CN102483411A

CN102483411A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定

Info

Publication number: CN102483411A
Application number: CN2009801552957A
Authority: CN
Inventors: 方颖; 伊丽莎白·M·布朗; 克雷格·威尔伯恩; 埃里克·A·纳尔逊
Original assignee: University of South Dakota
Current assignee: University of South Dakota
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2012-05-30
Also published as: WO2010062395A3; WO2010062395A2; CA2744675A1; EP2370817A4; EP2370817A2; US20120040335A1

Abstract

酶联免疫吸附测定(ELISA)基于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白7(nsp7)并提供了抗1型(欧洲)和2型(北美)PRRSV的血清抗体的同时检测和区分。本发明提供了利用PRRSV nsp7作为抗原的用于抗1型和/或2型PRRSV的血清抗体的检测和/或区分的血清学测定，并提供了用于PRRSV感染的检测、流行病学调查和爆发研究的诊断方法。本发明可单独使用或作为随访测定来确定利用诸如IDEXX HERDCHEKPRRS ELISA的其它测定可能发生的非预期的阳性结果的真实状况。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年11月26日提交的美国临时申请第61/200,398号的权益，其公开内容在此以其整体通过引用并入。

关于联邦赞助的研究或开发的声明

本发明在国家猪肉委员会(National Pork Board)基金号#05-155和美国农业部州际合作研究、教育和推广局(USDA Cooperative State Research，Eduction and Extension Service)的国家研究计划(National ResearchInitiative)基金号2004-35605-14197(通过PRRSV协作农业计划(PRRSVCAP)基金#580)下完成。美国政府可拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及生物技术，更具体地涉及用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和/或在病毒的基因型间进行区分的血清学测定。

背景

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)仍是世界范围内最具破坏性的猪的疾病之一。病原(PRRSV)被归类为套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)。核苷酸序列对比显示PRRSV可被分为不同的欧洲基因型(1型)和北美基因型(2型)，它们在基因组水平上仅具有约63％的核苷酸同一性(Allende等人，1999；Nelsen等人，1995)。PRRSV是含有单一正链RNA基因组的小的包膜病毒。PRRSV基因组长约15kb并含有9个可读框。复制酶相关基因ORF1a和ORF1b位于基因组的5′末端，占病毒基因组的近75％。预测ORF1a编码的多蛋白在8个位点被切割而形成9种终产物：nsp1α、nsp1β和nsp2到nsp8。复制酶的ORF1b部分的蛋白水解性切割生成产物nsp9到nsp12(Den Boon等人，1995；van Dinten等人，1996)。来源于ORF1a的非结构蛋白(nsp)具有蛋白水解活性且负责对其它nsp切割产物进行处理。ORF1b切割产物参与病毒转录和复制(Gorbalenya等人，1989；den Boon等人，1991；Godeny等人，1993；van Dinten等人，1996；Gorbalenya等人，1989；Snijder和Meulenberg，1998)。基因组的3′未端编码4个膜相关糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5；由亚基因组mRNA 2-5所编码)，2个非糖基化的膜蛋白(2b和M；由亚基因组mRNA 2和6所编码)，和1个核壳蛋白(N；由亚基因组mRNA 7所编码)(Meulenberg等人，1995，1996；Meng等人，1995；Mounir等人，1995；Bautista等人，1996；Mardassi等人，1996；Wu等人，2001，2005)。

缺少有效的疫苗和治疗性药物的情况下，实现“国家PRRS消除”的关键方法之一是鉴定PRRSV感染的猪，从而这样的猪可被检疫、隔离或从畜群(herd)中除去以阻止或减少感染传播至易感动物。测定畜群的PRRS状况的血清学检测常包括在用于监测和控制PRRS的管理策略中。大量信息表明核壳(N)蛋白是最具免疫原性的蛋白，并且是可用于鉴定感染的猪的血清学测定的理想靶标(Ferrin等人，2004；Seuberlich等人，2002；Wootton等人，1998)。

目前，基于N蛋白作为抗原的IDEXX

PRRS 2XR ELISA广泛用于对北美2型PRRSV或欧洲样1型PRRSV的抗体的检测。然而，应为血清阴性的畜群中个体非预期的阳性IDEXX ELISA结果引起了高度关注。这些假阳性需要使用替代的抗原来作为感染的更精确的指示。先前的研究已显示某些非结构蛋白，比如nsp2也具有高度免疫原性(Fang等人，2004；Oleksiewicz等人，2001a，b，2002；Johnson等人，2007)。然而，nsp 2一般是不可溶的，这使得难以在ELISA中使用其作为基底抗原进行研究。

本发明提供了可利用非结构蛋白对PRRSV感染的猪的体液免疫反应进行鉴定的试剂和/或方法。

发明概述

本发明提供了对兽医诊断实验室和研究者有用的方法。本发明涉及基于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白7(nsp7)的酶联免疫吸附测定(ELISA)。本发明提供了还可用于抗1型(欧洲)和2型(北美)PRRSV的血清抗体的同时检测和区分的材料与方法。

本发明还涉及使用nsp7作为抗原用于抗1型和/或2型PRRSV的血清抗体的检测和/或区分的血清学测定。本发明还涉及用于PRRSV感染的检测、流行病学调查和爆发研究的诊断方法。本发明可单独使用或作为随访测定来确定利用诸如IDEXX HERDCHEK PRRS ELISA的其它测定可能发生的非预期的阳性结果的真实状况。

本测定在抗原产生方面是方便的，并且还是可信的、经济的和具有高度灵敏性和血清型特异性。

本发明的基于nsp7的ELISA提供了超越其它基于非结构蛋白的ELISA的改进，这至少部分地由于抗原制备的方便和诊断性检验应用的高度特异性和精确度。

在示例性的实施方案中，重组的nsp 7蛋白，或其片段在用于抗1型和2型PRRSV的血清抗体的同时检测和区分的体外双重酶联免疫吸附测定(nsp7双重-ELISA)中作为抗原。

本发明还涉及用于检测抗nsp7或其片段的抗体的试剂盒。

附图简述

图1描绘了考马斯蓝(Coomassie blue)染色后的重组PRRSV非结构蛋白制备物十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳。泳道1显示了蛋白分子大小标准；泳道2至6分别代表nsp1、nsp2、nsp4、nsp7和nsp8制备物。NA＝北美基因型(II型)；EU＝欧洲基因型(I型)。注：nsp1进一步被切割为nsp1α和nsp1β亚基(5，13)。泳道2中显示了从固定的金属亲和柱洗脱的完整的nsp1和26kDa nsp1β。

图2描绘了对PRRSV nsp的抗体反应动力学。利用II型PRRSVVR2332对猪进行实验感染。血清样品如所示为从0到202dpi。对于nsp4和nsp8，检验了来自10只猪的血清样品；对于nsp1、nsp2和nsp7，检验了来自30只猪的血清样品。

图3描绘了基于PRRSV nsp7的ELISA的两曲线ROC图(two-graphROC plot)。图表利用965个(I型nsp7)个体动物血清样品和1,726个(II型nsp7)个体动物血清样品与GraphROC软件来计算。图左侧向下指向的柱状图代表未感染的动物，而图右侧向上指向的柱状图代表PRRSV-感染的动物。绿线代表截断(cutoff)S/P比率从0到2.7移动时测定的诊断敏感性。红线代表截断S/P比率从0到2.7移动时测定的诊断特异性。黑色虚垂直线代表0.51(图3A，I型)和0.52(图3B，II型)的优化的截断值，其对应于最大诊断灵敏度和特异性。

图4描绘了利用nsp7双重-ELISA对I型和II型PRRSV的区分。显示了根据计算的r值的I型和II型nsp7ELISA中具有大于截断S/P值的个体样品的分布。纵轴中显示了每个检验中与阳性血清的总数相比的血清样品的百分比。对于每个阳性样品，计算r值，r值代表通过用I型nsp7ELISA中所观察到的S/P比率除以II型nsp7ELISA中所观察到的S/P比率所得的比率的log10。因此，＞0的r值代表I型nsp7ELISA中的阳性，且＜0的r值代表II型nsp7ELISA中的阳性。

发明详述

如本文所用的，“抗体”意为天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体，及其抗原结合片段(参见，Huse等人，Science 246：1275-1281，1989；Winter和Harris，Immunol.Today 14：243-246，1993；Ward等人，Nature 341：544-546，1989；Harlow和Lane，Antibodies：A laboratory manual(抗体：实验室手册)(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1999；和Hilyard等人，Protein Engineering：Apractical approach(蛋白质工程：实践方法)(IRL Press 1992)；Borrabeck，Antibody Engineering(抗体工程)，第二版.(Oxford Univ.Press 1995))。

如本文所用的，“约”意为相当接近，或近似地，比所指的数字或量稍大或稍小。

如本文所用的，“血清”意为全血或其任何成分(fraction)，例如血浆、血小板和血浆浓缩物。

如本文所用的，“可检测的部分”或“标记”指在低浓度下通过分光镜方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法或化学方法可检测的化合物或组合物。例如，有用的标记包括，但不局限于，³²P、³⁵S、³H、¹²⁵I、荧光染料、高电子密度试剂、酶、磁性颗粒、生物素-链霉亲和素、地高辛配基、半抗原和蛋白。

如本文所用的，“诊断”或“诊断性”意为从一组标志物值，比如对PRRSV存在或不存在免疫反应，对疾病或病症的类型进行预测。

如本文所用的，“ELISA”意为酶联免疫吸附测定，包括直接ELISA和配体捕获ELISA，以及放射免疫测定(RIA)。参见美国专利第5,192,660号和第4,474,892号，以及国际专利公布WO 2008/060777、WO2007/066231、WO 2007/008966、WO 2006/009880和WO 1990/003447。

如本文所用的，“酶”意为催化特异的生物化学反应的蛋白或蛋白的有序聚集物，其中酶自身在该过程中不改变。

如本文所用的，“PCR”意为聚合酶链式反应。

两个多肽序列间的“百分比(％)序列同一性”可根据本领域中已知的方法来测定，包括，但不局限于，BLAST程序(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)，Altschul和Gish(1996)Meth Enzymol266：460-480；Altschul(1990)J Mol Biol 215：403-410))。

如本文所用的，“基本相同的”多肽序列意为仅通过保守性氨基酸置换或通过位于氨基酸序列的位点上的不破坏多肽的功能(例如，其被本文所描述的抗体识别的能力)的一个或多个非保守性置换、缺失或插入而与参照序列不同的氨基酸序列，所述氨基酸置换例如，将一种氨基酸置换为同类的另一种氨基酸(例如，缬氨酸置换为甘氨酸，精氨酸置换为赖氨酸等)。优选地，这样的序列在氨基酸水平上与用于对比的序列至少50-70％，更优选地至少70-85％，且最优选地至少85-99％基本相同。两个序列，无论是核酸序列或蛋白序列，可利用常用于进行序列比对的任何商业上可获得的计算机算法来对比。例如，为得到两个或多个序列的比对，可设定程序中的参数以使匹配的数目最大化和使缺口的数目最小化。

如本文所用的，“为表达定位”意为将编码所需蛋白或肽序列的核酸分子与指导该核酸分子的转录和翻译的序列可操作地连接。

如本文所用的，“nsp7”意为如通过其在可读框1a(ORF1a)中的位置和其鉴定为nsp7所限定的，任何猪动脉炎病毒非结构蛋白7(nsp7)，或其片段，比如可在GenBank^TM中查找到的那些序列，包括但不局限于，登录号X53459、M96262、U15146、AY588319、AY457635、Q9YN02、Q8B912、Q9WJB2、NP740601、NP066135、NC001961和U63121。全长Nsp7为近259个氨基酸且从ORF1a的翻译产物中切割。术语“nsp7”还包括纯化的蛋白或其片段，其可能被或可能未被修饰或有意地工程改造(参见美国专利第7,169,758号)。例如，nsp7肽或DNA序列中的修饰可由本领域中的技术人员利用已知的技术进行，并包括但不局限于，氨基酸改变、置换、替换、插入或缺失。优选地，这样的改变、置换、替换、插入或缺失保留了nsp7蛋白的所需抗原表位。

如本文所用的，“EU-nsp7”意为来源于1型PRRSV(即，欧洲基因型)的重组蛋白，和如本文所用的“NA-nsp7”意为来源于2型PRRSV(即，北美基因型)的重组蛋白。

如本文所用的，“肽”、“多肽”和“蛋白”包括通过肽键结合的5个或更多的氨基酸的聚合物，且包括翻译后修饰和氨基酸类似物。肽、多肽或蛋白之间不意图存在基于长度的差别。

如本文所用的，“样品”意为来源于受试者的生物材料的任何样品，比如，但不局限于，已从受试者的体内移除且含有或认为其含有受试者所产生的抗体的血液、血浆和其它液体。根据本发明的方法检验的样品可被直接地或间接地检验，并可能在检验前需要一些形式的处理。例如，血液样品在检验前可能需要一个或多个分离步骤。此外，样品可能需要添加试剂，比如缓冲液。

如本文所用的，“受试者”意为哺乳动物，包括，但不局限于，猪动物。

如本文所用的“治疗(treating/treatment)”不需要彻底治愈。其意为基础疾病(underlying disease)的症状至少被减少，和/或导致症状的一种或多种基础细胞性的、生理性的或生化性的原因或机制被减少和/或被消除。应理解地是，如本上下文中所用的，减少意为相对于疾病的状态，包括疾病的分子状态，而不仅是疾病的生理状态。

如本文所用的，“包含”、“包括”、“含有”“特征为”和其语法上等同的术语是包括型的或开放式术语，其不排除额外的、未列出的要素或方法步骤，但还包括更为限制性的术语，“由......组成”和“基本上由......组成”。

如本文和所附权利要求书中所用的，除非上下文中另外清楚指明，单数形式，例如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数。例如，提及“nsp7的表位”可包括多个这样的表位。

本发明包括试剂盒，例如，用于在生物样品中检测PRRSV的抗体的免疫测定试剂盒。本发明的试剂盒可包括：(a)捕获试剂，比如重组nsp7蛋白或其片段；和(b)检测试剂，比如与猪抗体结合的可检测的抗体或被标记的抗体(参见美国专利第7,449,296号和国际专利公布WO96/06619)。在某些实施方案中，试剂盒还包括捕获试剂的固体支持物。例如，捕获试剂可被固定在固体支持物(例如，微量滴定板)上。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于可检测的抗体的检测工具(means)(例如，比色工具、荧光工具(fluorometric means)等)。在某些实施方案中，试剂盒还包括说明书。在某些实施方案中，试剂盒还包括可针对其来测量样品的标准物。

在示例性的实施方案中，本发明的装置是检验带(test strip)。可将这样的检验带设计为仅以从应用到其上的生物样品可获得的液体为基础来操作(参见例如美国专利第5,591,645号和第4,235,601号)。可选地，可将检验带设计为与检测生物样品中抗体的存在的检测系统或显色溶液联合操作。在另一个示例性的实施方案中，可将检验带嵌入壳体或盒内。

虽然本发明是从捕获分子是nsp7或其片段的ELISA方面描述的，但是根据本公开，应理解捕获分子也可以是识别nsp7或其片段的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，伴随本公开的方法步骤的相应改变。

本研究的目的是测定对PRRSV非结构蛋白的体液免疫反应和开发用于PRRSV感染的动物的鉴定的新型工具。对PRRSV的体液免疫反应的先前研究主要集中于病毒结构蛋白尤其是核衣壳的抗体的检测。一些研究显示某些非结构蛋白，比如nsp1和nsp2是高度免疫原性的。已报道在I型和II型PRRSV菌株感染的1-4周内出现对nsp2中线性表位的抗体反应。Johnson等人观察到由nsp1和nsp2诱导的对疫苗和野外分离株(fieldisolate)的稳健且快速的交叉反应性抗体反应，和与构象性表位相关的显著较高水平的免疫反应。在本研究中，我们的数据表明nsp7也是高度免疫原性的。抗体反应的动力学分析表明对nsp7的响应与对nsp1和nsp2及商业IDEXX ELISA中所用的抗原的抗体反应具有可比性。如Johnson等人所指出的，对于在主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原呈递通路环境中向免疫系统的呈递，nsp是从感染的最早时间可获得的。由于溶细胞感染也释放蛋白到组织间隙(interstitial space)中，猜测对于非结构蛋白将产生与对结构蛋白的免疫反应等效的显著的抗体反应。对nsp抗原的抗体反应的一个值得关注的特征是在感染的202天时期中持续的抗体滴度，而对IDEXX抗原N蛋白的抗体反应在126 dpi后显示出滴度的逐渐减少。nsp抗原的持续水平的机制可能反应了nsp的长期保留和对免疫系统的呈递。

为选择用于诊断性检验开发的抗原，我们对比了PRRSV nsp ELISA和IDEXX ELISA之间的相关性。我们的结果显示基于nsp2和nsp7的ELISA与IDEXX ELISA的那些具有较高的相关性。我们还对比了nsp2和nsp7的氨基酸序列。我们先前的研究显示PRRSV nsp2区域在基因型内部和基因型之间具有高度可变性，在I型PRRSV中具有70.6％-91.6％的氨基酸同一性，且在II型PRRSV中具有74.9％-95.6％的氨基酸同一性，但在I型和II型基因型之间仅具有33.8％的同一性。nsp2的中央区域含有具有插入和缺失的高变域，且绝大多数被鉴定的B细胞表位位于这些区域中。相比之下，nsp7在每个基因型中相对保守，且在基因型之间是各异的。氨基酸序列对比显示nsp7在I型PRRSV中共有96.7％-97.4％的氨基酸同一性且在II型PRRSV中共有84.9％-100％的氨基酸同一性，但在I型和II型基因型之间仅具有约45％的同一性。这些结果表明基于nsp7的ELISA可能能够检测基因型特异的抗nsp7抗体反应。下面依次显示的是I型PRRSV nsp2的氨基酸比对和II型PRRSV nsp2的氨基酸比对。nsp2切割产物基于ORF1a多蛋白的预测的切割(Snijder等人，1995；van Dinten等人，1996；Allende等人，1999)。下划线区域显示了B细胞表位位点(ES)，在1型PRRSV nsp2中其由Oleksiewicz等人(2002)所鉴定，且在2型PRRSV nsp2中其由de Lima等人(2006)所鉴定。框内指出了用于差异ELISA的开发的表位。星号指出了缺失的氨基酸。因此，设计了作为用于1型和2型PRRSV的检测和区分的血清学诊断测定的基于nsp7的ELISA。

1型PRRSV nsp2的氨基酸比对

386 +

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1236

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2型PRRSV NSP2的氨基酸比对

384

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784

2332 nsp2 AQTTSDMMAW AVEQVDLKTW VKNYPRWTPP PPPPKVQPRK TKPVKSLPER KPVPAPRRKV GSDCGSPVSL GGDVPNSWED

NVSL-97 --A--E---- -A------A- ---------- ----R----- --S-----GN ---------- R------ILM -DN--DGR--

PA8 ---------- -A-------- ---------- --S----L-- --------K- ---------- ---------- ----------

HB1 T-A--E---- -A------A- --S------- ----R----- --S------D ---------- R-G-----LM -DN---GS--

864

2332 nsp2 LAVSSPFDLP TPPEPATPSS ELVIVSSPQC IFRPATPLSE PAPIPAPRGT VSRPVTPLSE PIPVPAPRRK FQQVKRLSSA

NVSL-97 -T-GG-L--S --S--M--L- -PALMPAL-Y -S--V-S--V L--V----R- ---------- --F-S---H- ----EEANL-

PA8 ---------- ------I--- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

HB1 -T-GG-LNF- --S-PM-PM- -P-LTPAL-R VPKLM---DG S--V----R- ----M----- --FLS---H- ----EEANP-

944

2332 nsp2 AAIPPYQDEP LDLSASSQTE YEASPPAPPQ SGGVLGVEGH EAEETLSEIS DMSGNIKPAS VSSSSSLSSV RITRPKYSAQ

NVSL-97 -TTLTH---- ---------- -----LT-L- NM-I-E-G-Q ----V----- -TLND-N--P ---------- K-----H---

PA8 -A-----N-- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

HB1 TTTLTH-N-- ---------- -----L-SS- NMSI-EAG-Q ----V----- -ILNDTS--P K--------- ----------

1024

2332 nsp2 AIIDSGGPCS GHLQEVKETC LSVMREACDA TKLDDPATQE WLSRMWDRVD MLTWRMTSVY QAICTLDGRL KFLPKMILET

NVSL-97 ---------- ---RRE--A- --I------- A--S------ ---------- --------A- --FRI----F E---------

PA8 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -V------M- ----------

HB1 ---------- ----K-K-A- --I------- S--S------ ---------- --------A- -FRTLN---F E---------

1104

2332 nsp2 PPPYPCEFVM MPHTPAPSVG AESDLTIGSV ATEDVPRILE KIENVGEMAN QGPLAFSEDK PVDDQLVNDP RISSRRPDES

NVSL-97 ---------- L---------- ---------- ---------G ----A---P- --L-TSFGEE --C--P-K-S WM---GF---

PA8 ---------- ----------- ---------- T--------- --G------- ---------- ---------- ----------

HB1 ---H--G--- L---------S ---------- ---------G --GDT -LL- ---S-PFKGG --C--PAKNS -M-P-ES---

1184

2332 nsp2 TSAPSAGTGG AGSFTDLPPS DGADADGGGP FRTVKRKAER LFDQLSRQVF DLVSHLPVFF SRLFYPGGGY SPGDWGFAAF

NVSL-97 -T-------- -DLP------ --L---EW-- L---RK---- ---------- N--------- -H--KSDS-- ----------

HB1 II--P-D--- --------S- -SV--N---- L----T--G- -L----C--- S--------- -H--XSDS-- ----------

2264

2332 nsp2 TLLCLFDCYS YPAFGIAPLL GVFSGSSRRV RMGVFGVWLA FAVGLFKPVS DPVGAACEFD SPECRNILHS FELLKPWDPV

NVSL-97 --F------- --F--FV--- ---------- ---------- ---------- ----T----- ------V--- ----------

HB1 --F------- --F--F---- ---------- ---------- ---------- ----T----- ------V--- ----------

1344

2332 nsp2 RSLVVGPVGL GLAILGRLLG SEQ ID NO：5

NVSL-97 ---------- ---------- SEQ ID NO：6

PA8 ---------- ---------- SEQ ID NO：7

HB1 ---------- ---------- SEQ ID NO：8

所选择的北美2型PRRSV分离株的nsp7氨基酸比对

共有序列#1 SLTGALAMRLNDEDLDFLTKWTDFKCFVSASNMRNAAGQFIEAAYAKALRVELAQLVQVD

11 ..................M......................................... 178

12 ..................M......................................... 178

13 ..................M......................................... 178

14 ..................M......................................... 178

15 ............................................................ 178

16 ..........T.......................................I......... 178

17 ........K.S.........L...........................I........... 178

18 ..................................................I......... 178

19 ..................M......................................... 178

20 ..........T.......................................I......... 178

共有序列#1 KVRGTLAKLEAFADTVAPQLSPGDIVVALGHTPVGSIFDLKVGSTKHTLQAIETRVLAGS

11 ............................................................ 358

12 ............................................................ 358

13 .............................R.............I................ 358

14 ....V....................................................... 358

15 ...........................................N................ 358

16 .....M...................................................... 358

17 ....V.............H........V.............I.NA............... 358

18 ...........................................G......V......... 358

19 ....V....................................................... 358

20 .....M...................................................... 358

共有序列#1 KMTVARVVDPTPTPPPAPVPIPLPPKVLENGPNAWGDEDRLNKKKRRRMEALGIYVMGGK

11 ............................................................ 538

12 ............................................................ 538

13 ............................................................ 538

14 ............................................................ 538

15 .............L..............................R............... 538

16 ............A...V..................................V..F..D.. 538

17 R...........A...V...V...........S..............K...V........ 538

18 .....................................G............TV..F..... 538

19 ............................................................ 538

20 ............A...V..................................V..F..D.. 538

共有序列#1 KYQKFWDKNSGDVFYEEVHNNTDEWECLRVGDPADFDPEKGTLCGHVTIENKAYHVYTSP

11 ............................................................ 718

12 ............................................................ 718

13 ............................................................ 718

14 .........................................................I.. 718

15 ..................................................DR........ 718

16 ...................IS........T...V.....T.IQ...I...D.V.N.F... 718

17 ...................D...A.....AD....L...R...........RP....A.. 718

18 ...................D...A......................T...D.D.K..A.. 718

19 .........................................................I.. 718

20 ...................IS........T...V.....T.IQ...I...D.V.N.F... 718

共有序列#1 SGKKFLVPVNPENGRVQWE

11 ................... 775 SEQ ID NO：9

12 ................... 775 SEQ ID NO：10

13 ................... 775 SEQ ID NO：11

14 ................... 775 SEQ ID NO：12

15 ................... 775 SEQ ID NO：13

16 ..RR....A....R.A... 775 SEQ ID NO：14

17 ..R.....AD....KA... 775 SEQ ID NO：15

18 ..........S.S..A... 775 SEQ ID NO：16

19 ................... 775 SEQ ID NO：17

20 ..RR....A....R.A... 775 SEQ ID NO：18

所选择的来自美国的1型PRRSV分离株的nsp7氨基酸比对

共有序列#1 TCCCTGACGGCTGCTCTAGCTTGCAAGTTGTCGCAGGCTGACCTTGATTTTTTGTCCAGC

1 .....A.........T................A........................... 60

3 ..T..............G.......................T.....A...........T 60

4 ....................C....................T.....C..C....T.... 60

5 ...............................................C............ 60

6 ...................................A........................ 60

7 .....A...................................................... 60

8 ..............C..............A.............................. 60

9 .................G.................A...........C............ 60

10 .........................................T.....C..C......... 60

共有序列#1 TTAACGAACTTCAAGTGCTTTGTATCTGCTTCAAACATGAAAAATGCTGCCGGCCAGTAC

1 ............................................................ 120

3 .......................G...........T...........C............ 120

4 ..G......C........G.............C.................T......... 120

5 ...........................................................T 120

6 ...............................................C..T......... 120

7 ...............................................C............ 120

8 ................................G.................T......... 120

9 .............................C.................C............ 120

10 ..G...............................................T......... 120

共有序列#1 ATTGAAGCAGCTTATGCCAAGGCCCTGCGCCAAGAGTTGGCCTCTCTAGTTCAGGTTGAC

1 ...........G..........................................A..... 180

3 ........................T..................................T 180

4 ............A....T.......................T.....G.....A...... 180

5 ...........G................................C............... 180

6 ...................G......A................................. 180

7 ............................................................ 180

8 ........................T................T..............C..T 180

9 .....G...........T.G......A.....G........T.....G...........T 180

10 .................T.......................T.....G.....A...... 180

共有序列#1 AAAATGAAAGGAATTTTGTCCAAGCTCGAGGCCTTTGCTGAAACAGCCACCCCGTCCCTT

1 ...........G................................................ 240

3 ...........G................................................ 240

4 ...T......................................................C. 240

5 ...................T.....T........................T......... 240

6 ..G........G................................................ 240

7 ...........G....A...........A.....................T.....T... 240

8 ..G.........................................C............... 240

9 ..........G...C.A........T..................G.....T......... 240

10 ............................................................ 240

共有序列#1 GACACAGGTGACGTGGTTGTTCTGCTTGGGCAACATCCTCACGGATCCATCCTCGATATT

1 ....T..........A............................................ 300

3 .....................T..........G...........G..T............ 300

4 .........................C.T................................ 300

5 ...G........................................................ 300

6 ............................................................ 300

7 .....................T.............C........................ 300

8 ..TC....................................T..T................ 300

9 ..............A........A...............G.................... 300

10 ............................................................ 300

共有序列#1 AATGTGGGGACTGAAAGGAAAACTGTGTCCGTGCAAGAGACCCGGAGCCTAGGCGGCTCC

1 ............................................................ 360

3 ..............................................A............. 360

4 .....................................................T.TT... 360

5 ................................................T....T..T... 360

6 ..................................................T......... 360

7 ........A.A................................................. 360

8 .......................C.....T.............................. 360

9 .....A.......................T..................T.......T..T 360

10 .....................................................T..T... 360

共有序列#1 AAATTCAGTGTTTGCACTGTCGTGTCCAACACACCCGTGGACGCCTTAACCGGCATCCCA

1 ..............T................................G............ 420

3 ............................................................ 420

4 ..................................................T......... 420

5 ..................................................T......... 420

6 ....................T....................T.................. 420

7 .......................T.................................... 420

8 ..............T....................T........................ 420

9 ..................................................T......... 420

10 ..................................................T......... 420

共有序列#1 CTCCAGACACCAACCCCTCTTTTTGAGAATGGTCCGCGTCATCGCGGTGAGGAAGACGAT

1 .............................................A.C............ 480

3 ....G....................................................... 480

4 .......T...GG.A.............................T..C........T... 480

5 .........................................C..T............... 480

6 .............................................A.............. 480

7 ....................................C........T.............. 480

8 .............................................A.............C 480

9 ................................C...........T..............C 480

10 .......T...GG.A.............................T..C........T... 480

共有序列#1 CTTAAAGTCGAGAGGATGAAGAAACACTGTGTGTCCCTCGGCTTCCACAACATCAATGGC

1 ..............................A............................. 540

3 ..C...........................A............................. 540

4 ........T.......A.G..............T.......................... 540

5 ....G................................................T...... 540

6 .............................................T.............. 540

7 ................AA..A.........T..............T........C..... 540

8 ..C.....................T.....A......................T.....A 540

9 ....GT..........A....................................T...... 540

10 .................................T.......................... 540

共有序列#1 AAAGTTTACTGCAAAATTTGGGACAAGTCTACCGGTGACACCTTTTACACCGATGATTCC

1 ..................................................G......... 600

3 .....C.....T..G..C.....T.............................C...... 600

4 ...........T.............................A...........C...... 600

5 ..............................C.......T.........T........... 600

6 .....A...........C.....T.................................... 600

7 ...........................................................T 600

8 .G.........T..........................T..................... 600

9 ....................C.....A..T........T..................... 600

10 ...........T.............................A...........C...... 600

共有序列#1 CGGTACACCCAAGACCATGCTTTTCAGGACAGGTCAGCCGACTACAGAGACAGGGACTAT

1 ............................................................ 660

3 .....T.....C...............................................C 660

4 ..............T.......................T..................... 660

5 ................T...A..C................................T... 660

6 .....T.........T............................................ 660

7 .............................T...........TC..........A.....C 660

8 .....T........T..............T.............................. 660

9 ................T...A..C................................T... 660

10 ..............T.......................T..................... 660

共有序列#1 GAGGGTGTGCAAACCGCCCCCCAACAGGGCTTTGATCCAAAGTCTGAAACCCCTGTTGGC

1 ...............A............A............................... 720

3 ..A......................A.................................. 720

4 ......A...G.................A............................... 720

5 .................................................A.......... 720

6 ..A......................................................... 720

7 .....C......................A....C........C..G.............. 720

8 ..A.........G....T....C.A................................... 720

9 ......................................................A..... 720

10 ......A...G.................A............................... 720

共有序列#1 ACTGTAGTGATCGGCGGTATTACGTATAACAGGTACCTGATCAAAGGTAAGGAGGTCCTG

1 .....T.............................T.....................T... 780

3 ....................C....................T.G................. 780

4 .....T.............................T......................... 780

5 .....G..............C.....................................T.. 780

6 .............................T.........................A..... 780

7 .................C........................................... 780

8 ......T...ATT.GC..G.......................................... 780

9 ..................G.......................................T.. 780

10 .....T.............................T......................... 780

共有序列#1 GTTCCCAAGCCTGACAACTGCCTTGAA

1 ..C........................ 807 SEQ ID NO：19

3 ..C....................C... 807 SEQ ID NO：20

4 ........................... 807 SEQ ID NO：21

5 ........................... 807 SEQ ID NO：22

6 ........................... 807 SEQ ID NO：23

7 ....GT.................C... 807 SEQ ID NO：24

8 .......A..C...C........A..G 807 SEQ ID NO：25

9 ........................... 807 SEQ ID NO：26

10 ........................... 807 SEQ ID NO：27

如通过ROC分析所测定的，基于nsp7的ELISA的进一步验证显示了该测定的良好的灵敏度和特异性。I型和II型nsp7ELISA两者的两曲线ROC图显示了未感染的和PRRSV感染的群体的柱状图，并展示了两个群体的最小重叠(图3)。两个群体间的重叠是由于具有已建立的截断以下的值的来自I型PRRSV感染群体的8个样品和来自II型PRRSV感染的群体的9个样品所导致的。这17个样品的进一步检查显示所有样品在ELISA板的阴性对照孔上表现出强背景，这表明血清中可能含有与第二抗体相互作用的其它非特异性成分。此外，这些样品中的8个发生溶血，表明血清收集和处理步骤没有在最优条件下完成。有四个来自阴性群体的样品在I型PRRSV ELISA上显示出阳性结果，且有三个来自阴性群体的样品在II型PRRSV ELISA上显示出阳性结果。这七个样品的IDEXX ELISA S/P值的范围从0.2到0.3。此观察可支持一些兽医对于具有大于0.20的S/P值的任何样品使用随访检验的实践。由于nsp7 ELISA能够检测抗体反应至202dpi，我们怀疑这些样品可能来自具有PRRSV感染史的畜群。

血清学是用于测定猪是否已暴露于PRRSV的标准诊断和监测方法。目前，IDEXX PRRS ELISA是用于测定猪群的血清状况的最广泛使用的血清学测定。然而，应为血清阴性的畜群中的阳性IDEXX ELISA结果导致了对于产生者的关注，其使对验证结果是阳性或阴性的多种随访测定的需要成为必需。这表明仍需要可信的测定以鉴定单一反应物与畜群反应物相比的血清学状况。虽然没有标准方案来验证PRRSV的假阳性血清学结果，但是大多数诊断实验室使用间接荧光抗体(IFA)测定和/或病毒中和测定。然而，来自这两个测定的结果受到抗原性变异的影响，且它们可能不能检测对诸如称作NAI型分离株的欧洲样PRRSV菌株的抗原性差异的PRRSV分离株的血清学反应。I型分离株在美国的出现使PRRSV的诊断复杂化，因为目前没有在PRRSV的I型和II型间清楚区分的标准血清学测定。养猪业朝向消除或消灭PRRSV的策略的前进将需要能够检测急性的和持续感染的猪、检测PRRSV的多种菌株并具有在I型PRRSV分离株和II型PRRSV分离株之间进行区分的能力的适当的血清学诊断测定。本研究中得到的结果表明PRRSV nsp7可作为用于基于ELISA的诊断测定的潜在的新型抗原。尤其是，利用除N蛋白外的不同靶标，将避免与N抗原特异性相关的任何假阳性。

总之，我们的结果显示了在PRRSV感染的过程中，nsp1、nsp2和nsp7诱导了高水平的抗体反应。在这三种蛋白中，具有以下特点的nsp7更适用于诊断开发：1)在细菌培养中nsp7作为可溶性重组蛋白被表达，其便于ELISA抗原制备，尤其是当用于处理数量庞大的诊断样品的诊断检验时；2)PRRSV nsp7蛋白编码区与其它两种免疫原性的蛋白nsp1和nsp2相比在基因型内的不同菌株中更具同源性；3)它能够在晚于126dpi时检测抗体反应。基于nsp7的ELISA显示了对于I型和II型PRRSV的鉴定和区分的良好的灵敏度和特异性。并且，nsp7双重-ELISA分辨出98％的样品具有可疑的假阳性IDEXX ELISA结果。因此，基于nsp7的ELISA可作为IDEXX ELISA的替代性检验或随访检验。

材料和方法

病毒和细胞：将MARC-145细胞培养在含10％胎牛血清(FBS)和抗生素(100单位/ml青霉素，20ug/ml链霉素)的基本伊格尔培养基(MinimalEagle′s Medium，MEM；GIBCO BRL Life Technologies)中。将细胞维持在37℃下的潮湿的5％CO₂的培养箱中。在MARC-145细胞上繁殖PRRSV菌株SD01-08(I型)和VR2332(II型)。

抗原产生：利用SD01-08(I型)和VR2332(II型)分离株来生成重组蛋白。基于EAV的研究，预测编码pp1a的PRRSV ORF1a切割为8种产物，nsp1到nsp8。nsp3和nsp5具有一些预测的非免疫原性的疏水结构域(Peptoo1)，因此不再对其考虑。预测nsp6仅含有16个氨基酸。对来自实验感染的猪的血清检验由这16种氨基酸制备的合成肽。当用于ELISA形式时，没有可检测的抗体反应。因此，仅PRRSV nsp1、nsp2、nsp4、nsp7和nsp8在本研究中被考虑了。在pET-24b载体(Novagen)中，依据预测的切割位点，来自VR2332的这些非结构蛋白区域作为重组蛋白被表达。由于nsp2因C末端疏水区域导致的低水平表达，产生了C末端截短的部分(13)。用于扩增每种非结构蛋白的引物列于表1中。将从SD01-08扩增的nsp7编码区克隆到pET-28a(+)载体(Novagen)中。表达重组蛋白并将其纯化，且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对纯化的融合蛋白进行分析。

表1.用于PRRSV ELISA抗原表达的引物

^*NA＝北美基因型(II型)；EU＝欧洲基因型(I型)；#编号对应于II型PRRSV，VR2332(GenBank登录号U87392)或I型PRRSV，SD01-08(GenBank登录号DQ489311)的基因组内的位置。限制性酶位点为粗体和斜体。

血清样品.对于I型PRRSV，使用了来自实验接种四种不同的I型PRRSV分离株，SD01-07、SD01-08、SD02-11或SD03-15(16)其中之一的32只猪的血清样品(n＝320)的套组。以7天间隔收集样品，持续至接种后天数(DPI)为85。对于II型PRRSV，从实验感染II型PRRSV菌株VR-2332的109只猪中获得了连续血清样品(n＝1014)。在开始的两周以7天间隔收集样品，且然后以14天间隔收集样品持续至接种后天数(DPI)为202。此外，从阴性对照实验猪中获得了1357个已知的PRRSV阴性样品。

将所有这些血清样品用于验证基于nsp7的ELISA，这些血清样品包括来自I型PRRSV感染动物的320个样品，来自II型PRRSV感染动物的1014个样品，和来自阴性对照动物的1357个样品。在来自II型PRRSV感染动物的1014个样品中，使用510个血清样品来测定对pp1a蛋白的血清学响应的动力学。为测定基于nsp7的ELISA区分I型和II型PRRSV的能力，对总计470个已知的阳性样品进行检验，其中含来自I型病毒感染的猪的215个样品和来自II型病毒感染的猪的255个样品。

除已知状况的样品外，利用野外样品来评估基于nsp7的ELISA，即从十个不同的州(MN、CO、SD、WI、IL、WY、IA、KY、NE和MO)的30个不同的农场自2007年到2008年收集的1,107个血清样品。还将这些样品在南达科他州动物疾病研究和诊断实验室(South Dakota AnimalDisease Research and Diagnostic Laboratory，SD ADRDL)进行测定。此外，还从SD ADRDL获得了100个IDEXX ELISA可疑的假阳性样品，并在基于nsp7的ELISA中对其进行检验。

基于PRRSV nsp抗原的ELISA.利用Immulon 2 HB 96-孔微量滴定板(Thermo Labsystems，Franklin，Mass)进行基于nsp抗原的ELISA。将由实验感染的猪生成的单批的内部质量对照血清样品用来建立以下的标准：高阳性(光密度～1.9-2.1)、低阳性(光密度～0.6-0.7)和阴性(光密度＜0.2)。实验测定重组蛋白的最优稀释从而使对照血清样品产生作为建立的标准的光密度(OD)。在15mM碳酸钠-35mM碳酸氢钠(ACB)，pH8.8中稀释重组蛋白。在1、3、5、7、9和11栏用100μl(～2ug/ml)稀释的蛋白包被平板。用作为背景对照的100μl的ACB包被2、4、6、8、10和12栏。对于基于nsp7的ELISA，利用I型PRRSV nsp7抗原(SEQ ID NO：43)包被1、4、7、10栏，利用II型PRRSV nsp7抗原包被2、5、8、11栏，并利用作为背景对照的ACB包被3、6、9、12栏。将平板在37℃下孵育1小时，且然后用含0.05％吐温20的PBS(PBST)中的10％w/v奶粉在4℃下封闭过夜。第二天，用300μl的PBST洗涤平板。用含5％牛奶(milk)的PBST 1∶50稀释检验和对照血清，并将100μl的稀释物添加到孔中。将平板在37℃下孵育1小时。然后洗涤平板，将100ul的山羊抗猪辣根过氧化物酶轭合物(KPL，Gaithersburg，MA)添加到所有孔中。将平板在37℃下孵育1小时，洗涤，且然后将100μl的ABTS过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)添加到所有孔中。观察显色直至阳性对照达到标准OD，且然后通过添加100μl的ABTS终止溶液(KPL，Gaithersburg，MA)来停止显色。通过利用由XChek软件(IDEXX Laboratories)控制的EL800酶标仪(EL800 microplate reader，BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT)在405nm处进行读数来定量显色。将原始平板数据拷贝到Excel数据表中以利用以下公式来计算样品比阳性(S/P)的比率：S/P＝(样品的OD-缓冲液的OD)/(阳性对照的OD-缓冲液的OD)。利用GraphPad InStat 3.06版(GraphPad Software，San Diego，CA)进行统计学分析。利用Pearson R相关性分析假定数据的高斯分布对平均S/P比率之间的测定相关性进行分析。

对基于nsp7的ELISA的验证：(i)截断测定、诊断灵敏度和诊断特异性。为精确评估nsp7 ELISA的诊断灵敏度和诊断特异性，利用nsp7双重-ELISA和IDEXX ELISA对来自具有已建立的PRRSV状况的个体动物的2,691个血清样品进行分析。阴性检验(非感染的)验证群体由来自阴性对照组的个体动物的样品组成。阳性检验(感染的)验证群体由来自实验感染的动物的样品组成(参照前面的“血清样品”章节)。利用GRAPHROC软件(14)(2.0版)进行受试者工作特征(Receiver OperatingCharacteristic，ROC)分析方法学评估。(ii)可重复性的测量。通过运行内部质量控制血清的相同批来评估nsp7双重ELISA的可重复性。在一个平板上的40个重复中计算板内精确度，利用一个血清在一个运行中的10个平板上来计算运行内精确度，且从至少一个血清的10次不同运行中计算运行间精确度。利用Control Chart Pro Plus软件(7.12.24版；ChemSW)计算平均值、标准偏差(sd)、变异系数的百分比(％CV)值，和Levey-Jennings控制图。(iii)反应率(r)的计算。对于每个阳性样品计算r值，r值代表通过将I型nsp7ELISA中所观察到的S/P比率除以II型nsp7ELISA中所观察到的S/P比率而获得的比率的log10。因此，＞0的r值代表I型nsp7 ELISA中的阳性，且＜0的r值代表II型nsp7 ELISA中的阳性。

免疫荧光测定(IFA)。将MARC-145细胞培养3-4天以在96孔细胞培养板(BD Biosciences，San Jose，CA)上汇合。每隔一栏用PRRSV(5×10³ 50％组织培养感染剂量/ml)感染，并将平板再孵育18-24小时。且然后每孔利用300μl 50％的(vol/vol)丙酮/甲醇来固定，在-20℃下持续20分钟，空气干燥并在-20℃下与干燥剂一起冷冻，直至使用。利用PBS将待测定的血清样品1∶20和1∶40稀释，将100μl的每种稀释转移到PRRSV感染的和未感染的MARC-145细胞的成对的孔。在37℃下将平板孵育1小时且然后用300μl的PBS洗涤三次。然后，将30μl的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗猪免疫球蛋白G(41.7ug/ml；KPL)添加到每个孔中。将平板在37℃下孵育1小时，并用PBS洗涤三次。用倒置显微镜和UV光源(Nikon Eclipse TS100)检查细胞的特异性荧光。

结果

抗原产生。在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达对应于来自II型PRRSVVR2332的nsp1、nsp2、nsp4、nsp7、nsp8，和来自I型PRRSV SD01-08的nsp7的全部或部分的DNA片段。nsp4、nsp7和nsp8以高水平表达并可以可溶形式被纯化。相比之下，重组nsp1和nsp2形成包涵体且进行蛋白再折叠步骤。利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后是考马斯蓝染色来评估重组蛋白的纯度。如图1中所示，所有的HIS加标签的重组蛋白根据其在表1中所列的预测的大小迁移。利用单克隆抗His抗体和特异的猪抗血清通过蛋白质印迹来验证每个蛋白的身份(数据未示出)。

测定抗pp1a蛋白的血清学响应的动力学。利用从实验感染II型分离株VR2332的30只猪收集的510个血清样品来进行对nsp1、2、4、7和8的血清学响应的检验。如图2中所示，nsp4与猪免疫血清产生弱反应。nsp8与nsp1、2和7相比具有较低的抗体反应，且在98dpi之后滴度下降。nsp1、nsp2和nsp7与猪免疫血清反应强烈。早在14dpi时即检测到对这些蛋白特异性的抗体，且响应持续到202dpi以后。有趣地是，在126dpi之后，对N蛋白的抗体滴度随时间推移而下降，而nsp1、nsp2和nsp7的抗体滴度仍保持相对地高。我们还对这三个抗原进行了详细对比，包括它们对早期血清转化的灵敏度和与N蛋白的关联，N蛋白是IDEXX

PRRS2XR ELISA中所用的抗原。在7dpi时，所有样品由所有抗原检测为阴性(S/P＜0.2)。在14dpi时，约65％的样品通过所有ELISA检测为血清阳性的(S/P＞0.5)；在21dpi时，无论用于检测的抗原怎样，所有样品被鉴定为阳性的(S/P＞0.5)(表2)。利用Pearson R相关性分析来评估PRRSVnsp ELISA和IDEXX ELISA之间的关联。在第一次126感染后天数期间，来自nsp2和nsp7的ELISA结果与IDEXX ELISA的结果良好相关(nsp2和IDEXX之间的R＝0.91；nsp7和IDEXX之间的R＝0.84)。相比之下，nsp1 ELISA对IDEXX ELISA的统计学相关性为0.57，其小于nsp2和nsp7的统计学相关性。

表2.由PRRSV nsp ELISA和IDEXX ELISA所检测的血清转化的对比

^aS/P＞0.5被认为是nsp ELISA的血清阳性，而S/P＞0.4被认为是IDEXX ELISA的血清阳性。

^bdpi：感染后天数。

基于nsp7的ELISA的截断测定、诊断灵敏度和诊断特异性。选择基于nsp7的ELISA作为用于1型和2型PRRSV的检测和/或区分的血清学诊断测定来进行进一步评价。评估基于nsp7的ELISA的稳健性和可重复性以测定其用于诊断应用的可能性。从I型病毒，SD01-08，和II型病毒，VR2332中制备重组的nsp7抗原。利用基于nsp7的ELISA和IDEXX ELISA对来自1,334个动物的已知阳性群体(I型和II型PRRSV感染的)的血清样品和来自已知阴性群体(PRRSV未感染的)的1,357个血清样品进行分析。将GRAPH ROC软件用于基于nsp7的ELISA的ROC分析以确定使这些测定的诊断特异性和诊断灵敏度均最大化的优化的截断。对于I型nsp7ELISA在0.51的S/P处计算使测定的效率最大的优化的截断，且对于II型nsp7 ELISA在0.52的S/P处(图3)。对于I型nsp7-ELISA，计算的诊断灵敏度为97.4％(94.4％至99.1％的95％置信区间)和对应的诊断特异性为98.3％(94.1％至98.7％的95％置信区间)，对于II型nsp7-ELISA，计算的诊断灵敏度为99.8％(99.4％至100％的95％置信区间)和对应的诊断特异性为99.3％(97.1％至99.5％的95％置信区间)。当使用由IDEXX所测定的S/P 0.4截断时，诊断灵敏度为97.4％(86％至99.9％的95％置信区间)，且IDEXX ELISA的诊断灵敏度为99.6％(97.8％至99.9％的95％置信区间)。这些结果表明基于nsp7的ELISA与IDEXX ELISA具有相当可比性。

基于nsp7的ELISA的可重复性。利用内部对照血清对比IDEXXELISA和基于nsp7的ELISA的精确度。利用先前描述的方案(9)来计算变异系数的百分比(％CV)。IDEXX ELISA板内％CV为7.1，一次运行中板间％CV为11.9，且运行间％CV为14.8。基于nsp7的ELISA表现出与IDEXX ELISA具有相似的变异性。I型nsp7ELISA板内％CV为6.5，一次运行中板间的％CV为11.9，且运行间的％CV为17.1，而II型nsp7 ELISA板内％CV为2.3，一次运行的板间％CV为5.4，且运行间％CV为9.5。这些结果表明基于nsp7的ELISA在诊断应用中具有高度可重复性。

表3.IDEXX和nsp7双重ELISA之间测定可重复性的对比

^*所列的值为高水平阳性内部对照血清的％CV

基于nsp7的ELISA用于I型和II型PRRSV的区分的应用。为确定基于nsp7的ELISA是否能够用来区分对I型和II型病毒感染的响应所产生的血清抗体，检验了总共470个已知的阳性样品。结果显示了利用I型nsp7 ELISA检验来自I型病毒感染的猪的所有样品为阳性(S/P＞0.51)，且在II型nsp7 ELISA中在来自I型PRRSV感染的动物的血清样品中没有检测到特异的抗体反应(S/P＜0.52；参见图4)。相似地，利用II型nsp7ELISA检验了来自II型病毒感染的猪的255个样品中的254个为阳性，且在I型nsp7 ELISA中仅有一个来自II型PRRSV感染的动物的样品检验为阳性。这些结果表明基于nsp7的ELISA对于鉴定基因型内的抗体反应是特异性的，并能够区分对I型和II型PRRSV感染的抗体反应。

表4.用于抗I型和II型PRRSV的抗体的检测的nsp7双重ELISA和IDEXX ELISA的灵敏度和特异性的对比

特征	IDEXX ELISA	I型nsp7 ELISA	II型nsp7 ELISA
				优化的截断(S/P)	0.4	0.51	0.52
诊断灵敏度(％)	97.4	97.4	99.8
				95％置信区间	86-99.9	94.4-99.1	99.4-100
诊断特异性(％)	99.6	98.3	99.3
				95％置信区间	97.8-99.9	94.1-98.7	97.1-99.5

基于nsp7的ELISA与IDEXX ELISA关于检测感染野外病毒的猪的对比。我们使用了提交至SD ADRDL的宽泛范围的野外血清样品(1,107个样品)来测定基于nsp7的ELISA是否能够用来检测来自感染多种遗传上不同的野外菌株的猪的血清抗体反应。因为野外血清样品的来源是未知的(猪感染I型还是II型PRRSV)，我们使用了来自I型和II型PRRSV的抗原并将该检验命名为nsp7双重ELISA。当将nsp7双重ELISA与IDEXXELISA对比时，502个IDEXX阳性样品中的490个(97.6％)被nsp7双重ELISA检验为阳性，且605个IDEXX阴性样品中的590个(97.5％)被nsp7双重ELISA检验为阴性。我们还研究了基于nsp7的ELISA在具有非预期的阳性IDEXX结果的样品中的应用。非预期的阳性结果定义为IDEXX阳性，但通过IFA检验为阴性，且没有暴露于PRRSV的证据。从SD ADRDL获得了具有可疑假阳性IDEXX ELISA结果的100个样品，且这些样品通过IFA确证为血清阴性。nsp7双重ELISA结果显示98个(98％)样品检验为阴性(表5)。

表5.利用nsp7双重ELISA对具有IDEXX ELISA非预期的阳性结果的野外血清和样品的评估

^*NA：不适用。未对于这些特异性样品进行IFA。

讨论

本研究的目的是测定对PRRSV非结构蛋白的体液免疫反应和开发用于鉴定PRRSV感染的动物的新型工具。对PRRSV的体液免疫反应的先前研究主要集中于病毒结构蛋白尤其是核衣壳的抗体的检测。一些研究显示某些非结构蛋白，比如nsp1和nsp2是高度免疫原性的。已报道在I型和II型PRRSV菌株感染的1-4周内出现对nsp2中线性表位的抗体反应。Johnson等人观察到由nsp1和nsp2诱导的对疫苗和野外分离株的稳健且快速的交叉反应性抗体反应，和与构象性表位相关的显著较高水平的免疫反应。在本研究中，我们的数据表明nsp7也是高度免疫原性的。抗体反应的动力学分析表明对nsp7的响应与对nsp1和nsp2及商业IDEXX ELISA中所用的抗原的抗体反应具有可比性。如Johnson等人所指出的，对于在主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原呈递通路环境中向免疫系统的呈递，nsp是从感染的最早时间可获得的。由于溶细胞感染也释放蛋白到组织间隙中，猜测对于非结构蛋白将产生与对结构蛋白的免疫反应等效的显著的抗体反应。对nsp抗原的抗体反应的一个值得关注的特征是在感染的202天时期中持续的抗体滴度，而对IDEXX抗原N蛋白的抗体反应在126dpi后显示出滴度的逐渐减少。nsp抗原的持续的水平的机制可能反应了nsp的长期保留和对免疫系统的呈递。

为选择用于诊断性检验开发的抗原，我们对比了PRRSV nsp ELISA和IDEXX ELISA之间的相关性。我们的结果显示基于nsp2和nsp7的ELISA与IDEXX ELISA的那些具有较高的相关性。我们还对比了nsp2和nsp7的氨基酸序列。我们先前的研究显示PRRSV nsp2区域在基因型内部和基因型之间具有高度可变性，在I型PRRSV中具有70.6％-91.6％的氨基酸同一性，且在II型PRRSV中具有74.9％-95.6％的氨基酸同一性，但在I型和II型基因型之间仅具有33.8％的同一性。nsp2的中央区域含有具有插入和缺失的高变域，且绝大多数被鉴定的B细胞表位位于这些区域中。相比之下，nsp7在每个基因型中相对保守，且在基因型之间是各异的。氨基酸序列对比显示nsp7在I型PRRSV中共有96.7％-97.4％的氨基酸同一性且在II型PRRSV中共有84.9％-100％的氨基酸同一性，但在I型和II型基因型之间仅具有约45％的同一性。这些结果表明基于nsp7的ELISA可能能够检测基因型特异的抗nsp7抗体反应。

如通过ROC分析所测定的，基于nsp7的ELISA的进一步验证显示了该测定的良好的灵敏度和特异性。I型和II型nsp7 ELISA两者的两曲线ROC图显示了未感染的和PRRSV感染的群体的柱状图，并展示了两个群体的最小重叠(图3)。两个群体间的重叠是由于具有已建立的截断以下的值的来自I型PRRSV感染群体的8个样品和来自II型PRRSV感染的群体的9个样品所导致的。这17个样品的进一步检查显示了所有样品在ELISA板的阴性对照孔上表现出强背景，这表明了血清中可能含有与第二抗体相互作用的其它非特异性成分。此外，这些样品中的8个发生溶血，表明血清收集和处理步骤没有在最优条件下完成。有四个来自阴性群体的样品在I型PRRSV ELISA上显示出阳性结果，且有三个来自阴性群体的样品在II型PRRSV ELISA上显示出阳性结果。这七个样品的IDEXX ELISA S/P值的范围从0.2到0.3。此观察可支持一些兽医对于具有大于0.20的S/P值的任何样品使用随访检验进行的实践。由于nsp7 ELISA能够检测抗体反应至202dpi，我们怀疑这些样品可能来自具有PRRSV感染史的畜群。

血清学是用于测定猪是否已暴露于PRRSV的标准诊断和监测方法。目前，IDEXX PRRS ELISA是用于测定猪群的血清状况的最广泛使用的血清学测定。然而，应为血清阴性的畜群中的阳性IDEXX ELISA结果导致了对于产生者的关注，其使对验证结果是阳性或阴性的多种随访测定的需要成为必需。这表明仍需要可信的测定以鉴定单一反应物与畜群反应物相比的血清学状况。虽然没有标准方案来验证PRRSV的假阳性血清学结果，但是大多数诊断实验室使用间接荧光抗体(IFA)测定和/或病毒中和测定。然而，来自这两个测定的结果受到抗原性变异的影响，且它们可能不能检测对诸如称作NAI型分离株的欧洲样PRRSV菌株的抗原性差异的PRRSV分离株的血清学反应。I型分离株在美国的出现使PRRSV的诊断复杂化，因为目前没有在PRRSV的I型和II型间清楚区分的标准血清学测定(7，28)。养猪业朝向消除或消灭PRRSV的策略的前进将需要能够检测急性的和持续感染的猪、检测PRRSV的多种菌株并具有在I型PRRSV分离株和II型PRRSV分离株之间进行区分的能力的适当的血清学诊断测定。本研究中得到的结果表明PRRSV nsp7可作为用于基于ELISA的诊断测定的潜在的新型抗原。尤其是，利用除N蛋白外的不同靶标，将避免与N抗原特异性相关的任何假阳性。

总之，我们的结果显示了在PRRSV感染的过程中，nsp1、nsp2和nsp7诱导了高水平的抗体反应。在这三种蛋白中，具有以下特点的nsp7更适用于诊断开发：1)在细菌培养中nsp7作为可溶性重组蛋白被表达，其便于ELISA抗原制备，尤其是当用于处理数量庞大的诊断样品的诊断检验时；2)PRRSV nsp7蛋白编码区与其它两种免疫原性的蛋白nsp1和nsp2相比在基因型内的不同菌株中更具同源性；3)它能够在晚于126dpi时检测抗体反应。基于nsp7的ELISA显示了对于I型和II型PRRSV的鉴定和区分的良好的灵敏度和特异性。并且，nsp7双重-ELISA分辨98％的具有可疑的假阳性IDEXX ELISA结果的样品。

基于这些特性，清楚地是，本公开的基于nsp7的ELISA在抗原产生方面是方便的，并且其是可信的、经济的以及高度灵敏的和特异的。因此，其被认为是用于常规诊断、流行病学调查和爆发研究的有用工具。

本发明的一方面是PRRSV非结构蛋白在血清学测定中的应用，和其区分对两种不同基因型的PRRSV的抗体反应的能力。当使用IDEXX PRRSELISA时获得非预期的阳性，或“假阳性”的血清学结果的原因被认为至少部分地归于PRRSV的核衣壳蛋白上并非PRRSV独有的表位的存在。使用可替代的靶标抗原，比如nsp7，被认为是预防、或至少避免假阳性问题的合理的解决方案。可选地，IDEXX PRRS ELISA可与基于nsp7的ELISA联合使用。

本公开的测定改进了猪的非常重要的疾病的诊断，且还对在流行病学研究中的使用具有重要价值。

先前对PRRSV的体液免疫反应的研究主要集中于结构蛋白的抗体的检测(Oleksiewicz等人，2002；Loem等人，1996；Murtaugh等人，2002；Meulenberg 1995)，尤其是核衣壳蛋白。PRRSV非结构蛋白在病毒复制中具有关键作用，且最近研究已表明，一些但非全部nsp具有高度免疫原性。已报道在I型和II型PRRSV菌株感染的1-4周内出现对nsp2中线性表位的抗体反应(de Lima等人，2006；Oleksiewicz等人，2001a，b，2002)。Johnson等人观察到由nsp1和nsp2诱导的对疫苗和野外分离株的稳健且快速的交叉反应性抗体反应，和与构象性表位相关的显著较高水平的免疫反应。本发明表明除nsp1和nsp2以外，nsp7也诱导了高水平的抗体反应。

如Johnson等人(2007)所指出的，对于在主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原呈递通路环境中向免疫系统的呈递，非结构蛋白是从感染的最早时间可获得的。由于溶细胞感染也释放病毒蛋白到组织间隙中，猜测对于非结构蛋白将产生与对结构蛋白的免疫反应等效的显著的抗体反应。在与N蛋白的对比中，在感染的较晚期阶段(126dpi之后)观察到了对N蛋白、nsp1蛋白、nsp2蛋白和nsp7蛋白的免疫反应的动力学差异。在感染的早期阶段对于nsp1、nsp2和nsp7的抗体滴度维持在相似的水平，但在感染的较晚期阶段，N蛋白的抗体水平具有显著下降。该结果表明nsp7是PRRSV存留的更佳的检测物。

本结果表明，由于以下事实，nsp7令人惊奇地非常适合在诊断检验或试剂盒中使用：

1)在细菌培养中nsp7作为可溶性重组蛋白被表达，其便于ELISA抗原制备，尤其是当用于处理数量庞大的诊断样品的诊断检验时；

2)PRRSV nsp7蛋白编码区在基因型内的不同菌株中更具同源性；和

3)利用nsp7的ELISA检测较早的抗体反应，其与IDEXX ELISA结果良好相关。

因此，根据本文所公开的发明的试剂盒可包括用于固定捕获试剂的固体支持物(例如，微量滴定板)。在优选的实施方案中，试剂盒还可包括用于检测抗体的检测工具(例如，比色工具或荧光工具，或其它适宜的工具)。试剂盒还可包括说明书，且可包括针对其来测量样品的标准物。

本发明的试剂盒可经销售或提供诊断试剂盒的机构来销售。还可在从疑似被感染的动物中获得的样品被送至诊断检验实验室的地方实施提供诊断服务的方法，且可在诊断中使用本发明的方法来测定感染的类型。

监测PRRSV阴性的或低患病率的畜群的血清状况对于养猪业是重要的。当IDEXX ELISA用作筛选工具时，来自阴性检验畜群中的样品的非预期的阳性结果可能需要另外的检验来解决这一问题。本文所描述的基于nsp7的双重ELISA对I型和II型PRRSV临床样品的鉴定和/或区分显示了良好的灵敏度和特异性。因此，基于nsp7的ELISA提供了IDEXX ELISA的可替代的检验。

nsp1、nsp2和nsp7与其它nsp相比诱导了较高的抗体反应，且早在14dpi时可被检测到，并持续202dpi以上。nsp8的抗体可在21dpi时被检测到，但保持低的滴度(图2)。基于nsp7的ELISA在抗原制备和诊断检验应用方面比基于其它nsp的ELISA表现更好(表IV)。

本文提供了利用nsp7重组蛋白作为抗原的用于抗1型和2型PRRSV的血清抗体的同时检测和区分的双重酶联免疫吸附测定(nsp7双重ELISA)。可选地，根据待获得的目标的不同，可使用单一nsp7抗原ELISA或同时使用来源于I型和II型的nsp7抗原的混合物。

总之，本公开的数据表明本文所描述的PRRS nsp7双重ELISA是基于非结构蛋白的用于PRRSV血清学的第一个差异ELISA。其在抗原产生方面是方便的，并且其是可信的、经济的以及高度灵敏的和特异性的。因此，其被认为是用于常规诊断、流行病学调查和爆发研究的潜在工具。

虽然利用全长的或接近全长的nsp7蛋白示出了本发明，但是鉴于本公开，现在应该认识到测定还可利用nsp7的片段或表位，nsp7的片段或表位可利用本领域中已知的方法产生。例如，可构建nsp7的表位区域或片段，并利用任何表达载体来表达，比如pET-28a(+)(Novagen)。相似地，可在表位或片段间添加一个或多个柔性肽接头(例如，GGGGS)以帮助展示表位或片段。可利用用本领域中已知的方法所设计的正向和反向引物来制备这样的表位或片段。引物可任选地含有一个或多个限制性位点以协助将表位或片段克隆到表达载体中。重组蛋白、表位或片段可在任何适宜的表达系统中表达以产生重组nsp7蛋白、表位或片段，所述表达系统包括，但不局限于，大肠杆菌BL21细胞、哺乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢细胞，HEK293细胞，或HELA细胞)、昆虫细胞(例如，利用杆状病毒表达载体)、酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或任何其它系统。任选地，nsp蛋白、表位或片段可含有其它特征，比如通过镍亲和色谱协助纯化的组氨酸标签。

虽然已在某些实施方案中描述了本发明，可在本公开的精神和范围内对本发明进行进一步的修改。因此本申请意在包括使用其一般原理的本发明的任何变化形式、用途、或改变形式。此外，本申请意在包括诸如属于本发明所属领域中已知的或常规的实践和落入所附权利要求书的限制的对本公开的变更。

本文所引用的所有的参考文献，包括Genbank登录号、出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，程度等同将每个参考文献独立地且特异地通过引用并入并在本文中以其整体列出，参考文献包括以下：

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Claims

1.一种检测、鉴定或定量对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的体液免疫反应的体外方法，所述方法包括：

将生物样品与来源于PRRSV的非结构蛋白7(nsp7)抗原相接触以实现所述生物样品中的抗体与所述nsp7抗原的结合；

引入用于检测所述nsp7抗原和抗体之间的复合物的存在或不存在的检测系统；和

定量地和/或定性地测定所述nsp7抗原和抗体之间的复合物的存在或不存在，其中所述复合物的存在表明对PRRSV的免疫反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述nsp7抗原来源于1型(欧洲)PRRSV。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述nsp7抗原来源于2型(北美)PRRSV。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述nsp7抗原包括1型(欧洲)PRRSV抗原和2型(北美)PRRSV抗原二者。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述nsp7抗原包括选自由SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：43或它们的组合组成的组的肽序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述nsp7抗原包括SEQ ID NO：43和来源于2型(北美)PRRSV的nsp7抗原。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述nsp7抗原包括从选自由SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18或它们的组合组成的组的肽序列获得的表位。

8.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将来自所述方法的所述nsp7抗原和抗体之间的复合物的存在或不存在与利用IDESS酶联免疫吸附测定(ELISA)分析在同样的生物样品上进行的对免疫学反应的测定相对比。

9.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述nsp7抗原和抗体之间的复合物的存在或不存在包括酶联免疫吸附测定(ELISA)的使用。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测系统包括与可检测性标记物共价或非共价连接的抗猪的抗体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可检测性标记物选自由放射性同位素、酶、荧光分子、磁性颗粒、电子不透明物质或它们的组合组成的组。

12.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括

将所述生物样品与来源于1型(欧洲)PRRSV的第一nsp7抗原和来源于2型(北美)PRRSV的第二nsp7抗原相接触；和

测定从动物中获得的所述生物样品是否具有对1型PRRSV或2型PRRSV的免疫反应。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是选自由血液、血清、血浆、眼泪、粘液和鼻分泌物组成的组的猪生物样品。

14.一种用于进行根据权利要求1所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

固体支持物；和

至少一种用于与生物样品接触的非结构蛋白7抗原性试剂。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于检测生物样品中抗体的存在的检测系统。

16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述抗原性试剂包括来源于1型(欧洲)PRRSV的非结构蛋白7，和/或其表位，和来源于2型(北美)PRRSV的nsp7抗原。

17.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述非结构蛋白7是来源于1型(欧洲)PRRSV的表位。

18.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述非结构蛋白7是来源于2型(北美)PRRSV的表位。

19.根据权利要求15所述的试剂盒，其中检测系统包括与可检测性标记物共价或非共价连接的检测抗体。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述可检测性标记物选自由放射性同位素、酶、荧光分子、磁性颗粒、电子不透明物质或它们的组合组成的组。