. Neste exemplo, comportamento anormal e respiração anormal e tosse foram observados de modo infreqüente para cada grupo. Conforme evidenciado neste estudo, este modelo de ataque e cepa de ataque não resultam em sintomas clínicos opressivos e este não é um parâmetro forte no qual basear a eficácia da vacina.

[00304] Além de tudo, as taxas de mortalidade não foram altas neste exemplo e a falta de uma alta taxa de mortalidade no grupo controle de ataque limita este parâmetro no qual basear a eficácia da vacina. Antes do Dia 46, nos Grupos 4 e 7 cada um teve um porco morto em quinze porcos, o Grupo 9 teve dois porcos mortos em quatorze porcos e o Grupo 8 teve três porcos mortos em quinze porcos. Devido ao fato de que o Grupo 9, o grupo controle de ataque não estava demonstrando sintomas clínicos de PCV2 e somente ocorreram duas mortes neste grupo pelo Dia 46, A vacina MLV de vírus da síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRSV) foi administrada a todos os porcos no Dia 46. Estudos anteriores utilizaram INGELVAC® PRRS MLV como um imunoestimulante para agravar doença PMWS associada com PCV2 e as taxas de mortalidade foram maiores nestes estudos anteriores. Ocorreram duas mortes logo depois de administrar a vacina de PRRS no Dia 46 - o Grupo 4 teve uma morte no Dia 46 e o Grupo 7 teve uma morte no Dia 47 - as quais provavelmente não foram associadas com a administração da vacina de PRRS. Pelo Dia 50, o Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina morta, teve a maior taxa de mortalidade (20%), seguido pelo Grupo 9 (controle de ataque) e o Grupo 7 (0,25 ug de rORF2 - Carbopol), com taxas de mortalidade de 14,3% e 13,3% respectivamente. Além de tudo, a administração da vacina de PRRS ao modelo de ataque tardio na fase de observação pós-ataque deste exemplo não aumentou significativamente as taxas de mortalidade.

[00305] Lesões macroscópicas em porcos com PMWS secundária a infecção por PCV2 tipicamente consistem de linfadenopatia generalizada em combinação com um ou mais dos seguintes: (1) pneumonia intersticial com edema interlobular, (2) palidez cutânea ou icterícia, (3) fígados atróficos mosqueados, (4) úlceras gástricas e (5) nefrite. Na necropsia (Dia 50), não foram observadas icterícia, hepatite, e nefrite em quaisqeur grupos. Uma úlcera gástrica foi observada em um porco do Grupo 7, mas não foi especificamente examinado para linfadenopa- tia. Com base na presença de lesões que foram consistentes com infecção por PCV2, três grupos tiveram no mínimo um porco diagnosticado experimentalmente com PCV2 (PMWS). O Grupo 8, o qual recebeu duas doses de vacina de vírus morto, teve 20% diagnosticados experimentalmente com PCV2, ao passo que o Grupo 7 e o Grupo 4 tiveram 13,3% e 6.7%, respectivamente, diagnosticados experimen-talmente com PCV2. Os escores da% média de lesão pulmonar variou entre os grupos na necropsia. Os Grupos 1, 2, 3, 4, 6 e 10 tiveram baixos escores da% de lesão pulmonar que variaram de 0,11 ± 0,38% a 0,90 ± 0,15%. Conforme esperado, o Grupo 9, o grupo controle de ataque, teve o maior escore da% média de lesão pulmonar (10,81 ± 23,27%). Em quatro grupos, os escores da% média de lesão pulmonar foram elevados devido a um a três porcos em cada um destes grupos terem escores de lesão pulmonar muito elevado. As lesões pulmonares foram vermelhas/púrpura e consolidadas. Tipicamente, lesões pulmonares associadas com PMWS são descritas como de cor castanha amarelada, não-flexíveis com edema interlobular. As lesões pulmonares observadas neste estudo foram ou não associadas com infecção por PCV2 ou um um segundo agente infeccioso pulmonar pode ter estado presente. Dentro do contexto deste estudo, os escores da% de lesão pulmonar provavelmente não refletem uma medida verdadeira da quantidade da infecção pulmonar devido a PCV2. Igualmente, diagnóstico experimental de pneumonia pode ter sido superutilizado também. Quaisquer porcos com lesões pulmonares, algumas tão pequenas quanto 0,10%, foram listados com um diagnóstico experimental de pneumonia. Neste exemplo, não houve diferença suficiente entre os grupos com respeito a lesões macroscópicas e% de lesões pulmonares nas quais basear a eficácia da vacina.

[00306] Os resultados da IHC mostraram as maiores diferenças entre os grupos. O Grupo 1 (16 μg de rORF2 - IMS 1314) teve os menores resultados IHC positivos para antígeno de PCV2 (0%); ao passo que os Grupos 9 e 10 tiveram os maiores resultados IHC positivos com taxas de incidência de 100% e 93,3% respectivamente. Os Grupos 3, 5, 6 e 7, os quais receberam 16, 4, 1 ou 0,25 μg de antígeno rORF2, respectivamente, adjuvantado com Carbopol, tiveram taxas positivas por IHC de 20%, 20%, 40% e 46.7%, respectivamente. O Grupo 2, o qual recebeu duas doses de 16 μg de vORF2 adjuvantado com Carbopol teve uma taxa positiva por IHC de 6,7%, ao passo que o Grupo 4 o qual recebeu somente uma dose da mesma vacina, teve uma taxa positiva por IHC de 13,3%. Devido à natureza objetiva deste teste e do fato de que os resultados da IHC se correlacionam com os resultados esperados, o teste de IHC é provavelmente um dos melhores parâmetros nos quais basear a eficácia da vacina.

[00307] Portanto em um aspecto da presente invenção, é determinado a Dosagem Protetora Mínima (MPD) de antígeno de PCV2 rORF2 adjuvantado com Carbopol no modelo de porco CDCD na face de um ataque de PCV2. Os Grupos 3, 5, 6 e 7 cada receberam duas doses de antígeno rORF2 adjuvantado com Carbopol, mas o nível de antígeno rORF2 variou para cada grupo. Os Grupos 3, 5, 6 e 7 cada receberam 16, 4, 1 ou 0,25 μg de antígeno rORF2 respectivamente. Em geral, reduzindo o nível de antígeno rORF2 diminuiu os títulos de anticorpos contra PCV2, e aumentou a taxa de mortalidade,% médida de lesões pulmonares e a incidência de tecidos IHC positivos. Dos quatro grupos recebendo níveis variáveis de rORF2 - Carbopol, Grupos 3 e 5, os quais receberam duas doses de 16 ou 4 μg de antígeno rORF2, respectivamente, cada um teve uma taxa positiva por IHC de somente 20%, e cada um teve títulos de anticorpos semelhantes. Além de tudo, com base em resultados positivos por IHC, a dosagem protetora mínima de antígeno rORF2 administrado duas vezes é aproximadamente 4 μg.

[00308] Em outro aspecto da presente invenção, foi avaliada a anti- genicidade de antígenos de PCV2 recombinantes (rORF2) e VIDO R-1 (vORF2). O Grupo 2 recebeu duas doses de 16 μg de vORF2 e o Grupo 3 recebeu duas doses de 16 μg de rORF2. Ambas as vacinas foram adjuvantadas com Carbopol. Ambas as vacinas foram consideradas seguras e ambas tiveram 0% de taxa de mortalidade. O Grupo 2 teve um título de anticorpos contra PCV2 de 2507 no Dia 25, enquanto o Grupo 3 teve um título de anticorpos contra PCV2 de 1503. O Grupo 3 teve um menor escore da% média de lesão pulmonar do que o Grupo 2 (0,11 ± 0,38% vs. 0,90 ± 0,15%), mas o Grupo 2 teve uma menor taxa de incidência IHC positiva do que o Grupo 3 (6,7% vs. 20%). Além de tudo, ambas as vacinas tiveram antigenicidade similar, mas vORF2 foi associado com resultados de IHC ligeiramente melhores.

[00309] Em ainda outro aspecto da presente invenção, foi determinada a conveniência de dois adjuvantes diferentes (Carbopol e IMS 1314). Ambos os Grupos 1 e 3 receberam duas doses de vacina contendo 16 ug de antígeno rORF2, ma o Grupo 1 recebeu o antígeno ad- juvantado com IMS 1314 ao passo que o Grupo 3 recebeu o antígeno adjuvantado com Carbopol. Ambos os grupos tiveram essencialmente o mesmo ADWG, essencialmente a mesma incidência de sinais clíni- cos pós-ataque, a mesma taxa de mortalidade, e essencialmente a mesma% média de lesões pulmonares; mas o Grupo 1 teve uma taxa IHC positiva de 0% ao passo que o Grupo 3 teve uma taxa IHC positiva de 20%. No entanto, o Grupo 3, o qual recebeu a vacina adjuvanta- da com Carbopol teve maiores títulos de IFAT PCV2 nos Dias 25, 32 e 50 do que o Grupo 1, o qual recebeu a vacina adjuvantada com IMS 1314. Além de tudo, embora a vacina de PCV2 adjuvantada com IMS 1314 não tenha proporcionado melhores resultados de IHC, não proporcionouproteção esmagadoramente melhor contra infecção por PCV2 e não induziu reação no sítio de injeção. Ao passo que a vacina de PCV2 adjuvantada com Carbopol teve performance quase tão boa quanto a vacina adjuvantada com IMS 1314, mas não foi associada com quaisquer eventos adversos.

[00310] Em ainda outro aspecto da presente invenção, foi determinada a viabilidade de ORF2 de PCV2 como um produto de 1 dose de 1 ml. Ambos os Grupos 2 e 4 receberam 16 μg de vacina vORF2 adju- vantada com Carbopol no Dia 0, mas o Grupo 2 recebeu uma segunda dose no Dia 14. O Grupo 4 teve um ADWG ligeiramente maior e uma% médida menor de lesões pulmonares do que o Grupo 2, mas o Grupo 2 teve maiores títulos de IFAT PCV2 no Dia 25, 32 e 50, e uma taca de incidência ligeiramente menor de tecidos IHC positivos. Todos os outros resultados para estes dois grupos foram similares. Além de tudo, uma dose de vORF2 adjuvantado com Carbopol teve desepenho similar a duas doses da mesma vacina.

Claims (5)

1. Vacina de combinação multivalente de dose única, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de circovírus porcino tipo 2 eficaz para reduzir a incidência ou amenizar a gravidade de infecções por circovírus porcino tipo 2, e um componente ativo imunogênico eficaz contra Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina (PRRS), em que o referido antígeno de circovírus porcino tipo 2 é uma proteína ORF2 de PCV2 viral isolada ou recombinante expressa em baculovirus, em que a referida proteína ORF2 de PCV2 é: (i) um polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; (ii) um polipeptídeo que é codificado por um DNA compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou sequencias degeneradas das mesmas, em que o referido componente ativo imunogênico eficaz contra vírus PRRS é vírus PRRS vivo modificado (PRRS MLV).

2. Vacina de combinação multivalente de dose única de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida vacina de combinação multivalente de dose única é eficaz para reduzir ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com infecção por PCV2 através da administração de uma dose da referida vacina a um porco.

3. Vacina de combinação multivalente de dose única de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno de circovírus porcino tipo 2 é um antígeno de circovírus porcino tipo 2 inativado, um circovírus porcino tipo 2 vivo modificado ou atenuado, um vírus quimérico que compreende no mínimo uma sequência de aminoácidos imunogênica de circovírus porcino tipo 2 ou componente do mesmo.

4. Vacina de combinação multivalente de dose única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno de circovírus porcino tipo 2 é uma proteína codificada por uma sequência de DNA, ou sequências degeneradas da mesma, de ORF2 de um circovírus porcino tipo 2.

5.Vacina de combinação multivalente de dose única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o antígeno de circovírus porcino tipo 2 é o antígeno ORF2 expressa por baculovírus.

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