UA73915C2 - Пептид, який індукує утворення нейтралізуючих антитіл (варіанти), антитіло, одержане за допомогою вказаного пептиду, імуногенна композиція для індукції нейтралізуючих антитіл, вакцина для профілактики зараження репродуктивно-респіраторним синдромом свиней (ррсс) та діагностичний набір для виявлення або ідентифікації антитіл, специфічних до ізоляту вррсс - Google Patents

Abstract

Винахід належить до пептидів, що відповідають антигенним сайтам ізоляту І-1102 вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (ВРРСС) та які індукують утворення нейтралізуючих антитіл, що реагують принаймні з двома різними ізолятами ВРРСС. Вказані пептиди знаходяться в складі білків GP4 та N та кодуються відкритими рамками зчитування ORF4 і ORF7. Ідентифіковані в цих сайтах амінокислотні послідовності можуть бути включені до складу вакцин проти ВРРСС. Винахід також стосується діагностичних тестів для виявлення або ідентифікації стрівальності ВРРСС у свиней.

Description

Опис винаходу

Винахід стосується інфекційного агента, який зумовлює "таємну хворобу свиней" - тобто вірусу РРОС, 2 пептидних послідовностей, що ідентифікуються у вірусу РРОС, та включення цих послідовностей у вакцини та діагностичні тести.

Вірус РРОС (ВРРСС) є збудником хвороби свиней, яка зараз називається репродуктивно-респіраторним синдромом свиней (РРОСС). Цей вірус є агентом-збудником хвороби свиней, відомої приблизно з 1987 року в

США і з 1990 року в Європі, яка спочатку була відома під різними найменуваннями, такими як "таємна хвороба 70 свиней", безплідність свиней і респіраторний синдром, а також під численними іншими назвами. Сам по собі вірус також отримав багато назв, серед яких - вірус І еіувіай (ІМ), вірус ЗІК5 і численні інші, однак зараз найбільш вживаними найменуванням є назва "вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней" (ВРРСС).

Він зумовлює викидні та респіраторні патології у свиней; вперше його було виділено в Європі |єЄвропейський патент Мо587780, патент США Мо56206911|, а потім - також в США і багатьох інших країнах світу. ВРРСОС - 72 невеликий вірус, що має оболонку, геном якого представлений одноланцюжковим позитивним геномом РНК.

Більш прийнятний сайт росту ВРРОС - макрофаги. На доповнення до макрофагів ВРРОС може рости в клітинах лінії СІ 2621 та інших клітинних лініях, клонованих на основі лінії клітин МА-104 нирки мавп |Вепйеєїй еї аї., 1992, 9. Меї. Оіадп. Іпмеві., 4, 127-133). Геном ВРРСОС, який представлений поліаденілованою молекулою РНК завдовжки приблизно 15 тисяч нуклеотидів, було секвеновано в 1993 році |Мешепбрегао еї аї!., 1993, Мігоіоду, 192, 62-74). Нуклеотидна послідовність, організація геному і механізм реплікації показали, що ВРРОС належить до групи невеликих РНК-вірусів, що мають оболонку, з позитивним ланцюгом, позначеним як Агегімігизев. Ця група включає вірус підвищеного титру лактатдегідрогенази (10М), вірус артериту коней (ЕАМ) і вірус геморагічної пропасниці мавп (ЗНЕМ). Ці віруси характеризуються схожою організацією геному, механізмом реплікації, морфологією і амінокислотною послідовністю вірусних білків. Артери-віруси містять геном завдовжки с від 12,5 до 15 тисяч нуклеотидів і синтезують з'єднану по 3'-кінцям групу з шести субгеномних РНК в процесі Ге) реплікації. Ці субгеномні РНК включають лідерну послідовність, що є похідною від 5'-концевої ділянки вірусного геному. Кодуючі рамки ОКЕТа і ОКЕ1Ь займають приблизно 2/3 всього вірусного геному і кодують

РНК-залежну РНК-полімеразу. Шість менших кодуючих рамок (генів) - від ОКЕ2 до ОКЕ7 - локалізовані в 3-частині вірусного геному. Мабуть, гени ОКЕ2-6 кодують білки капсиду, у той час як ОКЕ7 кодує о нуклеокапсидний білок |Мешепьего еї аї., 1995, Мігоіоду, 206, 155-163). «-

ВРРСС - перший з артеривірусів, для якого було показано, що всі шість білків, які кодуються відкритими рамками від ОКЕ2 до ОКЕ?7, асоційовані безпосередньо з віріоном. При цьому білок М з молекулярною масою о 15-КД (що кодується ОКЕ?7) і інтегральний мембрани білок М 18-кД (продукт ОКЕ6) не є М-глікозилованими, у той («се час як білок ОР 5 29-30-кД (ОКЕ2), білок ОР 45-50-кКД (ОКЕЗ), білок ОР; 31-35-кКД (ОКЕ4) і білок ОР» 25-кД 3о (ОКЕ5) глікозиловані по М-сайтам. Ці білки також виявляються в позаклітинному вірусному просторі і в лізатах в клітин, інфікованих північноамериканським ізолятом ВРРОС АТС МоуУкК2332І| та іншими ізолятами ВРРОС (іншими ізолятами цього вірусу є, наприклад, СМСОМ 1-1140; ЕСАСС М93070108; СМОСМ 1-1387; СМСМ 1-1388;

АТСС У2402; АТСС МА2429; АТСС МА2430; АТС МН2431; АТСС МА2475; АТСС МВ2385, хоча відоміічисленні «Ф інші приклади). З 50 Раніше заявники описували виділення і охарактеризування панелі ВРРОС-специфічних моноклональних с антитіл, які специфічні відносно до ОР з, ОР;, М і М (Мап Міецмувіайі ек а. , 1996, у. Міго!., 70, 4767-4772).

Із» Цікаво, що моноклональні антитіла до білка зР4 були нейтралізуючими: це підтверджує те, що принаймні частина білка-мішені знаходиться на поверхні віріону. Крім того, більшість моноклональних антитіл до білка М реагували зі всіма протестованими ізолятами ВРРОС.

Сам по собі репродуктивно-респіраторний синдром є серйозною проблемою свинарства в більшості регіонів і світу. Попадання вірусу РРОС в промислове стадо свиней призводить до значних економічних втрат. Діагностика оз РРОС широко розповсюджена і практикується багатьма ветеринарами і в багатьох лабораторіях. Більшість діагностичних тест-методів, такі як ІРМА, ІЕТ, ІФА, ТІФА, кожний з яких ефективний щодо виявлення приєднаних о ферментів або флуорохромів, та інших субстратів, заснована на взаємодії між антигеном ВРРСС і антитілами до - 20 ВРРОС з метою визначення присутності або антигену ВРРСС, або антитіл до ВРРОС в конкретному біологічному зразку, такому як проби крові, сироватки, тканини, тканинної рідини, лаважної (промивальної) рідини, сечі, сл фекалій, при тому, що зразки взяті у призначеної до діагностування тварини (такої як свиня). Антиген і (або) антитіла, які використовуються в цих діагностичних тестах, або діагностичні тести чи набори для діагностики

РРОС визначаються лише своїм походженням або своєю реактивністю щодо ВРРОСС. В принципі цього 25 достатньо для здійснення скринінга, в якому не вимагається досягнення високого рівня специфічності або

ГФ) чутливості. Однак, поширення вірусу РРОС, яке постійно триває, створює велику проблему для світового свинарства в такій мірі, що визначає нагальну необхідність позбавлятися РРСС в даному стаді свиней повністю, о а ще краще - добиватися цього в цілому регіоні або країні, де розвинуте свинарство. Чітким прикладом такої необхідності є програма з викорінення РРОС, розроблена в Данії. Якщо хтось вирішить повністю покінчити з 60 РРОС, йому знадобляться більш специфічні і чутливі діагностичні тести порівняно з тими тестами, які застосовуються сьогодні.

Також широко практикується вакцинація проти РРОС. Є ряд прикладів застосування модифікованих живих вакцин, хоча і вбиті вакцини також відомі. Однак, проблема, пов'язана з живими вакцинами взагалі і з живими вакцинами проти РРОС, зокрема, пов'язана з тим, що ці вакцини мають тенденцію розповсюджуватися на бо невакцинованих тварин, через це призводячи не до скорочення, а до розширення інфекції в стаді свиней і, отже,

не дозволяючи досягнути основної мети викорінення вірусу в популяції. У випадку застосування лінії маркерної вакцини, яка могла б за серологічними параметрами бути диференційована від вірусу дикого типу, дана проблема істотною мірою б зменшувалась. Додатковими недоліками є те, що живі вакцини інколи зумовлюють анафілактичні реакції у вакцинованих свиней через вплив неідентифікованих антигенних компонентів. Окрім того, що в цілому вбиті вакцини, як підтверджувалося, спричинюють захист вакцинованої свині, є ще і додаткова перевага, пов'язана з тим, що вони не розповсюджуються від свині до свині, а недоліком вбитих вакцин є те, що ускладненим може бути накопичування достатньої антигенної маси в одній дозі вакцини, необхідній для індукції імунної відповід, що може вимірюватись і має захисну ефективність. Зокрема, вбиті вакцини, які можуть 7/0 Викликати вимірні титри нейтралізуючих антитіл у свиней, були б більш прийнятними, оскільки заміри цих нейтралізуючих антитіл в популяціях вакцинованих свиней повинні допомогти у визначенні рівня захисту, що досягається вакцинацією, яка проводиться в даному стаді свиней. Крім того, якщо вдається досягнути успіху в накопичуванні необхідної антигенної маси, це також означає, що в даній вакцині наявні маси і інших неідентифікованих антигенів, які також можуть давати анафілактичні реакції, про які говорилось вище. В цьому /5 сенсі було б більш прийнятним знати, який з специфічних сайтів ВРРОС втягнутий в процес нейтралізації, що дало змогу б формувати більш підхожі вакцини, які включають ключові амінокислотні послідовності, що індукують утворення нейтралізуючих антитіл. Позитивною характеристикою вакцин, що застосовуються нині, які основані на ізолятах ВРРОСС, виділених у США, є те, що ці вакцини, окрім забезпечення повного захисту від американського вірусу і наявності перехресної реактивності з європейськими ізолятами ВРРСС, містять доки ще неідентифіковані епітопи або антигенні сайти, за якими вони можуть бути діагностовані від європейських ізолятів ВРРОС. Таким самим чином живі вакцини, основані на ізолятах ВРРОС, виділених в Європі, окрім забезпечення повного захисту та імунологічної перехресної реактивності з північноамериканськими ізолятами

ВРРСС, містять схожі, але доки неідентифіковані епітопи або антигенні сайти, за якими вони можуть бути диференційовані при порівнянні з ізолятами ВРРОС з США. сч

Якщо будуть доступні серологічні тести, які можуть виявляти відмінності (на основі невеликих відмінностей епітопів у ізолятів ВРРОС) між особинами свиней, які були або вакциновані вакциною на основі американського і) ізоляту, або заражені європейським штамом ВРРСС дикого типу (при цьому будучи вакцинованими чи ні), або які можуть розмежувати свиней, які були або вакциновані вакциною на основі європейського ізоляту, або заражені американським штамом ВРРОС дикого типу (будучи вакцинованими чи ні), то можуть бути створені маркерні ю зо вакцини і відповідні діагностичні тести (які вносять зазначені відрізняльні епітопи або антигенні сайти), які можуть використовуватись в умовах високої довіри до них в програмах з викорінення РРОС. Наприклад, в Данії (7 може стати можливим проведення вакцинації американською вакциною з подальшим вимірюванням рівня б антитіл у датських свиней, які продукують винятково до унікальних епітопів європейського ВРРОС дикого типу і не виявляють перехресної реактивності з американськими штамами. Це повинно дозволити проводити о з5 однозначну діагностику з подальшим вилученням свиней, заражених вірусом дикого типу з датських стад. Зараз ча таке розмежування є неможливим через в цілому дуже широку перехресну реактивність між ізолятами ВРРОС.

Ясно без подальшого роз'яснення, що програми з таким поєднанням вакцинації і діагностики повинні стати основою для викорінення РРОС і також можуть бути впроваджені в інших країнах, причому, якщо це буде необхідним, з використанням відмінних антигенних сайтів ВРРСС у вакцині і (або) в діагностичному тесті. «

Цей винахід представляє антигенні сайти, які включають амінокислотні послідовності ВРРОСС, що з с забезпечують покращення вакцин, які виробляються як вбиті або послаблені вакцини, або вакцини на основі методології рекомбінантної ДНК, а також антигенні сайти, які забезпечують покращення діагностичних методів, ;» тестів і наборів для них, і розробку нових способів діагностики, тестів і наборів для них. Штучні зміни або заміни амінокислотних залишків, які зберігають антигенні властивості (що, наприклад, підтверджується реактивністю з поліклональною сироваткою або моноклональними антитілами) і, відповідно, функціональність -І антигенних сайтів, можуть бути фахівцем у галузі конструювання і синтезу білків легко здійснені відносно послідовностей, для яких відомі наявність антигенного сайта і які представляють якийсь ізолят. Наприклад, о деякі амінокислотні залишки можуть бути у рутинний спосіб замінені на схожі: наприклад, основний залишок на со інший основний, кислий - на кислий, об'ємні - на об'ємні, гідрофільні і гідрофобні - відповідно, на інші 5о Підрофільні або гідрофобні, і т. ії. Також можливі інші менш стандартні, але більш специфічні зміни, які - Зберігають або навіть покращують антигенні властивості вибраної послідовності. Такі заміни можуть сп виконуватись за допомогою методу РЕРБСАМ на основі використання методик заміщення амінокислот і замісного картування |Мап Атегопдеп еї аї., 1992, Рерііде Кез., 5, 269-274). Коротко, амінокислотні залишки в межах антигенних сай-Т1В, що представляються цим винаходом, можуть бути, наприклад, замінені у традиційний спосіб або на основі замісного картування, при тому, що отримані в результаті пептидні послідовності будуть функціонально еквівалентні даному антигенному сайту. Заміщення амінокислот також може (Ф) бути пов'язане з замінами І- або О-амінокислот. Крім того, амінокислотні послідовності, що представляються ка даним винаходом, можуть бути доведені навіть до більш високого рівня імуногенності за рахунок приєднання до них ад'ювантів (таких як КІН) , відомих у цій галузі техніки. Додатково, ці пептиди можуть бути зроблені бо навіть більш імуногенними шляхом перетворення їх на пептиди з однією (такі як тандемні пептиди) або більшим числом послідовностей, що повторюються, а також за допомогою полімеризації або циркуляризації.

Хоча раніше було показано, що білок М є імуногенним (Мешепрего, 1995, 9. Сііп. Оіадпозіз І аб. Іттипо)., 2, 652-656; британський патент Мо2-289279-А|) і що існують консервативні і неконсервативні ділянки в складі білка М при порівнянні європейських (ІМ) і американських (МК2332) штамів (МУО 96/04010), заявники в даному б5 тексті вперше показують, які з консервативних і неконсервативних ділянок є антигенними і які з них можуть використовуватись нарізно або в поєднанні одна з одною в якості антигенів для імунізації або в діагностичних тестах. Більше того, тут проводиться ідентифікація тих антигенних ділянок в складі білка М, які включають як лінійні, так і залежні від конформаційного стану епітопи.

Білок ОР. є першим структурним білком вірусу РРОС, для якого показано, що він зумовлює продукування антитіл, які здатні нейтралізовувати вірус. Було визначено специфічну ділянку, що складається приблизно з 40 амінокислот, і було встановлене, що вона розміщена на поверхні віріону, визначаючи таким чином мішень для нейтралізуючих антитіл, які потім не дають змогу цьому вірусу інфікувати клітини. Це є багатонадійною новою інформацією, оскільки в цілому вже встановлено, що білок ОРБ5, який є основним структурним білком ВРРОС, найбільш важливий білок - "кандидат", втягнутий у прикріплення до клітини-хазяїна. 70 Цей винахід представляє основний антигенний сайт-нейтралізаційний сайт білка ОР, ВРРОС. Даний винахід представляє локалізацію основного нейтралізаційного сайту, важливого для формування ефективних маркерних вакцин, які включають базову (корову) амінокислотну послідовність і амінокислотні послідовності, які фланкують базову амінокислотну послідовність, що представляють ізоляти ВРРОСС, при тому, що ці послідовності включають нейтралізаційний сайт білка, який кодується відкритою рамкою ОКЕ , ВРРСОС. За /5 рахунок внесення послідовностей відповідних нейтралізаційних сайтів в різні типи вакцин стає можливим специфічним чином індукувати продукування нейтралізуючих антитіл у вакцинованої свині. Вбиті вакцини, які включають нейтралізаційні сайти, що представляються цим винаходом, сформовані так, щоб індукувати вимірні титри нейтралізуючих антитіл. Зокрема, нейтралізаційний сайт входить до складу послідовності, локалізованої на ділянці відкритої рамки ОКНЕ4, що кодує ту ділянку білка ВРРОС, що відповідає ділянці на рівні приблизно від 40-ї до 79-ї амінокислоти в послідовності, знайденої у ізоляту І-1102 ВРРСОС. Далі, вибрані амінокислотні послідовності можуть бути зроблені навіть більш імуногенними шляхом змішування цих пептидів з ад'ювантами або іншими носіями, відомими у цій галузі техніки. Сформовані таким чином пептидні композиції використовуються в якості вакцини. Однак, також вибрані амінокислотні послідовності, які включають нейтралізаційний сайт, вносять у векторні вакциноутворюючі системи, що є відокремленими рекомбінантними с ов векторами, похідними від гетерологічних вірусів або бактерій, або відібрані амінокислотні послідовності також у селективний спосіб вносять у векторні системи на основі вірусу ВРРСС або у вакцини, зроблені на його основі. і)

В іншому аспекті даного винаходу амінокислотні послідовності, які знаходяться на ділянці, що відповідає ділянці від 52-ї до 75-ї амінокислоти, більш точно відповідають нейтралізаційному (імуногенному) сайту, що має широку реактивність. Інші варіанти нейтралізаційного сайта, які представляються цим винаходом, можуть ю зо бути виявлені у різних відомих ізолятів ВРРСС або ізолятів ВРРСС, які ще будуть знайдені (див., наприклад, експериментальну частину даного тексту). -

Простим для фахівця, який працює в галузі молекулярної біологи, є порівняння послідовностей, які Ге! включають нейтралізаційний сайт, що представляються даним винаходом, з амінокислотною послідовністю білка, що кодується відкритою рамкою ОК 4, якогось іншого ізоляту ВРРОС. ме)

Цей винахід також представляє амінокислотні послідовності ВРРОС, які покращують діагностичні тести, ї- включаючи антиген- або антитіло-детекційні тести. Даний винахід представляє різні групи антигенних сайтів, призначені для використання нарізно або в поєднанні одна з одною в діагностичних тестах. В цьому сенсі цим винаходом представляються такі діагностичні тести, які використовуються для вирішення різних завдань в польових умовах при проведенні конкретної і диференційної діагностики. Взаємодії "антиген-антитіло" завжди « відбиває перехресну реактивність взаємодії "епітоп-антидетермінанта" при тому, взаємодіючі ділянки з с амінокислотних послідовностей складаються з 5-15 амінокислот. Таким чином, амінокислотні послідовності завдовжки 5-15 амінокислот, що частково або повністю перекриваються з базовими послідовностями антигенних ;» сайтів відповідно до цього винаходу, представляються даним винаходом для внесення до діагностичних тести.

Ці амінокислотні послідовності використовуються для вибору або формування антигену або антигенної речовини, що включають ті послідовності, які використовуватимуться в тесті. З іншого боку, цим винаходом -І також представляються синтетичні антитіла, які реагують з антигенними сайтами, які представляються даним винаходом. Ці сайти або споріднені послідовності реагують з синтетичним антитілом, одержаним в таких о системах, як фатові бібліотеки або клональний відбір (важких ланцюгів) антитіл, які включають антитіло со подібні молекули, що легко можуть експресуватись в гетерологічних експресійних системах.

Одна група, що представляється цим винаходом, включає амінокислотну послідовність, яка відповідає - зазначеному нейтралізаційному сайту, що вже пояснювалося вище. Діагностичні тести, які включають цей сайт і сп (або) специфічні щодо цього сайта антитіла, виявляють нейтралізуючі антитіла у свині.

Інша група, що представляється цим винаходом, включає консервативний антигенний сайт з складу білка М.

В межах консервативного антигенного сайта даний винахід представляє базову послідовність ММОЇ СОЇ І (ЗА або

ММОСОМІ ОК. Діагностичні тести, які включають цей сайт і (або) антитіла, специфічні щодо цього сайта, виявляють ті антитіла у свиней, які специфічно реагують з більшістю ізолятів ВРРОС. Також представляються

Ф) такі діагностичні тести, котрі засновані на антитілах до консервативного сайту і націлені на виявлення ка антигену ВРРОС, що дає змогу за допомогою такого тесту ідентифікувати ізоляти ВРРОС незалежно від їх походження. 60 Інша група, що представляється цим винаходом, включає неконсервативний відмінний антигенний сайт з складу білка М. Діагностичні тести, які включають цей сайт і (або) антитіла, специфічні щодо цього сайта, виявляють ті антитіла свиней, які специфічно реагують з відмінними ізолятами ВРРСС, при тому, що, наприклад, вакциновані тварини можуть бути діагностовані в групі свиней, інфікованих вірусом дикого типу. Також представлені такі діагностичні тести, що грунтуються на використанні антитіл до неконсервативного сайту і б5 Мають виявляти антиген ВРРСС, що таким чином дозволяє застосовувати цей тест для розмежування ізолятів

ВРРСС, що розрізняються. В межах одного такого неконсервативного сайта цей винахід представляє базову послідовність РКОСОАКККК або РЕОСОАКЕККК, або РКОСОАКККК, або СОРОККМКККМ, або СРОККМКККТ, або ОРОККМАККМ, або сОРОККЕКККМ, або ОсРОККІКККМ, або сРОСОІМККІМ. В межах іншого неконсервативного сайта даний винахід представляє базову послідовність МАСКМОБОКК або МРМММОКОТЕ, або МРМММОКОРК, або МРІИММОКООК, або МРМММОКООМ, або МРМИММОКООК, або МРІМММОКООК. Також штучні зміни, які б зберігали антигенні властивості і таким чином функціональність позначених вище базових послідовностей з меж білків СР. або М, можуть бути легко внесені будь-яким фахівцем в галузі конструювання і синтезу пептидів згідно з описаним тут вище.

Також цей винахід представляє групу, яка включає конформаційні епітопи (які значною мірою варіюються при 70 порівнянні різних ізолятів), що можуть бути знайдені на ділянках, що відповідають ділянкам, які виявляються у ізоляту 1-1102 від 51-ї до 68-ї амінокислоти (базова послідовність ізоляту І-1102 РКРНЕРІ ААЕОБІКННІ) або від 79-ї до 90-ї амінокислоти (базова послідовність у ізоляту І-1102 - БІОТАЕМОСАСТ), або від 111-ї до 124-ї амінокислоти (базова послідовність у ізоляту І-1102 - НІМКІ ІКМТЗТЗАБ) у складі білка М. Представлені цим винаходом консервативні і неконсервативні, так само як диференціюючі та конформаційні сайти білка М, ті /5 сайти, які подані в цьому винаході, дають змогу представити діагностичні тести, які однозначно визначають інфекцію вірусом РРОС. Тести сформовані таким чином, щоб уникнути врахування неконсервативних сайтів, що дозволяє виключити отримання несправжньо-негативних результатів. Крім того, різні неконсервативні сайти використовуються в розробці диференціюючих тестів, за допомогою яких можна, наприклад, відрізняти вакцинованих свиней від свиней, інфікованих ізолятами ВРРСОС дикого типу. Знову ж, як вже говорилося, для фахівця в галузі молекулярної біологи простим є зіставити послідовності, які включають консервативні або неконсервативні, або конформаційні епітоп-утворюючі сайти, з амінокислотними послідовностями, які кодуються відкритою рамкою ОКЕ7 будь-якого іншого ізоляту ВРРОС. Сайти, що представляються нинішнім винаходом, використовуються в нових "парах" "вакцина/діагностичний тест", призначених для використання в програмах з викорінення вірусу РРОС. сч

Експериментальна частина

Матеріали і методи (8)

Клітини і віруси

Штам Тег Ниигпе (СМОСМ 1-1102) вірусу РРОС було виділено в 1991 році (УУепвзусогі еї аї., 1991).

Американський штам цього вірусу (АТОС МоуУкК2332) був виділений Бенфілдом з спі-вавт. (Веппеїа еї аї., 1992). ю зо Штам МІ (Голландія, 1991 рік) був виділений в лабораторії заявників, штам ММ2 (Англія, 1991 рік) був люб'язно наданий д-ром Дрю (Т. Огему), штам ОЕМ (Данія, 1992 рік) був люб'язно наданий д-ром Ботне-ром (А. --

Воїпег), штам ОХ (Люксембург, 1992 рік) був люб'язно наданий д-ром Лошем (І озсі), штами ЗРА1 і 5РА?2 б (Іспанія, 1992 рік) був люб'язно наданий, відповідно, д-рами Шокуї і Еспунья (ЗпоКоцпі 45 Езрипа),, а штам ЕКА (Франція, 1992 рік) був люб'язно наданий д-ром Лефорбаном (У. І етограп). ме)

Віруси ВРРСОС і МК2332 культивували на клітинах Сі 2621 згідно з раніше описаним (Мап Міешувзіаайі еї аї., ї- 1996). Сім різних європейських ізолятів культивували з використанням альвеолярних (легеневих) макрофагів свині. Макрофаги підтримували в культурі згідно з раніше описаним (Мепвусогїі еї аі., 1991). Клітини ВНК-21 підтримували в мінімальному середовищі Дальбеко (модифіковане середовище Ігла) з доданням 595 плодової телячої сироватки і антибіотиків. Для експериментів з трансфекції клітини ВНК-21 вирощували в мінімальному « бередовищі Глазго (ірсо-ВКІЛ/. Ме Тесппоіодієв Ца.). з с Антисироватки . В попередніх експериментах використовувались свиняча ан-тисироватка-21 до ВРРОС і антипептидна и?» сироватка кролика (698 і 700). Сироватка 700 сформована до ділянки від 106-ї до 122-ї амінокислоти (СІ ЕМАБЕМ5ЕКСЕКМІР), що кодується відкритою рамкою ОКНЕ4 вірусу ВРРСС, і була одержана від кролика.

Одержання і охарактеризування моноклональних антитіл були описані раніше (Мап Міеілиувіайді еї аї., 1996). -І Гібридоми були одержані на матеріалі п'яти послідовних експериментів із злиття клітин і були специфічними відносно до білка, що кодується геном ОКЕ4 (моноклональні антитіла 121.4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, о 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130,7, 138.28), або до білка, що кодується

Ге) геном ОКЕ7 (моноклональні антитіла 122.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2, 130.4, 131.7, 138.22, МВЕ1, МУВЕЯ4, УУВЕ5, МВЕ6, 5ООМУ1Т7). Моноклональні антитіла серії МУВЕ були люб'язно надані д-ром Дрю з Англії (Ог. Огему, - УМУеубгідде, ОК) , а моноклональне антитіло БООМУ17 було люб'язно надане д-ром Бенфілдом з США (Окг. сп Вепіївіда, Зошій ОакКоїа, ОБ).

Плазмідні конструкції

Два олігонуклеотиди, розташовані вище (РККЗМ13) і нижче (РЕКЗМ14) кодуючої рамки ОКН4, раніше в Використовувались для ампліфікації Її клонування гена ОКНЕ4 ізоляту І-1102 до складу плазміди рОЕМ-47 з використанням сайтів рестрикції Ватні і Нтаїїї, внесених до складу цих затравок |Мешепрего еї аї., 1995). (Ф) Одержану плазміду позначили рАВМ209. Два олігонуклеотиди, які відповідають аналогічним положенням ка відносно до ініціюючого кодону (РККЗМ4) і відносно до термінуючому кодону (РКК5ЗМ5) гена ОКЕ4 штаму

Ук2332 використовувались для ампліфікації ОКЕ4 штаму МК2332 за допомогою ПЛР з ревертуван-ням згідно з бо Методами, описаними в попередніх дослідженнях. Одержаний ПЛР-фрагмент обробляли рестриктазою Ватні і частково рестриктазою Нтаїйй, з урахуванням того, що ген ОКЕ4 МК2332 має внутрішній НіпапПІ-сайт, і клонували в плазміду РОЕМ-47 з одержанням в результаті плазміди, позначеної рАВМ270. Методики рекомбінантної ДНК здійснювались в основному згідно з описаним у Сембрука з співавт. |Затрьгоок еї аї!., 1989, "МоІесшаг Сіопіпа:

А І арогаюгу Мапиаї!", Соїд Зргіпд Нагбог І аб., Соїа 5ргіпд Нагрог, МУ). Нуклеотидна послідовність ОКЕ4 УК2332 65 В складі рАВМ-270, визначена за допомогою автоматичного секвенатора (Арріїей Віозувіетв), була ідентична опублікованій послідовності (Мипацди еї аї.,, 1995, Агсй. МігоЇ, 140, 1451-1460). Далі, послідовності ОКЕ4

І-1102 ії МК2332 вносили до складу експресуючого вектора роЕМ1 вірусу бетіїкі тогеві. Плазміди рАВМ209 і рАВМ270 обробляли рестриктазами Ватні і Нтаї (у випадку рАВМ270 - частково), одержані фрагменти ОКЕ4 обробляли полімеразою Кльонов (РПагтасіа) з метою одержання "тупих кінців", після чого їх лігували по

Зтаї!-сайту рзЕМ1, дефосфорилованому телячою кишковою лужною фосфатазою (РІагтасіа). Плазміди, які включають ОКА 1-1102 (рРАВМ265) і МК2332 (рАВМ271) в правильній орієнтації, потім тестували за експресією ними білка РА. Крім того, були сформовані чотири різні химерні гени ОКЕ4 1І-1102 ії МК2332. Нуклеотидна послідовність ОКЕ4, що кодує амінокислоти 1-39 білка ОР,;, МК2332, була ампліфікована з складу плазміди рАВМ270 з використанням олігонуклеотидних зондів РЕКЗМ4 і РКК5Мб. Одержаний фрагмент розщепляли /о рестриктазами Ватні і засії!. Цей фрагмент лігували до складу плазміди рАВМ209, обробленої рестриктазами

Ватні їі ЗасіІ з метою забезпечення внутрішньорамкового злиття ділянок, що кодують амінокислоти 1-39 білка

СР, МК2332 і амінокислоти 40-183 білка СР. І-1102, в складі плазміди рАВМ306. Нуклеотидна послідовність гена ОКЕ4, що кодує амінокислоти 1-75 білка (РА МК2332, була ампліфікована з використанням олігонуклеотидів РККБМА і РКК5ЗМО (див. таблиця 2). Цей фрагмент розщепляли рестриктазами Крпі І Ватні.

Нуклеотидна послідовність гена ОКЕ4, що кодує амінокислоти 80-183 білка СР, І-1102, була ампліфікована з використанням зондів РКЕК5ЗМА4 6 і РКЕКЗМ14, а ампліфікований фрагмент розщепляли рестриктазами Крпі І

Ватні. Обидва фрагменти лігували водночас в плазміду РОЕМ-47, оброблену рестриктазами Ватні і Ніпайї, в результаті одержали плазміду рАВМ308. Таким самим шляхом комплементарну конструкцію було створено в складі плазміди рАВМ314 - вона включала нуклеотидну послідовність, кодуючу амінокислоти 1-79 білка ОР, 171102, ампліфіковану з використанням зондів РККЗМ1З і РЕКЗУ57 та ліговану до складу плазміди рОЕМ-47 на фрагмент, кодуючий амінокислоти 76-178 того ж білка МК2332, який було ампліфіковано з використанням зондів

РЕКБМ10 і РККБЗМ5. Четверта химерна конструкція включала фрагмент, кодуючий амінокислоти 40-79 білка ОР;

ВРРСОС, злитий з фрагментами, кодуючими амінокислоти 1-39 і амінокислоти 76-178 білка ОР, МК2332. Це досягали літуванням ВатнНі/ЗасіІ-фрагменту гена ОКНЕ4 з складу рАВМ270 і Засп/НіпанпІ-фрагменту гена ОКН4 з сч ов складу рАВМЗ14 до складу плазміди реєМ-42, обробленої рестриктазами Ватні і Ніпаїї. Цю плазміду було позначено рАВУМ325. Плазміди рАВУЗ306б, рАВУЗ308, рАВМУЗ14 і рАВМУЗ325 протестували на точність послідовності і) шляхом олігонуклеотидного секвенування. Химерні гени ОКЕ4 були перенесені з плазмід рАВМ306, рАвВМУЗО8, рАВМЗ314 і рАВМ325 у плазміду ром! так само, як це було описано для генів ОКЕ4 МК2332 і ВРРОС: в результаті були одержані плазміди рАВу296, рАВМЗО05, рАВМЗ321 і рАВМУЗ326, відповідно (Фіг. 3). ю зо Два олігонуклеотиди, розташовані вище (г М108: 5-СбАСТО-СТТААССТООТСААСТАТООССОСТААААДАССАСАССС-3)) та нижче (ім112: т 5-ССАТТСАССТОАСТОТТТААТТААСТТОС АСССТОА-3) гена ОВБЕ7, використовувались для ампліфікації і Ге! клонування гена ОКЕ7 до складу плазміди РОЕМ-Т з одержанням плазміди рАВМ431. Послідовності і положення цих та інших олігонуклеотидів, що використовувались для ампліфікації фрагментів гена ОКЕ?7, подані в таблиці ме) 1. Крім того, чотири різні химерні конструкції були сформовані з застосуванням ПЛР-опосередковуваного ї- мутагенезу. Послідовності, які кодують амінокислоти 25-26, 28-30 (сайт В: Фіг.3) були заміщені відповідними послідовностями білка М вірусу ЕАМ. Це здійснили шляхом ПЛР-ампліфікаци гена ОКЕ7 з використанням зондів

ЇМ108 ї ІМ143 (Б-ТОСОСДАТООССАСССАСТСААТОАССТОТОССООАТОСТТТООСТОСААТОАТАААСТСС-3)).

Мутований ДНК-фрагмент був внесений в плазміду рАВМ431 з використанням рестрикційних сайтів Мвсі і Расі з « одержанням в результаті плазміди рАВУ455. Ділянка гена ОКЕ7, що кодує амінокислоти 51-67, була заміщена з с відповідною ділянкою гена ОКЕ7 вірусу ГОМ. Плазміду рАВМ431 обробляли рестриктазами ЕсоМіІ та Сіа! і . лігували на ПЛР-фрагмент, одержаний з використанням затравок мов и? (Б-ССАССААССТАОООБАООАСАООССАААААСАААААССАОССОААОСТАСАТТ ТТ СССА-ТООСТООСТССАТСТ

САС-3)) та М99 (5-ССТСТОБАТСОАТТОСААССАСАСО-САОСОТТСАСТСТОООТОАООАССТОССОБАООТСАВАТОВАССАО -І СС-3), розщеплений тими самими рестриктазами. Одержану плазміду позначили рАВМ463. Ділянку гена ОКЕ7, що кодує амінокислоти 80-90, заміщали відповідною ділянкою гена ОКЕ7 вірусу ГОМ. Ген ОКЕ ІМ було мутовано о в умовах ПЛР з затравками ГМ101 со (Б-ОСТТОСАСОСОСССОТОАСОСТТ ТТ СААТСААВОСОБАОАСАСОСОТСОСТТТОо-АТССА-3) і ГМ112.

Одержаний фрагмент розщепляли рестриктазами Маг! і Расі та лігували на плазміду рАВМ431, оброблену - рестриктазами Сіаї і Расі. Одержали плазміду рАВМ453. Нарешті, ділянку, що кодує С-кінцеву частину білка М сп (амінокислоти 111-128), заміщали на послідовність, кодуючу відповідні амінокислоти білка М вірусу ГОМ. Ген

ОКЕ7 ампліфікували з використанням затравок ГМм108 і Гм102 (Б-АТОТСССООСОСТААОСООСОБАСОААТТАССАСААОСОТТААТСАСОСОСТОТОТАССА-ЗСААССОССАС-3) дв | клонували до складу вектора рСЕМ-Т, в результаті чого була одержана плазміда рАВУ456. Мутовані гени ОКЕ7 і гени ОКЕ7 дикого типу були вирізані з плазмід рАВМ431, рАВМ453, рАВМ455 і рАВМУ463 дією рестриктаз Расі

Ф) (утворює "тупі кінці"), Нраї, з плазміди рАВМ456 - дією НраЇ та мам. Ці гени були послідовно внесені в ка дефосфорилований Зтаї!-сайт експресуючого вектора рамі вірусу Зетіїкі тогезі. Плазміди рАВМ470, рАВМ-460, рАВМ462, рАВМУ518 і рвМ471, які включають відповідні гени ОКЕ7, що знаходяться в правильній орієнтації, далі во були протестовані по експресії з них білка М. Транскрипція т мійго і трансфекція вірусної ОКЕ7-РНК зЗептіїкі

Тогеві були описані вище для конструкцій ЗЕМ-ОКЕ4.

Для клонування генів ОКЕ4 з складу геномів семи різних європейських ізолятів лінії макрофагів були інфіковані штамами МІ1, ММ2, ОЕМ, ЕКА, ЗРА1, 5РА2? і ОХ та з них виділяли РНК згідно з описаним у

Мейленберга з співавт. |Мешепрегу еї а, 1993). Гени ОКЕ4 були ампліфіковані за допомогою ПЛР з 65 ревертуванням з використанням олігонуклеотидів РКК5М13З і РЕКЗМ 14 і клоновані по Ватні- і НтаППІ-сайтам в плазміду рРОЕМ-47. Для кожного штаму нуклеотидна послідовність гена ОКЕ4 була визначена в двох клонах,

одержаних в двох незалежних ПЛР. Амінокислотні послідовності, розшифровані з цієї нуклеотидної послідовності, були зіставлені з використанням комп'ютерної програми, розробленої для багатолінійного порівняння послідовностей - СІ ЮЗТАЇ (РСобепе: ІпіеїйПдепеїйсв Тт).

Транскрипція іп міїго і трансфекція РНК 5ЕМ-ОКЕ4

Плазміди рЗЕМІ, які включають різні конструкції гена ОКЕ4, були лінеаризовані шляхом розщеплення рестриктазою 5реї і трансрибовані іп міго. Синтезованою в результаті РНК трансфікували клітини ВНК-21, що знаходяться в 15-мм лунках 24-лункових планшетів з використанням ліпофектину. Клітини фіксували охолодженою на льоду 5095-вою (об'ємні відсотки) сумішшю метанолу і ацетону, а білок СР., експресований 7/0 різними конструкціями гена ОКА, забарвлювали за допомогою моноклональних антитіл в моношаровому імунотесті з приєднанням пероксидази (ІРМА). Для аналізу продуктів експресії генів ОКЕ4 за допомогою імунопреципітації клітини ВНК-21 в кількості 1Омлн. трансфікували за допомогою електропорації 1Омкг тринскрибованої іп міго РНК ЗЕМ-ОКН4. Піддані електропорації клітини висівали на З 3З5-мм лунки б-лункового планшета і через 18 годин після трансфекції клітини помічали.

Метод РЕРБСАМ

Повний набір нонапептидів або додекапептидів, що перекриваються, синтезували, виходячи з амінокислот, похідних від послідовності ОКЕ4 або ОКЕ7 ВРРСС згідно з раніше проведеними визначеннями ІМешепрбега еї аї|., 1993). Синтез пептидів в твердій фазі на поліетиленових шариках і імунний скринінг за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (метод ТІФА) були проведені згідно з встановленими процедурами 2о методу РЕРЗСАМ (Сеузеп еї аї., 1984, РМАБ, 81, 3998-4002).

Результати

Раніше заявники описали панель нейтралізуючих моноклональних антитіл, які реагували з білком 31-35-кКД

ВРРСС, позначеним як СРА, а також панель моноклональних антитіл, реактивних щодо білка М при проведенні аналізу методом Вестерн-блотинга. Для ОРА було показане, що він є глікопротеїном, що кодується геном ОКН4, сч в білок М є нуклеокапсидним білком, який кодується геном ОКЕ7. В експериментах з імунопреципіта-ци з використанням моноклональних антитіл, специфічних для ОР у, білок ОР4, похідний від лізатів клітин, (8) заражених ВРРСОС, переміщався у вигляді окремого бенда, що відповідає молекулярній масі 28кД разом із слабим розмитим бендом, який відповідає більш високій молекулярній масі. Моноклональні антитіла осаджували дифузний (глікозилований) білок ЗР, з молекулярною масою близько ЗікД з позаклітинного середовища ю зо ВРРСОС-інфікованих клітин, але не з позаклітинного середовища несправжньо-інфікованих клітин.

Ідентифікація нейтралізуючого домену в складі СОР --

Раніше було продемонстровано, що моноклональні антитіла, специфічні відносно до білка ОР, розпізнають Ге!

І-1102, але не американський ізолят МК2332 |Мап Міецмузіайі еї аЇ., 1996). З метою ідентифікації домену в складі білка ОР, який зв'язує нейтралізуючі моноклональні антитіла, заявники сформували злиті білки СР. у ме) з5 171102 та Мк2332. Ці білки були експресовані у вірусній експресійній системі ЗетіїКі Тогеві, розробленій ча

Лільєстрьомом з співавт. (І ПШевігот еї аї!., 1991, ВіоФесппоіоду, 9, 1356-1362). По-перше, ген ОКНЕ4 1І-1102 було клоновано до складу рОЕМІ з одержанням в результаті плазміди рАВМ265 (Фіг.1). РНК, транскрибована з рАВМ265, використовувалась для трансфекци клітин ВНК-21, а через 24 години трансфіковані клітини виявляли позитивне забарвлення при використанні панелі з 15 нейтралізуючих моноклональних антитіл. Ці моноклональні « антитіла не реагували з клітинами ВНК-21, трансфікованими конструкцією рЗЕМІ-РНК. Рекомбінантний білок ОР; з с імунопреципітували з використанням моноклонального антитіла 126.1 з помічених І1-| 581|-метіоніном клітин ц ВНК-21, трансфікованих РНК рАВМ265. Він мав схожий розмір порівняно з цим ОР, синтезованим в клітинах и"? С12621, інфікованих штамом 1І-1102, і характеризувався приєднанням М-гліканів, чутливих до дії РюсСавгеє і

ЕпдонН. Білок ОР, МК2332 також був клонований в роЕМІ, однак цей білок не розпізнався моноклональними антитілами при його експресії в клітинах ВНК-21 (Фіг.1). Для подальшого картування ділянки білка СР. у, -І взаємодіючої з моноклональними антитілами, на основі рЗЕМІ були сконструйовані чотири химерні гени ОКЕ4

І-11022 та МК2332 (Фіг.1). РНК, транскрибовані з плазмід рАВу296, рАВМЗ305, рАВМЗ321 і рРАВУЗ326, трансфікували о з клітинами ВНК-21 з подальшим тестуванням реактивності білків, що експресуються, відносно до (Се) ОР./-специфічних моноклональних антитіл із застосуванням тесту ІРМА. Параметри відповіді цих 15 цу 5 моноклональних антитіл були ідентичними: Це показало, що дані моноклональні антитіла спрямовані на 40-пептидну ділянку, в складі білка ОР. Продукт експресії плазміди рАВМ326, який включає амінокислоти 40-79, сл похідні від білка ОР, ізоляту СМОСМ 1-1102, оточені послідовностями, похідними від білка ОР , МК2332, чітко розпізнавався даною панеллю моноклональних антитіл. Для підтвердження того, що різні білки СР /, особливо ті, які не розпізнавались раніше цими моноклональними антитілами, дійсно були експресовані клітинами ВНК-21,

Вони були імунопреципіто-вані з лізатів клітин ВНК-21, які перед цим трансфікували РНК, транскрибували іп міго з плазмід рАВМ265, рАВМ271, рАВМ296, рАВМЗ3О5, рАВМУЗ321 і рАВУЗ326. Імунопреципітацію здійснювали з

Ф, використанням свинячої анти-ВРРОС антисироватки 21 (моноклональне антитіло 126.1) і антипептидних ко сироваток 698 і 700. Сироватка 700 сформована до амінокислот 106-122 білка ОР, ВРРСОС ізоляту СМСМ 1-1102: ця послідовність ідентична послідовності білка ОР; ізоляту АТС МК2332, за винятком 121-ї амінокислоти. Таким бо чином, з використанням сироватки 700 імунопреципітували всі білки СР. Вони не розрізнялись за розміром при аналізі методом електрофорезу в 5ЮО5-ПААГ, за винятком того, що білки СР, що експресуються плазмідами рАВМЗО5 і рАВМ271, мали дещо більшу рухливість. Найбільш ймовірно це зумовлене тим, що в послідовності білка МК2332 є ділеція 4 амінокислот порівняно з послідовністю І-1102 на його ділянці 62-64-ї амінокислот (Фіг.3). Повний набір СР,-специфічних моноклональних антитіл розпізнавав білки СР, які експресуються з 65 плазмід рАВМ265, рАВМ296, рАВМ321, рАВМЗ326б, але не ті, що експресувались з рАВУЗО5 і рАВМ271 - це підтверджує висновки тесту ІРМА (Фіг.3). Сироватка 698 виявила той самий профіль реагування, що і панель моноклональних антитіл. Сироватка 698 сформована до амінокислот 62-77 білка ОР; ВРРСС, які знаходяться в межах ідентифікованого тут нейтралізаційного домену білка ОР.;. Ця ділянка виявляється значною мірою гетерогенною в складі гена ОКЕ4 УК2332 і, отже, продукти експреси, які включають послідовність цієї ділянки

Ук2332, не розпізнаються даною сироваткою. Однак, нейтралізуючі поліклональні свинячі сироватки розпізнають білок ОР. І-1102 та химерні білки ОР,, а також білок ОР. МК2332: це вказує на те, що в складі свинячих антисироваток до ВРРСС є ряд нейтралізуючих антитіл, які специфічні відносно до нейтралізаційного сайту, що утворюється амінокислотами 40-79 в складі білка ОР.

РЕРЗСАМ білків, які кодуються ОКНЕ4 і ОКЕ7 70 Оскільки п'ятнадцять моноклональних антитіл, реактивних відносно до продукту гена ОКНЕ4, реагують з білком ОР. в аналізі методом Вестерн-блотинга, вони, як припускають, повинні розпізнати лінійний епітоп на ділянці амінокислот 40-79 послідовності СР ; у ізоляту І-1102. Для подальшого картування ділянки, що зв'язує моноклональні антитіла, здійснили аналіз методом РЕРЗСАМ, в якому використовували 9-вимірні або 10-вимірні полінуклеотиди, що перекриваються, для цієї ділянки. Як припускають, пептиди представляють антигенні сайти 7/5 Тоді, коли піки в даному наборі відтворювано не менше ніж вдвічі за величиною переважають фоновий рівень.

Моноклональні антитіла 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7 і 138-28 виявляють позитивну реактивність відносно до одного антигенного сайту, що складається з амінокислот 59-67 (ЗААОЕКІЗЕ) (Фіг.2). Моноклональне антитіло 122-12 лише слабко реагує з цим самим антигенним сайтом, у той час як інші 7 моноклональних антитіл в аналізі методом РЕРЗСАМ були негативними. В аналізі РЕРЗСАМ той самий антигенний сайт ідентифікується поліклональною свинячою сироваткою. Нейтралізуюча сироватка 21, взята на 6-у тижні після зараження свині-21 вірусом ВРРОСС, виявляла жорстку реактивність при широкій специфічності щодо антигенного сайту і фланкуючих його ділянок послідовності. Крім того, нейтралізуюча поліклональна свиняча сироватка (ма12 і ма14), взята на 54-й день після вакцинації з використанням вірусного вектора РКЕМ-ОКН4, а також при забої, здійсненому на 30-й день після повторної вакцинації, проведеної на 54-й день після першої вакцинації, жорстко сч ов реагувала при більш широкій специфічності порівняно з розміром нейтралізаційного антигенного сайта, раніше визначеного за допомогою методу РЕРБСАМ. (8)

У ізоляту І-1102 базова послідовність нейтралізаційного сайта включає амінокислотну послідовність

ЗААОЕКІЗЕ, що знаходиться в положеннях 59-67. У інших ізолятів базова послідовність може бути знайдена в такій же амінокислотній ділянці або по сусідству з нею, що знаходиться в складі амінокислотної послідовності, ю зо що відповідає нейтралізаційному сайту білка ОР4, включаючи, наприклад, такі послідовності, як ЗААОЕЕЇІЗЕ або

ЗТАОЕМІЗЕ, або ЗТАОЕМІРЕ, або ЗЕЕБО5МТ, або ЗАБЕАІР, або ЗАБЗЕАРЕРЕ, або РАРЕАЕРЕ, або РАРЕАІБ, або -/ї"7

ЗАРЕТЕК, або ЗТЗЕАРКК, але при цьому слід очікувати, що інші ізоляти ВРРОС мають відповідні, але при цьому Ге! дещо відмінні базові послідовності нейтралізаційного сайта, розташовані в самій ділянці амінокислот 59-67 або поруч з нею в складі амінокислотної послідовності, яка кодується геном ОКНЕ4 вірусу ВРРСОС ізоляту 1-1102. ме)

Також штучні зміни, які зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначених вище ї- базових послідовностей, можуть бути легко виконані фахівцем у галузі конструювання і синтезу пептидів. З урахуванням того, що в тесті РЕРЗСАМ було чітко продемонстровано більш широку реактивність нейтралізуючої поліклональної сироватки, амінокислотні послідовності, які включають амінокислотні базові послідовності і амінокислотні послідовності, які фланкують базові послідовності, різних ізолятів ВРРОС додатково « представляють нейтралізаційний антигенний сайт білка ОМКЕ4 вірусу ВРРОС. Зокрема, послідовності, які в с знаходяться в положеннях, що відповідають амінокислотам 40-79, також представляють нейтралізаційний сайт (Фіг.1). Знову ж, штучні зміни, які зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначених ;» вище антигенних сайтів, можуть бути легко виконані фахівцем у галузі конструювання і синтезу пептидів.

Враховуючи широку реактивність поліклональних нейтралізуючих сироваток ма12 і ма14 (Фіг.2), амінокислотні послідовності в положеннях, що відповідають амінокислотам 52-75, більш конкретно представляють широко -І реактивний нейтралізаційний сайт.

Моноклональні антитіла до білка ОКЕ7, реагували в чотирьох різних групах в методі РЕРЗСАМ - групи А(4), о В(2), С(3) ії (1). Група 1(0) (до якої, окрім інших, входять моноклональні антитіла 122.17, 130.3, 130.4,

Ге) 131.7, МУВЕ1, МУВЕ4, М/ВЕб, ЗООМУ17, і включаючи консервативні і неконсервативні реактивні сайти) реагувала з конформаційним епітопом, що не виявляється при РЕРЗСАМ. Група 2(В) (до якої, окрім інших, входять - моноклональні антитіла 125.1, 126.9, М5БО5 і М5БОО; що реагує зі всіма тестованими ізолятами ВРРОС, сп визначаючи таким чином консервативний антигенний сайт) вказує на базову послідовність ММОІ СО БА (що виявляється у ізоляту І-1102 в амінокислотних положеннях 22-32) або ММОІ СОМІ ОК. Група З(С) (до якої, окрім інших, входить моноклональне антитіло 126.15; яка в основному реактивна відносно до європейських ізолятів

ВРРОС, що таким чином визначає диференціюючий антигенний сайт) вказує на базову послідовність

РКОСОАКККК (знайдену у ізоляту І-1102 в амінокислотних положеннях 41-50) або РКЕОСОАКККК, або (Ф, РКОСОАКККК, або ОРОККМКККМ, або ОРОККМКККТ, або ОРОККМАКККМ, або ОРОККЕКККМ, або ка СРОККІКККМ, або СОРСООІМККІМ. Група (А) (до якої, окрім інших, входить моноклональне антитіло 138.22; яка в основному реагує зі штамами ВРРОСС, виділеними в Європі, що таким чином визначає диференціюючий бр антигенний сайт) вказує на базову послідовність МАСКМОЗОКК (знайдену у ізоляту І-1102 в амінокислотних положеннях 1-10) або МРМММОКОТЕ, або МРМММОКОРК, або МРМММОКООК, або МРМММОКООМ, або

МРМММОКООК, або МРМММОКООК. Також штучні зміни, що зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначених вище антигенних сайтів в складі білка М, можуть легко виконуватись фахівцем у галузі конструювання і синтезу пептидів. Хоча група 71 не представляє лінійні епітопи, порівняння 65 амінокислотних послідовностей ВРРСС і амінокислотних послідовностей вірусу ГОМ показує, що конформаційні епітопи (які на значному рівні варіюються у різних ізолятів) можуть бути виявлені в положеннях, які відповідають тим, що були знайдені у ізоляту І-1102 в амінокислотних положеннях 51-68 (амінокислотна послідовність ізоляту І-1102 РКРНЕРІ ААЕООІКННІ) або 79-90 (амінокислотна послідовність ізоляту І-1102 -

ЗБІОТАЕРМОСАСТ), або 111-124 (амінокислотна послідовність ізоляту І-1102 НТУМАКГІКМТЗТ5А5Б). Також штучні зміни, які зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначеного вище конформаційного епітопа в складі білка М, можуть легко виконуватись фахівцем в галузі конструювання та синтезу пептидів, особливо тим, який має інформацію, одержану при порівнянні послідовностей ізолятів ВРРСС і при порівнянні послідовностей білка М з такими у інших артеривірусів. Це було визначено в аналізі химерних по І! ОМ/ВРРОС білків ОКЕ7, що експресуються, в експресійній системі 5ЕМ (сформованій так само, як це було вище описане для 7/0 Гена ОКР4) з визначенням їх реактивності з моноклональними антитілами групи 1.

Химерні білки М

Далі домен О було картовано з використанням конструкцій, які включають ген ОКЕ7 і експресують химерні білки М. Оскільки б з десяті моноклональних антитіл до домену ОО розпізнавали і європейські, і північноамериканські ізоляти ВРРСОС, ділянки, які є найбільш консервативними для білка М вірусу ІМ і 7/5 Північноамериканського прототипу МУК2332 (Фіг.4), були мутовані. Нуклеотидні послідовності, кодуючі амінокислоти 51-67, 80-90 і 111-128, замінили на послідовності, які кодують відповідні амінокислоти того ж білка ГОМ (Фіг.4). Для закінченості також мутували сайт В (амінокислоти 25-30), який також є консервативним у європейських і північноамериканських ізолятів. Оскільки амінокислотна послідовність білка М вірусу ЇМ була по сайту В дуже схожою з такою у білка вірусу І ОМ, цю ділянку білка М вірусу ІМ було заміщено ділянкою, що кодує 2о Відповідні амінокислоти білка М вірусу ЕАМ (Фіг.4). Коли мутовані білки М і білки М дикого типу були експресовані в клітинах ВНК-21 з використанням вірусної експресійної системи Зетіїкі Тогеві, здійснювали їх тестування з використанням специфічних щодо білка М моноклональних антитіл в тесті ІРМА: в результаті

О-специфічні моноклональні антитіла реагували ідентично (таблиця 1). Їх зв'язування порушувалося мутаціями на амінокислотних ділянках 51-67 і 80-90, але не мутаціями амінокислотних ділянок 111-128 або 25-30 (сайт В). сч ов Як ї очікувалося, білки М, що несуть на ділянках амінокислот 51-67 і 80-90 послідовності вірусу ГОМ, забарвлювались моноклональними антитілами, що представляли групи А, В і С. Однак, число клітин, що (8) забарвлювалися, а також яскравість цього забарвлення були меншими порівняно з тими, що спостерігалися при тестуванні білка М дикого типу і білків М, мутованих по амінокислотній ділянці 25-30 (сайт В) або амінокислотній ділянці 111-128 (таблиця 1). Найбільш імовірним поясненням цього є низький рівень експресії ю зо білків М, що включають мутації на амінокислотних ділянках 51-67 або 80-90, оскільки низький вихід цих мутантних білків М порівняно з іншими білками М також спостерігався тоді, коли рівні кількості транскриптів -- були трансльовані в моделі іп міо (дані не наведені). Як і очікувалося, білок М, що включає послідовності Ге! вірусу ЕАМ в сайті В, не розпізнавався моноклокальними антитілами, картованими для сайта В у аналізі методом

РЕРЗСАМ, але розпізнавались моноклональними антитілами, які були картовані по сайтам А і С або домену 0. ме)

Ці дані вказують на те, що епітопи, картовані в домені О, є конформаційно-залежними і включають (частково) ї- амінокислоти 51-67 і 80-90.

Сєквенування білка ОРА у рхзних штамів ВРРСОС

З метою аналізу того, чи є основний нейтралізаційний антигенний сайт, що розпізнається СР /-специфічними антитілами, консервативним у різних ізолятів ВРРОС, далі досліджувалась реактивність і нейтралізуюча « активність моноклональних антитіл на матеріалі семи європейських штамів цього вірусу. Одержані результати св) с показали, що ці моноклональні антитіла розпізнавали і нейтралізовували інший голландський штам МІ і британський штам МУ, але не датський ізолят ОЕМ, два іспанські ізоляти РА і 5РА2, французький ізолят ЕКА і з люксембурзький ізолят Г ШХ. Отже, було виявлено зацікавленість до амінокислотної послідовності ділянки, що є нейтралізаційним сайтом білка ОР, у цих ізолятів.

Гени ОКНЕ4 клонували за допомогою ПЛР з ревертуванням з використанням затравок, сформованих на основі -І послідовностей ВРРОС, з подальшим секвенуванням нуклеотидної послідовності. Амінокислотні послідовності білка ОР, різних ізолятів, розшифровані по цим нуклеотидним послідовностям, були на 86-9790 ідентичні такій о послідовності ізоляту І-1102. Зіставлення цих амінокислотних послідовностей показало, що нейтралізаційний

Ге) сайт (амінокислоти 40-79) відрізняється більшою мірою, ніж решта частина цього білка. В цій ділянці найбільший рівень відмінностей амінокислотних послідовностей характерний для штамів САМ, ЗРА1, РА? і - ЕКА. Це відповідає виявленню того, що ці штами не нейтралізуються специфічними щодо штаму 1-1102 с моноклональними антитілами, і додатково підтверджує те, що цей сайт не є висококонсервативним у різних європейських ізолятів. Інша ділянка, що характеризується високим рівнем гетерогенності, була виявлена в

М-кінцевій частині білка ОР. Порівняння амінокислотної послідовності білка СОР ; ВРРСС і того ж білка штаму дв о МК2332 та інших північноамериканських ізолятів показує, що останні також значною мірою гетерогенні за параметрами нейтралізаційного сайта даного білка. Зіставлення амінокислотних послідовностей дозволяє

Ф) внести розрив у складі нейтралізаційного сайта у північноамериканських ізолятів (Фіг.3), який погоджується з ка виявленням того, що жоден з цих ізолятів не розпізнається моноклональними антитілами, що використовувались. В цілому, більш висока гетерогенність відзначалась серед послідовностей американських бо ізолятів вірусу порівняно з послідовностями європейських ізолятів.

Це погоджується з параметрами, характерними для вірусної оболонки, які ідентифікуються, наприклад, для амінокислотних послідовностей білка ОР.

Потенціал нейтралізаційного сайта з точки зору розробки вакцин має важливе значення у зв'язку з гетерогенністю структури нейтралізаційного сайта. Порівняння амінокислотних послідовностей білків ОР /, які 65 представляють різні європейські штами, показало, що нейтралізаційний сайт був більш гетерогенним, ніж інші ділянки даного білка: це підтверджує те, що цей сайт може використовуватись в імунологічному відборі.

Порівняння послідовностей нейтралізаційного сайта у європейських і північноамериканських штамів ВРРСС дозволило ідентифікувати розрив в 4 амінокислоти в послідовності північноамериканського походження порівняно з європейськими штамами, що додатково ілюструє значну амінокислотну гетерогенність ідентифікованого в даному винаході нейтралізаційного сайта ВРРСОС.

Нейтралізаційний сайт білка ОР.,, описаний в цьому винаході, є вперше ідентифікованим сайтом у вірусу

Ї еїзузіад. Для двох інших артеривірусів - ЕАМ і ГОМ - всі раніше виділені нейтралізуючі моноклональні антитіла були специфічними щодо білка 54//РЗ, що кодується геном ОКЕ5 |Оегеді еї аї., 1994; СІазег еї аї., 1995;

Ваїазигіуа еї а!., 1995; Напу 8: Ріддетапп, 1988). З використанням позбавлених нейтралізаційного сайта мутантів 7/0 нейтралізаційний сайт картували на амінокислотній ділянці зовнішнього домену білка б.

Аналогічні порівняння послідовностей були проведені по білюу ОКЕ7 ВРРСОС (Фіг.4) з метою подальшої демонстрації значного рівня амінокислотної змінності ідентифікованого тут консервативного по антигенним властивостям сайта і неконсер-вативних сайтів ВРРОС. В проведених дослідженнях заявники ідентифікували чотири різні антигенні сайти в складі білка М ВРРСОС. Три сайти, позначені А, В і С, включали лінійні епітопи, які були картовані по амінокислотним ділянкам 2-12, 25-30 і 40-46, відповідно. З іншого боку, четвертий сайт, позначений як "домен О", включає конформаційно-залежні епітопи, які (частково) включають амінокислоти 51-67 і 80-90, Сайти А і С включають епітопи, які консервативні у європейських ізолятів, але не консервативні у північноамериканських ізолятів ВРРОСС, сайт В включає епітопи, які є консервативними і у європейських, і північноамериканських ізолятів ВРРСС, в той час як сайт О включає як консервативні, так і неконсервативні для європейських і північноамериканських ізолятів ВРРОС епітопи. Описані тут консервативні сайти в складі білка М мають велике значення з точки зору розробки діагностичних тестів, необхідних для однозначної ідентифікації інфекцій вірусу ВРРСС, при тому, що ці тести повинні забезпечити виключення з використання неконсервативних сайтів, щоб у такий спосіб уникати несправжньо-негативних оцінок в цих тестах. Крім того, інформація про різні неконсервативні антигенні сайти має особливо важливе значення для розвитку ідентифікаційних тестів, за сч допомогою яких можна, наприклад, відрізняти вакцинованих свиней від свиней, заражених ізолятами вірусу

ВРРСС дикого типу. (8)

Фігура 1. Схематичне зображення білків С, які експресуються в системі роєм, та їх реактивність відносно

СР ,-специфічних моноклональних антитіл. Позначено індекси плазмід, що несуть різні гени ОКЕ4. Незабарвлені сегменти представляють амінокислотні послідовності, похідні від білка б, що кодується геном ОКНЕ4 вірусу ю зо ВРРСС; закрашені сегменти представляють амінокислотні послідовності, похідні від білка б, що кодується геном

ОМКР4 штаму МК2332. Нумерація амінокислот проставлена над сегментами. Гени спочатку були внесені в -- плазміду РОЕМ-47 і потім перенесені в експресійну систему рЗЕМ1, яку докладно описано в розділі "Матеріали і Ге! методи". Повний набір СР.,-специфічних моноклональних антитіл, які ідентично реагували з різними конструкціями в тесті ІРМА, і рівні реактивності позначені як позитивні (к) та негативні (-). ме)

Фігура 2. Аналіз методом РЕРЗСАМ ОР,-специфічних моноклональних антитіл і поліклональних сироваток з ї- використанням 12-вимірних пептидів, що перекриваються, які покривають амінокислотні залишки 25-94 білка

ОР,. Показане сканування моноклонального антитіла 130.7 і моноклонального антитіла 138.28, що розпізнають чотири послідовних пептиду (Фіг.2А). П'ять інших моноклональних антитіл (122.29, 122.30, 122.66, 122.71 і 138.28) виявляли схожі параметри специфічності. Показані сканування поліклональних сироваток, взятих у двох « особин свиней до імунізації (ма12-0 і ма14-0), після імунізаци вектором на основі вірусу несправжнього сказу, з с експре-суючого ОКН4 (ма12-54 і ма14-54), і після вторинного введення вірусу ВРРОС (ма12-8іІ і ма14-вІ) (Фіг2А і 28), а також показане (Фіг.20)) сканування полівалентної свинячий сироватки 21 до вірусу ЇМ (ма21). ;» Амінокислотна послідовність реактивних пептидів показана так, що базу загальних амінокислот обведено.

Фігура 3. Зіставлення амінокислотних послідовностей білків ОР у (А) і М (В) різних штамів ВРРОС. Показані тільки ті амінокислоти, які відрізняються від послідовності штаму І-1102. Підкреслені базові амінокислотні -І послідовності, що розпізнаються моноклональними антитілами і (або) поліклональними сироватками в аналізі методом РЕРЗСАМ. о Фігура 4. Локалізація антигенних зв'язувальних сайтів в послідовності білка М і порівняння амінокислотних

Ге) послідовностей білка М у північноамериканського штаму МК2332 і вірусу ГОМ. Антигенні сайти А, В і С та домен

О затінені. Сайти А, В та С були ідентифіковані методом РЕРЗСАМ, у той час як сайт О ідентифікували шляхом - конструювання химерних білків М. Амінокислотні послідовності ЇМ, які були заміщені відповідними сп амінокислотними послідовностями ГОМ з метою картування домену 0, підкреслені. Амінокислоти білка М вірусу

ЕАМ, що були внесені на ділянці амінокислот 25-30 з метою мутування сайта В, показані під послідовністю І ОМ.

Ідентичні амінокислоти з'єднані вертикальними лініями. о експресуються вірусом зЗетіїкі тогеві в клітинах ВНК-21, в тесті ІРМА во Ав 16111161 вет 0

РАвуєв: юю вАВУВІЄ віт ню

Мй вва юю 001 генів ОКНА вірусів ЇМ і МК2332 та химерних генів ОКНЕ4 в плазмідні вектори рОЕМ-47 і рзЕМ1

В пИВОДАТІ СИ ССАГГІНОК В Вин тУМ У КОЛАССЯЯ СЕТ аСОаАТО я ля ту УОСССТСООТИСОССТСАОТАСАТ У жені то г ; ФАТИТАЄТЬАО о еСОлОСОВ У

ТО встея ей Кри п 75 ТАвБУїО ОТ ИСОСЄТОТОЇ ТОТТАССА с КІ сайтів або послідовностей, що виступають, або для вилучення довгих повторів одного й того самого нуклеотиду. Рестрикційні сайти в затравках показані курсивом.

Claims (22)

Формула винаходу

1.Пептид, який індукує утворення нейтралізуючих антитіл, що включає амінокислотну послідовність, яка с складається принаймні з 7-40 амінокислотних залишків, яка відповідає амінокислотній послідовності, що о відповідає нейтралізаційному сайту білка СР. вірусу ВРРОС, при цьому зазначений нейтралізаційний сайт включає амінокислотні залишки, які знаходяться, приблизно, в амінокислотних положеннях 40-79, виявлених у ВРРСС ізоляту І-1102.

2.Пептид за п.1, що включає амінокислотну послідовність, де амінокислотні залишки замінені по іт) стандартному типу або за даними замісного картування. «-

З.Пептид за пп.1 або 2, який відрізняється тим, що зазначений нейтралізаційний сайт включає амінокислотні залишки, які знаходяться, приблизно, в амінокислотних положеннях 52-75 білка ОР ). вірусу ВРРСОС ізоляту Ме) І-1102. со

4.Пептид за будь-яким з пп.1-3, який відрізняється тим, що зазначений нейтралізаційний сайт включає амінокислотні залишки, які знаходяться, приблизно, в амінокислотних положеннях 59-67 білка СР; вірусу ВРРСС в. ізоляту І-1102.

5.Пептид за будь-яким з пп.1-4, який відрізняється тим, що зазначена амінокислотна послідовність включає амінокислотну послідовність, що вибирається з групи, яка складається з ЗААОЕКІ5Е, ЗААОЕЕЇІЗЕ, ЗТАОЄЕМІЗЕ, « ЗТАОЕМІРЕ, ЗЕЕБОБМТ, ЗАБЕАІК, ЗБАЗЕАЕК, РАРЕАЕЕК, РАРЕАЇК, ЗАРЕТЕК і 5Т5ЗЕАЕНК.

б.Пептид, який індукує утворення антитіл, які реагують принаймні з двома різними ізолятами ВРРСС, що в) с включає амінокислотну послідовність, яка складається принаймні з 5-15 амінокислотних залишків, яка відповідає "» амінокислотній послідовності, що відповідає консервативному сайту білка М вірусу ВРРОС, при цьому " зазначений консервативний сайт включає амінокислотні залишки, які знаходяться, приблизно, в амінокислотних положеннях 22-32 білка М вірусу ВРРСОС ізоляту І-1102.

7.Пептид за п.б, який включає амінокислотну послідовність, де амінокислотні залишки замінені по - стандартному типу або за даними замісного картування. оо

8.Пептид за пп.б або 7, який відрізняється тим, що зазначена амінокислотна послідовність включає амінокислотну послідовність, що вибирається з групи, яка складається з ММОЇ СОЇ І ЗА і ММОЇ! СОМІ ОК. со

9.Пептид, який індукує утворення антитіл, що здатні встановлювати відмінності між принаймні двома різними -л 20 ізолятами ВРРСС, який включає амінокислотну послідовність, що складається принаймні з 5-15 амінокислотних залишків, яка відповідає амінокислотній послідовності, що відповідає неконсервативному і диференціюючому сл сайту білка М вірусу ВРРОС, при цьому зазначений неконсервативний сайт включає амінокислотні залишки, які знаходяться, приблизно, в амінокислотних положеннях 41-50 білка М ВРРСС ізоляту І-1102.

10.Пептид за п.9У, який включає амінокислотну послідовність, де амінокислотні залишки замінені по 22 стандартному типу або за даними замісного картування. Ф!

11.Пептид за пп.9 або 10, який відрізняється тим, що зазначена амінокислотна послідовність включає амінокислотну послідовність, що вибирається з групи, яка складається з РКОСОАКККК, РКОСОАКЕКК, о РЕССОАККЕК, СОРОККМКККМ, СРОККМКККТ, СРОККМАККМ, СРОККЕКККМ, СРОККІКККМ і ОРООІМККІМ.

12.Пептид за п.9, який відрізняється тим, що зазначений неконсервативний сайт включає амінокислотні 60 залишки, які знаходяться, приблизно, в амінокислотних положеннях 1-10 білка М вірусу ВРРСС ізоляту І-1102.

13.Пептид за будь-яким з пп.9, 10 або 12, який відрізняється тим, що зазначена амінокислотна послідовність включає амінокислотну послідовність, що вибирається з групи, яка складається з МАСКМОБОКК, МРМММОКОТЕ, МРМММОКОРК, МРЯМММОКООК, МРМММОКООМ, МРМММОКООК і МЕМММОКООК.

14.Пептид, який індукує утворення антитіл, специфічних до конформаційного епітопу в складі білка М вірусу бо ВРРОС, при цьому зазначений пептид складається з 5-15 амінокислотних залишків, при цьому зазначеним амінокислотним залишкам відповідає конформаційний сегмент, який знаходиться, приблизно, в амінокислотних положеннях 51-68 або 79-90, або 111-124 білка М вірусу І еіузіай ізоляту І-1102.

15.Пептид за п.14, який відрізняється тим, що зазначена амінокислотна послідовність включає амінокислотну послідовність, що вибирається з групи, яка складається з РКРНЕРІ ААЕООІКННІ, 5ІОТАРМОСАСТ і НТУКИКМТЗТЗАВ.

16.Імуногенна композиція для індукції нейтралізуючих антитіл, що відповідає нейтралізаційному сайту білка СР, вірусу І еіузвіад, яка включає принаймні один пептид за будь-яким з пп.1-5 і фармацевтично прийнятний носій.

17.Вакцина для профілактики зараження репродуктивно-респіраторним синдромом свиней (РРСС), що 7/0 Включає пептид за будь-яким з пп.1-5 або імуногенну композицію за п.16, разом з підхожим ад'ювантом або носієм для введення тварині.

18.Антитіло, одержане за допомогою пептиду за будь-яким з пп.1-15, реактивне до пептиду за будь-яким з пп.1-15.

19.Діагностичний набір для виявлення або ідентифікації антитіл, специфічних до ізоляту ВРРОС, який /5 Включає принаймні один пептид за будь-яким з пп.1-15 разом з підхожим приладдям для виявлення.

20.Діагностичний набір за п.19, що використовується для тестування стрівальності РРСС у свині або у стаді свиней.

21.Діагностичний набір, призначений для виявлення або ідентифікації антитіл, специфічних до антигену, похідного від ізоляту ВРРСОС, який включає антитіло за п.18.

22.Діагностичний набір за п.21, що використовується для тестування стрівальності РРСС у свині або у стаді свиней. с (8) ІС) «- (22) со і - -

с . и? -І (95) се) - 50 сл Ф) іме) 60 б5