KR20070028547A - 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정 - Google Patents

바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정 Download PDF

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KR20070028547A
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Abstract

본 발명은 항-바이러스 항체의 존재 또는 부재에 대해 개체를 분석하는 것과 관련된 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 어떠한 개체 (예컨대, 어린 돼지와 같은 돼지 종의 일 구성원)가 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 방법 및 재료를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 특정 개체가 백신 버전의 바이러스를 투여받았는지, 천연 버전의 바이러스에 감염되었는지, 아니면 바이러스에 노출된 적이 없는지를 결정하는데 사용될 수 있는 방법 및 재료를 제공한다.
천연 버전의 바이러스, 백신 버전 바이러스, PRRS 바이러스, 돼지

Description

바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정{IDENTIFYING VIRALLY INFECTED AND VACCINATED ORGANISMS}
본 발명은 바이러스에 감염되거나 백신접종된 생물 (예컨대, 척추동물 및 포유류)의 동정과 관련된 방법 및 재료에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 바이러스, 예컨대 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스에 대한 항체를 갖는 포유류 (예를 들어, 돼지)를 동정하는 방법 및 재료에 관한 것이다.
바이러스에 감염된 생물은 감염 바이러스에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 면역 반응은 그 바이러스에 결합하는 항체의 생산을 포함할 수 있다. 바이러스에 대한 항체의 존재는 그 개체가 그 바이러스에 노출되었음을 의미할 수 있다. 예를 들어, PRRS 바이러스에 감염된 돼지는 PRRS 바이러스에 결합하는 돼지 항체를 포함할 수 있다.
PRRS는 암돼지에게 번식 장애 (예컨대, 암돼지의 후기 유산 및 사산) 및 새끼돼지에게 호흡기 장애 (예컨대, 자돈의 간질성 폐렴)를 일으키는 것을 특징으로 하는, 돼지의 바이러스 질병이다 (Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992) 및 Wensvoort et al., Vet Q., 13:121-130 (1991)). 이 바이러스는 1987년에 북아메리가에서 발견되었고 (Keffaber, Am. Assoc. Swine Pract. Newsl., 1:1-9 (1989) 및 Hill, Overview and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility and Respiratory syndrome). In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6, Denver CO, pp. 29-30. Livestock Conservation Institute, Madison, WI (1990)), 유럽에서는 1990년에 발견되었다 (Paton et al., Vet Rec., 128:617 (1991)). 원인 물질은 작은 외피보유 (enveloped) 양성-가닥 RNA 바이러스로서, 이는 주로 감염된 돼지의 폐포 마크로파지 및 혈액에서 발견된다. 이는 말 동맥염 바이러스 (EAV; den Boon et al., J. Virol., 65:2910-2920 (1991)), 마우스의 락테이트 디히드로게나제 상승 바이러스 (LDV; Plagemann and Moennig, Adv. Vir. Res., 41:99-192 (1992)), 및 원숭이 출혈열 바이러스 (SHFV; Godeny et al., In Proceedings of the 9th International Congress of Virology, p 22, August 8-13, Glasgow, Scotland (1993) and Plagemann, In Fields Virology, 3rd ed., pp. 1105-1120. Edited by B. N. Fields, D. M. Knipe and P. M. Howley. Philadelphia: Lippincott-Raven (1996))를 포함하는, 오더 니도바이랄(Order Nidovirales)에 속하는 (Cavanagh, Arch. Virol., 142:629-633 (1997)) 아터리비리데(Arteriviridae)의 한 구성원이다. 기타 아터리바이러스와 같이, PRRS 바이러스는 주로 마크로파지에 감염되며, 다양한 조직의 상주 마크로파지를 지속 감염시킨다 (Lawson et al., Virus Res., 51:105-113 (1997) 및 Christopher-Hennings et al., J. Vet. Diag. Invest., 7:456-464 (1995)).
개요
본 발명은 개체가 바이러스 백신 또는 바이러스 감염에 노출되었는지 여부를 결정하는, 개체의 분석과 관련된 방법 및 재료에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 어떠한 개체 (예컨대, 어린 돼지와 같은 돼지 종의 일 구성원)가 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, 돼지가 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는지 여부를 결정하면, 돼지 사육업자들은 돼지가 PRRS 바이러스에 감염될 수 있는지를 확인할 수 있다. 이로써 사육업자들은 PRRS 바이러스에 감염될 것으로 추측되는 돼지를, 감염되지 않을 것으로 생각되는 돼지로부터 분리할 수가 있다. 또한, 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하지 않는 돼지를 동정함으로써, 돼지 사육업자들은 사전 감염된 돼지를 다수 포함할 수 있는 전체 가축군이 아닌, 사전 감염되지 않은 돼지 집단에게 예방접종을 할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 특정 개체가 백신 버전의 바이러스를 투여받았는지, 천연 버전의 바이러스에 감염되었는지, 아니면 바이러스에 노출된 적이 없는지를 결정하는데 사용될 수 있는 방법 및 재료를 제공한다. 백신접종된 개체와 천연 버전의 바이러스에 감염된 개체를 구분하면, 인간의 경우에는 임상의들이, 가축의 경우에는 농부들이 그 바이러스에 대한 각 개체의 면역성의 면역학적 근원을 결정할 수 있다. 예를 들어, 다수의 돼지를 받은 농부는 그 돼지들이 PRRS 바이러스 백신을 투여받았는지, 천연 버전의 바이러스 (예컨대, PRRS 바이러스의 필드 단리물)에 감염되었는지, 아니면 각 바이러스에 대해 노출된 바가 없는지를 결정할 수 있다. 이러한 정보로, 농부들은 가축에게 백신접종을 할 필요가 있는지, 또는 감염되지 않은 임의의 돼지가 예를 들어, 천연 버전의 바이러스에 감염된 돼지로부터 감염될 위험이 있는지 여부를 결정할 수 있다.
전반적으로, 본 발명은 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 검출하는 키트를 특징으로 한다. 이 키트는 (a) NSP 2 폴리펩티드 및 ORF 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체에 대한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 항-돼지 Ig 항체를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 8개 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 폴리펩티드는 100개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 100개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 길이에 걸쳐 약 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 20개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 22의 서열과 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 20개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 22의 서열과 길이에 걸쳐 약 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 11의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 32의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스로 감염되지 않는 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 항-돼지 Ig 항체는 항-돼지 IgG 또는 IgM 항체일 수 있다. 항-돼지 Ig 항체는 염소 항-돼지 Ig 항체일 수 있다. 키트는 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 키트는 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (예컨대, 서열 36 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)를 포함할 수 있다. 키트는 PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (예컨대, 서열 32, 48, 51 또는 67의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)를 포함할 수 있다. 항-돼지 Ig 항체는 효소를 포함할 수 있다. 키트는 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 키트는 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는 대조군 샘플을 포함할 수 있다. 키트는 돼지 항-PRRS 바이러스 항체가 없는 돼지 혈청을 포함하는 대조군 샘플을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 샘플이 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는지 여부를 결정하기 위한 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 (a) NSP 2 폴리펩티드 및 ORF 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하며, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체에 대한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를, 만일 존재 한다면 샘플 내에 존재하는 항체와 폴리펩티드: 돼지 항-PRRS 바이러스 항체 복합체를 형성하는 조건하에서 샘플과 접촉시키는 것; 및 (b) 상기 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 복합체가 존재한다는 것은 샘플이 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 포함함을 나타낸다. 샘플은 돼지 혈청 샘플일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 8개 이상의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 폴리펩티드는 100개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 20개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 22의 서열과 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 11의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 32의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스로 감염되지 않는 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 상기 단계 (b)는 복합체를 항-돼지 Ig 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 항-돼지 Ig 항체는 효소를 포함할 수 있다. 상기 단계 (a)는 키트 내에서 샘플을 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함할 수 있고, 여기서 상기 키트는 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 키트는 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대, 서열 36 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드), PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예컨대, 서열 32, 48, 51 또는 67의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드), 및 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 방법은 샘플을 추가의 폴리펩티드와 접촉시켜 폴리펩티드: 돼지 항-PRRS 바이러스 항체 복합체를 형성하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 상기 추가의 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드, PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드, 또는 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 면에서, 본 발명은 동물이 백신 버전의 바이러스를 투여 받았는지, 아니면 천연 버전의 바이러스에 감염되었는지 여부를 결정하기 위한 키트를 특징으로 한다. 키트는 (a) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하는 아미노산 서열을 갖는 제1 폴리펩티드, 및 (b) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하지 않는 아미노산 서열을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 동물은 척추동물 (예컨대, 조류 또는 포유류 종)일 수 있다. 동물은 돼지 또는 인간일 수 있다. 바이러스는 PRRS 바이러스일 수 있다. 백신 버전은 약독화된 PRRS 바이러스일 수 있다. 백신 버전은 RespPRRS 백신일 수 있다. 제1 폴리펩티드는 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 C-말단 부분에 존재하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2 폴리펩티드는 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 N-말단 절반부에 존재하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 바이러스에 대한 동물의 면역학적 상태를 결정하는 방법을 특징으로 하고, 여기서 상기 면역학적 상태는 (1) 상기 동물이 백신 버전의 바이러스를 투여받았거나, (2) 상기 동물이 천연 버전의 바이러스에 감염되었거나, 또는 (3) 상기 동물이 바이러스에 대해 면역학적으로 노출된 바 없음을 의미한다. 이 방법은 (a) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드가, 만일 존재 한다면 제1 샘플 내에 존재하는 항체와 제1 폴리펩티드: 항체 복합체를 형성하는 조건하에서, 상기 동물로부터의 제1 샘플을 제1 폴리펩티드와 접촉시키는 것; (b) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하지 않는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드가, 만일 존재 한다면 제2 샘플 내에 존재하는 항체와 제2 폴리펩티드: 항체 복합체를 형성하는 조건하에서, 동물로부터의 제2 샘플을 제2 폴리펩티드와 접촉시키는 것; 및 (c) 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 또는 부재, 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재는 그 동물이 백신 버전의 바이러스를 투여받았음을 의미하며, 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재는 그 동물이 천연 버전의 바이러스에 감염되었음을 의미하며, 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재는 그 동물이 바이러스에 대해 면역학적으로 노출된 바가 없음을 의미한다. 동물은 척추동물 (예컨대, 조류 또는 포유류 종)일 수 있다. 동물은 돼지 또는 인간일 수 있다. 바이러스는 PRRS 바이러스일 수 있다. 백신 버전은 약독화된 PRRS 바이러스일 수 있다. 백신 버전은 RespPRRS 백신일 수 있다. 제1 폴리펩티드는 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 C-말단 부분에 존재하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2 폴리펩티드는 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 N-말단 절반부에 존재하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 면은 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드, 또는 20개의 아미노산 잔기 길이를 초과하는 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 갖는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 면은 PRRS 바이러스 NSP 4 폴리펩티드, 또는 20개의 아미노산 잔기 길이를 초과하는 PRRS 바이러스 NSP 4 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 갖는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 면은 PRRS 바이러스 NSP 1, NSP 2, 또는 NSP 4 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 세포는 원핵세포 (예컨대, 박테리아 세포)일 수 있다.
본 발명의 다른 면은 돼지 샘플에서 PRRS 바이러스 항체를 검출할 수 있는 검정법에서 배경 신호를 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 이 검정법은 PRRS 바이러스 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체를 돼지 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다. 이 방법은 고체 지지체를 8.0을 초과하는 pH 값 (예컨대, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 10.5 초과)에서 블로킹 용액으로 처리하는 것을 포함한다. 블로킹 용액은 우유 (예컨대, PBS 중의 탈지 건조 우유), 단백질 용액 또는 동물 혈청일 수 있다.
본 발명의 다른 면은 PRRS 바이러스 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체를 특징으로 한다. 고체 지지체는 8.0을 초과하는 pH 값 (예컨대, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 10.5 초과)에서 블로킹 용액으로 처리한다. 블로킹 용액은 우유 (예컨대, PBS 중의 탈지 건조 우유), 단백질 용액 또는 동물 혈청일 수 있다. 고체 지지체는 플라스틱 플레이트 (예컨대, 96웰 플레이트), 유리 슬라이드, 유리 또는 플라스틱 비드 등일 수 있다.
본 발명의 다른 면은, 고체 지지체에 결합된 폴리펩티드가 그 폴리펩티드에 결합하는 항체와 반응하는 능력을 증가시키기 위한 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 고체 지지체를 폴리펩티드 및 리소자임과 접촉시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스에 감염되지 않은 세포에 의해 생산되는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 항체는 항-PRRS 바이러스 폴리펩티드 항체일 수 있다. 리소자임은 계란 리소자임일 수 있다. 폴리펩티드와 리소자임은 리소자임 1 ng 당 폴리펩티드 4 ng 이상의 비율로 고체 지지체와 접촉될 수 있다. 리소자임과 폴리펩티드는 폴리펩티드 1 ng 당 리소자임 1 ng 이상의 비율로 고체 지지체와 접촉될 수 있다.
본 발명의 다른 면은 PRRS 바이러스 폴리펩티드 및 리소자임으로 처리된 고체 지지체를 특징으로 한다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 PRRS 바이러스에 감염되지 않은 세포에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 리소자임은 계란 리소자임일 수 있다. 폴리펩티드와 리소자임은 리소자임 1 ng 당 폴리펩티드 4 ng 이상의 비율로 고체 지지체와 접촉될 수 있다. 리소자임과 폴리펩티드는 폴리펩티드 1 ng 당 리소자임 1 ng 이상의 비율로 고체 지지체와 접촉될 수 있다.
다르게 정의하지 않으면, 본원에서 사용한 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 이하 기술한다. 본원에 언급된 모든 문헌, 특허출원, 특허, 및 기타 참조문헌들은 그 전체로서 본원에 참고자료로 포함된다. 모순되는 경우에는, 정의를 비롯한 본 발명의 명세서가 조절할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예들은 예시의 목적일 뿐이고 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 장점들은 이하 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 의해 명백할 것이다.
도면의 설명
도 1은 PRRS 바이러스 게놈의 모식도이다. 회색으로 나타낸 게놈 구역은 VR2332 바이러스 RNA로부터 PCR로 증폭시키고, 클로닝하고, 이. 콜라이 (E. coli) BL21(DE3RP) 세포에서 발현시켰다.
도 2는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 1 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 1) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 2)은 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 1 폴리펩티드를 코딩한다. 나타낸 아미노산 서열 (서열 3)은 시작 위치로부터 NSP 1 폴리펩티드-코딩 영역의 시작 부분의 아미노산 서열이다.
도 3은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 2 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 4) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 5)은 NSP 2 폴리펩티드를 코딩한다. 나타낸 아미노산 서열 (서열 6)은 시작 위치로부터 myc 태그-코딩 영역의 아미노산 서열이다. LEHHHHHH 서열 (서열 13)은 His 태그를 포함한다.
도 4는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 4 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 7) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 8)은 NSP 4 폴리펩티드를 코딩한다. 나타낸 아미노산 서열 (서열 9)은 myc-NSP 4-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 5는 아길런트 바이오애널라이저(Agilent bioanalyzer)를 사용하여 탐지한 리폴딩된 NSP 1 폴리펩티드의 형광 수준을 도시한 그래프이다. 정제되고 리폴딩된 NSP 1 폴리펩티드를 아길런트 2100 바이오애널라이저 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에 가하고, 프로테인 50 어세이 랩칩 키트(Protein 50 Assay LabChip kit)의 표준 프로토콜에 따라 분석하였다. 피크를 생성한 NSP 1 폴리펩티드는 46 kD (온전한 폴리펩티드), 및 각각 24 및 22 kD인 PCP1α 및 PCP1β에 해당한다.
도 6은 아길런트 바이오애널라이저를 사용하여 탐지한 리폴딩된 NSP 4 폴리펩티드의 형광 수준을 도시한 그래프이다. 정제되고 리폴딩된 NSP 4 폴리펩티드를 아길런트 2100 바이오애널라이저 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에 가하고, 프로테인 50 어세이 랩칩 키트의 표준 프로토콜에 따라 분석하였다. 단일 피크를 생성한 NSP 4 폴리펩티드는 26 kD이다.
도 7은 NSP 1 폴리펩티드 (리폴딩되지 않음), NSP 1 폴리펩티드 (리폴딩됨) 및 뉴클레오캡시드 (ORF 7) 폴리펩티드 (리폴딩됨)에 반응성인 항체에 대한 평균 역가치를 도시한 그래프이다. 항-NSP 1 또는 항-N 항체 반응의 시간 경과 실험은 PRRS 바이러스 MN30100주로 감염시키고 명시한 시간에 출혈시킨 14마리 돼지를 이용하여 실시하였다.
도 8은 NSP 4 폴리펩티드 (리폴딩되지 않음), NSP 4 폴리펩티드 (리폴딩됨) 및 뉴클레오캡시드 (ORF 7) 폴리펩티드 (리폴딩됨)에 반응성인 항체에 대한 평균 역가치를 도시한 그래프이다. 항-NSP 4 (리폴딩되지 않음) 및 항-ORF 7 항체 반응의 시간 경과 실험을 PRRS 바이러스 MN30100주로 감염시킨 14마리 돼지를 이용하여 실시하였고, 항-NSP 4 (폴딩됨) 반응은 잉겔락(Ingelac) MLV 백신으로 면역화된 돼지에서 실시하였다.
도 9는 잉겔백(Ingelvac) MLV로 면역화된 돼지에서 리폴딩된 NSP 1 및 NSP 4 폴리펩티드에 대해 반응성인 항체의 평균 역가치를 도시한 그래프이다.
도 10은 시판되는 ELISA 키트 (IDEXX 2XR 키트)를 사용하여 분석한, 샘플에 대한 샘플/양성 비 (S/P 비)를 도시한 그래프이다. Y축의 0.4에서 교차하는 수평선은 양성 결과에 대한 컷오프 (cutoff) 값을 나타낸다.
도 11은 ELISA에서 PRRS 바이러스 ORF 5의 3' 폴리펩티드 단편을 사용하여 분석한, 샘플에 대한 S/P 비를 도시한 그래프이다. Y축의 0.21에서 교차하는 수평선은 양성 결과에 대한 컷오프 (cutoff) 값을 나타낸다.
도 12는 ELISA에서 GP5-M 키메릭 폴리펩티드를 사용하여 분석한, 샘플에 대한 S/P 비를 도시한 그래프이다. Y축의 0.5에서 교차하는 수평선은 양성 결과에 대한 컷오프 (cutoff) 값을 나타낸다.
도 13은 MLV 또는 MN30100 PRRS 바이러스에 노출된 동물로부터 수득한 샘플에 대한 흡광도를 도시한 2개의 막대 그래프이다. 흡광도는 명시한 폴리펩티드를 사용하여 ELISA로 탐지하였다.
도 14는 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드의 서열 정렬을 포함한다. VR-2332 PRRS 바이러스의 NSP 2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 뉴클레오티드 3490-3495번에 위치한 천연 XhoI 제한 부위를 이용하여 말단절단함으로써, NSP 2P 폴리펩티드로 지칭하는 말단절단된 NSP 2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 생성시켰다.
도 15는 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드의 서열 정렬을 포함한다.
도 16은 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드의 서열 정렬을 포함한다.
도 17은 명시한 정제된 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 겔 사진을 포함한다.
도 18은 명시한 폴리펩티드를 포함하는 ELISA에 대한 흡광도를 도시한 그래프이다. 군은 표 6에 나타내었다.
도 19는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 2P 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 10) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 11)은 NSP 2P 폴리펩티드를 코딩한다. 제1 아미노산 서열 (서열 12)은 myc-NSP 2P-His 폴리펩티드의 myc 태그 영역의 아미노산 서열이고, 제2 아미노산 서열 (서열 13)은 myc-NSP 2P-His 폴리펩티드의 His 태그 영역의 아미노산 서열이다.
도 20은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 MN30100주의 ORF 5 5' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 14) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 15)은 ORF 5 5' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 16)은 myc-ORF 5 5'- His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 21은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 5 5' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 17) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 18)은 ORF 5 5' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 19)은 myc-ORF 5 5'- His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 22는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 5 5' 전체 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 20) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 21)은 ORF 5 전체 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 22)은 myc-ORF 5 전체-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다. 링커 아미노산 서열 (GGGGS; 서열 23)은 ORF 5 폴리펩티드의 5' 영역의 제1 및 제2 엑토도메인(ecotodomain) 사이에 위치한다.
도 23은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 5 3' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 24) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 25)은 ORF 5 3' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 26)은 myc-ORF 5 3'-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 24는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 MN30100주의 ORF 5 3' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 27) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 28)은 ORF 5 3' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 29)은 myc-ORF 5 3'-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 25는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 5+6 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 30) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 31)은 ORF 5+6 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 32)은 myc-ORF 5+6-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다. 제1 링커 아미노산 서열 (GGGGS; 서열 23)은 ORF 5 폴리펩티드의 5' 영역의 제1 및 제2 엑토도메인 사이에 위치한다. 제2 링커 아미노산 서열은 ORF 5 폴리펩티드의 5' 영역의 제2 엑토도메인과 ORF 6 폴리펩티드의 5' 영역의 제1 엑토도메인 사이에 위치한다. 제3 링커 아미노산 서열은 ORF 6 폴리펩티드의 5' 영역의 제1 및 제2 엑토도메인 사이에 위치한다.
도 26은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 7 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 34) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 35)은 ORF 7 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 36)은 myc-ORF 7-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 27은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 2HP 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 37) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 38)은 NSP 2HP 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 39)은 myc-NSP 2HP-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 28은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 2 S1 HP 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 40) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 41)은 NSP 2 S1 HP 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 42)은 myc-NSP 2 S1 HP-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 29는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 NSP 2 S2 HP 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 43) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 44)은 NSP 2 S2 HP 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 45)은 myc-NSP 2 S2 HP-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 30은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 6 5' 전체 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 46) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 47)은 ORF 6 5' 전체 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 48)은 myc-ORF 6 5' 전체-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 31은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 VR-2332주의 ORF 6 3' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 49) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 50)은 ORF 6 3' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 51)은 myc-ORF 6 3'-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 32는 MN 184, SDSU 73, 또는 EuroPRRS에 노출된 동물로부터 수득한 샘플 및 2개의 대조군에 대한 흡광도를 도시한 3개의 그래프를 포함한다. 흡광도 값은 VR-2332 폴리펩티드 (A), LV 폴리펩티드 (B), 또는 양자의 혼합물 (C)의 ELISA를 이용하여 탐지하였다.
도 33A는 NSP 2 폴리펩티드의 카이트-두리틀(Kyte-Doolittle) 수친화성(hydrophilicity) 프로파일을 포함한다. 도 33B는 NSP 2 및 NSP 2 단편의 모식도이다. 아미노산 번호는 VR-2332 orf 1 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00001
등록번호 U87392)에 따른 것이다. 시스테인 프로테아제 촉매활성 위치 및 소수성 도메인을 표지화하였다.
도 34는 명시한 바와 같이 처리한 동물로부터 수득한 샘플에 대한 흡광도를 도시한 2개의 그래프를 포함한다. 흡광도 값은 NSP 2 HP (ATP) 폴리펩티드 (A) 또는 NSP 2P (VR- 2332) 폴리펩티드 (B)의 ELISA를 이용하여 탐지하였다.
도 35는 명시한 바와 같이 희석하고, 명시한 양의 폴리펩티드를 포함하는 웰에 대하여 평가한 양성 및 음성 샘플에 대한 흡광도를 도시한 2개의 3D 그래프를 포함한다. 블로킹 단계 동안의 pH는 7.4 (A) 또는 9.6 (B)이다.
도 36은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 렐리스타드(Lelystad) 바이러스주의 ORF 7 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 52) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 53)은 ORF 7 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 54)은 myc-ORF 7-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 37은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 렐리스타드 바이러스주의 NSP 2P 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 55) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 56)은 NSP 2P 폴리펩티드를 코딩한다. 나타낸 아미노산 서열은 시작 위치로부터 NSP 2P 폴리펩티드-코딩 영역 (서열 3)의 시작까지, 및 NSP 2P 폴리펩티드-코딩 영역 종료 위치로부터 His 태그 (서열 13)까지의 아미노산 서열이다.
도 38은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 JA 142 바이러스주의 NSP 2P 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 57) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 58)은 NSP 2P 폴리펩티드를 코딩한다. 나타낸 아미노산 서열은 시작 위치로부터 NSP 2P 폴리펩티드-코딩 영역 (서열 3)의 시작까지, 및 NSP 2P 폴리펩티드-코딩 영역 종료 위치로부터 His 태그 (서열 13)까지의 아미노산 서열이다.
도 39는 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 베링거 잉겔하임 잉겔백(Boehringer Ingelheim Ingelvac) ATP 바이러스주의 NSP 2HP 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 59) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 60)은 NSP 2HP 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 61)은 myc-NSP 2HP-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 40은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 렐리스타드 바이러스주의 ORF 5 3' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 62) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 63)은 ORF 5 3' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 64)은 myc-ORF 5 3'-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 41은 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 렐리스타드 바이러스주의 ORF 6 3' 폴리펩티드인, pET 24b myc-폴리펩티드-His 제작물의 핵산 서열 (서열 65) 목록이다. 밑줄친 핵산 서열 (서열 66)은 ORF 6 3' 폴리펩티드를 코딩한다. 아미노산 서열 (서열 67)은 myc-ORF 6 3'-His 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 42는 리폴딩된 myc-ORF 7-His 폴리펩티드 100 ng에 가한 달걀 리소자임 양에 대한 흡광도를 도시한 그래프이다. 수치는 음성 혈청 배경을 뺀 뒤의 특이적 항-ORF 7 폴리펩티드 평균값이다. 데이터의 점은 1/300 (마름모), 1/600 (사각형), 1/1200 (삼각형) 및 1/2400 (x표)로 희석한 혈청으로부터 얻은 것이다.
도 43은 명시한 ELISA를 이용하여 동물에서 탐지한 흡광도 변화를 도시한 그래프이다. VR은 VR2332주의 폴리펩티드를 나타낸다. LV는 렐리스타드 바이러스의 폴리펩티드를 나타낸다. 오차의 표준 편차는 직선 회귀법에 의하여 결정한 방정식에 대한 데이터의 일치도(goodness-of-fit) 측정값이다.
도 44는 명시한 폴리펩티드를 포함하는 ELISA를 이용하여 명시한 PRRS 바이러스를 접종한 샘플에서 관찰한 흡광도를 도시한 그래프를 포함한다.
상세한 설명
본 명세서는 생물이 예를 들어, 바이러스 백신접종 (예컨대, 재조합 바이러스 폴리펩티드 백신 또는 약독화된 바이러스 백신으로 백신접종) 또는 바이러스 감염을 통해, 바이러스 항원에 노출되었는지 여부를 결정하기 위한 생물 평가 방법 및 관련 물질을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 상기 폴리펩티드의 제조 방법, 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 상기 숙주 세포의 제조 방법, 항-PRRS 바이러스 항체의 탐지용 키트, 항-PRRS 바이러스 항체의 탐지 방법, 바이러스에 대한 생물의 면역 상태 평가용 키트, 및 생물의 면역 상태의 평가 방법을 제공한다.
폴리펩티드
하나의 실시양태에서, 본 명세서는 생물 (예컨대, 돼지)의 샘플에 존재하는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 제공한다. 항-PRRS 바이러스 항체는 임의의 종류의 항-PRRS 바이러스 항체일 수 있다. 예를 들어, 항-PRRS 바이러스 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 항체일 수 있다. 이러한 항체는 생물이 PRRS 바이러스 폴리펩티드, 약독화된 PRRS 바이러스 백신 또는 병원성 PRRS 바이러스와 같은 PRRS 바이러스 항원에 노출되었을 때, 상기 생물 내에서 생성될 수 있다. 또한, 항-PRRS 바이러스 항체는 VR-2332 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00002
등록번호 PRU87392; 미국특허 5,846,805 및 5,683,865), MN30100 PRRS 바이러스 (Bierk et al., Vet. Rec, 148:687-690 (2001)), 약독화된 PRRS 바이러스, 예컨대, RespPRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00003
등록번호 AF066183), 16244B PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00004
등록번호 AF046869), PA8 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00005
등록번호 AF 176348), SP PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00006
등록번호 AF184212), NVSL 97-7985 IA 1-4-2 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00007
등록번호 AF325691), P129 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00008
등록번호 AF494042), CH-1a PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00009
등록번호 AY032626), JA142 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00010
등록번호 AY424271), NVSL 97-7895 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00011
등록번호 AY545985) 또는 PL97-1 PRRS 바이러스 (GenBank
Figure 112007004855238-PCT00012
등록번호 AY585241)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 종류의 PRRS 바이러스에 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 항-PRRS 바이러스 항체는 북아메리가, 유럽 또는 기타 지역 (예컨대, 중국)으로부터의 PRRS 바이러스 단리체 및 천연 버전을 포함하나, 이에 한정되지 않는 필드 단리물 또는 천연 버전의 PRRS 바이러스에 결합하는 항체일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 PRRS 바이러스에 감염되기 쉬운 생물의 샘플에 존재하는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있다. 이러한 생물로는 돼지 종, 예컨대 가축용 돼지, 야생 돼지 및 맷돼지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 경우, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 PRRS 바이러스에 쉽게 감염되지 않는 생물의 샘플에 존재하는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 예를 들어, PRRS 바이러스 폴리펩티드, 약독화된 PRRS 바이러스 백신 또는 병원성 PRRS 바이러스 접종을 통해, PRRS 바이러스 항원에 노출된 토끼 또는 마우스의 샘플에 존재하는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있다. 토끼 또는 마우스에서 항-PRRS 바이러스 항체를 제조할 때, 토끼 또는 마우스 혈청 샘플 내의 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는 것은 과학자들이 항-PRRS 바이러스 항체를 생산하는 토끼 또는 마우스를 확인하는 것을 도울 수 있다.
임의의 샘플을 생물로부터 수득하여, 항-PRRS 바이러스 항체의 존재 또는 부재에 대하여 평가할 수 있다. 이러한 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플 및 조직 샘플 (예컨대, 림프 조직, 근육 조직 및 피부 조직)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 혈액 샘플을 돼지로부터 수득하여, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체의 존재 또는 부재에 대하여 평가할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 임의의 길이 (예컨대, 아미노산 잔기 8 내지 2500개)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 길이는 아미노산 잔기 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 초과, 또는 그 이상일 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 아미노산 잔기 25 내지 800개 사이, 아미노산 잔기 50 내지 800개 사이, 아미노산 잔기 50 내지 450개 사이, 아미노산 잔기 50 내지 400개 사이, 아미노산 잔기 50 내지 300개 사이, 아미노산 잔기 100 내지 400개 사이, 또는 아미노산 잔기 100 내지 300개 사이일 수 있다.
폴리펩티드는 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 폴리펩티드 (예컨대, NSP 1, NSP 2, NSP 3, NSP 4, NSP 5, NSP 6, pol, C/H, HEL, CORONA, ORF 2, ORF 2b, ORF 3, ORF 4, ORF 5, ORF 6 또는 ORF 7 폴리펩티드)에 존재하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 GenBank 등록번호 PRU87392에 제시된 서열의 뉴클레오티드 1339 내지 3495번에 의하여 코딩되는 영역과 같은 소수성 영역이 결핍된 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 ORF 5 또는 ORF 6 폴리펩티드의 엑토도메인일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드의 5' 말단의 제1 엑토도메인 (ORF 5 5' 엑토도메인 1), PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드의 5' 말단의 제2 엑토도메인 (ORF 5 5' 엑토도메인 2), PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드의 5' 말단의 제1 엑토도메인 (ORF 6 5' 엑토도메인 1), PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드의 5' 말단의 제2 엑토도메인 (ORF 6 5' 엑토도메인 2), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 폴리펩티드가 1개가 넘는 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상을 넘는) 엑토도메인을 포함하는 경우, 엑토도메인은 서로 인접해있거나, 링커 서열 (예컨대, GGGGS 아미노산 링커 서열)에 의하여 분리될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 태그로 통상적으로 사용되는 아미노산 서열 (예컨대, 폴리-히스티딘 태그, myc 태그, GFP 태그 및 GST 태그)을 포함하는 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드의 아미노산 50개 단편은 폴리히스티딘 태그의 아미노산 서열 (예컨대, HHHHHH, 서열 33)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 (1) 특정 길이, 및 (2) 상기 길이에 걸쳐 동정된 아미노산 서열에 대한 퍼센트 동일성을 가진다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 단리된 핵산은 상기 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나, (1) 특정 길이, 및 (2) 상기 길이에 걸쳐 동정된 아미노산 서열에 대한 퍼센트 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대표적으로, 동정된 핵산 또는 아미노산 서열은 특정 서열 식별 번호 또는 특정 GenBank 등록번호로 참조되는 서열이거나, 특정 PRRS 바이러스 핵산 또는 폴리펩티드 (예컨대, PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드)이다. 동정된 서열에 대표적으로 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열을 표적 서열이라고 지칭한다. 예를 들어, 동정된 서열은 서열 16, 19 또는 22에 제시한 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드 서열일 수 있다.
임의의 핵산 또는 아미노산 서열의 길이, 및 상기 길이에 걸친 퍼센트 동일성은 다음과 같이 결정한다. 먼저, BLASTN 버전 2.0.14 및 BLASTP 버전 2.0.14을 포함하는 BLASTZ의 스탠드-얼론 (stand-alone) 버전의 BLAST 2 서열 (B12seq) 프로그램을 사용하여 특정 핵산 또는 아미노산 서열을 동정된 핵산 또는 아미노산 서열과 비교한다. 이러한 BLASTZ의 스탠드-얼론 (stand-alone 버전은 뉴욕 주립대의 올드 웨스트배리 캠퍼스 도서관 (카탈로그 번호: QH 447.M6714), 및 피셔 앤드 리처드슨 (Fish & Richardson)의 웹사이트 ("fr" dot "com/blast/") 또는 미국 연방 정부의 생물기술 정보 국립 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트 ("ncbi" dot "nlm" dot "nih" dot "gov")로부터 입수가능하다. B12seq 프로그램 사용법에 대한 지시사항은 BLASTZ에 수반된 readme 파일에서 찾을 수 있다. B12seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 2개의 서열 간 비교를 수행한다. BLASTP은 아미노산 서열을 비교하는데 사용하고, BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용한다. 2개의 핵산 서열을 비교하기 위하여, 선택 조건은 다음과 같이 설정한다: -i는 비교할 제1 핵산 서열이 들어있는 파일 (예컨대, C:＼seq1.txt)에 설정하고; -j는 비교할 제2 핵산 서열이 들어있는 파일 (예컨대, C:＼seq2.txt)에 설정하고; -p는 blastn에 설정하고; -o는 임의의 원하는 파일 이름 (예컨대, C:＼output.txt)에 설정하고; -q는 -1에 설정하고; -r은 2에 설정하고; 나머지 모든 선택 조건들은 기본 설정에 둔다. 예를 들어, 두 서열 간의 비교 결과를 포함하는 출력 파일을 생성시키기 위하여 다음과 같은 명령을 사용할 수 있다: C:＼B12seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastn -o c:＼output.txt -q -1 -r 2. 2개의 아미노산 서열을 비교하기 위하여, B12seq의 선택 조건은 다음과 같이 설정한다: -i는 비교할 제1 아미노산 서열이 들어있는 파일 (예컨대, C:＼seq1.txt)에 설정하고; -j는 비교할 제2 아미노산 서열이 들어있는 파일 (예컨대, C:＼seq2.txt)에 설정하고; -p는 blastp에 설정하고; -o는 임의의 원하는 파일 이름 (예컨대, C:＼output.txt)에 설정하고; 나머지 모든 선택 조건들은 기본 설정에 둔다. 예를 들어, 두 아미노산 서열 간의 비교 결과를 포함하는 출력 파일을 생성시키기 위하여 다음과 같은 명령을 사용할 수 있다: C:＼B12seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt. 표적 서열이 동정된 서열의 임의의 부분과 상동 구간을 공유한다면, 지정된 출력 파일은 상기 상동 구간을 정렬된 서열로 나타낼 것이다. 표적 서열이 임의의 부분과 상동 구간을 공유하지 않는다면, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열을 나타내지 않을 것이다.
일단 정렬되면, 임의의 일치하는 위치에서 시작하고 임의의 다른 일치하는 위치에서 종료하는, 동정된 서열로부터의 서열과 표적 서열의 정렬에 존재하는, 표적 서열의 상존성(consecutive) 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 수를 계수하여 길이를 결정한다. 일치하는 위치는 표적 및 동정된 서열 양쪽 모두에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 존재하는 임의의 위치이다. 표적 서열에 존재하는 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 아니므로 계수하지 않는다. 마찬가지로, 동정된 서열에 존재하는 갭은, 동정된 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 아니라 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 계수하므로, 계수하지 않는다.
결정된 길이에 걸친 퍼센트 동일성은 길이 전체에 걸쳐 일치하는 위치의 수를 계수하고, 상기 수를 길이로 나눈 뒤, 결과 값에 100을 곱하여 결정한다. 예를 들어, (1) 1000개 뉴클레오티드 표적 서열을 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드 서열과 비교하고, (2) B12seq 프로그램이 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드 서열의 영역과 정렬된 표적 서열로부터, 뉴클레오티드 영역의 첫번째와 마지막 뉴클레오티드가 일치하는 200개의 뉴클레오티드를 제시하였으며, (3) 200개의 정렬된 뉴클레오티드에 걸친 일치 수는 180인 경우, 1000개 뉴클레오티드 표적 서열은 200의 길이를 가지며, 길이에 걸쳐 90 퍼센트 동일성을 가진다 (즉, 180/200 * 100 = 90).
동정된 서열과 정렬된 단일 핵산 또는 아미노산 표적 서열은 각각 고유의 퍼센트 동일성을 나타내는 많은 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 동정된 서열과 정렬된 20개 뉴클레오티드 영역을 포함하는 다음과 같은 표적 서열은 하기 표 A에 열거한 것을 포함하는 많은 상이한 길이를 가진다.
Figure 112007004855238-PCT00013
Figure 112007004855238-PCT00014
퍼센트 동일성 값은 반올림한다는 것을 주목하여야 한다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13 및 78.14은 78.1로 내리고, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 및 78.19는 78.2로 올린다. 길이 값은 항상 정수인 것도 주목하여야 한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 예컨대, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 또는 그 이상의 아미노산 잔기 길이에 걸쳐, 서열 9, 16, 19, 22, 26, 29, 32, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 61, 64 또는 67에 제시한 서열과 약 70% 이상 (예컨대, 약 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 실질적으로 순수할 수 있다. 본 명세서에서 폴리펩티드와 관련하여 "실질적으로 순수함"이란, 폴리펩티드가 천연적으로 결합되는 다른 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 및 핵산을 실질적으로 포함하지 않는다는 의미이다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 천연적 환경으로부터 분리된 임의의 폴리펩티드이고, 순도 60% 이상이다. 본 명세서에서 폴리펩티드와 관련하여 "실질적으로 순수함"은 또한 화학적 합성된 폴리펩티드도 포함한다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 순도 약 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상일 수 있다. 대표적으로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 비-환원 폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일의 주 밴드를 나타낼 것이다.
폴리펩티드 또는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수득하기 위하여, 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, HPLC 및 폴리펩티드 합성 기술과 같은 통상의 폴리펩티드 정제 기술을 사용할 수 있다. 또한, 임의의 물질을 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수득하기 위한 공급원으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수득하기 위하여 특정 대상 폴리펩티드를 과발현하도록 조작한 배양된 세포를 사용할 수 있다. 이러한 세포는 원핵 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 세포와 같은 박테리아 세포) 또는 진핵 세포 (예컨대, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포)일 수 있다. 폴리펩티드는 친화성 매트릭스 상에 폴리펩티드가 포획되도록 하는 아미노산 서열을 함유하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, c-myc, 헤마글루티닌, 폴리-히스티딘 또는 플래그 (Flag TM) 태그 (코닥)이 폴리펩티드 정제를 보조하는데 사용될 수 있다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하는 폴리펩티드 내에 어디에나 삽입될 수 있다. 유용할 수 있는 다른 융합은 폴리펩티드 탐지를 돕는 효소, 예컨대 알칼라인 포스파타제를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드는 추가의 성분을 함유하는 폴리펩티드 조성물로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드와 조합하여, 1종 이상의 상이한 폴리펩티드 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 이상의 상이한 폴리펩티드)를 함유하는 조성물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드 및 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드 1종 또는 그 이상을 함유하는 조성물은 1종 또는 그 이상의 담체, 예컨대 용매, 현탁제 또는 임의의 다른 비히클을 함유할 수 있다. 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 원하는 부피, 콘시스턴시 및 기타 적절한 수송 또는 화학적 특성을 제공하도록 원하는 용도에 따라 선택할 수 있다. 대표적인 담체로는 물; 염수 용액; 결합제 (예컨대, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예컨대, 락토스 및 기타 당, 젤라틴 또는 황산칼슘); 윤활제 (예컨대, 전분, 폴리에틸렌 글리콜 또는 아세트산나트륨); 붕해제 (예컨대, 전분 또는 소듐 스타치 글리콜레이트); 및 습윤제 (예컨대, 소듐 라우릴 술페이트)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
핵산
본 명세서에서 "핵산"이란, RNA, 및 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 (예컨대, 화학적 합성된) DNA를 포함하는 DNA를 포괄하는 용어이다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 (sense) 가닥 또는 안티센스 (antisense) 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 환형 또는 선형일 수 있다.
본 명세서에서 핵산과 관련하여 "단리된" 것이란, 게놈이 유래한 생물 또는 바이러스의 천연 게놈 내에 바로 인접하는 양쪽 서열(5' 말단에 하나, 3' 말단에 하나)과 바로 인접되어 있지 않은 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 핵산은 천연 게놈 내에서 재조합 DNA 분자의 바로 옆을 플랭킹하는 것으로 통상 발견되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 존재하지 않는, 임의의 길이의 재조합 DNA 분자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 단리된 핵산은 백터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 허피스 바이러스), 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA 내로 혼입된 재조합 DNA 뿐만 아니라, 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자로 존재하는 재조합 DNA (예컨대, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의하여 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단리된 핵산은 혼성화 또는 융합 핵산 서열의 일부인 재조합 DNA 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 핵산에 관련하여 "단리된" 것이란 또한 임의의 비-천연 핵산을 포함하는데, 이는 비-천연 핵산 서열은 천연적으로 발견되지 않고, 천연 게놈 내에 존재하는 바로 인접한 서열을 가지지 않기 때문이다. 예를 들어, 비-천연 핵산, 예컨대, 조작된 핵산은 단리된 핵산으로 간주한다. 조작된 핵산은 통상의 분자적 클로닝 또는 화학적 핵산 합성 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 단리된 비-천연 핵산은 다른 서열과 독립적으로 존재하거나, 또는 백터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 허피스 바이러스) 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포의 게놈 DNA 내에 혼입될 수 있다. 또한, 비-천연 핵산은 혼성화 또는 융합 핵산 서열의 일부인 핵산 분자를 포함할 수 있다.
예를 들어, cDNA 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한 절단물을 함유한 겔 슬라이스 내에 수백 내지 수백만 개의 다른 핵산 분자중에 존재하는 핵산은 단리된 핵산으로 여기지 않는다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 핵산 및 특정 세포와 관련하여 "외인성 (exogenous)"이란, 천연적으로 발견되는 것처럼 그 특정 세포에서 유래하지 않는 임의의 핵산을 지칭한다. 따라서, 모든 비-천연 핵산은 세포 내에 도입되면, 세포에 대하여 외인성인 것으로 간주된다. 비-천연 핵산은 천연적으로 발견되지만, 핵산 전체로는 천연적으로 존재하지 않는 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편을 함유할 수 있다는 사실을 주목하여야 한다. 예를 들어, 발현 벡터 내에 게놈 DNA 서열을 함유하는 핵산 분자는 비-천연 핵산이므로, 세포 내에 도입되면 세포에 대하여 외인성인데, 이는 핵산 분자 전체 (게놈 DNA와 벡터 DNA)로서는 천연적으로 존재하지 않기 때문이다. 따라서, 전체로는 천연적으로 존재하지 않는 임의의 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 허피스 바이러스)는 비-천연 핵산으로 간주한다. PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의하여 생성된 게놈 DNA 단편 및 cDNA도 천연적으로 발견되지 않는 별도의 분자로 존재하므로 비-천연 핵산으로 간주한다. 또한, 천연적으로 발견되지 않는 배열의 프로모터 서열 및 폴리펩티드-코딩 서열을 함유하는 임의의 핵산 (예컨대, cDNA 또는 게놈 DNA)은 비-천연 핵산이다.
천연 핵산은 특정 세포에 대하여 외인성일 수 있다. 예를 들어, X라는 사람의 세포로부터 단리된 전체 염색체는 Y라는 사람의 세포 내에 도입되면, Y의 세포에 대해서는 외인성 핵산이다.
단리된 핵산은 본 명세서에 제공되는 임의의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵산은 원래 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드에 존재하는 소수성 영역 (예컨대, VR-2332 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 722번)이 결핍된 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 또는 그 이상의 아미노산 잔기 길이에 걸쳐, 서열 9, 16, 19, 22, 26, 29, 32, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 61, 64 또는 67에 제시한 서열에 대하여 약 70% 이상 (예컨대, 약 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산은 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이에 걸쳐, 서열 2, 5, 8, 11, 15, 18, 21, 25, 28, 31, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 58, 60, 63 또는 66에 제시한 서열과 약 70% 이상 (예컨대, 약 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상) 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 단리된 핵산은 염기 약 5개 이상의 길이 (예컨대, 염기 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개 이상의 길이)일 수 있고, 혼성화 조건 하에서 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드 (예컨대, PRRS 바이러스 NSP 2P 폴리펩티드 또는 PRRS 바이러스 ORF 5/ORF 6 키메릭 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥과 혼성화할 수 있다. 혼성화 조건은 중등도로 또는 고도로 엄격한 혼성화 조건일 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 중등도로 엄격한 혼성화 조건이란, 약 42℃, 25 mM KPO4 (pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트(Denhart) 용액, 50 ㎍/mL 초음파 분해한 변성된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드, 10% 덱스트란 술페이트 및 1-15 ng/mL 탐침 (약 5x107 cpm/㎍)을 함유하는 혼성화 용액 중에서 혼성화를 실시하고, 약 50℃, 2X SSC 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트를 함유하는 세척 용액으로 세척을 실시하는 것을 의미한다.
고도로 엄격한 혼성화 조건이란, 약 42℃, 25 mM KPO4 (pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 50 ㎍/mL 초음파 분해한 변성된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드, 10% 덱스트란 술페이트 및 1-15 ng/mL 탐침 (약 5x107 cpm/㎍)를 함유하는 혼성화 용액 중에서 혼성화를 실시하고, 약 65℃에서 2X SSC 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트를 함유하는 세척 용액으로 세척을 실시하는 것을 의미한다.
단리된 핵산은 통상의 분자적 클로닝 및 화학적 핵산 합성 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, GenBank에서 제공되는 PRRS 바이러스 핵산 서열 (예컨대, GenBank
Figure 112007004855238-PCT00015
등록번호 PRU87392)과 유사성을 가지는 핵산 서열을 함유하는 단리된 핵산을 수득하기 위하여 PCR을 이용할 수 있다. PCR은 미국특허 4,683,195에 기재된 것과 유사한 방법으로 표적 핵산을 증폭하는 방법 또는 기술, 및 상기 문헌에 기재된 방법의 후속 변형법을 지칭한다. 일반적으로, 증폭할 잠재적인 주형의 반대 가닥 서열과 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하기 위하여 대상 영역의 말단 또는 그 상류의 서열 정보를 사용한다. PCR을 이용하여, 핵산 서열은 RNA 또는 DNA로부터 증폭될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 박테리오파지 서열, 플라스미드 서열, 바이러스 서열 등으로부터 뿐만 아니라 세포 전체 RNA, 게놈 전체 DNA 및 cDNA로부터의 PCR 증폭에 의하여 단리될 수 있다. RNA를 주형 공급원으로 사용하는 경우, 상보적 DNA 가닥을 합성하기 위하여 역전사효소를 사용할 수 있다.
또한, 핵산 및 아미노산 데이터베이스 (예컨대, GenBank®)를 이용하여 단리된 핵산을 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 일부 상동성을 가지는 임의의 핵산 서열은 GenBank®를 검색하는 검색어로 사용할 수 있다.
숙주 세포
숙주 세포는 본 명세서에 기재한 단리된 핵산을 함유하도록 설계할 수 있다. 이러한 세포는 원핵 세포 (예컨대, 이. 콜라이, 비. 섭틸리스 또는 아그로박테리움 투미파시엔스(Agrobacterium tumifaciens), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 세포와 같은 박테리아 세포) 또는 진핵 세포 (예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 종 세포 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 효모 세포와 같은 진균류 세포; 곤충 세포; 또는 포유류 세포)일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 단리된 핵산을 함유하는 세포는 폴리펩티드를 발현할 필요는 없다는 것을 주목하여야 한다. 또한, 단리된 핵산은 세포의 게놈 내에 통합되거나, 에피솜(episome) 상태로 유지될 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 안정적으로 또는 일시적으로, 본 명세서에서 제공되는 단리된 핵산을 함유하는 제작물로 형질감염될 수 있다. 대표적으로, 숙주 세포는 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 함유하고, 코딩된 폴리펩티드를 발현한다.
단리된 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위하여, 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 침전, 전기천공, 열 쇼크, 리포펙션 (lipofection), 미세주입 및 바이러스-매개 핵산 전달은 단리된 핵산 분자를 세포 내로 도입시키는데 사용할 수 있는 통상법이다.
항-PRRS 바이러스 항체의 탐지
본 명세서에 제공된 방법 및 물질은 생물 (예컨대, 돼지) 내의 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 항-PRRS 바이러스 항체는 PRRS 바이러스 폴리펩티드가 항-PRRS 바이러스 항체(샘플 내에 존재하는 경우)에 결합하여 항체-폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서, 본 명세서에서 제공되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드를 생물의 샘플과 접촉시킴으로써 탐지된다. 이러한 복합체는 예를 들어, 상기 생물의 항체에 결합하는 표지된-항체를 사용하여 탐지될 수 있다.
본 명세서에 제공되는 임의의 PRRS 바이러스 폴리펩티드는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제공된 수 종의 상이한 PRRS 바이러스 폴리펩티드는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하기 위하여 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, PRRS 바이러스 NSP 1, NSP 2, NSP 4 및 ORF 7 폴리펩티드를 함유하는 키트는 항-PRRS 바이러스 항체를 탐지하는데 사용될 수 있다.
전형적으로, PRRS 바이러스 폴리펩티드는 고체 기재, 예컨대 딥스틱(dipstick), 마이크로티터 플레이트, 입자 (예컨대, 비즈), 친화성 컬럼 및 면역블롯팅 멤브레인 상에 고정화된다. 고체 기재의 예시적 기재 및 이들의 사용 방법에 대해서는 미국특허 5,143,825; 5,374,530; 4,908,305; 및 5,498,551를 참고할 수 있다. 예를 들어, PRRS 바이러스 폴리펩티드는 고체 기재, 예컨대 96-웰 플레이트 상에 공지된 방법으로 고정화된 뒤, 샘플 내에 존재하는 항-PRRS 바이러스 항체가 고정화된 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 결합하여 항체-폴리펩티드 복합체를 형성하도록 하는 조건 하에서 돼지로부터의 샘플과 접촉될 수 있다. 적합한 조건으로는 실온에서 적절한 완충액 (예컨대, 인산나트륨 완충액, pH 7.2 내지 7.4) 중에 약 10분 이상 내지 약 10시간 (예컨대, 약 1 내지 약 2.5 시간) 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 그런 다음, 결합하지 않은 물질을 씻어내고, 항체-폴리펩티드 복합체를 탐지할 수 있다.
이러한 항체-폴리펩티드 복합체의 존재를 탐지하는 것은 PRRS 바이러스 감염의 지표일 수 있다. 항체-폴리펩티드 복합체를 탐지하기 위하여 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체-폴리펩티드 복합체에 결합 친화성을 가지는 지시 분자를 사용하여 항체-폴리펩티드 복합체를 탐지할 수 있다. 본 명세서에서, "지시 분자"란 특정 폴리펩티드, 항체 또는 항체-폴리펩티드 복합체의 존재를 육안 또는 적절한 장치로 가시화할 수 있도록 하는 임의의 분자이다. 대표적으로, 지시 분자는 샘플을 수득한 생물 (예컨대, 돼지)로부터의 항체에 결합 친화성을 가지는 항체, 예컨대, 항-돼지 IgG 항체이다. 지시 분자는 표준법에 의하여 직접 또는 간접적으로 탐지될 수 있다. 예컨대, 문헌[Current Protocols in Immunology, Chapters 2 and 8, Coligan et al., (eds.), John Wiley & Sons (1996)]을 참조할 수 있다. 직접 탐지를 위하여, 지시 분자는 방사성 동위원소, 플루오로크롬, 기타 비-방사성 표지, 또는 다른 임의의 적합한 발색단으로 표지화될 수 있다. 간접 탐지법을 위하여, 효소, 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 및 알칼라인 포스파타제(AP)를 지시 분자에 결합시킨 뒤, HRP 또는 AP에 대한 표준 검정법을 사용하여 항체-폴리펩티드 복합체의 존재를 탐지할 수 있다. 별법으로, 지시 분자를 아비딘 또는 스트렙타비딘에 결합시킨 뒤, 예를 들어, 플루오로크롬에 융합된 바이오틴을 이용하여 항체-폴리펩티드 복합체를 탐지하거나, 그 반대로 할 수 있다. 따라서, 항체-폴리펩티드 복합체에 대한 검정법은 효소 결합 면역검정법 (ELISA), 예컨대, 경쟁적 ELISA, 방사성면역검정법 (RIA), 형광 검정법, 화학발광 검정법, 면역블롯 검정법 (웨스턴 블롯팅), 미립자-기반 검정법, 및 기타 공지된 기술을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체-폴리펩티드 복합체는 용액 중에서 형성된다. 이러한 복합체는 면역침전을 통해 탐지될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 10, Section VI, Ausubel et al., (eds.), Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)]을 참조할 수 있다.
항-PRRS 바이러스 항체 검출용 키트
본원에서 제공되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드는 항-PRRS 바이러스 항체 검출용 키트를 만드는 데 사용될 수 있다. 이러한 키트는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 또는 그보다 많은 PRRS 바이러스 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 키트는 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드, PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드, PRRS 바이러스 NSP 4 폴리펩티드, PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드, PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드, PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드, 또는 이들의 조합을 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 PRRS 바이러스 NSP 2P 폴리펩티드 및 ORF 7 폴리펩티드를 함유한다.
PRRS 바이러스 폴리펩티드를 함유하는 키트는 비제한적으로 예를 들자면 포장 자료 (예컨대, 사용설명서), 지시 분자 (예컨대, 항-돼지 Ig 항체), 버퍼, 양성 대조군 샘플 (예컨대, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 함유하는 샘플), 및 음성 대조군 샘플 (예컨대, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체가 결여된 돼지 혈청을 포함하는 샘플)을 함유할 수 있다.
개체의 면역학적 상태의 검정
본원에서 제공되는 방법 및 재료를 사용하여 바이러스에 대한 생물의 면역학적 상태를 결정할 수 있다. 이러한 방법 및 재료를 사용하여 임의의 생물의 면역학적 상태를 결정할 수 있다. 예를 들어, 돼지, 개, 고양이, 새 (예컨대 병아리, 칠면조, 또는 오리), 양, 소, 말, 염소, 원숭이, 또는 인간의 면역학적 상태를 본원에서 제공된 방법 및 재료를 사용하여 결정할 수 있다. 게다가, 임의의 바이러스에 대한 생물의 면역학적 상태를 결정할 수 있다. 예를 들어, PRRS 바이러스, 써코바이러스, 인플루엔자 바이러스, 허피스 바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스, 코로나바이러스, 피코로나바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 또는 필로바이러스에 대한 생물의 면역학적 상태를 결정할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법을 사용하여 생물의 면역학적 상태가 (1) 개체가 백신 버전의 바이러스를 받았는지, (2) 개체가 천연 버전의 바이러스에 감염되었는지 또는 (3) 개체가 면역학적으로 바이러스에 대하여 노출된 바가 없는지에 해당되는지를 결정할 수 있다. 몇몇 경우에서, 본원에서 제공되는 방법 및 재료를 사용하여 면역학적 상태가 (1) 개체가 백신 버전의 바이러스를 받았거나 또는 (2) 개체가 천연 버전의 바이러스에 감염되었는지 중의 한 가지의 경우인 생물 사이를 식별할 수 있다.
일반적으로, 두개 이상의 폴리펩티드를 사용하여 생물의 면역학적 상태를 검정한다. 제1 폴리펩티드는 보존된 (예컨대, 고도로 보존되거나 또는 어떤 경우에서 완전히 보존된) 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드는 백신 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제1 폴리펩티드와 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제1 폴리펩티드와 결합하도록 하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. PRRS 바이러스에 관한 돼지의 면역학적 상태를 검정할 때, 제1 폴리펩티드는 PRRS ORF 5 폴리펩티드의 C-말단 영역과 같은 백신과 천연 버전의 PRRS 바이러스의 사이에 보존되는 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 백신과 천연버전의 PRRS 바이러스 사이에서 보존되는 다른 아미노산 서열은 표준 서열 정렬로부터 얻을 수 있다 (도 14-16).
제2 폴리펩티드는 백신 버전 바이러스와 천연 버전의 바이러스 사이에 잘 보존되지 않는 (예컨대 가변 서열) 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 제2 폴리펩티드는 백신 버전의 바이러스 내에 존재하는 서열과 유사 또는 동일한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 폴리펩티드는 백신 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제2 폴리펩티드와 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제2 폴리펩티드와 결합하지 않는 아미노산 서열을 가질 수 있다. PRRS 바이러스에 관한 돼지의 면역학적 상태를 검정할 때, 제2 폴리펩티드는 백신과 PRRS ORF 5 폴리펩티드의 N-말단 영역과 같이 천연버전의 PRRS 바이러스 사이에 가변인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 제2 폴리펩티드와 같은 아미노산 서열은 VR-2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스로부터 유래할 수 있다. 백신과 천연 버전의 PRRS 바이러스로부터 보존되지 않는 기타 아미노산 서열은 표준 서열 정렬로부터 얻을 수 있다 (도 14-16).
바이러스에 관한 생물의 면역학적 상태를 검정하기 위하여, 제1 및 제2 폴리펩티드를 제1 및 제2 폴리펩티드가 샘플 내에서 항바이러스 항체가 존재한다면 항바이러스 항체와 결합할 수 있는 조건 하에서 개체로부터의 샘플과 접촉시켜 (1) 제1 폴리펩티드-항체 복합체 또는 (2) 제1 폴리펩티드-항체 복합체 및 제2 폴리펩티드-항체 복합체 중의 어느 하나를 형성할 수 있다. 제2 폴리펩티드-항체 복합체가 아닌 제1 폴리펩티드-항체 복합체의 형성은 샘플이 천연 버전의 바이러스에 노출된 개체로부터 온 것임을 시사해줄 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드-항체 복합체 모두의 형성은 샘플이 백신 버전의 바이러스에 노출된 개체로부터 온 것임을 시사해 준다.
제1 폴리펩티드-항체 복합체 또는 제2 폴리펩티드-항체 복합체 어느 것도 검출되지 않음은 샘플이 바이러스에 노출된 바 없는 개체로부터 온 것임을 시사해준다. PRRS 바이러스에 관한 돼지의 면역학적 상태를 검정하는 경우, 제1 및 제2 폴리펩티드를 제1 및 제2 폴리펩티드가 혈액 샘플 내에 존재한다면 항-PRRS 바이러스 항체에 결합하는 조건 하에서 돼지로부터의 혈액 샘플과 접촉하여, (1) 제1 폴리펩티드-항체 복합체 또는 (2) 제1 폴리펩티드-항체 복합체 및 제2 폴리펩티드-항체 복합체 중 어느 하나를 형성할 수 있다. 제2 폴리펩티드-항체 복합체가 아닌 제1 폴리펩티드-항체 복합체의 형성은 샘플이 천연 버전의 PRRS 바이러스에 노출된 돼지로부터 온 것임을 시사해줄 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드-항체 복합체 모두의 형성은 샘플이 백신 버전의 PRRS 바이러스에 노출된 돼지로부터 온 것임을 시사해 줄 수 있다. 제1 폴리펩티드-항체 복합체 및 제2 폴리펩티드-항체 복합체 모두가 검출되지 않으면 샘플이 바이러스에 노출되지 않은 돼지로부터 온 것임을 시사해 줄 수 있다.
전형적으로, 바이러스 폴리펩티드는 고체 기재 예컨대 계량봉, 마이크로티터 플레이트, 입자 (예컨대, 비드), 친화 칼럼, 및 이뮤노블롯(immunoblot) 막에 고정될 수 있다. 고체 기재의 예시적 기재 및 이들의 사용 방법에 대하여 미국특허 5,143,825; 5,374,530; 4,908,305; 및 5,498,551를 참조한다. 예를 들어, PRRS 바이러스 폴리펩티드 (예컨대, 한 종류로서 보존된 PRRS 바이러스 아미노산 서열로 제한된 PRRS 바이러스 서열을 갖는 폴리펩티드와 다른 종류로서 발산 PRRS 바이러스 아미노산 서열로 제한된 PRRS 바이러스 서열을 갖는 폴리펩티드)를 공지된 방법을 사용하여 96-웰 플레이트와 같은 고체 지지체 상에 고정시키고, 그 다음에 샘플 내에 존재하는 항-PRRS 바이러스 항체를 고정 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 결합시키는 조건 하에서 돼지 샘플과 접촉시켜 폴리펩티드-항체 복합체를 형성한다. 적합한 조건은 실온에서 대략 10분 이상에서 약 10시간 (예컨대 약 1 내지 약 2.5시간) 적당한 버퍼(예컨대, 소듐 포스페이트 버퍼, pH 7.2 내지 7.4) 내에 인큐베이션하는 것을 포함한다. 그런 후, 비결합 물질을 씻어내고, 폴리펩티드-항체 복합체를 본원에서 기술한 바와 같이 검출할 수 있다.
개체의 면역학적 상태를 검정하기 위한 키트
백신 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하고 천연 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제1 폴리펩티드에 결합할 수 있도록 된 아미노산 서열을 갖는 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 결합하여 생물의 면역학적 상태를 검정하는 키트를 제조할 수 있다. 제2 폴리펩티드는 백신 버전의 바이러스에 존재하는 서열과 유사하거나 동일한 서열을 가질 수 있다. 또한, 제2 폴리펩티드는 백신 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제2 폴리펩티드와 결합하고 천연 버전의 바이러스에 대하여 만들어진 항체가 제2 폴리펩티드와 결합하지 않도록 된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 키트는 추가의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 백신 버전 및 천연 버전의 바이러스 사이에서 보존되는 상이한 서열을 각각 갖는 두개, 세개, 네개 , 다섯개, 여섯개, 일곱개, 여덟개, 아홉개 , 열개 또는 그 보다 많은 상이한 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 이와 마찬가지로, 키트는 백신 버전 및 천연 버전의 바이러스 사이에서 보존되는 상이한 서열을 각각 갖는 두개, 세개, 네개 , 다섯개, 여섯개, 일곱개, 여덟개, 아홉개 , 열개 또는 그 보다 많은 상이한 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
키트는 다른 성분, 비제한적으로 들자면 포장 자료 (예컨대, 사용설명서), 지시 분자 (예컨대, 항-개체 Ig 항체), 버퍼, 양성 대조 샘플, 음성 대조 샘플을 포함하는 기타 성분들을 포함할 수 있다.
일부 경우, 고체 지지체는 폴리펩티드 및 리소자임과 접촉하여 고체 지지체와 부착하는 폴리펩티드가 폴리펩티드와 결합하는 항체와 반응할 수 있는 능력을 증가시킬 수 있다. 임의의 폴리펩티드는 비제한적으로 들자면 본원에서 제공되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드 (예컨대, PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드)를 비롯한 고체 지지체와 부착할 수 있다. 임의의 리소자임을 사용할 수 있다. 전형적으로, 리소자임은 특정 박테리아, 특히 그람 양성 박테리아의 세포 벽의 N-아세틸무람산과 N- 아세틸글루코사민 사이의 β-1,4 글루코시딕 연결을 분해시키는 가수분해성 효소일 수 있다. 리소자임은 비제한적으로 예를 들자면 타액, 눈물, 젖, 소변물, 자궁경관 점액, 백혈구 및 신장을 비롯한 동물 분비물 및 조직에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 리소자임은 돼지의 자궁 분비물에서 찾을 수 있다 (Roberts and Bazer, J. Reprod. Fertil, 82:875-892 (1988)). 병아리의 흰자로부터의 리소자임이 광범위하게 연구되고 결정구조가 규명된 첫번째 효소이다 (Diamond, J. MoI. Biol., 82:371-391 (1974)). 리소자임은 새의 흰자에 광범위하게 분포되어 있다 (Prager et ah, J. Biol. Chem., 249:7295-7297 (1974)). 리소자임의 구조-작용 관계가 다른 곳에 기재되어 있다 (Imoto et al., J. Vertebrate Lysozymes, The Enzymes 7, P. Boyer, Academic Press, NY, 1972)).
폴리펩티드 대 리소자임의 임의의 비가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 및 리소자임이 리소자임 1 ng 당 4 ng 이상의 폴리펩티드의 비로 (예컨대, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 또는 그 초과) 고체 지지체와 접촉할 수 있다. 일부 경우에서, 리소자임과 폴리펩티드를 폴리펩티드 1 ng 당 리소자임 1 ng 이상의 비로 (예컨대, 1:1, 2:1, 3:1, 4: 1, 5:1, 또는 그 초과) 고체 지지체와 접촉할 수 있다.
고체 지지체는 비제한적으로 예를 들자면 유리 슬라이드, 플라스틱 플레이트, 96-웰 플레이트, 비드 등을 포함하는 임의의 유형의 고체 지지체일 수 있다.
다음으로 실시예에서 본원 발명을 더 설명할 것이다. 그러나, 이들은 특허청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1 - 재조합 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 제조
방법 및 물질
플라스미드 클로닝 벡터 pET24b, pET25b, 및 pETBlue2를 노바겐(Novagen) (Madison, WI 소재)로부터 입수하고 pGEM-T는 프로메가 (Promega) (Madison, WI 소재)로부터 입수하였다. E. coli BL21(DE3) 세포는 노바겐으로부터 입수하였다. E. coli BL21(DE3)주 Tuner, RP, 및 ABLE-K는 스트라타젠 (Stratagene) (La Jolla, CA)으로부터 입수하였다. DH5α 세포를 인비트로겐(Invitrogen) (Carlsbad, CA 소재)로부터 입수하였다. 플라스미드 및 DNA 정제 키트는 퀴아겐(Qiagen) (Valencia, CA 소재)로부터 입수하였다. PCR 제제는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ)으로부터 입수하였다. 표준 실험실 공급장비, 박테리아 성장 배지, 및 전기 영동 화학물질을 시그마 케미칼 코(St. Louis, MO)로부터 입수하였다. 클로닝을 위한 PRRS 바이러스 cDNA 단편은 NSP Iα 및 lβ, NSP 2, 및 NSP 4를 코딩하는 VR-2332 게노믹 영역의 역전사효소-PCR 증폭에 의하여 얻어진다.
PCR 증폭, DNA 단편의 클로닝, 및 제한 분석
프라이머3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Massachusetts) 및 PRRS 바이러스 VR2332주 서열 (GenBank 등록번호 U87392 또는 PRU87392)을 사용하여 PCR에 대한 프라이머를 디자인하였다 (표 1). 프라이머를 합성하고, 정제하고 인테그레이티드 DNA 테크놀러지스, 인크(Integrated DNA Technologies, Inc.) (Coralville, IA 소재)에 의하여 정량화하였다. PCR 반응은 어플라이드 바이오시스템스 히트 액티베이티드 AmpliTaq Gold® 키트 (로쉐 몰레큘 러 시스템스 (Roche Molecular Systems), Branchburg, NJ 소재)를 이용하였다. 반응 혼합물은 (총 부피 50 ml)는 1OX 버퍼 H (1X 농도), 1.5 mM MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 200 μM ; 각 프라이머 쌍 0.2 μM (Table 1); 1.0 U AmpliTaq Gold®, 및 적절한 cDNA를 함유하였다. 혼합시, 용액이 즉시 써모사이클러(GeneAmp PCR system 2400, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), Shelton, CT 소재) 내에 들어갔다. 온도 사이클: 1 사이클 (10분 동안 95℃); 35 사이클 (30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 45초 동안 72℃); 1 사이클 (7분 동안 72℃, 4℃ 유지). 다음에 얻어진 증폭된 DNA를 아가로스 겔을 사용하여 분리하였다. 소기의 생성물 크기에 상응하는 밴드를 겔 추출(Gel Extraction Kit, Qiagen)하고 그 다음에 PCR 정제 키트를 사용하여 더 정제하였다. 다음에 단리된 생성물을 pGEM-T 벡터 내로 클로닝하고 DH5α 세포로 형질전환하고, 이를 IPTG 및 X-GaI가 있는 LB 100 ㎍/mL 암피실린 (Amp) 아가플레이트 위에 펼쳤다. 백색 콜로니를 선택하여 키웠다. 표준 T7 및 SP6 프라이머 (Advanced Genetic Analysis Center, University of Minnesota, St, Paul MN)를 사용하여 선택된 콜로니로부터의 핵산을 시퀀싱하였다. 초기 BLAST 서치 스크리닝 (GeneBank NCBI, Bethesda, MD) 후에, 미량의 파일을 바꾸어 벡터 서열을 제거하고(Seqman, DNASTAR, Inc., Madison, WI) 배열하였다(Megalign, DNASTAR).
myc tag 5' 리더 서열 및 말단 3' His 태그를 함유하는 pET 24b (Novagen, Madison, WI)에 기초한 특정화 벡터를 고효율 폴리펩티드 발현 및 단리를 위해 조 작하였다. 이 플라스미드 (pET 24b myc His)는 myc 태그 바로 3'의 Bam HI 사이트와 말단 6X His 태그 앞의 Xho I 사이트를 갖는다. 상기 벡터는 BamHI 및 Xho I로 분해(digestion)시켜 삽입 제조하고, 이어서 송아지 창자 알칼라인 포스파타제(CIAP)[프로메가 (Promega)제조]로 탈인산화하였다. PCR 조건, 삽입체 단리, 및 정제는 상기 서술한 바와 같이 수행한 후, 제한효소 분해(BamHI, Xho I)하여 라이게이션 삽입체를 제조하였다. 라이게이션 반응은 전형적으로 100 ng의 탈인산화 벡터, 20 ng 삽입체, 1X 라이게이션 버퍼, 및 400 Units T4 리가제 [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), Beverly, MA 소재), 총부피 10 μl를 함유하였다. 라이게이션 반응은 DH5α 세포 내로 형질전환하기 전에 16℃에서 16시간 동안 두었다. 콜로니를 앞서 기술한 바와 같이 선택하고 키웠다. 선택된 콜로니로부터의 핵산을 시퀀싱하고 분석하였다 (그 결과 플라스미드 pET 24b myc-폴리펩티드-His를 얻었다).
단백질 발현의 시험
폴리펩티드 발현을 시험하기 위하여, 재조합 플라스미드를 아르기닌에 대한 진핵생물 tRNA을 함유하고 클로람페니콜 (cam) 내성인 BL21 (DE3)-RP 세포로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 카나마이신 30 ㎍/mL (kan 30), 클로람페니콜 35 ㎍/mL (cam 35) LB 플레이트 상에 펼치고, 콜로니 pET 24b 플라스미드에 대한 T7 및 SP6 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 10개의 양성 콜로니를 2 mL의 2xYT 배지 (kan 30, cam 35) 내에서 30℃에서 밤새 키웠다. 밤새 키운 배 양물의 각각 200 μl을 사용하여 10개의 온도평형을 맞춘 (30℃) 2xYT (kan 30)의 10mL 분취량 10개를 접종하였다. 이들 배양물을 30℃에서 OD6O 값이 0.4가 되게 키우고, 200 μl를 SDS-PAGE 분석을 위하여 빼내고, IPTG를 첨가하여 최종 농도가 1.0 mM이 되게 하였다. 이렇게 유도한 샘플을 30℃에서 4시간 동안 성장하게 하고, 그 다음 200 ml를 SDS-PAGE 분석을 위해 빼내었다.
대규모의 폴리펩티드 발현 및 정제
천연(native) His 태그된 단백질에 대한 퀴아겐(Qiagen) Ni-NTA 아가로스 친화 단리 과정의 변형법을 사용하여 폴리펩티드를 정제하였다. 간략하게 말하자면, 1 리터 배양물로부터 유도된 박테리아 세포를 4℃에서 20분 동안 4000 g 펠렛팅하여 상청액을 부어내었다. 이 펠렛을 용해(lysis) 버퍼(pH 8.0에서 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 1 μM 펩스타틴 A, 1 μM 류펩틴, 및 1 mM PMSF) 30mL에서 재현탁하고, 그 다음 리소자임을 첨가하여 최종 농도가 1.0 mg/mL가 되게 하였다. 이 용액을 얼음에서 60분 동안 인큐베이션하고 다음으로 250W의 초음파를 10초 간격으로 10초간 가해주었다. 다음으로 RNAse A (10 ㎍/mL 최종) 및 DNAse I (5 ㎍/mL 최종)를 첨가하고, 용액을 얼음에서 추가로 핵산을 분해하기 위하여 추가 15분 동안 배양하였다. 다음에 용리물(lysate)을 10,000 x g로 30분 동안 원심분리하고(4℃) 불용성 집합체 및 세포 잔류물을 펠릿화하였다. 상기 펠렛은 대부분 발현된 재조합 폴리펩티드를 함유물의 형태로 함유하고, 변성된 형태로 단리되어 후에 리폴딩된다. 원심분리한 다음에 바로, 펠렛을 pH 8.0에서 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 및 8 M 우레아를 함유하는 용액 30 mL에 재현탁하였다. 이 재현탁된 펠렛을 실온에서 30분 동안 회전시키고 (200 rpm) 다음에 후처리를 위해 4℃에서 보관하였다.
다양한 양의 가용성 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 6 mL의 50% Ni-NTA 슬러리에 따라 붓고 4℃ 1시간 동안 완만히 회전시켰다. 다음에 상청액-Ni-NTA 혼합물을 1.5 x 30 cm 칼럼에 붓고 중력에 의하여 배수시켰다. 칼럼을 pH 8.0에서 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 1 μM 펩스타틴 A, 1 μM 류펩틴, 및 1 mM PMSF를 함유하는 용액 20mL로 두번 씻었다. 폴리펩티드를 pH 8.0에서 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 1 μM 펩스타틴 A, 1 μM 류펩틴, 및 1 mM PMSF를 함유하는 용리 버퍼 3mL 분취량으로 용출하였다. 정제된 폴리펩티드를 접선 흐름 여과 카세트 (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kD, Millipore, Bedford MA) 또는 YM-3 아미콘 센트리프렙(Amicon Centriprep)® 원심분리 필터 장치(centrifugal filter device, Millipore Corp. Bedford, MA)에 의하여 농축시키고, 다음으로 50% 글리세롤 및 20 mM Tris HCl, pH 7.5에 대하여 투석 (Spectra/Por MWCO® 6- 8,000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) 하였다. Bio-Rad RC DC 단백질 검정 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 폴리펩티드 농도를 결정하였다. 정제된 폴리펩티드 용액을 -20℃에 보관하였다.
4℃에 보관된 변성된 불용성 재조합 폴리펩티드 혼합물을 10,000xg 에서 30 분간 4℃에서 원심분리하여, 세포 잔류물을 펠렛화시켰다. 상청액은 고수준의 앞선 불용성의 변성 재조합 폴리펩티드를 함유하였고, 6 mL의 50% Ni-NTA 슬러리로 따라 붓고 4℃에서 1시간 동안 회전시켰다 (200 rpm). 다음에 상청액-Ni-NTA 혼합물을 1.5 x 30 cm 칼럼에 붓고 배수되게 하였다. 칼럼을 pH 6.3에서 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 및 8 M 우레아를 함유하는 용액 20mL로 두회 세척하였다. 다음에 폴리펩티드를 pH 5.9에서 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 및 8 M 우레아를 함유하는 용출 버퍼의 3 mL 분취량으로 4차례 용출하였다. SDS 겔 분석, 폴리펩티드의 농도, PBS로의 투석, 및 농도의 결정을 상기 기술된 바에 따라 행하였다.
폴리펩티드 리폴딩
변성된 재조합 폴리펩티드의 리폴딩을 다른 곳에 기술된 변형된 방법을 사용하여 수행하였다 (Buchner et al., Anal. Biochem., 205:263-270 (1992) 및 Clark, Curr. Opin. Biotechnol, 9:157-163 (1998)). 간략히 설명하면, 정제된 폴리펩티드를 함유하는 변성된 폴리펩티드 용액을 모으고 500 mL의 0.1 M Tris, pH 8.0, 6 M 구아니딘-HCl, 및 2 mM EDTA에 대하여 4℃에서 4시간 동안 투석하였다 (Spectra/Por MWCO® 6-8,000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA). 다음에 새로운 버퍼로 추가 4시간 동안 투석을 반복하였다. 폴리펩티드 농도를 3 mg/mL (농도는 Bio- Rad RC DC 단백질 검정 키트, Bio-Rad, Hercules, CA로 결정함)로 조절한 다음, 디티오트레이톨 (DTT)을 300 mM의 DTT 최종 농도로 첨가하였다. 얻어진 5-mL 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 다음에 0.45 μM 필터 [ 시린지 필터(Syringe Filter), Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)를 사용하여 여과하였다. 다음에 줄어든 폴리펩티드 용액을 4℃에서 적당히 교반하면서 500 mL의 리폴딩 버퍼 (100 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 M L-아르기닌, 8 mM 산화 글루타티온, 2 mM EDTA, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 류펩틴, 및 1 mM PMSF)를 급속히 첨가하여, 최종 희석도가 약 1:100에 상응하게 하였다. 다음에 얻어진 용액을 0.22 μm 멤브레인 (Steritop, Millipore, Bedford MA)를 통하여 여과하여 입상물을 제거하고 밤새 교반하였다. 정제된 폴리펩티드를 접선 흐름 여과 카세트 (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kD, Millipore, Bedford MA)에 의하여 10mL의 부피로 농축하고 다음에 50% 글리세롤 및 20 mM Tris HCl, pH 7.5에 대하여 투석 (Spectra/Por MWCO® 6-8,000, Spectrum Laboratories)하였다. 폴리펩티드 농도를 Bio-Rad RC DC 단백질 검정 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 결정하였다. 정제된 폴리펩티드 용액을 -2O℃에서 보관하였다.
겔 전기영동 및 이뮤노블롯팅(immunoblotting)
박테리아 용리물, 정제 분획, 및 정제된 폴리펩티드를 래믈리(Laemmli) 버퍼 시스템(Laemmli, Nature, 227:680-684 (1974))을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다. 단백질 밴드를 0.025% 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하여 시각화하였다. 이뮤노블롯팅을 위하여, 겔을 지지된 니트로셀룰로스 막 상에 전기블롯팅(electroblot)하였다 (MSI Separations, Westbrook MA). 막을 항-myc 모노클로날 항체 9E10로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 항체 결합을 알칼라인 포스파타제-컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG를 사용하여 검출하고 ECL 웨스턴 블롯팅 시스템(Western Blotting system, (Amersham Pharmaciea Biotech, Piscataway, NJ)을 사용하여 시각화하였다.
ELISA
ELISA 플레이트를 100 μl 카보네이트 버퍼 (15 mM Na2CO3 및 35 mM NaHCO3), pH 9.6 내에서 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드로 또는 버퍼만으로 밤새 코팅하고, PBS-Tween (0.1% Tween-20)으로 6번 세척하였다. 2.5% 무지방 건조 우유를 함유하는 PBS-Tween 200μl를 실온에서 1시간 동안 첨가하고 앞서 결합된 부위를 블로킹하고, 플레이트를 5번 세척하였다. 다양하게 희석한 100μl의 돼지 혈청을 실온에서 2시간 동안 두번 첨가하고, 플레이트를 PBS-Tween으로 4번 세척하였다. 특이적 항체의 수준을 1:5000으로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소-항 돼지 IgG (중쇄 + 경쇄) (KPL, Gaithersburg MD) 내의 웰에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 결정하였다. 웰을 5차례 세척하고, 100 μl의 TMB 기질(KPL)로 발색시켰였다. 15분 후에 1 M 인산 100 μL로 반응을 정지시키고, 플레이트를 450 nm에서 판독했다.
pETBlue2 (Novagen)
pGEM-T 내의 클론을 DH5α 세포로 형질전환하였다. 콜로니를 밤새 키우고, 플라스미드를 퀴아겐 미니프렙(Qiagen Miniprep) 정제 키트로 단리하였다. 정제된 플라스미드 및 2 ㎍의 pETBIue2를 개별적으로 Nco I 및 Not I으로 4시간 동안 소화시켰다. pETBlue2를 소화의 마지막 20분 동안 CIAP로써 탈인산화하였다. 삽입 단편 및 선형화된 pETBlue2는 퀴아겐 겔 정제 키트로 정제하고, 다음에 벡터 대 삽입체 비율을 약 1:2 비로 하여 라이게이션하였다.
라이게이션체를 DH5α 세포로 형질전환하였다. 플레이트 당 2개의 콜로니를 밤새 배양하고, 배양물 상에서 플라스미드 분리를 수행하여 플라스미드를 단리하였다. 정제된 플라스미드를 다음에 BL-21 (DE3) RP 세포로 형질전환하였다. 클론 당 두개의 콜로니를 배양하고, 30℃에서 4시간 동안 400 μM의 IPTG로 유도하였다. 전세포 용리물의 후속적인 SDS-PAGE 겔 결과, 특이적인 폴리펩티드 유도의 증거는 나오지 않았다. 이와 유사하게 마이크로티터 플레이트 상에 코팅되고 PRRS+ 및 PRRS- 돼지 혈청으로 반응된 유도 세포 용리물의 ELISA 시험은 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 증거를 보여주지 않았다. PRRS 바이러스 폴리펩티드 발현에 대한 pETBlue2 평가를 이 지점에서 정지하였다.
pET24d/pET25b (Novagen)
2 ㎍의 pET24d를 Nco I 및 Not I로 분해시키고, CIAP로 탈인산화시켰다. 다음에 단편을 퀴아겐 PCR 정제 키트로 정제하였다. 아가로스 겔을 사용하여 단편을 더 정제하고, 퀴아퀵 겔 엑스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)를 사용하여 겔로부터 벡터 단편을 추출하였다. 다음에 pET24d 단편을 라이게이션하여 인서트 대 벡터 비 약 2:1로 클론 단편을 라이게이션하였다. 이들 플라스미드의 DH5α 세포로의 형질전환은 콜로니 성장을 초래하지 않았다. 탈인산화되지 않은 pET24d 벡터, 또는 탈인산화되었거나 되지 않은 pET25d로의 클로닝 후에도 유사한 결과가 얻어졌다.
클로닝
PCR을 사용하여, PRRS 바이러스 VR2332주의 ORF Ia 내의 아미노산 위치에서 그들의 활성 부위가 동정된 다음의 세개의 PRRS 바이러스 프로테아제를 증폭하였다: 파파인 유사 시스테인 프로테아제 α 및 β (PCP α/β) (아미노산 74-146 및 268-339), 비통상 시스테인 프로테아제 (아미노산 435-506), 및 폴리오바이러스 3C-유사 세린 프로테아제 (아미노산 1840-1946). PRRS 바이러스 게놈 내의 이들 기능성 프로테아제 도메인의 위치는 도 1에서 도시되어 보여준다. 표 1은 PCR 증폭된 PRRS 바이러스 VR2332주의 뉴클레오티드 서열 영역을 보여 주고 전체 결과가 요약되어 있다.
클로닝된 PRRS 바이러스 NSP 단편
비구조 단백질 (NSP) 증폭된 영역 제한 부위 결과
1 (PCP α/β) 174-1322 AccIII, BamHI, NdeI, XhoI, XhoI, NcoI PCR 밴드, 분해 생성물, PCR 스크리닝에 의한 형질전환된 박테리아 콜로니 양성, 플라스미드 없음
2 (비통상적 시스테인 프로테아제) 1339-4922 BamHI, NcoI, NdeI, XhoI PCR 밴드, 분해 생성물, PCR-양성 콜로니, 플라스미드 없음
4 (폴리오바이러스 3C 유사 세린 프로테아제 5598-6209 NdeI, XhoI PCR 밴드, 분해 생성물, 형질전환된 박테리아 콜로니, 삽입체가 있는 플라스미드, 단백질의 점 돌연변이
비구조적 단백질 1 (NSP 1)
이 단편과 pET24b의 라이게이션 생성물을 E. coli DH5α 세포에 형질전환하여 콜로니를 얻었다. 콜로니는 천천히 성장했고, 전형적으로 가시적이 되는데 37℃에서 48시간이 필요했다. PCR에 의한 콜로니의 스크리닝은 클론된 단편의 존재와 일치되는 양성 결과를 주었다. 브로쓰(broth)에서 성장된 박테리아로부터 재조합 플라스미드를 회수하는 노력은 성공적이지 못하였다. 이는 재조합 플라스미드는 불안정한 것으로 보였다. 이 문제를 극복하기 위하여, 다양한 이. 콜라이(E. coli) 계통-DH5α, JM109, HBlOl, SURE (Stratagene), 및 ABLE (Stratagene)-을 플라스미드 수용체로 사용했다. 형질전환 플레이트 및 브로쓰 배양물을 37℃, 30℃, 및 22℃에서 배양하였다. 배양물 부피 1, 2, 5, 10, 및 25 mL를 수행하였다. 퀴아겐 미니프렙(Qiagen miniprep), 페놀/클로로포름 추출과 함께 표준 알칼라인 용리 및 리튬 클로라이드/이소프로판올 침전을 사용한 가열 용리를 비롯한 다양한 플라스미드 정제 방법을 시도하였다. 이들 조건 및 처리의 어느 것도 재조합 플라스미드의 회수를 초래하지 않았다. 총 353개의 형질전환체를 콜로니 PCR로 스크리닝하여, 약 70개의 반응에서 밴드가 나타났다. 플라스미드 정제로는 가시적 밴드가 나타나지 않거나, 또는 진단 제한효소 분해시 겔로부터 사라지는 고분자량 밴드가 나타났다. 이 결과는 게놈 DNA의 거동과 일치하였다.
비구조 단백질 2 (NSP 2)
NSP 1에서와 동일한 결과를 얻었다. 형질전환된 콜로니를 PCR에 의해선 양성인 LB 아가 플레이트 상에 얻었으나, 플라스미드 DNA를 단리하려는 시도는 실패하였다.
비구조 단백질 4 (NSP 4)
NSP 4에 대한 결과는, 한가지 예외만 빼고는 NSP 1 및 NSP 2에서와 동일하였다. 플라스미드 DNA를 클론으로부터 성공적으로 회수했고, DNA 시퀀싱 결과 예상되는 NSP 4를 함유하는 것으로 나타났다. 이소류신에서 트레오닌으로 아미노산 16이 변화한 점 돌연변이(point mutation)가 관찰되었다.
pET24bmycHis 내에서 NSP 단편의 클로닝
NSP 1, NSP 2, 및 NSP 4에 상응하는 DNA 단편을 PCR에 의하여 증폭하고, pET24b-mycHis 로 클로닝하였다 (도 2, 3, 및 4). 기능적으로 양성 클론은 개별 클로니의 소규모 시험 유도에 의하여 동정되었고, 단일, 고 발현 클론을 채택, 성장 정제하고 시퀀싱하였다. 각 클론은 5' 말단에 EcoRl 및 BamHI 부위를 함유하고, 3'-말단에 Xhol 부위를 함유하였다. 코딩된 폴리펩티드는 아미노 말단 myc 태그 및 카르복실 말단 6x His 태그를 함유하였다.
재조합 NSP 발현 및 정제
개별 콜로니를 배양하고 본원에 기술한 바와 같이 폴리펩티드 발현을 위하여 유도하였다. 폴리펩티드를 Ni-NTA 고정 금속 친화도 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 재조합 NSP 1 및 NSP 4가 기술된 조건 하에서 쉐이크 플라스크 내에서 mg/L 수준으로 용이하게 발현되었고, 친화도 크로마토그래피 및 리폴딩 후 약 50%의 폴리펩티드를 회수하였다. 정제되고 리폴딩된 폴리펩티드는 균질하고 예상된 프로테아제 활성과 일치하는 단편 크기를 함유하였다. NSP 1 및 NSP 4 폴리펩티드는 균질한 폴리펩티드로 이루어졌고, NSP 1 제제가 온전한(intact) 폴리펩티드 및 PCP 1α 및 PCP 1β로 자동적인 단백질가수분해적으로 절단되는 두개의 단편을 함유하나, NSP 4 제제는 단일 밴드인 폴리펩티드로 이루어졌다 (도 5 및 6).
폴리펩티드 발현 수율
비구조 단백질(NSP) 총 발현량 (mg/L 배양물) 정제된 Ni-NTA (mg/L 배양물) 리폴딩 후 (mg/L 배양물)
NSP 1 (pcpα/pcp β) 20 10 9
NSP 4 25 14 13
NSP 2 폴리펩티드는 쿠마시 블루로 스테이닝된 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에 전세포 용리물에 가시화되지 않는 낮은 수준으로 발현되었으나, 항-myc 항체로 웨스턴 블롯 검출에 의하여 관찰되었다. 132 kD의 코딩된 폴리펩티드 서열보다 낮은 크기에서의 다중 밴드의 존재는 단백질 가수분해에 의한 분해가 박테리아 성장 및 폴리펩티드 발현 동안에 또는 세포 용리(lysis) 및 샘플 조작 동안 중 어느 하나 중에 일어날 수 있다는 것을 시사한다. 웨스턴 블롯 밴드가 PRRS 바이러스 NSP 2를 함유한다는 추가 증거를 마이크로티터 플레이트 웰을 NSP 1, NSP 2 또는 NSP 4를 발현하는 클론으로부터 유도된 박테리아 용리물로 피복된 ELISA 시험 결과로부터 얻었다. NSP 2 폴리펩티드를 함유하는 웰은 특이적 및 희석에 좌우되며 강하게 반응한다. NSP 2 폴리펩티드의 낮은 수준의 발현은 폴리펩티드의 카르복실 말단을 향한 소수성 영역의 존재에 기인한 것일 수 있다.
ELISA 반응성에 관한 리폴딩의 효과
세개의 NSP 폴리펩티드 사이의 항체 반응성의 명백한 차이는 예비 ELISA 시험에서 관찰되었고, 정제된 재조합 폴리펩티드의 배좌(conformation)가 가변적이고 면역활성에 영향을 줄 수 있다는 가능성을 제기하였다. 재조합 뉴클레오캡시드 (N)는 발현, 정제 및 리폴딩의 조건에 따라 면역활성에서 변한다. 그러므로, 리폴딩 이전 및 이후의 NSP 1 및 NSP 4의 면역활성이 평가되었다.
리폴딩은 NSP 1의 면역활성에 영향을 주었다 (도 7). 리폴딩되지 않는 친화도 정제된 NSP 1 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 감염 후 120일 기간 동안 돼지로부터 얻을 수 없는 혈청에 실질적으로 비반응성이었다.
대조적으로, 비-리폴딩 또는 리폴딩된 NSP 4 폴리펩티드에 대하여 항-NSP 4 항체 역가의 실질적인 차이는 없었다 (도 8). NSP 4에 대한 두 형태에서 차이가 없는 것이 분명하였기 때문에 리폴딩된 폴리펩티드 반응성의 분석을 52일에 종결하였다. 리폴딩의 효과가 없음은 분석을 위한 혈청 샘플의 선택에 의하여 더 강조된다. 최대 항체 반응이 동종 바이러스 (VR2332이 Ingelvac MLV 백신의 친종 계통임)로 면역된 동물에게서 일어날 것으로 예측하고, 리폴딩된 노출된 바 없는 폴리펩티드로 테스팅하였다. 최소 반응이 불균질 계통 (MN30100)에 감염된 동물에게서 일어날 것을 예측하고 비-리폴딩된 폴리펩티드로 시험하였다. 이들 조건 하에서, 아무런 차이가 관찰되지 않았다.
이들 결과는 NSP 1의 경우 폴리펩티드 리폴딩이 면역반응성에 영향을 주고 NSP 4에 대해서는 현저하지 않다는 것을 입증하였다. 그러나, 각 재조합 NSP 폴리펩티드는 루틴하게 리폴딩되고 글리세롤 내에서 가용 형태로 보관되어 균일 생성물을 유지한다.
NSP 재조합 폴리펩티드에 대한 항체 반응의 유도 및 지속
항-NSP 1 항체 반응의 동역학적 거동은 생후 4개월 암퇘지에서의 N에 대한 반응과 유사하였다. 항-NSP 1 역가는 약 감염후 14일에서 1/50,000였고, 감염후 약 21일에 약 1/140,000로 최고였다. 항체 수준이 급격히 감소하고 감염후의 28-120일의 N (ORF 7)과 동등하였다. Ingelvac MLV로 면역화된 소그룹의 어린 돼지 (생후 4-6 주)에서, NSP 1에 대한 항체 역가는 유사한 날카로운 피크와 급격한 감소를 보여주었으나, 감염 후에 21일에 나타나지 않고 28일에 나타났다 (도 9).
비출산 암퇘지에서, NSP4에 대한 항체 반응은 N 및 NSP 1에 비하여 약하였다. 감염후 40-55일째에 역가가 증가하는 증거와 다시 감염 후 100-110일째에 증가하는 증거가 있었다. 어린 돼지에서, 항-NSP 4 역가에서 면역 후 약 28-35일에 시작하는 유사한 늦고 적당한 증가가 있었다 (도 9). 이 시간의 틀은 급성 감염이 치유된 기간과 상응한다.
돼지 항-NSP 항체의 VR2332 NSP 재조합 폴리펩티드에 대한 교차 반응성
PRRS 바이러스 VR2332주로부터 유래되고 박테리아에서 발현된 정제 및 리폴딩된 NSP 1 및 4 폴리펩티드는 PRRS 바이러스의 동종 계통 (Ingelvac MLV) 및 이종 계통 (MN30100)에 노출된 돼지로부터의 항혈청과 동등하게 반응하였다.
실시예 2 - 추가 재조합 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 생성
다음의 폴리펩티드를 제조하였다: PRRS 바이러스 NSP 2P 폴리펩티드 (도 19), PRRS 바이러스 제1 N-말단 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드 (ORF 5 5'; 도 20 및 21 ), PRRS 바이러스 제1 및 제2 N- 말단 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드 (ORF 5' total; 도 22), PRRS 바이러스 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드 (ORF 5 3'; 도 23 및 24), PRRS 바이러스 제1 및 제2 N-말단 엑토도메인 ORF 6 폴리펩티드 (ORF 5+6; 도 25)를 사용하여 PRRS 바이러스 제1 및 제2 N-말단 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드를 합한 키메릭 폴리펩티드 및 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 PRRS 바이러스 VR-2332주 (GenBank® 등록번호 PRU87392) 또는 PRRS 바이러스 MN30100주에서의 뉴클레오티드 서열로부터의 것이다.
PCR 증폭 및 클로닝
클로닝을 위한 단편은 다른 곳에서 기술된 바와 같이 제조된 플라스미드 (Nelsen et al, J. Virol, 73:270-280 (1999))로부터 얻었다. 소기의 단편을 PCR에 의하여 적절한 클로닝 부위로써 단리하였다. 프라이머3을 사용하여 프라이머를 디자인하였다 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Massachusetts). 올리고뉴클레오티드 프라이머를 IDT (Coralville, IA)로부터 입수했다. ORF 7, ORF 5 5', 및 ORF 5 3 ' 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 AmpliTaq Gold® kit (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ)를 사용한 별개의 반응에서 PCR 증폭되었다. ORF 5 5' 전체 및 ORF 5+6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 cDNA의 PCR에 의하여 그리고 이어진 올리고 어닐링, PCR 증폭 및 라이게이션에 의하여 구축하였다. 반응 혼합물 (총부피 50 μl)은 1OX Buffer II (1X 농도), 1.5 mM MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각 200 μM; 각 프라이머쌍 0.2 μM; 1.0 U AmpliTaq Gold®, 및 적절한 일련적으로 희석된 (1:10 ... 1:10,000) mRNA 유도된 cDNA를 함유하였다. 혼합시에, 용액을 즉시 써모시클러 내에 두었다 (GeneAmp PCR system 2400, Perkin Elmer, Shelton, CT). 온도 사이클; 1 사이클 (10부 동안 95℃); 35 사이클 (30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃ , 45초 동안 72℃ ); 1 사이클 (7분 동안 72℃, 4℃ 유지). 다음으로 얻어진 증폭된 DNA를 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 예측되는 생성물 크기에 상응하는 밴드를 추출하였고 (Gel Extraction Kit®, Qiagen, Valencia, CA), 그 다음에 퀴아겐(Qiagen) PCR 정제 키트® (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 더 정제하였다. 다음에 단리된 생성물을 pGEM®T 벡터 (Promega, Madison, WI) 내로 클로닝하여 DH5α 세포 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California)로 형질전환하고, 이를 IPTG 및 X- GaI이 있는 LB 100 mg/mL 암피실린 (Amp) 아가 플레이트 상에 펼쳤다. 콜로니를 색깔로 선택하여 성장시키고, 핵산을 시퀀싱하였다 (Advanced Genetic Analysis Center, University of Minnesota, St, Paul MN). 초기 BLAST 서치 스크리닝 (GeneBank NCBI, Bethesda, MD) 후에, 미량의 파일을 바꾸어 벡터 서열을 제거하고 (Seqman DNASTAR, Inc., Madison, WI), 중복되는 서열을 정렬하였다 (Megalign DNASTAR, Inc., Madison, WI). NSP 2P 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 Xhol로써 클론 pET 24b myc-NSP 2-His를 분해하고 벡터를 다시 라이게이션함으로써 얻었다 (도 3) .
발현 플라스미드로의 서브-클로닝
적절한 pGEM®T 컨스트럭트를 말단 BamHl 및 Xho I 부위를 갖는 프라이머에 대한 템플레이트로서 사용하여 클론을 증폭시켰다. PCR 조건 및 인서트 단리 및 정제는 표준으로 하고 다음으로 제한 소화 (BamHI, Xhol)시켜 라이게이션을 위한 삽입체를 제조하였다. 라이게이션 조건은 100 ng의 탈인산화 벡터, 20 ng 인서트, 1X 라이게이션 버퍼, 및 400 U T4 리가제 (New England Biolabs 제조), 총 부피 10 μl였다. 결찰 반응은 DH5α 세포 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California)로 형질전환하기 전 16℃에서 16시간 동안 두었다. 콜로니를 앞서 기술한 바와 같이 선택하고 성장시키고 핵산을 시퀀싱하고 분석하였다 (플라스미드 pET 24b myc-폴리펩티드-His를 제공함).
ORF 5 5' 및 ORF 5 3'과 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 컨스트럭트를 또한 바이러스를 함유하는 세포 배양 상청액으로부터 출발하여 MN30100 PRRS 바이러스 서열 (Bierk et al., Vet. Rec, 148:687-690 (2001))로부터 만들었다. 바이러스 RNA는 표준 과정에 의하여 배지로부터 얻었다. 바이러스 RNA를 QIAamp 바이러스 RNA 키트 (Qiagen)를 사용하여 단리하고 -80℃에서 저장하였다. 정제된 RNA를 GeneAmp RNA PCR 키트 (Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ)를 사용하여 랜덤 헥사머로써 cDNA로 전환하였다. 간략히 설명하면, 1 μl의 랜덤 헥사머 50 μM 용액을 3.0 ㎍ 의 총 RNA와 총 부피 4 μl 되도록 합하였다. 이 용액을 10분간 68℃ 로 가열한 후, 얼음에서 빨리 냉각하였다. 16 ml의 마스터 혼합 용액을 1OX Buffer H (1X 최종 농도); 5 mM MgCl2, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각 1.0 mM ; 20 U/ml RNAse 억제제, 및 25 U/μl 역전사효소를 함유하는 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 이 용액을 25℃에서 10 분 동안, 42℃에서 30 분 동안, 99℃에서 5 분동안 다음에 4℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 cDNA를 -20℃에서 저장하고 PCR 증폭을 위하여 사용하였다.
단백질 발현
플라스미드 pET 24b myc-폴리펩티드-His를 클로람페니콜 (cam) 내성 및 아르기닌 및 프롤린에 대한 진핵 tRNA를 갖는 BL21(TM) (DE3)-RP 세포 (Stratagene, River Creek, TX) 내로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 카나마이신 30 ㎍/mL (kan 30), 클로람페니콜 35 ㎍/mL (cam 35) LB 플레이트 위에 펼치고, T7, pET 24b 플라스미드를 위한 T7 종결 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR에 의하여 스크리닝하였다. 열개의 양성 콜로니 각각은 2 mL의 2xYT 배지 (kan 30, cam 35)에서 30℃로 밤새 키웠다. 밤새 배양한 배양물 200 μL을 사용하여 10개의 온도가 평형으로된 (30℃) 10mL 분취량의 2xYT (kan 30)을 접종시켰다. 이들 배양물을 30℃에서 ODλ=600 가 0.3이 되도록 키우고; 200 μL를 SDS-PAGE 분석을 위하여 빼내고 IPTG를 첨가하여 최종 농도가 1.0 mM가 되게 하였다. 이 유도된 샘플을 30℃에서 4시간 동안 자라게 하고 그다음 200 μL를 SDS-PAGE 분석을 위하여 빼냈다. SDS-PAGE 겔은 콜로니 모두가 예기되는 크기의 폴리펩티드를 높은 수준으로 (>2 mg/liter 배지) 발현했음을 나타냈다. 더 대규모의 발현을 총 1 리터의 배지에 대하여 100X로 스케일을 크게 하는 동일한 방식으로 행하였다.
폴리펩티드 정제
폴리펩티드를 변성된 His 태그된 폴리펩티드 (Qiagen, Valencia, CA)에 대한 Qiagen Ni- NTA 아가로스 친화 단리 과정의 변형 과정을 사용하여 정제하였다. 간략히 말하면, 박테리아 세포를 함유하는 유도된 플라스미드 1리터를 4℃에서 20분간 4000 g 펠렛팅하여, 상청액을 부어냈다. 원심분리 바로 다음에, 이 펠렛은 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아를 함유하는 pH 8.0 용액 30 mL에 재현탁시키고, 실온에서 30분간 온화하게 회전시켰다. 다음에 얻어진 현탁액을 30분 동안 10,000 g으로 원심분리하고 (4℃) 세포 잔류물을 펠렛화하였다. 상청액은 고수준의 변성된 폴리펩티드를 함유하고, 6 mL의 50% Ni-NTA 슬러리 내로 따르고 4℃에서 1시간 동안 온화하게 교반하였다. 이 다음에 상청액-Ni-NTA 혼합물을 1.5 cm ID x 30 cm 길이의 칼럼에 붓고, 배수되게 하였다. 다음에 이 칼럼을 pH6.3으로 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아를 함유하는 용액 20 mL로 두번 씻었다. 이 다음에 폴리펩티드를 pH 5.9에서 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아를 함유하는 용출 버퍼 분취량 3 mL로 4번 용출하였다. SDS 겔 분석 및 단백질 농도를 상기 기술된 바와 같이 결정하였다 (도 17).
폴리펩티드 리폴딩
변성된 재조합 폴리펩티드의 리폴딩을 여러곳에 기술된 방법의 변형방법을 사용하여 수행하였다 (Buchner et ai, Anal. Biochem., 205(2):263-70 (1992) and Clark, Curr. Opin. Biotechnol, 9(2):157-63 (1998)). 먼저, 순수한 폴리펩티드를 함유하는 변성된 폴리펩티드 용액을 모으고 4℃ 4시간 동안 500 mL 의 0.1 M Tris, pH 8.0, 6 M 구아니딘-HCl, 및 2 mM EDTA에 대하여 투석하였다(Spectra/Por MWCO® 6-8,000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA). 이 다음에 추가 4시간 동안 신선한 버퍼로 투석을 반복하였다. 폴리펩티드 농도를 3 mg/mL로 조정한 다음 (Bio-Rad RC DC 단백질 검정 키트, (Bio-Rad , Hercules , CA)를 사용하여 농도 결정함), 디티오트라이톨(DTT)를 첨가하여 최종 농도 300 mM DTT를 얻었다. 이 용액 (5 mL)을 실온에서 2시간 동안 교반하게 하고 이어서 0.45 μm 필터(Syringe Filter, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)를 사용하여 여과를 하였다. 다음에 감축된 폴리펩티드 용액을 4℃에서 완만히 교반하면서 최종 희석도가 약 1:100에 해당되는 500 mL의 리폴딩 버퍼 (100 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M L-아르기닌, 8 mM 산화된 글루타티온, 2 mM EDTA 1O μM 펩스타틴 A, 10 μM 류펩틴, 1 mM PMSF)로 하였다. 다음에 얻어진 용액을 0.22 μm 막 (Steritop, Millipore, Bedford MA)을 통하여 여과하여 입상물을 제거하고 밤새 교만하면서 두었다. 정제된 폴리펩티드를 접선 흐름 여과 카세트에 의하여 농축하여 (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kd , Millipore, Bedford MA) 부피 10 mL로 하고 다음에 pH 8.0, 20 mM Tris HCl에 대하여 투석하였다 (Spectra/Por MWCO® 6-8,000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA). 폴리펩티드 농도를 Bio-Rad RC DC 단백질 검정법 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA), 정량적 SDS 겔, 및 아질런트 2100 바이오어낼라이져(Agilent 2100 bioanalyzer) (Protein LabChip® Kit, Agilent Technologies, Palo Alto, California)를 사용하여 결정하였다. 정제된 폴리펩티드 용액을 -80 ℃에서 저장하였다. 폴리펩티드 ORF 5 5', ORF 5 3', 및 ORF 5 모두는 리폴딩이 ELISA 반응성에 영향을 주기 않기 때문에 루틴하게 리폴딩되지 않았다.
ELISA
폴리펩티드를 카보네이트 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에 1 ㎍/mL의 농도로 희석시켰다. 각각의 ELISA 플레이트 웰 (COSTAR 3590, 96 웰 EIA/RIA 플레이트, 코닝 인크. (Corning Inc., 뉴저지주 코닝 소재))을 그 후 100 ㎕ 적절한 폴리펩티드 카보네이트 용액 (웰 당 100 ng 폴리펩티드 제공)으로 코팅한 후, 밤새 4℃에서 인큐베이팅했다. 샘플을 이중으로 수행했다. 한 세트의 웰을 혈청 및 2차 항체 배경 효과를 결정하기 위해 코팅하지 않았다 (0.005 흡광 단위 미만인 것으로 발견). 그 후 플레이트를 실온에서 PBS-Tween-20 (0.1%)으로 6번 세척했다 (EL-404 마이크로플레이트 워셔 (Microplate Washer), 바이오-테크 인스트루먼트스 인크. (Bio-Tek Instruments Inc. 버몬트주 빈우스키 소재). 비-특이 결합 부위를 실온에서 2 시간 동안 3% 탈지 건조 우유 (NFDM)를 함유하는 PBS-Tween (0.1%)의 300 ㎕/웰로 블로킹했다. 그 후 플레이트를 상기한 바와 같이 세척했다. 혈청 샘플을 그 후 3% NFDM 함유 PBS-Tween-20 (0.1%)로 1:2000로 희석한 후 100 ㎕을 적절한 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 평형화했다. 일련의 희석을 사용한 타이터 값은 1:2000 혈청 희석물이 유사한 데이타 경향을 보인다고 지시했다 (오차 범위내). 웰을 그 후 상기한 바와 같이 세척했다. 2차 검출 항체 (퍼옥시다아제 라벨링된 염소 항-돼지 IgG (H+L), 커크가드 앤드 페리 래보라토리즈 인크. (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. (KPL) 메릴랜드주 게티스버그 소재))를 3% NFDM 함유 PBS-Tween (0.1 %)에 1:5000으로 희석하고, 100 ㎕ 희석된 용액을 각 웰에 첨가했다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이팅한 후 플레이트를 다시 세척했다. 테트라 메틸 벤지딘 (TMB cat #50-76-00 커크가드 앤드 페리 래보라토리즈 인크.)을 사용해 색상측정 분석을 수행했다. TMB 퍼옥시다아제 (용액 A) 및 퍼옥시다아제 (용액 B)의 동등 부피를 함께 혼합하고 100 ㎕을 각 웰에 첨가했다. 용액을 실온에서 15분간 현상되도록 방치했다 (청색). 반응물을 그 후 100 ㎕ 1 M 인산을 첨가해서 켄칭했다 (황색). 플레이트를 450 nm에서 판독했다 (써모 맥스 마이크로플레이트 판독기 (Thermo Max microplate reader, 몰레큘라 디바이스 (Molecular Devices), 캘리포니아주 써니베일 소재).
실시예 3 - 반복적인 동종 야생형 바이러스 면역유발 후 PRRS 바이러스 항체 반응
혈액학은 수의과 질환 모니터링 및 제어의 초석이 되어왔다. 특이 항체의 혈청 내 존재는 질환에 대한 사전 노출을 지시하고 동물이 보호성 면역을 가짐을 또한 확인할 수 있게 한다. 현재 이용가능한 PRRS 바이러스 ELISA 항체 시험은 돼지, 특히 재감염된 동물의 감염군에서 발견되는 모든 가능한 상황에 대해 민감하지 않을 수 있다. 초기 감염 후 4 내지 6개월 내 많은 동물이 혈액음성적인 상태로 돌아간다 (Yoon et al, J. Vet. Diagn. Invest., 7:305-312 (1995)). 또한, 변형된 생 PRRS 바이러스 백신으로 수회 반복적으로 백신접종된 동안 ELISA 항체 음성으로 돌아가 잔류하는 동물에 대한 보고가 있어 왔다 (Baker et al., Proc. Allen D. Leman Swine Conference, vol. 26 (suppl.) p. 31 (1999)). ELISA 항체 반응의 손실이 동일한 야생형 PRRS 바이러스에 대한 반복적이고 종종 일어나는 노출 후에 일어나는 경우, 연속적인 바이러스 유포에 대해 가축 무리를 모니터링할 때 고객에게 PRRS 바이러스 ELISA 시험 결과를 수의사가 해석해주는 방법을 변경시킬 수 있다.
(1) PRRS 바이러스 ELISA 혈액음성 동물이 야생형 바이러스에 의한 복수의 저-용량 면역화에 의해 유도될 수 있는지를 결정하기 위해 및 (2) 개별 재조합 ORF 폴리펩티드에 대한 항체 및 PRRS 바이러스 혈청 중화 항체의 발현 시간순을 특성화하기 위해 하기의 실험을 수행했다.
68마리 PRRS 바이러스-음성 6 개월령 숫돼지를 한달 상간으로 두번 주입한 후 매 격달 용량 당 102.5 필드 균주 SD 28983 PRRS 바이러스를 사용해 총 6번의 면역화에 대해 6/60 유형 스케줄에 근접하게 주입했다. 동물을 각 면역화 후 3주째에 채혈하고, 샘플을 PRRS 바이러스 ELISA 및 혈청 중화 항체에 대해 시험했다. 마지막 면역화 후 4개월 (초기 노출 후 12 개월)에, 동물을 SD 28983로 재면역유발했다.
혈액 샘플을 형광 초점 중성화에 의해 혈청 중화 항체 (검정법 접종원으로서 23983주 바이러스) 및 본원에 기재된 바와 같이 얻어진 재조합 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 대한 항체에 대해 시험했다. 요약하면, 원하는 cDNA 핵산 단편을 이. 콜라이에 발현을 위해 삽입하여 PRRS 바이러스 rORF 폴리펩티드를 제조하였다. 제조된 폴리펩티드는 뉴클레오캡시드 (ORF 7 폴리펩티드) 및 바이러스 외피 내에 공동 위치하는 ORF 5 외피 폴리펩티드 및 ORF 6 매트릭스 폴리펩티드 모두의 엑토도메인 영역을 함유하는 키메라 폴리펩티드 단편을 포함한다. ELISA 플레이트를 각 폴리펩티드로 코팅하고 혈청 샘플을 희석을 제한하여 시험했다. 결과를 광학 밀도 비 보다는 타이터로 기록했다. 혈액 샘플을 또한 시판되는 PRRS 바이러스 ELISA (2XR PRRS 바이러스 항체 시험 키트; IDEXX 래보라토리즈)을 사용해 시험했다.
PRRS 바이러스 2XR ELISA 항체 수준은 전염성이 강한 PRRS 바이러스 28983주로 반복적으로 주입해도 초기의 혈액-변환 후 급속히 감소했다. 거의 모든 동물이 초기에는 견고하게 양성 항체 반응을 보였다. 상기 동물의 75 퍼센트는 그러나 생 바이러스로의 6번째 주입 후 4개월에 혈청음성 상태로 돌아갔다. 이는 MLV PRRS 바이러스 백신으로 수회 백신접종된 암돼지에서 발견된 것과 유사하다 (Baker et al, Proc. Allen D. Leman Swine Conference, vol. 26 (suppl.) p. 31 (1999)). 반대로, 혈청 중화 시험은 초기 감염 후 나중에 항체를 검출했고, 모든 동물이 실험의 끝에 혈청 중화 항체 양성을 유지했다.
rORF ELISA는 일시적 항체 곡선을 보여주었다. 재조합 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 사용한 검정법은 4개월에 낮은 수준으로 떨어지는 IDEXX 2XR ELISA 반응 곡선을 밀접하게 따르는 곡선을 보여주었다. 반대로, 외피 키메라 ORF 5 및 ORF 6 폴리펩티드 ELISA는 PRRS 혈청 중화 항체 반응 곡선에 근접하게 동일한 일시적인 패턴을 보여주었다. 따라서, 돼지는 주로 뉴클레오캡시드 폴리펩티드에 대한 강한 항체 반응을 초기에 보이나, 시간이 경과하면서 항체 반응이 외피 폴리펩티드에 재지향되는 것으로 보인다. PRRS 바이러스에 대한 면역 반응이 면역적으로 보호적인 혈청 중화 항체로 전환하는데 느린 것으로 보인다.
상기 결과는 효과적인 진단 키트가 ORF 5 폴리펩티드 및 ORF 6 폴리펩티드를 포함할 수 있음을 증명한다. 또한 IDEXX PRRS 바이러스 ELISA 키트가 PRRS 바이러스 뉴클레오캡시드 폴리펩티드에 결합하는 항체를 검출하는데 제한된 것으로 보이므로, 백신접종 또는 재노출 후의 약한 IDEXX PRRS 바이러스 ELISA 항체 반응은 동물이 백신 또는 바이러스에 대한 보호성 면역 반응을 가진다는 것을 역설적으로 지시할 수 있음을 상기 결과는 증명한다.
실시예 4 - PRRS 바이러스의 전염성이 강한 및 약독화된 균주에 대한
비교 항체 반응
(1) 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 대한 돼지의 항체 반응을 특성화하기 위해, (2) 전염성이 다른 바이러스 단리물에 대한 항체 반응을 결정하기 위해, 및 (3) 항체 반응과 면역유발에 대한 보호 간의 관계를 결정하기 위해 하기의 실험을 수행했다.
100 마리의 PRRS-음성 3-4 주령 새끼돼지를 군으로 나누었다. 군 당 열 마리 돼지를 고도로 또는 중등도로 감염성이 있는 (SDSU73, MN 184, JA 142, 및 17198-6), 저도로 감염성이 있는 (VR2332 및 ABST-I), 또는 감염성이 없는 (Ingelvac PRRS 및 Ingelvac ATP)로 특성화되는 2x103 TCID50 PRRS 바이러스 균주로 비강내 접종했다. 열 마리 돼지의 한 군은 동량의 모든 바이러스를 함유하는 칵테일을 수여받았고, 열 마리의 대조군 돼지는 아무런 바이러스를 수여받지 않았다. 동물들이 급성 감염으로부터 완전히 회복된 후, MN 184로 면역유발했다. 임상 증후를 실험에 걸쳐 기록했고, 검시를 면역유발 후 14일째에 수행했다. 동물을 매주 채혈했고, 항체 수준을 발현 및 정제를 위해 이. 콜라이에 원하는 cDNA 단편을 삽입하여 제조된 정제된 비구조 및 구조 폴리펩티드에 대한 ELISA로 측정했다. 폴리펩티드는 VR2332 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드 (뉴클레오캡시드 폴리펩티드), VR2332 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드, VR2332 PRRS 바이러스 NSP 2P 폴리펩티드, VR2332 PRRS 바이러스 NSP 4 폴리펩티드, VR2332 ORF 5 5' 엑토도메인 1 폴리펩티드, MN30100 VR2332 ORF 5 5' 엑토도메인 1 폴리펩티드, VR2332 ORF 5 3' 엔도도메인 폴리펩티드, MN30100 ORF 5 3' 엔도도메인 폴리펩티드, VR2332 ORF 5 5' 엑토도메인 1 및 2 폴리펩티드, 및 VR2332 ORF 5/ORF 6 키메릭 폴리펩티드 (ORF 5 5' 엑토도메인 1 및 2 플러스 ORF 6 5' 엑토도메인 1 및 2; 또한 GP5-M 키메릭 엑토도메인 폴리펩티드로 지칭)을 포함했다. ELISA 플레이트를 각 폴리펩티드로 코팅하고, 혈청 샘플을 1/2000의 희석에서 시험했다. 특이 항체 수준은 배경-보정 광학 밀도 값으로 표현했다.
PRRS 바이러스 접종에 대한 임상 반응은 전염성이 없는 또는 저도로 전염성이 있는 균주가 주어진 동물에서 관찰된 효과 부재 또는 최소한의 효과에서부터 MN 184로 투여된 동물의 약 50 퍼센트의 사멸까지 달랐다. 고도로 및 중등도로 전염성이 있는 균주로 접종된 동물의 항체 반응은 현저했다. 항체는 보통 감염 후 21일째에 처음으로 나타나고 28일째에 피크를 이루었다. 뉴클레오캡시드에 대한 항체의 수준은 28일 후에 급속히 감소되었으나, 기타 바이러스 폴리펩티드에 대한 반응은 실험의 끝에까지 고도의 수준으로 유지하려는 경향이 있었다. 비구조 폴리펩티드 NSP 1 및 NSP 2에 대한 항체 반응은 뉴클레오캡시드에 대한 반응 수준 만큼 또는 보다 높았으나, 바이러스 프로테아제를 코딩하는 NSP 4에 대한 반응은 모든 시점에서 낮았다.
바이러스 투여에 대한 체액성 반응은 모든 처리군에서 IDEXX-양성이었으나, 항체 반응의 강도에 있어서의 현저한 편차가 명백했다. 전염성이 없는 그리고 저도로 전염성이 있는 균주는 중등도 또는 고도로 전염성이 있는 균주와 비교시 보다 적게 강한 항체 반응을 유발했다. 상기 차이는 시험된 모든 항원에 대해 존재했다. 그러나, 면역유발에 대한 반응은 모든 처리군에서 유사했다.
요약하면, 다양한 구조 및 비구조 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 대한 항체 반응의 차이를 관찰했다. 또한, 약독화된 형태와 비교해서 PRRS 바이러스의 전염성이 있는 균주에 대한 항체 반응의 편차가 관찰되었다. 그러나, 항체 반응에서의 차이는 이종의 고도로 전염성이 있는 면역유발 균주로의 재감염에 대한 보호와 관련되지 않았다. 급성 감염 및 후속의 전염성이 있는 면역유발을 통해 상기 발견은 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 대한 항체 반응을 처음으로 특성화한다.
실시예 5 - 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드 대 시판되는 ELISA 키트를 사용한
PRRS 바이러스에 대한 항체 검출
IDEXX ELISA가 양성에서 음성으로 변하는 연장된 시간 및 복수의 노출 조건하에서 특정 폴리펩티드 ELISA가 PRRS 바이러스 양성 샘플을 검출할 수 있는지를 결정하기 위해 하기의 실험을 수행했다. PRRS-음성 6 개월령 숫돼지를 필드 균주 SD 28983 PRRS 바이러스의 102.5조직 배양 감염성 용량 50% (TCID50)로 초기에 주입하고, 그 후 1, 2, 4, 6 및 8개월에 걸쳐 총 6번의 접종을 했다. 동물을 각 접종 전에 채혈하고, 혈청을 수집했다. 혈액 샘플을 (1) 시판되는 PRRS 바이러스 ELISA (2XR PRRS 바이러스 항체 시험 키트; IDEXX 래보라토리즈) 또는 (2) 특정 PRRS 바이러스 폴리펩티드 함유 ELISA를 사용해 시험했다. IDEXX 2XR HerdChek(등록상표) ELISA를 1/40 희석된 혈청 샘플에 제조자의 지시에 따라 수행했다. 데이타는 각 군의 모든 샘플의 평균 및 표준 편차로 제시된다. 군의 크기는 군 당 23 마리 돼지로부터 19-23개 샘플로 다양했다.
IDEXX 키트를 사용해 분석된 동물의 약 반이 353일 시점에서 음성인 것으로 발견되었다 (표 3 및 도 10). 0.4 보다 큰 S/P 비는 샘플이 PRRS 바이러스에 대한 항체에 대해 양성인 것을, 0.4 보다 작은 S/P 비는 샘플이 PRRS 바이러스에 대한 항체에 대해 음성인 것을 지시했다.
IDEXX 키트를 사용한 샘플의 분석
일수 평균 S/P 양성 샘플의 수 음성 샘플의 수
0 0.124 0 22
29 1.273 22 1
59 1.033 20 1
132 0.697 17 2
270 0.629 18 4
353 0.480 11 11
재조합 GP5 엔도도메인 폴리펩티드 또는 재조합 GP5-M 키메릭 폴리펩티드를 ELISA에 사용해 동일한 샘플을 분석했다. 요약하면, 플레이트를 밤새 카보네이트 pH 9.6 중 웰 당 100 ng 폴리펩티드로 코팅했다. 혈청을 1/1000로 희석하고 이중으로 시험했다. GP5 엔도도메인 폴리펩티드 ELISA를 위해, 각 군내 모든 샘플의 비조정된 OD 값의 샘플/양성 비 및 0.21 보다 큰 (양성) 또는 작은 (음성) 평균을 가진 샘플의 수로 데이터를 제시했다. GP5-M 키메릭 폴리펩티드 ELISA를 위해, 각 군내 모든 샘플의 비조정된 OD 값의 샘플/양성 비 및 0.5 보다 큰 (양성) 또는 작은 (음성) 평균을 가진 샘플의 수로 데이터를 제시했다. 샘플/양성 비를 샘플 OD 빼기 항원이 없는 대조군 웰의 OD/양성 대조군 OD 빼기 항원 없는 대조군의 웰의 OD로서 결정했다.
두 샘플이 353일 시점에서 시험된 PRRS 바이러스 GP5 엔도도메인 폴리펩티드에 대한 항체에 대해 음성인 것으로 발견되었다 (표 4 및 도 11). GP5-M 키메릭 폴리펩티드가 사용될 때, 모든 시험된 샘플은 353일 시점에서 양성인 것으로 발견되었다 (표 5 및 도 12). 상기 결과는 GP5 폴리펩티드를 사용한 분석이 시판되는 IDEXX 키트가 검출하지 못하는 상황에서 항-PRRS 바이러스 항체를 검출할 수 있음을 증명했다.
ELISA에서 GP5 엔도도메인 폴리펩티드를 사용한 샘플의 분석
일 수 개월수 평균 S/P 양성 샘플의 수 음성 샘플의 수
0 0.000 0.123 0 22
29 1.000 0.565 23 0
59 2.000 0.374 19 2
132 4.400 0.360 15 4
270 9.000 0.537 23 0
353 11.800 0.576 20 2
ELISA에서 GP5-M 키메릭 폴리펩티드를 사용한 샘플의 분석
일 수 개월수 평균 S/P 양성 샘플의 수 음성 샘플의 수
0 0.000 0.333 0 22
29 1.000 1.929 21 2
59 2.000 1.722 20 1
132 4.400 2.157 19 0
270 9.000 3.378 23 0
353 11.800 3.318 22 0
실시예 6 - PRRS 바이러스 폴리펩티드의 혼합물 대
시판되는 ELISA 키트를 사용하는 PRRS 바이러스에 대한 항체 검출
군 당 10 마리의 이유 돼지를 각각 표 6에 나열된 바이러스 단리물 3.0 Log10 TCID50/mL 함유 조직 배양 배지 2 mL로 비강 내 접종했다. 풀은 여덟 단리물의 각각이 동일한 부분을 구성하는 혼합물이었다. 대조군은 조직 배양 배지 단독이었다.
PRRS 바이러스 단리물
단리물 군 번호 전염성
VR 2332 Ingelvac(등록상표)PRRS MLV* VR2332 JA 142 Ingelvac(등록상표)PRRS ATP* 142 SDSU 73 Abst- 1* SDSU 73 MN 184 17198 풀** 대조군 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 중등 약독화 고도 약독화된 JA 고도 약독화 고도 고도 고도 N/A
* 약독화된 PRRS 바이러스 단리물
** 여덟 단리물 모두를 함유하는 혼합물
IDEXX ELISA 키트를 재조합 폴리펩티드 ELISA와 비교하기 위해, 혈청을 접종 후 7일에 군 당 다섯 마리의 돼지로부터 맹검으로 선택했다. 다섯 샘플 중 네개를 14일째에 또 시험했다. IDEXX ELISA 키트에서, S/P 비 ≥0.4는 샘플이 양성이고, S/P 비 <0.4는 샘플이 음성임으로 지시했다. 동일한 샘플을 IDEXX ELISA 키트와 재조합 폴리펩티드 ELISA를 사용해 분석했다.
재조합 폴리펩티드 ELISA에서, 하기 폴리펩티드를 본원에서 기재한 바와 같이 발현하고 정제했다: ORF 7 폴리펩티드, ORF 5+6 키메릭 엑토도메인 폴리펩티드, NSP 2P 폴리펩티드, 및 ORF 5 3' 엔도도메인 폴리펩티드. 정제된 폴리펩티드 농도를 OD280 흡광도, 아질런트 바이오애널라이저 (Agilent bioanalyzer) 분석, SDS PAGE, 및 RC DC 라우리 단백질 분석에서의 일치에 의해 결정했다. 마이크로타이터 플레이트를 150 ng의 각 폴리펩티드로, 100 ㎕ 카보네이트, pH 9.6, 코팅 완충액 중 총 600 ng로 코팅했다. ELISA를 1/500 희석된 혈청 샘플에 수행했다. IDEXX ELISA에 의해 분석된 바와 같이 7 및 14일째 샘플은 동일한 샘플이다. 또한, 군 당 7 마리 동물(MN184 및 풀 군 중 5 마리)을 50일째에 분석했다. 대조군은 항상 음성이었다. 군 10의 일곱 마리 돼지를 시험했고 모든 시험일에 음성이었다.
IDEXX 키트 사용시 7일째에 수집된 시험 샘플 중 오직 하나만이 양성이었다(표 7). 또한, 14일째에 수집된 열세개의 샘플은 PRRS 바이러스 항체에 대해 음성이었다. 14일째에 수집된 36개 샘플 중 23개가 PRRS 바이러스 항체에 대해 양성이었다.
IDEXX ELISA 키트로의 결과
일 수 평균 S/P 양성 샘플의 수 음성 샘플의 수
7 0.116374 1 44
14 0.753558 23 13
대조적으로, PRRS 바이러스 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 ELISA를 사용해 분석시 7일째에 수집된 45개 샘플 중 14가 양성이었다 (표 8). 또한, 14일째에 수집된 36개 샘플 중 8개만이 PRRS 바이러스 항체에 대해 음성이었다. 14일째에 수집된 36개 샘플 중 28개가 PRRS 바이러스 항체에 대해 양성이었다. 또한, 50일째에 수집된 59개 샘플 중 54개가 PRRS 바이러스 항체에 대해 양성이었다 (표 8).
PRRS 바이러스 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 ELISA로의 결과
일 수 평균 S/P 양성 샘플의 수 음성 샘플의 수 커트오프 값
7 0.558178 14 31 0.4
14 1.549222 28 8 0.4
50 3.024511 54 5 0.55
상기 결과는 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 혼합물이 PRRS 바이러스 노출 시점과 관련해서 초기 뿐만 아니라 후기에 PRRS 바이러스에 노출된 동물에서 PRRS 바이러스 항체를 검출하는데 사용될 수 있음을 증명했다. 예를 들어, 양성 샘플을 PRRS 바이러스 노출 후 7, 14, 및 50일에 검출했다.
각 군에 대한 샘플을 또한 본원에서 기재된 바와 같이 얻은 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드로 ELISA를 사용해 시험할 수 있었다 (도 18).
실시예 7 - PRRS 바이러스의 필드 균주 또는 백신에 노출된 동물 사이의 구별
Ingelvac MLV (RespPRRS으로도 지칭; GenBank 등록번호 AF066183)로 백신접종 후 28일에, 혈청 샘플을 5 마리 돼지로부터 얻고, 1/300으로 희석하고, PRRS 바이러스 VR2332주 유래 5' 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드, PRRS 바이러스 단리물 MN30100 유래 5' 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드, PRRS 바이러스 VR2332주 유래 3' 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드 또는 PRRS 바이러스 단리물 MN30100 유래 3' 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드 200 ng로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 이중으로 분석했다. PRRS 바이러스 단리물 MN30100로 접종된 후 28일에, 혈청 샘플을 5마리 돼지로부터 얻고 동일한 방식으로 분석했다. PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드의 5' 엑토도메인은 PRRS 바이러스 단리물 간에 변하는 아미노산 서열을 함유하는 반면, PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드의 3' 엔도도메인은 PRRS 바이러스 단리물 간에 보존되는 아미노산 서열을 함유한다.
3' 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드 (VR2332 유래 3' 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드 또는 MN30100 유래 3' 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드)를 함유하는 ELISA는 PRRS 바이러스의 백신 균주 (Ingelvac MLV) 또는 필드 단리물 (MN30100)에 노출된 동물 유래 샘플 중에서 PRRS 바이러스 항체를 검출했다 (표 9 및 도 13). 상기 결과는 PRRS 바이러스의 백신 버전 유래이든 또는 야생형 버전 유래이든 PRRS 바이러스 간에 보존된 PRRS 바이러스 서열에 한정된 폴리펩티드가 임의 유형의 PRRS 바이러스(예컨대, PRRS 바이러스의 백신 버전 또는 야생형 버전)에 노출된 동물을 검출하는데 사용될 수 있음을 증명했다.
PRRS 바이러스 Ingelvac MLV 또는 MN30100에 노출되고 PRRS 바이러스 Ingelvac MLV 또는 MN30100 유래 폴리펩티드 단편과 반응된 돼지 유래 혈청 샘플의 ELISA 결과
ELISA 용 폴리펩티드 동물이 노출된 바이러스 평균* 표준 편차 SEM
5' ORF 5(VR2332) MN30100 0.009 0.05303 0.037
MLV 1.443 0.11172 0.079
5' ORF 5(MN30100) MN30100 0.946 0.22273 0.157
MLV 0.193 0.00636 0.004
3' ORF 5(VR2332) MN30100 1.985 0.26269 0.185
MLV 2.336 0.19940 0.141
3' ORF 5(MN30100) MN30100 1.726 0.27930 0.197
MLV 1.932 0.42426 0.300
*데이타는 배경 삭감 후의 특이 OD 값임
VR2332 유래 5' 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드를 함유하는 ELISA는 백신 균주 (Ingelvac MLV)에 노출된 동물로부터 얻은 샘플 중의 PRRS 바이러스 항체를 검출하고 PRRS 바이러스의 필드 단리물(MN30100)에 노출된 동물로부터 얻은 샘플 중의 PRRS 바이러스 항체를 검출하지 않았다(표 9 및 도 13). 유사하게, MN30100 유래 5' 엑토도메인 ORF 5 폴리펩티드를 함유하는 ELISA는 PRRS 바이러스의 필드 단리물(MN30100)에 노출된 동물로부터 얻은 샘플 중의 PRRS 바이러스 항체를 검출하고 백신 균주 (Ingelvac MLV)에 노출된 동물로부터 얻은 샘플 중의 PRRS 바이러스 항체를 검출하지 않았다(표 9). 상기 결과는 PRRS 바이러스 간에 변하는 PRRS 바이러스 백신 버전 유래 PRRS 바이러스 서열에 한정된 폴리펩티드가 야생형 버젼의 PRRS 바이러스에 노출된 동물에 비해 백신 버전의 PRRS 바이러스에 노출된 동물을 확인하는데 사용될 수 있음을 증명했다.
실시예 8 - 백신 균주 및 필드 단리물 유래 추가
재조합 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 제조
하기 폴리펩티드를 제조했다: PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드 (도 26), PRRS 바이러스 NSP 2HP 폴리펩티드 (도 27), PRRS 바이러스 NSP 2 Sl HP 폴리펩티드 (도 28), PRRS 바이러스 NSP 2 S2 HP 폴리펩티드 (도 29), PRRS 바이러스 제1 및 제2 N-말단 엑토도메인 ORF 6 폴리펩티드 (ORF 6 5' total; 도 30), 및 PRRS 바이러스 엔도도메인 ORF 6 폴리펩티드 (ORF 6 3'; 도 31). 각 경우, 폴리펩티드는 하나의 myc 서열 후 PRRS 바이러스 서열 후 폴리히스티딘 서열을 함유했다. 상기 폴리펩티드의 PRRS 바이러스 서열을 코딩하는 핵산은 PRRS 바이러스 VR-2332주 중의 뉴클레오티드 서열 (GenBank 등록번호 PRU87392)로부터 얻었다. 또한, myc-ORF 7-His 폴리펩티드, myc-ORF 5 3'-His 폴리펩티드, myc-ORF 6 3'-His 폴리펩티드, 및 myc-NSP 2-His 폴리펩티드를 제조했다. 상기 폴리펩티드의 PRRS 바이러스 서열을 코딩하는 핵산은 PRRS 바이러스의 렐리스타드 (Lelystad) 바이러스 (LV) 균주 중의 뉴클레오티드 서열로부터 얻었다 (GenBank 등록번호 M96292). myc-NSP 2 HP-His 폴리펩티드도 제조했다. 상기 폴리펩티드의 PRRS 바이러스 서열을 코딩하는 핵산은 베링거 잉겔하임 (Boehringer Ingelheim) 백신 균주 ATP 중의 뉴클레오티드 서열로부터 얻었다. PRRS 바이러스 JA142주를 위한 GenBank 등록번호 AY424271이 ATP 서열을 얻기 위해 사용되었는데, PRRS 바이러스 JA 142주가 베링거 잉겔하임 백신 균주 ATP의 모체 바이러스 균주이기 때문이다.
VR-2332의 PRRS 서열 함유 폴리펩티드를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제작했다. PRRS 바이러스 LV주 또는 ATP주의 서열 함유 플라스미드를 위해, 바이러스를 수크로스 구션을 통해 원심분리하여 세포 배양 용리물로부터 단리했다. 바이러스 RNA를 키아젠(Qiagen) 키트로 추출했다. 프라이머를 필요 제한 부위를 함유하고 원하는 서열을 증폭하기 위해 고안했다. PCR 생성물을 키아젠 PCR 정제 키트로 정제하고 pGEM-T 벡터에 결찰했다. 플라스미드를 이. 콜라이 DH5α에서 증폭하고, 정제하고, BamHI 및 Xhol로 절단했다. 삽입물을 정제하고 pET 24b myc His 벡터내로 재클로닝했다.
재조합 폴리펩티드를 플라스미드로부터 BL21 (DE3)-RP 세포 중에 발현했다. 형질전환 후, 세포를 카나마이신 (30 ㎍/mL) 및 클로람페니콜 (35 ㎍/mL) 함유 LB 아가 플레이트에 평판하고 밤새 37 ℃에서 배양했다. 단일 콜로니를 골라 상기와 같이 카나마이신 및 클로람페니콜 함유 20 mL 2xYT 배지에서 성장시키고 225 rpm에서 진탕시켜 밤새 배양했다. 20 mL 배양물을 30 ℃에서 항생제를 갖는 1 리터 2xYT 배지에 전이하고 OD600가 0.3에 도달할 때까지 진탕했다. IPTG를 1 mM로 첨가하고, 플라스크를 30 ℃에서 4 내지 5 시간 진탕했다. 200 ㎕ 배양물을 겔 분석을 위해 제거했다.
잔존 배양물을 4000xg에서 20 분간 4℃에서 원심분리하여 박테리아를 펠렛화시켰다. 펠렛을 30 mL 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, 8 M 우레아, pH 8.0에 재현탁했다. PMSF를 1 mM로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 부드럽게 회전시켰다. 혼합물을 10,000xg에서 30 분간 4℃에서 원심분리하여 세포 잔해를 펠렛화시켰다. Ni-NTA 아가로스 (키아젠, 캘리포니아주 발렌시아 소재)의 6 mL 50% 슬러리를 변성된 단백질을 함유하는 상층액에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 부드럽게 회전했다. 그 후 혼합물을 유리 칼럼 1.5 cm ID x 40 cm에 정치하고 탈수했다. 칼럼을 20 mL 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, 8 M 우레아, pH 6.3로 두번 세척했다. 재조합 단백질을 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, 8 M 우레아, pH 5.5-5.7의 3-4개 4-mL 분취액으로 용리했다. 단백질을 -20℃에서 리폴딩시 까지 저장했다.
합한 단백질 용액에 231.3 mg 디티오트레이톨을 첨가하고 2 시간 동안 부드럽게 교반하여 단백질을 리폴딩했다. 그 후, 용액을 500 mL 리폴딩 완충액 (100 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 M L-아르기닌, 8 mM 산화 글루타티온, 2 mM EDTA, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 루펩틴, 1 mM PMSF)에 신속히 희석시키고 밤새 부드럽게 4℃에서 교반했다. 단백질을 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration) (펠리콘 (Pellicon) XL 울트라셀 (Ultracel) PLC 5 kd, 밀리포어 (Millipore), 메사츄세츠주 베드포드 소재)에 의해 재농축하고 10 mM Na 포스페이트, pH 8.0에 대해 밤새 4℃에서 투석했다 (Spectra/Por MWCO 3,000). 용액을 원심분리에 의해 3,800 rpm에서 30분간 4℃에서 필요시 농축했다(센트리프렙 (Centriprep), 밀리포어)). 단백질을 -80℃에서 분취액으로 저장했다. 단백질 농도 및 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 평가했다.
실시예 9 - 북아메리카 및 유럽 유전자형 중의 하나 또는 모두 유래의 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 혼합물을 사용한 북아메리카 및 유럽 유전자형 PRRS 바이러스에 대한 항체 검출
(1) 북아메리카 유형 PRRS 바이러스 (예컨대, VR-2332) 유래 폴리펩티드를 사용한 ELISA가 유럽 유형 PRRS 바이러스 (예컨대, 렐리스타드 바이러스)로 접종된 돼지 유래 PRRS 바이러스 양성 샘플을 검출할 수 있는지를 결정하기 위해 (2) 유럽 유형 PRRS 바이러스 (예컨대, 렐리스타드 바이러스) 유래 폴리펩티드를 사용한 ELISA가 북아메리카 유형 PRRS 바이러스 (예컨대, VR-2332)로 접종된 돼지 유래 PRRS 바이러스 양성 샘플을 검출할 수 있는지를 결정하기 위해 하기의 실험을 수행했다. 북아메리카 및 유럽 유형 바이러스 유래 폴리펩티드들의 조합을 사용한 ELISA가 바이러스 유형 둘 중의 하나로 감염된 돼지 유래 PRRS 바이러스 양성 샘플을 검출할 있는지 결정하기 위해 하기의 실험을 또한 수행했다.
15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6 중의 하기 폴리펩티드를 사용하여 ELISA 플레이트 (COSTAR 3590, 96 웰 EIA/RIA 플레이트, 뉴욕주 코닝 소재)를 코팅했다: myc-ORF 7-His (VR-2332), myc-ORF 6 3'-His (VR-2332), myc-ORF 5 3'-His (VR-2332), myc-ORF 7-His (LV), myc-ORF 6 3'-His (LV), 및 myc-ORF 5 3'-His (LV). 상기 폴리펩티드를 ORF 7 (N), ORF 6 (M), 또는 ORF 5 (GP5)의 모두 또는 일부를 함유하는 각각의 플라스미드로부터 발현했다. 3개 VR-2332 폴리펩티드의 각 100 ng/100 ㎕ 또는 3개 LV 폴리펩티드의 각 100 ng/100 ㎕, 또는 6개 폴리펩티드 모두의 각 50ng/100 ㎕를 함유하는 용액으로 웰을 코팅했다. 따라서, 모든 웰이 300 ng의 폴리펩티드를 함유했다.
플레이트를 코팅 용액과 밤새 4℃에서 인큐베이팅했다. 플레이트 웰을 PBS, 0.05% Tween 20, pH 7.3-7.5로 한번 세척하고 웰 당 PBS, 0.05% Tween 20, pH 9.4-9.6 중의 300 ㎕ 5% 탈지 건조 우유로 2시간 동안 블로킹했다. 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20, pH 7.3-7.5로 5번 세척하고, PBS, 0.05% Tween 20, 5% 탈지 건조 우유 중에 1/500 희석된 시험 혈청 100 ㎕를 1 시간 동안 이중 웰에 첨가했다. 플레이트를 5번 세척하고, PBS, 0.05% Tween 20, 5% 탈지 건조 우유 중에 1/5000 희석된 돼지 IgG (H+L) (KPL, 메릴랜드주 게티스버그 소재)에 대한 퍼옥시다아제-라벨링된 친화도 정제된 항체 100 ㎕를 1 시간 동안 첨가했다. 플레이트를 5번 세척하고, 효소 기질을 5분간 첨가했다. 효소 기질은 웰 당 100 ㎕의 동량의 TMB 퍼옥시다아제 기질 용액 A 및 퍼옥시다아제 H2O2 기질 용액 B (TMB 퍼옥시다아제 기질 시스템, KPL, 메릴랜드주 게티스버그 소재)이 서로 혼합된 것으로 구성되었다. 반응을 100 ㎕ 2 M 인산을 가해서 정지하고, 결과를 450 nm에서 써모 맥스 마이크로플레이트 리더 (Thermo Max Microplate Reader, 몰레큘라 디바이스)로 판독했다.
감염되지 않은 (음성 혈청 A 및 음성 혈청 B), 유럽 유형 PRRS 바이러스로 감염된 (n=9), 및 두개의 북아메리카 PRRS 바이러스 균주, MN 184주 또는 SDSU 73주 (Johnson et al, Vet. Immunol. Immunopathol, 102:233-247 (2004)) 중의 하나로 감염된 (각기 n=l) 돼지로부터 혈청 샘플을 얻었다. 샘플을 감염 후 대략 0, 7, 14, 21, 28, 35, 및 49 일째에 얻었다. VR-2332 폴리펩티드 혼합물은 감염 후 14일째 그리고 그 이후 모든 시점에서 MNl 84 또는 SDSU 73에 노출된 돼지의 혈청 중의 항-PRRS 바이러스 항체를 검출했다(도 32; 패널 A). VR-2332 폴리펩티드는 유럽 PRRS 바이러스로 감염된 돼지 중에서 항-PRRS 바이러스 항체를 검출하지 않았다.
LV 폴리펩티드의 혼합물은 감염 후 7일째 그리고 그 이후 모든 시점에서는 고도 수준으로 유럽 유형 PRRS 바이러스에 노출된 돼지의 혈청 중의 항체를 검출했다 (도 32; 패널 B). LV 폴리펩티드 또한 14일째에 그리고 그 후에 북아메리카 PRRS 바이러스에 노출된 돼지에서 항체를 검출했다 (도 32; 패널 B). LV 및 VR-2332 폴리펩티드의 조합은 LV 폴리펩티드 단독과 유사하게 노출된 돼지의 혈청 중의 항-PRRS 바이러스 항체를 검출하였으나, MN 184에 노출된 동물 중에서 보다 높은 수치를 갖는 경향이 있었다 (도 32; 패널 C).
상기 결과는 LV 폴리펩티드들, 예를 들면 ORF 5 3', ORF 6 3', 및 ORF 7 폴리펩티드의 혼합물이 감염 후 빠르면 7일째에 유럽 및 북아메리카 유전자형 PRRS 바이러스에 노출된 돼지에서 항체 반응을 검출할 수 있음을 지시한다. VR-2332 폴리펩티드는 북아메리카 유형 PRRS 바이러스에 노출된 돼지의 혈청을 특이적으로 인지하고, 유럽 유형 바이러스에 노출된 돼지 유래 혈청을 인지하지 않았다. 따라서, 폴리펩티드의 적절한 혼합물로, 모든 PRRS 바이러스에 대한 혈액학적 반응을 검출할 수 있고 북아메리카 및 유럽 유형 간의 구별이 가능하다.
실시예 10 - 비구조 단백질 폴리펩티드를 사용한 PRRS 바이러스의 백신 또는
필드 균주에 노출된 동물 간의 구별
PRRS 바이러스에 대한 돼지 항체 반응이 N과 같은 구조 단백질 보다 비구조 단백질에서 클 수 있음을 실시예 4가 증명했다. NSP의 검출이 보다 민감한 분석을 가능케 할지 모르므로, PRRS 바이러스의 VR-2332 또는 Ingelvac ATP 백신 균주 유래 비구조 단백질로부터 유래된 폴리펩티드로 구성된 ELISA가 PRRS 바이러스의 필드 균주에 노출된 돼지로부터 Ingelvac ATP주 또는 Ingelvac MLV주로 백신접종된 돼지를 구별할 수 있는지를 결정하기 위해 하기의 시험을 수행했다. 다양한 폴리펩티드를 NSP 2 일부를 함유하도록 제조했다(도 33).
첫번째 실험에서, 28일 간 필드 바이러스 또는 Ingelvac MLV 백신 바이러스에 노출된 돼지 유래 혈청 샘플을 myc-NSP 2 P-His (VR-2332) 또는 myc-NSP 2HP-His (VR-2332) 폴리펩티드로 코팅된 마이크로타이터 플레이트내에서 인큐베이팅했다. VR-2332주로부터 유도된 MLV 백신으로 접종된 돼지 유래 혈청은 myc-NSP 2P-His 및 myc-NSP 2 HP-His 폴리펩티드 모두와 강하게 반응했다. 일곱 마리 돼지 유래 1/1000로 희석된 혈청 샘플 중의 양성 신호는 NSP 2P에 대해 0.8 내지 3.6 OD 단위이고 NSP 2HP에 대해 0.7 내지 3.1 OD 단위이었다. 배경 삭감 후 상대 퍼센트 차이 (1-(ODNSP 2HP/ODNSP 2P))는 9.9 내지 23.2 퍼센트이었다. 대조적으로, 5개의 상이한 야생형 필드 바이러스 중의 임의와 접종된 돼지 유래 혈청은 myc-NSP 2HP-His 폴리펩티드 보다 myc-NSP 2P-His 폴리펩티드와 더 강하게 반응했다. 5 개의 상이한 바이러스에 노출된 35 마리의 돼지 중 양성 신호는 NSP 2P에 대해 0.54 내지 3.3 OD 단위이고 NSP 2HP에 대해 0.22 내지 1.9 OD 단위이었다. 상대 퍼센트 차이는 36.6 내지 85.1 퍼센트이었다.
상기 결과는 NSP 2HP (VR-2332) 폴리펩티드가 기타 PRRS 바이러스 NSP 2HP 폴리펩티드와 상이한데, 그의 유도된 백신 바이러스, MLV가 NSP 2HP (VR-2332) 폴리펩티드와 선택적으로 반응하는 돼지 중 항체를 유발함을 지시한다. 또한, NSP 2P (VR-2332)로 필드 바이러스 노출된 돼지 유래 혈청 샘플의 현저한 반응도는 상기 폴리펩티드가 진단 폴리펩티드로서 이용될 수 있음을 지시한다. MLV 백신 용 NSP 2 HP 폴리펩티드의 상대 특이성은 VR-2332 NSP 2P 및 NSP 2HP 모두에 대한 시험 혈청의 상대 혈액학적 반응도를 비교하는 시험이 필드 바이러스에 노출된 돼지로부터 Ingelvac MLV로 백신접종된 돼지를 구별할 수 있음을 지시한다.
두번째 실험에서, GenBank 중 PRRS 바이러스 서열 간에 아미노산 서열 변이를 보이는 NSP 2 (VR-2332) 폴리펩티드의 추가 부분을 이전 실험에서와 같이 필드 바이러스 또는 Ingelvac MLV 백신에 노출된 돼지 유래 혈청과의 특이 반응도에 대해 평가했다. ELISA 플레이트를 myc-NSP 2P-His (VR-2332) 폴리펩티드 또는 myc-NSP 2 Sl HP-His (VR-2332) 또는 myc-NSP 2 S2 HP-His (VR-2332) 폴리펩티드로 코팅했다.
백신접종된 및 필드 바이러스-노출된 동물 유래 모든 돼지 혈청을 1/1000로 희석되고 (n=42), 상기한 바와 같이 고도의 OD 값을 갖는 NSP 2P와 반응시켰다. 그러나, 혈청은 NSP 2 S1 HP 및 NSP 2 S2 HP 모두와 약하게 반응했다. 샘플의 90% 초과의 OD 값은 0.1 미만이었다. 상기 결과는 약 30 내지 40개의 아미노산으로 된 폴리펩티드가 폴리펩티드 중의 아미노산 서열의 높은 변이도에도 불구하고 바이러스 감염에 대한 상이한 혈액학적 반응도를 구별하기에 충분한 면역반응도를 포함하지 않을 수 있음을 지시한다.
세 번째 실험에서, 마이크로타이터 플레이트를 실시예 9에 기술된 바와 같이myc-NSP 2HP-His (ATP) 또는 myc-NSP 2P-His (VR-2332) 폴리펩티드로 코팅했다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 백신 및 필드 바이러스에 노출된 돼지 유래 혈청 샘플로 ELISA 분석을 수행했다. 혈청 샘플을 1/1000으로 희석하고, 발색 반응을 3분 후에 정지한 것을 제외하고는 실시예 9에 기재된 바와 같이 검정법을 수행했다. 본원에 기재된 바와 같이, 필드 바이러스 또는 MLV 백신에 노출된 돼지 유래 혈청 샘플은 NSP 2P (VR-2332)와 양성으로 반응했다 (도 34). Abst-1 또는 백신 균주 ATP에 노출된 돼지 유래 혈청은 낮거나 무시될 수 있는 면역 반응을 유발하는 용량으로 사용함으로 인해 양성으로 반응하지 않았다. NSP 2HP (ATP) 폴리펩티드는 백신의 모체 바이러스인 JA142에 노출된 돼지 유래 혈청과 강하게 반응하나, 필드 바이러스 SDSU73 및 17198-6에 노출된 돼지 유래 혈청과도 반응했다. 상기 결과는 비구조 폴리펩티드, 예를 들면 상이한 PRRS 바이러스 균주, 예를 들면 Ingelvac ATP주 및 VR-2332주 유래 NSP 2HP 및 NSP 2 P의 사용이 특정 균주 또는 단리물에 대한 돼지의 노출에 특이적인 혈액학적 시험을 초래하지 않음을 증명했다. NSP 2HP (VR-2332)와 달리, NSP 2HP (ATP) 폴리펩티드는 기타 PRRS 바이러스 NSP 2 HP 폴리펩티드와 특유하게 상이하지 않을 수 있다.
실시예 11 - 배경 신호 감소시키는 블로킹 단계 동안의 pH 증가
ELISA 시험 중 고도의 비특이적 배경은 돼지 혈액학 연구, 예를 들면 6 개월 이상된 나이든 동물로부터의 저도 희석된 혈청에서 특히 일반적으로 일어나는 문제이다. 양성 및 음성 돼지 혈청의 특이 및 비특이 반응도의 수준을 pH 7.4 또는 9.6에서 블로킹된 ELISA 플레이트 상에서 결정했다. 웰을 동량의 N, ORF 5 및 ORF 6 엑토도메인, 및 ORF 5 엔도도메인 (모두 VR-2332 유래)으로 0 내지 300 ng/웰로 코팅하고, 양성 및 음성 혈청을 1/40 내지 1/4000로 희석했다. 양성 혈청 샘플을 7 주령 돼지로부터 VR-2332 노출 3주 후에 얻었다. 음성 혈청 샘플을 6 개월령 돼지로부터 얻었다. PBS, 0.05% Tween 20 (pH 7.4 또는 9.6) 중의 5% 탈지 건조 우유로 블로킹을 수행했다.
혈청 농도-의존성 발색을 pH 7.4에서 PRRS 바이러스-양성 혈청에서 관찰했으나, PRRS 바이러스-음성 혈청 웰 중의 비특이 발색은 플레이트 상에서 중등도 및 저도의 항원에서의 특이 반응도 보다 조차 높았다 (도 35). 블로킹 pH 값 9.6에서, 비특이 반응도는 거의 완전히 소실되었다. 특이 반응도는 약 50 퍼센트 감소되었으나, 총 신호-대-노이즈 비는 크게 증가했다 (도 35).
상기 결과는 중성 pH에서 ELISA 플레이트에 도포된 블로킹 용액 (예컨대, 단백질 용액)이 단백질-결합 능력을 완전히 중성화하지 못하여 돼지 이뮤노글로불린의 비특이 결합 및 고도의 OD 값을 초래함을 지시한다. 상기 문제는 원래 검정법의 민감도를 증가시키는 저도의 혈청 희석에서 더욱 심하다. 블로킹 용액의 pH를 7.4 초과로 증가시킴 (예컨대, 9 초과)은 넓은 범위의 항원 코팅 양 및 혈청 희석도에 걸쳐 비특이 반응도를 감소시키거나 소실시켰다.
실시예 12 - 재조합 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 제조
하기의 폴리펩티드를 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방법 및 재료를 사용해 제조했다: PRRS 바이러스 (렐리스타드주) ORF 7 폴리펩티드 (도 36), PRRS 바이러스 (렐리스타드주) NSP 2P 폴리펩티드 (도 37), PRRS 바이러스 (JA 142주) NSP 2P 폴리펩티드 (도 38), PRRS 바이러스 (ATP주) NSP 2HP 폴리펩티드 (도 39), PRRS 바이러스 (렐리스타드주) 엔도도메인 ORF 5 폴리펩티드 (ORF 5 3'; 도 40), 및 PRRS 바이러스 (렐리스타드주) 엔도도메인 ORF 6 (ORF 6 3'; 도 41) 폴리펩티드.
실시예 13 - 코팅 완충액에 리소자임 첨가가 뉴클레오캡시드에 대한
반응도를 증가시킴
재조합 폴리펩티드로 웰을 코팅함에 있어서, 리소자임을 대조군으로서 포함했다. 요약하면, ELISA 웰을 100 ㎕ 카보네이트 완충액 중의 100 ng 폴리펩티드 (예컨대, 리폴딩된 myc-ORF 7-His 폴리펩티드) 단독 또는 다양한 양의 계란 리소자임 (시그마)으로 코팅했다. PRRS 바이러스 VR2332주으로 감염된 지 21일 후의 두 마리의 돼지 유래 혈청 샘플 또는 두개의 비감염된 대조군 돼지 혈청에 ELISA를 수행했다.
myc-ORF 5-3'-His 폴리펩티드 및 비-리폴딩된 myc-ORF 7-His 폴리펩티드를 비롯한 다양한 재조합 폴리펩티드로 플레이트를 코팅시 다양한 농도의 리소자임의 존재 또는 부재하에 발색 반응의 강도에 어떠한 차이가 관찰되지 않았다. 유사하게, 리소자임 단독으로는 반응이 관찰되지 않았다. 그러나, 리폴딩된 myc-ORF 7-His 폴리펩티드 반응은 리소자임의 존재하에서 상당히 증가했다. 더욱이, 향상된 정도가 첨가된 리소자임의 양에 비례했다 (도 42). 코팅 단계에서의 리소자임의 포함은 웰 당 최대 약 200 ng 리소자임 까지 용량-의존적으로 면역 PRRS 바이러스혈청의 특이 반응도를 증가시켰다.
효과는 검사된 모든 혈청 희석물에서 관찰되었고, 보다 큰 효과가 덜 희석된 혈청에서 관찰되었다. 혈청의 1/300 희석물에서, 평균 특이 흡광도는 리소자임의 부재하에 약 0.42이나, 164 ng 이상의 리소자임 존재하에 1.0 초과였다. 리소자임의 향상 효과를 또한 웰 당 20 내지 500 ng를 포함하는 다양한 코팅 양의 리폴딩된 myc-ORF 7-His 폴리펩티드로도 관찰했다. 웰 당 약 100 ng 리소자임이 예를 들어, 1:40 내지 1:5000의 시험 혈청 희석, 45 분 내지 90 분 동안의 항원과의 시험 혈청의 인큐베이션, 1:500 내지 1:5000의 제2 항체 컨쥬게이트의 희석, 2분 내지 20분 동안의 발색 반응 시간을 비롯한 다양한 조건 하에 향상된 결과를 제공했다. 리소자임이 ORF 7 폴리펩티드에 대한 특이 항-PRRS 혈액학적 반응도를 향상시킨다는 발견은 ORF 7 폴리펩티드가 PRRS 바이러스의 주된 항원이고 혈액학적 시험에 널리 사용되므로 유용하다. 항-ORF 7 폴리펩티드 항체의 검출 민감도를 증가시키는 조건은 PRRS 바이러스에 대한 조기 감염 또는 노출에 대한 진단 검정법의 민감도를 증가시킬 수 있고, 노출 또는 혈액변환 후의 검출 기간을 증가시킬 수 있고, 양성 및 음성 결과 차이를 증가시킬 수 있으므로 보다 강한 시험의 기초를 제공할 수 있다.
실시예 14 - 재조합 바이러스 단백질-기재 ELISA의 증가된 안정성
상업적 돼지-사육장에서 임신한 암돼지 중에서의 PRRS 바이러스에 대한 사전 노출을 검출하기 위한 재조합 폴리펩티드의 능력을 IDEXX 2XR ELISA과 비교해 평가했다. 풍토적으로 감염된 무리 중의 32 마리의 임신한 암돼지 유래 혈청을 35일 간격으로 얻고 항-PRRS 바이러스 항체에 대해 IDEXX 2XR ELISA 및 3개의 재조합 PRRS 바이러스 폴리펩티드의 조합 (ORF 7, ORF 5-3', 및 ORF 6-3', 모두 VR2332주), 또는 VR2332주 유래 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드 (ORF 5+6 엑토도메인 키메라, NSP 1, 및 NSP 2P) 또는 랠리스테드 바이러스 균주 유래 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드 (NSP 2P; 도 37)에 대한 ELISA 반응도로 시험했다. 요약하면, 1/500로 희석된 혈청 샘플을 50 ng ORF 5+6 키메라 단독, 또는 ORF 7, ORF 5-3' 및 ORF 6-3' (각기 33 ng)의 조합 100 ng, 또는 100 ng NSP 1, 또는 100 ng NSP 2P로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 이중으로 수행했다. 혈청 샘플을 또한 IDEXX 2XR ELISA로 분석했다. 각기 ELISA 분석에 대해, 평균 흡광도 값 차이 (35일-0일)을 32 마리의 모든 돼지에 대해 계산하고 양성 내지 음성으로 정렬했다. 데이타의 각 세트에 대해, 가정적인 선형 회귀 식 및 회귀 계수를 계산했다. 결과 값을 모든 32 마리 동물에 대해 각 재조합 폴리펩티드 제조물에 대해 가장 높은 것에서부터 가장 낮은 것까지 정렬했다(도 43).
각 경우, 양성 (중간일 0일 보다 중간일 35일에 높은 값) 내지 음성 (중간일 0일 보다 중간일 35일에 낮은 값)의 범위 값을 얻었다. 항체 수준과 관련하여 동물 중에서 가장 큰 편차 (잔차의 표준 편차[standard deviation of the residuals] = 0.55)가 양성 및 음성 모두에서 IDEXX 2XR ELISA 시험에서 일어났다 (도 43). 가정적 회귀 분석에서 선의 기울기가 0에 더 가깝고 가장 높은 반응과 낮은 반응의 편차가 감소하는 것으로 보아, 재조합 폴리펩티드 ELISA가 더 균일한 결과를 보였다 (도 43). 각 경우에 선형 회귀 식의 기울기가 0에 더 가깝고 잔차의 표준 편차가 더 작은 것으로 보아, 상기 결과는 IDEXX 2XR ELISA에 비해 평균적으로 더 균일한 것이었다. 가장 일치하는 결과는 랠리스테드 바이러스 유래 NSP2P로 얻어졌다.
35일간의 검정법 결과의 큰 차이는 반응도에서 큰 감소를 보이는 동물의 면역성 손실로서, 그리고 반응도의 큰 증가의 경우에 영향받기 쉬운 동물의 신규한 감염으로서 해석될 수 있다. 개별 동물 및 상업용 돼지 집단의 PRRS 바이러스 상태에 대한 오류적인 양성 및 음성 해석이 증가될 가능성이 있음은 일치한다. 재조합 폴리펩티드 ELISA 검정법은 PRRS 바이러스에 대한 동물의 노출과 일치하는 동물 반응에 있어서의 보다 적은 편차, 동물에서의 면역 반응의 존재, 35일 간의 동물의 항체 상태에서의 소량 변화를 보였다. 개별 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 조합에 기초한 재조합 폴리펩티드 ELISA가 PRRS 바이러스에 대한 무리의 노출에 대한 보다 균일한 평가를 제공할 수 있고, 오류적인 양성 및 음성 해석의 가능성을 감소시킬 수 있음을 상기 결과는 지시한다.
실시예 15 - 북아메리카 및 유럽 유전자형 유래 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드를 사용한 북아메리카 및 유럽 유전자형 PRRS 바이러스에 대한 항체의 검출
실시예 9에 기술된 혈청 샘플 및 재조합 PRRS 바이러스 ORF 7 (랠리스테드 바이러스 유래, 유럽 유전자형; 도 36) 및 NSP2P (VR2332 유래, 북아메리카 유전자형; 또는 랠리스테드 바이러스, 도 37) 폴리펩티드를 사용하여 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 대한 반응의 특이성을 검사했다. 유럽 유전자형 PRRS 바이러스 및 북아메리카 유전자형 바이러스, MN184로 접종된 돼지 유래 혈청 샘플은 랠리스테드 바이러스 ORF 7 폴리펩티드와 강하게 반응하는 반면, 북아메리카 유전자형 균주 SDSU73, VR2332, 및 Ingelvac MLV은 약하게 반응했다 (도 44). 랠리스테드 바이러스의 ORF 7 폴리펩티드가 유럽 PRRS 바이러스 균주뿐만 아니라 북아메리카 PRRS 바이러스의 서브세트에 대한 혈액학적 반응을 구별하는데 사용될 수 있음을 상기 결과는 지시한다. 유럽 유전자형 PRRS 바이러스로 접종된 돼지 유래 혈청 샘플은 LV NSP 2P 폴리펩티드와 독점적으로 반응하고 VR2332 NSP 2P 폴리펩티드와 전혀 반응하지 않았다 (도 44, 패널 B 및 C). VR2332 NSP 2P 폴리펩티드는 VR2332에 노출된 돼지 유래 혈청과 강하게 반응하고, 양성적이나 덜 강하게 Ingelvac MLV 및 SDSU73에 노출된 돼지 유래 혈청과 반응하였다. MN184에 노출된 돼지 유래 혈청과는 전혀 반응하지 않는 것으로 보였다. 개별 PRRS 바이러스 폴리펩티드는 PRRS 바이러스의 서브세트에 노출된 돼지의 혈액학적 반응을 검출할 수 있는 것을 상기 결과는 지시한다.
기타 태양
본원이 상세한 설명과 관련되어 기술되었으나, 상기 기재는 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정되는 본원의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위함임을 이해할 것이다. 기타 측면, 장점 및 변형이 하기 청구항의 범위 내에 속한다.
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ctg aac acc gtc 273 Ser Gly Ser Gly Ala Phe Arg Thr Arg Lys Pro Ser Leu Asn Thr Val 20 25 30 aat gtg atc ggg tcc tcc atg ggc tct ggc ggg gtg ttt acc atc gac 321 Asn Val Ile Gly Ser Ser Met Gly Ser Gly Gly Val Phe Thr Ile Asp 35 40 45 ggg aaa gtc aag tgc gta act gcc gca cat gtc ctt acg ggc aat tca 369 Gly Lys Val Lys Cys Val Thr Ala Ala His Val Leu Thr Gly Asn Ser 50 55 60 65 gct cgg gtt tcc ggg gtc ggc ttc aat caa atg ctt gac ttt gac gta 417 Ala Arg Val Ser Gly Val Gly Phe Asn Gln Met Leu Asp Phe Asp Val 70 75 80 aag gga gat ttc gct ata gct gat tgc ccg aat tgg caa ggg gct gcc 465 Lys Gly Asp Phe Ala Ile Ala Asp Cys Pro Asn Trp Gln Gly Ala Ala 85 90 95 ccc aag acc caa ttc tgc acg gat gga tgg act ggc cgt gcc tat tgg 513 Pro Lys Thr Gln Phe Cys Thr Asp Gly Trp Thr Gly Arg Ala Tyr Trp 100 105 110 cta aca tcc tct ggc gtc gaa ccc ggc gtc att gga aaa gga ttc gcc 561 Leu Thr Ser Ser Gly Val Glu Pro Gly Val Ile Gly Lys Gly Phe Ala 115 120 125 ttc tgc ttc acc gca tgt ggc gat tcc ggg tcc cca gtg 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cctgcggcct tagacaggaa cggtgcttgt actagcgcca 574 agtacgtact taagctggaa ggtgagcatt ggactgtcac tgtgacccct gggatgtccc 634 cttctttgct ccctcttgaa tgtgttcagg gctgttgtgg gcacaagggc ggtcttggtt 694 ccccagatgc agtcgaggtc tccggatttg accctgcctg ccttgaccgg ctggctgagg 754 tgatgcacct gcctagcagt gctatcccag ccgctctggc cgaaatgtct ggcgattccg 814 atcgttcggc ttctccggtc accaccgtgt ggactgtttc gcagttcttt gcccgtcaca 874 gcggagggaa tcaccctgac caagtgcgct tagggaaaat tatcagcctt tgtcaggtga 934 ttgaggactg ctgctgttcc cagaacaaaa ccaaccgggt caccccggag gaggtcgcag 994 caaagattga cctgtacctc cgtggtgcaa caaatcttga agaatgcttg gccaggcttg 1054 agaaagcgcg cccgccacgc gtaatcgaca cctcctttga ttgggatgtt gtgctccctg 1114 gggttgaggc ggcaacccag acgatcaagc tgccccaggt caaccagtgt cgtgctctgg 1174 tccctgttgt gactcaaaag tccttggaca acaactcggt ccccctgacc gccttttcac 1234 tggctaacta ctactaccgt gcgcaaggtg acgaagttcg tcaccgtgaa agactaaccg 1294 ccgtgctctc caagttggaa aaggttgttc gagaagaata tgggctcatg ccaaccgagc 1354 ctggtccacg gcccacactg ccacgcgggc tcgacgaact caaagaccag atggaggagg 1414 acttgctgaa actggctaac gcccagacga cttcggacat gatggcctgg gcagtcgagc 1474 aggttgacct aaaaacttgg gtcaagaact acccgcggtg gacaccacca ccccctccgc 1534 caaaagttca gcctcgaaaa acgaagcctg tcaagagctt gccggagaga aagcctgtcc 1594 ccgccccgcg caggaaggtt gggtccgatt gtggcagccc ggtttcatta ggcggcgatg 1654 tccctaacag ttgggaagat ttggctgtta gtagcccctt tgatctcccg accccacctg 1714 agccggcaac accttcaagt gagctggtga ttgtgtcctc accgcaatgc atcttcaggc 1774 cggcgacacc cttgagtgag ccggctccaa ttcccgcacc tcgcggaact gtgtctcgac 1834 cggtgacacc cttgagtgag ccgatccctg tgcccgcacc gcggcgtaag tttcagcagg 1894 tgaaaagatt gagttcggcg gcggcaatcc caccgtacca ggacgagccc ctggatttgt 1954 ctgcttcctc acagactgaa tatgaggcct ctcccccagc accgccgcag agcgggggcg 2014 ttctgggagt agaggggcat gaagctgagg aaaccctgag tgaaatctcg gacatgtcgg 2074 gtaacattaa acctgcgtcc gtgtcatcaa gcagctcctt gtccagcgtg agaatcacac 2134 gcccaaaata ctcagctcaa gccatcatcg actcgggcgg gccctgcagt gggcatctcc 2194 aagaggtaaa ggaaacatgc cttagtgtca tgcgcgaggc atgtgatgcg actaagcttg 2254 atgaccctgc tacgcaggaa tggctttctc gcatgtggga tcgggtggac atgctgactt 2314 ggcgcaacac gtctgtttac caggcgattt gcaccttaga tggcaggtta aagttcctcc 2374 caaaaatgat a ctc gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg 2419 Leu Glu His His His His His His 25 ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 2479 cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta 2539 tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcg 2588 <210> 11 <211> 2151 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 11 gctggaaaga gagcaagaaa agcacgctct tgtgcgactg ctacagtcgc tggccgcgct 60 ttgtccgttc gtgaaacccg gcaggccaag gagcacgagg ttgccggcgc caacaaggct 120 gagcacctca aacactactc cccgcctgcc gaagggaatt gtggttggca ctgcatttcc 180 gccatcgcca accggatggt gaattccaaa tttgaaacca cccttcccga aagagtgaga 240 cctccagatg actgggctac tgacgaggat cttgtgaatg ccatccaaat cctcagactc 300 cctgcggcct tagacaggaa cggtgcttgt actagcgcca agtacgtact taagctggaa 360 ggtgagcatt ggactgtcac tgtgacccct gggatgtccc cttctttgct ccctcttgaa 420 tgtgttcagg gctgttgtgg gcacaagggc ggtcttggtt ccccagatgc agtcgaggtc 480 tccggatttg accctgcctg ccttgaccgg ctggctgagg tgatgcacct gcctagcagt 540 gctatcccag ccgctctggc cgaaatgtct ggcgattccg atcgttcggc ttctccggtc 600 accaccgtgt ggactgtttc gcagttcttt gcccgtcaca gcggagggaa tcaccctgac 660 caagtgcgct tagggaaaat tatcagcctt tgtcaggtga ttgaggactg ctgctgttcc 720 cagaacaaaa ccaaccgggt caccccggag gaggtcgcag caaagattga cctgtacctc 780 cgtggtgcaa caaatcttga agaatgcttg gccaggcttg agaaagcgcg cccgccacgc 840 gtaatcgaca cctcctttga ttgggatgtt gtgctccctg gggttgaggc ggcaacccag 900 acgatcaagc tgccccaggt caaccagtgt cgtgctctgg tccctgttgt gactcaaaag 960 tccttggaca acaactcggt ccccctgacc gccttttcac tggctaacta ctactaccgt 1020 gcgcaaggtg acgaagttcg tcaccgtgaa agactaaccg ccgtgctctc caagttggaa 1080 aaggttgttc gagaagaata tgggctcatg ccaaccgagc ctggtccacg gcccacactg 1140 ccacgcgggc tcgacgaact caaagaccag atggaggagg acttgctgaa actggctaac 1200 gcccagacga 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caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 537 ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcg 596 <210> 21 <211> 159 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 21 atgaacgcca gcaacgacag cagctcccat ctacagctga tttacaactt gacgctatgt 60 gagctgaatg gcacagattg gctagctaac aaatttgatt gggcagtgct cgagggagga 120 ggcggcagcg ggtttgttca cgggcggtat gtcctaagt 159 <210> 22 <211> 81 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 22 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Met Asn Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln 20 25 30 Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu 35 40 45 Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Leu Glu His His His His His 65 70 75 80 His <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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cctcctagac 60 actaagggca gactctatcg ttggcggtcg cctgtcatta tagagaaagg gggtaaggtt 120 gaggtcgaag gccacctgat cgacctcaaa agagttgtgc ttgatggttc cgtggcaaca 180 cctttaacca gagtttcagc ggaacaatgg ggtcgtcct 219 <210> 29 <211> 101 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 29 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Met Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr 20 25 30 Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp 35 40 45 Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly 50 55 60 His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr 65 70 75 80 Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro Leu Glu His 85 90 95 His His His His His 100 <210> 30 <211> 700 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> CDS <222> (175)..(528) <400> 30 aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga 60 ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 120 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg 177 Met 1 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat cga tcc atg aat tct 225 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn Ser 5 10 15 agt gga tcc atg aac gcc agc aac gac agc agc tcc cat cta cag ctg 273 Ser Gly Ser Met Asn Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu 20 25 30 att tac aac ttg acg cta tgt gag ctg aat ggc aca gat tgg cta gct 321 Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala 35 40 45 aac aaa ttt gat tgg gca gtg ctc gag gga gga ggc ggc agc ggg ttt 369 Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Phe 50 55 60 65 gtt cac ggg cgg tat gtc cta agt gga gga ggc ggc agc atg ggg tcg 417 Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Ser 70 75 80 tcc tta gat gac ttc tgt cat gat agc acg gct cca caa aag gtg ctt 465 Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys Val Leu 85 90 95 gga gga ggc ggc agc gcg cac ttt cag agt aca aat aag ctc gag cac 513 Gly Gly Gly Gly Ser Ala His Phe Gln Ser Thr Asn Lys Leu Glu His 100 105 110 cac cac cac cac cac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt 568 His His His His His 115 tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct 628 tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg 688 tagcggcgca tt 700 <210> 31 <211> 270 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 31 atgaacgcca gcaacgacag cagctcccat ctacagctga tttacaactt gacgctatgt 60 gagctgaatg gcacagattg gctagctaac aaatttgatt gggcagtgct cgagggagga 120 ggcggcagcg ggtttgttca cgggcggtat gtcctaagtg gaggaggcgg cagcatgggg 180 tcgtccttag atgacttctg tcatgatagc acggctccac aaaaggtgct tggaggaggc 240 ggcagcgcgc actttcagag tacaaataag 270 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 32 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Met Asn Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln 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tagcggcgca tt 907 <210> 38 <211> 477 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 38 ggcagcccgg tttcattagg cggcgatgtc cctaacagtt gggaagattt ggctgttagt 60 agcccctttg atctcccgac cccacctgag ccggcaacac cttcaagtga gctggtgatt 120 gtgtcctcac cgcaatgcat cttcaggccg gcgacaccct tgagtgagcc ggctccaatt 180 cccgcacctc gcggaactgt gtctcgaccg gtgacaccct tgagtgagcc gatccctgtg 240 cccgcaccgc ggcgtaagtt tcagcaggtg aaaagattga gttcggcggc ggcaatccca 300 ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtct gcttcctcac aggctgaata tgaggcctct 360 cccccagcac cgccgcagag cgggggcgtt ctgggagtag aggggcatga agctgaggaa 420 accctgagtg aaatctcgga catgtcgggt aacattaaac ctgcgtccgt gtcatca 477 <210> 39 <211> 187 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 39 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Pro Val Ser Leu Gly Gly Asp Val Pro Asn 20 25 30 Ser Trp Glu Asp Leu Ala Val Ser Ser Pro Phe Asp Leu Pro Thr Pro 35 40 45 Pro Glu Pro 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reproductive and respiratory syndrome virus <400> 42 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Ala Thr Ala Thr Val Ala Gly Arg Ala Leu Ser Val 20 25 30 Arg Glu Thr Arg Gln Ala Lys Glu His Glu Val Ala Gly Ala Asn Lys 35 40 45 Ala Glu His Leu Lys His Leu Glu His His His His His His 50 55 60 <210> 43 <211> 538 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> CDS <222> (175)..(366) <400> 43 aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga 60 ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 120 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg 177 Met 1 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat cga tcc atg aat tct 225 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn Ser 5 10 15 agt gga tcc gca aag att gac ctg tac ctc cgt ggt gca aca aat ctt 273 Ser Gly Ser Ala Lys Ile Asp Leu Tyr Leu Arg Gly Ala Thr Asn Leu 20 25 30 gaa gaa tgc ttg gcc agg ctt gag aaa gcg cgc ccg cca cgc gta atc 321 Glu Glu Cys Leu Ala Arg Leu Glu Lys Ala Arg Pro Pro Arg Val Ile 35 40 45 gac acc tcc ttt gat tgg gat ctc gag cac cac cac cac cac cac 366 Asp Thr Ser Phe Asp Trp Asp Leu Glu His His His His His His 50 55 60 tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 426 caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 486 ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca tt 538 <210> 44 <211> 108 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 44 gcaaagattg acctgtacct ccgtggtgca acaaatcttg aagaatgctt ggccaggctt 60 gagaaagcgc gcccgccacg cgtaatcgac acctcctttg attgggat 108 <210> 45 <211> 64 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 45 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Ala Lys Ile Asp Leu Tyr Leu Arg Gly Ala Thr Asn 20 25 30 Leu Glu Glu Cys Leu Ala Arg Leu Glu Lys Ala Arg Pro Pro Arg Val 35 40 45 Ile Asp Thr Ser Phe Asp 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cag ttg 321 Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu 35 40 45 ctg ggt gca atg ata aag tcc cag cgc cag caa cct agg gga gga cag 369 Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln 50 55 60 65 gcc aaa aag aaa aag cct gag aag cca cat ttt ccc ctg gct gct gaa 417 Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu 70 75 80 gat gac atc cgg cac cac ctc acc cag act gaa cgc tcc ctc tgc ttg 465 Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu 85 90 95 caa tcg atc cag acg gct ttc aat caa ggc gca gga act gcg tcg ctt 513 Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu 100 105 110 tca tcc agc ggg aag gtc agt ttt cag gtt gag ttt atg ctg ccg gtt 561 Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val 115 120 125 gct cat aca gtg cgc ctg att cgc gtg act tct aca tcc gcc agt cag 609 Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln 130 135 140 145 ggt gca agt ctc gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg ctgctaacaa 662 Gly Ala Ser Leu Glu His His His His His His 150 155 agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct 722 tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt 782 ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcg 821 <210> 53 <211> 384 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 53 atggccggta aaaaccagag ccagaagaaa aagaaaagta cagctccgat ggggaatggc 60 cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtgcaatga taaagtccca gcgccagcaa 120 cctaggggag gacaggccaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cctggctgct 180 gaagatgaca tccggcacca cctcacccag actgaacgct ccctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagcgg gaaggtcagt 300 tttcaggttg agtttatgct gccggttgct catacagtgc gcctgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcagggtgc aagt 384 <210> 54 <211> 156 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 54 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys 20 25 30 Ser Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln 35 40 45 Leu Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly 50 55 60 Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala 65 70 75 80 Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys 85 90 95 Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser 100 105 110 Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro 115 120 125 Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser 130 135 140 Gln Gly Ala Ser Leu Glu His His His His His His 145 150 155 <210> 55 <211> 2336 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> CDS <222> (175)..(234) <220> <221> CDS <222> (2134)..(2157) <400> 55 aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga 60 ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 120 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg 177 Met 1 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat cga tcc atg aat tct 225 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn Ser 5 10 15 agt gga tcc gctgccggca aacgggctcg tgctaagcgt gccgctaaaa 274 Ser Gly Ser 20 gtgagaagga ttcggctccc acccccaagg ttgccctgcc ggtccccacc tgtggaatta 334 ccacctactc tccaccgaca gacgggtctt gtggttggca tgtccttgcc gccataatga 394 accggatgat aaatggtgac ttcacgtccc ctctgactca gtacaacaga ccagaggatg 454 attgggcttc tgattatgat cttgttcagg cgattcaatg tctacgactg cctgctaccg 514 tggttcggaa tcgcgcctgt cctaacgcca agtaccttat aaaacttaac ggagttcact 574 gggaggtaga ggtgaggtct ggaatggctc ctcgctccct ttctcgtgaa tgtgtggttg 634 gcgtttgctc tgaaggctgt gtcgcaccgc cttatccagc agacgggcta cctaaacgtg 694 cactcgaggc cttggcgtct gcttacagac taccctccga ttgtgttagc tctggtattg 754 ctgactttct tgctaatcca cctcctcagg aattctggac cctcgacaaa atgttgacct 814 ccccgtcacc agagcggtcc ggcttctcta gtttgtataa attactatta gaggttgttc 874 cgcaaaaatg cggtgccacg gaaggggctt tcatctatgc tgttgagagg atgttgaagg 934 attgtccgag ctccaaacag gccatggccc ttctggcaaa aattaaagtt ccatcctcaa 994 aggccccgtc tgtgtccctg gacgagtgtt tccctacgga tgttttagcc gacttcgagc 1054 cagcatctca ggaaaggccc caaagttccg gcgctgctgt tgtcctgtgt tcaccggatg 1114 caaaagagtt cgaggaagca gccccggaag aagttcaaga gagtggccac aaggccgtcc 1174 actctgcact ccttgccgag ggtcctaaca atgagcaggt acaggtggtt gccggtgagc 1234 aactgaagct cggcggttgt ggtttggcag tcgggaatgc tcatgaaggt gctctggtct 1294 cagctggtct aattaacctg gtaggcggga atttgtcccc ctcagacccc atgaaagaaa 1354 acatgctcaa tagccgggaa gacgaaccac tggatttgtc ccaaccagca ccagcttcca 1414 caacgaccct tgtgagagag caaacacccg acaacccagg ttctgatgcc ggtgccctcc 1474 ccgtcaccgt tcgagaattt gtcccgacgg ggcctatact ctgtcatgtt gagcactgcg 1534 gcacggagtc gggcgacagc agttcgcctt tggatctatc tgatgcgcaa accctggacc 1594 agcctttaaa tctatccctg gccgcttggc cagtgagggc caccgcgtct gaccctggct 1654 gggtccacgg taggcgcgag cctgtctttg taaagcctcg aaatgctttc tctgatggcg 1714 attcagccct tcagttcggg gagctttctg aatccagctc tgtcatcgag tttgaccgga 1774 caaaagatgc tccggtggtt gacgcccctg tcgacttgac gacttcgaac gaggccctct 1834 ctgtagtcga tcctttcgaa tttgccgaac tcaagcgccc gcgtttctcc gcacaagcct 1894 taattgaccg aggcggtcca cttgccgatg tccatgcaaa aataaagaac cgggtatatg 1954 aacagtgcct ccaagcttgt gagcccggta gtcgtgcaac cccagccacc agggagtggc 2014 tcgacaaaat gtgggatagg gtggacatga aaacttggcg ctgcacctcg cagttccaag 2074 ctggtcgcat tcttgcgtcc ctcaaattcc tccctgacat gattcaagac acaccgcct 2133 ctc gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag 2187 Leu Glu His His His His His His 25 gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct 2247 aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg 2307 acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcg 2336 <210> 56 <211> 1899 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 56 gctgccggca aacgggctcg tgctaagcgt gccgctaaaa gtgagaagga ttcggctccc 60 acccccaagg ttgccctgcc ggtccccacc tgtggaatta ccacctactc tccaccgaca 120 gacgggtctt gtggttggca tgtccttgcc gccataatga accggatgat aaatggtgac 180 ttcacgtccc ctctgactca gtacaacaga ccagaggatg attgggcttc tgattatgat 240 cttgttcagg cgattcaatg tctacgactg cctgctaccg tggttcggaa tcgcgcctgt 300 cctaacgcca agtaccttat aaaacttaac ggagttcact gggaggtaga ggtgaggtct 360 ggaatggctc ctcgctccct ttctcgtgaa tgtgtggttg gcgtttgctc tgaaggctgt 420 gtcgcaccgc cttatccagc agacgggcta cctaaacgtg cactcgaggc cttggcgtct 480 gcttacagac taccctccga ttgtgttagc tctggtattg ctgactttct tgctaatcca 540 cctcctcagg aattctggac cctcgacaaa atgttgacct ccccgtcacc agagcggtcc 600 ggcttctcta gtttgtataa attactatta gaggttgttc cgcaaaaatg cggtgccacg 660 gaaggggctt tcatctatgc tgttgagagg atgttgaagg attgtccgag ctccaaacag 720 gccatggccc ttctggcaaa aattaaagtt ccatcctcaa aggccccgtc tgtgtccctg 780 gacgagtgtt tccctacgga tgttttagcc gacttcgagc cagcatctca ggaaaggccc 840 caaagttccg gcgctgctgt tgtcctgtgt tcaccggatg caaaagagtt cgaggaagca 900 gccccggaag aagttcaaga gagtggccac aaggccgtcc actctgcact ccttgccgag 960 ggtcctaaca atgagcaggt acaggtggtt gccggtgagc aactgaagct cggcggttgt 1020 ggtttggcag tcgggaatgc tcatgaaggt gctctggtct cagctggtct aattaacctg 1080 gtaggcggga atttgtcccc ctcagacccc atgaaagaaa acatgctcaa tagccgggaa 1140 gacgaaccac tggatttgtc ccaaccagca ccagcttcca caacgaccct tgtgagagag 1200 caaacacccg acaacccagg ttctgatgcc ggtgccctcc ccgtcaccgt tcgagaattt 1260 gtcccgacgg ggcctatact ctgtcatgtt gagcactgcg gcacggagtc gggcgacagc 1320 agttcgcctt tggatctatc tgatgcgcaa accctggacc agcctttaaa tctatccctg 1380 gccgcttggc cagtgagggc caccgcgtct gaccctggct gggtccacgg taggcgcgag 1440 cctgtctttg taaagcctcg aaatgctttc tctgatggcg attcagccct tcagttcggg 1500 gagctttctg aatccagctc tgtcatcgag tttgaccgga caaaagatgc tccggtggtt 1560 gacgcccctg tcgacttgac gacttcgaac gaggccctct ctgtagtcga tcctttcgaa 1620 tttgccgaac tcaagcgccc gcgtttctcc gcacaagcct taattgaccg aggcggtcca 1680 cttgccgatg tccatgcaaa aataaagaac cgggtatatg aacagtgcct ccaagcttgt 1740 gagcccggta gtcgtgcaac cccagccacc agggagtggc tcgacaaaat gtgggatagg 1800 gtggacatga aaacttggcg ctgcacctcg cagttccaag ctggtcgcat tcttgcgtcc 1860 ctcaaattcc tccctgacat gattcaagac acaccgcct 1899 <210> 57 <211> 2588 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> CDS <222> (175)..(234) <220> <221> CDS <222> (2386)..(2409) <400> 57 aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga 60 ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 120 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg 177 Met 1 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat cga tcc atg aat tct 225 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn Ser 5 10 15 agt gga tcc gctggaaaga gagcaaggaa agcacgctct ggtatgacca 274 Ser Gly Ser 20 ccacagtcgc tcaccgcgcc ttgcccgctc gtgaaatcca gcaagccaaa aagcacgagg 334 atgccggcgc tgataaggct gtgcatctca ggcactattc tccgcctgcc gacgggaact 394 gtggttggca ctgcatttcc gccatcgcca accgaatggt gaattccaaa tttgaaacta 454 ctcttcccga gagggtgaga ccttcagatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaaca 514 ccatccaaat tctcaagctc cctgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gttggcgcca 574 aatacgtgct taagctggaa ggcgagcatt ggactgtctc tgtgaccctt gggatgtccc 634 cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gctgttgtga gcataagagc ggacttggtc 694 ccccagatgc ggtcgaagtt ttcggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg 754 taatgcactt gcctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca 814 actgtccggc ttccccggtc actactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca 874 gaggaggaga gcaccctgat caggtgcgct taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg 934 ttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg 994 caaggattga tcagtacctc catggtgcaa caagtcttga agaatgcttg attaggcttg 1054 agagggtttg cccgccgagc gctgcggaca ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg 1114 gggttggggc ttcaactcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 1174 ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca aagactcagt ccctctgacc gccttctcgc 1234 tgtccaattg ctactatcct gcacaaggtg acgaggttcg tcaccgtgag aggctaaact 1294 ccgtactctc taagctggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac 1354 ctggcccgcg acccgcacta ccgaacgggc tcgtcgaact taaagaccag atggaggagg 1414 atctgctgaa actagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 1474 aggttgatct gaaagcttgg gtcaaaaact acccacggtg gacaccgcca ccccctccac 1534 caagagttca gcctcgaaaa acaaagtctg tcaagagctt gccagggaac aaacctgtcc 1594 ccgctccacg caggaaggtc agatctgatt gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 1654 ttcctgacgg tcgggaagat ttgactgttg gtggccccct tgatctttcg acaccatccg 1714 agccgatgac acctctgagt gagcctgcac ttatgcccgc gttgcaatat atttctaggc 1774 cagtgacatc tttgagtgtg ctggccccag ttcctgcacc gcgtagaact gtgtcccgac 1834 cggtgacgcc cttgagtgag ccaatttttg tgtctgcacc gcgacacaaa tttcagcagg 1894 tggaagaagc gaatctggcg gcaacaacgc tgacgcacca ggacgaacct ctagatttgt 1954 ctgcatcctc acagactgaa tatgaggctt ctcccctaac accactgcag aacatgggta 2014 ttctggaggt gggggggcaa gaagctgagg aagttctgag tgaaatctcg gatacactga 2074 atgacatcaa ccctgcacct gtgtcatcaa gcagctccct gtcaagtgtt aagatcacac 2134 gcccaaaaca ctctgctcaa gccatcattg actcgggcgg gccctgcagt gggcatctcc 2194 gaagggaaaa agaagcatgc ctcagcatca tgcgtgaggc ttgtgatgcg gctaagctta 2254 gtgaccctgc cacgcaggaa tggctttctc gcatgtggga tagggttgac atgctgactt 2314 ggcgcaacac gtctgcttac caggcgttcc gcatcttaga tggtaggttt gagtttctcc 2374 caaagatgat a ctc gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg 2419 Leu Glu His His His His His His 25 ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 2479 cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta 2539 tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcg 2588 <210> 58 <211> 2151 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 58 gctggaaaga gagcaaggaa agcacgctct ggtatgacca ccacagtcgc tcaccgcgcc 60 ttgcccgctc gtgaaatcca gcaagccaaa aagcacgagg atgccggcgc tgataaggct 120 gtgcatctca ggcactattc tccgcctgcc gacgggaact gtggttggca ctgcatttcc 180 gccatcgcca accgaatggt gaattccaaa tttgaaacta ctcttcccga gagggtgaga 240 ccttcagatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaaca ccatccaaat tctcaagctc 300 cctgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gttggcgcca aatacgtgct taagctggaa 360 ggcgagcatt ggactgtctc tgtgaccctt gggatgtccc cttctttgct cccccttgaa 420 tgtgttcagg gctgttgtga gcataagagc ggacttggtc ccccagatgc ggtcgaagtt 480 ttcggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg taatgcactt gcctagcagt 540 gtcatcccag ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca actgtccggc ttccccggtc 600 actactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca gaggaggaga gcaccctgat 660 caggtgcgct taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg ttgaggaatg ctgttgccat 720 cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg caaggattga tcagtacctc 780 catggtgcaa caagtcttga agaatgcttg attaggcttg agagggtttg cccgccgagc 840 gctgcggaca ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg gggttggggc ttcaactcag 900 acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg ttcctgtcgt gactcaagag 960 cctttggaca aagactcagt ccctctgacc gccttctcgc tgtccaattg ctactatcct 1020 gcacaaggtg acgaggttcg tcaccgtgag aggctaaact ccgtactctc taagctggag 1080 ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac ctggcccgcg acccgcacta 1140 ccgaacgggc tcgtcgaact taaagaccag atggaggagg atctgctgaa actagtcaac 1200 gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc aggttgatct gaaagcttgg 1260 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caggcgttcc gcatcttaga tggtaggttt gagtttctcc caaagatgat a 2151 <210> 59 <211> 907 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> CDS <222> (175)..(735) <400> 59 aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga 60 ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 120 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg 177 Met 1 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat cga tcc atg aat tct 225 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn Ser 5 10 15 agt gga tcc ggc agc ccg att ttg atg ggc gac aat gtt cct gac ggt 273 Ser Gly Ser Gly Ser Pro Ile Leu Met Gly Asp Asn Val Pro Asp Gly 20 25 30 cgg gaa gat ttg cct gtt ggt ggc ccc ctt gat ctt tcg aca cca tcc 321 Arg Glu Asp Leu Pro Val Gly Gly Pro Leu Asp Leu Ser Thr Pro Ser 35 40 45 gag ccg atg aca cct ctg agt gag cct gca cct atg ccc gcg ttg caa 369 Glu Pro Met Thr Pro Leu Ser Glu Pro Ala Pro Met Pro Ala Leu Gln 50 55 60 65 tat att tct agg cca gtg aca cct ttg agt gag ctg gcc cca gta cct 417 Tyr Ile Ser Arg Pro Val Thr Pro Leu Ser Glu Leu Ala Pro Val Pro 70 75 80 gca ccg cgt aga act gtg tcc cga ccg gtg acg ccc ttg agt gag cca 465 Ala Pro Arg Arg Thr Val Ser Arg Pro Val Thr Pro Leu Ser Glu Pro 85 90 95 att ttt gtg tct gca ccg cga cac aaa ttt cgg cag gtg gaa gaa gcg 513 Ile Phe Val Ser Ala Pro Arg His Lys Phe Arg Gln Val Glu Glu Ala 100 105 110 aat ctg gcg gca aca atg ctg acg cac cag gac gaa cct cta gat ttg 561 Asn Leu Ala Ala Thr Met Leu Thr His Gln Asp Glu Pro Leu Asp Leu 115 120 125 tct gca tcc tca cag act gaa tat gag gct tct ccc cta aca cca ctg 609 Ser Ala Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ala Ser Pro Leu Thr Pro Leu 130 135 140 145 cag aac atg ggt att ctt gag gtg ggg ggg caa gaa gct gag gaa gtt 657 Gln Asn Met Gly Ile Leu Glu Val Gly Gly Gln Glu Ala Glu Glu Val 150 155 160 ctg agt gaa aac tcg gat aca ctg aat gac atc aac cct gca cct gtg 705 Leu Ser Glu Asn Ser Asp Thr Leu Asn Asp Ile Asn Pro Ala Pro Val 165 170 175 tca tca ctc gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg ctgctaacaa 755 Ser Ser Leu Glu His His His His His His 180 185 agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct 815 tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt 875 ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca tt 907 <210> 60 <211> 477 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 60 ggcagcccga ttttgatggg cgacaatgtt cctgacggtc gggaagattt gcctgttggt 60 ggcccccttg atctttcgac accatccgag ccgatgacac ctctgagtga gcctgcacct 120 atgcccgcgt tgcaatatat ttctaggcca gtgacacctt tgagtgagct ggccccagta 180 cctgcaccgc gtagaactgt gtcccgaccg gtgacgccct tgagtgagcc aatttttgtg 240 tctgcaccgc gacacaaatt tcggcaggtg gaagaagcga atctggcggc aacaatgctg 300 acgcaccagg acgaacctct agatttgtct gcatcctcac agactgaata tgaggcttct 360 cccctaacac cactgcagaa catgggtatt cttgaggtgg gggggcaaga agctgaggaa 420 gttctgagtg aaaactcgga tacactgaat gacatcaacc ctgcacctgt gtcatca 477 <210> 61 <211> 187 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 61 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Pro Ile Leu Met Gly Asp Asn Val Pro Asp 20 25 30 Gly Arg Glu Asp Leu Pro Val Gly Gly Pro Leu Asp Leu Ser Thr Pro 35 40 45 Ser Glu Pro Met Thr Pro Leu Ser Glu Pro Ala Pro Met Pro Ala Leu 50 55 60 Gln Tyr Ile Ser Arg Pro Val Thr Pro Leu Ser Glu Leu Ala Pro Val 65 70 75 80 Pro Ala Pro Arg Arg Thr Val Ser Arg Pro Val Thr Pro Leu Ser Glu 85 90 95 Pro Ile Phe Val Ser Ala Pro Arg His Lys Phe Arg Gln Val Glu Glu 100 105 110 Ala Asn Leu Ala Ala Thr Met Leu Thr His Gln Asp Glu Pro Leu Asp 115 120 125 Leu Ser Ala Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ala Ser Pro Leu Thr Pro 130 135 140 Leu Gln Asn Met Gly Ile Leu Glu Val Gly Gly Gln Glu Ala Glu Glu 145 150 155 160 Val Leu Ser Glu Asn Ser Asp Thr Leu Asn Asp Ile Asn Pro Ala Pro 165 170 175 Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 180 185 <210> 62 <211> 644 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> CDS <222> (175)..(465) <400> 62 aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga 60 ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga 120 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acat atg 177 Met 1 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat cga tcc atg aat tct 225 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn Ser 5 10 15 agt gga tcc tgc atg gcc tgc cgc tat gcc cgt acc cgg ttt acc aac 273 Ser Gly Ser Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr Asn 20 25 30 ttc att gtg gac gac cgg ggg aga gtt cat cga tgg aag tct cca ata 321 Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro Ile 35 40 45 gtg gta gaa aaa ttg ggc aaa gcc gaa gtc gat ggc aac ctc gtc acc 369 Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val Thr 50 55 60 65 atc aaa cat gtc gtc ctc gaa ggg gtt aaa gct caa ccc ttg acg agg 417 Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr Arg 70 75 80 act tcg gct gag caa tgg gag gcc ctc gag cac cac cac cac cac cac 465 Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala Leu Glu His His His His His His 85 90 95 tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 525 caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 585 ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcg 644 <210> 63 <211> 207 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 63 tgcatggcct gccgctatgc ccgtacccgg tttaccaact tcattgtgga cgaccggggg 60 agagttcatc gatggaagtc tccaatagtg gtagaaaaat tgggcaaagc cgaagtcgat 120 ggcaacctcg tcaccatcaa acatgtcgtc ctcgaagggg ttaaagctca acccttgacg 180 aggacttcgg ctgagcaatg ggaggcc 207 <210> 64 <211> 97 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 64 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr 20 25 30 Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro 35 40 45 Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val 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accgagcata cgctgtgaga aagcccggac taacatcagt gaacggcact 180 ctagtaccag gacttcggag cctcgtgctg ggcggcaaac gagctgttaa acgaggagtg 240 gttaacctcg tcaagtatgg ccgg 264 <210> 67 <211> 116 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 67 Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ser Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ser Ser Phe Thr Glu Ser Trp Lys Phe Ile Thr Ser Arg 20 25 30 Cys Arg Leu Cys Cys Leu Gly Arg Arg Tyr Ile Leu Ala Pro Ala His 35 40 45 His Val Glu Ser Ala Ala Gly Leu His Ser Ile Ser Ala Ser Gly Asn 50 55 60 Arg Ala Tyr Ala Val Arg Lys Pro Gly Leu Thr Ser Val Asn Gly Thr 65 70 75 80 Leu Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Val Leu Gly Gly Lys Arg Ala Val 85 90 95 Lys Arg Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Gly Arg Leu Glu His His 100 105 110 His His His His 115 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 68 aggtcgtgta ctgtcagtca 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 69 acgtggtgaa ctgccagtga 20 <210> 70 <211> 719 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 70 Ala Gly Lys Arg Ala Arg Lys Ala Arg Ser Gly Ala Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 Ala Gly Arg Ala Leu Ser Val Arg Glu Thr Arg Gln Ala Lys Glu His 20 25 30 Glu Val Ala Gly Ala Asn Lys Ala Glu His Leu Lys His Tyr Ser Pro 35 40 45 Pro Ala Glu Gly Asn Cys Gly Trp His Cys Ile Ser Ala Ile Ala Asn 50 55 60 Arg Met Val Asn Ser Lys Phe Glu Thr Thr Leu Pro Glu Arg Val Arg 65 70 75 80 Pro Pro Asp Asp Trp Ala Thr Asp Glu Asp Leu Val Asn Ala Ile Gln 85 90 95 Ile Leu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Asp Arg Asn Gly Ala Cys Thr Ser 100 105 110 Ala Lys Tyr Val Leu Lys Leu Glu Gly Glu His Trp Thr Val Thr Val 115 120 125 Thr Pro Gly Met Ser Pro Ser Leu Leu Pro Leu Glu Cys Val Gln Gly 130 135 140 Cys Cys Glu His Lys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Asp Ala Val Glu Val 145 150 155 160 Ser Gly Phe Asp Pro 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syndrome virus <400> 93 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Thr Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Val Asn Ala Asn 20 25 30 Ser Asn Ser Ser Ser His Phe Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu 195 200 <210> 94 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 94 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 95 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 95 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 96 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 96 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 97 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 97 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 98 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 98 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 99 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 99 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 100 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 100 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Tyr Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 101 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 101 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Arg Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ile Lys Asn Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Ser Ser Ala 115 120 <210> 102 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 102 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Arg Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ile Lys Asn Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Ser Ser Ala 115 120 <210> 103 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 103 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ile Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 115 120 <210> 104 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 104 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ser Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Gly Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 105 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 105 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Arg Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Ser Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120

Claims (83)

  1. (a) NSP 2 폴리펩티드 및 ORF 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체에 대한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드; 및
    (b) 항-돼지 Ig 항체
    를 포함하는, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 검출하기 위한 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 8개 이상의 아미노산 잔기 길이인 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 100개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 100개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 길이에 걸쳐 약 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 20개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 22의 서열과 상기 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 20개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 22의 서열과 길이에 걸쳐 약 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 11의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스에 감염되지 않은 세포에 의해 생산되는 재조합 폴리펩티드인 키트.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항-돼지 Ig 항체가 항-돼지 IgG 또는 IgM 항체인 키트.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항-돼지 Ig 항체가 염소 항-돼지 Ig 항체인 키트.
  12. 제1항에 있어서, PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 키트.
  13. 제1항에 있어서, PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 키트.
  14. 제1항에 있어서, PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 키트.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항-돼지 Ig 항체가 효소를 포함하는 것인 키트.
  16. 제1항에 있어서, PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 키트.
  17. 제1항에 있어서, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는 대조군 샘플을 포함하는 키트.
  18. 제1항에 있어서, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체가 없는 돼지 혈청을 포함하는 대조군 샘플을 포함하는 키트.
  19. (a) NSP 2 폴리펩티드 및 ORF 5 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 PRRS 바이러스 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하며, 돼지 항-PRRS 바이러스 항체에 대한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를, 만일 존재 한다면 샘플 내에 존재하는 항체와 폴리펩티드: 돼지 항-PRRS 바이러스 항체 복합체를 형성하는 조건하에서 샘플과 접촉시키는 것; 및
    (b) 상기 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것
    을 포함하고, 여기서 복합체가 존재한다는 것은 샘플이 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 포함함을 나타내는 것인, 샘플이 돼지 항-PRRS 바이러스 항체를 포함하는지 여부를 결정하기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 샘플이 돼지 혈청 샘플인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 8개 이상의 아미노산 잔기 길이인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드가 100개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 5의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 20개 이상의 아미노산 길이이고, 서열 22의 서열과 상기 길이에 걸쳐 약 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 11의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스에 감염되지 않은 세포에 의해 생산되는 재조합 폴리펩티드인 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 단계 (b)가 복합체를 항-돼지 Ig 항체와 접촉하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항-돼지 Ig 항체가 효소를 포함하는 것인 방법.
  29. 제19항에 있어서, 상기 단계 (a)가 키트 내에서 샘플을 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 키트는 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드에 존재하는 아 미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 PRRS 바이러스 ORF 5 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 키트가 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  31. 제19항에 있어서, 상기 샘플을 추가의 폴리펩티드와 접촉시켜 폴리펩티드: 돼지 항-PRRS 바이러스 항체 복합체를 형성하는 것을 포함하고, 여기서 상기 추가의 폴리펩티드는 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드, PRRS 바이러스 ORF 6 폴리펩티드, 또는 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  32. (a) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하는 아미노산 서열을 갖는 제1 폴리펩티드, 및
    (b) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하지 않는 아미노산 서열을 갖는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는, 동물이 백신 버전 바이러스를 투여 받았는지, 아니면 천연 버전의 바이러스에 감염되었는지 여부를 결정하기 위한 키트.
  33. 제32항에 있어서, 상기 동물이 척추동물인 키트.
  34. 제32항에 있어서, 상기 동물이 돼지인 키트.
  35. 제32항에 있어서, 상기 바이러스가 PRRS 바이러스인 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 백신 버전이 약독화된 PRRS 바이러스인 키트.
  37. 제35항에 있어서, 상기 백신 버전이 RespPRRS 백신인 키트.
  38. 제35항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 C-말단 부분에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  39. 제35항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드가 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 N-말단 절반부에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  40. 바이러스에 대한 동물의 면역학적 상태를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 면역학적 상태는 (1) 상기 동물이 백신 버전의 바이러스를 투여받았거나, (2) 상기 동물이 천연 버전의 바이러스에 감염되었거나, 또는 (3) 상기 동물이 바이러스에 대해 면역학적으로 노출된 바 없음을 의미하고, 상기 방법은
    (a) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드가, 만일 존재 한다면 제1 샘플 내에 존재하는 항체와 제1 폴리펩티드: 항체 복합체를 형성하는 조건하에서, 상기 동물로부터의 제1 샘플을 제1 폴리펩티드와 접촉시키는 것,
    (b) 백신 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하지 않는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드가, 만일 존재 한다면 제2 샘플 내에 존재하는 항체와 제2 폴리펩티드: 항체 복합체를 형성하는 조건하에서, 동물로부터의 제2 샘플을 제2 폴리펩티드와 접촉시키는 것, 및
    (c) 상기 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 또는 부재, 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것
    을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재는 상기 동물이 백신 버전의 바이러스를 투여받았음을 의미하고, 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 부 재는 그 동물이 천연 버전의 바이러스에 감염되었음을 의미하며, 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재는 상기 동물이 바이러스에 대해 면역학적으로 노출된 바가 없음을 의미하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 동물이 척추동물인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 동물이 돼지인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 바이러스가 PRRS 바이러스인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 백신 버전이 약독화된 PRRS 바이러스인 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 백신 버전이 RespPRRS 백신인 방법.
  46. 제40항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 C-말단 절반부에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  47. 제40항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드가 VR2332 또는 RespPRRS PRRS 바이러스의 ORF 5 폴리펩티드의 N-말단 절반부에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 것 인 방법.
  48. PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드, 또는 20개의 아미노산 잔기 길이를 초과하는 PRRS 바이러스 NSP 1 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 갖는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
  49. PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드, 또는 20개의 아미노산 잔기 길이를 초과하는 PRRS 바이러스 NSP 2 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 갖는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
  50. PRRS 바이러스 NSP 4 폴리펩티드, 또는 20개의 아미노산 잔기 길이를 초과하는 PRRS 바이러스 NSP 4 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 갖는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
  51. PRRS 바이러스 NSP 1, NSP 2 또는 NSP 4 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포.
  52. 제51항에 있어서, 원핵세포인 숙주 세포.
  53. 제51항에 있어서, 박테리아 세포인 숙주 세포.
  54. PRRS 바이러스에 대한 돼지의 면역학적 상태를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 면역학적 상태는 (1) 상기 돼지가 백신 버전의 PRRS 바이러스를 투여받았거나, (2) 상기 돼지가 천연 버전의 PRRS 바이러스에 감염되었거나, 또는 (3) 상기 돼지가 PRRS 바이러스에 대해 면역학적으로 노출된 바 없음을 의미하고, 상기 방법은
    (a) 백신 버전의 PRRS 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 PRRS 바이러스에 대해 생성된 항체가 제1 폴리펩티드에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드가, 만일 존재 한다면 제1 샘플 내에 존재하는 항체와 제1 폴리펩티드: 항체 복합체를 형성하는 조건하에서, 상기 돼지로부터의 제1 샘플을 제1 폴리펩티드와 접촉시키는 것,
    (b) 백신 버전의 PRRS 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하고, 천연 버전의 PRRS 바이러스에 대해 생성된 항체가 제2 폴리펩티드에 결합하지 않는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드가, 만일 존재 한다면 제2 샘플 내에 존재하는 항체와 제2 폴리펩티드: 항체 복합체를 형성하는 조건하에서, 돼지로부터의 제2 샘플을 제2 폴리펩티드와 접촉시키는 것, 및
    (c) 상기 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 또는 부재, 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것
    을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재는 상기 돼지가 백신 버전의 PRRS 바이러스를 투여받았음을 의미하고, 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 존재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재는 상기 돼지가 천연 버전의 PRRS 바이러스에 감염되었음을 의미하며, 제1 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재 및 제2 폴리펩티드: 항체 복합체의 부재는 그 돼지가 PRRS 바이러스에 대해 면역학적으로 노출된 바가 없음을 의미하는 것인 방법.
  55. 고체 지지체를 8.0을 초과하는 pH 값에서 블로킹 용액으로 처리하는 것을 포함하는, PRRS 바이러스 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체를 돼지 샘플과 접촉시키는 것을 포함하여 돼지 샘플에서 PRRS 바이러스 항체를 검출할 수 있는 검정법에서, 배경 신호를 감소시키는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 pH 값이 8.5를 초과하는 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 pH 값이 9.0을 초과하는 것인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 pH 값이 9.5를 초과하는 것인 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 pH 값이 10.0을 초과하는 것인 방법.
  60. 제55항에 있어서, 상기 블로킹 용액이 우유인 방법.
  61. 제55항에 있어서, 상기 블로킹 용액이 PBS 중의 탈지 건조 우유인 방법.
  62. 8.0을 초과하는 pH 값에서 블로킹 용액으로 처리된, PRRS 바이러스 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체.
  63. 제62항에 있어서, 상기 pH 값이 8.5를 초과하는 고체 지지체.
  64. 제62항에 있어서, 상기 pH 값이 9.0을 초과하는 고체 지지체.
  65. 제62항에 있어서, 상기 pH 값이 9.5를 초과하는 고체 지지체.
  66. 제62항에 있어서, 상기 pH 값이 10.0을 초과하는 고체 지지체.
  67. 제62항에 있어서, 상기 블로킹 용액이 우유인 고체 지지체.
  68. 제62항에 있어서, 상기 블로킹 용액이 PBS 중의 탈지 건조 우유인 고체 지지체.
  69. 제62항에 있어서, 상기 고체 지지체가 플라스틱 플레이트인 고체 지지체.
  70. 고체 지지체를 폴리펩티드 및 리소자임과 접촉시키는 것을 포함하는, 고체 지지체에 결합된 폴리펩티드가 그 폴리펩티드에 결합하는 항체와 반응하는 능력을 증가시키는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 폴리펩티드인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드인 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스로 감염되지 않는 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드인 방법.
  74. 제70항에 있어서, 상기 항체가 항-PRRS 바이러스 폴리펩티드 항체인 방법.
  75. 제70항에 있어서, 상기 리소자임이 계란 리소자임인 방법.
  76. 제70항에 있어서, 상기 폴리펩티드와 리소자임을 리소자임 1 ng 당 폴리펩티드 4 ng 이상의 비율로 고체 지지체와 접촉시키는 방법.
  77. 제70항에 있어서, 상기 리소자임과 폴리펩티드를 폴리펩티드 1 ng 당 리소자임 1 ng 이상의 비율로 고체 지지체와 접촉시키는 방법.
  78. PRRS 바이러스 폴리펩티드 및 리소자임과 접촉된, PRRS 바이러스 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체.
  79. 제78항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스 ORF 7 폴리펩티드인 고체 지지체.
  80. 제78항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 PRRS 바이러스로 감염되지 않는 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드인 고체 지지체.
  81. 제78항에 있어서, 상기 리소자임이 계란 리소자임인 고체 지지체.
  82. 제78항에 있어서, 상기 폴리펩티드 및 리소자임을 리소자임 1 ng 당 폴리펩티드 4 ng 이상의 비율로 접촉시키는 고체 지지체.
  83. 제78항에 있어서, 상기 리소자임 및 폴리펩티드를 폴리펩티드 1 ng 당 리소자임 1 ng 이상의 비율로 접촉시키는 고체 지지체.
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