CN101189027A - 改良的prrs疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及经过改良修饰的欧洲基因型活体PRRS疫苗,和可用于制造该疫苗的新型PRRSV病毒株。
Description
发明背景
1.技术领域
本发明属于抗传染病疫苗领域。更具体地,其涉及抗猪生殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)(PRRS),一种影响猪的病毒病的疫苗。
2.背景信息
猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种(+)链ssRNA病毒,属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)。该病毒以两种基因型存在,称作“US”型和“EU”型,它们有约50%的序列同源性(Dea S等人(2000).Arch Virol 145:659-88),但仍然可以通过其免疫学性质加以区分。大多数关于各种分离物的测序信息都是基于结构蛋白质,即包膜蛋白GP5,其只占病毒基因组的~4%,而对非结构蛋白(nsp)则知之甚少。
nsp2蛋白在EU型原型Lelystad病毒(LV)中具有1078个氨基酸,与PRRSV-US仅有32%的同源性(Allende R等人(1999).J Gen Virol80:307-15)。它在自然感染期间诱发产生血清抗体(Oleksiewicz MB等人(2001a).J Virol 75:3277-90,Oleksiewicz MB等人(2001b).Vet Microbiol81:109-25),似乎对病毒复制发挥重要作用(Snijder EJ等人(2001).J GenVirol 82:985-94,van der Meer Y等人(1998).J Virol 72:6689-98),并且被认为具有物种特异性功能(de Vries AAF等人(1997).Seminars in Virology8:33-47)。nsp2氨基酸序列的核苷酸序列编码用SEQ ID NO:2表示。nsp2编码区中的长度变化形式迄今为止仅对一种US型分离物(Shen S等人(2000).Arch Virol 145:871-83)和在美国发现的EU型病毒株(Fang Y等人Virus Res.2004Mar 15;100(2):229-35,Ropp SL等人J Virol.2004Apr;78(7):3684-703)进行过描述。
PRRSV的分离和疫苗的制造在许多出版物中均有描述(WO 92/21375,WO 93/06211,WO93/03760,WO 93/07898,WO 96/36356,EP 0 676 467,EP 0732 340,EP 0 835 930)。但仍然需要提供具有改良特性,特别是对效率和安全性进行了改良的疫苗。
发明简述
本发明涉及经过改良修饰的欧洲基因型活体PRRS疫苗,以及可用于制造该疫苗的新型PRRSV病毒株。特别地,本发明提供了改良的PRRS病毒株,其保存在欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of CellCultures)(ECACC),登录号为ECACC 04102703,ECACC 04102702和ECACC 04102704,或者前述其中一个病毒株的任何后代或子孙。
附图简述
图1:RT-PCR产物的琼脂糖凝胶(2%琼脂糖,溴化乙锭染色),该产物得自于Lelystad类分离物的nsp2区(pos.2068-2713)(泳道1),PRRS(泳道2)和阴性对照(泳道3)。泳道4:100bp梯型(ladder)。来自于PRRS的产物(在434和416bp有双带,在347bp有带)小于LV类的产物(569bp)。
图2:在Ma104细胞培养物上传代一次之后,从所选空斑获得的nsp2PCR产物。
图3:每种长度变化形式的一个代表性空斑的核苷酸序列与原型株Lelystad病毒(LV)的核苷酸序列比较。
图5:从接种PRRS的6周龄仔猪临床样品获得的nsp2PCR产物。圆圈显示罹患PMWS的猪的样品。
图6A:从不同野外样品获得的显示同样缺失222个核苷酸的nsp2PCR产物的核苷酸序列,作为源自于Porcilis PRRS疫苗瓶的一组空斑(例如,空斑P45),与Porcilis衍生空斑36的全长(Lelystad类)序列比较。
图6B:从不同野外样品获得的显示同样缺失135个核苷酸的nsp2PCR产物的核苷酸序列,作为源自于Porcilis PRRS疫苗瓶的一组空斑(例如,空斑P27),与Porcilis衍生空斑36的全长(Lelystad类)序列比较。
图6C:从不同野外样品获得的显示同样缺失153个核苷酸的nsp2PCR产物的核苷酸序列,作为源自于Porcilis PRRS疫苗瓶的一组空斑(例如,空斑P31),与Porcilis衍生空斑36的全长(Lelystad类)序列比较。
发明详述
本发明涉及改良的PRRS疫苗。特别地,本发明涉及经过修饰的活体疫苗(MLV)。经过修饰的活体疫苗的特征在于,包含可以在猪体内复制、但不会引发PRRS临床症状,或者只引发很少且温和的疾病症状的活体病毒。而且,一旦注射,它便会在猪体内诱发免疫响应,通常会导致对之后致病PRRS病毒的感染产生相当大程度的保护。显示这种特征的病毒通常称作减毒病毒。一般而言,减毒病毒可以由致病病毒分离物产生,通过在合适的宿主细胞内重复传代,直到显示期望的性质为止(WO 92/21375,WO93/06211,WO93/03760,WO 93/07898,WO 96/36356,EP 0 676 467,EP 0 732340,EP 0 835 930)。或者,它还可以通过遗传再建产生,通过使用有感染性的克隆,通常是病毒基因组的全长互补DNA转录产物(WO 98/18933,EP 1018 557,WO 03/062407,Nielsen et al,J Virol 2003,77:3702-3711)。在优选的实施方案中,本发明涉及包含欧洲基因型减毒PRRS病毒的MLV。
本发明是基于如下的意外发现,即如果注意使用于疫苗的病毒在nsp2序列中不出现某些缺失,可以提高PRRS MLV的安全性和效能。更具体地,根据本发明的病毒应当包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列,或者与SEQ IDNO:1相差1,2,3,4或5个核苷酸(取代、缺失或插入)的核苷酸序列,作为全部或部分nsp2编码序列的一部分。换言之,所述病毒中不应缺失相应于SEQ ID NO:1核苷酸Nos.145-163的核苷酸。
根据本发明可用于产生疫苗的减毒病毒株已经根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2004年10月27日由Boehringer Ingelheim VetmedicaGmbH保存在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,Great Britain,登录号为04102703(PRRSV bs104-P27),04102702(PRRSV bs104-P31),和04102704(PRRSV bs104-P36)。然而,根据本发明的疫苗不应包含在同一天在相同条件下保存在ECACC的登录号为04102701(PRRSV bs104-P45)的病毒株。该保存病毒株是通过空斑纯化从商业可获得的疫苗产品(PRRS,Intervet Deutschland GmbH,Unterschleiβheim)获得的,这将在实施例中加以说明。意外地发现,所述产品包含4个亚克隆,其中三个克隆(ECACC04102703,ECACC04102702,或ECACC 04102704)具有根据本发明的期望特征,使它们适合于用作改良疫苗制剂的成分,而第四个克隆(ECACC04102701)具有不合需要的nsp2缺失。
在一个方面中,本发明是PRRS病毒株,其可以是已经于2004年10月27日保存在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,Great Britain,登录号为ECACC 04102703,ECACC04102702,和ECACC 04102704的PRRS病毒株中的任何一个,或者前述病毒株其中之一的任何后代或子孙。因此,本发明的范围包括通过以相同或不同的形式繁殖或增殖从保藏病毒株衍生的PRRS病毒株,特别是具有保藏病毒株基本特征的后代。在连续增殖时,病毒株可以发生突变,其大部分不会显著改变这些病毒株的性质。
专家可以显见,本发明的病毒株可以被修饰,以便给予进一步的期望性质。这可以通过经典的增殖和筛选技术加以实现,例如在合适的宿主细胞中连续增殖从而扩展减毒表型。此外还可以通过合适的基因工程技术对这些病毒株的基因组核酸序列进行定向突变而实现。如上文概述的,这些技术通常采用构建病毒基因组的全长互补DNA拷贝(有感染性的克隆),然后通过DNA重组和操作方法(如定点诱变等)进行修饰。这样,可以对例如病毒蛋白质的抗原基或酶性质进行修饰。欧洲和北美基因型PRRS病毒株的感染性克隆在文献中已有报道,见上文引用的参考文献。
适用于本发明疫苗的PRRS病毒株可以通过本领域已知的方法培养和收获,例如通过在合适的宿主细胞中进行繁殖,如猿猴细胞系MA-104、Vero细胞或猪肺泡巨噬细胞,如在实施例中描述的。
因此,本发明优选实施方案的疫苗包含PRRSV病毒株ECACC04102703,ECACC04102702或ECACC 04102704中任何一个以及这些病毒株的任何组合或其后代,但不包含PRRSV病毒株ECACC04102701。优选地,根据本发明的疫苗是经过修饰的活体疫苗,包括一种或多种存活于合适载体中的这些病毒株,但也可以使用失活的病毒制备灭活疫苗(KV)。MLV典型地被配制为允许每剂量给予101-107个病毒颗粒,优选地每剂量103-105个颗粒,更优选地每剂量104-105个颗粒(4.0-5.0log10 TCID50)。KV可以根据每剂量103-1010个病毒颗粒的失活前滴度加以配制。疫苗可以包含药物可接受的载体,例如生理盐溶液。疫苗可以包含或者可不包含佐剂。合适佐剂的实例是α-生育酚乙酸酯,其可以作为商品获得,商品名为Diluvac或者,例如,可以使用明矾基佐剂。
根据本发明的疫苗可以以活体病毒冻干制剂的形式提供,用溶剂复原,产生用于注射的溶液。溶剂可以例如是水、生理盐水或缓冲液,或佐剂溶剂。溶剂可以包含佐剂,例如α-生育酚乙酸酯。然后可将复原的疫苗注射到猪体内,例如通过肌内或皮内注射到颈部。对于肌内注射,可使用2ml的体积,对于皮内注射,典型地为0.2ml。在进一步的方面中,本发明是一种疫苗产品,包括不同容器内的病毒冻干组合物,和用于复原的溶剂,以及任选进一步包含含有使用说明的册页或标识。
根据本发明的疫苗可以不仅包含一种或多种前述的病毒株,还可以包含具有对抗PRRS或其他猪病毒性或细菌性疾病活性的其它成分,例如猪环病毒或经典猪瘟病毒。因此,本发明进一步涉及上述的疫苗,其特征在于,它包含至少一种具有抗非PRRS猪疾病活性的其它抗原。
实施例
1.材料和方法
1.1.用PRRS实验感染怀孕母猪
研究设计
本研究使用14只来自已经证实为PRRSV阴性畜群(病毒学和血清学检验)的健康母猪。母猪面临初次或第二次分娩,并且在妊娠第94天(+/-3)进行疫苗接种/攻击感染(challenge infection)时确认已经怀孕。将它们分成3个处理组(表1)。第一组在妊娠第94天(+/-3)用含至少104.0TCID50的2ml商业剂量的PRRS肌肉注射处理。攻击对照组(组2)鼻内给予2ml致病欧洲野外分离物(European field isolate)92045的细胞培养基,剂量为104.72TCID50。组3在授精前7天肌肉注射接种2ml商业剂量的Ingelvac PRRSMLV,其含有104.0TCID50,并在妊娠第94天(+/-3)用欧洲野外分离物92045(鼻内给予104.72TCID50在2ml细胞培养基中)进行攻击。
对组1中的动物进行监视,直到分娩后5天,对组2和3中的动物进行监视,直到分娩后28天。
动物阶段(Animal phase)
在接种疫苗之前,使所有母猪对动物设施适应一周。调查人每天监视母猪和仔猪的一般健康状况。对每只死亡或者安乐死的动物进行死后检查和随后的实验室分析。
用超声检查确认怀孕。在研究的第0、7、14天和分娩日获得母猪血清,用于PCR和ELISA检验。任何与流产相关的材料均进行实验室检验。
对所有死产仔猪进行常规总体病理研究。从死产仔猪及干尸(mummies)收集全部肺叶的肺组织样品。用于PCR测试的样品保存在-70℃。在出生日从每只仔猪收集2ml哺乳前(precolostral)血液。制备血清,并将等分样品保存在-70℃。血清用于测试病毒血症,用以评估经胎盘感染。组1中存活到第5天的全部仔猪,在第5日龄时安乐死。
临床和生殖能力参数
分别检查了如下的主要指标(按优先顺序):每次产仔活产仔猪的数目,每次产仔死产仔猪的数目,每次产仔干尸化胎的数目,和存活至5或28日龄的仔猪的数目。新生病毒血症(viremic)仔猪的数目用乳前血清确定。检验母猪和/或仔猪PCR阳性血液和组织样品的频率,用以评估感染的流行病学和过程。
1.2野外样品
本研究检验的野外样品从常规PRRSV诊断获取,并且由来自不同欧洲国家的血、血清和各种器官材料,主要是肺和淋巴结组成。这些样品在-20℃保存最多3天后制备RNA,随后剩余的材料转移到-70℃长期保存。RNA和RT-PCR产物保存在-20℃。
1.3.细胞培养
Ma104细胞(克隆CL2621)在含有10%FCS和抗生素的MEM(Dulbecco,Germany)中生长。
猪肺泡巨噬细胞用Wensvoort等人(Wensvoort,G.等人Vet.Quat.1991,13:121-130)说明的方法收集,并修改为如下:每片肺叶用50-100ml PBS灌注,随后揉捏3-5分钟。然后从肺叶收集流体,并通过纱布滤器。重复该程序,直到灌洗液澄清。收集的洗出液在室温下500g离心15分钟。离心沉淀在PBS中清洗,并将50%RPMI 1640(Biochrom),40%FCS和10%DMSO中1×107个细胞的等分试样在-196℃冷冻。为了进一步使用,PAMs在含有10%FCS和抗生素的RPMI 1640培养基中培养。
1.4.用于细胞培养物中分离病毒的器官材料的制备
将大约0.5cm3组织材料转移到含有一个不锈钢均浆器小球(ballet)的试管中,该均浆器小球处于1.8ml灭菌PBS中。试管搅动10分钟,直到器官材料均匀化。在室温下450g离心2分钟,使细胞碎片沉淀。上清液通过0.45μm孔无菌滤器,并保存在-70℃。使用24孔微滴定板用30μl的等分试样接种一个半长满的细胞培养物单层。
1.5.RNA分离
器官材料的RNA用RNeasy Mini试剂盒提取,而血清、血浆、细胞培养物上清和疫苗溶液的RNA用QIAamp Viral RNA Mini Kit(均为Qiagen)提取,根据制造商的推荐,每次制备分别使用大约100mg器官材料和140μl液体材料。根据制造商的推荐,最终用65μl缓冲液洗脱RNA。
1.6.病毒空斑纯化
48小时之前接种在10cm细胞培养板上的长满的单层Ma104细胞用病毒以10倍稀释度在10-1-10-4分别加以感染。细胞用病毒稀释物孵育1小时,然后除去病毒稀释物,用30ml含有5%甲基纤维素(Sigma)的Ma104培养基覆盖细胞。5-7天后挑取空斑并转移到24孔板内的Ma104单层。在大约50%CPE时从这些平板收获病毒,用于进一步的分析。
1.7.免疫荧光测定
细胞用冰冷却的丙酮∶甲醇(1∶1)在-20℃固定15分钟,之后风干。在PBS中重新水化之后,用PBS以1∶1000稀释的PRRSV特异性单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc.,USA)培养细胞1小时。用PBS清洗3次后,细胞用山羊抗鼠FITC偶联的二抗(Dianova,Hamburg,Germany)(1∶150PBS中)再培养1小时。用PBS最终再清洗3次后,细胞用甘油∶PBS溶液(1∶1)覆盖,并进行免疫荧光显微镜检查。
1.8.诊断性nRT-PCR和nsp2PCR
进行诊断性RT-nPCR以检查样品中PRRSV-EU病毒的存在;然后对阳性样品进行nsp2片段扩增。引物序列如表2所列。
诊断性RT-nPCR用Titan One Tube Kit(Roche Molecular Biochemicals)如下进行:[5μl总RNA制剂,1*RT-PCR缓冲液,0.4mM dNTPs,20pmol PLS和PLR引物,5mM二硫苏糖醇,1mM MgCl2,2.5-5U RNasin(Promega Ltd),1-2.5U酶混合物,用DEPC处理的蒸馏水调节到终体积为25μl]。循环条件如下:45℃1小时,94℃2分钟,和30次循环94℃30秒,58℃45秒和68℃45秒,最后在68℃延伸5分钟。巢式PCR反应用Qiagen Taq(QiagenAG)进行如下:[1μl RT-PCR产物,1*PCR缓冲液,10μl Q-溶液,3.5mM MgCl2,0.3mM dNTPs,20pmol每种EU-7-n-s和EU-7-n-as引物,2.5UTaq聚合酶,用蒸馏水调节到终体积为50μl]。循环条件如下:7次循环94℃1分钟,58℃1分钟和72℃1分钟,随后30次循环94℃1分钟,70℃1.5分钟(无退火步骤),最后在70℃延伸5分钟。
然后用Qiagen One Step RT-PCR Kit(Qiagen)采用一步反转录PCR对阳性样品进行nsp2片段扩增,引物为EU-1a-2058-s和EU-1a-2683-as,如下进行:[2μl RNA制剂,5μl RT-PCR缓冲液,5μl Q-溶液,0.4mM dNTPs,20pmol每种引物,2.5-5U RNasin(Promega),1μl One Step酶混合物,用DEPC处理的蒸馏水调节到终体积为25μl]。循环条件如下:50℃1小时,95℃15分钟和40次循环94℃60秒,60℃5秒,50℃5秒和72℃2分钟,最后在72℃延伸10分钟。
巢式PCR反应用Taq聚合酶(Qiagen)和引物对EU-1a-2061-s+EU-1a-2574-as如下进行:[1μl RT-PCR产物,1*PCR缓冲液,10μl Q-溶液,3.5mM MgCl2,0.6mM dNTPs,20pmol每种引物,2.5U Taq聚合酶,用蒸馏水调节到终体积为50μl]。循环条件如下:8次循环94℃1分钟,60℃5秒,50℃5秒和68℃45秒,随后50次循环94℃1分钟和70℃1分钟(无退火步骤),最后在70℃延伸5分钟。巢式PCR引物用M13标签延长,以便于对PCR产物进行直接核苷酸测序。
1.9.核苷酸测序
对巢式PCR产物进行核苷酸测序,该产物用包含M13标签的的引物直接从PCR反应或从PCR产物中产生,该产物已从琼脂糖凝胶切离且用JETsorb凝胶提取试剂盒(Genomed)纯化。使用自动测序器LI-COR DNAAnalyzer GENE READIR(LI-COR Inc.,Lincoln,Nebraska,USA)进行测序。核苷酸序列和推出的氨基酸序列用vsl.1(LI-COR Inc.,Lincoln,Nebraska,USA)和2.6软件包(Hitachi Software GeneticSystems Inc.,San Francisco,USA)分析。
2.结果
用20ml灭菌PBS复原含有10倍剂量冻干PRRS修饰活体疫苗的小瓶。从该溶液制备RNA,并根据所述通过RT-nPCR扩增nsp2片段。相同实验中扩增来自另一种已知核苷酸序列的欧洲Lelystad类PRRSV病毒株的RNA,作为阳性对照。该片段的扩增产物预期为569bp,并为对照病毒株获得。然而,PRRS样品不产生这种产物。相反,它在常规2%琼脂糖凝胶中显示双带,一条带在大约430bp,另一条在大约350bp(见图1)。
从凝胶中分别纯化这两条带,然后进行核苷酸测序。显然,与Lelystad病毒的核苷酸序列相比,两条PCR产物均具有缺失;然而,所得的序列有些模糊,不能确定确切的缺失范围。因此我们决定对疫苗进行空斑纯化,以排除该模糊是由于非同质疫苗株造成的可能。
再次,用20ml灭菌PBS复原含有10倍剂量冻干PRRS疫苗的小瓶。在不同的稀释度下用长满的Ma104单层培养复原的疫苗溶液,如材料和方法中所述,然后用含有甲基纤维素的培养基加以覆盖。培养5-7天后挑取空斑,在24孔板中用Ma104培育,直到它们显示大约50%的CPE。然后收获细胞培养物上清液,并保存在-70℃。
对总共47个空斑进行进一步的考察。为此,从24孔板上的第一代上清液制备RNA,用于RT-nPCR扩增nsp2片段。在2%琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物。表3对结果进行了总结。除了可能由于空斑重叠导致的混合群体外,发现了4个特殊的群体(大小范围分别是大约569bp,434bp,416bp和347bp)。一些代表性空斑的PCR产物如图2所示。
随后,通过对nsp2RT-nPCR产物进行直接测序,确定每个组中一个代表性空斑的核苷酸序列,获得了如下的结果:空斑no.36:nsp2中无缺失;空斑no.27:缺失了135nt;空斑no.31:缺失了153nt;和空斑no.45:缺失了222nt。这些空斑的核苷酸序列如图3所示。
生殖参数
一旦分娩,在妊娠90天时用PRRS疫苗接种过的母猪7062和6677显示出中等到严重的生殖障碍(见表4)。在7062产仔中,死产和弱产动物的比例为62.5%,在6677产仔中为44.4%。此外,直到分娩后5天,母猪7062的4只活产小猪和母猪6677的全部弱产小猪死亡。表5列出了临床观察结果。总之,分娩5天后,两窝幼仔中,只有29.4%的(5只)小猪还存活。
组2的6只母猪在用PRRS野外病毒分离物92045感染后分娩。分别有25.3%和26.4%的小猪死产或干尸化。在活产的42只小猪中,24只(27.6%)小猪弱产,只有18只小猪(20.7%)正常出生。与在妊娠94(+/-3)天时用PRRS接种的母猪的产仔相似,只有29.9%的出生的小猪存活。
与组2相似地用IngelvacMLV接种并进行攻击感染的母猪,分娩出72.9%的正常健康小猪。分别有16.7%和6.2%的小猪死产或干尸化。尽管母猪6930到第28天失去了全部小猪,但是在其它窝的幼仔中只有2只小猪在此期间死亡。因此,用IngelvacMLV接种并用高致病性PRRS野外病毒分离物92405进行攻击感染的猪中,有60.4%一直存活到第28日龄。
临床样品的病毒学检验
检验母猪和小猪的血清以及组1小猪的肺组织和体液,看是否存在PRRSV。对PCR阳性样品进行开放阅读框5和7以及nsp2片段的核苷酸测序。表6列出了PCR所得的结果和病毒分离物。
在患有生殖障碍的两种母猪6677和7061中,每个PCR阳性样品的ORF5和7序列显示与PRRS相同,表明在这些动物体内不能检测到其他的PRRSV病毒株。尽管来自母猪7062的所有死产小猪体内均发现了PRRSV,但是只有一只来自母猪6677的死产小猪反应呈阳性(50%)。母猪7062的所有弱产小猪以及母猪6677的67%弱产小猪和50%健康正常出生小猪产生了阳性PCR结果,通过序列分析证实为PRRS,甚至在初乳摄取之前获得的样品中亦是如此。因此,17只小猪中只有4只(23.5%)发现是PRRS阴性。对于nsp2片段,每个样品均显示在大约347bp有一个强带,其相应于从PRRS疫苗中可能扩增出的nsp2片段的最短变体(图4)。大多数样品在大约434bp还有一条非常弱的带;只有小猪7062/4310具有强的双带。
对于不同的诊断,对器官材料以及血清进行检查,鉴定PRRSV US基因型,以及PPV,BVD,CSFV,BDV,PrV,PCV2,SIV,PEV/PTV,swParamyxo V,EMCV,swHEV,及钩端螺旋体属某些种(Leptospira spp.),Chlamydophila某些种和衣原体属某些种(Chlamydia spp.)。所有这些检查均产生阴性结果。
在Ma104和猪肺泡巨噬细胞上的病毒分离
以来自每只母猪的5只小猪的肺材料作为对象,尝试在Ma104细胞和猪肺泡巨噬细胞的病毒分离,从每只母猪选择2只死产和3只活产小猪(见表6)。使用30μl匀浆化且灭菌过滤的器官悬液等分样品分别接种一孔Ma104细胞和PAM细胞。细胞在37℃和5%CO2下培养5天,然后在免疫荧光测定中用PRRSV特异的单克隆抗体SDOW17染色。10个器官悬液中,有4个在Ma104和PAM细胞上均产生了细胞病变效果和阳性染色结果。剩余的6个样品在两种细胞类型上均产生了阴性结果。
从每个阳性样品,从PAM和Ma104细胞各自的细胞培养物上清液制备RNA。对RNA进行ORF5和7以及nsp2片段的RT-nPCR。ORF 5和7的PCR产物的核苷酸测序证实该病毒是PRRS。nsp2PCR产物清楚地产生了最大缺失222个核苷酸的PRRS序列。
从这些实验可以得出结论,由空斑45代表的并且以ECACC04102701保藏的变体较有可能导致所观察到的经胎盘感染和生殖性能减退。
a)来自用Porcilis PRRS进行疫苗接种的农场的样品
对定期用PRRS接种的6周龄小猪的PRRSV野外病毒阴性畜群进行PRRSV-EU的考察。从4,7,9.5和13.5周龄的小猪分别获取10个样品。在9.5周组中,3只小猪患有断奶多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome)(PMWS),其通常与猪环病毒2和PRRS共感染有关(Ellis等人,Vet Microbiol 2004,98:159-163)。在接种之前、接种后1、3.5和7.5周时从1/10,7/10,9/10和7/10的动物中获得了PRRSV-EU特异性RT-nPCR产物。在对PRRSV阳性样品的nsp2编码区进行RT-PCR扩增时,只获得了PRRS的典型PCR产物:8个样品只产生~347bp产物,4个样品只产生~434bp产物,4个样品产生了434和347bp双带。没有样品给出Lelystad类的产物(见图5)。在四只PMWS患病小猪中有三只可以扩增nsp2区,其中2只显示434bp产物,一只显示347bp产物。
b)常规诊断野外样品中的Nsp2长度变化
对总共514份送来诊断的来自PRRS疑似畜群并且在常规RT-nPCR中为PRRSV阳性的血液和组织样品进行nsp2片段扩增。514份样品中有41.4%获得了扩增产物。在30.7%的分析样品中发现了不同长度的缺失,表明野外中有总频率至少为12.7%的nsp2缺失变体。在大多数实例中,发现条带显示出与PRRS疫苗相同的形式,由434和416bp(双)带组成,它们在常规2%琼脂糖凝胶上难以区分,或者由347bp带组成。因此,对所选样品进行核苷酸测序,以检查是否这些PCR产物实际上源自于PRRS疫苗病毒。结果如图6A-C所示。
表1:研究组和处理
n-母猪数目;i.m.肌内;i.n.鼻内
表2:用于生成nsp2 RT-PCR产物的引物序列
名称 | 序列 | 目的 |
PLS | ATGGCCAGCCAGTCAATC | RT-PCRORF7 |
PLR | TCGCCCTAATTGAATAGGTG | RT-PCRORF7 |
EU-7-n-s | TGTAAAACGACGGCCAGTATGATAAAGTCCCA GCGCCAG | nPCR ORF7 |
EU-7-n-as | CAGGAAACAGCTATGACCCTGTATGAGCAACC GGCAGCAT | nPCR ORF7 |
EU-1a-2058-s | TGTTGAAGGATTGTCCGAGCTCC | RT-PCRORF1a |
EU-1a-2683-as | AGATCCAAAGGCGAACTGCTG | RT-PCRORF1a |
EU-1a-2061-s | TGTAAAACGACGGCCAGTTGAAGGATTGTCCG AGCTCC | nPCRORF1a |
EU-1a-2574-as | CAGGAAACAGCTATGACCATCAGAACCTGGGT TGTCGG | nPCRORF1a |
对于巢式PCR引物,M13标签用斜体标注,而引物的PRRSV特异序列被下划线标注。
表3:在Ma104细胞培养物中传代1次后,47个空斑的nsp2PCR结果
PCR产物长度 | ∑空斑 | 空斑编号 |
~569bp | 2 | 36,58 |
~434bp | 10 | 24,27,32,43,46,49,53,55,57,59 |
~416bp | 1 | 31 |
~347bp | 20 | 8,9,10,11,12,13,25,26,28,33,37,38,40,42,44,45,47,51,54,56 |
混合 | 14 | 1,2,4,5,6,7,15,16,18,30,34,35,41,48,19,50,52 |
W=虚弱,Dep=抑郁,A=厌食
1小猪4305在第1天由于采血意外死亡.
2小猪4307和4308由于无乳死亡
3小猪4310显示严重的肺炎迹象
母猪/小猪ID | 材料 | PRRSV-EU(PCR) | 测序证实的PorcilisPRRS* | PAMs上PorcilisPRRS MLV的重分离物** | Ma104上Porcilis PRRSMLV的重分离物** |
6677 | 血清,0天 | 阴性 | nd. | nd. | nd. |
血清,7天 | 阳性 | 是 | nd. | nd. | |
血清,14天 | 阳性 | 是 | nd. | nd. | |
血清,分娩日 | 阳性 | 是 | nd. | nd. | |
7062 | 血清,0天 | 阴性 | nd. | nd. | nd. |
血清,7天 | 阳性 | 是 | nd. | nd. | |
血清,14天 | 阳性 | 是 | nd. | nd. | |
血清,分娩日 | 阳性 | 是 | nd. | nd. | |
6677/1 | 肺组织 | 阴性 | nd. | 阴性 | 阴性 |
6677/2 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阴性 | 阴性 |
6677/4300 | 肺组织 | 阳性 | 是 | nd. | nd. |
6677/4301 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阳性 | 阳性 |
6677/4302 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阴性 | 阴性 |
6677/4303 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阳性 | 阳性 |
6677/4304 | 肺组织 | 阴性 | nd. | nd. | nd. |
6677/4305 | 肺组织 | 阴性 | nd. | nd. | nd. |
6677/4306 | 肺组织 | 阴性 | nd. | nd. | nd. |
7062/1 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阴性 | 阴性 |
7062/2 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阴性 | 阴性 |
7062/3 | 肺组织 | 阳性 | 是 | nd. | nd. |
7062/4 | 肺组织 | 阳性 | 是 | nd. | nd. |
7062/4307 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阳性 | 阳性 |
7062/4308 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阳性 | 阳性 |
7062/4309 | 肺组织 | 阳性 | 是 | 阴性 | 阴性 |
7062/4310 | 肺组织 | 阳性 | 是 | nd. | nd. |
nd:未做
*:进行了常规诊断PCR的PCR片段被测序
表7:显示nsp2缺失PCR产物的样品的历史;参考图6A
表8:显示nsp2缺失PCR产物的样品的历史;参考图6B
表9:显示nsp2缺失PCR产物的样品历史;参考图6C
Claims (12)
1.抗猪生殖与呼吸综合征(PRRS)的疫苗,包括活体PRRS病毒,其特征在于,它包含一种或多种PRRS病毒株或者前述一种或多种病毒株的后代,该病毒株于2004年10月27日保存在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,Great Britain,登录号为ECACC 04102703,ECACC 04102702和ECACC 04102704,任选地与药物可接受的载体一起,但不包括以登录号ECACC 04102701保存的病毒株。
2.权利要求1的疫苗,包括以登录号ECACC 04102703,ECACC04102702,和ECACC 04102704保存的PRRS病毒株。
3.权利要求1或权利要求2的疫苗,进一步含有佐剂。
4.权利要求3的疫苗,其中佐剂是α-生育酚乙酸酯。
5.权利要求1-4中任一项的疫苗,其包含所述病毒的冻干组合物。
6.PRRS病毒株,其是于2004年10月27日保存在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 0JG,Great Britain,登录号为ECACC 04102703,ECACC 04102702和ECACC 04102704的PRRS病毒株中的任一个,或是任意一个前述病毒株的后代。
7.制造疫苗的方法,包括将根据权利要求6的一种或多种PRRS病毒株与药物可接受的载体混合。
8.根据权利要求6的PRRS病毒用于制造疫苗的用途。
9.疫苗产品,包括在不同容器中的根据权利要求5的冻干组合物和用于复原的溶剂,并且任选进一步包括含有使用说明的册页或标签。
10.权利要求9的疫苗产品,其中溶剂含有佐剂。
11.对猪进行疫苗接种的方法,包括向猪给予根据权利要求1-5,7,9或10中任一项的疫苗或疫苗产品。
12.根据前述权利要求任一项的疫苗,其特征在于,它包含至少一种具有抗非PRRS的猪疾病活性的其它抗原。
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