ES2289781T3 - Sitios antigenicos prrsv que identifican secuencias de peptidos de virus prrs, para su uso en vacunas de ensayos de diagnosticos. - Google Patents

Abstract

Un péptido de 10-15 residuos de aminoácidos que logra anticuerpos que reaccionan con por lo menos dos diferentes aislamientos de PRRSV, comprendiendo, el péptido, las secuencia VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK, ó el péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada mediante cambios artificiales o sustitución de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos correspondiente al sitio conservado de la proteína N del PRRSV, seleccionándose el sitio conservado, de entre las VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK, en donde, el citado péptido, reacciona con los anticuerpos monoclonales que enlazan a péptidos que tienen la secuencia VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK.

Description

Sitios antigénicos PRRSV que identifican secuencias de péptidos de virus PRRS, para su uso en vacunas de ensayos de diagnósticos.

La presente invención, se refiere al agente causante de la "enfermedad porcina misteriosa", el virus PRRS, a las secuencias de péptidos identificadas en los virus PRRS, y a incorporar estas secuencias en vacunas y tests de ensayos de diagnósticos.

El virus PRRS (PRRSV) es el agente causante de una enfermedad del cerdo, denominada de una forma corriente, síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS -del inglés, porcine reproductive and respiratory syndrome-). El virus, es el agente causante de una enfermedad porcina, vista desde aproximadamente el año 1987 en los Estados Unidos de América y, desde el año 1990, en Europa, conocida, inicialmente, mediante nombres tales como los correspondientes a "Enfermedad misteriosa del cerdo", "Síndrome de infertilidad y respiratorio de cerdo" y mediante muchos más nombres. Al virus en sí mismo, se le denominó también con muchos nombres, entre otros, virus de Lelistad (LV), virus del SIRS, y muchos más, pero ahora, se denomina, mayoritariamente, síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Éste provoca abortos y agotamiento respiratorio en los cerdos, y se aisló, por primera vez, en Europa, en el año 1991 (patente europea 587 780, patente estadounidense US 5.620.691) y, subsiguientemente, en los Estados Unidos de América y en muchos otros países, a través del mundo entero. El PRRSV, es un virus pequeño provisto de envoltura, que contiene un genoma de RNA de hebra positiva. El PRRSV, crece, de una forma preferible, en macrófagos. Adicionalmente a los macrófagos, el PRRSV puede crecer en la línea de células CL 2621, y otras líneas celulares clonadas a partir de la línea del riñón del mono, MA-104 (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest. 4; 127-133, 1992). El genoma del PRRSV, policlonado de aproximadamente 15 kb, se secuenció en el año 1993 (Meulenberg et al., Virology 192; 62-74, 1993). La secuencia nucleótida, la organización del genoma y la estrategia de replicación, indicaba que, el PRRSV, está relacionado con un grupo pequeño de virus de RNA de hebra positiva, provistos de envoltura, designados como arterivirus. Este grupo, incluye al virus de la elevación del lactato - deshidrogenasa (LDV), virus de la arteritis equina (EAV) y el virus de la fiebre hemorrágica símica (SHFV). Estos virus, tienen una organización del genoma, una estrategia de replicación, una morfología y una secuencia de aminoácidos de proteínas víricas, que son semejantes. Los arterivirus, contienen un genoma de 12,5 a 15 kb, y sintetizan un juego anidado en 3' de seis RNAs subgenómicos, durante la replicación. Estos RNAs subgenómicos, contienen una secuencia líder la cual se deriva del extremo 5' del genoma vírico. Las ORFs 1a y 1b, comprenden aproximadamente dos tercios del genoma vírico, y codifican la RNA polimerasa RNA-dependiente. Seis ORFs más pequeñas, ORF 2 a 7, se encuentran localizadas en el extremo 3' del genoma vírico. Las ORFs 2 a 6, codifican, de una forma parecida, proteínas de envoltura, mientras que, la ORF 7, codifica a la proteína nucleocápsida (Meulenberg et al, Virology 206; 155-163;
1995).

El PRRSV, es el primer arterivirus, para el cual, se ha demostrado el hecho de que, la totalidad de las seis proteínas codificadas por las ORFs 2 a 7, se encuentran asociadas con el virión. La N-proteína de 15 - KDa (codificada por ORF 7) y la proteína M de membrana integral de 18 - KDa (ORF 6) no son N-glicosiladas, mientras, sí que los son la proteína GP_{2} de 29- a 30 -KkDa (ORF2), la proteína GP_{3} de 45 a 50 KDA (ORF_{3}), la proteína GP_{4}, de 31 a 35 Ka (ORF4), y la proteína de 25 - KDa GP_{5} (ORF5). Estas proteínas, se han detectado, también, en virus extracelulares y lisados de células infectadas con un aislamiento de Norteamérica del PRRSV, ATCC-VR2332, y otros aislamientos del PRRSV (otros aislamientos del PRRSV son, por ejemplo, el CNCM I-1140, el ECACC V93070108, el CNCM I-1387, el CNCM I-1388, el ATCC-VR2402, el ATCC-VR2429, el ATCC-VR 2430, el ATCC-VR2431, el ATCC-VR 2475, el ATCC-VR2385, pero se conocen también muchos más).

Nosotros, hemos descrito, ya, anteriormente, el aislamiento y la caracterización de un panel de MAbs PRRSV-específico, que eran específicos para GP_{3}, GP_{4}, M y N (van Nieuwtadt et al., J. Virol. 70, 4767-4772, 1996). De una forma interesante, los MAbs dirigidos contra la GP_{4}, se neutralizaban, sugiriendo el hecho de que, por lo menos una parte de la proteína, se exponía a la superficie del virión. Adicionalmente, además, la mayoría de los MAbs dirigidos contra N, reaccionaban con la totalidad de los aislamientos sometidos a test de ensayo.

El PRRS en sí mismo, es un problema de máximo interés, para la industria porcina, en la mayoría de las partes del mundo. La introducción del PRRSV, en los rebaños de cerdos, provocará algunas pérdidas económicas. Los tests de ensayo de diagnóstico contra la PRRS, se practican extensamente, por parte de varios veterinarios y laboratorios. La mayoría de los tests de ensayo de diagnóstico, tales como los correspondientes a los IPMA, IFT, IFA, ELISA, comprendiendo, cada uno de ellos, medios apropiados de detección, tales como enzimas conjugadas de fluorocromos, y otras substancias, utilizan interacciones entre derivados del PRRSV y anticuerpos dirigidos contra el PRRSV, con objeto de medir la presencia de bien ya sea antígeno de PRRSV ó anticuerpos dirigidos contra el PRRSV, en una muestra biológica, tal como la correspondiente a sangre, suero, tejido, fluidos de tejido, fluidos de lavado, orina, heces, la cual se ha tomado como muestra, del animal (tal como un cerdo) a ser sometido a test de ensayo. El antígeno y/o anticuerpos utilizados en estos tests de ensayo de diagnósticos, o equipos de diagnóstico a modo de "kits", o ensayos, para la diagnosis de PRRS, se definen únicamente por su origen del PRRSV ó por su reactividad con el PRRSV. En principio, esto es suficiente como para realizar ensayos de cribado, en donde, sin embargo no se requiere explícitamente una alta especificidad o sensibilidad. No obstante, la en algún tiempo continua expansión de PRRS, ha causado grandes problemas en la industria porcina, hasta el extremo de que, existe una tremenda necesidad, en cuanto la erradicación del PRRS, de la totalidad de los rebaños, o incluso de áreas, regiones o países enteros, en donde se hacen crecer los cerdos. Un claro ejemplo de esta necesidad, es el programa de erradicación propuesto, con relación al PRRS, en Dinamarca. Si se decide erradicar completamente el PRRS, entonces, son necesarios tests de ensayo de diagnósticos, que exhiban una mayor especificidad o sensibilidad que las de los tests de ensayo que se utilizan hoy en día.

La vacunación contra el PRRS, se practica también muy extensamente. Se conocen algunos ejemplos, de vacunas vivas modificadas que se utilizan, así como también se conocen vacunas muertas. No obstante, existe un problema con las vacunas vivas, de una forma general, y así, de este modo, también con las vacunas vivas de PRRS, problema éste consistente en el hecho de que, estas vacunas, tienen una tendencia a extenderse a los cerdos no vacunados, expandiéndose con ello, en lugar de reducirse, la infección detectable en rebaños de cerdo, y siendo, de este modo, contra-productivo para la erradicación completa. Si se utiliza una vacuna de registro o marcador indicativo en línea, la cual pudiera diferenciarse serológicamente del tipo de virus salvaje, entonces, este problema, podría reducirse enormemente. Las desventajas añadidas, residen en el hecho de que, las vacunas vivas, algunas veces, provocan reacciones anafilácticas en los cerdos vacunados, debido a los componentes antigénicos indefinidos. Si bien se reporta el hecho de que, por regla general, las vacunas muertas, reducen la protección en el cerdo vacunado, y que tienen la ventaja adicional de que no se expanden de cerdo a cerdo, no obstante, una desventaja de las vacunas muertas, reside en el hecho de que puede ser difícil de acumular suficiente masa antigénica en una dosis de una vacuna, para obtener una respuesta inmune mesurable y protectora. Podría ser beneficioso el disponer de vacunas muertas especiales que puedan inducir títulos mesurables de anticuerpos neutralizantes en cerdos, debido al hecho de que, la medición de estos anticuerpos neutralizantes en poblaciones de cerdos vacunados, ayudarían a generar un entendimiento acerca del nivel de protección obtenido mediante la vacunación en rebaños de cerdos. Adicionalmente a ello, si se tiene éxito en el ensamblaje de la masa antigénica necesaria, esto significa, también, el hecho de que se encuentran presentes más, y otra masa antigénica indefinida, en la vacuna, la cual puede también dar lugar a reacciones anafilácticas, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba. En este sentido, sería beneficioso el conocer cual tipo de sitio específico de PRRSV, se encuentra involucrado en la neutralización, conduciendo con ello al diseño de vacunas mejores y más apropiadas, incorporando las importantes secuencias peptídicas para la neutralización de anticuerpos. Una ventaja de las vacunas actualmente utilizadas que se originan a partir de aislamientos aislados en los Estados Unidos de América, reside en el hecho de que, tales tipos de vacunas, aunque plenamente protectoras contra los aislamientos europeos del PRRSV, e inmunológicamente, reactivamente cruzados con éstos, contienen epítopos o sitios antigénicos, hasta ahora indefinidos, mediante los cuales, éstos pueden discernirse a partir de aislamientos del PRRSV procedentes de los Estados Unidos de América.

Si pudiera disponerse de tests de ensayo serológicos, los cuales pudieran discriminar (en base a las pequeñas diferencias epitópicas entre aislamientos de PRRSV), entre cerdos que estén, o bien ya sea vacunados con una vacuna derivada de los Estados Unidos de América, o bien ya sea infectados con un tipo salvaje europeo de PRRSV (que se encuentren vacunados, o no), o que pudieran discriminar cerdos que se encuentren o bien ya sea vacunados con una vacuna derivada de Europa, o bien ya sea infectados con un tipo salvaje estadounidense de PRRSV (que se encuentren vacunados, o no), entonces, podrían desarrollarse vacunas marcadoras de registro y los correspondientes tests de ensayo de diagnóstico (que incorporasen los citados epítopos discernientes o sitios antigénicos), las cuales podrían utilizarse con una amplia confidencia, en la erradicación de programas para PRRS. Así, por ejemplo, en Dinamarca, podría entonces ser posible el vacunar con una vacuna derivada de los Estados Unidos de América, y medir el juego de anticuerpos en los cerdos daneses, los cuales estén solamente dirigidos contra epítopos únicos en los tipos salvajes europeos de PRRSV y que no sean de reacción cruzada con cepas estadounidenses. Esto podría posibilitar la detección inequívoca y subsiguiente eliminación de los cerdos del tipo salvaje infectados, de los rebaños daneses. De una forma corriente, tal tipo de discriminación, no es posible, debido a la amplia reactividad cruzada inmunológica global, entre los aislamientos de PRRSV. No hace falta decir que, tales tipos de programas de vacunación combinados, serán la base para la erradicación de PRRS, y pueden también utilizarse en otros países, utilizándose, en caso necesario, distintos sitios antigénicos de PRRSV, en la vacuna y/o test de ensayo de diagnóstico.

La invención, proporciona, ahora, un sitio antigénico, el cual comprende las secuencias peptídicas correspondientes a la reivindicación 1, las cuales permiten la mejora de las vacunas, bien ya sean éstas vacunas muertas o atenuadas, o bien ya sean derivadas vía tecnología de DNA recombinante, y sitios antigénicos, los cuales permiten la mejora de procedimientos de diagnóstico, tests de ensayo, y equipos a modo de kits, y la producción de nuevos procedimientos de diagnóstico, tests de ensayo y equipos a modo de kits. Los cambios artificiales o sustituciones de residuos de aminoácidos que mantienen su antigenicidad, (tal y como se definen, por ejemplo, mediante la reactividad con sueros policlonales o MAbs), y así, de este modo, la funcionalidad del sitio antigénico, pueden derivarse fácilmente a partir de secuencias conocidas, para constituir un sitio antigénico de un aislamiento específico, por parte de una persona con conocimientos comunes en el arte de la técnica especializada correspondiente al diseño y síntesis de péptidos. Así, por ejemplo, ciertos residuos de aminoácidos, pueden reemplazarse, de una forma conveniente, mediante otros que sean de una naturaleza comparable, por ejemplo, un residuo básico, por otro residuo básico, y un ácido por un ácido, un residuo masivo por otro residuo masivo, un residuo hidrofóbico o un residuo hidrofílico, por otro residuo hidrofóbico u otro residuo hidrofílico, y así sucesivamente. También son posibles otros cambios menos convencionales, pero más específicos, que mantengan, o incluso mejoren, la antigenicidad de la secuencia seleccionada. Tales tipos de cambios, pueden realizarse, por ejemplo, mediante sustituciones de aminoácidos basadas en PEPSCAN, o mediante técnicas de mapas de sustitución (van Amerongen et . al., Peptide Research (1992) 5, 269-274. De una forma abreviada, los residuos de aminoácidos que se encuentran en los sitios antigénicos proporcionados por la presente invención, pueden reemplazarse, por ejemplo, de una forma convencional, bajo las directrices de las técnicas de mapas de sustitución, con lo cual, las secuencias de péptidos resultantes, son funcionalmente equivalentes al sitio antigénico. Los aminoácidos de sustitución, pueden ser bien ya sea residuos de aminoácidos L, o bien ya sea residuos de aminoácidos D. Adicionalmente, además, las secuencias de péptidos proporcionadas por la presente invención, se convierten en todavía más inmunogénicas, mediante la conjugación de éstas a adyuvantes (tales como el KLH), que sean conocidos en el arte especializado de la técnica. Adicionalmente, además, los péptidos, se convierten en todavía más inmunogénicos, al realizar péptidos con una (tal como los péptidos tándem), o más secuencias repetidas o mediante polimerización o circularización.

Si bien se ha mostrado ya anteriormente el hecho de que, la proteína N, es inmunogénica (Meulenberg (1995, J. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2, 652-656, GB 2 289 279 A), y que las regiones conservadas y no conservadas entre las proteínas N de las cepas Europeas (LV) y cepas Estadounidenses (VR 2332), existen (WO 96/04 010), nosotros demostramos, aquí, por primera vez, cúales regiones conservadas y no conservadas son antigénicas y cúales pueden utilizarse individualmente o en combinación, como antígenos, para ensayos de inmunización o de diagnóstico. Adicionalmente, además, se identifica, aquí, el hecho de que, las regiones antigénicas, en la proteína N, consisten ambas en epítopos dependientes de conformación.

La proteína GP4, es la primera proteína estructural de PRRSV, para la cual se muestra que, ésta, logra anticuerpos que pueden neutralizar al virus. Se identificó y se definió una región específica de aproximadamente 40 aminoácidos, la cual debía exponerse a la superficie del virión, como una diana para la neutralización de anticuerpos, los cuales evitan el que, el virus, infecte a las células. Esto es un nuevo descubrimiento estimulante, debido al hecho de que, se asume, de una forma general, el hecho de que, la proteína GP5, la estructural mayor del PRRSV, es el candidato más importante involucrado en la unión de la célula huésped.

Este documento, describe la localización de un sitio mayor de neutralización para el diseño de vacunas marcadoras o de registro que comprenden secuencias de núcleo de aminoácidos y secuencias de aminoácidos colindantes con las secuencias de aislamientos de PRRSV, secuencias éstas que comprenden el sitio de neutralización sobre la proteína ORF4 del PRRSV. Procediendo a incorporar las secuencias relevantes de los sitios de neutralización, en varios tipos de vacunas, es posible el inducir, de una forma específica, los anticuerpos de neutralización, en los cerdos vacunados. La vacunas muertas que comprenden los sitios de neutralización proporcionados por la presente invención, se realizan para inducir anticuerpos de neutralización mesurables. Especialmente, las secuencias localizadas en posiciones, en la proteína codificada por ORF4, del PRRSV, correspondientes a aquéllas que se encuentran en aproximadamente los aminoácidos 40 a 79, tal y como se encuentran en aislamiento del PRRSV I-1102, comprenden el sitio de neutralización. Adicionalmente, además, se realizan secuencias peptídicas seleccionadas todavía más inmunogénicas, procediendo a mezclar los péptidos con adyuvantes y otros portadores o soportes conocidos en el arte especializado de la técnica. Las composiciones peptídicas de estas forma obtenidas, se utilizan como vacunas. No obstante, se incorporan también las secuencias peptídicas que comprenden el sitio de neutralización, en sistemas de vectores de vacunas, siendo o bien vectores recombinantes distintos derivados de virus heterólogos, o bien bacterias, pero, las secuencias peptídicas seleccionadas, se incorporan también de una forma selectiva, en los virus de vectores del PRRS, o vacunas derivados de éstos.

Se describen, también, secuencias de aminoácidos localizadas en las posiciones correspondientes a aproximadamente 52 a 75, constitutivas, de una forma más específica, de un amplio sitio reactivo de neutralización. Otras formas de presentación del sitio de neutralización proporcionado por la presente invención, son la que pueden encontrarse entre los varios aislamientos de PRRSV conocidos o a ser encontrados (véase, por ejemplo, la parte experimental de la presente descripción). Es fácil, para cualquier persona que trabaje en el sector de la biología molecular, el comparar las secuencias que comprenden el sitio de neutralización proporcionado por la presente invención, con las secuencia de aminoácidos de proteína codificadas por ORF4, de todavía otro aislamiento de PRRSV.

La invención, proporciona asimismo las secuencias peptídicas de la reivindicación 1, las cuales mejoran los tests de ensayo de diagnósticos, bien ya sean tests de ensayo de detección de antígenos, o bien ya sean tests de ensayo de detección de anticuerpos. La invención, proporciona varios grupos de sitios antigénicos, los cuales se utilizan solos o en combinación con tests de ensayo de diagnóstico. Así, de este modo, mediante la presente invención, se proporcionan tests de ensayo de diagnóstico, los cuales sirven para las varias necesidades existentes en sector, con respecto a la diagnosis y a la diagnosis diferencial. Las interacciones antígeno - anticuerpo, suponen siempre las interacciones cruzadas epítopo-parátopo de secuencias de aminoácidos que son secuencias de una longitud de 5 a 15 aminoácidos. Así, de este modo, con la invención, se proporcionan las secuencias de aminoácidos de una longitud de 5 a 15 aminoácidos y que se solapan de una forma parcial o de una forma completa con las secuencias núcleo de los sitios antigénicos de la invención, para su incorporación en los tests de ensayo de diagnósticos. Estas secuencias peptídicas, se utilizan para seleccionar o diagnosticar el antígeno o la substancia antigénica que contiene las secuencias, en el test de ensayo a ser utilizado. De una forma alternativa, y según se proporciona mediante la invención, se proporcionan anticuerpos sintéticos, reactivos con los sitios antigénicos proporcionados por la presente invención. Estos sitios o secuencias relacionadas, reaccionan con el anticuerpo sintético obtenido a partir de sistemas tales como las bibliotecas de presentación de fagos o selección clónica de anticuerpos (de cadena pesada, que constituyen las moléculas semejantes a anticuerpos que pueden ser fácilmente expresadas en sistemas de expresión de heterólogos.

Otro grupo, comprende la secuencia peptídica correspondiente al citado sitio de neutralización, tal y como se ha explicado anteriormente, arriba. Los tests de ensayo de diagnóstico, que comprenden este sitio y/o anticuerpos específicamente dirigidos contra este sitio, detectan anticuerpos neutralizantes en el cerdo.

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Otro grupo proporcionado por la presente invención, comprende un sitio antigénico conservado en la proteína N. En el sitio antigénico conservado, la presente invención, proporciona una secuencia núcleo VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK. Los tests de ensayo de diagnóstico que comprenden este sitio y/o anticuerpos específicamente dirigidos contra este sitio, detectan a aquéllos anticuerpos, en cerdos, que reaccionan específicamente con la mayoría de aislamientos de PRRSV. Así, de este modo, se proporcionan tests de ensayo de diagnóstico, los cuales utilizan anticuerpos dirigidos contra el sitio conservado, para detectar el antígeno de PRRSV, permitiendo el detectar aislamientos de PRRSV, de una forma irrespectiva en cuanto a su origen.

Otro grupo, comprende un sitio antigénico de diferenciación, no conservado, en la proteína N. Los tests de ensayo de diagnóstico, que comprenden este sitio y/o anticuerpos, específicamente dirigidos contra este sitio, detectan a aquéllos anticuerpos, en cerdos, los cuales reaccionan específicamente con distintos aislamientos de PRRSV, con lo cual, por ejemplo, pueden discriminarse cerdos vacunados, con respecto a cerdos infectados con el PRRSV de tipo salvaje. También, puede realizarse tests de ensayo de diagnóstico, los cuales utilicen anticuerpos dirigidos contra el sitio no conservado, para detectar el antígeno de PRRSV, permitiendo el test de ensayo, con ello, el discernir diferentes aislamientos de PRRSV. Entre uno de estos sitios no conservados, hay una secuencia núcleo PRGGQAKKKK ó PRGGQAKRKK ó PRGGQAKKRK ó GPGKKNKKKN ó GPGKKNKKKT ó GPGKKNRKKN ó GPGKKFKKKN ó GPGKKIKKKN ó GPGQINKKIN. Entre otros sitios no conservados, hay una secuencia núcleo MAGKNQSQKK
ó MPNNNGKQTE ó MPNNNGKQPK ó MPNNNGKQQK ó MPNNNGKQQN ó MPNNNGKQQK ó
MPNNNGRQQK. También, los cambios artificiales que mantienen la antigenicidad y, así de este modo, la funcionalidad de las secuencias núcleo anteriormente facilitadas, arriba, en las proteína GP4 ó N, pueden introducirse de una forma fácil, por parte de cualquier persona experta en el arte especializado de la técnica del diseño y síntesis de péptidos, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba.

La invención, describe también un grupo que comprende epítopos de conformación (los cuales pueden variar en gran forma, entre los varios aislamientos), que pueden encontrarse en posiciones correspondientes a aquéllas encontradas en el aislamiento I-1102, desde la posición de aminoácidos 51 a aproximadamente 68 (en la secuencia PKPHFPLAAEDDIRHHL, del aislamiento de núcleo I-1102) ó desde la posición 79 a aproximadamente la posición 90 (en la secuencia SIQTAFNQGAGT, de la secuencia de núcleo I-1102) ó desde la posición 111 a la posición 124 (en la secuencia de HTVRLIRVTSTSAS del aislamiento de núcleo I-1102) en la proteína N. Los sitios conservados y no conservados y de diferenciación y de conformación, en la proteína N, proporcionan tests de ensayo de diagnóstico los cuales diagnostican, de una forma inequívoca, las infecciones por PRRSV. Se realizan tests de ensayo, los cuales evitan el emplear sitos no conservados, evitando, con ello, los resultados falsos negativos. Adicionalmente a ello, los varios sitios no conservados, se utilizan en el desarrollo de tests de ensayo de diferenciación, los cuales pueden discriminar, por ejemplo, a los cerdos vacunados de los cerdos no vacunados, infectados con los aislamientos del PRRSV del tipo salvaje. También, otra vez, tal y como se ha mencionado anteriormente, es fácil, para cualquier persona que trabaje en el sector especializado de la biología molecular, el alinear las secuencias que comprenden los sitios epítopos conservados o no conservados o de conformación, con secuencias de aminoácidos de la proteína codificada por ORF de todavía otro aislamiento de PRRSV. Los sitios proporcionados por la presente invención, se utilizan en nuevos pares de test de diagnostico de discriminación de vacunas, para su uso en programas de erradicación de PRRS.

Parte experimental Materiales y métodos Células y virus

La cepa Ter Huurne (CNCM I-1102) del PRRSV, se aisló en el año 1991 (Wensvoort et al., 1991). La cepa US ATCC-VR2332, se aisló por parte de Benfield et al. (1992). La cepa NL1 (Países Bajos, 1991), se aisló en nuestros laboratorios, la cepa NY2 (Inglaterra, 1991), fue amablemente cedida por parte de T. Drew, la cepa DEN (Dinamarca, 1992), fue amablemente cedida, por parte de A. Botner, la cepa LUX (Luxemburgo, 1992), fue amablemente cedida por parte de Losch, las cepas SPA1 y SPA2 (España, 1992), fueron amablemente cedidas por parte de Shokouhi y Espuna, respectivamente, y la cepa FRA (Francia), fue amablemente cedida, por parte de Y. Leforban.

Las PRRSV y VR2332, se cultivaron en células CL2621, tal y como se ha descrito previamente (van Nieuwstadt et al., 1996). Los siete diferentes aislamientos europeos, se cultivaron en macrófagos alveolares porcinos. Los macrófagos, se mantuvieron de la forma que se ha descrito anteriormente (Wensvoort et al., 1991). Las células BHK-21, se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco, suplementado con un 5% de suero bovino fetal y antibióticos. Para los experimentos de transfección, se cultivaron células BHK-21, en Glasgow Minimal Esencial Medium (GIBCO-BRL/Life Tecnologies Ltd.).

Antisueros

El suero porcino anti-PRRSV 21 y el suero anti-peptídico del conejo 698 y 700, se utilizaron en experimentos previos. El suero 700, está dirigido contra los aminoácidos 106 a 122 (CLFYASEMSEKGFKVIF), codifacados por la ORF4 del PRRSV, y se obtuvo de procedencia de un conejo. La producción y la caracterización de MAbs, se ha descrito ya (van Nieuwstadt et al., 1996). Los hibridomas, se derivaron de cinco experimentos consecutivos de fusión, y estaban dirigidos contra la proteína ORF4 (MAb 121.4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130.7, 138.28) ó la proteína ORF7 (MAb 112.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2, 130.4, 131.7, 138,22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17). Las WBE, fueron amablemente cedidas por parte del Dr. Drew, Weybridge, Reino Unido; La Mab SDOW17, fue amablemente cedida por parte del Dr. Benfield, South Dakota, EEUU.

Construcciones de plásmidos

Se utilizaron dos oligonucleótidos, localizados corriente arriba (PRRSV13) y corriente abajo (PRRSV14), previamente a proceder a amplificar y clonar la ORF4 del aislamiento I-1102 en el pGEM-4Z, utilizando los sitios BamHI y HindIII, introducidos en los cebadores (Meulenberg et al., 1985). El plásmido resultante, se denominó pABV209. Se utilizaron dos oligonucleótidos localizados a una posición similar con respecto al codón de iniciación (PRRSV4), y al codón de terminación (PRRSV5) de la ORF4 del VR2332, para amplificar la ORF4 de la VR2332, por mediación de RT-PCR, tal y como se ha descrito en estudios previos. El fragmento de PCR, se digirió con BamHI y, parcialmente, con Hind III debido al hecho de que, la ORF4 del VR2332, contiene el sitio interno HindIII y clonó en el pGEM-4Z, dando como resultado el plásmido pABV270. Se realizaron esencialmente técnicas de DNA recombinante, tal y como éstas se describen por parte de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, - Clonación molecular, Un manual de laboratorio -, Cold Spring Harbor Lab. NY. 1989). La secuencia de nucleótidos de la VR 2332 ORF4 en el pABV270, determinada en un secuenciador automático de DNA (Applied Biosystems), era idéntica a la secuencia publicada (Murtaugh et al., Arch. Virol., 140; 1451-1460, 1995).

A continuación, se procedió a transferir la ORF4 de las I-1102 y VR2332, al vector de expresión pSFV1 del virus de Semliki Forest. Los pABV209 y pAB270, se digirieron con BamHI y HindIII (Parcialmente para el pABV270), los fragmentos de ORF4, se trataron con polimerasa de Klenow (Pharmacia) para crear extremos embotados y, éstos, se ligaron en el sito SmaI del pSFV1, desfosforilizado con fosfatasa intestinal alcalina de ternero (Pharmacia). Se procedió a someter adicionalmente a tests de ensayo, a los plásmidos que contenían ORF4 de la I-1102 (pABV265) y de la VR2332 (pABV271) en la orientación correcta, para la expresión de la proteína GP_{4}. Adicionalmente, además, se realizaron cuatro genes diferentes quiméricos de la ORF4 de la I-1102 y la VR2332. La secuencia nucleotídica de los aminoácidos 1 a 39 de la GP_{4} de la VR2332, que codifica a la ORF4, se amplificó a partir del plásmido pABV270, con los oligonucleótidos PRRSV4 y PRRSV6. El fragmento obtenido, se digirió con BamHI y SacII. Este fragmento, se ligó en pABV209, digerido con BamHI y SacII, para crear una fusión en marco, entre los aminoácidos 1 a 39 de la proteína GP_{4} de la VR2332 y 40 a 183 de la proteína GP_{4} de la I-1102 en el pABV306. La secuencia nucleótida de los aminoácidos 1 a 75 de la GP4 de la V2332 que codifica para la ORF4, se amplificó con los oligonucleótidos PRRSV4 y PRRSV9 (véase la tabla 2). Este fragmento, se digirió con KpnI y BamHI. La secuencia nucleótida de los aminoácidos 80 a 183 de la proteína GP_{4} de la I-1102, que codifica para la ORF4, se amplificó con PRRSV46 y PRRSV14 y, el fragmento amplificado, se digirió con KpnI y Bam HI. Ambos fragmentos, se ligaron conjuntamente, en pGEM digerido con BamHI y HindIII, dando como resultado el plásmido pABV308. De la misma forma, se procedió a crear una construcción complementaria, en el pABV314, consistente en la secuencia nucleótida de los aminoácidos 1 a 79, que codifican a la proteína I-1102 GP4, amplificada con PRRSV13 y PRRSV57, ligada a un fragmento de los aminoácidos 76 a 178 que codifica a la VR2332, la cual se amplificó con PRRSV10, y PRRSV5, en pGEM-4Z. Una cuarta construcción quimérica consistente en un fragmento codificado por los aminoácidos 40 a 79, de la proteína GP_{4} de PERSV fusionada a los fragmentos codificados por los aminoácidos 1 a 19 y los aminoácidos 76 a 178, de la proteína GP_{4} de la VR2332. Este cometido, se realizó procediendo a ligar el fragmento ORF4 BamHI/SacII del pABV270 y el fragmento ORF_{4} SacII/HindIII del pABV314, en pGEM, digerido con BamHI y HindIII. Este plásmido, se designó como pABV325. Se procedió a ensayar los plásmidos pABV306, pABV307, pABV314, y pABV325, para la secuencia correcta, mediante secuenciación de oligonucleótidos. Los genes quiméricos ORF4, se transfirieron desde los pABV306, pABV307, pABV314, y pABV325, al PSFVI, de una forma idéntica a la que se ha descrito anteriormente, arriba, para los genes de ORF4 de las VR2332 y PRRSV, dando como resultado los pABV296, pABV305, pABV321, y pABV326, respectivamente (figura 3).

Se utilizaron los oligonucleótidos localizados corriente arriba (LV108; 5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATG
GCCGGTAAAAACCAGAGCC 3') y corriente abajo (LV112; 5' CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACC
CTGA 3') de la ORF7, para amplificar y clonar el gen ORF7 en el pGEM-T, dando como resultado el pABV431. Las secuencias y la posición de estos y otros oligonucleótidos utilizados para amplificar los fragmentos de ORF7, se encuentran listados en la tabla 1. adicionalmente, además, se realizaron cuatro construcciones quiméricas diferentes, mediante mutagénesis dirigida por PCR. Las secuencias que codificaban para los aminoácidos 35-26, 28-30 (sitio B; figura 3), se sustituyeron por las correspondientes secuencias de la proteína EAV N. Este cometido, se realizó mediante amplificación por PCR de la ORF7, con LV108 y LV134 (5' TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAAT
GACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGATAAA GTCC 3'). El fragmento de DNA mutado, se introdujo en el pABV431, utilizando el sitio MacI y PacI, los cuales dieron como resultado el pABV455. La región de la ORF7 codificada por los aminoácidos 51 a 67, se sustituyó por la región correspondiente de LDV ORF7. El pABV431, se digirió con los EcoNI y CLAI, y se ligaron a un fragmento de PCR producido con los cebadores LV98 (5'CCAGCAACC
TAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTT CCCATGGCTGGTCCATCTGAC 3') y LV99 (5' CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGGAGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCA
CATGGACCAGCC 3'), digeridos con las mismas enzimas. Este plásmido, se designó como pABV463. La región de ORF7 codificada por los aminoácidos 80 a 90, se sustituyó por la correspondiente región del gen LDV-ORF7. El gen ORF del LV, se mutó, en una PCR, con los cebadores LV 101 (5' GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAAT
CAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCTTTCATCCA 3') y L112. El fragmento obtenido, se digirió con ClaI y PacI. Esto tuvo como resultado el pABV453. Finalmente, la región que codificaba a la parte terminal de la proteína N (aminoácidos 111-128) se reemplazó por una secuencia que codificaba a los correspondientes aminoácidos de la proteína N del LDV. El gen ORF7, se amplificó con cebadores LV108 y LV102 (5'ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAG
GAATTAGCAGAAGCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCAGCAACCGGCAG 3'), y se clonó con el vector pGEM-T, dando como resultado el pABV456. Estos genes de ORF7 del tipo salvaje y mutados, se escindieron de los pABV431, pABV453, pABV455, y PAB463, mediante digestión con PacI (con terminal embotado) y HpaI y del pABV456, mediante digestión con HpaI y SwaI. Estos genes, se insertaron, a continuación, en el sitio desfosforilado SmI, del vector de expresión del virus de Semliki Forest pSFV1. Los plásmidos pAB470, pAB460, pAB462, pABV518 y pABV471, que contenían los respectivos genes PRF7, en la orientación correcta, se sometieron adicionalmente a tests de ensayo, para la expresión con la proteína N. La transcripción y transfección in vitro del ORF7-RNA, del virus de Semliki Forest, fue de la misma forma que se la que se ha descrito anteriormente, arriba, para las construcciones de
SFV-ORF4.

Para clonar los genes ORF4 de diferentes aislamientos europeos, se procedió a infectar macrófagos, con NL1, NY2, DEN, FRA, SPA1, SPA2, y LUX y, el RNA, se aisló, tal y como se describe por parte de Meulenberg et al. (1993). Los genes ORF4, se amplificaron por mediación de RT-PCR, con los oligonucleótidos PRRSV13 y PRRSV14, y se clonaron con BamHI y HIndIII, en pGEM-4Z. Para cada cepa, se determinaron dos PCRs independientes. Las secuencias de proteínas derivadas de la secuencia nucleótida, se alinearon, utilizando el programa de alineamiento de secuencias CLUSTAL de PCGene (Intelligenetics Tm).

Transcripción y transfección in vitro del RNA de SFV-ORF4

Se procedió a linealizar plásmidos pSFV1, que contenían diferentes construcciones de ORF4, mediante digestión con Spel, y se transcribieron in vitro. El RNA sintetizado, se transfirió a las células BHK-21, en hoyos de 15 mm, de placas de veinticuatro hoyos, utilizando lipofectina. Las células, se fijaron con una mezcla de metanol/acetona al 50% (volumen/volumen), enfriada con hielo y, la proteína GP4 expresada por parte de diferentes construcciones de ORF4, se marcó (mediante tinción) con MAbs, en el ensayo monocapa de inmunoperoxidasa (IPMA). Para analizar los productos de expresión del ORF4, mediante inmunoprecipitación, se transfirieron 10^{7} células de BH K-21, con 10 \mug de RNA de SFV-ORF4, transcrito in vitro, mediante electroporación. Las células electroporadas, se colocaron en placas, en tres hoyos de 35 mm, de placas de seis hoyos y, 18 horas después de la transfección, se procedió a marcar las células.

Método de Pepscan

Se procedió a sintetizar un juego completo de nonapéptidos o dodecapépticos que se solapan, a partir de aminoácidos derivados de las secuencia ORF4 u ORF7 del PRRSV, tal y como se ha determinado previamente (Meulenberg et al., 1993). Las síntesis de péptidos de fase sólida, en barras de polietileno e inmuno-rastreo con un análisis del tipo de ensayo inmunoabsorbente unido a la enzima (ELISA), se llevaron a cabo, en concordancia con los procedimientos de PEPSCAN (Geysen et al., PNAS, 81, 3998-4002, 1984).

Resultados

Nosotros, hemos descrito, previamente, un panel de MAbs neutralizante, que reaccionaba con una proteína de 31 a 35 kDa del PRRSV, designada GP_{4} y un panel de Mabs reactivo con la proteína N, mediante análisis de Western blot (transferencia de Western). La GP_{4}, mostró ser una glicoproteína estructural codificada por la ORF4, y N, mostró ser la proteína nucleocápsida codificada por la ORF7. En experimentos de inmunoprecipitación con Mabs específicos de GP_{4}, la proteína GP_{4} derivada de lisados de células infectadas con el PRRSV, migraba como una banda discreta de 28 kDa, conjuntamente con un ligero frotis de un peso molecular aparente algo mayor. El MAbs, inmunoprecipitaba una proteína GP_{4} (glicosilada) difusa, de aproximadamente 31 kDA, procedente del medio extracelular infectado con PRRSV, pero no del medio extracelular de células ficticiamente infectadas.

Identificación del dominio neutralizante en GP_{4}

Nosotros, hemos demostrado, previamente, el hecho de que el MAbs específico para la proteína GP_{4}, reconocía a la I-1102, pero no al aislamiento US VR2332 (van Nieuwstadt et al., 1996). Con objeto de identificar el dominio de unión de los MAbs neutralizantes en la proteína GP_{4}, nosotros, hicimos proteínas de fusión de la proteína GP_{4} de I-1102 y VR2332. Estas proteínas, se expresaron en el sistema de expresión de virus de Semliki Forest, desarrollado por Liljeström et al. (Biotechnol., 9, 1356-1362, 1991). En primer lugar, la ORF4 de la I-1102, se clonó en pSFV1, dando como resultado el plásmido pABV265 (figura 1). El RNA transcrito a partir del pABV265, se transfectó a la células BHK-21 y, 24 horas después de la transfección de las células, se tiñeron positivamente, con el panel de quince MAbs neutralizantes. Los MAbs, no reaccionaron con las células BHK -21, transfectadas con pSFV1-RNA. La proteína recombinante GP_{4}, se inmunoprecipitó con MAb 126.1, a partir de células BHK-21 marcadas con L-[^{35}S]-metionina, transfectadas con pABV265-RNA. Ésta, tenía un tamaño similar a la de la GP auténtica, proteína sintetizada en células CL2621, infectadas con I-1102 y que contenían también N-glicanos PNGaseF- y EndoH-sensitivos. La proteína GP_{4} del VR2332, se clonó, también, en pSFV1, pero esta proteína, no se reconoció mediante los MAbs, después de la expresión en células BHK-21 (Fig. 1). Para localizar adicionalmente la región, en la proteína GP_{4}, reconocida mediante los MAbs, se construyeron cuatro genes quiméricos de ORF4, de las I-11022 y VR2332, en el PSFV1 (Fig. 1). Se procedió a transferir RNA transcrito a partir de los plásmidos pABV296, pABV305, pABV321, y pABV326, a células BHK-21, y se procedió a someter a test de ensayo, en IPMA, la reactividad de las proteínas expresadas con MAbs GP_{4}-específicos. El modelo patrón de estos quince MAbs, era idéntico, y éste indicaba el hecho de que, estos MAbs, se dirigían a una región de 40 aminoácidos, en la proteína GP_{4}; el producto de expresión del pABV326, consistente en los aminoácidos 40 a 79, derivados de la proteína GP_{4} del aislamiento CNCM I-1102 y circundado por secuencias derivadas de la proteína VR 2332-GP_{4}, se reconocía, todavía, mediante el panel de los MAbs. Con objeto de asegurar el hecho de que, las diferentes proteínas GP_{4}, especialmente, aquéllas que no se reconocen por los MAbs, se expresaban de una forma apropiada, en las células BKH21, éstas se inmunoprecipitaron a partir de lisados de células BHK-21, que se transfectaron con RNA transcrito in vitro, a partir de los plásmidos pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV321 y pABV326. La inmunoprotección, se llevó a cabo con suero anti-PRRSV porcino 21, Mab 126.1 y suero antipeptídico 698 y 700. El suero 700, se dirigió contra los aminoácidos 106-122 de la PRRSV-proteína GP_{4} del aislamiento CNCN I- 1102, una secuencia la cual era idéntica a la proteína GP_{4} del aislamiento ATCC-VR2332, aparte del aminoácido 121. Así, por lo tanto, todas las proteínas GP_{4}, se inmunoprecipitaron con suero 700. Éstas eran indistinguibles en cuanto a su tamaño, cuando se analizaron mediante SDS-PAGE, excepto en cuanto a lo referente a las proteínas GP_{4} expresadas por los pABV305 y pABV271, las cuales migraban de una forma ligeramente más rápida. Esto es debido, de la forma más probable, a la deleción de 4 aminoácidos en la secuencia VR2332, relativa a la secuencia I-1102, entre los aminoácidos 62-64 (figura 3). El juego completo de MAbs GF_{4}-específicos, reconocía a las proteínas GP_{4} expresadas a partir de los pABV265, pABV296, pABV321 y pABV326, pero no a las expresadas a partir de los pABV305 y pABV271, las cuales confirmaban los resultados obtenidos mediante IPMA (figura 3). El suero 698, tenía el mismo perfil de reacción que los MAbs. El suero 698, se dirige contra los aminoácidos 62 a 77 de la GP_{4} del PRRSV, los cuales se encuentran localizados dentro del ahora identificado dominio de neutralización de la proteína GP_{4}. Esta región, es altamente heterogénea en VR2332 ORF_{4} y, por lo tanto, los productos de expresión que contienen la secuencia VR2332, en esta región, no se reconocían por parte de este suero. No obstante, el suero porcino policlonal neutralizante, reconoce a la proteína GP_{4} I-1102, y a las proteínas GP_{4} quiméricas y a la proteína GP_{4} VR2332, indicando el hecho de que, en el suero porcino anti-PRRSV, se encuentran presentes una variedad de anticuerpos neutralizantes que se dirigen contra el sitio neutralizante formado por los aminoácidos 40 a 79 de la proteína GP_{4}.

Pepscan de las proteínas ORF4 y ORF7

Puesto que, los quince MAbs reactivos con las proteína ORF4, reaccionaban todos ellos con la proteína GP_{4}, en los análisis de western blot (transferencia western), éstos se expresaron, para reconocer un epítopo lineal, en una región que se extendía desde los aminoácido 40 al 79 de la GP_{4} del aislamiento I-1102. Con objeto de organizar adicionalmente el mapa de la región de unión de las MAbs, se procedió a realizar un análisis de PEPSCAN, utilizando nonapéptidos o docecapéptidos solapantes, en esta región. Se consideró que, los péptidos, representaban sitios antigénicos, si los picos, en tal tipo de juego, alcanzaban un valor de más de dos veces el de fondo, de una forma reproducible. Los MAbs 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7, 138-28, reaccionaban positivamente con un sitio específico antigénico, consistente en los aminoácidos 59 a 67 (SAAQEKISF) (figura 2). El MAb 122-12, reaccionó solamente de una forma débil, con este sitio antigénico, mientas que, los 7 MAbs restantes, fueron negativos, en el análisis de PEPSCAN. Los sueros policlonales porcinos, identificaban también a este sitio en el análisis de PEPSCAN. El suero neutralizante 21, tomado en la semana 6, después de la infección del cerdo 21, con PRRSV, reaccionó fuertemente y ampliamente con el sitio y sus regiones colindantes. Adicionalmente, además, los sueros porcinos policlonales neutralizantes (va12 y va14), tomados a 54 días después de la vacunación con virus del vector PRV-ORF4, y en el sacrificio a 30 días después del estímulo, en el día 54, con PRRSV, reaccionaban más fuertemente y de una forma más extensa, con el sitio de neutralización identificado en el análisis de PEPSCAN.

En el aislamiento I-1102, las secuencia núcleo del sitio de neutralización, comprende la secuencia de aa SAAQEKISF, localizada a partir de la posición 59-67. En otros aislamientos, la secuencia núcleo, puede encontrarse en la correspondiente posición de aa, ó alrededor de ésta, la cual es una secuencia de aminoácidos correspondiente al sitio de neutralización de la proteína GP_{4}, la cual comprende, por ejemplo, secuencias tales como las correspondientes a las SAAQEEISF, ó STAQENISF, ó STAQENIPF, ó SEESQSVT, ó SASEAIR, ó SASEAFR, ó PAPEAFR, ó PAPEAIR, ó SAFETFR, ó STSEAFR, pero debe esperarse que, otros aislamientos del PRRSV, tengan secuencias correspondientes pero ligeramente diferentes, del sitio de neutralización localizado en la posición de aa correspondiente a los aa 59-68 de la secuencia de aminoácidos del aislamiento I-1102 del PRRSV, ó a aproximadamente esta posición. Asimismo, pueden también introducirse fácilmente cambios artificiales que mantengan la antigenicidad y, así, de este modo, la funcionalidad de las secuencias núcleo anteriores, por parte de la persona experta comúnmente especializada en el arte de la técnica del diseño y la síntesis de péptidos. También, además, tal y como se demuestra claramente mediante la reactividad mucho más amplia en el análisis de PEPSCAN de los sueros policlonales neutralizantes, las secuencias de aa que comprenden secuencias núcleo de aa y secuencias de aa que lindan con las secuencias núcleo de los varios aislamientos del PRRSV, constituyen adicionalmente el sito de neutralización en la proteína ORF4 del PRRSV. De una forma especial, las secuencias localizadas en las posiciones correspondientes a aproximadamente los aa 40 a 79, constituyen el sitio de neutralización (figura 1). De nuevo, otra vez, pueden introducirse fácilmente cambios artificiales que mantengan la antigenicidad y, así, de este modo, la funcionalidad de los sitios antigénicos anteriores, por parte de la persona experta comúnmente especializada en el arte de la técnica del diseño y la síntesis de péptidos. También, además, considerando la amplia reactividad de los sueros neutralizantes policlonales va12 y va14 (figura 2), las secuencias de aa localizadas en las posiciones correspondientes desde aproximadamente los aa 52 a 75, constituyen, de una forma más específica, un sitio de neutralización ampliamente reactivo.

Los MAbs dirigidos contra la proteína ORF7, reaccionaron en cuatro grupos diferentes, en el análisis de PEPSCAN, grupo A(4), B(2), C(3), y D(1). El Grupo 1(D) (en el cual, entre otros, los MAbs 122.17, 130.3, 130.4, 131.7, VBE1, VBE4, VBE6, SDOW17 y que comprenden sitios reactivos no conservados), reaccionó con un epítopo conformacional no detectable en el PEPSCAN. El Grupo 2(B) (en el cual, entre otros, los MAbs 125.1, 126.9, NS25 y NS99, y reactivos con todos los aislamientos de PRRSV sometidos a test de ensayo, identificando, con ello, un sitio antigénico conservado), identifica a una secuencia núcleo VNQLCQLGA (encontrada en el aislamiento I-1102, desde la posición de aa 22 a 32) ó VNQLCQMLGK. El Grupo 3(C) (en el cual, entre otros, el MAb 126.15 y, principalmente reactivo con las cepas del PRRSV aisladas en Europa, identificando, con ello, un sitio antigénico de diferenciación), identifica a la secuencia núcleo PRGGQAKKKK (encontrada en el aislamiento I-1102, desde la posición de aa 41 a aproximadamente 50) ó PRGGQAKRKK ó PRGGQAKKRK ó GPGKKNKKKN ó GPGKKNKKKT ó GPGKKNRKKN ó GPGKKFKKKN ó GPGKKIKKKN ó GPGQINKKIN. El Grupo 4(A) (en el cual, entre otros, el MAb 138.22 y, principalmente reactivo con las cepas del PRRSV aisladas en Europa, identificando, con ello, un sitio antigénico de diferenciación), identifica a la secuencia núcleo NAGKNQSQKK (encontrada en el aislamiento I-1102, desde la posición de los aa de la posición 1 a aproximadamente 10) ó MPNNNGKQTE ó MPNNNGKQPK Ó MPNNNGKQQK ó MPNNNKGQQN ó MPNNNGKQQK ó MPNNNGRQQK. Asimismo, pueden también introducirse fácilmente cambios artificiales que mantengan la antigenicidad y, así, de este modo, la funcionalidad de los sitios antigénicos, en la proteína N, por parte de la persona experta comúnmente especializada en el arte de la técnica del diseño y la síntesis de péptidos. A pesar del hecho de que, el grupo 1, no constituye epítopos lineales, la comparación de las secuencias de aa de PRRSV, con las secuencias de LV, muestra el hecho de que pueden encontrarse epítopos de conformación (los cuales varían ampliamente, entre los varios aislamientos), en las posiciones correspondientes a aquéllas encontradas en el aislamiento I-1102, desde la posición de aa 51 a aproximadamente 68 (en el aislamiento I-1102, la secuencia de aa PKPHFPLAAEDDIRHHL) ó desde 79 a aproximadamente 90 (en el aislamiento I-1002 de la secuencia de aa SIQTAFNQGAGT) ó desde 111 a 124 (en el aislamiento I-1002 de la secuencia de aa HTVLIRVTSTSAS). Asimismo, pueden también introducirse fácilmente cambios artificiales que mantengan la antigenicidad y, así, de este modo, la funcionalidad de los sitios de epítopos de conformación, en la proteína N, por parte de la persona experta comúnmente especializada en el arte de la técnica del diseño y la síntesis de péptidos, especialmente, con información recolectada mediante comparación de secuencias de aislamientos de PRRSV, y mediante comparación con secuencias de proteína N de otros arterivirus. Esto, se determinó en las proteínas quiméricas de expresión ORF7 LDV/PRRSV, en el sistema de expresión de SFV (realizado tal y como se describe anteriormente, arriba, para la ORF7) y determinando su reactividad con MAbs procedentes del grupo 1.

Proteínas N quiméricas

Se procedió a organizar adicionalmente el mapa del dominio D, con construcciones de proteínas quiméricas de expresión ORF7. Puesto que, de 6 a 10 MAbs dirigidos contra el dominio D, reconocían a ambos tipos de aislamientos, del PRRSV, los aislamientos europeos y los aislamientos norteamericanos, se procedió a mutar las regiones que se conservaban de una forma mayor, entre la proteína N de LV y el prototipo norteamericano VR232 (figura 4). La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 51 a 67, 80 a 90, y 111 a 128, se sustituyó por una secuencia que codifica para los correspondientes aminoácidos de LDV (figura 4). Para completar, se procedió a mutar el sitio B (aminoácidos 25-30) que también se conserva en los aislamientos europeos y norteamericanos. Puesto que, la secuencia de aminoácidos de la proteína N del LV, era muy similar a la proteína N de LDV, en el sitio B, esta región de la proteína N de LV, se sustituyó por una región que codificaba a los correspondientes aminoácidos de la proteína N de EAV (figura 4). Cuando las proteínas N mutadas y del tipo salvaje, se expresaron en células BHK 21, utilizando el sistema de expresión de virus de Semliki Forest, y éstas se sometieron a tests de ensayo con MAbs N-específicos, en IPMA, los MAbs D-específicos, reaccionaron idénticamente (tabla 1). Su unión, se interrumpió mediante mutaciones entre los aminoácidos 51-67 y 80-90, pero no mediante mutaciones entre los aminoácidos 111-128, ó los aminoácidos 25-30 (sitio B). Tal y como se esperaba, las proteínas N, con secuencias de LDV entre los aminoácidos 51-67 y 80-90, se encontraban todavía marcados (teñidas) mediante los MABs dirigidos contra los sitios A, B y C. No obstante, el número de células que se encontraban marcadas (teñidas), y la brillantez de esta tinción de marcación, era inferior al observado para la proteína N del tipo salvaje y las proteínas N mutadas en los aminoácidos 25-30 (sitio B) ó en los aminoácidos 111-128 (tabla 1). Esto era debido, más probablemente, a una baja expresión de las proteínas N que contienen mutaciones entre los aminoácidos 51-67 ó 80-90, mientras que se obtuvo también un menor rendimiento productivo de estas proteínas N mutantes, comparado con los de otras proteínas N, cuando se tradujeron, in vitro, cantidades iguales de transcriptasa (datos no mostrados). Tal y como se esperaba, la proteína N que contenía secuencias de EAV en el sitio B, no se reconoció mediante organización de mapas de MAbs en el sitio B (mediante análisis de pepscan), pero éstas se reconocían todavía, mediante MAbs que organizaban el mapa de los sitios A, C ó dominio D. Estos datos, indican el hecho de que, los epítopos cuyo mapa se organizaba, para el dominio D, son dependientes de la conformación, y consisten (parcialmente) en los aminoácidos 51-67 y 80-90.

Análisis de la secuencia de la proteína GP_{4} de diferentes cepas de PRRSV

Para analizar el hecho de si, el sito de neutralización antigénico mayor, reconocido por los anticuerpos GP_{4}-específicos, se conservaba, entre los diferentes aislamientos de PRRSV, la reactividad y actividad neutralizante de los MAbs, se sometieron adicionalmente a test de ensayo, en siete cepas europeas diferentes. Los resultados obtenidos, indicaban que, estos MAbs, reconocían y neutralizaban a otra cepa NL1 holandesa, y a una cepa NY inglesa, pero no al aislamiento DEN danés, dos cepas SPA1 y SPA2 españolas, un aislamiento FRA francés, y un aislamiento LUX en Luxemburgo. Así, por lo tanto, nosotros, estábamos interesados en la secuencia de aminoácidos, en la región del sitio de neutralización de la proteína GP_{4} de estos aislamientos. Los genes ORF4, se clonaron por mediación de RT-PCR, utilizando cebadores derivados de las secuencia de PRRSV, y se procedió a determinar la secuencia nucleotídica. La secuencia de aminoácidos de la proteína GP_{4} de diferentes aislamientos derivados de esta secuencia nucleotídica, era en un 86 a un 97%, idéntica, con respecto a la de la I-1102. El alineamiento de esta secuencia de aminoácidos, mostraba el hecho de que, el sitio de neutralización (aminoácidos 40 a 79) es mucho más divergente que el de la parte restante de la proteína. En esta región, especialmente, las secuencias de aminoácidos de las cepas DAN, SPA1, SPA2, y FRA, son diferentes. Esto se encuentra en línea con el descubrimiento de que, estas cepas, no se neutralizan mediante el MAbs I-1102-específico, y confirma adicionalmente el hecho de que, ese sitio, no se conserva de una forma muy amplia, entre los aislamientos europeos. Se observó otra región de mayor heterogenicidad, en la parte N-terminal de la proteína GP_{4}. La comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína GP_{4} del PRRSV y la de la VR2332 y otras cepas norteamericanas, muestra el hecho de que, éstas últimas, son también heterogéneas en el sitio de neutralización de la proteína. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos, tiene como resultado la introducción de una brecha, en el sitio de neutralización de los aislamientos norteamericanos (figura 3), lo cual se encuentra en concordancia con las observación del hecho de que, no se reconoce ninguno de estos aislamientos, mediante los MAbs. Globalmente, se observó una mayor diversidad, entre las secuencias de los aislamientos americanos, que entre las secuencias de los aislamientos europeos.

Esto se encuentra en línea con los rasgos distintivos característicos para una envoltura víricas típica, identificada, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos de la GP_{4}.

El potencial del sitio de neutralización para el desarrollo de la vacuna, es de la mayor importancia, en vistas a la heterogenicidad del sitio de neutralización. La comparación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas GP_{4} de diferentes cepas europeas, indicaba el hecho de que, el sitio de neutralización, era mucho más variable que otras partes de la proteína, sugiriendo el hecho de que, este sitio, es susceptible de inmunoselección. La comparación de las secuencias de los sitios de neutralización, de las cepas europeas y norteamericanas, exhibía una brecha de 4 aminoácidos en las secuencias norteamericanas, con respecto a las europeas, ilustrando adicionalmente la extensa variabilidad de los aminoácidos del ahora identificado sitio de neutralización del PRRSV.

El sitio de neutralización de la proteína GP_{4} aquí descrito, es el primer sitio identificado para virus de Lelystad. Para otros dos arterivirus, EAV y LDV, los MAbs de neutralización que se aislaron, se dirigieron todos contra la proteína codificada por ORF5 (Deregt et al., 1994; Glaser et al., 1995; Balasuriya et al., 1995; Harty and Plagemann, 1988). Utilizando mutantes de neutralización - escape, se procedió a organizar el mapa del sitio de neutralización del EAV, para aminoácidos específicos, en el ectodominio de G_{1}.

Se procedió a realizar comparaciones de secuencias, para la proteína ORF7 del PRRSV (figura 4), que ilustran adicionalmente la extensa variabilidad de aminoácidos de los ahora identificados sitios antigénicamente conservados y sitios antigénicamente no conservados del PRRSV. En este trabajo, nosotros, identificamos cuatro sitios antigénicos distintos, en la proteína N del PRRSV. Tres sitios, designados como A B y C, contienen epítopos lineales y, para éstos, se organizó un mapa entre los aminoácidos 2- 12, 25-30, y 40-46, respectivamente. Como contraste de ello, el cuarto sitio, designado como dominio D, contiene epítopos dependientes de conformación, los cuales se encuentran (parcialmente) compuestos por los aminoácidos 51-67 y 80-90. Los sitios A y C, contienen epítopos que se conservan en los aislamientos europeos del PRRSV, pero no en los aislamientos norteamericanos del PRRSV, mientras que, el sitio D, contiene ambos epítopos, los cuales se conservan, y no se conservan, en los aislamientos europeos y los aislamientos norteamericanos, del PRRSV. Los sitios conservados en la proteína N aquí descrita, son de gran importancia en el desarrollo de los tests de ensayo de diagnóstico dirigidos a la diagnosis inequívoca de las infecciones por PRRSV, debiendo evitar, estos tests de ensayo de diagnóstico, el empleo de sitios no conservados, evitando, con ello, resultados falsos negativos. Adicionalmente, además, el conocimiento sobre los varios sitios conservados, es altamente valioso en el desarrollo de tests de ensayo de diferenciación, los cuales pueden por ejemplo discriminar a los cerdos vacunados, de los cerdos infectados con los aislamientos del tipo salvaje del PRRSV.

Leyenda

Figura 1

Diagrama esquemático de las proteínas G, expresadas en el pSFV1 y su reactividad con MAbs GP_{4}-específicos.

Los nombres de los plásmidos que contienen los diferentes genes de la ORF_{4}, se encuentran indicados. Las barras abiertas, representan las secuencias de aminoácidos derivadas de la proteína G, codificada por la ORF4 del PRRSV, las barras negras, representan las secuencias de aminoácidos derivadas de la proteína G codificada por la ORF4 del VR2332. Los números de los aminoácidos, se indican por encima de las barras. Los genes, se insertaron, en primer lugar, en el PGEM-4Z y, después, se transfirieron al PSFV1, tal y como se describe, en detalle, en la sección de materiales y métodos. El juego completo de 14 MAbs GP_{4}-específicos, reaccionó idénticamente con los constructores diferentes en IPMA y, la reactividad, se indica como positiva (+) y negativa (-).

Figura 2

Análisis de los MAbs GP_{4}- específicos y sueros policlonales con péptidos de solapado de 12 meros, que cubren los residuos 25 a 94 de la GP_{4}.

Se muestra (2 A), la exploración de los Mabs 130.7 y Mab 138.28, los cuales reconocen a cuatro péptidos consecutivos. Otros cinco MAbs (122.29, 122.30, 122.66, 122,71 y 183.28), exhibían una especificidad similar. Las exploraciones de los sueros policlonales procedentes de dos cerdos, antes de la inmunización (va12-0, va14-0), después de la inmunización con un vector del virus pseudorabies que expresaba la ORF4 (va12-54 y va14-s1), se muestran en las figuras (2 A y 2 B), y la exploración del suero anti-LV porcino polivalente 21 (VA21), se muestra en la figura (2D9. la secuencia de aminoácidos de los péptidos reactivos, se muestra con el núcleo de residuos comunes encerrados.

Figura 3

Alineamiento de secuencias de aminoácidos de las proteínas GP_{4} (A) y N (B), de varias cepas de PRRSV.

Únicamente se muestran los aminoácidos que difieren de la secuencia I-1102. Las secuencias peptídicas reconocidas por los Mabs y/o sueros policlonales, en el análisis de pepscan, se subrayan.

Figura 4

Localización de sitios antigénicos de unión en la secuencia de proteína N y comparación con la secuencia de proteína N con las de las cepas norteamericanas VR2332 y LDV.

Los sitios antigénicos A, B y C, y dominio D, se muestran en sombreado. Los sitios A, B y C, se identificaron en análisis de pepscan, el sitio D, se identificó mediante construcción de proteínas N quiméricas. Las secuencias de aminoácidos del LV, las cuales se sustituyeron por las correspondientes secuencias de aminoácidos del LDV, con objeto de organizar el mapa del dominio D, se encuentran subrayadas. Los aminoácidos de la proteína N del EAV, que se insertaron entre los aminoácidos 25-30, para mutar el sitio B, se muestran debajo de la secuencia del LDV. Los aminoácidos idénticos, se conectan con barras verticales.

TABLA 1 Tinción de proteínas N quiméricas, expresadas mediante el virus de Smiliki forest, en células de BHK-21, en IPMA

1

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TABLA 2 Secuencia de cebadores utilizados en la PCR, para clonar los genes ORF4 de los LV y VR2332 y genes ORF-4 quiméricos, en los vectores de los plásmidos pGEM-4Z y pSFV1

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}   \begin{minipage}[t]{145mm} Los nucleótidos subrayados
en estos cebadores, se encuentran mutados, con respecto a la
secuencia original, para crear sitios de restricción o secuencias
que se proyectan, o para impedir largos tramos de un nucléotido
particular. Los sitios de restricción, en los cebadores, se muestran
en
bastardilla.\end{minipage} \cr}

Claims (4)

1. Un péptido de 10-15 residuos de aminoácidos que logra anticuerpos que reaccionan con por lo menos dos diferentes aislamientos de PRRSV, comprendiendo, el péptido, las secuencia VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK, ó el péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada mediante cambios artificiales o sustitución de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos correspondiente al sitio conservado de la proteína N del PRRSV, seleccionándose el sitio conservado, de entre las VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK, en donde, el citado péptido, reacciona con los anticuerpos monoclonales que enlazan a péptidos que tienen la secuencia VNQLCQLLGA ó VNQLCQMLGK.

2. Un anticuerpo reactivo, según la reivindicación 1.

3. Un equipo de test de ensayo de diagnóstico, a modo de kit, para la detección o la identificación de anticuerpos dirigidos contra el aislamiento del PRRSV, que comprende por lo menos un péptido de la reivindicación 1, conjuntamente con medios apropiados para la detección.

4. Un equipo de test de ensayo de diagnóstico, a modo de kit, para la detección o la identificación de anticuerpos dirigidos contra un antígeno derivado del aislamiento del PRRSV, que comprende un anticuerpo según la reivindicación 2, conjuntamente con medios apropiados para la detección.