MXPA06015105A

MXPA06015105A - Identificacion de organismos viralmente infectados y vacunados.

Info

Publication number: MXPA06015105A
Application number: MXPA06015105A
Authority: MX
Inventors: Craig R Johnson; Michael P Murtaugh
Original assignee: Univ Minnesota
Priority date: 2004-06-18
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2007-03-26
Also published as: US7611717B2; US8399187B2; TW200604526A; WO2006009880A3; US20100035276A1; RU2007101725A; WO2006009880A2; AU2005265142A1; US20070003570A1; AR049924A1; KR20070028547A; BRPI0510928A; CA2571452A1; EP1781327A4; EP1781327A2; JP2008503727A; SG153829A1

Abstract

Este documento proporciona metodos y materiales relacionados con la valoracion de organismos para la presencia o ausencia de anticuerpos anti-virus. Por ejemplo, este documento proporciona metodos y materiales que pueden ser utilizados para determinar si un organismo (por ejemplo, un miembro de una especie de cerdos, tal como un puerco) contiene o no anticuerpos de virus anti-PPRS. En otras modalidades, este documento proporciona metodos y materiales que pueden ser utilizados para determinar si un organismo particular que recibio una version de vacuna de un virus, se infecto con una version del virus de existencia natural, o esta sin afeccion con respecto al virus.

Description

IDENTIFICACIÓN DE ORGANISMOS VIRALMENTE INFECTADOS Y VACUNADOS Campo de la Invención El presente documento se refiere a métodos y materiales involucrados en la identificación de organismos viralmente infectados o vacunados (por ejemplo, vertebrados y mamíferos). Por ejemplo, el presente documento se refiere a métodos y materiales para identificar a un mamífero (por ejemplo, un cerdo) que tiene anticuerpos contra un virus tal como un virus de síndrome reproductivo respiratorio del porcino (PRRS). Antecedentes de la Invención Los organismos infectados con un virus pueden montar una respuesta inmune contra dicho virus infeccioso. Dicha respuesta inmune puede incluir la producción de anticuerpos que enlazan al virus. La presencia de anticuerpos contra un virus puede indicar que el organismo fue expuesto a dicho virus. Por ejemplo, los cerdos infectados con un virus PRRS pueden contener anticuerpos de cerdo que enlazan al virus PRRS. El PRRS es una enfermedad viral de los cerdos, caracterizada por una falla reproductora en cerdas (por ejemplo, abortos de término tardío y alumbramiento de crías muertas en cerdas) y dificultades respiratorias en cerditos (por ejemplo, neumonía intersticial en cerdos recién nacidos) (Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4: 117-126 (1992) y Wensvoort et al., Ver Q., 13: 121-130 (1991)). En Norte América se detectó en 1987 (Keffaber, Am. Assoc. Porcino Pract. Newsl., 1: 1-9 (1989) y Hill, Overview y History of Mystery Porcino Disease (Porcino Infertility y Respiratory syndrome). En: Proceedings of the Mystery Porcino Disease Committee Meeting, Octubre 6, Denver CO, pp. 29-30. Livestock Conservation Institute, Madison, Wl (1990)) y en Europa en 1990 (Patón et al., Vet Rec, 128: 617 (1991)). El agente que lo causa es un virus de ARN con hebra positiva envuelta, pequeña que se recupera principalmente de macrófagos alveolares y la sangre de cerdos infectados. Es un miembro de Arteriviridae, que incluye virus de arteritis equina (EAV; den Boon et al., J. Virol., 65: 2910-2920 (1991)), virus de elevación de deshidrogenasa de lactato de ratones (LDV; Plagemann y Moennig, Adv. Vir. Res., 41: 99-192 (1992)), y virus de fiebre hemorrágica de simio (SHFV; Godeny et al., In Proceedings of the 9th International Congress of Virology, p 22, Agosto 8-13, Glasgow, Scotland (1993) y Plagemann, In Fields Virology, 3o edición., pp. 1105-1120. Edited by B. N. Fields, D. M. Knipe and P. M. Howley, Philadelphia: Lippincott-Raven (1996)), in the Order Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol., 142: 629-633 (1997)). Igual que otros arteriovíruses, el virus PRRS infecta predominantemente macrófagos y establece una infección persistente en macrófagos residentes de diversos tejidos (Lawson et al., Virus Res., 51: 105-113 (1997) y Christopher-Hennings et al., J. Vet. Diag. Invest., 7: 456-464 (1995)).

Breve Descripción de la Invención El presente documento comprende métodos y materiales relacionados con la evaluación de organismos para determinar si los organismos fueron expuestos o no a una vacuna viral o infección viral. Por ejemplo, el presente documento proporciona métodos y materiales que pueden ser utilizados para determinar si un organismo contiene o no (por ejemplo, un miembro de una especie porcino tal como un cerdo) anticuerpos de víruses anti-PRRS. El determinar, por ejemplo, si los cerdos contienen o no anticuerpos del virus anti-PRRS puede permitir a los granjeros de cerdos identificar cerdos que puedan estar infectados con virus PRRS. Esto puede permitir al granjero separar los cerdos de los que se tiene sospecha que están infectados con un virus PRRS de los cerdos que se consideran no infectados. Así mismo, la identificación de cerdos que no contienen anticuerpos del virus anti-PRRS, puede permitir a los granjeros de cerdos vacunar la población de cerdos previamente no infectada en forma opuesta a todo un rebaño, lo cual puede incluir muchos cerdos infectados previamente. En una modalidad, el presente documento proporciona métodos y materiales que pueden utilizarse para determinar si un organismo en particular recibió una versión de vacuna de un virus, fue infectado con una versión del virus que ocurre naturalmente, o es na?ve con respecto al virus. La diferenciación entre organismos vacunados y organismos infectados con una versión del virus que ocurre naturalmente, puede permitir a los especialistas, en el caso de h umanos, y granjeros, en el caso de animales, determinar el origen inmunológico de cada inmunidad del organismo del virus. Por ejemplo, un granjero que recibe un rebaño de cerdos, puede determinar si los cerdos del rebaño recibieron una vacuna de virus P RRS, o fueron infectados con una versión del virus que ocurre naturalmente (por ejemplo, un aislado de campo del virus PRRS), o son na?ve con respecto al virus. Con esta información , el granjero puede determinar si el rebaño no necesita ser vacunado o si cualesquiera de los cerdos no infectados está en riesgo de infectarse, por ejemplo, por los cerdos que fueron infectados con una versión del virus que ocurre naturalmente. En general, el presente documento presenta un equipo para detectar un anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino. Este equipo incluye (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido de virus PRRS seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos NSP 2 y polipéptidos ORF 5, en donde el polipéptido contiene un epítope para el anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino; y (b) un anticuerpo Ig anti-porcino. El polipéptido puede tener al menos ocho residuos de aminoácidos de longitud. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos de al menos 100 aminoácidos de longitud que es al menos aproximadamente el 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ I D NO:5 con respecto a la longitud. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos de al menos 1 00 aminoácidos de longitud que es al menos aproximadamente el 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ I D NO: 5 con respecto a la longitud. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos con al menos 20 aminoácidos de longitud que es al menos aproximadamente el 80% idéntica a una secuencia establecida en SEQ I D NO:22 con respecto a la longitud. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos de al menos 20 aminoácidos de longitud que es al menos aproximadamente el 90% idéntica a una secuencia establecida en SEQ I D NO:22 con respecto a la longitud . El polipéptido puede contener la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ I D NO: 1 1 . El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácido de SEQ I D NO: 32. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácido de S EQ I D NO: 1 6, 1 9, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61 ó 64. El polipéptido puede ser un polipéptido recombinante producido en células no infectadas con un virus PRRS. El anticuerpo Ig anti-porcino puede ser un anticuerpo IgG ó Ig M anti-porcino. El anticuerpo Ig antiporcino puede ser un anticuerpo Ig anti-porcino de cabra. El equipo puede contener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 2 de virus PRRS y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 5 de virus PRRS . El equipo puede contener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 7 de virus PRRS (por ejemplo, un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO:36 ó 54). El equipo puede contener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 6 del virus PRRS (por ejemplo, un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO:32, 48, 51 ó 67). El anticuerpo Ig anti-porcino puede contener una enzima. El equipo puede contener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 1 de virus PRRS. El equipo puede contener una muestra de control que contiene un anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino. El equipo puede contener una muestra de control que contiene anticuerpos del virus anti-PRRS de porcino que carecen de suero de porcino. En otra modalidad , el presente documento presenta un método para determinar si una muestra contiene un anticuerpo de virus anti-PRRS de porcino. El método incluye (a) contactar un polipéptido con la muestra bajo condiciones en donde el polipéptido forma un complejo de anticuerpo de virus anti-PRRS de polipéptido: porcino con u n anticuerpo, si se encuentra, dentro de la m uestra, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido de virus PRRS seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos NSP 2 y polipéptidos ORF 5, en donde el polipéptido contiene un epítope para el anticuerpo de virus anti-PRRS de porcino; y (b) detectar la presencia o ausencia del complejo , en donde la presencia del complejo índica que la muestra contiene el anticuerpo de virus anti-PRRS de porcino. La muestra puede ser una muestra de suero de cerdo. El polipéptido puede tener al menos ocho residuos de aminoácidos de longitud. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos con al menos 100 aminoácidos de longitud, la cual es de al menos aproximadamente el 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ I D NO:5 con respecto a la longitud . El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos de al menos 20 aminoácidos de longitud que es de al menos aproximadamente el 80% idéntica a una secuencia establecida en SEQ I D NO:22 con respecto a la longitud. El polipéptido puede contener la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ I D NO: 1 1 . Él polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO:32. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61 ó 64. El polipéptido puede ser un polipéptido recombinante producido por células no infectadas con un virus PRRS. El paso (b), puede incluir contactar el complejo con un anticuerpo Ig anti-porcino. El anticuerpo Ig anti-porcino puede contener una enzima. El paso (a), puede incluir contactar la muestra con polipéptídos dentro de un equipo, en donde el equipo contiene un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 2 del virus PRRS y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 5 del virus PRRS. El equipo puede contener un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 7 del virus PRRS (por ejemplo, un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO:36 ó 54), un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 6 del virus PRRS (por ejemplo, un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO: 32, 48, 51 ó 67), y un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 1 del virus PRRS. El método puede incluir contactar la muestra con un polipéptido adicional para formar un complejo de anticuerpo de virus anti-PRRS de polipéptido: porcino, en donde el polipéptido adicional contiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 7 del virus PRRS, un polipéptido ORF 6 del virus PRRS, o un polipéptido NSP 1 del virus PRRS. En otro aspecto, el presente documento presenta un equipo para determinar si un animal recibió o no una versión de vacuna de un virus, o fue infectado con una versión del virus que ocurre naturalmente. El equipo incluye, (a) un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al primer polipéptido, y anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente enlazados al primer polipéptido, y (b) un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de la vacuna del virus enlaza al segundo polipéptido, y anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente que no enlaza al segundo polipéptido. El animal puede ser un vertebrado (por ejemplo, una especie avían o de mamífero). El animal puede ser un cerdo o un humano. El virus puede ser un virus PRRS. La versión de la vacuna puede ser un virus PRRS atenuado. La versión de la vacuna puede ser la vacuna RespPRRS. El primer polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos que se encuentra en una parte de terminal-C de un polipéptido ORF 5 de un virus PRRS VR2332 o RespPRRS . El segundo polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la mitad de la terminal-N de un polipéptido ORF 5 de un virus PRRS VR2332 o RespPRRS. En una modalidad , el presente documento presenta un método para determinar el estado inmunológico de un animal con respecto a un virus, en donde el estado inmunológico es tal que (1 ) el animal recibió una versión de vacuna del virus, (2) el animal fue infectado con una versión del virus que ocurre naturalmente, o (3) el animal es inmunológicamente na?ve con respecto al virus. El método incluye, (a) contactar una primera muestra del animal con un primer polipéptido bajo condiciones en donde el primer polipéptido forma un primer complejo de polipéptido: anticuerpo con un anticuerpo, si se encuentra, dentro de la primera muestra, en donde el primer polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos, de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al primer polipéptído, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente enlazan al primer polipéptido; (b) contactar una segunda muestra procedente del animal con un segundo polipéptido bajo condiciones en donde el segundo polipéptido forma un segundo complejo de polipéptido: anticuerpo con un anticuerpo, si se encuentra, dentro de la segunda muestra, en donde el segundo polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al segundo polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente no enlazan al segundo polipéptído; y (c) detectar la presencia o ausencia del primer complejo de polipéptido: anticuerpo, y la presencia o ausencia del segundo complejo del polipéptido: anticuerpo, en donde la presencia del primer complejo de polipéptido: anticuerpo, y la presencia del segundo complejo de polipéptido: anticuerpo indica que el animal recibió la versión de vacuna del virus, en donde la presencia del primer complejo de polipéptido: anticuerpo y la ausencia del segundo complejo de polipéptido: anticuerpo, indica que el animal fue infectado con la versión del virus que ocurre naturalmente, y en donde la ausencia del primer complejo del polipéptido: anticuerpo y la ausencia del segundo complejo del polipéptido: anticuerpo indica que el animal es inmunológicamente naive con respecto al virus. El animal puede ser un vertebrado (por ejemplo, una especia avian o de mamífero). El animal puede ser un cerdo o un humano. El virus puede ser un virus PRRS. La versión de vacuna puede ser un virus PRRS atenuado. La versión de vacuna puede ser la vacuna RespPRRS. El primer polipéptído puede contener una secuencia de aminoácidos que se encuentra en una parte de terminal-C de un polipéptido ORF 5 de un virus PRRS VR2332 o RespPRRS . El segundo polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos que se encuentra a la mitad de la terminal-N de un polipéptído ORF 5 de un virus PRRS VR2332 o RespPRRS. Otro aspecto del presente documento, presenta un polipéptido substancialmente puro que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NS P 2 del virus PRRS o un fragmento del polipéptido NSP 2 del virus PRRS, en donde el fragmento es mayor a 20 residuos de aminoácidos de longitud. Otro aspecto del presente documento, presenta un polipéptido substancialmente puro que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptído NSP 4 del virus PRRS o un fragmento del polipéptido NSP 4 del virus PRRS , en donde el fragmento es mayor a 20 residuos de aminoácidos de longitud. Otro aspecto del presente documento, presenta una célula huésped que expresa un polipéptido NSP 1, NSP 2 ó NSP 4 del virus PRRS. La célula puede ser una célula procariótica (por ejemplo, una célula bacteriana). Otro aspecto del presente documento, presenta un método para reducir señales de fondo en un ensayo, con la capacidad de detectar anticuerpos de virus PRRS en una muestra de porcino. El ensayo incluye contactar un soporte sólido que contiene polipéptidos del virus PRRS con la muestra porcino. El método incluye tratar el soporte sólido con una solución de bloqueo con un valor de pH mayor a 8.0 (por ejemplo, mayor a 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 ó 10.5). La solución de bloqueo puede ser leche (por ejemplo, leche en polvo sin grasa en PBS), soluciones de proteína o suero animal. Otro aspecto del presente documento, presenta un soporte sólido que contiene polipéptidos del virus PRRS. El soporte sólido fue tratado con una solución de bloqueo con un valor de pH mayor a 8.0 (por ejemplo, mayor a 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 ó 10.5). La solución de bloqueo puede ser leche (por ejemplo, leche en polvo sin grasa en PBS), soluciones de proteína o suero animal. El soporte sólido puede ser una placa plástica (por ejemplo, una placa de 96 depósitos), una corredera de vidrio, cuentas de vidrio o plástico, o similares. Otro aspecto del presente documento, presenta un método para incrementar la capacidad de un polipéptído adherido a un soporte sólido, para reaccionar con un anticuerpo que enlaza al polipéptido. El método incluye contactar el soporte sólido con el polipéptido y una lisozima. El polipéptido puede ser un polipéptido de virus PRRS. El polipéptido puede ser un polipéptido ORF 7 del virus PRRS. El polipéptido puede ser un polipéptido recombmante producido por células no infectadas con un virus PRRS. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de polipéptido de virus anti-PRRS. La lisozima puede ser una lisozima de huevo de pollo. El polipéptido y la lisozima pueden contactarse con el soporte sólido en una proporción de al menos 4 ng del polipéptido por 1 ng de la lisozima. La lisozima y el polipéptido pueden contactarse con el soporte sólido en una proporción de al menos 1 ng de la lisozima por 1 ng del polipéptido. Otro aspecto del presente documento, presenta un soporte sólido que fue tratado con un polipéptido de virus PRRS y una lisozíma. El polipéptido puede ser un polipéptido ORF 7 del virus PRRS. El polipéptido puede ser un polipéptido recombinante producido por células no infectadas con un virus PRRS. La lisozima puede ser una lisozima de huevo de pollo. El polipéptido y la lisozima pueden contactarse con el soporte sólido en una proporción de al menos 4 ng del polipéptido por 1 ng de la lisozima. La lisozima y el polipéptido pueden contactarse con el soporte sólido en una proporción de al menos 1 ng de la lisozima por 1 ng del polipéptido. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen los mismos significados a los comprendidos comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser utilizados en la práctica o elaboración de pruebas de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, será controlada. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Se podrán apreciar otras, características y ventajas de la presente invención a partir de la descripción detallada que se encuentra más adelante y de las reivindicaciones adjuntas. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1, es un diagrama de un genoma de virus PRRS.

Las regiones genómicas sombreadas con color gris fueron amplificadas mediante PCR a partir del ARN viral VR2332, fueron clonadas y expresadas en células E. coli BL21 (DE3RP). La figura 2, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:1) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET, con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 1 de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:2) codifica un polipéptido NSP 1 de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de aminoácidos mostrada (SEQ I D NO:3) es la secuencia de aminoácidos desde el sitio de inicio hasta el inicio de la región de codificación-polipéptido NSP 1 . La figura 3, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:4) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2 de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:5) codifica un polipéptido NSP 2. La secuencia de aminoácido mostrada (SEQ I D NO :6) es la secuencia de aminoácido desde el sitio de inicio dentro de la región de codificación de etiqueta myc. La secuencia LEHHHHHH (SEQ I D NO: 1 3) incluye una etiqueta his. La figura 4, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:7) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 4 de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO: 8) codifica un polipéptido NSP 4. La secuencia de aminoácido mostrada (SEQ I D NO:9) es una secuencia de aminoácido de un polipéptido myc-NSP 4-His. La figura 5, es una gráfica que traza el nivel de fluorescencia de los polipéptidos NSP 1 redoblados detectados utilizando un bioanalizador Agilent. El polipéptido NSP 1 purificado y multiplicado se aplicó a un Bioanalizador Agilent 21 00 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) y es analizado de acuerdo con el protocolo estándar del equipo Protein 50 Assay LabChip. El polipéptido NSP 1 dio como resultado picos que corresponden a 46 kD (polipéptído intacto) y PCP 1 a y PCP 1 ß de 24 y 22 kD , respectivamente. La figura 6, es una gráfica que traza el nivel de fluorescencia de los polipéptidos NSP 4 redoblados detectados utilizando un bioanalizador Agilent. El polipéptído NSP 4 purificado y multiplicado se aplicó a un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) y se analizado de acuerdo con el protocolo estándar del equipo Protein 50 Assay LabChip. El polipéptido NSP 4 dio como resultado un solo pico en 26 kD. La figura 7 , es una gráfica que traza los valores del titulador promedio para anticuerpos que reaccionan contra polipéptidos NSP 1 (no redoblados), polipéptidos NSP 1 (redoblados), y polipéptidos (ORF 7) de nucleocápsido (redoblados). El curso del tiempo de una respuesta de anticuerpo anti-NSP 1 o anti-N se llevó a cabo utilizando un corte de 14 cerdos que fueron infectados con una cepa de virus PRRS MN30100 y se les extrajo sangre en los tiempos indicados. La figura 8 , es una gráfica que traza los valores del titulador promedio para anticuerpos que reaccionan contra polipéptidos NSP 4 (no redoblados), polipéptidos NSP 4 (redoblados), y polipéptidos (ORF 7) de nucleocápsido (redoblados). El curso en tiempo de las respuestas de anticuerpo anti-NSP 4 (no redoblados) y anti-ORF 7 se llevaron a cabo utilizando un corte de 14 cerdos que fueron infectados con la cepa del virus PRRS M N301 00 , en tanto que se llevaron a cabo las respuestas anti-NSP 4 (multiplicadas) en cerdos inmunizados con la vacuna Ingelac MLV. La figura 9, es una gráfica que traza los valores del titulador promedio para anticuerpos que reaccionan contra polipéptidos NSP 1 y NSP 4 redoblados, en cerdos inmunizados con Ingelvac MLV. La figura 1 0, es una gráfica que traza la proporción de muestra/positiva (proporción S/P) para muestras analizadas utilizando el equipo ELISA comercialmente disponible (equipo I DEXX 2XR). La línea horizontal que ¡ntersecta el eje-Y en 0.4, muestra el valor de corte de un resultado positivo. La figura 1 1 , es una gráfica que traza las proporciones S/P para muestras analizadas utilizando un fragmento de 3' polipéptido del virus PRRS O RF 5 en un ensayo ELISA. La línea horizontal que intersecta el eje-Y en 0.21 , muestra el valor de corte de un resultado positivo. La figura 12, es una gráfica que traza las proporciones S/P para muestras analizadas utilizando un polipéptido quimérico GP5-M en un ensayo ELI SA. La línea horizontal que intersecta el eje-Y en 0.5, muestra el valor de corte de un resultado positivo. L figura 13, contiene dos gráficas de barra que trazan la absorbancia para muestras obtenidas de animales expuestos a víruses PRRS MLV ó MN30100. Los valores de absorbancia fueron detectados utilizando un ensayo ELISA con el polipéptido indicado. La figura 14, contiene una alineación de secuencia de los polipéptidos NSP 2 del virus PRRS. El ácido nucleico que codifica el polipéptido NSP 2 del virus PRRS VR-2332 fue truncado utilizando el sitio de restricción Xhol que ocurre naturalmente en los nucleótidos 3490-3495 para generar el ácido nucleico que codifica un polipéptido NSP 2 truncado referido como un polipéptido NSP 2P. La figura 15, contiene una alineación de secuencia de polipéptidos ORF 5 del virus PRRS. La figura 16, contiene una alineación de secuencia de los polipéptidos ORF 7 del virus PRRS. La figura 17, contiene fotografías de geles de polipéptidos de virus PRRS purificados indicados. La figura 18, contiene gráficas que trazan la absorbancia para ensayos ELISA que contienen el polipéptido indicado. Los grupos se establecen en la tabla 6. La figura 19, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:10) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2P de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO: 1 1 ), codifica un polipéptido NSP 2P. La primera secuencia de aminoácidos (SEQ I D NO: 12) es una secuencia de aminoácidos de la región de marca myc de un polipéptido myc-NSP 2P-His, en tanto que la segunda secuencia de aminoácidos (SEQ I D NO : 13) es una secuencia de aminoácidos de la región de marca His de un polipéptido myc-NSP 2P-His. La figura 20, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO: 14) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 5 5' de la cepa MN30100 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO : 15) codifica un polipéptído ORF 5 5' . La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO: 16) es una secuencia de aminoácido de un polipéptido myc-ORF 5 5'-His. La figura 21 , es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO: 1 7) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 5 5' de la cepa VR-2332 del virus PRRS . La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO: 18) codifica un polipéptido ORF 5 5' . La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO : 19) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-O RF 5 5'-His. La figura 22, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:20) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido total ORF 5 5' de la cepa VR-2332 del virus PRRS . La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:21 ), codifica un polipéptido total ORF 5. La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:22) es una secuencia de aminoácido para un polípéptido His-total myc-ORF 5. Se localiza una secuencia de aminoácidos enlazadora (GGGGS; SEQ I D NO:23) entre el primer y segundo ectodominios de la región 5' del polipéptido ORF 5. La figura 23, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (S EQ I D NO:24) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 5 3' de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:25) codifica un polipéptido ORF 5 3'. La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:26) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 5 3'-His. La figura 24, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:27) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 5 3' de la cepa M N301 00 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:28) codifica un polipéptido ORF 5 3' . La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:29) es una secuencia de aminoácido para un polipéptído una región myc-ORF 5 3'-His. La figura 25, es una descripción de un listado de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:30) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 5 + 6 de una cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:31 ) codifica un polipéptido ORF 5 + 6. La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:32) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 5 + 6-His. Se localiza una primera secuencia de aminoácidos enlazadora (GGGGS; SEQ I D NO:23) entre el primer y segundo ectodominios de la región 5' del polipéptido ORF 5. Se localiza una segunda secuencia de aminoácidos enlazadora entre el segundo ectodominio de la región 5' del polipéptido ORF 5 y el primer ectodominio de la región 5' del polipéptido ORF 6. Se localiza una tercera secuencia de aminoácido enlazadora entre el primer y segundo ectodominios de la región 5' del polipéptido ORF 6. La figura 26, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:34) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptído ORF 7 de la cepa VR-2332 del virus PRRS . La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:35) codifica un polipéptído ORF 7. La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:36) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 7-His. La figura 27, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:37) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2H P de la cepa VR-2332 del virus PRRS . La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:38) codifica un polipéptido NSP 2H P. La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO: 39) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-NSP 2HP-His.

La figura 28, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:40) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2 S1 HP de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ ID NO:41), codifica un polipéptído NSP 2 S1 HP. La secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:42) es una secuencia de aminoácidos de un polipéptido myc-NSP 2 S1 HP-Hís. La figura 29, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:43) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2 S2 HP de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ ID NO:44) codifica un polipéptido NSP 2 S2 HP. La secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:45) es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido myc-NSP 2 S2 HP-His. La figura 30, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:46) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido total ORF 6 5' de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ ID NO:47) codifica un polipéptido total ORF 6 5'. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:48) es una secuencia de aminoácidos para un polipéptido myc-ORF 65' total-His. La figura 31, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:49) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 6 3' de la cepa VR-2332 del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO: 50) codifica un polipéptido ORF 6 3' . La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:51 ) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 6 3'-His. La figura 32, contiene tres gráficas que trazan la absorbancia de muestras obtenidas de animales expuestos a M N 184, SDSU 73, o EuroPRRS, así como dos controles. Se detectaron valores de absorbancia utilizando un ensayo ELI SA de polipéptidos VR-2332 (A), polipéptidos LV (B) o una mezcla de ambos (C). La figura 33A, contiene un perfil de hidrofilicidad Kyte-Doolittle de un polipéptido NSP 2. La figura 33B, es un diagrama de NSP 2 y fragmentos de NSP 2. La numeración del aminoácido es de acuerdo con VR-2332 orf 1 (número de acceso GenBank® U87392). El sitio catalítico de proteasa de cisteína y el dominio hidrofóbico están etiquetados. La figura 34, contiene dos gráficas que trazan la absorbancia para muestras obtenidas de animales tratados como se indica a continuación . Los valores de absorbancia fueron detectados utilizando un ensayo ELISA de polipéptidos NSP 2 HP (ATP) (A) o polipéptidos NSP 2P (VR-2332) (B). La figura 35, contiene dos gráficas 3D que trazan la absorbancia de muestras positivas y negativas diluidas como se indicó y evaluadas con depósitos que tienen la cantidad indicada del polipéptido. El pH durante el paso del bloqueo fue de ya sea 7.4 (A) o 9.6 (B). La figura 36, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:52) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 7 procedente de la cepa del virus Lelystad del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO :53) codifica un polipéptido O RF 7. La secuencia de aminoácido (SEQ I D N O:54) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 7-His. La figura 37, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:55) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2P de la cepa de virus Lelystad del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO: 56) codifica un polipéptido NSP 2P. La secuencia de aminoácido mostrada, es la secuencia de aminoácido desde el sitio de inicio hasta el inicio de la región de codificación de polipéptido NSP 2P (SEQ I D NO:3), y desde el final de la región de codificación de polipéptído NSP 2P a través de la marca his (SEQ I D NO: 13). La figura 38, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:57) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2P de la cepa de virus JA 142 del virus PRRS . La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO: 58) codifica un polipéptido NSP 2P. La secuencia de aminoácido mostrada es la secuencia de aminoácido desde el sitio de inicio hasta el inicio de la región de codificación de polipéptido NSP 2P (SEQ I D NO:3), y desde el final de la región de codificación del polipéptido NSP 2P a través de la marca his (SEQ I D NO: 13). La fig ura 39 , es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:59) de una construcción myc-polípéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido NSP 2HP de la cepa de virus Boehringer I ngelheim Ingelvac ATP del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:60) codifica un polipéptido NSP 2HP . La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO: 61 ) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-NSP 2HP-His. La figura 40, es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:62) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptido ORF 5 3' de la cepa de virus Lelystad del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:63) codifica un polipéptido ORF 5 3' . La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO:64) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 5 3'-His. La figura 41 , es una descripción de una secuencia de ácido nucleico (SEQ I D NO:65) de una construcción myc-polipéptido-His de 24b pET con el polipéptido siendo un polipéptído ORF 6 3' de la cepa del virus Lelystad del virus PRRS. La secuencia de ácido nucleico subrayada (SEQ I D NO:66) codifica un polipéptído O RF 6 3'. La secuencia de aminoácido (SEQ I D NO: 67) es una secuencia de aminoácido para un polipéptido myc-ORF 6 3'-His. La figura 42, es una gráfica que traza la absorbancia versus la cantidad de lisozima de huevo de pollo agregada a 100 ng de polipéptido myc-ORF 7-His multiplicado. Los valores son los primeros de polipéptido anti-ORF 7 específicos después de la substracción de los fondos de suero negativos. Los puntos de datos son de sueros diluidos 1 /300 (rombo), 1 /600 (cuadrado), 1 /1200 (triángulo), y 1 /2400 (cruz-x). La figura 43, es una gráfica que traza el cambio en la absorbancia detectada en animales utilizando los ensayos ELI SAs. VR indica que el polipéptido es de la cepa VR2332. LV indica que el polipéptido es del virus Lelystad . La desviación estándar de los residuos es una medida de aceptación-de-ajuste de los datos a la ecuación determinada por la regresión lineal. La figura 44, contiene g ráficas que trazan la absorbancia observada con muestras inoculadas con el virus PRRS indicada utilizado ensayos ELISAs que contienen el polipéptido indicado. Descripción Detallada de la Invención El presente documento proporciona métodos y materiales relacionados para evaluar organismos y determinar si los organismos fueron expuestos o no a antígenos virales, por ejemplo, a través de una vacunación viral (por ejemplo, vacunación con una vacuna de polipéptidos virales recombinantes o una vacuna de virus atenuado) o una infección viral. Por ejemplo, el presente documento proporciona polipéptidos, ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos, métodos para elaborar dichos polipéptidos, células huésped que expresan dichos polipéptidos, métodos para elaborar dichas células huésped, equipos para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS , métodos para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS, equipos para evaluar el estado inmunológico de un organismo con respecto a un virus, y métodos para evaluar el estado inmunológico de un organismo. Polipéptidos En una modalidad , el presente documento proporciona polipéptidos que pueden ser utilizados para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS que se encuentran en una muestra de un organismo (por ejemplo, cerdos). Los anticuerpos del virus anti-PRRS pueden ser cualquier tipo de anticuerpo de virus anti-PRRS. Por ejemplo, los anticuerpos de virus anti-PRRS pueden ser anticuerpos IgA, Ig D, Ig E, IgG ó IgM . Dichos anticuerpos pueden formarse en un organismo cuando dicho organismo se expone a un antígeno de virus PRRS , tal como polipéptido de virus PRRS, una vacuna de virus PRRS atenuada , o un virus PRRS patogénico. Además, los anticuerpos de virus anti-PRRS pueden ser anticuerpos que enlazan a cualquier tipo de virus PRRS incluyendo, sin limitación , un virus VR-2332 PRRS (No. de Acceso GenBank® PRU87392; Patentes Norteamericanas Nos. 5, 846,805 y 5,683,865), un virus PRRS MN30100 (Bierl et al. , Ver. Rec , 148: 687-690 (2001 )), un virus PRRS atenuado, tal como el virus RespPRRS (No . de Acceso GenBank® AF0661 83), un virus PRRS 1 6244B (No. de Acceso GenBank® AF046869), un virus PRRS PA8 (No. de Acceso GenBank® AF 176348), un virus PRRS SP (No. de Acceso GenBank® AF 1 84212), un virus PRRS NVSL 97-7985 IA 1 -4-2 (No. de Acceso GenBank® AF325691 ), un virus PRRS P 129 (No. de Acceso GenBank® AF494042), un virus PRRS CH-1 a (No. de Acceso GenBank® AY032626), un virus PRRS JA 142 (No. de Acceso GenBank® AY424271 ), un virus PRRS NVSL 97-7895 (No. de Acceso GenBank® AY545985), o un virus PRRS PL97-1 (No. de Acceso GenBank® AY585241 ). De igual manera, los anticuerpos del virus anti-PRRS pueden ser anticuerpos que enlazan a aislados de campo o versiones que ocurren naturalmente de un virus PRRS, que incluyen, sin limitación , aislados y versiones que ocurren naturalmente de víruses PRRS, de Norte América, Europa o cualquier otra parte (por ejemplo , China). Los polipéptidos proporcionados en la presente invención , se pueden utilizar para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS que se encuentran en una muestra procedente de un organismo que es susceptible a una infección de virus PRRS . Dichos organismos incluyen, sin limitación , especies de porcino tales como cerdos domésticos y feroces y jabalíes salvajes. En algunos casos, los polipéptidos aquí proporcionados se pueden utilizar para detectar anticuerpos el virus anti-PRRS que se encuentran en una muestra de un organismo que no es susceptible a infección por virus PRRS. Por ejemplo, los polipéptidos aquí proporcionados pueden ser utilizados para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS que se encuentran en una muestra procedente de un conejo o ratón que fue expuesto a un antígeno de virus PRRS, a través, por ejemplo, en inyección de un polipéptido de virus PRRS, una vacuna de virus PRRS atenuada, o un virus PRRS patogénico. Cuando se elaboran anticuerpos de virus anti-PRRS en un ratón o conejo, la detección de los anticuerpos del virus anti-PRRS en una muestra de suero de conejo o ratón puede ayudar a los científicos a identificar conejos o ratones que producen anticuerpos del virus anti-PRRS. Se puede obtener cualquier muestra de un organismo y evaluarse con respecto a la presencia o ausencia de un anticuerpo de virus anti-PRRS. Dichas muestras incluyen , sin limitación, muestras de sangre, muestras de suero, muestras de tejido (por ejemplo, tejido linfático, tejido muscular y tejido de piel). Por ejemplo, las muestras de sangre pueden obtenerse de cerdos y evaluarse con respecto a la presencia o ausencia de anticuerpos de virus anti-PRRS de cerdo. Los polipéptidos aquí proporcionados pueden tener cualquier longitud (por ejemplo, entre 8 y 2500 residuos de aminoácidos). En algunas modalidades, el polipéptido puede contener al menos ocho residuos de aminoácidos. Por ejemplo, la longitud de un polipéptido puede ser mayor a 8, 9, 1 0 1 1 , 12, 13, 14, 1 5, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600 , 700, 800, 900, 1000, o más residuos de aminoácidos. En otras modalidades, la longitud del polipéptido puede ser de entre 25 y 800 residuos de aminoácidos, entre 50 y 800 residuos de aminoácidos, entre 50 y 450 residuos de aminoácidos, entre 50 y 400 residuos de aminoácidos, entre 50 y 300 residuos de aminoácidos, entre 100 y 400 residuos de aminoácidos, o entre 100 y 300 residuos de aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener cualquier secuencia de aminoácido. Por ejemplo, un polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido de virus PRRS (por ejemplo, un polipéptido NSP 1 , NSP 2, NSP 3, NSP 4, NSP 5, NSP 6, pol, C/H, HEL, CORONA, ORF 2, ORF 2b, O RF 3, ORF 4, ORF 5, ORF 6 u ORF 7). En algunas modalidades, el polipéptido puede ser un polipéptido NSP 2 del virus PRRS que carece de una región hidrofóbica tal como la región codificada por los nucleótidos 1339 a 3495 de la secuencia establecida en el número de Acceso GenBank PRU87392. En otras modalidades, el polipéptido puede ser un ectodominio de un polipéptido ORF 5 u ORF 6 del virus PRRS . Por ejemplo, un polipéptido puede contener el primer ectodominio del extremo 5' de un polipéptido ORF 5 del virus PRRS (ectodominio ORF 5 5' 1 ), el segundo ectodominio del extremo 5' del polipéptido ORF 5 del virus PRRS (ectodominio ORF 5 5' 2), el primer ectodominio del extremo 5' de un polipéptido O RF 6 del virus PRRS (ectodominio ORF 6 5' 1 ), el segundo ectodominio del extremo 5' de un polipéptido ORF 6 del virus PRRS (ectodominio ORF 6 5' 2), o combinaciones de los mismos. Cuando un polipéptido contiene más de uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) ectodominio, los ectodominios pueden seg uir uno al otro o estar separados a través de una secuencia enlazadora (por ejemplo, una secuencia enlazadora de aminoácidos GGGGS). Los polipéptidos aqu í proporcionados pueden contener secuencias de aminoácidos adicionales, incluyendo las comúnmente utilizadas como marcas (por ejemplo, marcas poly-histidine, marcas myc, marcas GFP y marcas GST). Por ejemplo, un frag mento de 50 aminoácidos de un polipéptído NSP 2 del virus PRRS pude contener la secuencia de aminoácidos de una marca polyhistidine (por ejemplo, HHH H H H , SEQ I D NO:33). U n polipéptido aqu í proporcionado puede contener una secuencia de aminoácidos que tiene (1 ) una longitud, y (2) un porcentaje de identidad con una secuencia de aminoácidos con respecto a la longitud. De igual manera, un ácido nucleico aislado aquí proporcionado puede codificar dicho polipéptido o puede contener una secuencia de ácido nucleico que tiene ( 1 ) una longitud, y (2) un porcentaje de identidad con una secuencia de ácido nucleico identificada con respecto a dicha longitud. Normalmente, la secuencia de ácido nucleico o aminoácido identificada es una secuencia referenciada por un número de identificación de secuencia en particular o un número de acceso GenBank particular, o es un ácido nucleico o polipéptido de virus PRRS particular (por ejemplo, polipéptido NSP 2 del virus PRRS). La secuencia de ácido nucleico o de aminoácido que es comparada con la secuencia identificada, normalmente se refiere como una secuencia objetivo. Por ejemplo, una secuencia identificada puede ser una secuencia de polipéptido ORF 5 del virus PRRS, tal como se establece en SEQ I D NO: 16, 19 ó 22. Una longitud y porcentaje de identidad con respecto a la longitud de la secuencia de ácido nucleico o aminoácido, se determina como se indica a continuación . Primero, se compara una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con la secuencia de ácido nucleico o aminoácido identificado utilizando el programa BLAST 2 Sequences (B 12seq) procedente de la versión independiente de BLASTZ que contiene la versión BLASTN 2.0.14 y la versión BLASTP 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ, puede ser obtenida en la Biblioteca de la U niversidad del Estado de N ueva York - campus Oíd Westbury (número de catálogo QH 447. M6714) así como del sitio web Fish & Richardson's ("fr" punto "com/blast/") o del sitio web del Centro Nacional de Información de Biotecnolog ía del gobierno de los Estados Unidos ("ncbi" punto "nlm" punto "nih" punto "gov"). Las instrucciones que explican como utilizar el programa B 12seq pueden encontrarse en el archivo de lectura que acompaña BLASTZ. B 12seq lleva a cabo una comparación entre dos secuencias utilizando ya sea el algoritmo BLASTN ó BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácido nucleico, en tanto, que se utiliza BLASTP para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, se establecen las siguientes opciones: se establece -i para un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que será comparada (por ejemplo, C:\seq 1 .txt); se establece -j para un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que será comparada (por ejemplo, C:\seq2.txt); se establece -p para blastn ; se establece -o para cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); se establece -q para -1 ; se establece -r para 2; y todas las otras opciones se dejan en su configuración por default. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente comando para generar un archivo de salida que contiene una comparación entre las dos secuencias: C:\B 12seq-i c:\seq 1 .txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, se establecen las siguientes opciones de B 12seq: se establece -i para un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que será comparada (por ejemplo, C:\seq 1 .txt); se establece -j para un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que será comparada (por ejemplo, C:\seq2.txt); se establece -p para blastp; se establece -o para cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las otras opciones se dejan en su config uración por default. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente comando para generar un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si la secuencia objetivo comparte homología con cualquier parte de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado presentará las regiones de homología como secuencias alineadas. Si la secuencia objetivo no comparte homología con cualquier parte de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas. Una vez alineada, se determina una longitud contando el número de nucleótidos o residuos de aminoácido consecutivos procedentes de la secuencia objetivo presentada en alineación con la secuencia de la secuencia identificada que inicia con cualquier posición que corresponde y finaliza con cualquier otra posición que corresponde. Una posición que corresponde es cualquier posición, en donde se presenta un residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en las secuencias tanto identificadas como objetivo. Las brechas presentadas en la secuencia objetivo, no se toman en cuenta ya que las brechas no son nucleótidos o residuos de aminoácidos. De igual manera, las brechas presentadas en la secuencia identificada no se cuentan ya que los nucleótidos de la secuencia objetivo o los residuos de aminoácido son contados, y no los nucleótidos o residuos de aminoácido de la secuencia identificada. El porcentaje de identidad con respecto a una longitud determina, se determina contando el número de posiciones que corresponden con respecto a la longitud y dividiendo el número entre la longitud , seguido de multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, si (1 ) se compara una secuencia objetivo de 1 000 nucleótidos con una secuencia de polipéptido NSP 2 del virus PRRS, (2) el programa B 12seq presenta 200 nucleótidos de la secuencia objetivo alineada con una región de la secuencia del polipéptido NSP 2 del virus PRRS, en donde el primero y el último nucleótidos de la región de 200 nucleótidos corresponden, y (3) el número de correspondencias con respecto a los 200 nucleótidos alineados es de 180, entonces la secuencia objetivo de 1 000 nucleótidos contiene una longitud de 200 y un porcentaje de identidad con respecto a la longitud de 90 (por ejemplo, 180 - -200 * 1 00 = 90). Se podrá apreciar que una sola secuencia objetivo de ácido nucleico o de aminoácido que se alinea con una secuencia identificada, puede tener diferentes longitudes, teniendo cada longitud su propio porcentaje de identidad. Por ejemplo, una secuencia objetivo que contiene una región de 20 nucleótidos que se alinea con una secuencia identificada como se indica a continuación , tiene muchas diferentes longitudes incluyendo las que se describen en la tabla A. 1 20 Secuencia Objetivo: AGGTCGTGTACTGTCAGTCA I I I I I I I I I I I I I I I Secuencia Identificada: ACGTGGTGAACTGCCAGTGA Tabla A Se debe observar que el valor del porcentaje de identidad es redondeado a la décima más cercana. Por ejemplo, 78.11, 78.12, 78.13 y 78.14 se redondean a 78.1, en tanto que 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 y 78.19 se redondean hasta 78.2. También se debe observar que el valor de longitud siempre será un entero. En algunas modalidades, el polipéptido puede tener una secuencia de aminoácido de al menos aproximadamente el 70% (por ejemplo, al menos aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95 ó 99%) de identidad con la secuencia establecida en SEQ ID NO:9, 16, 19, 22, 26, 29, 32, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 61, 64 ó 67, con respecto a la longitud, tal como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más residuos de aminoácidos. Los polipéptidos aquí proporcionados, pueden ser substancialmente puros. El término "substancialmente puro" tal como se utiliza en la presente invención con referencia a un polipéptido, significa que el polipéptido está substancialmente libre de otros polipéptidos, lípidos, carbohidratos y ácido nucleico, con los cuales está naturalmente asociado. Por ejemplo , un polipéptido substancialmente puro es cualquier polipéptido que es eliminado de su ambiente natural y tiene al menos el 60% de pureza. El término "substancialmente puro" tal como se utiliza en la presente invención con referencia a un polipéptido, también incluye polipéptidos químicamente sintetizados. Un polipéptido substancialmente puro puede tener al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 99% de pureza. Normalmente, un polipéptido substancialmente puro producirá una sola banda mayor en un gel de poliacrilamida sin reducción . Se puede utilizar cualquier método para obtener un polipéptido o un polipéptido substancialmente puro. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de purificación de polipéptidos comunes, tales como cromatografía por afinidad y H PLC, así como técnicas de síntesis de polipéptido. Además, se puede utilizar cualquier material como una fuente para obtener un polipéptido substancialmente puro. Por ejemplo, las células cultivadas construidas para sobre-expresar un polipéptido de interés en particular, se pueden utilizar para obtener polipéptidos substancialmente puros. Dichas células pueden ser células procarióticas (por ejemplo células bacterianas tales como células E. coli) o células eucarióticas (por ejemplo, células de levadura, células de insecto, células de mamífero). Se puede diseñar un polipéptido para contener una secuencia de aminoácido que permita que el polipéptido sea capturado en una matriz de afinidad. Por ejemplo, se puede utilizar una marca tal c-myc, hemaglutinina, poli histidina o Flag™ (Kodak) para auxiliar a la purificación del polipéptido. Dichas marcas pueden ser insertadas en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo ya sea el término carboxilo o amino. Otras fusiones que podrían se útiles incluyen enzimas que ayudan a la detección del polipéptido, tales como fosfatasa alcalina. Los polipéptidos aquí proporcionados pueden ser formulados en una composición de polipéptido que contenga ingredientes adicionales. Por ejemplo, un polipéptido aquí proporcionado puede ser combinado con otros polipéptidos para formar una composición que contiene más de un diferente polipéptido (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más diferentes polipéptidos). Por ejemplo, una composición puede contener un polipéptido NSP 2 del virus PRRS, y un polipéptido NSP 1 del virus PRRS. Una composición que contiene uno o más polipéptidos aquí proporcionados, puede contener uno o más transportadores tales como un solvente, agentes de suspensión o cualquier otro vehículo. Los vehículos pueden ser líquidos o sólidos, y pueden ser seleccionados con el uso deseado en mente, para proporcionar el volumen, consistencia deseado y otras propiedades químicas y de transporte pertinentes. Los vehículos típicos incluyen, sin limitación, agua; solución salina; agentes de enlace (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); rellenadores (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, gelatina o sulfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, almidón , polietilénglicol o acetato de sodio); desintegrantes (por ejemplo, almidón o glucolato de almidón de sodio), y agentes de humectación (por ejemplo, sulfato laurilo de sodio). Ácidos Nucleicos El término "ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente invención , comprende tanto ARN como ADN , incluyendo cADN , ADN genómico y ADN sintético (por ejemplo, sintetizado en forma química). El ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de hebra doble. Cuando es de una sola hebra, el ácido nucleico puede ser la hebra de sentido o la hebra de anti-sentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o nuclear. El término "aislado" tal como se utiliza en la presente invención con referencia al ácido nucleico, se refiere a un ácido nucleico que ocurre naturalmente que no está inmediatamente contiguo con ambas de las secuencias con las cuales está inmediatamente contigua (uno en el extremo 5' y el otro en el extremo 3') en el genoma que ocurre naturalmente del organismo o virus del cual se deriva. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación , una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre que se elimine o no esté presente una de las secuencias de ácido nucleico que normalmente se encuentran flanqueando en forma inmediata dicha molécula de AD N recombinante en un genoma que ocurre naturalmente. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado, incluye, sin limitación, un ADN recombinante que existe como una molécula separada (por ejemplo, un cADN o un fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias, así como ADN recombinante que está incorporada en un vector, un plásmido de réplica autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o virus herpes), o en el ADN genómico de un procarioto o eucarioto. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que sea parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión . El término "aislado" tal como se utiliza en la presente invención con referencia al ácido nucleico, también incluye cualquier ácido nucleico que no ocurre naturalmente, ya que las secuencias de ácido nucleico que no ocurren naturalmente no se encuentran en la naturaleza, y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma que ocurre naturalmente. Por ejemplo, un ácido nucleico que no ocurre naturalmente, tal como un ácido nucleico construido, se considera como un ácido nucleico aislado. El ácido nucleico construido puede elaborarse utilizando técnicas de síntesis de clonación molecular o de ácido nucleico químico comunes. El ácido nucleico que no ocurre naturalmente aislado puede ser independiente de otras secuencias, o encontrarse en un vector, un plásmido de réplica autónoma, un virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus o un virus de herpes) o el ADN genómico de un procarioto o eucarioto. Además, un ácido nucleico que no ocurre naturalmente puede incluir una molécula de ácido n ucleico que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión . Los expertos en la técnica podrán apreciar que un ácido nucleico que existe entre de cientos a millones de otras moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dentro de bibliotecas de cADN o genómicas, o rebanadas de gel que contienen una digestión de restricción de ADN genómico, no serán consideradas como un ácido nucleico aislado. El término "exógeno" tal como se utiliza en la presente invención , con referencia al ácido nucleico y a una célula en particular se refiere a cualquier ácido nucleico que no se origine de dicha célula en particular, tal como se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, todos los ácidos nucleicos que no ocurren naturalmente se consideran como exógenos para una célula, una vez que se introducen dentro de la misma. Es importante observar que el ácido nucleico que no ocurre naturalmente puede contener secuencias de ácido nucleico o fragmentos de secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la naturaleza, siempre que el ácido nucleico como un total, no exista en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN genómica dentro de un vector de expresión, es un ácido nucleico que no ocurre naturalmente, y por lo tanto es exógeno a una célula una vez que se introduce en la misma, ya que la molécula de ácido nucleico como un total (ADN genómico más ADN de vector) no existe en la naturaleza. Por lo tanto, cualquier vector, plásmido de réplica autónomo, o virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus o virus de herpes) el cual como un total no existe en la naturaleza, se considera como un ácido nucleico que no ocurre naturalmente. Se entiende que los fragmentos de ADN genómicos producidos mediante PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción , así como cADNs se consideran como ácido nucleico que no ocurre naturalmente, ya que existen como moléculas separadas que no se encuentran en la naturaleza. También se entiende que cualquier ácido nucleico que contiene una secuencia promotora y una secuencia que codifica polipéptido (por ejemplo, cADN o ADN genómico) en un ajuste que no se encuentra en la naturaleza, es un ácido nucleico que no ocurre naturalmente. El ácido nucleico que está ocurriendo naturalmente puede ser exógeno a una célula en particular. Por ejemplo, un cromosoma entérico aislado de la célula de una persona X, es un ácido nucleico exógeno con respecto a una célula de la persona Y, una vez que el cromosoma se introduce en la célula de la persona Y. U n ácido nucleico aislado puede codificar cualesquiera de los polipéptidos aquí proporcionados. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede codificar un polipéptido NSP 2 del virus PRRS, que carece de una región hidrofóbica (por ejemplo , residuos de aminoácidos del 1 al 722 del polipéptido NSP 2 del virus PRRS VR-2332) que se encuentra normalmente en un polipéptido NSP 2 del virus PRRS. En algunas modalidades, el ácido nucleico puede codificar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos el 70% (por ejemplo, al menos aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95 ó 99%) idéntica a la secuencia establecida en las SEQ ID NO:9, 16, 19, 22, 26, 29, 32, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 61, 64 ó 67 con respecto a la longitud, tal como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más residuos de aminoácidos. En otras modalidades, el ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico con la menos el 70% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 75, 80, 85, 90, 95 ó 99%) idéntica a la secuencia establecida en las SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 15, 18, 21, 25, 28, 31, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 58, 60, 63 ó 66 con respecto a la longitud, tal como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más nucleótidos. Los ácidos nucleicos aislados aquí proporcionados, pueden tener al menos aproximadamente 5 bases de longitud (por ejemplo, al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ó 5000 bases de longitud) e hibridar, bajo condiciones de hibridación, para la hebra de sentido o antisentido de un ácido nucleico que codifica un polipéptido aquí proporcionado (por ejemplo un polipéptido NSP 2P del virus PRRS , o un polipéptido quimérico O RF5/O RF 6 del virus PRRS). Las condiciones de hibridación pueden ser condiciones de hibridación moderada o altamente estrictas. Para el propósito de la presente invención, las condiciones de hibridación moderadamente estrictas significan que la hibridación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 42°C en una solución de hibridación que contiene 25 mM KPO4 (pH 7.4), 5X SSC, solución de Denhart 5X, 50 µg/mL de ADN de esperma de salmón sonicado, desnaturalizado, 50% de formamida, 10% de sulfato de Dextrano y 1 - 15 ng/mL de sonda (aproximadamente 5x107 cpm/µg), en tanto que los lavados se llevan a cabo a una temperatura de aproximadamente 50°C con una solución de lavado que contiene 2X SSC y 0.1 % de sulfato dodecilo de sodio. Las condiciones de hibridación altamente estrictas significan que la hibridación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 42°C en una solución de hibridación , que contiene 25 mM KPO4 (pH 7.4), 5X SSC, solución de Denhart 5X, 50 µg/mL de ADN de esperma de salmón sonicado, desnaturalizado, 50% de formamida, 10% de sulfato de Dextrano y 1 -15 ng/mL de sonda (aproximadamente 5x1 07 cpm/µg ), en tanto que los lavados se llevan a cabo a una temperatura de aproximadamente 65°C con una solución de lavado que contiene 0.2X SSC y 0.1 % de sulfato dodecilo de sodio. Los ácidos nucleicos aislados se pueden obtener utilizando cualquier método que incluya, sin limitación, técnicas de clonación molecular comunes o síntesis de ácido nucleico químico. Por ejemplo, se puede utilizar PCR para obtener un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de ácido nucleico que comparte similitud con una secuencia de ácido nucleico de virus PRRS proporcionado, por ejemplo, en GenBank® (por ejemplo, No. de Acceso GenBank® PRU87392). PCR se refiere a un procedimiento o técnica en la cual el ácido nucleico objetivo se amplifica en una forma similar a la que se describe en la Patente Norteamericana No. 4,683, 195, y las modificaciones subsecuentes del procedimiento aquí descrito. Generalmente, la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, se utilizan para diseñar cebadores de oligon ucleótidos que son idénticos o similares en secuencia a hebras opuestas de una plantilla potencial que será amplificada. Utilizando PCR, una secuencia de ácido nucleico puede ser amplificada a partir de ARN o ADN . Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico puede ser aislada mediante amplificación PCR del ARN celular total, ADN genómico total , y cADN , así como de secuencias de bacteriófago, secuencias de plásmido, secuencias virales y similares. Cuando se utiliza el ARN como una fuente de la plantilla, se puede utilizar transcriptasa inversa para sintetizar hebras de ADN complementarias.

Además, las bases de datos de ácido nucleico y aminoácido (por ejemplo, GenBank®) se pueden utilizar para obtener un ácido nucleico aislado. Por ejemplo, cualquier secuencia de ácido nucleico que tenga cierta homología con una secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido aquí proporcionado, se puede utilizar como una consulta para investigar GenBank®. Células Huésped Se puede diseñar una célula huésped para contener un ácido nucleico aislado aquí descrito. Dichas células pueden ser células procarióticas (por ejemplo, células bacterianas tales como células de especies E. coli, B. subtilis, o Agrobacterium tumifaciens, Streptomyces) o células eucarióticas (por ejemplo, células fúngicas tales como células de levadura que incluyen , sin limitación, células de especie Saccharomyces y células Pichia pastoris; células de insecto; células de mamífero). Se debe observar que las células que contiene un ácido nucleico aislado aquí proporcionado, no se requiere que expresen un polipéptido. Además, el ácido nucleico aislado puede ser integrado en el genoma de la célula o mantenerse en un estado episomal. Por lo tanto, las células huésped pueden ser transfectadas en forma estable o temporal con una construcción que contiene un ácido nucleico aislado aquí proporcionado. Normalmente, una célula contiene una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido aquí proporcionado, y expresa dicho polipéptido codificado.

Se pueden utilizar cualesquiera métodos par introducir una molécula de ácido nucleico aislada en una célula. Por ejemplo, se puede utilizar precipitación de fosfato de calcio, electroporación, shock de calor, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico transmitida en forma viral que son métodos comunes, para introducir una molécula de ácido nucleico aislada en una célula. Detección de anticuerpos de virus anti-PRRS Los métodos y materiales aquí proporcionados, se pueden utilizar para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS dentro de un organismo (por ejemplo, un cerdo). En general, se detectan anticuerpos de virus anti-PRRS contactando un polipéptido de virus PRRS aquí proporcionado, con una muestra de un organismo bajo condiciones, en donde el polipéptido de virus PRRS puede enlazar a un anticuerpo de virus anti-PRRS, si se encuentra dentro de la muestra, para formar un complejo de anticuerpo-polipéptido. Dichos complejos pueden detectarse utilizando, por ejemplo, anticuerpos etiquetados que enlazan a los anticuerpos del organismo. Cualesquiera de los polipéptidos del virus PRRS aquí proporcionados, se pueden utilizar para detectar anticuerpos del virus anti-PRRS. Además, se pueden utilizar múltiples polipéptidos de virus PRRS diferentes aquí proporcionado, en combinación para detectar anticuerpos de virus anti-PRRS. Por ejemplo, se puede utilizar un equipo que contiene polipéptidos NSP 1 , NSP 2, NSP 4 y O RF 7 del virus PRRS, para detectar anticuerpos del virus anti-PRRS. Normalmente, los polipéptidos del virus PRRS son inmovilizados en substratos sólidos tales como varillas graduadas, placas de microtitulación , partículas (por ejemplo , cuentas), columnas de afinidad y membranas de inmunomanchado. Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5, 143, 825; 5,374,530; 4, 908,305 y 5,498, 551 , para descripciones de ejemplos de substratos sólidos y métodos para su uso. Por ejemplo, se pueden inmovilizar polipéptidos del virus P RRS en un substrato sólido, tal como una placa de 96 depósitos, utilizando metodologías conocidas, posteriormente contactarlas con una muestra de un cerdo, bajo condiciones tales como las de anticuerpos de virus anti-PRRS que se encuentran dentro de la muestra, que pueden enlazar a los polipéptidos del virus PRRS inmovilizado para formar complejos de anticuerpo-polipéptido. Las condiciones adecuadas incluyen incubación en un regulador adecuado (por ejemplo, regulador de fosfato de sodio, pH 7.2 a 7.4) a temperatura ambiente desde aproximadamente al menos 10 minutos hasta aproximadamente 1 0 horas (por ejemplo, hasta aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2.5 horas) Posteriormente, se lava el material no enlazado, y los complejos de anticuerpo-polipéptido pueden ser detectados. La detección de la presencia de dichos complejos de anticuerpo-polipéptido, puede indicar una infección de virus PRRS. Se puede utilizar cualquier método para detectar los complejos de anticuerpo-polipéptido. Por ejemplo, una molécula indicadora que tiene afinidad de enlace con el complejo de anticuerpo-polipéptido, se puede utilizar para detectar un complejo de anticuerpo-polipéptido. Tal como se utiliza en la presente, una "molécula indicadora" es cualq uier molécula que permite la presencia de un polipéptido, anticuerpo o complejo de anticuerpo-polipéptido determinado para ser visualizado, ya sea a simple vista o con un instrumento adecuado. Normalmente, la molécula indicadora es un anticuerpo que tiene afinidad de enlace para anticuerpos procedentes del organismo (por ejemplo, un cerdo) del cual se obtuvo la muestra, por ejemplo, anticuerpos IgG anti-cerdo. Las moléculas indicadoras pueden ser detectadas ya sea directa o indirectamente a través de metodologías estándar. Ver por ejemplo la publicación de Current Protocols in i mmunology, Capítulos 2 y 8, Coligan y Asociados (eds. ), John Wiley & Sons (1996). Para detección directa, la molécula indicadora puede estar etiquetada con un radioisótopo, fluorocromo, otra etiqueta no radioactiva , o cualquier otro cromóforo adecuado. Para métodos de detección indirecta, las enzimas tales como peroxidasa de rábano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP) pueden adherirse a la molécula indicadora, y la presencia del complejo de anticuerpo-polipéptido puede detectarse utilizando ensayos estándar para H RP ó AP. Como alternativa, la molécula indicadora puede ser adherida a avidina o estreptavidina , y la presencia del complejo de anticuerpo-polipéptido puede ser detectada con biotina conjugada, por ejemplo, para un fluorocromo o viceversa. Por lo tanto, los formatos de ensayo para detectar complejos de anticuerpo-polipéptido pueden incluir inmunoensayos enlazados por enzimas (ELISA) tales como ELISAs competitivos, radioinmunoensayos (RÍA), ensayos de fluorescencia, ensayos quimioluminescentes, ensayos de inmunomanchado (manchados Western), ensayos a base de particulado y otras técnicas conocidas. En algunas modalidades, se forman en la solución complejos de anticuerpo-polipéptido. Dichos complejos pueden detectarse mediante inmunoprecipitación. Ver por ejemplo la publicación de Short Protocols in Molecular Biology, Capítulo 1 0 , Sección VI , Ausubel y Asociados, (eds.), Green Publishing Associates y John Wiley & Sons (1 992) . Equipos para detectar anticuerpos de virus PRRS. Los polipéptidos de virus PRRS aquí proporcionados, se pueden utilizar para elaborar equipos para detectar anticuerpos de virus PRRS. Dichos equipos pueden contener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más diferentes polipéptidos de virus PRRS. Por ejemplo, un equipo puede contener un polipéptidos NSP 1 de virus PRRS, un polipéptido NSP 2 de virus PRRS, un polipéptido NSP 4 de virus PRRS, un polipéptido ORF 5 de virus PRRS, un polipéptido ORF 6 de virus PRRS, un polipéptido ORF 7 de virus PRRS, o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, el equipo puede contener un polipéptido NSP 2P de virus PRRS y un polipéptido ORF 7. El equipo que contiene los polipéptidos de virus PRRS pueden contener otros componentes, incluyendo sin limitación , materiales para empaque (por ejemplo, instrucciones escritas), moléculas indicadoras (por ejemplo, anticuerpos Ig anti-porcino), amortiguadores, muestras de control positivo (por ejemplo, una muestra que contiene anticuerpos de virus PRRS de porcino) y muestras de control negativo (por ejemplo, una muestra que contiene suero de porcino que carece de anticuerpos de virus PRRS de porcino. Evaluación del estado inmunológico de un organismo. Los métodos y materiales aquí proporcionados, pueden ser utilizados para determinar el estado inmunológico de un organismo con respecto a un virus. Dichos métodos y materiales pueden ser utilizados para determinar el estado inmunológico en cualquier o ganismo. Por ejemplo, el estado inmunológico de un cerdo, perro, gato, pájaro (por ejemplo, pollo, pavo o pato), oveja, vaca, caballo, cabra, mono o humano puede determinarse utilizando los métodos y materiales aquí proporcionados. Además, el estado inmunológico de un organismo con respecto a cualquier virus podrá ser determinado. Por ejemplo, el estado inmunológico de un organismo con respecto a un virus P , un circovírus, un virus influenza , un virus de herpes, un adenovirus, un parvovirus, un coronavirus, un picornavirus, un virus de parainfluenza o un filovirus puede ser determinado. En una modalidad, los métodos y materiales aquí proporcionados pueden utilizarse para determinar si el estado inmunológico de un organismo es tal que, (1 ) el organismo recibió una versión de vacuna de un virus, (2) el organismo fue infectado con la versión del virus que ocurre naturalmente, o (3) el organismo es inmunológicamente naive con respecto al virus. En algunos casos, los métodos y materiales aquí proporcionados pueden ser utilizados para diferenciar entre organismos que tienen ya sea un estado inmunológico, de modo que (1 ) el organismo recibió una versión de vacuna de un virus ó (2) el organismo fue infectado con una versión del virus que ocurre naturalmente. En general, se utilizan al menos dos polipéptidos para evaluar el estado inmunológico de un organismo. El primer polipéptido puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que está conservada (por ejemplo, altamente conservada, o en alg unos casos, completamente conservada) entre una versión de vacuna de un virus y de versiones del virus que ocurren naturalmente. Por ejemplo, el primer polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlacen al primer polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra las versiones del virus que ocurren naturalmente enlacen al primer polipéptido. Cuando se evalúa el estado inmunológico de un cerdo con respecto a un virus PRRS, el primer polipéptido puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que está conservada entre la vacuna y las versiones de los viruses PRRS que ocurren naturalmente, tales como una región de terminal-C de un polipéptido ORF 5 PRRS. Se pueden obtener otras secuencias de aminoácidos conservadas entre vacunas y versiones de viruses PRRS que ocurren naturalmente, a partir de alineaciones de secuencia estándar (figuras 14 a 16). El segundo polipéptido puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que no está bien conservada (por ejemplo, una secuencia variable) entre una versión de la vacuna y un virus y versiones del virus que ocurren naturalmente. El segundo polipéptido que tiene una secuencia que es similar o idéntica a una secuencia que se encuentra en una versión de vacuna del virus. Por ejemplo, el segundo polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos, de modo que los anticuerpos elaborados contra una versión de vacuna del virus se enlazan al segundo polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra las versiones del virus que ocurren naturalmente no enlazan al segundo polipéptido. Cuando se evalúa el estado inmunológico de un cerdo con respecto a un virus PRRS, el segundo polipéptido puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es variable entre vacunas y versiones de viruses PRRS que ocurren naturalmente, tales como una región de terminal-N de un polipéptido O RF 5 PRRS . La secuencia de aminoácidos de dicho segundo polipéptido puede ser de un virus PRRS VR-2332 ó RespPRRS. Otras secuencias de aminoácido no conservadas entre vacunas y versiones de viruses PRRS que ocurren naturalmente, se pueden obtener a partir de alineaciones de la secuencia estándar (figuras 14 a 16). Para evaluar el estado inmunológico de un organismo con respecto a un virus, el primero y segundo polipéptidos pueden ponerse en contacto con una muestra del organismo bajo condiciones que el primero y segundo polipéptidos puedan enlazar a anticuerpos anti-virus, si se encuentran dentro de la muestra, para formar ya sea (1 ) un primer complejo de polipéptido-anticuerpo ó (2) un primer complejo de polipéptido-anticuerpo y un segundo complejo de polipéptido-anticuerpo. La formación de un primer complejo de polipéptido-anticuerpo y no del segundo complejo de polipéptido-anticuerpo, puede indicar que la muestra proviene de un organismo que fue expuesto a una versión del virus que ocurre naturalmente. La formación tanto del primer complejo de polipéptido-anticuerpo como del segundo complejo de polipéptido-anticuerpo puede indicar que la muestra proviene de un organismo que fue expuesto a una versión de vacuna del virus. La falla para detectar ya sea el primer complejo de polipéptido-anticuerpo o el segundo complejo de polipéptido-anticuerpo, puede indicar que la muestra proviene de un organismo que es naive con respecto al virus.

En el caso de la evaluación del estado inmunológico de un cerdo con respecto al virus PRRS , el primero y segundo polipéptidos pueden poner en contacto con una muestra de sangre del cerdo bajo condiciones tales que el primero y segundo polipéptidos puedan enlazar a los anticuerpos del virus PRRS, si se encuentran dentro de la muestra de sangre, para formar ya sea (1 ) un primer complejo de polipéptido-anticuerpo ó (2) un primer complejo de polipéptido-anticuerpo y un segundo complejo de polipéptido-anticuerpo. La formación del primer complejo de polipéptido-anticuerpo y no el segundo complejo de polipéptido-anticuerpo, puede indicar que la muestra proviene de un cerdo que fue expuesto a una versión del virus PRRS que ocurre naturalmente. La formación tanto del primer complejo de polipéptido-anticuerpo como del segundo complejo de polipéptido-anticuerpo, puede indicar que la muestra proviene de un cerdo que fue expuesto a una versión de vacuna del virus PRRS. La falla en la detección ya sea del primer complejo de polipéptido-anticuerpo o el segundo complejo de polipéptido-anticuerpo, puede indicar que la muestra proviene de un cerdo que es naive con respecto al virus. Normalmente, los polipéptidos del virus están inmovilizados en substratos sólidos tales como varillas graduadas, placas de mícrotitulación , partículas (por ejemplo, cuentas), columnas de afinidad y membranas de inmunomanchado. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5, 143, 825; 5,374,530; 4,908,305; y 5,498,551 , para descripciones de ejemplo de los substratos sólidos y métodos para su uso. Por ejemplo, los polipéptidos del virus PRRS (por ejemplo, un polipéptido con una secuencia de virus PRRS limitada a una secuencia de aminoácido de virus PRRS conservada de otro polipéptido con una secuencia de virus PRRS limitada a una secuencia de aminoácido de virus P RRS divergente) puede ser inmovilizada en un substrato sólido, tal como una placa de 96 depósitos, utilizando metodologías conocidas, posteriormente ponerse en contacto con una muestra de un cerdo bajo condiciones tales que los anticuerpos de virus PRRS que se encuentran dentro de la muestra puedan enlazar a los polipéptidos del virus PRRS inmovilizado para formar complejos de polipéptido-anticuerpo. Las condiciones adecuadas incluyen incubación en un amortiguador adecuado (por ejemplo, regulador de fosfato de sodio, pH de 7.2 a 7.4) a temperatura ambiente, desde aproximadamente al menos 10 minutos hasta aproximadamente 1 0 horas (por ejemplo , desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2.5 horas). Posteriormente, se lava el material no enlazado y los complejos de polipéptido-anticuerpo pueden ser detectados tal como se describe en la presente invención. Equipos para evaluar el estado inmunológico de un organismo. U n primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, de modo que los anticuerpos elaborados contra una versión de vacuna de virus puedan enlazar al primer polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra versiones del virus que ocurren naturalmente que pueden enlazar al primer polipéptido puedan ser combinadas con un segundo polipéptido para elaborar un equipo para evaluar el estado inmunológíco de un organismo. El segundo polipéptido puede tener una secuencia que es similar o idéntica a una secuencia que se encuentra en una versión de vacuna del virus. Además, el segundo polipéptido puede tener una secuencia de aminoácido de modo que los anticuerpos elaborados contra una versión de vacuna de virus enlacen al segundo polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra versiones del virus que ocurren naturalmente no enlacen al segundo polipéptido. Dichos equipos pueden contener polipéptidos adicionales. Por ejemplo , un equipo puede contener dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez ó más diferentes polipéptidos, teniendo cada uno una secuencia diferente que está conservada entre la vacuna y las versiones del virus q ue ocurren naturalmente. De igual manera, un equipo puede contener dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez ó más diferentes polipéptidos, teniendo cada uno una secuencia viral diferente que no está conservada entre la vacuna y las versiones del virus que ocurren naturalmente. El equipo puede contener otros componentes incluyendo, sin limitación, materiales de empaque (por ejemplo, instrucciones escritas) moléculas indicadoras (por ejemplo, anticuerpos Ig de anti-organismos), amortiguadores, muestras de control positivo y muestras de control negativo. En algunos casos, un soporte sólido se puede poner en contacto con un polipéptido y una lisozima para incrementar la capacidad del polipéptido adherido al soporte sólido, de reaccionar con un anticuerpo que enlaza al polipéptido. Se puede adherir cualquier polipéptido a un soporte sólido, incluyendo, sin limitación, los polipéptidos del virus PRRS aquí proporcionados (por ejemplo, el polipéptido ORF 7 del virus PRRS). Se puede utilizar cualquier lisozima. Normalmente, una lisozima puede ser una enzima hidrolítica que degrada las ligaduras ß-1 ,4 glucosídicas entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina en paredes celulares de ciertas bacterias, particularmente bacterias gram-positivas. Se puede encontrar una lisozima en secreciones y tejidos animales, incluyendo, sin limitación , saliva, lágrimas, leche, orina, mucosa cervical, leucocitos y en ríñones. Por ejemplo, se puede encontrar una lisozima en secreciones uterinas del cerdo (Roberts and Bazer, J. Reprod. Fértil. , 82: 875-892 ( 1988)). La lisozima procedente de huevo de pollo blanco, ha sido extensamente estudiada y fue la primera enzima para la cual se resuelve una estructura de cristal (Diamond , J. Mol. Biol. , 82:371 -391 (1 984)). La lisozima está ampliamente distribuida en clara de huevo de pájaros (Prager y Asociados, J. Biol. Chem. , 249:7295-7297 (1974)). Las relaciones de función de estructura de las lisozimas se describen en otras partes (I moto y Asociados, J. Vertébrate Lysozymes, The Enzymes 7, P. Boyer, Academic Press, NY, 1 972)). Se puede utilizar cualquier proporción de polipéptido a lisozima. Por ejemplo, se puede contactar un polipéptido y una lisozima con un soporte sólido en una proporción de al menos 4 ng del polipéptido por 1 ng de la lisozima (por ejemplo, 4: 1 , 5: 1 , 6: 1 , 7: 1 , ó más). En algunos casos, se puede contactar una lisozima y un polipéptido con un soporte sólido en una proporción de al menos 1 ng de la lisozima por 1 ng del polipéptido (por ejemplo, 1 : 1 , 2: 1 , 3: 1 , 4: 1 , 5: 1 , ó más). El soporte sólido puede ser cualquier tipo de soporte sólido incluyendo, sin limitación, correderas de vidrio, placas de plástico, placas de 96 depósitos, cuentas y similares. La presente invención será descrita en forma adicional en los ejemplos que se encuentran a continuación, los cuales no limitan el alcance de la presente invención tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas. EJEMPLOS Ejemplo 1 - Producción de polipéptidos de virus PRRS recombinante Métodos y materiales. Se obtuvieron vectores de clonación de plásmido pET24b, pET25b, y pETBIue2 en Novagen (Madison, Wl) y se obtuvo pG EM-T de Promega (Madison, Wl), se obtuvieron células en Novagen . Se obtuvieron cepas E. coli (BL21 (DE3) Tunwer, RP, y ABLE-K en Stratagene (La Jolla, CA). Se obtuvieron células DH5a en I nvitrogen (Carlsbad, CA). Se obtuvieron equipos de purificación de plásmido y ADN en Qiagen (Valencia, CA). Se obtuvieron reactivos PCR en Applied Biosystems (Roche Molecular Systems, Branchburg , N-J ). Se obtuvieron suministros de laboratorio estándar, medios de crecimiento bacteriano y químicos para electroforesis en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se obtuvieron fragmentos de cADN de virus PRRS para clonación mediante amplificación PCR-transcriptasa inversa de regiones de ARN genómico VR-2332 que codifican NSP 1 a y 1 ß, NSP 2, y NSP 4. Amplificación PCR, clonación de fragmentos de ADN y análisis de restricción . Se diseñaron cebadores para PCR utilizando Primer3 (Whitehead I nstitute for Biomedical Research , Cambridge, Massachusetts) y una secuencia VR2332 de la cepa de virus PRRS (número de acceso GenBank U87392 ó PRU87392) (tabla 1 ). Se sintetizaron , purificaron y cuantificaron cebadores mediante Integrated DNA Technologies, I nc. (Coralville, IA). Las reacciones PCR utilizaron el equipo AmpliTaq Gold® activado por calor de Applied Biosystems (Roche Molecular Systems, Branchburg , NJ). Las mezclas de reacción (volumen total de 50 µl) contuvieron 10X Buffer I I (concentración IX), 1 .5 mM MgCI2, 200 µM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 0.2 µM cada par de cebador (tabla 1 ); 1 .0 U AmpliTaq Gold®, y el cADN adecuado. Al momento del mezclado, las soluciones se colocaron inmediatamente en el termociclador (sistema PCR GeneAmp 2400 , Perkin Elmer, Shelton , CT). Ciclo de temperatura: 1 ciclo (95°C durante 10 minutos); 35 ciclos (94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos); 1 ciclo (72°C durante 7 minutos, se mantuvo a 4°C). El ADN amplificado resultante se separó posteriormente utilizando un gel de agarosa. Las bandas que corresponden a los tamaños de producto anticipados fueron extraídas por gel (Gel Extraction Kit, Qiagen) y posteriormente fueron purificadas en forma adicional utilizando un equipo de purificación PCR. Los productos aislados fueron clonados posteriormente en un vector pG EM-T y transformados en células DH5a, las cuales fueron dispersadas en LB de placas de ágar de 100 µg/ml de ampicilina (Amp) con I PTG y X-Gal. Se seleccionaron y crecieron colonias blancas. El ácido nucleico de las colonias seleccionadas fue secuenciado utilizando cebadores T7 y SP6 estándar (Advanced Genetic Analysis Center, University of Minnesota, St. Paul MN). Después de una clasificación de búsqueda BLAST inicial (GeneBank NCBI , Bethesda, MD), se editaron archivos de trazo para eliminar la secuencia del vector (Seqman, DNASTAR, I nc. , Madison , Wl ) y se alinearon (Megalign, DNASTAR). Un vector especializado con base en pET 24b (Novagen , Madison Wl) que contiene una secuencia líder 5' de etiqueta myc y una etiqueta His 3' terminal , fueron construidas para expresión y aislamiento de polipéptido de alta eficiencia. Este plásmido (pET 24b myc His) contiene un sitio Bam H l inmediatamente 3' para la marca myc y un sitio Xho I que precede la marca 6X His terminal. El vector se preparó para inserción mediante digestión con Bam H I y Xho I , seguido de desfosforilación con fosfatasa alcalina de intestino de becerro (CIAP) (Promega). Las condiciones PCR, aislamiento de inserto, y purificación fueron como se describió anteriormente después de la digestión por restricción (BamH I , Xho I ) para preparar el inserto para ligadura. Las reacciones de ligadura normalmente contenían 100 ng del vector desfosforilado, 20 ng de inserto, IX de amortiguador de ligadura, y 400 U nidades de ligasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA), volumen total 10 µl. La reacción de ligadura se colocó a una temperatura de 16°C durante 16 horas antes de la transformación en células DH5a. Se seleccionaron colonias tal como se describió previamente y se crecieron. El ácido nucleico de las colonias seleccionadas fue secuenciado y analizado (producción en plásmido pET 24b myc-polipéptido-His). Prueba de expresión de proteína. Para probar la expresión de polipéptido, se transformaron plásmidos recombinantes en células BL21 (DE3)-RP, las cuales contienen tARN's eucarióticos para arginina y prolina y son resistentes a cloranfenicol (cam). Las células transformadas fueron dispersadas en canamicina 30 µg/ml (kan 30), cloranfenicol 35 µg/ml (cam 35), placas LB y clasificadas por colonia PCR, utilizando los cebadores T7 y SP6 del plásmido 24b pET. Se crecieron durante la noche 1 0 colonias positivas a una temperatura de 30°C en 2 ml de medio 2xYT (kan 30, can 35). Se utilizaron 200 µl de cada uno de los cultivos durante la noche, para inocular diez alícuotas de 10 ml equilibradas en temperatura (30°C) de 2xYT (kan 30). Estos cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C hasta un OD6oo de 0.4, se eliminaron 200 µl para análisis SDS-PAGE, y se agregaron IPTG a una concentración final de 1 .0 mM . Las muestras inducidas se dejaron crecer a una temperatura de 30°C durante 4 horas, y posteriormente se eliminaron 200 µl para análisis SDS-PAG E. Expresión y purificación de polipéptido a gran escala. Se purificaron polipéptidos utilizando una modificación del procedimiento de aislamiento de afinidad de agarosa Qiagen Ni-NTA para proteínas marcadas His nativas. En síntesis, las células bacterianas inducidas de un cultivo de 1 litro, fueron peletizadas en 4,000 g durante 20 minutos a una temperatura de 4°C, y se decantó el sobrenadante. El pellet fue resuspendido en 30 ml de amortiguador de lisis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI, 10 mM imidazole, 1 µM pepstatina A, 1 µM leupeptina, y 1 mM PMSF, a un pH de 8.0), y posteriormente se agregó lisozima a una concentración final de 1 .0 mg/ml. La solución se incubó en hielo durante 60 minutos, seguido de sonicación sobre hielo utilizando seis ráfagas de 1 0 segundos de 250 W en intervalos de 10 segundos. Posteriormente se agregaron ARNsa (10 µg/ml final) y ADNsa 1 (5 µg/ml final), y la solución se incubó sobre hielo durante 15 minutos adicionales para degradar en forma adicional los ácidos nucleicos. Posteriormente el lisado fue centrifugado (4°C) durante 30 minutos a 1 0, 000 xg para peletizar los agregados insolubles y los residuos celulares. El pellet contuvo la mayoría del polipéptido recombinante expresado en la forma de cuerpos de infusión y fue aislado en la forma desnaturalizada para ser multiplicado posteriormente. I nmediatamente después de la centrifugación, este pellet fue suspendido nuevamente en 30 ml de una solución que contiene 1 00 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, y 8 M urea en un pH de 8.0. El pellet resuspendido fue rotado (200 rpm) a temperatura ambiente durante 30 minutos y posteriormente puesto a una temperatura de 4°C para procesamiento posterior. El sobrenadante que contiene diversos niveles de polipéptido soluble, fue decantado en 6 ml de una pasta 50% Ni-NTA y rotado suavemente (200 rpm) durante 1 hora a una temperatura de 4°C. la mezcla de sobrenadante-Ni-NTA fue vertida posteriormente en una columna 1 .5 x 30 cm y extraída por gravedad . La columna fue lavada dos veces con 20 ml de una solución que contiene 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI , 20mM imidazole, 1 µM pepstatina A, 1 µM leupeptina, y 1 mM PMSF, en un pH de 8.0. El polipéptido fue eluido con cuatro alícuotas de 3 ml de amortiguador de elución que contiene 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI , 250 mM imidazole, 1 µM pepstatina A, 1 µM leupeptina, y 1 mM PMSF, en un pH de 8.0. Se concentraron polipéptidos purificados ya sea mediante una cinta de filtración de flujo tangencial (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kD, Millipore, Bedford MA) o un aparato de filtro centrífugo YM-3 Amicon Centriprep® (Millipore Corp. Bedford, MA), seguido de diálisis (Spectra/Por MWCO® 6-8,000, Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA) contra 50% de glicerol y 20 mM Tris-HCl, pH de 7.5. Se determinaron las concentraciones de polipéptido utilizando el equipo de ensayo de proteína Bio-Rad RC DC (Bio-Rad, Hercules, CA). Las soluciones de polipéptido purificadas fueron almacenadas a una temperatura de -20°C. La mezcla de polipéptido recombinante insoluble desnaturalizado almacenado a una temperatura de 4°C fue centrifugado a una temperatura de 4°C durante 30 minutos en 10,000 xg para peletizar los residuos celulares. El sobrenadante conten ía altos niveles del polipéptido recombinante desnaturalizado previamente insoluble y fue decantado en 6 ml de una pasta 50% Ni-NTA y girado suavemente (200 rpm) durante 1 hora a una temperatura de 4°C. La mezcla de sobrenadante-N¡-NTA posteriormente fue vertida en una columna de 1 .5 x 30 cm y se permitió la extracción. La columna fue lavada dos veces con 20 ml de una solución que contiene 1 00 mM NaH2PO , 10 mM Tris-HCl , y 8 M urea, en un pH de 6.3. Posteriormente el polipéptido fue extractado cuatro veces con alícuotas de 3 ml de regulador de extracción que contiene 1 00 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl , y 8 M urea, pH 5.9. Se llevaron a cabo análisis de gel SDS, concentración del polipéptido, diálisis en PBS, y las determinaciones de concentración tal como se describió anteriormente. Redoblado de polipéptido. El redoblado del polipéptido recombinante desnaturalizado se llevó a cabo utilizando una variación de los métodos descritos en otras partes (Buchner y Asociados, Anal. Biochem. , 205:263-270 ( 1 992) y Clark, Curr. Opin . Biotechnol . , 9: 157-163 (1998)). En síntesis, las soluciones de polipéptido desnaturalizadas que contienen polipéptido purificado fueron recolectadas y dializadas (Spectra/Por MWCO® 6-8 , 000, Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA) durante 4 horas a una temperatura de 4°C contra 500 ml de 0.1 M Tris, pH 8.0, 6M guanidina-HCI , y 2 mM EDTA. Posteriormente la diálisis fue repetida con amortiguador fresco durante 4 horas adicionales. Después de ajustar la concentración de péptido a 3 mg/ml (concentración determinada con el equipo de ensayo de proteína Bio-Rad RC DC, Bio-Rad , Hercules, CA), se agregó ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 300 mM DTT. La solución de 5-ml resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas seguido de filtración utilizando un filtro 0.45 µm (Syrin.ge Filter, Físher Scientific, Pittsburgh, PA). La solución de polipéptido reducida se agregó posteriormente en forma rápida a una temperatura de 4°C con agitación moderada en 500 ml de amortiguador de multiplicación (100 mM Tris HCl , pH 8.0, 0.5 M L-arginina, 8 mM de glutationa oxidada, 2 mM EDTA, 10 µM pepstatina A, 1 0 µM leupeptina, y 1 mM PMSF) que corresponde a una dilución final de aproximadamente 1 : 1 00. La solución resultante posteriormente fue filtrada a través de una membrana de 0.22 µm (Steritop, Millipore, Bedford , MA) para eliminar los particulados y se agitó durante la noche. Se concentró el polipéptido purificado mediante una cinta de filtración de flujo tangencial (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kD, Millipore, Bedford , MA) hasta un volumen de 1 0 ml seguido de diálisis (Spectra/Por MWCO® 6-8 , 000, Spectrum Laboratories) contra 50% de glicerol y 20 mM Tris HCl, pH de 7.5. Se determinaron las concentraciones de polipéptido utilizando el equipo de ensayo de proteína Bio-Rad RC DC (Bio-Rad, Hercules, CA). Se almacenaron soluciones de polipéptido purificadas a una temperatura de -20°C. Electroforesis de gel e inmunomanchado. Se analizaron los usados bacterianos, fracciones de purificación y polipéptidos purificados sobre geles de SDS-poliacrilamida con el sistema de amortiguación Laemmli (Laemmli, Nature, 227:680-684 ( 1974)). Se visualizaron bandas de proteína manchando con 0.025% de azul Coomassie. Para el inmunomanchado, se electromancharon los geles sobre membranas de nitrocelulosa soportada (MSI Separations, Westbrook MA). Las membranas fueron incubadas con anticuerpo monoclonal anti-myc 9E 10 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectó el enlace de anticuerpos utilizando IgG de cabra-anti-ratón conjugado por fosfatasa alcalina y se visualizó con el sistema ECL Western Blotting (Amersham Pharmacia Biotech , Piscataway, NJ). ELISA Se recubrieron placas ELI SA con polipéptidos de virus PRRS individuales en 1 00 µl de amortiguador de carbonato ( 15 mM Na2CO y 35 mM NaHCO3), pH 9.6, o amortiguador solo durante la noche y se lavó seis veces con PBS-Tween (0.1 % Tween-20). Se agregaron 200 µl de PBS-Tween que contiene 2.5% de leche en polvo sin grasa durante 1 hora a temperatura ambiente, para bloquear los sitios enlazados previamente, y las placas se lavaron cinco veces. 100 µl de suero de cerdo en varias diluciones se agregó por duplicado durante 2 horas a temperatura ambiente, y las placas se lavaron 24 veces con PBS-Tween. Los niveles de anticuerpo específico fueron determinados mediante incubación de los depósitos en IgG cabra-anti-porcino conjugado con peroxidasa de rábano (cadenas pesadas + ligeras) (KPL, Gaithersburg , MD) diluidas 1 :5000 durante 1 hora. Los depósitos fueron lavados cinco veces, y se desarrolló el color con 100 µl de substrato TMB (KPL). Se detuvieron las reacciones después de 1 5 minutos con 1 00 µl 1 M de ácido fosfórico, y las placas se leyeron en 450 nm. pETBIue 2 (Novagen). Se transformaron clones en pGEM-T en células DH5a. Las colonias se crecieron durante la noche, y se aislaron plásmidos con equipos Qiagen Miniprep Purification. Los plásmidos purificados y 2 µg de pETBIue2 fue digeridos en forma individual con Neo I y Not I durante 4 horas. Se desfosforiló pETBIue2 con CIAP durante al menos 20 minutos de digestión . Los fragmentos de inserto y pETBIue2 linearizado fueron purificados con gel con el equipo Qiagen Gel Purification y posteriormente ligados en una proporción de aproximadamente 1 :2 de vector a inserto. Las ligaduras fueron transformadas en células DH5a. Se cultivaron durante la noche dos colonias por placa, y se llevó a cabo una preparación de plásmido durante los cultivos para aislar los plásmidos. Posteriormente se transformaron los plásmidos purificados en células BL-21 (DE3) RP. Dos colonias por clon fueron cultivadas e inducidas por 400 µM de I PTG durante 4 horas a una temperatura de 30°C. U n gel S DS-PAG E subsecuente de los usados celulares completos no mostró evidencia de inducción de polipéptido específico. En forma similar, las pruebas ELISA de Usados de célula inducidas recubiertas sobre placas de microtitulación y reactivadas con sueros de porcino PRRS+ y PRRS", no revelaron evidencia de polipéptido de virus PRRS. La evaluación de pETBIue2 para la expresión de polipéptido de virus PRRS, se detuvo en este punto. pET24d/pET25b (Novagen). Se digirió 2 µg de pET24d con Neo I y Not I , y se desfosforiló con CIAP. Posteriormente el fragmento fue purificado con un equipo Qiagen PCR Purification. Se utilizó un gel de agarosa para purificar en forma adicional el fragmento, y se utilizó un equipo QIAquick Gel Extraction para extraer el fragmento de vector del gel . Posteriormente se ligó el fragmento pET24d a los fragmentos de clon en una proporción de aproximadamente 2: 1 de inserto a vector. La transformación de estos plásmidos en células DH5a no dio como resultado el crecimiento de la colonia. Se obtuvieron resultados similares después de la clonación en vector pET24d, el cual no fue desfosforilado o en pET24d , el cual fue o no desfosforilado. Clonación. Se utilizó PCR para amplificar las tres proteasas de virus PRRS que fueron identificadas mediante sus sitios activos, en las siguientes posiciones de aminoácido en ORF 1 a de la cepa de virus PRRS VR2332: proteasa de cisteína tipo papaína a y ß (PCP a/ß) (aminoácidos 74-146 y 268-339), proteasa de cisteína inusual (aminoácidos 435-506), y la proteasa de serina tipo poliovirus 3C (aminoácidos 1840-1946). La ubicación de estos dominios de proteasa funcional en el genoma de virus PRRS se muestra en forma gráfica en la figura 1 . La tabla 1 , describe las regiones de secuencia de nucleótidos de la cepa de virus PRRS VR2332 que fueron amplificadas mediante PCR y resume los resultados generales.

Tabla 1 . Fragmentos NSP de virus PRRS clonados.

Proteína no estructural 1 (NSP 1 ). Los productos de ligadura de este fragmento y pET24b, produjeron colonias después de la transformación de las células E. coli DH5a. Las colonias crecieron lentamente y normalmente requirieron 48 horas a una temperatura de 37°C para ser visibles. La clasificación de colonias mediante PCR produjo resultados positivos consistentes con la presencia de un fragmento clonado. Los esfuerzos para recuperar plásmido recombinante de bacterias crecidas en caldo, no tuvieron éxito. Pareció que los plásmidos recombinantes no fueron estables. Para superar este problema, se utilizó una variedad de cepas E. coli como receptores de plásmido: D H5a, J M 109, HB 101 , Sure (Stratagene), y ABLE (Stratagene). Se incubaron placas de transformación y cultivos de caldos a una temperatura de 37°C, 30°C, y 22°C. Los volúmenes de cultivo de 1 , 2, 5, 1 0, y 25 ml se llevaron a cabo. Se intentaron diversos métodos de purificación de plásmido, incluyendo miniprep Qiagen , lisis alcalina estándar con extracción de fenol/cloroformo y lisis de ebullición con precipitación de cloruro de ütio/isopropanol. Ninguna de estas condiciones y tratamientos dio como resultado la recuperación de plásmido recombinante. En todos, se clasificaron 353 transformadores mediante PCR de colonia, con aproximadamente 70 reacciones produciendo bandas. Las purificaciones de plásmido no produjeron bandas visibles o una banda de alto peso molecular, la cual al momento de la digestión con restricción de diagnóstico desapareció del gel. Este resultado es consistente con el comportamiento del ADN genómico. Proteína no estructural 2 (NSP 2). Se obtuvieron los mismos resultados que con NSP 1 . Se obtuvieron colonias transformadas en placas de ágar LB que fueron positivas mediante PCR, aunque los intentos para aislar el ADN de plásmido no tuvieron éxito. Proteína no estructural 4 (NSP 4). Los resultados con NSP 4 fueron idénticos a las experiencias con NSP 1 y NSP 2 con una excepción . El ADN de plásmido se recuperó en forma exitosa de un clon y se mostró mediante secuenciación de ADN para contener el NSP 4 anticipado. Se observó una mutación de punta que cambió 16 aminoácidos de isoleucina a treonina. Clonación de fragmentos NSP EN pET24bmycHis. Se amplificaron fragmentos de ADN que corresponden a NSP 1 , NSP2, y NSP 4 medíante PCR y se clonaron en pET24b-mycHis (figuras 2, 3, y 4). Los clones funcionalmente positivos fueron identificados mediante inducción de prueba a pequeña escala de codones individuales, y se recogió un clon con expresión superior simple, se creció, purificó, y secuenció. Cada clon contenía sitios EcoR1 y BamH I en el extremo 5' y un sitio Xhol en el extremo 3'. Los polipéptidos codificados contenían una marca myc de terminal amino y una marca 6x His de terminal carboxilo. Expresión y purificación NSP recombinante. Se crecieron colonias individuales y se indujeron para expresión de polipéptido como se indica en la presente invención . Se purificaron polipéptidos mediante cromatografía por afinidad de metal inmovilizada mediante Ni-NTA. NSP 1 y NSP 4 recombinantes fueron fácilmente expresados en niveles mg/l en frascos de agitación bajo las condiciones descritas, y aproximadamente el 50% del polipéptido fue recuperado después de la cromatografía por afinidad y multiplicado (Tabla 2). Los polipéptidos purificados y redoblados fueron homogéneos y conten ían tamaños de fragmentos consistentes con las actividades de proteasa anticipadas. Los polipéptidos NSP 1 y NSP 4 consistieron en polipéptidos homogéneos en los cuales la preparación NSP 1 contiene el poüpéptido intacto y dos fragmentos disociados en forma autoproteolítica en PCP1 a y PCP 1 ß, en tanto que la preparación NSP 4 fue una banda simple (figuras 5 y 6). Tabla 2. Producciones de expresión de polipéptido.

El polipéptido NS P2 se expresó en niveles bajos que podrían no ser visualizados en los Usados celulares completos en geles de poliacrilamida S DS manchados con azul Coomassie, aunque se observó mediante detección de manchado Western con anticuerpo anti-myc. La presencia de múltiples bandas con tamaños menores a la secuencia de polipéptído codificada de 132 kD, indicó que la degradación proteolítica ocurrió ya sea durante el crecimiento bacteriano y expresión de polipéptido, o durante la lisis celular y manejo de muestras. Se obtuvo una evidencia adicional de que la banda de manchado Western contenía NSP 2 de virus PRRS de los resultados del ensayo ELISA de prueba, en donde los depósitos de la placa de microtitulación fueron recubiertos con Usados bacterianos inducidos procedentes de clones que expresan NSP 1 , NSP 2, ó NSP 4. Los depósitos que contienen el polipéptido NSP 2, reaccionaron fuertemente y en un modo específico y dependiente de la dilución . El bajo nivel de expresión del polipéptido NSP 2, puede ser debido a la presencia de una región hidrofóbica hacia el extremo carboxilo del polipéptido. Efecto de multiplicación en reactividad de ensayo ELISA. Las diferentes aparentes en reactividad de anticuerpos entre los tres polipéptidos NSP, se observaron en el ensayo ELISA de prueba preliminar, surgiendo la posibilidad de que la conformación de los polipéptidos purificados, recombinantes pueda ser variable y pueda afectar la inmunorreactividad. El nucleocápsido recombinante (N) varía en in munorreactividad dependiendo de las condiciones de expresión, purificación , y multiplicación. Por consiguiente, la inmunorreactividad de NSP 1 y NSP 4 fue evaluada antes y después de la multiplicación. La multiplicación tuvo un efecto en la inmunorreactividad de NSP 1 (figura 7). El polipéptido NSP 1 purificado por afinidad que no fue multiplicado, fue esencialmente no reactivo para el suero obtenido de cerdos durante un período de 120 días después de la infección del virus PRRS. En contraste, no hubo una diferencia substancial en tituladores del anticuerpo NSP 4 contra polipéptidos NSP 4 no redoblados o redoblados (figura 8). El análisis de la reactividad de polipéptido multiplicada fue determinado a los 52 días, ya que se pudo apreciar que no hubo diferencia en las dos formas de NSP 4. La carencia de efecto de multiplicación se enfatizó en forma adicional a través de la elección de las muestras de suero para análisis. La respuesta de anticuerpo máxima fue anticipada para ocurrir en animales inmunizados con virus homólogo (VR2332 es la cepa parenteral de la vacuna Ingelvac MLV) y se probó con polipéptido multiplicado, presumiblemente nativo. Se anticipó que ocurrirá la respuesta mínima en animales afectados con la cepa heteróloga (MN30100) y probada con polipéptido no multiplicado. Bajo estas condiciones, no se observaron diferencias. Estos resultados demuestran que la multiplicación del polipéptido afecta la inmunorreactividad en el caso de NSP 1 y es insignificante para NSP 4. Sin embargo, cada polipéptido NSP recombinante, es multiplicado en forma rutinaria y almacenado en forma soluble en glicerol para mantener un producto uniforme. Inducción y duración de respuestas de anticuerpo para polipéptido recombinante NSP. Las cinéticas de una respuesta de anticuerpo NSP 1, fueron similares a la respuesta a N en cerdos dorados de 4 meses de edad. El titulador NSP 1 fue de aproximadamente 1/50,000 a los 14 días después de la infección y se elevó a los 21 días después de la infección aproximadamente 1/140,000. Los niveles de anticuerpo declinaron rápidamente y fueron equivalentes a N (ORF 7) a partir de los 28-120 días después de la infección. En un pequeño grupo de cerdos jóvenes (4 a 6 semanas de edad) inmunizados con Ingelvac MLV, los tituladores de anticuerpo para NSP 1 mostraron un pico afilado similar y declinaron rápidamente, aunque el pico ocurrió a los 28 días en lugar de a los 21 días después de la infección (figura 9). En (gilts), la respuesta de anticuerpos para NSP 4, fue débil en comparación con N y con NSP 1. Hubo evidencia de un incremento en el titulador a los 40 a 55 días después de una infección, y nuevamente, posiblemente a los 100 y 110 días después de la infección. En cerdos jóvenes, hubo un incremento tardío y modesto similar en tituladores anti-NSP 4 comenzando aproximadamente a los 28 a 35 días después de la inmunización (figura 9). Esta estructura de tiempo corresponde al período en el cual se resolvió la infección aguda. Reactividad cruzada de anticuerpos NSP de porcino para polipéptido recombinante VR2332 NSP. Los polipéptidos NSP 1 y 4 purificados y redoblados, derivados de la cepa VR2332 del virus PRRS y expresados en bacterias, reaccionaron en forma equivalente con antisuero de cerdos expuestos a una cepa homologa (Ingelvac MLV) y una cepa heteróloga (MN30100) del virus PRRS. Ejemplo 2 -Producción de polipéptidos de virus PRRS recombinante adicional Se produjeron los siguientes polipéptidos: polipéptido NSP 2P de virus PRRS (figura 19), un polipéptido del primer ectodominio de terminal-N de virus ORF 5 (ORF 5 5' ; figuras 20 y 21 ), un polipéptido ORF 5 del primer y segundo ectodominios de terminal-N del virus PRRS (ORF 5' total; fig ura 22), un polipéptido ORF 5 de endodominio del virus PRRS (ORF 5 3'; figuras 23 y 24), un polipéptído quimérico que combina un polipéptido ORF 5 del primero y segundo ectodominios de terminal-N del virus PRRS con un polipéptido ORF 6 del primero y segundo ectodominío de terminal-N del virus PRRS (ORF 5+6; figura 25), y un polipéptido ORF 7 del virus PRRS. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos fue de las secuencias de nucleótidos en la cepa VR-2332 del virus PRRS (número de acceso GenBank® PRU87392) o la cepa MN30100 del virus PRRS. Amplificación PCR y clonación . Se obtuvieron fragmentos para clonación de plásmidos preparados como se describe en otras partes (Nelsen y Asociados, J . Virol. 73:270-280 (1999)). Los fragmentos deseados fueron aislados con sitios de clonación adecuados mediante PCR. Los cebadores fueron designados utilizando Primer3 (Whitehead I nstitute for Biomedical Research , Cambridge, Massachusetts). Los cebadores de oligonucleótido fueron obtenidos de I DT (Coralville, IA). El ácido nucleico que codifica los polipéptidos ORF 7, ORF 5 5' , y ORF 5 3', fue amplificado mediante PCR en reacciones separadas utilizando el equipo AmpliTaq Gold® (Roche Molecular Systems, Branchburg , NJ). El ácido nucleico que codifica el polipéptido ORF 5 5' total y ORF 5 + 6 fue construido tanto mediante PCR de cADN como mediante endurecimiento oligo subsecuente, amplificación PCR y ligadura. Las mezclas de reacción (50 µl volumen total) contenían 10X amortiguador (1 X concentración), 1 .5 mM MgCI2, 200 µM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP; 0.2 µM cada par de cebador; 1 .0 U AmpliTaq Gold®' el cADN derivado de mARN diluido en serie en forma adecuada ( 1 : 1 0... 1 : 1 0,000). Al momento de la mezcla, la solución se colocaron inmediatamente en el termociclador (GeneAmpPCR system 2400, Perkin Elmer, Shelton, CT). El ciclo de temperatura; un ciclo (95°C durante 10 minutos); a 35 ciclos (94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos); un ciclo (72°C durante 7 minutos, se mantuvo a una temperatura de 4°C). Los ADNs de amplificados resultantes, se separaron posteriormente sobre un gel de agarosa. Las bandas que corresponden a los tamaños de producto anticipado fueron extractadas con gel (Gel Extraction Kit®, Quiagen, Valencia, CA) posteriormente fueron purificadas en forma adicional utilizando el equipo Quiagen PCR Purification Kit® (Quiagen , Valencia, CA). Posteriormente los productos aislados fueron clonados en vector pGEM® (Promega, Madison, Wl) transformados en células DH5a (invitrogen Corp. , Carlsbad, California), las cuales fueron dispersadas sobre placas de agar de LB 100 mg/mL de ampicilina (Amp) con I PTG y X-Gal. Las colonias fueron seleccionadas por color y fueron crecidas y el ácido nucleico fue secuenciado (Advanced Genetic Análisis Center, University of Minnesota, St, Paul MN). Después de una clasificación de búsqueda BLAST inicial (GeneBank NCBI, Bethesda, MD), los archivos de los trazos fueron editados para eliminar la secuencia del vector (Seqman®DNASTAR, Inc., Madison, Wl), y la secuencias de traslape fueron alineadas (Megaling®DNASTAR, Inc., Madison, Wl). El ácido nucleico que codifica los péptidos NSP 2P fue obtenido digiriendo el clon pET 24b myc-NSp 2-His (figura 3) con Xhol y religando el vector. Subclonación en el plásmido de expresión Los clones fueron amplificados utilizando las construcciones pGEM@t adecuadas en la forma de plantillas para cebadores que tienen sitios BamH1 y Xho I terminales. Las condiciones PCR y el aislamiento y purificación del inserto fueron estándar, seguido de digestión por restricción (BamH1, Xhol) para preparar el inserto para ligadura. Las condiciones de ligadura fueron: 100 ng de vector desfosforilado, 20 ng de inserto, 1X de amortiguador de ligadura y 400 U T4 de ligasa (New England Biolabs), volumen total 10 µL. la reacción de ligadura se colocó a una temperatura de 16°C durante 16 horas antes de la transformación en células DH5a (Invitrogen Corp., Carlsbad, California). Las colonias se seleccionaron como se describió anteriormente y se crecieron, y el ácido nucleico fue secuenciado y analizado (que produce el plásmido myc-polypeptido-His de pET 24 de plásmido). Las construcciones de ácido nucleico que codifican polipéptidos similares a ORF 55' y ORF 5 3' también fueron elaboradas a partir de secuencias de virus PRRS MN30100 (Bierk y asociados Vet. Rec, 148:687-690(2001)) comenzando a partir de los sobrenadantes del cultivo celular que contiene el virus. Se obtuvo ARN viral del medio a través de procedimientos estándar. El ARN viral fue aislado utilizando el equipo de ARN viral QlAamp (Quiagen) y almacenado a una temperatura de -80°C. El ARN purificado fue convertido a cADN con exámenes aleatorios utilizando el equipo GeneAmp RNA PCR (Applied Biosistems, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). En síntesis, se combinó 1 µL de una solución de 50 µM de exámenes aleatorios combinados con 3.0 µg de ARN total para un volumen total de 4 µL. la solución se calentó a una temperatura de 68°C durante 10 minutos, posteriormente se enfrió rápidamente sobre hielo. Se agregaron 16 µL de una solución de mezcla maestra para una concentración final que contenía 10X de Amortiguado II (1X de concentración final), 5mM MgCI2, 1.0 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, u dTTP; 20 U/µL de inhibidor Rnasa, 25 U/µL de transcriptasa inversa de esta solución se incubó inmediatamente a una temperatura de 25°C durante 10 minutos, 42°C durante 30 minutos, 99°C durante 5 minutos, posteriormente 4°C durante 5 minutos. El cADN resultante fue almacenado a una temperatura de -20°C y utilizado para amplificación PCR. Expresión de Proteína Se transformaron plásmidos myc-polypeptide-His 24b pET en células (DE3)-RP BL21 ™(Stratagene, River Creek, TX), las cuales conten ían tARN's eucariótico para arginina y proüna así como resistencia cloramfenicol (cam). Las células transformadas fueron dispersadas sobre canamicina 30 µg/mL (kan 30), cloramfenicol 35 µg/mL (cam 35) placas LB y clasificadas mediante PCR de colonia utilizando el T7, cebadores de terminación T7 para el plásmido 24b pET. Diez colonias positivas fueron crecidas cada una durante la noche a una temperatura de 30°C en 2 mL de medio 2x Yt (kan 30, cam 35). 200 µL de cada uno de los cultivos que se procesaron durante la noche, fueron utilizados para inocular 10 alícuotas de 10 mL equilibradas durante temperatura (30°C) de 2xYT (can 30). Estos cultivos fueron crecidos a una temperatura de 30°C a un OD?=6oo de 0.3; 200 µL se eliminaron SDS-PAGE para análisis; y se agregó I PTG a una concentración final de 1 .0 mM . Las muestras inducidas se dejaron crecer a una temperatura de 30°C durante 4 horas posteriormente se eliminaron 200 µL para el análisis SDS-PAGE. Los gels SDS-PAGE indicaron que todas las colonias se expresaron polipéptidos del tamaño anticipado en altos niveles (medio que >2 mg/Utros). La expresión a gran escala se realizó en la misma forma escalando en 1 00X para un total de un litro del medio. Purificación de polipéptido Los polipéptidos fueron purificados utilizando una modificación del procedimiento de aislamiento por afinidad de agaroza Quiagen Ni-NTA para los polipéptidos marcados His desnaturalizados (Quiagen; Valencia, CA). En síntesis, se peletizó un litro de plásmido inducido que contiene células bacterianas en 4000 g durante 20 minutos a una temperatura de 4°C y el sobrenadante fue decantado. Inmediatamente después de la centrifugación, el pellet fue suspendido nuevamente en 30 mL de una solución que contiene 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, en un pH de 8.0, y fueron giradas suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente las suspensiones resultantes fueron centrifugadas (4°C) durante 30 minutos a 10,000 g para peletizar los residuos celulares. El sobrenadante contenía altos niveles de polipéptido desnaturalizado y fue decantado en 6 mL de una pasta Ni-NTA 50% y girado suavemente durante 1 hora a una temperatura de 4°C. La mezcla de sobrenadante -Ni-NTA fue vertida posteriormente en una columna de longitud de 1.5 cm ID x 30 cm y se dejó drenar. La columna se lavó posteriormente dos veces con 20 mL con una solución que contiene 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, a un pH 6.3. Posteriormente el polipéptido fue eluido cuatro veces con alícuotas de3 mL de amortiguador de elusión que contiene 100 mM NaH2PO , 10 mM Tris HCl, 8 M Urea, a un pH 5.9. El análisis de SDS y la concentración de proteínas se determinaron como se describe anteriormente (figura 17). Multiplicación de péptido La multiplicación de los polipéptidos recombínantes desnaturalizados se llevó a cabo utilizando una variación del método que se describe en otras partes (Buchner y asociados. , Anal . Biochem. , 205(2):263-70 (1 992) y Clark, Curr. Opin . Biotechnol. , 9(2): 157-63 (1998)). Primero , las soluciones de polipéptido desnaturalizados que contienen polipéptido puro fueron reunidas y dializadas (Spectra/porMWCO ® 6-8,000, Spectrum Laboratorios, Rancho Domínguez, CA) durante 4 horas a una temperatura de 4°C contra 500 mL de 0.1 M Tris, pH 8.0 , 6H guanidina-HCI , y 2 mM EDTA. Posteriormente se repitió la diálisis con amortiguador fresco durante 4 horas adicionales. Después de ajustar la concentración del polipéptido 3 mg/mL (determinación de concentración utilizando el equipo de ensayo de proteína BioRad RC DC y Bio-Rad; Hercules, CA), se agregó ditotreitol (DTT) produciendo una concentración final de 300 mM DTT. Se dejó en agitación está solución (5 mL) a temperatura ambiente durante 2 horas seguido de filtración utilizando filtro 0.45 µm (Springe Filter, Fisher Scientific, Pittsburg, PA). La solución de polipéptido reducida se agregó posteriormente en forma rápida a una temperatura de 4°C con agitación moderada en 500 mL de amortiguación de multiplicación ( 1 00 mM Tris a un pH 8.0, 0.5 M L_Arginine, 8 mM de gotationa oxidada, 2mM EDTA, 1 0 µM pepstatin A, 10 µM leupeptin , 1 mM PMSF) correspondiendo a una solución final de aproximadamente 1 : 100. Posteriormente la solución resultante fue filtrada a través de una ventana 0.22 µm (Steritop, Millipore, Bedford MA) para eliminar los particulados y dejarlos en agitación durante la noche. El polipéptido purificado se concentró mediante cinta de filtración de flujo tangencial (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kd , Millipore, Bedford MA) hasta un volumen de 10 mL seguido de diálisis (Spectra/Por MWCO® 6-8 ,000, Spectrum Laboratorios, Rancho Domínguez, CA) contra 20 mM Tris HCl , a un pH 8.0. Las concentraciones del polipéptido fueron determinadas utilizando el equipo de ensayo de proteína Bio-Rad RC DC (Bio-Rad , Hercules, CA), gel de SDS cuantitativo y el bioanalizador Agilent 21 00, las soluciones de polipéptido purificadas son almacenadas a una temperatura (Protein LabChip®kit, Agilent Technologies, Palo Alto, California). Las soluciones de polipéptidos purificadas fueron almacenadas a una temperatura de -80°C. Los polipéptidos ORF 5 5' , ORF 5 3' , y ORF 5 totales no fueron redoblados en forma rutinaria debido a que la multiplicación no afectó la reactividad del ensayo ELISA. ELISA Los polipéptidos fueron diluidos en amortiguador de carbonato (1 5 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) a una concentración de 1 µg/mL. Cada uno de los depósitos de la placa ELISA (COSTAR 3590, 96 Depósitos ElA/RIA Placa, Corning I nc. , Corning, NY) fue recubierto posteriormente con 100 µL de a solución de carbonato de polipéptido adecuada (proporcionando 1 00 ng del polipéptido por depósito) posteriormente se incubaron durante la noche a una temperatura de 4°C y las muestras se corrieron por duplicado. Se dejó sin cubrir un grupo de depósitos para determinación del suero y los efectos secundarios de fondo del anticuerpo (encontrados como menores a 0.005 unidades de Absorbancia). Posteriormente las placas fueron lavadas (EL-404 microplate Washer, Bio-Tek I nstruments I nc. Winooski, VT) seis veces con PBS-TWEEN-20 (0.1 %) a temperatura ambiente. Se bloquearon los sitios de enlace no específicos con 300 µL/depósito de PBS-Tween (0.1 %) que contiene 3% de leche en polvo (N FDM) sin grasa durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente las placas fueron lavadas como se describió anteriormente. Posteriormente las muestras de suero se diluyeron con 1 :2000 con PBS-Tween-20 (0.1 %) que contiene 3% NFDM, posteriormente se agregó 100 µL a los depósitos adecuados, y las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los valores del titulador utilizando dilución en serie indicaron que las diluciones de suero 1 :2000 demostraron tendencias de datos similares (dentro de error). Posteriormente las células fueron lavadas como se indicó anteriormente. Se diluyó el anticuerpo de detección secundaria (IgG (H + L), Kirkegaard & Perry Laboratorios I nc.- porcino de cabra etiquetado con peroxidasa). (KPL) Gaithersburg , MD) 1 :5000 en PBS-Tween (0.1 %) contiene 3% NFDM se agregaron 100 µL de solución diluida a cada deposito. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas de lavaron nuevamente. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, las palcas se volvieron a lavar. Se utilizó bencidina de tetra metilo (TMB ca #50-76-00 Kirkegaard & Perry Laboratorios Inc. (KPL) Gaithersburg , MD) para llevar a cabo el análisis calorimétrico. Se mezclaron juntos volúmenes ¡guales de peroxidasa TMB (solución A) y peroxidasa (solución B) y se agregaron a cada depósito 100 µL la solución se dejó desarrollar durante 15 minutos a temperatura ambiente (color azul). Las reacciones se extinguieron posteriormente agregando 100 µL de 1 mM de ácido fosfórico (color amarillo). Las placas se leyeron en 450 nm (lector de microplaca Termo Max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Ejemplo 3-respuesta de anticuerpo de virus P RRS después de estímulos repetidos de virus homólogo tipo natural La serología ha sido la piedra angular del monitoreo y control de enfermedades veterinarias. De la presencia de anticuerpos específicos en suero, se indica antes de la exposición a la enfermedad , y también puede confirmar que el animal posee inmunidad protectora. Las pruebas de anticuerpo ELISA de virus PRS disponibles normalmente, no pueden ser sensibles a todas las posibles situaciones que se encuentran en grupos de cerdos infectados, particularmente animales infectados nuevamente. Muchos animales regresaron al estado cero negativo a los 4 a 6 meses después de la infección inicial (Yoon y asociados. , J. Vet. Diagn. I nvest. , 7:305-312 (1 995)). Además, existen reportes de animales que regresan y permanecen negativos de anticuerpos ELI SA durante múltiples vacunaciones repetidas con una vacuna de virus PRRS vivo modificado (Baker y asociados. , Proc. Alien D. Leman Porcino Conference, vol. 26 (suppl.) p.31 (1999)). Si ocurre la pérdida de respuesta al anticuerpo ELISA después de exposiciones frecuentes repetidas al mismo virus PRRS de tipo natural, esto puede alterar la forma en que los veterinarios interpretan los resultados de la prueba ELISA del virus PRRS para sus clientes, cuando se monitorean rebaño circulación del virus continua. El siguiente experimento se llevó a cabo para (1) determinar si los animales cero negativos ELISA de virus PRRS pueden ser inducidos a través de inmunización múltiple de baja dosis con virus tipo natural, (2) caracteriza la línea nueva de expresión del suero de virus PRRS que neutraliza anticuerpos y anticuerpos para polipéptidos ORF recombinantes naturales. Se inyectaron dos veces sesenta y ocho cerdos ambulantes de 6 meses de edad negativos de virus PRRS, con un mes de diferencia, y posteriormente cada mes aproximando un programa tipo 6/60 para un total de 6 inmunizaciones utilizando virus SD 28983 de la cepa de campo 10 2 5 por dosis. Se extrajo sangre a los animales tres semanas después de cada inmunización, y las muestras se probaron con respecto a ELISA de virus PRRS de anticuerpos de inmunización de suero. Cuatro meses después de la última inmunización (12 meses después de la exposición inicial), los animales fueron estimulados nuevamente con SD 28983. Las muestras de sangre fueron probadas para anticuerpos de neutralización de suero mediante neutralización de foco fluorescente (virus de cepa 23983 como el inoculo de ensayo) y con respecto a anticuerpos para polipéptidos desde virus PRRS recombinante obtenidos tal y como se describe en la presente invención. En sisntesis, los polipéptidos rORF del virus PRRS fueron producidos insertando los fragmentos de ácido nucleico de cADN deseados en E. coli para expresión. Los polipéptidos produjeron nucleocápsido incluido (un polipéptido ORF 7) y un fragmento de polipéptido de quimera que conten ía las regiones de ectodominio tanto de un polipéptido de envoltura ORF 5 como un polipéptido de matriz ORF 6, los cuales se localizan en conjunto dentro de la envoltura viral. Se recubrieron placas ELISA con cada polipéptido y las muestras de suero se probaron mediante dilución limitante. Los resultados se registraron como tituladores en lugar de como proporciones de densidad óptica. Las muestras de sangre también fueron probadas utilizando un ELISA de virus PRRS comercialmente disponible (equipo de prueba de anticuerpo de virus 2XR PRRS; I DEXX Laboratorios). Los niveles de anticuerpo ELISA 2XR de virus PRRS cayeron en forma estrepitosa después de cero/conversión inicial incluso en inyecciones repetidas con el virus PRRS de la cepa 28983. Casi todos los animales desarrollaron inicialmente respuestas de anticuerpo sólidamente positivos. El 755 de estos animales, regresó sin embargo al estado de cero-negativo cuatro meses después de la sexta inyección con el virus vivo. Esto es similar a lo que se observó en cerdas después de múltiples vacunaciones con la vacuna del virus MLV PRRS (Baker y asociados. , Proc. Alien D . Leman Porcino Conference, vol. 26 (suppl .) p.31 (1999)). En forma inversa, la prueba de neutralización de suero detectó anticuerpo después de la infección inicial, y todos los animales permanecieron positivos del anticuerpo de neutralización de suero al final del experimento. Los ELISA rORF revelaron curvas de anticuerpos temporales. El ensayo utilizando polipéptidos de nucleocápsido recombinante dieron como resultado una curva que siguió de cerca la curva de respuesta I DEXX 2XR ELI SA cayendo a bajos niveles a los cuatro meses. En forma inversa, el ELISA de polipéptido ORF 5 y ORF 6 de quimera de envoltura siguió un patrón temporal casi idéntico a la curva de respuesta de anticuerpo que fue de neutralización de suero con PRRS por lo tanto, parece que los cerdos producen inicialmente fuertes respuestas al anticuerpo dirigidas predominantemente contra un polipéptido de nucleocápsido, aunque con el tiempo las respuestas de anticuerpos se dirigen nuevamente a los polipéptidos de envoltura. Parece que la respuesta inmune al virus PRRS es lenta en desplazarse para anticuerpos de neutralización de suero inmunológicamente protectores. Estos resultados demuestran que un equipo de diagnóstico efectivo puede incluir polipéptídos ORF 5 y polipéptidos ORF 6. Estos resultados también demuestran que una respuesta de anticuerpo de ELISA de vi rus I DEXX P RRS débil después de la vacunación o una nueva exposición , puede indicar en forma paradójica que el animal tiene una respuesta inmune protectora contra la vacuna o virus, ya q ue el equipo ELI SA del virus I DEX PRRS parece estar limitada a detectar anticuerpos que enlazan a polipéptidos de nucleocápsido del virus PRRS. Ejemplo 4-respuestas de anticuerpos comparativas con cepas virulentas v atenuadas del virus PRRS El siguiente experimento se realizó para (1 ) caracterizar respuestas de anticuerpos de cerdos a polipéptidos de virus PRRS individuales, (2) determinar las respuestas de anticuerpos a aislados virales que varían en cuanto virulencia, (3) determinar la relación entre la respuesta del anticuerpo y la protección al estímulo. Se dividieron en grupos cien cerditos de 3 a 4 semanas de edad negativos-PRRS se inocularon diez cerditos por grupo en forma intranasal con cepas del virus 2x103 TCI D50 PRRS caracterizadas como alta o moderadamente virulentas (SDSU73, MN 184, JA 142, y 171 98-6), con virulencia baja (VR2332 y ABST-1 ), a virulentas (I ngelvac PRRS y I ngelvac ATP). Un grupo de diez cerditos recibió un cóctel que contiene cantidades iguales de todos los virus, y diez cerdos de control no recibieron virus. Después de que los animales se recuperaron totalmente de la infección aguda, fueron estimulados con MN 1 84. Los signos clínicos fueron registrados a lo largo del experimento y se llevaron a cabo necropsias 14 días después del estímulo. A los animales se les extrajo sangre en forma semanal, y los niveles de anticuerpo se determinaron mediante ensayo ELISA para polipéptidos estructurales y no estructurales purificados que fueron producidos insertando fragmentos de cADN deseados en E.coli para expresión y purificación. Los polipéptidos incluyeron un polipéptido VR2332 PRRS del virus ORF 7 (un polipéptido de nucleocápsido, un polipéptido NSP 1 del virus VR2332 PRRS, un poüpéptido NSP 2P del virus VR2332, un polipéptido NSP 4 del virus VR2332 ORF 5 5', un polipéptido de ectodominio 1 M N301 00 VR2332 ORF 5 5' un polipéptido de ectodominio 1 VR2332 ORF 5 3' , un polipéptido de ectodominio MN30100 ORF 5 3' un polipéptido de endodominio VR2332 ORF 5 5' , un polipéptído de ectodominios 1 y 2 VR2332 ORF 5/ORFy polipéptido quimérico (O RF 5 5' ectodominios 1 y 2 ORF 6 5' más ectodominios 1 y 2 G P5-M ; también referidos como un polipéptido de ectodominio quimérico ORF 6 5' G P5-M). Se recubrieron placas ELISA con cada polipéptido, y las muestras de suero fueron probadas a una dilución de 1 /2000. Se expresaron niveles de anticuerpo como valores de densidad óptica corregidos por fondo. Las respuestas clínicas a la inoculación del virus PRRS fluctuó de ningún efecto observado a efectos mínimos observados en animales a los que se les administró cepas virulentas o cepas levemente virulentas, hasta la muerte en aproximadamente del 50% de los animales a los que se les administró M N 184. Las respuestas de anticuerpo a animales inoculados con cepas virulentas alta y moderadamente virulentas fueron pronunciadas. Los anticuerpos normalmente aparecieron primero a los 21 días y se elevaron 28 días después de la infección. El nivel de anticuerpos a nucleocápsido declinó dramáticamente después del días 28, en tanto que la respuesta a otros polipéptidos virales tendió a mantenerse a altos niveles hasta el final del experimento. Las respuestas de anticuerpo ha polípéptidos no estructurales NSP 1 y NSP 2 fueron tan altas como o más altas que la respuesta al nucleocapsido, aunque la respuesta a NSP 4, codificando una proteasa viral , fue baja en todos los puntos de tiempo. Aunque la respuesta humoral a la administración viral fue positiva-I DEXX en todos los grupos de tratamientos, aparecieron marcadas variaciones en la intensidad de las respuestas del anticuerpo. Las cepas virulentas y levemente virulentas provocaron menos respuestas de anticuerpos robustas en comparación con las cepas de moderada a altamente virulentas. Estas diferencias se encontraron en todos los antígenos probados. Sin embargo, la respuesta al estímulo fue similar entre todos los grupos de tratamiento. En resumen, se observaron diferencias en respuesta de anticuerpos a varios polipéptidos de virus PRRS estructurales y no estructurales. Además, se observó variación en respuestas de anticuerpo a cepas virulentas del virus PRRS en comparación con sus formas atenuadas. Las diferencias en respuestas de anticuerpo, no estuvieron asociadas, sin embargo , con protección contra nueva infección con un cepa de estímulo altamente virulenta, heteróloga. Estos descubrimientos son la primera caracterización de las respuestas de anticuerpo a polipéptidos de virus PRRS individuales a lo largo de infección aguda y después de estímulo virulenta. Ejemplo 5- Detección de anticuerpos a virus PRRS utilizando polipéptidos de virus PRRS utilizando individuales versus un equipo ELISA comercialmente disponible El experimento que se encuentra a continuación se llevó a cabo para determinar si los ensayos ELISA de polipéptido particulares pueden detectar muestras positivas de virus PRRS bajo condiciones de múltiple exposición y períodos de tiempo prolongados, en los cuales los cambios I DEXX ELISA son de positivo a negativo. Se inyectaron cerdos ambulantes de 6 meses de edad negativos -PRRS con dosis de infección al 50% de cultivo de tejido 102 5 (TCI D50) del virus PRRS de cepa de campo SD 28983, posteriormente al uno, dos, cuatro, seis y ocho meses para un total de seis inoculaciones. A los animales se les extrajo sangre antes de cada inoculación , y se recolectó el suero. Las muestras de sangre fueron probadas utilizando ( 1 ) un ensayo ELISA de virus PRRS comercialmente disponible (equipo de prueba de anticuerpo de virus 2XR PRRS, I DEXX Laboratorios) o (2) un ensayo ELISA que contiene polipéptidos de virus PRRS particulares. Se llevó a cabo el ensayo ELISA IDEXX 2XR HerdChek® de acuerdo con las direcciones del fabricante en muestras de suero diluidas 1/40. Los datos se presentaron como desviación promedio y estándar de todas las muestras en cada grupo. El tamaño de grupo varió de 19 a 23 muestras de cerdos por grupos. Aproximadamente la mitad de los animales analizados utilizando el equipo IDEXX fueron encontrados como negativos en el punto de tiempo de 353 días (Tabla 3 y Figura 10). Una proporción S/P mayor a 0.4, indicó que la muestra fue positiva para anticuerpos del virus PRRS, en tanto que una proporción S/P menor a 0.4, indicó que la muestra fue negativa para anticuerpos para el virus PRRS. Tabla 3. Análisis de muestra utilizando equipo IDEXX Las muestras fueron analizadas, analizando ya sea polipéptidos de endodominio GP5 recombinantes o polipéptidos quiméricos GP5-M recombinantes en ELISAs. En síntesis, las placas fueron recubiertas con 100 ng de polipéptido por depósito en carbonato con un pH 9.6 durante la noche. Se diluyeron los sueros 1 /100 y se probaron por duplicado. Para ELISAs de polipéptido de endodominio G P5 los datos se presentaron como la proporción de muestra/positiva de valores no ajustados de todas las muestras en cada grupo y el número de muestras con un promedio mayor a (Positivo) o menor a (Negativo) 0.21 . Para los ensayos ELISAs de polipéptido quimérico GP5-M los datos se presentan como proporción de muestra/positiva de valores o de no ajustados de todas las muestras en cada grupo y el número de muestras con un promedio mayor a (Positivo) o menor a (Negativo) 0.5. De la proporción de muestra/positiva se determinó como la OD de muestra menos OD de depósitos de control sin el OD de control antígeno/positivo menos OD de control de depósitos sin antígeno. Se encontraron dos muestras como negativas para anticuerpos para polipéptidos de endodominio G P5 del virus PRRS probado en el punto de tiempo de 353 días (Tabla 4 y figura 1 1 ). Cuando se utilizó polipéptido quimérico GP5-M , todas las muestras probadas se encontraron, positivas en el punto de tiempo de 353 días (Tabla 5 y figura 12). Estos resultados demuestran que los ensayos utilizaron polipéptidos GP5 pueden detectar anticuerpos de virus GP5 en situaciones en donde no lo puede hacer el equipo anti-PRRS comercialmente disponible.

Tabla 4. Análisis de muestra utilizando un polipéptido de endodominio GP5 en un ensayo ELISA.

Tabla 5. Análisis de muestras utilizando polipéptido quimérico GP5-M en un ensayo ELISA.

Ejemplo 6-Detección de anticuerpos para virus PRRS utilizando una mezcla de polipéptidos de virus PRRS versus un eauioo ELISA comercialmente disponible Se inocularon en forma diez cerdos Weaned por grupo en forma intranasal con 2 mL de medio de cultivo de tejido que contiene 3.0 Log10TCID5o/mL de los aislados de virus descritos en la Tabla 6. El grupo fue una mezcla de porciones iguales de cada uno de los ocho aislados. El control fue medio de cultivo de tejido solo. Tabla 6. Aislado de virus PRRS Aislado No. de Grupo Virulencia VR2332 1 Moderado Ingelvac® PRRS MLV* 2 Atenuado VR2332 JA 142 3 Alto Ingelvac® PRRS ATP* 4 JA Atenuado 142 SDSU 73 5 Alto Abst-1* 6 Atenuado SDSU 73 MN 184 7 Alto Alto 17198 8 Alto Pool** 9 N/A Control 10 *Aislados de virus PRRS atenuado **Mezcla que contienen los ocho aislados Para comparar el equipo ELISA IDEXX con un ensayo ELISA de polipéptido recombinante, los sueros fueron seleccionados en forma ciega de cinco cerdos por grupos al 7 día después de la inoculación. Cuatro de las cinco muestras también fueron probadas el día 14. Para el equipo ELISA IDEXX, una proporción S/P ±>0.4 indicó que la muestra fue positiva, en tanto que una proporción S/P <0.4 indicó que la muestra fue negativa. Las mismas muestras fueron analizadas utilizando en equipo ELISA IDEXX y el ensayo ELISA de polipéptido recombinante. Para el ensayo ELISA de polipéptido recombinante, se expresaron los siguientes polipéptidos y se purificaron como se describe en la presente invención: un polipéptido ORF 7, un polipéptido de ectodominio quiméricos ORF 5 + 6, un polipéptido NSP 2P y un polipéptido de endodominio ORF 5 3'. Las concentraciones de polipéptido purificadas fueron determinadas mediante conciliación entre absorbancia OD2so análisis de bioanalizador Agilent, SDS PAGE y ensayo de proteína RC DC Lowry. Las placas de microtitulación fueron recubiertas con 150 ng de cada polipéptido para un total de 600 ng en 1 00µ de carbonato, pH 9.6 que contiene amortiguador. Se llevaron a cabo ensayos ELI SAs sobre muestras de suero en una dilución de 1 /500. Las muestras del d ía siguiente y del día 14 son muestras idénticas a las que fueron analizadas mediante ELISA IDEXX. Además, se analizaron en el día 57 animales por grupo (5 en MN 184 y grupos reunidos). Los animales de control fueron negativos todas las veces. Se probaron siete cerdos en el grupo 10 y fueron negativos todos los días probados. Ú nicamente una de las muestras probadas recolectar el día 7 fue positiva cuando se analizó utilizando el equipo I DEXX (Tabla 7). Además, trece muestras recolectadas el día 14 fueron negativas apara anticuerpos de virus PRRS . Veintitrés de las 36 muestras recolectadas el día 14 fueron positivas para anticuerpos de virus P RRS.

Tabla 7. Resultados con equipo ELISA IDEXX En contraste, 14 de las 45 muestra probadas recolectadas el día 7 fueron positivas cuando se analizaron utilizando el ensayo ELISA que contiene la mezcla de polipéptido de virus PRRS (Tabla 8). Además, únicamente ocho de las 36 muestras recolectadas el día 14 fueron negativas para anticuerpos de virus PRRS. Veintiocho de las 36 muestras recolectadas el día 14 fueron positivas por anticuerpos de virus PRRS. Además, 54 de las 59 muestras recolectadas el día 50 fueron positivas para anticuerpos del virus PRRS (Tabla 8). Tabla 8. Resultados con ELISA que contienen la mezcla de polipéptido de virus PRRS Estos resultados demostraron que las mezclas de polipéptidos de virus PRRS pueden utilizarse para detectar anticuerpos de virus PRRS en animales expuestos al virus PRRS en los puntos de tiempo que no son únicamente tempranos sino también tardíos con respecto al tiempo de la exposición al virus PRRS. Por ejemplo, se detectaron muestras positivas los días 7, 14 y 50 después de la exposición del virus PRRS. Las muestras para cada grupo también fueron probados utilizando ensayos ELISA con un polipéptido de virus PRRS individual obtenido tal y como se describe en la presente invención (figura 18). Ejemplo 7-Diferenciación entre animales expuestos a la vacuna o cepas de campo del virus PRRS Veintiocho días después de la vacunación con el Ingelvac MLV el (también referido como RespPRRS; Número de Acceso AF066183) GenBank®, las muestras de suero fueron obtenidas de cinco cerdos, diluidas 1 /300 y analizadas por duplicado sobre placas ELISA recubiertas con 200 ng de un polipéptido de ORF 5 de ectodominio 5' procedentes de la cepa del virus PRRS VR2332, un polipéptido ORF 5 de ectodominio 5' del aislado del virus PRRS M N30100, un polipéptido ORF 5 de endodominio 3' de la cepa del virus PRRS VR2332 o un polipéptido ORF 5 de endodominio 3' del aislado del virus PRRS MN30100. Veintiocho días después de la inoculación con el aislado de virus PRRS M N30100, las muestras de suero fueron obtenidas de 5 cerdos y analizadas en la misma forma. El ectodominio 5' de los polipéptidos ORF 5 del virus PRRS tienen una secuencia de aminoácido que es variable entre aislados del virus PRRS, en tanto que el endodominio 3' de los polipéptidos ORF 5 del virus PRRS contiene una secuencia de aminoácidos que está conservada entre los aislados del virus PRRS. Los ensayos ELISA que contienen los polipéptidos ORF 5 del endodominio 3' (ya sea el polipéptido ORF 5 y el endodominio 3' del VR2332 o el polipéptido ORF 5 del endodominio 3' de M N30100) detectado en anticuerpos del virus PRRS en muestras obtenidas de animales expuestos ya sea a la cepa de vacuna (I ngelvac MLV) o al aislado de campo (MN30100) del virus PRRS (Tabla 9 y figura 13). Estos resultados demuestran que un polipéptido limitado a la secuencia del virus PRRS que se conserva entre los virus PRRS, ya sea procedentes de una versión de vacuna o de una versión tipo natural del virus PRRS, se puede utilizar para detectar animales expuestos a cualquier tipo de virus PRRS (por ejemplo, una versión de vacuna o una versión de tipo natural del virus PRRS).

Tabla 9. Resultados ELISA de muestras de suero obtenidos de cerdos expuestos a virus PRRS Ingelvac MLV o MN30100 y reaccionados con fragmentos de polipéptido ya sea del virus PRRS Ingelvac MLV o MN30100.

*Los datos son valores específicos después de la substracción del fondo. Los ensayos ELISA que contienen el polipéptido ORF 5 de ectodominio 5' de VR2332 detectaron anticuerpos del virus PRRS en muestras obtenidas de animales expuestos a la cepa de vacuna (Ingelvac MLV) y no detectaron anticuerpos de virus PRRS en muestras obtenidas de animales expuestos al aislado de campo (MN30100) del virus PRRS (tabla 9 y figura 13). De igual forma, los ensayos ELISA que contienen el polipéptido ORF 5 de ectodominio 5' de ORF 5 detectaron anticuerpos de virus PRRS en muestras obtenidas de animales expuestos al aislado de campo (MN30100) del virus PRRS y no detectaron anticuerpos del virus PRRS en muestras obtenidas en animales expuestos a la cepa de vacuna (I ngelvac MLV) (Tabla 9). Los resultados demuestran que un polipéptido limitado a una secuencia de virus PRRS de una versión de vacuna de un virus PRRS que es variable entre virus PRRS puede utilizarse para identificar animales expuestos a la versión de vacuna de virus PRRS en forma expuesta a animales expuestos a una versión tipo natural del virus PRRS. Ejemplo 8-Producción de polipéptidos del virus PRRS recombinante adicionales procedentes de cepas de vacuna v aislados de campo Se produjeron los siguientes polipéptidos: un polipéptido ORF 7 de virus PRRS (figura 26), un polipéptido del virus NSP 2H P (figura 27), un polipéptido NSP 2 S 1 H P del virus PRRS (figura 28), un polipéptido NSP 2 S2 HP del virus PRRS (figura 29), un polipéptido ORF 6 de primero y segundo dominios de terminal-N del virus PRRS (ORF 65' figura 30), y un polipéptido ORF 6 del virus PRRS (ORF 6 3'; figura 31 ). En cada caso, los polipéptidos contenían una secuencia myc seguida de la secuencia del virus PRRS seguido de una secuencia de polihistidina. El ácido nucleico que codifica la secuencia del virus PRRS de estos polipéptidos fue que la secuencia de nucleótido en la cepa VR-2332 del virus PRRS (genBank® Número de Acceso PRU87392). Además, un polipéptido myc-ORF 7-His, un polipéptido myc-ORF 5 3'-His, un polipéptido myc-ORF 6 3'-His, un polipéptido myc-NSP 2-His fueron producidos. El ácido nucleico que codifica la secuencia de virus PRRS de estos polipéptídos fue a partir de la secuencia de nucleótidos en la cepa Lelystad Virus (LV) del virus (Número de Acceso No. M96292 GenBank®). También se produjo un polipéptido myc-NSP 2 H P-His. El ácido nucleico que codifica la secuencia de virus PRRS de este polipéptido fue a partir de la secuencia de nucleótidos en la cepa de vacuna ATP Boehringer I ngelheim. Se utilizó el número de acceso GenBank® No.AY424271 para la cepa JA142 del virus PRRS, para obtener las secuencias ATP ya que la CEPA JA142 del virus PRRS es la cepa de virus de origen de la cepa de vacuna ATP Boehriner I ngelheim. Los polipéptidos que contienen una secuencia PRRS de VR-2332 fueron construidos como se describe en el Ejemplo 2. Para plásmidos que contienen secuencias de las cepas LV o ATP, del virus PRRS , los virus fueron aislados de los Usados de cultivo celular mediante centrifugación a través de un colchón de sacarosa. Se extrajo ARN viral con un equipo Quiagen. Los cebadores fueron designados para amplificar las secuencias deseadas y para contener sitio de restricciones. Los productos PCR fueron limpiados con el equipo de purificación Quiagen PCR y ligados en el vector. Los plásmidos fueron amplificados en pGEM-T, purificados y digeridos con E.coli DH5a, y BamH I y Xhol. El inserto fue purificado y clonado nuevamente en el vector pET 24b myc His.

Se expresaron polipéptidos recombinantes a partir de plásmidos en células (DE3)-RP. Después de la transformación las células fueron dispersadas en placas de agar LB que contienen canamizina (30 µg/mL) y cloramfenicol (35 µg/mL) y se incubaron durante la noche a una temperatura ambiente 37°C. Se recogió una sola colonia y se creció en 20 mL de medio 2xYT que contiene canamicina y cloramfenicol tal como se indicó anteriormente y se creció durante la noche con agitación a 225 rpm. Se transfirieron 20 mL de cultivo a un litro de medio 2x YT con antibiótico a una temperatura de 30°C con agitación hasta que el OD60 alcanzó 0.3. Se agregó Í PTG a 1 mM , y el frasco se agitó durante de 4 a 5 horas a una temperatura de 30°C. Se eliminaron para análisis de gel 200 µl de cultivo. El cultivo restante fue centrifugado en 4000 xg durante 30 minutos a una temperatura de 4°C para peletizar las bacterias. El pelet fue resuspendido en 30 mL de 10 mM NaH2PO4 1 0 mM Tris HCl , 8 M urea, pH 8.0. Se agregó PMS F a 1 mM, y la mezcla fue girada suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se centrifugó a 10, 000 xg durante 30 minutos a una temperatura de 4°C para peletizar los residuos celulares. Se agregaron seis mL de una pasta al 5°% de azarosa Ni-NTA (Quiagen; Valencia CA) al sobrenadante que contiene la proteína desnaturalizada y se giraron suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente la mezcla se colocó a una columna de vidrio 1 .5 cm I D x 40 cm y se dejó drenar. La columna se lavó dos veces con 20 mL de 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCL, 8 M urea, pH 6.3. La proteína recombinante se eluyó con de t3 a4 alícuotas de 4 mL de 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl , 8 M urea, pH 5.5 a 5.7. Las proteínas se almacenaron a una temperatura de -20°C hasta que se multiplicaron. Las proteínas se multiplicaron agregando 231 .3 mg de ditiotreitol a la solución de proteína reunida y se agitaron suavemente durante 2 horas. Posteriormente, la solución se diluyo rápidamente en 500 mL de amortiguador de multiplicación (100 mM Tris HCl , pH 8.0, 0.5 M L arginina, 8 mM de glutationa oxidaza, 2 mM EDTA, 10 µM de pepstatina A, 10 µL de leupeptina, 1 mM PMSF) y se agitó suavemente durante la noche a una temperatura de 4°C. La proteína se reconcentró mediante filtración de flujo tangencial (Pellicon XL Ultracel PLC 5 kd , Millipore, Bedford MA) y se diaiizó (Spectra/Por MWCO 3, 000) durante la noche a una temperatura de 4°C contra 1 0 mM de Na fosfato, pH 8.0. Las soluciones se concentraron mediante centrifugación (Centriprep, Millipore) a 3800 rpm durante 30 minutos a una temperatura de 4°C según fuera necesario. Las proteínas se almacenaron en alícuotas a una temperatura ambiente de -80°C. Las concentraciones y pureza de las proteínas fueron evaluadas mediante electroforesis de gel SDS-poliacrilamida. Ejemplo 9- Detección de anticuerpos para virus PRRS de genotipo Norteamericano v Europeo utilizando mezclas de polipéptidos de virus PRRS de cualquiera de ambos genotipos Se llevaron a cabo los siguientes experimentos (1 ) determinar se los ensayos ELISA utilizando polipéptidos del virus PRRS tipo Norteamericano (por ejemplo VR-2332) tienen la capacidad de detectar muestras positivas de virus PRRS de cerdos inoculados con un virus PRRS tipo Europeo (por ejemplo, virus Lelystad) (2) determinar si los ensayos ELI SA utilizando polipéptidos de un virus PRRS tipo Europeo (por ejemplo, virus Lelystad) tiene la capacidad de detectar muestras positivas de virus PRRS de cerdos inoculados con un virus PRRS tipo Norteamericano (por ejemplo , VR-2332). También se llevaron a cabo los siguientes experimentos para determinar si los ensayos ELISA utilizando una combinación de polipéptidos tanto de virus tipo Norteamericano como Europeo tienen la capacidad de detectar muestras positivas de virus PRRS deseados infectados ya sea con cualquier tipo del virus. Los polipéptidos que se encuentran a continuación en 1 5 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6, se utilizaron para recubrir placas ELI SA (COSTAR 3590, placa de 96 depósitos EIA/RIA, Corning NY): myc-ORF 7-His (VR-2332), myc-ORF 63'-His (VR-2332), myc-ORF 53'-His (VR-2332), myc-ORF 7-His (LV), myc-ORF 63'-His(LV), y myc-ORF 53'-His (LV). Estos polipéptidos se expresaron a partir de los plásmidos respectivos que contienen todos o parte de ORF 7 (N), ORF 6 (M), u O RF 5 (G P5). Los depósitos fueron recubiertos con soluciones que contienen ya sea 100 ng de cada uno de los tres polipéptidos VR-2332/100 µL, o 100 ng cada uno de los tres polipéptidos LV/100 µL, o 50 ng de cada uno de los seis polipéptidos/100 µL. Por lo tanto, todos los depósitos conten ían 300 ng de polipéptido. Las placas se incubaron con solución de recubrimiento durante la noche a una temperatura de 4°C. Los depósitos de la placa fueron lavados una vez con PBS, 0.05% Tween 20, pH 7.3-7.5 y bloqueados con 300 µ L de 5% de leche en polvo sin grasa en PBS, 0.05% Tween 20, pH 9.4-9.6, por depósito durante 2 horas. Las placas se lavaron 5 veces en PBS , 0.05% Tween 20, pH 7.3-7.5, y 100 µ L de suero de prueba diluido 1 /500 en PBS, 0.05% Tween 20, 5% de leche en polvo sin grasa agregada para duplicar los depósitos durante 1 hora. Las placas se lavaron 5 veces, y se agregó durante 1 hora 1 00 µL de anticuerpo purificado por afinidad etiquetado con peroxidasa para IgG de Porcino (H + L) (KPL, Gaithersburg MD) diluido 1 /5000 en PBS, 0.05% Tween 20, 5% de leche en polvo sin grasa. Las placas se lavaron 5 veces, y se agregó durante 5 minutos substrato de enzimas. El substrato de enzimas consistió en 100 µL por depósito de partes iguales de TMB solución de substrato de peróxido A TMB y solución de substrato H2O2 de peroxidasa B (TMB Peroxidase Substrate System, KPL, Gaithersburg MD) mezcladas juntas. Las reacciones se detuvieron con 100 µL de 2 M de ácido fosfórico, y los resultados se leyeron en 450 nm en un Lector Termo Max Microplate, Molecular Devices, Sunnyvale CA.

Se obtuvieron muestras de suero de cerdos no infectados (suero A negativo y suero B negativo), infectados con virus tipo Europeo PRRS (n = 9), y cualquiera de las dos cepas de virus PRRS Norteamericano, MN 184 o SDSU 73 (Johnson et al., Vet. lmmunol. Immunopathol., 102:233-247 (2004)) (n = 1 cada una). Las muestras se obtuvieron a aproximadamente a los 0, 7, 14, 21, 28, 35, y 49 días después de la infección. La mezcla de polipéptidos de VR-2332 detectó anticuerpos de virus anti-PRRS en suero de cerdos expuestos a MN184 o SDSU 73 a los 14 días después de la infección, y todos los puntos de tiempo posteriores (figura 32; panel A). Los polipéptidos VR-2332 no detectaron anticuerpos de virus anti-PRRS en suero de cerdos infectados con un virus PRRS Europeo. La mezcla de polipéptídos LV detectó anticuerpos en suero de cerdos expuestos al virus PRRS de genotipo Europeo a los 7 días de la infección y altos niveles en todos los puntos de tiempo posteriores (figura 32; panel B). Los polipéptidos LV también detectaron anticuerpos en cerdos expuestos a víruses PRRS Norteamericanos al día 14 y posteriormente (figura 32; panel B). La combinación de polipéptidos LV y VR-2332 detectó anticuerpos de virus anti-PRRS en suero de cerdos expuestos en forma similar a polipéptidos LV solos excepto que no hubo tendencia a valores mayores en los animales expuestos a MN 184 (figura 32; panel C). Estos resultados indican que los polipéptidos LV, tales como la mezcla de polipéptidos ORF 53' , ORF 63' , y ORF 7, puede detectar una respuesta de anticuerpo en cerdos expuestos a víruses PRRS de genotipo Europeo y Norteamericano tan pronto como a los 7 días después de la infección. Los polipéptidos VR-2332 reconocen específicamente sueros de cerdos expuestos a víruses PRRS tipo Norteamericano, y no sueros de cerdos expuestos a virus tipo Europeo. Por lo tanto, con las mezclas adecuadas de polipéptidos, se pueden detectar respuestas serológicas para todos los víruses PRRS y se pueden diferenciar entre respuestas para tipos Europeo y Norteamericano. Ejemplo 10 - Diferenciación entre animales expuestos a una vacuna o cepas de campo de virus PRRS utilizando polipéptidos de proteína no estructural El ejemplo 4, demostró que las respuestas de anticuerpo de porcino para los víruses PRRS pueden ser mayores a las proteínas no estructurales que a las proteínas estructurales, tales como N . Ya que la detección de NSP's puede dar como resultado un ensayo más sensible, se llevaron a cabo los siguientes experimentos para determinar si ios ensayos ELISAs comprendieron polipéptidos derivados de una proteína no estructural de VR-2332 o la cepa de vacuna ATP Ingelvac del virus PRRS puede diferenciar cerdos vacunados con las cepas Ingelvac MLV o I ngelvac ATP de cerdos expuestos a cepas del campo del virus PRRS . Los diversos polipéptidos fueron producidos conteniendo porciones de NSP 2 (figura 33).

En el primer experimento, las muestras de suero de cerdos expuestos a víruses de campo o al virus de vacuna Ingelvac MLV durante 28 días, fueron incubadas en placas microtituladoras recubiertas con polipéptidos myc-NSP 2 P-His (VR-2332) o myc-NSP 2HP-His (VR-2332). Los sueros de cerdos inoculados con vacuna MLV, la cual fue derivada de la cepa VR-2332, reaccionó fuertemente tanto con polipéptidos myc-NSP 2P-His como con polipéptidos myc-NSP 2 HP-His. Las señales positivas en muestras de suero diluidas 1 /1 000 de siete cerdos fluctuó de 0.8 a 3.6 OD unidades contra NSP 2P y de 0.7 a 3.1 OD unidades contra NSP 2HP. La diferencia en porcentaje relativo (1 -(ODNSP 2Hp/ODNSp 2p)) después de la substracción del fondo, fluctuó de 9.9 a 23.2 por ciento. En contraste, los sueros de cerdos inoculados con cualesquiera de los cinco diferentes víruses de campo tipo natural reaccionaron más fuertemente con poüpéptidos myc-NSP 2P-His que con polipéptidos myc-NSP 2H P-His. Las señales positivas entre 35 cerdos expuestos a cinco diferentes víruses fluctuó de 0.54 a 3.3 OD unidades contra NS P 2P y de 0.22 a 1 .9 OD unidades contra NSP 2HP . La diferencia en porcentaje relativo fluctuó de 36.6 a 85.1 por ciento. Estos resultados indican que el polípéptido NSP 2HP (VR-2332) es diferente a los otros polipéptidos NSP 2HP del virus PRRS de modo que su virus de vacuna derivado MLV, provoca anticuerpos en cerdos que reaccionan en forma selectiva con el polipéptido NSP 2H P (VR-2332). Además, la reactividad pronunciada de muestras de suero de cerdos expuestos al virus de campo con NSP 2P (VR-2332) indica que este polipéptido puede ser utilizado como un polipéptido de diagnóstico. La especificidad relativa del polipéptido NSP 2 HP para la vacuna MLV indica que una prueba que compara la reactividad serológica relativa de un suero de prueba tanto para VR-2332 NSP 2P como para NSP 2HP puede diferenciar porcino vacunados con I ngelvac MLV de cerdos que fueron expuestos a víruses de campo. En un segundo experimento, las partes adicionales del polipéptido NSP 2 (VR-2332) que mostraron variación en la secuencia de aminoácidos entre las secuencias del virus PRRS en GenBank fue evaluada con respecto a reactividad específica con suero de cerdos expuestos a la vacuna I ngelvac MLV o víruses de campo como en el experimento previo. Las placas ELISA fueron recubiertas con polipéptidos myc-NSP 2P-His (VR-2332) o con polipéptidos myc-NSP 2 S 1 H P-His (VR-2332) o myc-NSP 2 S2 HP-His (VR-2332). Todos los suero de cerdos, tanto de animales vacunados como de animales expuestos al virus de campo y diluidos 1 /1000 (n=42), reaccionaron con NSP 2P con valores OD altos como en el experimento anterior. Sin embargo, los sueros reaccionaron débilmente tanto con NSP 2 S 1 HP como con NSP 2 S2 HP. Los valores OD de más de 90 por ciento de las muestras, fueron debajo de 0.1 . Estos resultados indican que los polipéptidos de aproximadamente 30 a 40 aminoácidos pueden no comprender suficiente inmunoreactividad para discriminar diferentes reactividades serológicas a una infección viral incluso cuando sea alta la variabilidad de la secuencia de aminoácido en el polipéptido. En un tercer experimento, las placas microtituladoras fueron recubiertas tal como se describe en el Ejemplo 9, con polipéptidos myc-NSP 2H P-His (ATP) o myc-NSP 2P-His (VR-2332). Se llevaron a cabo ensayos ELISA con muestras de suero de cerdos expuestos a vacunas y víruses de campo tal como se describe en el Ejemplo 4. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 9, con la excepción de que las muestras de suero fueron diluidas 1 /1000 , y se detuvieron las reacciones de desarrollo de color después de 3 minutos. Tal como se muestra en ia presente invención, las muestras de suero de cerdos expuestos a víruses de campo o a la vacuna MLV reaccionan en forma positiva con NSP 2P (VR-2332) (figura 34). El Suero de cerdos expuestos a Abst-1 o la cepa de vacuna ATP no reaccionan en forma positiva, debido al uso en dosis que provoca una baja respuesta inmune o insignificante. El polipéptido NSP 2HP (ATP) reaccionó fuertemente con suero procedente de un cerdo expuesto a JA142, el virus de origen de la vacuna, aunque también al suero de cerdos expuestos a víruses de campo SDSU73 y 17198-6. Estos resultados demuestran que el uso de polipéptidos no estructurales, tales como NS P 2HP y NSP 2 P de diferentes cepas del virus PRRS, tal como Ingelvac ATP y VR-2332 no dio como resultado una prueba serológica que fue específica para exposición de porcino a una cepa o aislado en particular. El polipéptido NSP 2H P (ATP) puede no ser diferente en forma única de otros polipéptidos NSP 2 HP del virus PRRS en la forma en la que lo es NSP 2HP (VR-2332). Ejemplo 1 1 - I ncremento de pH durante el paso de bloqueo reduce señales de fondo Los fondos superiores no específicos en pruebas ELISA, es un problema que se encuentra comúnmente en serología de porcino, especialmente con sueros en bajas diluciones y procedentes de animales con más edad , tales como seis meses y más. Los niveles de reactividad específica y no específica de sueros de porcino positivos y negativos fueron determinados en placas ELISA que fueron bloqueadas en un pH de 7.4 ó 9.6. Los depósitos fueron recubiertos con cantidades ¡guales de ectodominios N , ORF 5 y ORF 6, y endodominio ORF 5 (todos procedentes de VR-2332) de 0 a 300 ng/depósito, y se aplicaron sueros positivos o negativos en diluciones de 1 /40 a 1 /4000. Las muestras de suero positivas fueron obtenidas de un cerdo de 7 semanas de edad a las 3 semanas después de la exposición VR-2332. Se obtuvieron muestras de suero negativo de un cerdo de 6 meses de edad. El bloqueo se llevó a cabo con 5% de leche en polvo sin grasa en PBS , 0.05% Tween 20 en un pH de 7.4 ó 9.6. Se observó desarrollo de color dependiente de la concentración de suero en suero positivo del virus PRRS en un pH de 7.4, aunque el desarrollo de color no específico en depósitos del suero negativo-virus PRRS fue incluso mayor que la reactividad específica en niveles de moderados a bajos del antígeno en la placa (figura 35). Con un valor de pH de bloqueo de 9.6, la reactividad no específica se abolió casi completamente. La reactividad específica se redujo aproximadamente en un 50%, aunque la proporción se señal a ruido general se incrementó en gran medida (figura 35). Estos resultados indican que las soluciones de bloqueo (por ejemplo , soluciones de proteína) aplicadas a las placas ELISA en un pH neutral , no neutralizan completamente la capacidad de enlace de proteína, dando como resultado enlace no específico de inmunoglobulinas y valores OD altos de porcino. El problema se incrementa en diluciones de suero bajas las cuales podrían incrementar por otra parte la sensibilidad del ensayo. El incremento del pH en la solución de bloqueo arriba de 7.4 (por ejemplo, mayor a 9) redujo o abolió la reactividad no específica a través de un amplio rango de cantidades de recubrimiento con antígenos y diluciones de suero. Ejemplo 12 - Producción de polipéptidos de virus PRRS recombinante Se produjeron los siguientes polipéptidos utilizando métodos y materiales similares a los descritos en el Ejemplo 2: un polipéptido ORF 7 del virus PRRS (cepa Lelystad) (figura 36), un polipéptido NSP 2P del virus PRRS (cepa Lelystad) (figura 37), un polipéptido NSP 2P del virus PRRS (cepa JA 142) (figura 38), un polipéptido NS P 2H P del virus PRRS (cepa ATP) (figura 39), un polipéptido ORF 5 de endodominio del virus PRRS (cepa Lelystad) (ORF 53' ; figura 40), y un polipéptido ORF 6 de endodominio del virus PRRS (cepa Lelystad) (ORF 63'; figura 41 ). Ejemplo 13 - Adición de lisozimas a amortiguador de recubrimiento, incrementa reactividad a nucleocápsido Se incluyeron lisozimas como un control en el recubrimiento de depósitos con polipéptidos recombinantes. En síntesis, se recubrieron depósitos ELISA con 100 ng de polipéptidos (por ejemplo, polipéptido myc-ORF 7-H is multiplicado) solo o con varias cantidades de lisozima de huevo de pollo (Sigma) en 100 µL de amortiguador de carbonato. Se llevó a cabo el ensayo ELI SA con muestras de suero procedentes de dos cerdos de 21 días, después de la infección con VR2332 de la cepa del virus PRRS o suero de dos cerdos de control no infectados. No se observó diferencia en la intensidad de las reacciones de color, cuando las placas se recubrieron con varios polipéptidos recombinantes, incluyendo polipéptido myc-ORF 5-3'-His y polipéptido myc-ORF 7-His no multiplicado, en la presencia o ausencia de lisozima en varias concentraciones. En forma similar, no se observó reactividad para la lisozima sola. Sin embargo, la reactividad del polipéptido myc-ORF 7-His multiplicado, se incrementó substancialmente en la presencia de lisozima. Además, el grado de aumento fue proporcional a la cantidad de lisozima agregada (figura 42). En la inclusión de lisozima en el paso de recubrimiento incrementó la reactividad específica de suero de virus PRRS inmune en una forma dependiente de la dosis hasta un máximo de aproximadamente 200 ng de lisozima por depósito (figura 42). Se observó el efecto en todas las diluciones de sueros examinados, observándose mayores efectos con suero menos diluido. En una dilución de suero 1 /300, la absorbancia específica promedio fue de aproximadamente 0.42 en la ausencia de lisozima, aunque fue mayor a 1 .0 en la presencia de 164 ng o más de lisozima. El efecto de aumento de la lisozima, también fue observado con un amplio rango de cantidades de recubrimiento, incluyendo el rango de 20 a 500 ng , de polipéptido myc-ORF 7-His multiplicado por depósito. Aproximadamente 1 00 ng de lisozima por depósito, proporcionó resultados mejorados bajo una variedad de condiciones incluyendo, por ejemplo, dilución de suero de prueba de 1 :40 a 1 :5000, incubación de suero de prueba con antígeno durante 45 minutos a 90 minutos, dilución del segundo conjugado de anticuerpo de 1 :500 a 1 :5000, y tiempo de reacción de desarrollo de color de 2 minutos a 20 minutos. El descubrimiento de que la lisozima aumenta la reactividad serológica anti-PRRS específica para el polipéptido ORF 7, es útil ya que el polipéptido ORF 7 es un antígeno importante del virus PRRS y es ampliamente utilizado en la elaboración de pruebas serológicas. Las condiciones que incrementan la sensibilidad de la detección de ios anticuerpos del polipéptido anti-ORF 7 puede incrementar la sensibilidad de un ensayo de diagnóstico para la infección temprana o la exposición al virus PRRS, puede incrementar la duración de detección después de la exposición o seroconversión, y puede proporcionar una base para una prueba más robusta, ya que la diferencia entre resultados positivos y negativos puede ser incrementada. Ejemplo 14 - Estabilidad incrementada de ensayos ELI SA basados en proteína viral recombinante La capacidad de los polipéptidos recombinantes para detectar la exposición previa al virus PRRS en cerdas en gestación en una operación de crianza de cerdos comercial, se evalúa en comparación con el ensayo ELISA I DEXX 2XR. Los sueros de 32 cerdas en gestación en un rebaño infectado en forma endémica, se obtuvieron en intervalos de 35 días y se probaron con respecto a anticuerpos del virus anti-PRRS mediante ensayo ELISA I DEXX 2XR y mediante reactividad ELISA para una combinación de tres polipéptidos de virus PRRS recombinante (ORF 7, ORF 5-3', y ORF 6-3', todos de la cepa VR2332), o polipéptidos de virus PRRS individual de la cepa VR2332 (ORF 5 + 6 quimera de ectodominio, NSP 1 , y NSP 2P) o un polipéptido de virus PRRS individual procedente de la cepa de virus Lelystad (NSP 2P; figura 37). En síntesis, las muestras de suero diluidas 1 /500, corrieron en duplicado en placas ELISA recubiertas con 50 ng de quimera ORF 5 + 6 sola, o 100 ng de una combinación de ORF 7, ORF 5-3' y ORF 6-3' (33 ng cada uno), o 100 ng de NSP 1 , 0 100 ng de NSP 2P. Las muestras de suero también fueron analizadas mediante ensayo ELISA I DEXX 2XR. Para cada ensayo ELISA, la diferencia en valor de absorbancia promedio (día 35 a día 0) se calculó en los 32 cerdos y se ordenó de positivo a negativo. Para cada grupo de datos, se calculó la ecuación de regresión lineal hipotética y el coeficiente de regresión . Los valores de resultantes fueron ordenados del valor más alto al más bajo para los 32 animales de cada preparación de polipéptido recombinante (figura 43). En cada caso, se obtuvo un rango de valores de positivo (valor más alto en intervalos de 35 días a intervalos de 0 días) a negativo (valor más bajo en intervalos de 35 días a intervalos de días 0). La variación más alta (desviación estándar de los residuos = 0.55) entre los animales en los niveles de anticuerpo, tanto positivo como negativo, ocurrió en la prueba ELISA I DEXX 2XR (figura 43). La prueba ELISA de polipéptido recombinante exhibió resultados más uniformes a los del análisis de regresión hipotética que indicó una línea con una pendiente más cercana a cero, y redujo la variación en las respuestas más altas y más bajas (figura 43). Estos resultados fueron en promedio más uniformes, tal como se indica mediante la pendiente de la ecuación de regresión lineal que fue más cercana a cero, y la desviación estándar más pequeña de los residuos en cada caso en comparación con la prueba ELISA I DEXX 2XR. El resultado más consistente se obtuvo con NSP2P derivado del virus Lelystad . Las grandes diferencias en el ensayo dieron como resultado un período de 35 días que puede ser interpretado como una pérdida en inmunidad en animales que exhiben una gran disminución en reactividad, y en la forma de una infección nueva de animales susceptibles en casos de grandes incrementos en reactividad. La consecuencia puede ser un incremento potencial en interpretaciones positivas, falsas y negativas falsas del estado del virus PRRS de animales individuales y de poblaciones porcino comerciales. Los ensayos ELISA de polipéptido recombinante exhibieron menos variación en respuestas del animal , en forma consistente con la exposición de los animales al virus PRRS, la presencia de una respuesta inmune a los animales, y un pequeño cambio en el estado del anticuerpo del animal en un período de 35 días. Estos resultados indican que los ensayos ELISA de polipéptido recombinante con base en polipéptidos individuales o en combinación de polipéptidos, puede proporcionar una evaluación más uniforme de exposición del rebaño al virus PRRS y puede tener una probabilidad reducida de interpretaciones positivas falsas y negativas falsas. Ejemplo 15 - Detección de anticuerpos para víruses PRRS de genotipo Norteamericano v Europeo utilizando polipéptidos de virus PRRS individuales de cualquier genotipo Las muestras de suero descritas en el Ejemplo 9 , así como los polipéptídos ORF 7 del virus PRRS (del virus Lelystad, un genotipo Europeo; figura 36) y NSP2P (de VR2332 , un genotipo Norteamericano; o virus Lelystad, figura 37) del virus P RRS recombinante, se utilizaron para examinar la especificidad de reacción para polipéptidos de virus PRRS individuales. Las muestras de suero de cerdos inoculados con un virus PRRS de genotipo Europeo y con virus de genotipo Norteamericano, MN 1 84, reaccionó fuertemente con polipéptidos ORF 7 del virus Lelystad , aunque las cepas de genotipo Norteamericano SDSU73, VR2332, e I ngelvac MLV reaccionaron débilmente (figura 44). Estos resultados indican que los polipéptidos ORF 7 del virus Lelystad se pueden utilizar para discriminar respuestas serológicas para un grupo de víruses PRRS Norteamericanos, así como cepas del virus PRRS Europeo. Las muestras de suero de cerdos inoculados con un virus PRRS de genotipo Europeo, reaccionaron exclusivamente con polipéptidos LV NSP 2P y no todos con los polipéptídos VR2332 NSP 2P (figura 44, paneles B y C). El polipéptido VR2332 NSP 2P reaccionó fuertemente con suero de cerdos expuestos a VR2332, y en forma positiva, aunque menos fuerte, con sueros de cerdos expuestos a Ingelvac MLV y SDSU73. Pareció no reaccionar para nada con suero de cerdos expuestos a MN 1 84. Estos recubrimientos indican que los polipéptidos del virus PRRS individual pueden detectar respuestas serológicas para cerdos expuestos a subgrupos de víruses PRRS. OTRAS MODALI DADES Quedará entendido que aunque la presente invención ha sido descrita junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la presente invención, el cual está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un equipo para detectar un anticuerpo de virus anti-PRRS de porcino, en donde el equipo comprende: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido de virus PRRS seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos de NSP 2 y polipéptidos ORF 5, en donde el polipéptido comprende un epítope para dicho anticuerpo de virus anti-PRRS de porcino; y (b) un anticuerpo Ig anti-porcino. 2. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos ocho residuos de aminoácido de longitud. 3. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 100 aminoácidos de longitud, la cual tiene al menos el 80 por ciento aproximadamente de identidad, con respecto a la longitud, con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO:5. 4. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 100 aminoácidos en longitud, la cual tiene al menos el 90 por ciento de identidad, con respecto a la longitud, con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO:5. 5. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 20 aminoácidos de longitud, en la cual tiene aproximadamente el 80 por ciento de identidad con una secuencia que se encuentra en la SEQ ID NO:22, con respecto a la longitud. 6. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 20 aminoácidos de longitud, la cual tiene al menos aproximadamente 90 por ciento de identidad con la secuencia que se encuentra en la SEQ ID NO:22, con respecto a la longitud. 7. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO:11. 8. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61, ó 64. 9. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido recombinante producido por las células no infectadas con un virus PRRS. 10. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo Ig anti-porcino es un anticuerpo IgG ó IgM anti-porcino. 11. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo Ig anti-porcino es un anticuerpo Ig de cabra anti-porcino. 12. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el equipo comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 2 del virus PRRS y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptído ORF 5 del virus PRRS. 13. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el equipo comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 7 del virus PRRS. 14. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el equipo comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 6 del virus PRRS. 15. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo Ig anti-porcino comprende una enzima. 16. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el equipo comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 1 del virus PRRS. 17. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque el equipo comprende una muestra de control que contiene anticuerpo del virus anti-PRRS porcino. 18. El equipo tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque el equipo comprende una muestra de control que contiene un suero de porcino que carece de anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino. 1 9. Un método para determinar si una muestra contiene o no un anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino, caracterizado porque el método comprende: (a) contactar un polipéptido con la muestra bajo condiciones en donde el polipéptido forma un complejo de anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino:polipéptido con un anticuerpo, si encuentra, dentro de la muestra, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido del virus PRRS seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos NSP 2, y polipéptidos ORF 5, en donde el polipéptido comprende un epítope para el anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino; y (b) detectar la presencia o ausencia del complejo, en donde la presencia del complejo indica que la muestra contiene el anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino. 20. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque la muestra es una muestra de suero de cerdo. 21. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos ocho residuos de aminoácidos de longitud. 22. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 100 aminoácidos de longitud, la cual tiene al menos el 80 por ciento de identidad, con respecto a la longitud, con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO:5. 23. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 20 aminoácidos de longitud, la cual tiene aproximadamente el 80 por ciento de identidad para una secuencia que se encuentra en la SEQ ID NO:22 con respecto a la longitud. 24. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO:11. 25. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, 19, 22, 26, 29, 32, 39, 45, 61, ó 64. 26. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido recombinante producido por células no infectadas con un virus PRRS. 27. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el paso (b), comprende contactar el complejo con un anticuerpo lg anti-porcino. 28. El método tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo Ig anti-porcino contiene una enzima. 29. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el paso (a) comprende contactar la muestra con polipéptidos dentro de un equipo, en donde el equipo comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 2 del virus PRRS y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 5 del virus PRRS. 30. El método tal como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque el equipo comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 7, del virus PRRS, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido ORF 6 del virus PRRS, y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en un polipéptido NSP 1 del virus PRRS. 31. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el método comprende contactar la muestra con un polipéptido adicional para formar un complejo de polipéptido: anticuerpo del virus anti-PRRS de porcino, en donde el polipéptido adicional comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentran en un polipéptido ORF 7 del virus PRRS , un polipéptido ORF 6 del virus PRRS, o un polipéptido NSP 1 del virus PRRS. 32. U n equipo para determinar si un animal recibió o no una versión de vacuna de un virus o fue infectado, con una versión que ocurre naturalmente del virus, caracterizado porque el equipo comprende: (a) un primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al primer polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente enlazan al primer polipéptido, y (b) un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al segundo polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente no enlazan al segundo polipéptido. 33. El equipo tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el animal es un vertebrado. 34. El equipo tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el animal es un cerdo. 35. El equipo tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el virus es un virus PRRS. 36. El equipo tal como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque la versión de vacuna es un virus PRRS atenuado. 37. El equipo tal como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque la versión de vacuna es la vacuna RespPRRS. 38. El equipo tal como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en una parte de terminal-C de un polipéptido ORF 5 de un virus VR2332 ó RespPRRS PRRS. 39. El equipo tal como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la mitad de terminal-N de un polipéptido ORF 5 de un virus PRRS VR2332 ó RespPRRS. 40. Un método para determinar el estado inmunológico de un animal con respecto a un virus, en donde el estado inmunológico es tal que, (1 ) el animal recibió una versión de vacuna del virus, (2) un animal fue infectado con una versión del virus que ocurre naturalmente, o (3) el animal es inmunológicamente na?ve con respecto al virus, caracterizado porque el método comprende: (a) contactar la primera muestra del animal con un primer polipéptido bajo condiciones en donde el primer polipéptido forma un primer complejo de polipéptido: anticuerpo , con un anticuerpo, si se encuentra, dentro de la primera muestra, en donde el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al primer polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente enlazan al primer polipéptido, (b) contactar una segunda muestra del animal con un segundo polipéptido bajo condiciones en donde el segundo polipéptido forma un segundo complejo de polipéptidos:anticuerpo con un anticuerpo, si se encuentra, dentro de la segunda muestra, en donde el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus enlazan al segundo polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus que ocurre naturalmente, no enlazan al segundo poüpéptido, y (c) detectar la presencia o ausencia del primer complejo de polipéptido:anticuerpo, y la presencia o ausencia del segundo complejo de polipéptido:anticuerpo, en donde la presencia del primer complejo del polipéptido: anticuerpo , y la presencia del segundo complejo de polipéptido:anticuerpo, indica que el animal recibió la versión de vacuna del virus, en donde la presencia del primer complejo de polipéptido:anticuerpo, y la ausencia del segundo complejo de polipéptido:anticuerpo, indica que el animal fue infectado con la versión del virus que ocurre naturalmente, y en donde la ausencia del primer complejo de polipéptido:anticuerpo y la ausencia del segundo complejo de polipéptido:anticuerpo indica que el animal es inmunológicamente na?ve con respecto al virus. 41 . El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el animal es un vertebrado. 42. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el animal es un cerdo. 43. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el virus es un virus PRRS. 44. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la versión de vacuna es un virus PRRS atenuado. 45. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la versión de vacuna es la vacuna RespPRRS. 46. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la mitad de terminal-C de un polipéptido ORF 5 de un virus PRRS de VR2332 o RespPRRS. 47. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la mitad de la terminal-N de un polipéptido ORF 5 de un virus PRRS VR2332 o RespPRRS. 48. Un polipéptido substancialmente puro que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NSP 1 del virus PRRS o un fragmento del polipéptido NSP 1 del virus PRRS, en donde el fragmento tiene más de 20 residuos de aminoácidos de longitud. 49. Un polipéptido substancialmente puro que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NSP 2 del virus PRRS o un fragmento del polipéptido NSP 2 del virus PRRS, en donde el fragmento tiene más de 20 residuos de aminoácidos de longitud. 50. Un polipéptido substancialmente puro que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido NSP 4 del virus PRRS o un fragmento del polipéptido NSP 4 del virus PRRS, en donde el fragmento tiene más de 20 residuos de aminoácidos de longitud. 51. Una célula huésped que expresa un polipéptido NSP 1, NSP 2, ó NSP 4 del virus PRRS. 52. Una célula huésped tal como se describe en la reivindicación 51, caracterizada porque la célula es una célula procariótica. 53. Una célula huésped tal como se describe en la reivindicación 51, caracterizada porque la célula es una célula bacteriana. 54. Un método para determinar el estado inmunológico de un cerdo con respecto a un virus PRRS, en donde el estado inmunológico es tal que (1 ) el cerdo recibió una versión de vacuna del virus PRRS , (2) el cerdo fue infectado con una versión del virus PRRS que ocurre naturalmente, o (3) el cerdo es inmunológicamente na?ve con respecto al virus PRRS , caracterizado porque un método comprende: (a) contactar una primera muestra del cerdo con un primer polipéptido bajo condiciones en donde el primer polipéptido forma un primer complejo de polipéptido:anticuerpo con un anticuerpo, si se encuentra, dentro de la primera muestra, en donde el primer polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus PRRS enlaza al primer polipéptido y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus PRRS que ocurren naturalmente enlazan al primer polipéptido, (b) contactar una segunda muestra procedente del cerdo, en un segundo polipéptido bajo condiciones en donde el segundo polipéptido forma un segundo complejo de polipéptido:anticuerpo con un anticuerpo, si se encuentra, dentro de la segunda muestra, en donde el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de modo que los anticuerpos elaborados contra la versión de vacuna del virus PRRS enlazan al segundo polipéptido, y los anticuerpos elaborados contra la versión del virus PRRS que ocurren naturalmente no enlazan el segundo polipéptido, y (c) detectar la presencia o ausencia del primer complejo de polipéptido-.anticuerpo y la presencia o ausencia del segundo complejo de polipéptido:anticuerpo, en donde la presencia del primer complejo de polipéptido:anticuerpo y la presencia del segundo complejo del polipéptido:anticuerpo indica que el cerdo recibió la versión de vacuna del virus PRRS, en donde la presencia del primer complejo del polipéptido:anticuerpo y la ausencia del segundo complejo del polipéptido:anticuerpo indica que el cerdo fue infectado con la versión del virus PRRS, que ocurre naturalmente, y en donde la ausencia del primer complejo de polipéptido:anticuerpo y la ausencia del segundo complejo de polipéptido:anticuerpo indica que el cerdo es ¡nmunológicamente na?ve con respecto al virus PRRS. 55. U n método para reducir las señales de fondo en un ensayo, con la capacidad de detectar anticuerpos del virus PRRS en una muestra de porcino, en donde el ensayo comprende contactar un soporte sólido que comprende polipéptídos del virus PRRS, con una muestra porcino, y en donde el método comprende tratar el soporte sólido con una solución de bloqueo con un valor de pH mayor a 8.0. 56. El método tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 8.5. 57. El método tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 9.0. 58. El método tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 9.5. 59. El método tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 10.0. 60. El método tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizado porque la solución de bloqueo es leche. 61. El método tal como se describe en la reivindicación 55, caracterizado porque la solución de bloqueo es leche en polvo sin grasa en PBS. 62. Un soporte sólido que comprende polipéptidos del virus PRRS, caracterizado porque el soporte fue tratado con solución de bloqueo con un valor de pH mayor a 8.0. 63. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 8.5. 64. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 9.0. 65. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 9.5. 66. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el valor de pH es mayor a 10.0. 67. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque la solución de bloqueo es leche. 68. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque la solución de bloqueo es leche en polvo sin grasa en PBS. 69. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el soporte sólido es una placa de plástico. 70. Un método para incrementar la capacidad de un polipéptido adherido a un soporte sólido, para reaccionar con un anticuerpo que enlaza al polipéptido, en donde el método comprende contactar el soporte sólido con el polipéptído y una lisozima. 71. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de virus PRRS. 72. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido ORF 7 del virus PRRS. 73. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido recombinante producido por células no infectadas con un virus PRRS. 74. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de polipéptido del virus anti-PRRS . 75. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque la üsozima es una lisozima de huevo de pollo. 76. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque el polipéptido y la lisozima están en contacto con un soporte sólido en una proporción de al menos 4 ng del polipéptido por 1 ng de la lisozima. 77. El método tal y como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque la lisozima y el polipéptido están en contacto con el soporte sólido en una proporción de al menos 1 ng de la lisozima por 1 ng del polipéptido. 78. Un soporte sólido que comprende polipéptidos del virus PRRS , caracterizado porque el soporte se puso en contacto con un polipéptido del virus PRRS y una lisozima. 79. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 78, caracterizado porque el poüpéptido es un polipéptido ORF 7 del virus PRRS. 80. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 78 , caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido recombinante producido por células no infectadas con un virus PRRS. 81 . El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 78 , caracterizado porque la lisozima es una lisozima de huevo de pollo. 82. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 78, caracterizado porque el polipéptido y la lisozima se ponen en contacto con un soporte sólido en una proporción de al menos 4 ng del polipéptido 1 ng de la lisozima. 83. El soporte sólido tal como se describe en la reivindicación 78, caracterizado porque la lisozima y el polipéptido se contactan con el soporte sólido en una proporción de al menos 1 ng de la lisozima por 1 ng del polipéptido.