ES2553879T3 - Procedimiento para la producción a escala comercial de PRRSV - Google Patents

Abstract

Un método para la producción a escala comercial de virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV), que comprende: a) al mismo tiempo, sembrar un medio de cultivo a gran escala con una línea de células de mamífero que es permisiva a una infección por el PRRSV en un biorreactor e infestar dichas células de mamífero con un PRRSV; b) propagar el virus durante 5 a 7 días post-infección; c) llevar a cabo una primera etapa de recolección separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado; d) reponer el medio en dicho biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 días; e) llevar a cabo una segunda etapa de recolección separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado; f) reponer el medio en dicho biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 días; y g) llevar a cabo una tercera etapa de recolección separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la produccion a escala comercial de PRRSV Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a la produccion a escala comercial del virus del Smdrome Reproductor y Respiratorio Porcino (PRRSV - siglas en ingles) vivo atenuado, el cual se puede utilizar en la produccion de vacunas basadas en el mismo, y al uso del mismo en el tratamiento de cerdos.

Antecedentes de la invencion

El smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS - siglas en ingles) es considerado por muchos como la enfermedad mas importante que afecta actualmente a la industria porcina en todo el mundo. El smdrome fue descubierto primero en 1987 en los Estados Unidos como la "enfermedad misteriosa del cerdo" y se propago rapidamente por todo el globo. Esta enfermedad provoca perdidas graves en la reproduccion, esta asociada con una mortalidad incrementada debido a infecciones secundarias y esta ligada a una conversion reducida en la alimentacion y a una ganancia en peso media diaria. Desgraciadamente, se ha manifestado difmil el control del virus que provoca el PRRS.

El virus del PRRS (PRRSV) es un virus de ARN de una sola cadena con envoltura, clasificado en la familia Arteriviridae (Cavanaugh, 1997). Causa una enfermedad del cerdo muy extendida que se describio por primera vez como la "enfermedad misteriosa del cerdo" en EE.UU. en 1987 (Hill, 1990). La enfermedad se manifiesta como una enfermedad respiratoria en todos los grupos de edad del cerdo, que conduce a la muerte en algunos cerdos mas jovenes y a problemas reproductivos graves en hembras en edad de reproduccion.

La transmision del PRRSV puede, y a menudo ocurre a traves del contacto directo entre cerdos infectados y susceptibles. Tambien puede producirse una transmision a distancias muy cortas por el aire o a traves del semen. Una vez infestado, el virus puede permanecer en la sangre de adultos durante aproximadamente dos a cuatro semanas, y en cerdos infestados durante uno o dos meses o mas. Verracos infestados pueden esparcir el virus en el semen durante mas de 100 dfas. Este largo periodo de viremia aumenta significativamente la posibilidad de transmision. Ademas, el virus del PRRS puede atravesar la placenta durante el ultimo tercio del periodo de gestacion para infestar a cochinillos en el utero y provoca partos muertos o cochinillos nacidos debiles.

Todos los tipos y tamanos de rebanos, incluidos aquellos con un estado de salud alto u ordinario o de unidades bajo techado o al aire libre pueden ser infestados con virus del PRRS. Los rebanos infestados pueden experimentar perdidas de reproductividad graves, asf como niveles incrementados de neumoma post-destete con un desarrollo deficiente. La fase reproductora dura tfpicamente de dos a tres meses; sin embargo, a menudo los problemas post- destete se vuelven endemicos. La enfermedad reproductora se caracteriza por un brote de aborto que afecta tanto a las cerdas como a las lechonas en el ultimo tramo de gestacion. Se producen lechigadas prematuras en torno a los 109 y 112 dfas de gestacion. Aumenta el numero de partos muertos y de cochinillos nacidos debiles, y resulta en un considerable incremento en la mortalidad pre-destete.

Tradicionalmente, la fase respiratoria ha sido observada en los neonatales, especialmente en neonatales de flujo continuo. Sin embargo, los problemas respiratorios provocados por el virus del PRRS tambien pueden observarse en el engorde final como parte de la enfermedad complejo respiratorio porcino (PRDC - siglas en ingles). Pueden producirse una reduccion en la tasa de desarrollo, un aumento en el porcentaje de cerdos no comerciables y una elevada mortalidad post-destete. Hallazgos diagnosticos indican elevados niveles de neumoma que se asocian con el virus del PRRS, junto con una amplia diversidad de otros microbios que se observan comunmente como agentes infecciosos secundarios. Aislados bacterianos pueden incluir Streptococcus suis, Haemophilus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Pasteurella multocida, entre otros. Agentes vmcos comunmente implicados incluyen el virus de la influenza porcina y el coronavirus respiratorio porcino. Los cerdos afectados rara vez responden a altos niveles de medicacion y han fracasado sistemas de ingreso/salida en el control de la enfermedad.

El virus existe en forma de dos genotipos denominados tipo „US" y tipo „EU" que comparten aproximadamente el 50% de homologfa de secuencia (Dea S y col. (2000). Arch Virol 145:659-88). Estos dos genotipos tambien se pueden distinguir por sus propiedades inmunologicas. La mayor parte de la informacion de la secuenciacion de diversos materiales aislados se basa en las protemas estructurales, es decir, la protema de la envoltura GP5 que justifica solo el 4% del genoma vmco, mientras que se conoce solo poco de las protemas no estructurales (nsp, del ingles " non-structural proteins"). El aislamiento de PRRSV y la preparacion de vacunas se han descrito en diversas publicaciones (documentos WO 92/21375 , WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930).

La vacunacion es el metodo clave para aliviar la carga del PRRS, dado que cerdos que se recuperan de una infeccion por el PRRS desarrollaran una respuesta inmune, la cual, bajo circunstancias normales, les protegera de ser infestados de nuevo por la misma cepa de virus. Sin embargo, el virus del PRRS tiene la capacidad de cambiar debido a la alta tasa de mutacion que a menudo se produce en virus de ARN positivos, de cadena sencilla; y, por lo

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tanto, pueden surgir nuevas cepas de virus. En tales casos, puede no existir una produccion cruzada entre cepas, y pueden observarse nuevos brotes en granjas que habfan sido infestadas previamente. As^ existe una necesidad continua de vacunas adicionales.

El metodo mas frecuentemente utilizado para producir vacuna contra el virus vivo atenuada consiste en hacer pasar el virus en serie en un sustrato (habitualmente un cultivo celular con una lmea de celulas que es permisiva al virus) que no sea el hospedante natural (S) hasta que este lo suficientemente atenuada (es decir, reducida en la virulencia o capacidad productora de enfermedades) a ser utilizado como una vacuna. Para el primer paso, el cultivo celular se infesta con el inoculo seleccionado. Despues de obtener clara evidencia de la replicacion del virus (p. ej. efectos citopaticos [CPE - siglas en ingles] inducidos por el virus en las celulas infestadas), se utiliza una parte almuota del medio de cultivo celular, o de las celulas infestadas, o ambos, del primer paso para infestar a un segundo cultivo celular. El proceso se repite hasta que una o mas mutaciones cnticas en el genoma viral provoque una atenuacion suficiente, de modo que el virus se pueda utilizar de forma segura como una vacuna. El grado de atenuacion se determina, habitualmente, de forma empmca exponiendo al hospedante natural (S) a niveles de paso del virus progresivamente mayores.

El proceso anterior es fundamentalmente solido y ha sido utilizado con exito para el desarrollo de numerosas vacunas para uso humano y veterinario. Sin embargo, cuando se trata de una produccion a escala industrial, sigue existiendo la necesidad de proporcionar un metodo para la produccion de PPRSV eficaz y economico.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un nuevo metodo para la produccion de virus del PRRS vivo para uso en la fabricacion de vacunas de este tipo. Los metodos descritos en esta memoria se pueden utilizar en la produccion a gran escala de cualquier virus del PRRS, que incluyen, pero no se limitan a la cepa 94881 de PPRSV, PRRSV 94881, depositada ante la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC) bajo los Numeros de Acceso ECACC 11012501 y ECACC 11012502, cada una depositada el 25 de enero de 20ll de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest, o cualquier descendencia o progenie de una de las cepas antes mencionadas.

Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion a escala comercial de virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV), que comprende:

a) al mismo tiempo, sembrar un medio de cultivo a gran escala con una lmea de celulas de mairnfero que es permisiva a una infeccion por el PRRSV en un biorreactor e infestar las celulas de mamffero con un PRRSV.

b) propagar el virus durante 5 a 7 dfas post-infeccion;

c) llevar a cabo una primera etapa de recoleccion separando el medio del biorreactor y aislar del mismo el virus propagado;

d) reponer el medio en el biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 dfas;

c) llevar a cabo una segunda etapa de recoleccion separando el medio del biorreactor y aislar del mismo el virus

propagado;

f) reponer el medio en el biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 dfas; y

c) llevar a cabo una tercera etapa de recoleccion separando el medio del biorreactor y aislar del mismo el virus

propagado.

En determinadas realizaciones, el metodo puede comprender, ademas, al menos una etapa de re-alimentacion y de recoleccion subsiguientes a la tercera etapa de recoleccion, que comprende reponer el medio en el biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 dfas, y realizar una cuarta etapa de recoleccion separando el medio del biorreactor y aislando del mismo el virus propagado.

Preferiblemente, en el metodo de produccion la multiplicidad de infeccion (MOI - siglas en ingles) diana es 0,01 a 0,30 y las celulas de marnffero son sembradas a una densidad de aproximadamente 7 x 108 a 1,0 x 109 por cada biorreactor de 300 L. Mas particularmente, la densidad de siembra de las celulas es de aproximadamente 1,0 x 109 por cada biorreactor de 300 L. En realizaciones espedficas, la MOI es de aproximadamente 7 x 108 partmulas de virus.

El metodo puede comprender vigilar la concentracion de dextrosa del medio, en el que la primera etapa de recoleccion se realiza el primer dfa cuando la concentracion de dextrosa del medio disminuye a menos de 0,1 g/L.

En el metodo de produccion comercial, la segunda recoleccion se realiza preferiblemente 1 o 2 dfas post-re- alimentacion con medio, y la tercera recoleccion se realiza 1 a 4 dfas despues de la segunda re-alimentacion con el medio.

En realizaciones espedficas, el medio de cultivo se anade al biorreactor el dfa antes de o el mismo dfa antes de la

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adicion de la lmea de celulas de mamHfero y el PRRS. Preferiblemente, el medio de cultivo se anade al biorreactor un dfa antes de la adicion de la lmea de celulas de mamnfero y el PRRS. La temperatura del biorreactor se establece entre 34°C y 38°C.

En realizaciones espedficas, el medio comprende suero de ternero fetal al 5% v/v, irradiado.

El metodo se puede utilizar para la produccion a escala comercial de cualquier PRRSV, que incluye, pero no se limita a PRRSV seleccionado del grupo que consiste en la cepa 94881 de PPRSV, PRRSV 94881, depositada ante la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC) bajo los Numeros de Acceso ECACC 11012501 y ECACC 11012502, cada una depositada el 25 de enero de 2011 de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest, VR 2332, la cepa del virus Lelystad (Agente Lelystad (CDI-NL-2.91), u otras cepas tales como las depositadas bajo los Numeros de Acceso ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM N° de Acceso I-1140, CNCM N° de Acceso No I-1387, CNCM N° de Acceso I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 y VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 o ECACC V93070108; deposito ATCC VR-2332, deposito ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 y ATCC VR 2402, o cualquier descendencia o progenie de una de las cepas antes mencionadas.

Tambien se contempla un metodo de produccion a escala comercial para la preparacion de un PRRSV, que comprende:

a. una siembra simultanea tanto de celulas de mamnfero permisivas a la infestacion por el PRRSV como del PRRSV en un biorreactor que contiene un medio adecuado para el crecimiento de las celulas; y

b. realizar tres etapas consecutivas de recoleccion, en donde se recolecta PRRSV, en donde, despues de cada una de las primera y segunda recolecciones, se repone el medio, y en donde:

i. la primera recoleccion se realiza el primer dfa en el que la concentracion de dextrosa del medio desciende a menos de 0,1 g/L;

ii. la segunda recoleccion se realiza 1 o 2 dfas despues de la adicion del medio tras la primera recoleccion; y

iii. la tercera recoleccion se realiza entre 1 y 4 dfas despues de la adicion del medio tras la segunda recoleccion. Se contempla tambien un metodo alternativo que utiliza al mismo tiempo un proceso de frasco rodante que es equivalente al proceso del biorreactor arriba descrito. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion a escala comercial de virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV), que comprende:

a) al mismo tiempo, sembrar un medio de cultivo a gran escala con una lmea de celulas de mamffero que es permisiva a una infeccion por el PRRSV en frascos rodantes e infestar dichas celulas de mamffero con un PRRSV;

b) propagar el virus durante 5 a 7 dfas post-infeccion;

c) realizar una primera etapa de recoleccion separando el medio de dicho frasco rodante y aislar del mismo el virus propagado;

d) reponer el medio en dicho frasco rodante y propagar el virus durante aproximadamente 2 dfas;

e) llevar a cabo una segunda etapa de recoleccion separando el medio de dicho frasco rodante y aislar del mismo el virus propagado;

f) reponer el medio en dicho frasco rodante y propagar el virus durante aproximadamente 2 dfas y

g) realizar una tercera etapa de recoleccion separando del biorreactor el medio y aislando del mismo el virus propagado.

Otro aspecto de la descripcion se refiere a un PRRSV MLV, que comprende un PRRSV producido de acuerdo con los metodos descritos en esta memoria, formulados con un adyuvante o soporte aceptable para su administracion a un cerdo.

Breve descripcion de las diversas vistas de los dibujos

Figura 1: Proceso simultaneo para la produccion a gran escala de PRRSV 94881.

Figura 2: Definicion y secuencias temporales del proceso simultaneo para los Biorreactores de 300 L

Figura 3: Tftulos virales y perfiles de dextrosa para las tres operaciones simultaneas en los Biorreactores de 300 L.

Figura 4: Figura 4: Tftulos virales y perfiles de glutamina para las tres operaciones simultaneas en los Biorreactores de 300 L.

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Figura 5: Figura 5: Tftulos virales y perfiles de DO para las tres operaciones simultaneas en los Biorreactores de 300 L.

Figura 6: Muestra los resultados de la RT-PCT PCR en el tiempo que representan el % de viremia en animales vacunados con PRRSV 94881.

Figura 7: Proceso simultaneo para la produccion en frascos rodantes de PRRSV 94881.

Figura 8: Definicion y secuencias temporales del proceso simultaneo para el proceso en frascos rodantes. Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona metodos para la produccion a gran escala de virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV) para uso en la produccion de vacunas y otras composiciones. En metodos de produccion tfpicos, el virus se desarrolla en una lmea de celulas que es permisiva a la infeccion por PRRSV. Sin embargo, en metodos generales de este tipo, la lmea de celulas se desarrolla en o cerca de la confluencia antes de la infestacion con el PRRSV. En la presente invencion, los autores de la invencion han demostrado, de manera inesperada, que la lmea de celulas no necesita ser sembrada ni hecha crecer antes de la infestacion con PRRSV, sino que el PRRSV y la lmea de celulas se pueden anadir al proceso del cultivo de celulas al mismo tiempo. Asf, esta invencion proporciona la importante ventaja de ahorro de tiempo, coste y materiales cuando el virus se produce en masa a escala comercial. La expresion escala comercial se refiere a volumenes de cultivo celular superiores a 10 L. Por ejemplo, la escala comercial se refiere a un intervalo de escala de produccion de 10 L a 3000 L para PRRSV vivo. En aspectos mas espedficos, el volumen es de 30 L a aproximadamente 300 L.

Los metodos de la presente invencion se pueden utilizar para la produccion de cualquier cepa de PRRSV, que incluye pero no se limita a las cepas de PRRSV depositadas como ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 y VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 o ECACC V93070108. En aspectos particularmente preferidos, los metodos de la invencion se utilizan para producir la cepa 94881 de PRRSV, depositada por Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Alemania, en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down, Salisbury, 30 Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretana, con los Numeros de Acceso ECACC 11012501 (cepa parental) y ECaCc 11012502 (MSV atenuado de elevado paso), cada una depositada el 25 de enero de 2011 de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, o cualquier descendencia o progenie de una de las cepas antes mencionadas. Los virus desarrollados pueden ser cualquiera de los virus antes mencionados, en su formato atenuado. Alternativamente, los virus pueden estar geneticamente modificados de modo que comprendan uno o mas acidos nucleicos heterologos que codifican determinantes antigenicos adicionales de uno o mas enfermedades del cerdo.

La persona experta comprendera que existe un cierto numero de lmeas celulares que son permisivas a la infestacion por parte de PRRSV. Celulas a modo de ejemplo son celulas de macrofagos alveolares porcinas tales como las derivadas de celulas MARC-145. Otras celulas que se pueden infestar con el PRRSV incluyen celulas MA-104; celulas de rinon de hamster bebe (BHK - siglas en ingles); celulas de ovario de hamster chino (CHO); y celulas de rinon de mono verde africano que no sean celulas MA-104 ni celulas MARC-145 tales como celulas VERO; que son trasnfectadas. Ademas, las celulas pueden ser celulas primarias procedentes de un cerdo que han sido adaptadas para el crecimiento a largo plazo en cultivo. Celulas hospedantes particularmente adecuadas son la lmea de celulas de simio MA-104, celulas Vero, o macrofagos alveolares porcinos. El PRRSV crece preferentemente en macrofagos de pulmon alveolares (Wensvoort et al., 1991). Unas pocas lmeas de celulas tales como CL2621 y otras lmeas de celulas clonadas de la lmea de celulas de rinon de mono MA-104 (Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993) son tambien susceptibles al virus y se pueden utilizar en metodos de produccion a gran escala descritos en esta memoria.

En el metodo a modo de ejemplo de la presente invencion mostrado en el Ejemplo 1 que figura mas abajo se proporciona un proceso simultaneo para la produccion de MLV 94881 de PRRSV. Mientras que este proceso se muestra para mLv 94881 de PRRSV, la persona experta comprendera que este proceso se puede utilizar facilmente para cualquier PRRSV para el que se requiera una produccion a gran escala.

Los virus producidos mediante el metodo de produccion de la invencion se pueden utilizar para aplicaciones para las que se utiliza actualmente el PRRSV. En un aspecto espedfico, el virus producido de acuerdo con los metodos descritos en esta memoria se utiliza para preparar un MLV de PRRSV.

Las cepas de virus desarrolladas de acuerdo con los metodos de la invencion pueden ser virus PRRS virulentos, virus PRRS atenuados o, de hecho, virus de PRRS que han sido modificados para impartirles propiedades adicionales deseables. Esto se puede conseguir mediante tecnicas convencionales de propagacion y seleccion, tales como la propagacion continuada en celulas hospedadoras adecuadas para extender el fenotipo atenuado. Alternativamente, las cepas pueden ser modificadas geneticamente por mutacion dirigida a la secuencia de acido nucleico del genoma de estas cepas mediante tecnicas adecuadas de ingeniena genetica. Se secuencio el genoma de PRRSV por completo o parcialmente (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a, Murthaugh et al, 1995) y codifica, ademas de la aRn polimerasa dependiente de ARN (ORFs 1a y 1b), seis protemas estructurales, de las cuales cuatro son glicoprotemas con cubierta denominadas GP2 (ORF2), Gp3 (ORF3), GP4 (ORF4) y GP5 (ORF5),

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una protema de la membrana no glicosilada M (ORF6) y la protema N de la nuclecapsida (ORF7) (Meulenberg et al. 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996). La caracterizacion inmunologica y la secuenciacion de nucleotidos de las cepas europea y de EE.UU. de PRRSV han identificado diferencias antigenicas menores dentro de las cepas de PRRSV localizadas en las protemas virales estructurales (Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995).

De hecho, el virus a modo de ejemplo desarrollado en la invencion es el virus PRRSV 94881. Mientras que una cepa atenuada se desarrolla utilizando los metodos descritos en esta memoria, el virus puede facilmente ser un virus PRRSV 94881 que se transforma en un virus quimerico, en donde la cadena principal del virus PRRSV 94881 bajo el N° de Acceso ECACC 11012502 o, de hecho, la cepa parental depositada bajo el N° de Acceso ECACC 11012501 se modifica para reemplazar la secuencia endogena de uno o mas de ORF 1a, ORF 1b, ORF 2, ORF 3, ORF 4, ORF 5, ORF 6 u ORF 7 con el ORF correspondiente de una cepa diferente de virus del PRRS. Por ejemplo, la cepa diferente de del virus PRRS puede ser una cepa europea diferente tal como la cepa del virus Lelystad (Agente Lelystad (CDI-NL-2.91), u otras cepas tales como las depositadas bajo los Numeros de Acceso ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, N° de Acceso ante CNCM I-1140, N° de Acceso ante CNCM I- 1387, N° de Acceso ante CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 y VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388, o ECACC V93070108 o, de hecho, puede ser una cepa de EE.UU. tal como el virus norteamericano del PRRS, pT7P129A; deposito ATCC VR-2332, deposito ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 y ATCC VR 2402.

Tecnicas recombinantes para preparar secuencias modificadas son bien conocidas por los expertos en la tecnica y, habitualmente, emplean la construccion de copias de ADN complementarias de longitud completa (clones infecciosos) del genoma viral que luego pueden modificarse mediante metodos de recombinacion y manipulacion de ADN (tal como la mutagenesis dirigida al sitio, etc.). De este modo, se pueden modificar, por ejemplo, sitios antigenicos o propiedades enzimaticas de las protemas vmcas. En la bibliograffa se han resenado clones infecciosos de cepas del virus del PRRS de genotipo europeo y norteamericano, y se pueden desarrollar utilizando los metodos de la invencion.

Preferentemente, las vacunas de acuerdo con la presente descripcion son vacunas vivas modificadas que comprenden una o varias de estas cepas vivas en un vehmulo adecuado, pero tambien se puede utilizar un virus inactivado para preparar vacunas con virus muerto (VM). Las VVM se formulan tfpicamente para permitir la administracion de 101 a 107 partmulas vmcas por dosis, preferentemente 103 a 105 partmulas por dosis, mas preferentemente 104 a 105 partmulas por dosis (4,0-5,0 log-10 TCID50). Los VM se pueden formular basandose en un tftulo de preinactivacion de 103 a 1010 partmulas vmcas por dosis. La vacuna puede comprender un vehmulo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una solucion salina fisiologica. La vacuna puede comprender o no un coadyuvante. Un ejemplo de coadyuvante adecuado es acetato de a-tocoferol que se puede obtener bajo la marca Diluvac Forte®. Alternativamente, se pueden utilizar, por ejemplo, coadyuvantes a base de alumbre.

Los cerdos pueden ser infestados mediante el PRRSV a traves de la via oronasal. El virus en los pulmones es absorbido por los macrofagos alveolares en los pulmones y en estas celulas la repilcacion de PRRSV se completa en el espacio de 9 horas. El PRRSV se traslada desde los pulmones a los nodulos linfaticos de los pulmones en el espacio de 12 horas y a los nodulos linfaticos perifericos, la medula osea y el bazo en el espacio de 3 dfas. En estos sitios, solo unas pocas celulas se tinen de forma positiva para el antfgeno viral. El virus esta presente en la sangre durante al menos 21 dfas y, a menudo, durante mucho mas tiempo. Al cabo de 7 dfas, se encuentran en la sangre anticuerpos contra el PRRSV. La presencia combinada de virus y anticuerpo en cerdos infectados con el PRRS demuestra que la infeccion por el virus puede persistir durante largo tiempo, aunque a un bajo nivel, a pesar de la presencia del anticuerpo. Durante al menos 7 semanas, la poblacion de celulas alveolares en los pulmones es diferente de los pulmones SPF normales.

Una vacuna se puede presentar en forma de una preparacion liofilizada del virus vivo, que se va a reconstituir en un disolvente, para dar como resultado una solucion para inyeccion. Asf, despues de las etapas de recoleccion de la presente invencion, el virus se puede combinar y liofilizar. El disolvente puede ser, p. ej., agua, solucion salina fisiologica o tampon, o un disolvente coadyuvante. El disolvente puede contener coadyuvantes, por ejemplo, acetato de a-tocoferol. La vacuna reconstituida se puede inyectar a continuacion en un cerdo, por ejemplo, en forma de inyeccion intramuscular o intradermica en el cuello. Para la inyeccion intramuscular, se puede aplicar un volumen de 2 ml, para una inyeccion intradermica es tfpicamente de 0,2 ml. En un aspecto adicional, la presente descripcion es por tanto un producto de vacuna que comprende en recipientes separados, una composicion liofilizada del virus y un disolvente para la reconstitucion y, opcionalmente, contiene ademas un folleto o una etiqueta con las instrucciones de uso.

Una vacuna preparada a partir de un virus producido por un metodo de la invencion puede no solo comprender una o varias de las cepas mencionadas anteriormente, sino tambien puede incluir otros componentes activos contra el SRRP u otras enfermedades porcinas vmcas o bacterianas, tales como el circovirus porcino o el virus de la fiebre porcina clasica. Por consiguiente, la descripcion se refiere adicionalmente a una vacuna tal y como se ha descrito, caracterizada porque contiene al menos un antfgeno adicional activo contra una enfermedad porcina que no es el SRRP. Ademas, la vacuna puede comprender determinados adyuvantes aceptables en farmacia o veterinaria. Uno de estos adyuvantes es D-tocoferol. Asf, nuevas composiciones de vacunas, en particular vacunas contra el virus

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PRRS que comprenden PRRSV 94881 se pueden mejorar adicionalmente mediante la adicion de adyuvantes. Mejoras de este tipo comprenden la preparacion de las vacunas en combinacion con adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna, de modo que se observa una mejora respuesta/resultado clmico con la administracion de la combinacion del adyuvante y la vacuna en comparacion con la administracion de la vacuna sola. Por ejemplo, las composiciones de vacunas de la invencion pueden comprender una vacuna contra el virus PRRSV 94881 y un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en MCP-1, fracciones de Haemophilus sonmus, Carbapol™ y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la vacuna del virus que comprende la vacuna contra el virus PRRSV 94881, puede ser una vacuna subunidad recombinante o. alternativamente, puede ser una vacuna contra el virus viva atenuada. Una vacuna viva a modo de ejemplo que existe es Ingelvac®PRRS MLV y el PRRSV 94881 se puede formular de una manera similar a Ingelvac®PRRS MLV.

Ademas de lo anterior, las composiciones de vacunas pueden contener otros ingredientes en tanto que los otros ingredientes no interfieran con las propiedades del adyuvante del MCP-1, fracciones de Haemophilus sonmus, Carbapol™ u otro carbomero o la vacuna contra el virus subyacente. Otros ingredientes de este tipo incluyen, por ejemplo, aglutinantes, colorantes, desecantes, antisepticos, agentes humectantes, estabilizantes, excipientes, adhesivos, plastificantes, agentes de pegajosidad, espesantes, materiales para parches, bases para unguentos, separadores de queratina, sustancias de caracter basico, promotores de la absorcion, acidos grasos, esteres de acidos grasos, alcoholes superiores, tensioactivos, agua y agentes tampon. Otros ingredientes preferidos incluyen agentes tampon, bases para unguentos, acidos grasos, antisepticos, sustancias de caracter basico o tensioactivos.

Puede variar el contenido o la cantidad de los adyuvantes utilizados en la descripcion y se puede determinar teniendo en consideracion, por ejemplo, las propiedades de la vacuna contra el virus del pRrS que se este utilizando, y la forma de dosificacion. El adyuvante puede comprender, por ejemplo, 1 a 100% en peso. Las composiciones de la descripcion, basadas en PRRSV 94881, se producen mezclando juntos el componente adyuvante y el componente vacuna contra el virus, ya sea solos o con otros diversos ingredientes. Las composiciones pueden ser tales que la vacuna contra el virus y los adyuvantes se presentan como una formulacion o, alternativamente, el adyuvante y la vacuna se presentan en formulaciones distintas que se pueden administrar de forma simultanea o secuencial.

El componente adyuvante se puede administrar por separado de la vacuna contra el virus en la administracion a organismos. Alternativamente, el adyuvante de acuerdo con la descripcion, junto con la vacuna contra el virus, se puede administrar como una composicion de vacuna sencilla. La vacuna contra el virus puede ser cualquier vacuna contra el virus. Aspectos mas espedficos contemplan el uso de una vacuna contra el virus PRRS que comprende PRRSV 94881. Ademas, una vacuna de este tipo se puede combinar con otras vacunas tales como Ingelvac® PRRS MLV y/o Porcilis® PRRS. Esta es meramente una vacuna contra el virus PRRS a modo de ejemplo, y otras vacunas de este tipo se pueden suplementar con los adyuvantes descritos en esta memoria.

Las composiciones inmunogenicas descritas en esta memoria son particularmente ventajosas en la induccion de la produccion de una respuesta de anticuerpo al virus PRRS. En particular, se demuestra en esta memoria que el uso de estos adyuvantes espedficos y, en particular, MCP-1, potencia la respuesta inmune al virus PRRS cuando existe una administracion combinada del adyuvante y la vacuna contra el virus PRRS en comparacion con la administracion de vacuna sola. Se demuestra que una administracion de este tipo produce una disminucion de la gravedad de los smtomas clmicos tales como lesiones pulmonares, anorexia, decoloraciones de la piel, letargia, smtomas respiratorios, cochinillos momificados, tos, diarrea y combinaciones de los mismos, que estan asociados con una infeccion por PRRSV. De hecho, hay una mayor disminucion de la gravedad de los smtomas clmicos asociados con una infeccion por el virus PRRS, observada con la combinacion de la vacuna y adyuvante en comparacion con la disminucion de este tipo de smtomas producida por la administracion de la vacuna sola en ausencia de dicho adyuvante.

Asf, las composiciones potencian particularmente el resultado clmico en un animal enfermo en comparacion con el resultado de la administracion de la vacuna contra el virusPRRS sola. En aspectos espedficos, el resultado clmico potenciado es una reduccion del porcentaje de lesiones pulmonares cuando se compara con animales que no reciben la composicion inmunogenica en combinacion con dicho adyuvante. En otros aspectos, el resultado clmico potenciado es una reduccion de la viremia en animales cuando se compara con animales que no reciben la composicion inmunogenica en combinacion con dicho adyuvante.

Asf, en un aspecto, la descripcion se refiere a una vacuna mejorada, mas particularmente a una vacuna contra el virus PRRS mejorada, en donde la mejora comprende mezclar la vacuna contra el virus con un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en MCP-1, fracciones de Haemophilus sonmus, carbapol y combinaciones de los mismos. La composicion de vacunas de la descripcion puede comprender, ademas, un soporte farmaceuticamente aceptable. Ademas, las vacunas pueden comprender otros ingredientes activos, incluidos HS, ORF 5, INF alfa, Poli ICLC, IL-12 para potenciar adicionalmente la funcion de la vacuna contra el PRRS. Adyuvantes de este tipo se pueden anadir solos o en combinacion con MCP-1.

Las composiciones de vacunas de la descripcion se pueden formular por cualquier metodo conocido en la tecnica de la formulacion, por ejemplo en preparados lfquidos, suspensiones, unguentos, polvos, lociones. emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, emulsiones, cremas, cataplasmas, parches y geles, y se utilizan

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preferiblemente como medicamentos. As^ de acuerdo con otro aspecto de la presente descripcion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende la composicion de vacunas anterior. La composicion de vacunas de acuerdo con la presente invencion, cuando se administra dermalmente, puede inducir significativamente la produccion de anticuerpos. Por consiguiente, en otra realizacion preferida de la presente invencion, la composicion de vacunas se puede proporcionar como un preparado transdermal.

Ademas, tal como se describe arriba, el virus y el adyuvante en la presente invencion se pueden administrar a un organismo juntos en forma de una composicion de vacunas sencilla, o en forma de un preparado adyuvante separado y distinto del componente virus del PRRS antigenico de la vacuna, con lo que el adyuvante actua de tal manera que la cantidad de un anticuerpo producido en el organismo en respuesta a la vacuna contra el virus PRRS se puede incrementar significativamente en comparacion con la administracion de la vacuna contra el virus PRRS sola. Asf, de acuerdo con todavfa otro aspecto de la presente descripcion, se proporciona un metodo para aumentar la cantidad de un anticuerpo producido contra el virus del PRRS, comprendiendo el metodo administrar una cantidad inunoloicamente eficaz de la vacuna contra el virus del PRRS, y un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en MCP-1, fracciones de Haemophilus sonmus, carbapol y combinaciones de los mismos, ya sea solos o en combinacion con un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en HS, ORF 5, INF alfa, Poli ICLC, IL-12 y combinaciones de los mismos, en una cantidad eficaz como un inmunoadyuvante, de forma simultanea o sucesiva en el organismo.

Cuando el adyuvante y la vacuna contra el virus PRRS se administran a un organismo, se potencia el resultado clmico del animal. La cantidad eficaz del adyuvante y la cantidad inmunologicamente eficaz de la vacuna contra el virus del PRRS se puede determinar adecuadamente por una persona con una experiencia normal en la tecnica teniendo en consideracion, por ejemplo, el tipo y las propiedades de la sustancia antigenica, las especies de organismos, la edad, peso corporal, gravedad de las enfermedades, tipo de las enfermedades, el tiempo de administracion y el metodo de administracion, y utilizando, ademas, la cantidad de un anticuerpo producido contra la sustancia antigenica en el organismo como un mdice.

La vacuna contra el virus del PRRS, el adyuvante o combinaciones de los mismos se pueden administrar a organismos por cualquier metodo adecuado, seleccionado, por ejemplo, dependiendo del estado de los pacientes y las propiedades de las enfermedades. Ejemplos de metodos de este tipo incluyen la administracion intraperitoneal, la administracion dermal (por ejemplo inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular, inyeccion intradermal y parches), administracion nasal, administracion oral, administracion a traves de la mucosa (por ejemplo administracion rectal, administracion vaginal y administracion corneal). Entre ellos se prefiere la administracion intramuscular.

Una dosis terapeutica de PRRSV MLV a modo de ejemplo es aproximadamente dos mililitros (2 mL). Los artesanos expertos reconoceran que se puede variar la cantidad de dosificacion en base a la raza, estatura y otros factores ffsicos del sujeto individual, asf como la formulacion espedfica de PRRSV MLV y la via de administracion. Preferiblemente, el PRRSV MLV se administra en una dosis unica; sin embargo, pueden ser utiles dosis adicionales. De nuevo, el artesano experto reconocera a traves de la presente descripcion que la dosificacion y el numero de dosis se ve influenciado por la edad y el estado ffsico del cerdo sujeto, asf como por otras consideraciones comunes a la industria y las condiciones espedficas bajo las cuales se administra el PRRSV MLV.

En otras determinados aspectos, la vacuna puede ser una vacuna multivalente que comprende dos o mas virus del PRRS, en que al menos una de los virus del PRRS es el virus 94881 atenuado, depositado bajo el n° de Acceso ECACC 11012502. Los otros virus PRRS pueden ser uno o mas seleccionados del grupo consistente en la cepa PRRSV depositada bajo los Numeros de Acceso cepa del virus Lelystad (Agente Lelystad (CDI-NL-2.91), u otras cepas tales como las depositadas bajo los Numeros de Acceso eCaCC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, N° de Acceso ante CNCM I-1140, N° de Acceso ante CNCM I-1387, N° de Acceso ante CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 y VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388, o ECACC V93070108 o, de hecho, puede ser una cepa de EE.UU. tal como el virus norteamericano del PRRS, pT7P129A; deposito ATCC VR-2332, deposito ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 y ATCC VR 2402.

Las vacunas basadas en virus PRRS se pueden utilizar para vacunar tanto a cochinillos como a cerdas. En un aspecto de la descripcion, se selecciona un regimen de dosis particular en base a la edad del cerdo y el antfgeno seleccionado para la administracion. Esto permitira a los cerdos de cualquier edad recibir la dosis mas eficaz en base al descubrimiento de la presente descripcion de que la infeccion por PRRSV (tanto por exposicion de tipo salvaje y de vacunacion) se despeja mucho mas rapidamente en animales de mas edad. Asf, en algunos aspectos, se prefiere la vacunacion de animales de edad a la vacunacion de cerdos mas jovenes, incluidos los de tres semanas de edad y menores ayuda a inducir la inmunidad activa y sigue siendo muy beneficiosa. La edad del animal puede ser un factor importante en el control del PRRS y puede ser un factor que impacta sobre sobre la vacunacion y el desarrollo de una respuesta inmune eficaz. Asf, la edad, la gestion de la enfermedad, la cna de los animales, la inmunidad innata y activa son importantes y necesitan ser considerados en las estrategias de control.

La vacuna contra PRRSV 94881 se puede administrar de cualquier manera convencional y, en algunos metodos preferidos, la administracion es nasal. Se prefiere que la vacuna contra el PRRSV administrada proporcione sus

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beneficios de tratar o reducir la gravedad o la incidencia de una infeccion por PRRSV tras una dosis unica, como con Ingelvac®, sin embargo, si se seleccionan otros antigenos o vacunas de combinacion o multivalentes, debe entenderse que estos pueden administrarse de su forma convencional, que puede incluir una o mas dosis de refuerzo despues de la administracion inicial. Los expertos en la tecnica seran capaces de determinar niveles de dosificacion apropiados en base a la vacuna contra el PRRSV seleccionada y el intervalo de edades de los animales a los que se administrara el antigeno.

Ejemplo 1:

Ampliacion a modo de ejemplo para la produccion de PRRSV 94881 MLV

La ampliacion del proceso en el biorreactor de 300 L para PRRSV 94881 utilizaba celulas MA104 que se encontraban entre el paso 64-84. Estas celulas se expandieron en frascos rodantes de 850 cm2 (Corning). Las celulas se cultivaron al mismo tiempo con una infeccion por virus en Biorreactores air-lift de 300 L. A lo largo del proceso de cultivo, las concentraciones en el medio de dextrosa/lactato se vigilaron en g/L. En la recogida, los fluidos se desecharon y se retuvieron las muestras de virus.

Las composiciones del medio eran como se muestra en la siguiente tabla:

Componente

Cantidad

Suero bovino fetal

5%

gamma irradiado

MEM sin polvo rojo fenol

9,6 g/L

Sulfato de neomicina

30 mg/L

Bicarbonato de sodio

1,4 g/L

Acido clortftdrico

para ajustar el pH

Se prepararon y filtraron el MEM sin medio Rojo Fenol, neomicina y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio. El FBS se anadio al medio, colocandose el medio simultaneamente en el biorreactor. La cantidad de neomicina anadida se calcula mediante: vol (L) x 30 mg/L Potencia (mg/g de base).

El proceso simultaneo para el crecimiento de PRRSV 94881 comprende sembrar celulas AK MA104 en el biorreactor e infestar simultaneamente las celulas con la siembra viral de PRRSV 94881. La figura 1 esboza el proceso simultaneo. En la figura 2 se proporcionan secuencias temporales para el proceso simultaneo esbozado en la figura 1.

En el proceso simultaneo un volumen de 270 L de medio se filtro en condiciones esteriles en el biorreactor. El medio se anadio al recipiente el mismo dfa o el dfa anterior a la adicion de celulas y suero. Si el medio se anade al biorreactor el dfa anterior a la adicion de las celulas y suero, se recomienda que se active el control de la temperatura de manera que el medio se mantenga a 35°C, el pH en el modo de control con el pH mantenido en 7,25 □ 0,1 y modo de vigilancia de la DO y agitacion ajustada a 35 rpm. El dfa de la adicion de las celulas y suero bovino fetal irradiado (IFBS - siglas en ingles), el control de la the temperatura se ajusta a 36°C. El IFBS se anade al biorreactor despues de la adicion del medio y antes de la siembra de las celulas. La concentracion diana del IFBS es 5% v/v, lo cual, en el volumen de 270 L, es un volumen de 14,0 L de IFBS por biorreactor.

Se realizaron tres rondas en el biorreactor de 300 L. Los parametros del biorreactor eran: punto de ajuste de la temperatura a 36°C, punto de ajuste del pH a 7,25 en el modo de control, vigilancia de la DO y agitador a 35 rpm. Las Tablas 3, 4 y 5 muestran los datos registrados el % de DO % a partir del OIT, dextrosa y lactato a partir de YSI, y el pH y L-gutamina a partir de NOVA. Los tftulos PD son solo de referencia. Los tftulos QC son los tftulos oficiales.

Tabla 3: Resultados para la operacion del lote 00lPD-X en el biorreactor de 300 L

dfas

pH DO % Dextrosa g/L Lactato g/L Gln mmol/L Tftulo Tftulo Comentarios

PD

QC

YSI YSI NOVA TCID50 TCID50

-1

7,24 168 N/E N/E N/E N/E N/E Solo Medio

0PI

7,2 92 N/E N/E N/E N/E N/E N/E

1PI

7,26 168 1 0,073 2,63 3,67 N/E N/E

2PI

7,25 83 0,95 0,12 2,36 4,9 N/E N/E

3PI

7,23 74 0,742 0,262 2,14 5,88 N/E N/E

4PI

7,24 63 0,408 0,58 1,72 6,45 7,0 N/E

5PI

7,06 30 0,044 0,921 1,19 6,50 7,3 DO control

6PI

7,25 30 0,011 0,902 0,74 6,38 6,7 Claro

7PI

7,24 30 0 0,855 0,49 7,40 7,4 turbio

La Tabla 3 muestra los resultados del lote 001PD-X durante 7 dfas de infeccion. Se tomaron muestras diariamente y la operacion se termino el dfa 7 PI. El pH se ajusto a 7,25 y se mantuvo constante durante la operacion, excepto el d^a 4 PI cuando cayo por debajo de 7,0. El dfa 4 PI, la glucosa cayo hasta 0,4 desde 0,74 el dfa anterior, la 5 glutamina comenzo a ser consumida y el tftulo comenzo a aumentar aproximadamente un log. El tftulo pico se observo el d^a 5 PI cuando la glucosa se habfa consumido totalmente (< 0,1 g/L). Tambien el d^a 5 PI, la DO cayo hasta el 30% y se inicio el control para evitar la cafda a cero de la DO durante una noche. El dfa 6 PI cayo el tftulo y luego aumento hasta 7,4 el dfa 7 PI. La muestra era turbia el dfa 7 PI.

Tabla 4: Resultados para la operacion del lote 002PD-X en el biorreactor de 300 L

dfas

pH DO % Dextrosa g/L Lactato g/L Gln mmol/L Tftulo Tftulo Comentarios

PD

QC

YSI YSI NOVA TCID50 TCID50

-1

7,27 116 N/E N/E N/E N/E N/E Medio anadido

0PI

7,2 83 1,04 0 N/E N/E N/E celulas/suero/siembra anadidos

1PI

7,25 75 1,01 0,073 1,64 3,88 n/a N/E

2PI

7,25 74 0,954 0,105 1,73 5,5 n/a N/E

3PI

7,24 70 0,762 0,223 1,41 5,93 6 N/E

4PI

7,19 60 0,409 0,561 1,25 6,62 6,5 N/E

5PI

7,21 30 0,005 0,881 0,9 6,79 7,5 RECOLECCION-I

R0PI (re- alimentado)

7,24 116 0,001 0,858 0,64 N/E N/E fallo la sonda DO

R1PI

6,99 116 0,247 0,726 1,38 7,13 7,5 N/E

R2PI

7,15 116 0,0 0,894 0,95 7,06 7,0 dextrosa era cero

R3PI

7,13 116 0,0 0,865 0,66 6,69 7,5 Claro

R4PI

7,13 116 0,0 0,819 0,21 7,52 7,5 Claro

R5PI

7,13 116 0,0 N/E 0,1 7 7,3 Cierta turbidez

10 La Tabla 4 muestra resultados del lote 002PD-X (R0P1 es el punto en el que se re-alimenta el cultivo). En base a los resultados del tftulo del lote 001PD-X, el dfa de recoleccion se establecio el dfa 5 PI. Los dfas 1 PI a 5 PI del lote 002PD-X eran consistentes con el lote 001PD-X. El biorreactor fue recolectado y luego se re-alimento el dfa 5 PI. Se establecio la curva de crecimiento para la recoleccion-II. Se tomaron muestras sobre una base diaria durante 5 dfas. La dextrosa se habfa consumido por completo hacia el dfa R2PI. El tftulo se encontraba en el pico durante 5 dfas (la 15 variacion de 0,5 logs se encuentra dentro del error de ensayo). La glutamina se habfa consumido totalmente hacia el

dfa R5PI. La sonda de DO fallo despues de la re-alimentacion. El nivel de DO no se pod^a medir (lo mas probablemente proximo a cero). El dfa R4PI las celulas segman estando fijadas, ya que la muestra en el frasco era clara. El dfa R5PI se observo una cierta turbidez en el frasco de la muestra, lo que indicaba que las celulas podfan haber comenzado a desprenderse de descendencia.

Tabla 5: Resultados para la operacion del lote 003PD-X en el biorreactor de 300 L

dfas

pH DO % Dextrosa g/L Lactato g/L Glutamina mmol/L Tftulo PD Tftulo QC Comentarios

YSI YSI NOVA TCID50 TCID50

0PI

7,49 78 N/E N/E N/E N/E N/E N/E

1PI

7,25 69 0.987 0,078 2,05 4,38 4,7 vigilar la DO/controlar el pH

2PI

7,23 66 0.935 0,107 1,9 5,13 5,7 N/E

3PI

7,22 60 0.783 0,221 1,71 6,2 6,5 N/E

4PI

7,29 53 0.453 0,519 1,45 6,36 6,6 N/E

5PI

7,1 30 0.049 0,899 1,17 6,36 7,0 RECOLECCION- I

0PI (re- alimenta- cion)

7,19 71 N/E N/E N/E N/E N/E Vigilar la DO

R1PI

6,98 18 0.305 0,702 2,69 7.26 7,3 N/E

R2PI

7,23 7 0,0 0,917 1,82 6,85 7,5 RECOLEC- CION-II

0PI 2a re- alimenta- cion

7,21 74 N/E N/E N/E N/E N/E N/E

2R1PI

6,91 13 0,097 0,853 1,69 7,0 7,5 control de la DO a 10%

2R2PI

7,19 3 0,0 0,883 0,82 7,2 7,3 Vigilar la DO

2R3PI

7,17 2 N/E N/E 0,42 7,46 7,5 turbio

2R4PI

7,24 18 N/E N/E 0,22 7,0 7,5 la DO esta subiendo

2R5PI

7,24 47 N/E N/E 0,13 6,68 7,0 turbio

2R6PI

7,22 62 N/E N/E 0,06 6,5 7,0 turbio

2R7PI

7,24 68 N/E N/E 0,04 6,36 6,2 turbio

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La Tabla 5 muestra los resultados del lote 003PD-X. En base a los resultados del tttulo del lote 002PD-X, el dfa de recoleccion-II se establecio el dfa 1 PI o 2PI. Se decidio recolectar fluidos el dfa 2 PI para proporcionar una flexibilidad para la produccion. Se establecio una curva de crecimiento para la Recoleccion-III durante 7 dfas. Se tomaron muestras sobre una base diaria. La dextrosa se habfa consumido por completo hacia el dfa 2 R2PI. El tftulo 10 se encontraba en el pico durante 4 dfas y luego cayo hasta 7,0 durante 2 dfas (la variacion de 0,5 logs se encontraba dentro del error de ensayo), despues cayo hasta 6,2 el dfa 7 PI. La glutamina se habfa consumido totalmente hacia el dfa 2 R5PI. La DO se tomo fuera de control el dfa 2R2PI para vigilar la muerte de las celulas.

Fase de recoleccion-I para la propagacion del virus en la escala de 300 L: La curva de crecimiento para la Recoleccion-I (lote 001PD-X) mostro que las partfculas virales continuaban creciendo hasta el dfa 7 PI a pesar de

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haberse consumido por completo la dextrosa (< 0,1 g/l) hacia el d^a 5 PI. El consumo de glutamina se inicio cuando la dextrosa se encontraba aproximadamente la mitad de la concentracion inicial de 1 g/L (dfa 4 PI), y luego, despues de haberse consumido la dextrosa, la glutamina parecio ser la fuente de energfa primaria. La inconsistencia en las lecturas de glutamina durante los primeros 2-3 dfas pudieran atribuirse a fluctuaciones en el instrumento NOVA, ya que el medio solo contiene 2 mmol/L. Los niveles de la DO descendfan de forma consistente durante el metabolismo de dextrosa/glutamina y la propagacion del virus.

La cinetica de propagacion del virus sugirio recolectar el virus 5-7 dfas PI. La variacion en los tftulos de QC entre el dfa 4 PI y 7 PI se encontraba dentro de la variacion del ensayo (± 0,71 logs/ml). El criterio de Recoleccion-I era el instante en el que la dextrosa se habfa consumido por completo (< 0,1 g/l) que era consistente con los datos de 30 L (N° de estudio 6127-1310-09K-198). Por lo tanto, las mediciones fuera de lrnea de la dextrosa, partiendo del dfa 4 PI senan necesarias para seguir la pista de los niveles de dextrosa. La Tabla 3 demostro que el virus PRRSV 94881 era estable durante 3 dfas (5-7 dfas PI) en el biorreactor de 300 L despues de haberse agotado la dextrosa. Sin embargo, si se ha de realizar una segunda recoleccion, en base a los resultados de las tablas 4 y 5, se recomienda que la Recoleccion-I se realice el primer dfa en el que la concentracion de la dextrosa es < 0,1 g/L (utilizando la medicion YSI) para asegurar la adherencia de las celulas a los descendientes (soportes) en el biorreactor.

Fase de recoleccion-II para la propagacion del virus en la escala de 300 L: Para los lotes 002PD-X y 003PD-X, despues de haberse realizado la Recoleccion-I el dfa 5 PI, se anadieron medio reciente y suero al 5% para generar la segunda recoleccion de fluidos virales (Tablas 4 y 5). El medio MEM (270-280 L) con IFBS (al 5% v/v) se anadio al biorreactor siguiendo los mismos procesos que los establecidos para ajustar el primer material de recoleccion. Se realizo una curva de crecimiento para la recoleccion-II durante 5 dfas en el lote 002PD-X y el tftulo del pico se consiguio el dfa 1 post re-alimentacion (vease la Tabla 4). El tftulo era estable durante 4 dfas. El tftulo del virus el dfa 1 post-re-alimentacion era equiparable al tftulo de la primera recoleccion Tabla 2). El nivel de dextrosa se habfa consumido por completo el dfa 2 PI. Se podfa utilizar un intervalo de cuatro dfas post-re-alimentacion para el segundo criterio de recoleccion. Sin embargo, la realizacion de la segunda recoleccion el dfa 4 PI podna tener un efecto sobre la tercera recoleccion, ya que se observo una cierta turbidez en las muestras de fluido que se tomaron el dfa 4 PI, indicando la muerte de las celulas o el desprendimiento de la descendencia. Asf, para el lote 003PD-X la recoleccion-II se realizo el dfa 2 PI. En base a los datos del lote 003PD-X se recomienda que los dfas diana de la Recoleccion II sean 1-2 PI si se han de realizar una segunda re-alimentacion y una tercera recoleccion.

Fase de recoleccion-III para la propagacion del virus en la escala de 300 L: Para el lote 003PD-X (Tabla 5), despues de haber realizado la Recoleccion II el dfa 2 PI, se anadio al recipiente medio y suero adicionales para la generacion de fluidos virales de tercera recoleccion (Tabla 5). El medio MEM (270-280 L) con IFBS (al 5% v/v) se anadio al biorreactor siguiendo los mismos procesos que los establecidos para ajustar el primer material de recoleccion. Se realizo una curva de crecimiento para la recoleccion-III durante 7 dfas y el tftulo del pico se consiguio el dfa 1 post re-alimentacion (vease la Tabla 5). El tftulo era estable durante 4 dfas. El tftulo del virus el dfa 1 post-re-alimentacion era equiparable al tftulo de la segunda recoleccion (Tablas 4 y 5). La dextrosa se habfa consumido por completo el dfa 1 Pi. Se podfa utilizar un intervalo de cuatro dfas post-re-alimentacion para el tercer criterio de recoleccion.

Las tres graficas que figuran mas abajo representan los perfiles de dextrosa, glutamina y DO y los tftulos para las tres operaciones realizadas en el biorreactor de 300 L. El proposito de la graficas es mostrar la consistencia de las tres operaciones.

La figura 3 muestra un sumario de las tres operaciones realizadas en la escala de 300 L para el consumo de dextrosa y los tftulos de virus. Los perfiles de la Recoleccion-I para las tres operaciones eran muy consistentes, la dextrosa se habfa consumido totalmente (< 0,1 g/l) hacia el dfa 5 PI y coincidio con el tftulo pico en las tres operaciones realizadas. Despues de la primera re-alimentacion, la dextrosa se encontraba por debajo de 0,3 g/l para los lotes 002PD y 003PD el dfa 1 PI y el tftulo ya se encontraba en el pico. El dfa 2 PI, la dextrosa se habfa consumido por completo y el tftulo del virus permaneda en el pico. Para la recoleccion III en el lote 003PD, cunado la segunda re-alimentacion se realizo el dfa R2PI, la dextrosa habfa descendido a menos de 0,1 g/L hacia el dfa 2R1PI y el tftulo se encontraba en el pico.

La figura 4 muestra un sumario de las tres operaciones realizadas en la escala de 300 L para el consumo de glutamina y los tftulos de virus. Como se puede ver, los perfiles de la recoleccion-I para las tres operaciones eran muy consistentes. La glutamina cayo a la mitad de su concentracion inicial de 2 mmol/L hacia el dfa 5 PI y coinicidio con el tftulo pico en las tres operaciones realizadas. Despues de la primera re-alimentacion, la glutamina cayo hasta la mitad de su concentracion inicial hacia el dfa 2 PI para los lotes 002PD y 003PD y el tftulo ya se encontraba en el pico desde el dfa 1 PI. Para la recoleccion III en el lote 003PD, la segunda re-alimentacion se realizo el dfa R2PI. La glutamina se estaba consumiendo lentamente hasta 0 hacia el dfa 5 PI y el tftulo del virus era consistente y luego las celulas comenzaron a morir y el tftulo cayo hacia el dfa 7 PI.

Como se puede observar para el perfil de Recoleccion-I, las tres operaciones eran muy consistentes, la DO habfa cafdo hasta el 30 % hacia el dfa 5 PI y coincidio con los tftulos pico en las tres operaciones realizadas. Despues de la primera re-alimentacion, la sonda de DO fracaso para el lote 002PD-X, de modo que no hay datos disponibles, en el lote 003PD-X DO cayo el dfa 1 PI, coincidiendo con el tftulo pico. Para la recoleccion-III en el lote 003PD, cuando la segunda re-alimentacion se realizo el dfa R2PI, la DO disminuyo rapidamente hasta el dfa 3 PI cuando las celulas

5

10

15

20

25

30

comenzaron a morir y la O se consumio hasta 0 hacia el dfa 5 PI y el tftulo del virus era consistente, entonces las celulas comenzaron a morir y el tftulo cayo hacia el dfa 7 PI.

Tabla 6: Sumario de las condiciones y resultados del proceso simultaneo en operaciones en biorreactores de 300 L*.

Lote

PCD MOI TOH1 Tftulo H1 TOH2 Tftulo H2 TOH3 Tftulo H3

001PD-X

7,0 x 109 0,1 5 7,3 N/E N/E N/E N/E

002PD-X

7,0 x 109 0,1 5 7,5 1-4 7,5 N/E N/E

003PD-X

7,0 x 109 0,1 5 7,0 2 7,5 1-4 7,5

*Condiciones diana (0,1 MOI, 7,0 x 109 celulas totales por biorreactor de 300 L, pH 7,25 y 36°C)

(H1): Indica las primeras recolecciones en dfas post-infeccion.

(H2): Indica las segundas recolecciones en dfas post-infeccion.

(H3): Indica las terceras recolecciones en dfas post-infeccion.

Los fluidos virales procedentes del Lote 001PD-X se blanquearon y desecharon. Se mantuvo un litro de la recoleccion-I del lote 002PD-X y se anadio SGS (al 25% v/v) para fines de busqueda, el resto de los fluidos fueron blanqueados y desechados. Dos litros de la Recoleccion II del lote 003PD-X se mantuvieron congelados para fines de concentracion y el resto de los fluidos se blanqueraon y desecharon.

Intervalo de la densidad de celulas de siembra (PCD) para la escala de 300 L: La densidad de celulas de siembra (PCD) es 7,0 x 109 celulas totales por cada biorreactor de 300 L con un volumen de trabajo de 270-280 L. Basado en los datos del Proceso de Transferencia del Proceso Final de 30 L (6127-1310-09K-198), el intervalo de siembra de celulas totales oscila entre 7,0 x 108 - 1,0 x 109 por cada biorreactor de 30-L. Debido a restricciones en el tiempo, solo se evaluo la densidad de siembra de celulas diana.

Intervalo de la multiplicidad de infeccion (MOI) para la escala de 300 L: La MOI diana de 0,1 es ideal para la propagacion de PRRSv 94881 dentro de este sistema de crecimiento. Los niveles bajo y alto de la MOI de 0,01 y 0,3, respectivamente, se examinaron en los biorreactores de 30 L.

Analisis de riesgo: Los parametros recomendados del procesos simultaneo en el biorreactor de 300 L se esbozan en la Tabla 11. Solamente se testaron parametros diana y se consideraron por si eran crfticos o no crfticos para el proceso. Los intervalos se evaluaron en la escala de 30 L. Las definiciones son como sigue:

Parametros crfticos son aquellos parametros que son crfticos para los atributos de calidad del producto final;

Parametros no crfticos son aquellos parametros que pueden ser controlados directamente dentro del intervalo definido o que tienen un amplio intervalo operacional, de modo que una desviacion del punto establecido no es crftica. Parametros no crfticos ayudan a controlar los parametros crfticos dentro del intervalo definido.

Parametros "Para Informacion Solamente" son parametros que son vigilados para obtener informacion adicional sobre el proceso, pero que no tienen correlacion directa con los atributos del producto final.

Tabla 7: Sumario de los parametros del proceso simultaneo en un biorreactor de 300 L para PRRSV 94881 MLV

Parametro

*Lfmite Inferior Ensayado *Lfmite Superior Ensayado *Intervalo Aceptado Diana Aceptada Crftico/No Crftico

MOI

0,01 n/a 0.01-0.30 0,10 NC*

Densidad de Siembra de Celulas

To x TO" celulas 1,0 x 10IU celulas n° 7,0 x 10° celulas a 10 x 109 celulas 7,0 x 109 celulas NC*

Tiempo de la 1a Recoleccion (Dfas post- infeccion)

Dfa 4 Dfa 7 Dfa 5 - Dfa 7 PI Dfa 5 -7 PI Crftico **

Temperatura

35 °C 38 °C 36±1°C 36 °C NC*

pH

6,5 7,9 6.9 -7.9 7,2 NC*

5

10

15

20

25

30

35

Tiempo de 2a Recoleccion (Dfas post re- alimentacion)

Dfa 1 Dfa 5 Dfa 1 - Dfa 4 PI 1-2 Cntico***

Tiempo de 3a Recoleccion (Dfas post re- alimentacion)

Dfa 1 Dfa 7 Dfa 1 - Dfa 4 PI 1-4 Cntico

No cntico dentro del intervalo examinado en la escala de 30 L.

** El criterio de primera-Recoleccion se decide por el tiempo del consumo completo de dextrosa en el periodo de 5-7 d^as PI. Sin embargo, si se ha de realizar una segunda recoleccion, la Recoleccion-I debena ser el primer dfa en el que la dextrosa es 0,1 g/L

*** Los fluidos son estables durante 5 dfas. Sin embargo, si se ha de realizar una recoleccion, la recoleccion debena hacerse entre los dfas 1 y 2

N° basado en datos de 30 L para el scale-up

Conclusiones y Recomendaciones del Proceso: El proceso simultaneo de ampliacion del biorreactor de 30 L al de 300 L se consiguio con exito. La Recoleccion-I se encontraba dentro del intervalo del biorreactor de 30 L para los dfas de recoleccion y el tftulo. La Recoleccion-II tambien tema exito con tftulos equiparables a la Recoleccion-I. El tftulo de la 2a recoleccion era estable durante 4 dfas. Se consiguio una recoleccion adicional (tercera) con tftulos equiparables a las recolecciones I y II. El tftulo de la tercera recoleccion era estable durante al menos 4 dfas.

Las recomendaciones para un proceso simultaneo en un biorreactor de 300 L preferido para PRRSV 94881 MLV son como sigue:

Propagacion del virus, RECOLECCION-I: La composicion del medio era MEM sin Rojo Fenol, 30 mg/L de neomicina y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio. Celulas MA104 se sembraron a una densidad de 7 x 109 / biorreactor para descendencia de 300 L en 270 - 280 L de medio suplementado con 14,0 L de suero de bovino fetal al 5% v/v (intervalo: 7 x 109 - 1 x 1010 / biorreactor para descendencia de 300 L). La temperatura del biorreactorse controlo en 36 ± 1°C. La DO se ajusta en el "Modo de Vigilancia". Activar el control de la DO en el punto establecido de 10% una vez que el nivel de DO caiga a 10 - 30%. el pH 7,2 se establece en el Modo Control. Los parametros PID utilizados para el valor elevado de pH (adicion de CO2) eran:

Ganancia

300,00

Reajustar mins por cada repeticion

2,20

Tasa, minuto

0,50

Unidades de pH de la valve fina

0,03

Lfmite CV de la valvula fine

5%

El caudal de aire se ajusta a 2,0 SLPM; el caudal de CO2 a 2,0 SLPM; el caudal de O2 a 2,0 SLPM; el caudal de N2 se ajusta a 2,0 SLPM y la tasa de purgado de gas total debena estar en 2,0 SLPM.

La MOI diana es 0,1 (intervalo 7 x 108 - 1 x 109 partfculas de virus / biorreactor para descendencia de 300 L).

Para el criterio de recoleccion-I, el muestreo fuera de lrnea de las mediciones de dextrosa se toman comenzando el dfa 4 PI. La tendencia de la DO debena utilizarse como indicador. La Recoleccion-I debena realizarse cuando la dextros aes < 0,1 g/L (intervalo 2 dfas +/-), lo cual ocurre habitualmente entre los 5-7 dfas PI. Sin embargo, si se ha de realizar una segunda recoleccion, la Recoleccion-I se recomienda el primer dfa en el que la concentracion de dextrosa es < 0,1 g/L.

Primera Re-Alimentacion- RECOLECCION-II: Despues de la primera Recoleccion, re-alimentar el biorreactor con 270 - 280 L de composiicon de medio MEM sin Rojo Fenol, neomicina y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio suplementado con 14,0 L de suero bovino fetal (al 5% v/v). La re-alimentacion se realiza bajo las mismas condiciones que el ajuste del medio de la primera recoleccion (veanse los parametros de la Primera Recoleccion anteriores). el control del pH se ha de mantener en un punto establecido de 7,2. Los parametros PID utilizados para el valor elevado de pH (adicion de CO2) eran:

5

10

15

20

25

30

35

Ganancia

300,00

Reajustar mins por cada repeticion

2,20

Tasa, minuto

0,50

Unidades de pH de la valve fina

0,03

Lfmite CV de la valvula fine

5%

El control de la temperatura permanece en un punto establecido de 36 ± 1°C. El control de la DO se ajusta en el "Modo de Vigilancia".

Segunda Re-Alimentacion - RECOLECCION-III: Inmediatamente despues de la segunda recoleccion, re-alimentar el biorreactor con 270 - 280 L de composiicon de medio MEM sin Rojo Fenol, neomicina y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio suplementado con 14,0 L de suero bovino fetal irardiado (al 5% v/v). La re-alimentacion se realiza bajo las mismas condiciones que el ajuste del medio de la primera recoleccion (veanse los parametros de la segunda recoleccion anteriores). el control del pH se ha de mantener en un punto establecido de 7,2. Los parametros PID utilizados para el valor elevado de pH (adicion de CO2) eran:

Ganancia

300,00

Reajustar mins por cada repeticion

2,20

Tasa, minuto

0,50

Unidades de pH de la valvula fina

0,03

Lfmite CV de la valvula fina

5%

El control de la temperatura ha de permanecer en un punto establecido de 36 ± 1°C. La DO se ajusta en el Modo de Vigilancia. Los resultados actuales del ensayo demuestran que el tiempo optimo oscila entre los dfas 1 - 4 post re- alimentacion para los fluidos virales de la tercera Recoleccion.

Debe entenderse que el proceso anterior es a modo de ejemplo y se puede modificar adicionalmente para aumentar el rendimiento y/o reducir los costes de poner en funcionamiento el bioprocesador. Por ejemplo, cambios en los parametros pueden incluir, pero no se limitan a: reducir la concentracion de suero para segunda y terceras recolecciones, reducir la densidad de siembra de celulas, anadir las celulas y la siembra al mismo frasco y agitarlo, de manera que se pueda acortar la propagacion del virus para la recoleccion I. Tambien, se puede mejorar adicionalmente el rendimiento del virus mediante una re-alimentacion mas para una posible Recoleccion IV. Componentes de medio agotado de alimentacion son, pero no se limitan a glucosa y glutamina

Ejemplo 2 (ejemplo de referencia)

En un ejemplo espedfico, el PRRSV 94881 producido de acuerdo con el metodo arriba descrito se utilizo para determinar la eficacia del PRRSV 94881 en la vacunacion de cerdos. En este estudio, cochinillos de 4 a 13 dfas de edad fueron vacunados intramuscularmente con una composicion que comprendfa 107,6 TCID 50 en 2 ml (dfa 0 de estudio). El dfa 13, se desteto a los cochinillos y se les vigilo en cuanto a diversos parametros de la enfermedad hasta el dfa 90. Los parametros del estudio inclrnan vigilar la viremia, la presencia de virus en los tejidos y las secreciones, observaciones clmicas, lesiones pulmonares y ganancia de peso.

Cada uno de los grupos de estudio: los vacunados, los centinelas y los controles se pesaron los dnias de estudio 0, 14, 28, 56 y 90. Se tomaron muestras de sangre cada dfa alterno entre los dfas 0 y 14 y una vez a la semana hasta el dfa 90 tanto para el grupo vacunado como para los centinelas y una vez a la semana a lo largo de los periodos de estudio para los controles hasta el dfa 90.

Se tomaron frotis nasales, orales y faciales cada dfa alterno entre los dfas 0 y 14 y una vez a la semana hasta el dfa 56 tanto para el grupo vacunado como para los centinelas y una vez a la semana a lo largo de los periodos de estudio para los controles hasta el dfa 56.

La necropsia se confirmo en el grupo vacunado en dos cerdos cada dfa alterno de los dfas 0 a 14 y una semana desde el dfa 14 al dfa 90 con el resto de los cerdos el dfa 90. En el grupo centinela 5 cerdos el dfa 56 permanedan el dfa 90. Grupo control 2 cerdos cada dfa alterno entre el dfa 0 y el dfa 14, una vez a la semana entre el dfa 14 y el dfa 56 y los cerdos restantes el dfa 90.

Cada dfa se realizaron observaciones clmicas.

La RT- PCR cuantitativa se realizo utilizando cebadores espedficos de PRRSV europeo para muestras de frotis de la sangre, oral, fecal y nasal, asf como lavados de los pulmones.

A partir de estos estudios los datos demostraron que los cochinillos mostraban una salud normal, excepto unos 5 pocos cerdos que cojeaban. Post-mortem no habfa aspectos anormales en la necropsia, excepto que 1-2 animales mostraban signos de nodulos linfaticos inguinales suavemente ampliados. De manera importante, se observo que no existfan lesiones pulmonares en el grupo vacunado.

La figura 6 muestra el porcentaje de animales viremicos en el grupo centinela en comparacion con el grupo vacunado con una composicion que contiene la cepa de virus del PRRS atenuada depositada con el N° de Acceso 10 11012502 en la ECACC, mostrando eficacia del virus del PRRS producido de acuerdo con los metodos de la

invencion en proporcionar inmunidad protectora a cerdos.

Ejemplo 3

El siguiente equipo y reactivos (Tabla 8) se utilizaron en el desarrollo del proceso en frasco rodante simultaneo para EU PRRS 94881:

15 Tabla 8: Equipo

Etapa del Proceso

Procedimiento Equipo

Mantenimiento de celulas MA104 (pasos 58-78) y AK- MA104 (pasos 64-84) . Misma lmea de celulas, diferentes pasos

Mantenimiento y ampliacion, de acuerdo con los registros del proceso BPF-777 y BPF-778 Frascos rodantes de 850 cm2 (CORNING)

Recuento de celulas

Recuento automatico Celula Vi

Cultivo celular

Crecimiento de celulas Frascos rodantes de 850 cm2 (CORNING) Sacudidor rodante e incubadora

Produccion de Virus

Infeccion

Conc. de Dextrosa/Lactato g/L(± 5% de variacion del ensayo)

YSI2700

Muestreo

pipetas

Medio MEM con Rojo Fenol y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio se obtuvo de SAFC. La Tabla 9 describe la composicion del Medio, mas concentracion del suero. este medio se utilizo para porpagar el virus, incluidas todas las re-alimentaciones de frascos rodantes.

20 Tabla 9: Composicion del Medio MEM.

Catalogo/Articulo n°

Componente Numero de lote Cantidad por frasco rodante

700754

Suero bovino fetal 10D837 20 mL (5% v/v)

gamma irradiado, US

62892-1000M3056

MEM con Rojo Fenol 10L259 400 mL

Proceso simultaneo con tres recolecciones:

El proceso simultaneo anadfa medio con suero, celulas AK- MA104 y siembra de virus EU PRRS 94881 en un recipiente. Luego, se mezclo el contenido del recipiente y se dispenso a a los frascos rodantes (TOI igual a cero los 25 dfas PP). La figura 7 ilustra el metodo del proceso simultaneo y la figura 8 ilustra la definicion del proceso y las secuencias temporales.

Frasco Rodante y Preparacion del Medio:

El experimento presentado aqu era una tanda de 5 frascos rodantes. El tamano real de la tanda puede variar.

Bajo condiciones asepticas se anadieron a un recipiente 2000 mL de medio MEM y 100 mL de suero bovino fetal irradiado. Luego se anadieron 5 x 107 celulas AK-MA104 y siembra de virus EU PRRS a una MOI de 0,1. Estos 5 materiales se mezclaron y, bajo condiciones asepticas se dispensaron aproximadamente 400 mL por cada frasco rodante de 850 cm2 Corning. Los frascos rodantes se incubaron luego a 37°C en un sacudidor rodante a una velocidad de 0,5 rpm. Se realizaron hasta tres recolecciones con dos re-alimentaciones de medio.

Criterio para la Recoleccion y Potencia Aceptable..

Los criterios para recolectar los frascos rodantes se basaron en el punto establecido/ objetivo para los parametros 10 cnticos del proceso en el biorreactor de 300 L validado de los Ejemplos 1 y 2, tal como se muestra en la Tabla 10

que figura mas abajo.

La recoleccion-I se realizo los dfas 5 -7 PI y el nivel de dextrosa era < 0,1 g/L. La recoleccion II tuvo lugar el dfa 2 PI despues de la re-alimentacion y la recoleccion III el dfa 2 PI despues de la segunda re-alimentacion.

La potencia de las tres recolecciones de los frascos rodantes debena ser > 105,5 TCID50/1T1L.

15 Tabla 10: Criterios de recoleccion/potencia aceptable para EU PRRS 94881 MLV

Parametro

Diana Aceptable

Tiempo de la 1a Recoleccion (Dias post- infeccion)

Dfa 5 -7 PI

Nivel de dextrosa a la 1a recoleccion

0,1 g/L

Tiempo de 2a Recoleccion (Dias post re-alimentacion)

2

Tiempo de 3a Recoleccion (Dias post re-alimentacion)

2

Potencia

> 105,5 TCID50/mL

*Parametros cnticos son aquellos parametros que son cnticos para los atributos de calidad del producto final Operaciones con frascos rodantes

Tabla 11: Experimento inicial para el desarrollo del EU PRRS 94881 del proceso simultaneo de frascos rodantes y 20 resultados de los tftulos

Frasco rodante codigo

Densidad de siembra de celulas por cada FR MOI H-1 + re- alimen- tacion Dextrosa g/L TCID50 por mL H-II + re-alimen- tacion TCID50 por mL H-III Final TCID50 por mL

A

3,5 x 10° 0,1 5PI 0,304 < 5,5 7PI °,5 9PI <°,0

B

3,5 x 10° 0,1 °PI 0,048 °,5 8PI °,° 10PI < 5,7

C

3,5 x 10° 0,1 7PI 0,00° < 5,5 9PI < °,3 11PI °,7

D

3,5 x 10° 0,005 5PI N/E < 5,° 7PI °,5 9PI < 5,5

E

3,5 x 10° 0,005 °PI 0,057 < 5,5 8PI < 5,5 10PI 7,4

F

3,5 x 10° 0,005 7PI 0,0 < 5,5 9PI < 5,5 11PI < 5,5

G

7 x 10° 0,1 5PI 0,0°° °,° 7PI °,9 9PI < °.3

H

7 x 10° 0,1 °PI 0,009 °,5 8PI ',3 10PI 6,'

I

7 x 10° 0,1 'PI 0 < °,2 9PI ',0 11PI 6,6

J

1 x 107 0,1 5 PI 0,095 6,9 7 PI 6,6 9 PI/10 PI < 6,3/6,7

K

1 x 107 0,1 6 PI 0 7,3 8 PI 7,5 10 PI/11 PI 6,5/6,6

L

1 x 107 0,1 7 PI 0 7,7 9 PI <5,5 11 PI/12 PI 7,2/6,6

M

1 x 10' 0,005 5PI 0,118 <5,6 'PI ',5 9PI <6,0

N

1 x 10' 0,005 °PI 0,014 ',0 8PI 6,' 10PI 6,'

O

1 x 10' 0,005 'PI 0 6,' 9PI ',3 11PI 6,'

Experimento control: Proceso convencional de frasco rodante para EU PRRS 94881

Frasco rodante codigo

Densidad de Siembra de Celulas TOI MOI Reco- leccion I + re- alimen- tacion TCID50 por mL Recoleccion II + re-alimen- tacion TCID50 por mL Recoleccion III Final TCID50 por mL

P

2 x 10' 3 dfas 0,005 3PI 6,' 6PI ',4 9PI 6,9

Q

2 x 10' 3 dfas 0,005 4PI 6,' 'PI 10PI 6,'

R

2 x 10' 3 dfas 0,005 5PI ',0 8PI ',2 11PI 6,6

S

2 x 10' Al cabo de 3 dfas, se hizo un recuento de las celulas para el calculo de MOI para los FRs P, Q y R

La Tabla 11 muestra el experimento inicial disenado para definir el proceso simultaneo en frasco rodante basado en los siguientes parametros a partir del proceso descrito en los Ejemplos 1 y 2 y los informes del virus de siembra de trabajo mostrados en la Tabla 12a.

5 Tabla 12a: Parametros evaluados para definir el proceso simultaneo en frasco rodante

parametros

intervalo informacion

Densidad de siembra de celulas por cada FR de 850cm2

3,5 x 106 bajo intervalo de siembra de celulas

',0 x 106

Intervalo medio de siembra de celulas

1,0 x 10'

Equivalente a FR de 300 L basado en celulas/mL

MOI

0,005 Proceso convencional en FR

0,1

MOI diana para proceso en FR de 300 L

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Quince frascos rodantes fueron sembrados con celulas MA-104 a densidades de siembra de celulas que oscilan entre 3,5 x 106 y 1 x 107 (vease la Tabla 11 columna 2). Los frascos rodantes fueron marcados por orden alfabetico. Conjuntos de tres frascos rodantes teman la misma densidad de siembra de celulas y el mismo MOI que oscilaba entre 0,005 y 0,1 (Tabla 11, tercera columna).

Se evaluaron tres densidades de siembra de celulas y dos MOIs (Tabla 12). Conjuntos de tres frascos rodantes teman la misma densidad de siembra de celulas y el mismo MOI (Tabla 4, columna 1). Los frascos rodantes se ajustaron de acuerdo con la preparacion del frasco rodante y del medio arriba descrita y se incubaron en un sacudidor rodante a una velocidad de 0,5 RPM a 37°C en incubadora.

La recoleccion I de los frascos rodantes A, D, G, J y M se produjo el dfa 5 PI, y luego se re-alimentaron y se incubaron durante dos dfas. Luego se realizo la R-II, los frascos rodantes se re-alimentaron e incubaron y se realizo una tercera recoleccion y final dos dfas mas tarde.

La R-I de los frascos rodantes B, E, H, K y N se produjo el dfa 6 PI, y luego se re-alimentaron y se incubaron durante dos dfas. Luego se realizo la R-II; los frascos rodantes se re-alimentaron una vez mas y se re-incubaron. Una tercera recoleccion y final dos dfas mas tarde.

Finalmente, la R-I de los frascos rodantes C, F, I, L y O se produjo el dfa 7 PI, y luego se re-alimentaron y se incubaron durante dos dfas. Luego se realizo la R-II, los frascos rodantes se re-alimentaron y re-incubaron y se realizo una tercera recoleccion y final dos dfas mas tarde.

El proceso convencional en frascos rodantes (frascos rodantes P, Q, R y S) se utilizo como un control para este experimento. Este proceso se desarrollo con dos recolecciones. La tercera recoleccion se anadio al porceso en estos experimentos, asf como el intervalo de recoleccion-I de hasta 5 dfas PI.

Celulas MA104 se sembraron en frascos rodantes de 850cm2 a razon de 2 x 107 y se incubaron durante 3 dfas (frascos rodantes P, Q, R y S). Al cabo de tres dfas, el frasco rodante S se tripsinizo y las celulas se recontaron mediante Vi-cell. El recuento de celulas se utilizo para el calculo del MOI del virus para los FRs P, Q y R. La cantidad calculada de virus se anadio a los frascos rodantes que se incuban a 37°C en un sacudidor rodante. Al cabo de 3 dfas, se realiza la recoleccion-I en el frasco rodante P, que luego fue re-alimentado e incubado a 37°C. Despues de 3 dfas, se obtuvo una segunda recoleccion, y se re-alimento una segunda vez y se incubo durante 3 dfas adicionales para una recoleccion tercera y final.

Los frascos rodantes Q y R siguieron el mismo proceso despues de la R-I, el dfa 4 PI para el FR Q y 5 PI para el FR R.

El proceso convencional en frascos rodantes es mas largo que el proceso simultaneo descrito en los Ejemplos 1 y 2 y requiere mas trabajo, ya que las celulas necesitan crecer durante 3 dfas antes de ser infestadas con el virus. Tambien, requiere el doble de la densidad de siemnra de las celulas cuando se compara con el proceso simultaneo, pero una MOI nas baja. Este proceso proporciono altos tftulos consistentes para las tres recolecciones.

Se decidio que el tiempo de recoleccion R-I (TOH) para el proceso simultaneo se basara solo en los dfas diana, independientemente del consumo de dextrosa. Se tomaron muestras para medir la dextrosa y el tftulo los dfas de recoleccion.

En base a los criterios para el tftulo aceptable de potencia (Tabla 10), los frascos rodantes A, B, C, D, E y F mostraron tftulos inconsistentes para las recolecciones I, II y III.

Los frascos rodantes G, H e I con una densidad de siembra de las celulas de 7 x 106 y una MOI diana de 0,1 teman un nivel de dextrosa en la primera recoleccion dentro del objetivo de < 0,1 g/L. Los resultados de los tftulos para los frascos rodantes G y H eran aceptables. Para la recoleccion-II, todos los frascos rodantes G, H e I teman tftulos de logs alto 6 y bajo 7. Para la recoleccion-III, los frascos rodantes G y H eran aceptables con tftulos de 6,6 y 6,5, respectivamente. Para la mayona del conjunto de recolecciones G, H e I eran aceptables.

El siguiente experimento J, K y L era el mas prometedor en terminos de tftulos. La dextrosa se consumio en la R-I para todos los FRs y el tftulo dentro de criterios aceptables en base a la Tabla 10. En las segunda y tercera recolecciones los tftulos tambien cumpftan los criterios en la Tabla 3, excepto para dos frascos rodantes. La R-III para los FRs J, K y L se extendio durante un dfa mas, demostrando que los tftulos segrnan siendo aceptables. (Tabla 11)

Los ultimos frascos rodantes M, N y O teman una elevada densidad de siembra de celulas y una MOI baja mostraba resultados de tftulos consistentes para los frascos rodantes N y O.

Tabla 12b: Comparacion de parametros entre el proceso simultaneo en frascos rodantes y el proceso en biorreactor

Parametro

biorreactor de 300 L Conjunto de frascos rodantes J, K y L

Volumen de trabajo de medio mas suero en mL

283500 400

Densidad de siembra de celulas/mL

2,53 x 104 2,5 x 104

MOI

0,1 0,1

En base a la Tabla 10, los resultados de los frascos rodantes J, K y L TCID50/1T1L mostrados en la Tabla 11, cumplieron todos los criterios para las recolecciones I, II y III. La relacion de la densidad de siembra de celulas por 5 mL en los frascos rodantes J, K y L son equivalentes a la densidad de siembra de celulas en el biorreactor por mL (Tabla 6) para el de 300 L. En base a estos datos, los parametros para los frascos rodantes J, K y L eran los elegidos para una operacion de confirmacion (Tabla 13).

Tabla 13: Establecimiento de la operacion de confirmacion en el proceso simultaneo en frascos rodantes y concentracion de dextrosa en la recoleccion-I

Frasco rodante codigo

Densidad de siembra de celulas/FR MOI Recoleccion I + re-alimen- tacion dextrosa g/L a TOH H II + re-alimen- tacion H III Final

J1

1 x 10' 0,1 5PI 0,080 'PI 9PI

J2

1 x 107 0,1 5PI 0.128 'PI 9PI

J3

1 x 10' 0,1 5PI 0,066 'PI 9PI

J4

1 x 10' 0,1 5PI 0.0'6 'PI 9PI

J5

1 x 10' 0,1 5PI 0.128 'PI 9PI

K1

1 x 10' 0,1 6PI 0.13' 8PI 10PI

K2

1 x 10' 0,1 6PI 0,058 8PI 10PI

K3

1 x 10' 0,1 6PI 0,100 8PI 10PI

K4

1 x 10' 0,1 6PI 0,088 8PI 10PI

K5

1 x 10' 0,1 6PI 0,08' 8PI 10PI

L1

1 x 10' 0,1 'PI 0,005 9PI 11PI

L2

1 x 10' 0,1 'PI 0,006 9PI 11PI

L3

1 x 10' 0,1 'PI 0,0 9PI 11PI

L4

1 x 10' 0,1 'PI 0.013 9PI 11PI

L5

1 x 10' 0,1 'PI 0,004 9PI 11PI

10

La Tabla 13 muestra la tanda de confirmacion para el proceso simultaneo elegido evakuado en la Tabla 10.

Se ajusto un total de 15 frascos rodantes a una densidad de siembra de celulas de 1 x 107 cada una en 400 mL de medio con suero y siembra de EU PRRS 94881 MSV+4 a una MOI de 0,1. Los frascos rodantes se dividieron en 3 grupos de 5. La recoleccion-I se realizo el dfa 5 PI oara los FRs J1 a J5, el dfa 6 PI para K1 a K5 y el dfa 7 PI para

5

10

15

20

25

L1 a L5. La dextrosa se midio para cada uno de los frascos rodantes. Despues, las recolecciones se agruparon y se tomaron muestras para cada uno de los tftulos. Subsiguientemente, se realizaron re-alimentaciones y recolecciones II y III final.

En la recoleccion-I, por termino medio, todos los quince frascos rodantes teman dextrosa dentro de criterios de recoleccion de < 0,1g/L para el proceso de biorreactor (Tabla 3), que confirmo que el proceso es consistente en frascos rodantes.

Tabla 14: Sumario de las condiciones y resultados TCID50 del proceso simultaneo en frasco rodante

Lote (agrupacion de 5 frascos rodantes)

PCD MOI TOH1 Dextrosa g/L a TOH1 TCIDso/mL H1 TOH2 TCIDso/mL H2d TOH3 TCIDso/mL H3

J

1,0 x 10' 0,1 5PI 0.092 6,5 7PI 7,3 9PI 6,5

K

1,0 x 10' 0,1 6PI 0,084 6,7 8PI 7,6 10PI 6,7

L

1,0 x 107 0,1 7PI 0,000 6,5 9PI 7,7 11PI 7,4

La Tabla 14 muestra un sumario de las condiciones y los tftulos de virus en TCID50 /mL para la agrupacion de frascos rodantes J, K y L para R-I, R-II y R-III para el proceso simultaneo en frascos rodantes de la presente invencion.

Para imitar el proceso en frascos rodantes, se agruparon muestras de cada uno de los frascos rodantes individuales para el conjunto J (Tabla 13) y la muestra agrupada para el tftulo. El mismo proceso se aplico a los frascos rodantes K y L para R-I, R-II y RIII.

La dextrosa para las muestras de la agrupacion R-1 eran 0,0 g/L para J, K y L. Los tftulos para R-I, R-II y R-III oscilan de 6,5 a 7,7 que es equiparable al proceso en el biorreactor de 300 L. (Tabla 15)

Tabla 15: Sumario de las condiciones y resultados de TCID50/mL del proceso simultaneo validado en FR de 300 L*

Lote

PCD MOI TOH1 Dextrosa g/L a TOH1 TCID50/mL H1 TOH2 TCID50/mL H2d TOH3 TCID50/mL H3

021610PD

7,2 x 109 0,1 5PI 0,0 7,5 7PI 7,5 9PI 6,7

030110PD

7,2 x 109 0,1 6PI 0,0 7,3 8PI 7,4 10PI 7,4

031510PD

7,2 x 109 0,1 7PI 0,0 7,5 9PI 6,7 11PI 7,4

*muestras contienen SGS como estabilizador

La Tabla 15 muestra los parametros y los tftulos en TCID50/1T1L para las tres tandas de validacion realizadas bajo condiciones de cGMP. Los tres lotes teman la misma densidad de celulas de siembra y la misma MOI. La dextrosa era 0,0 g/L en la recoleccion I para los tres lotes. Todas las recolecciones teman resultados dentro de criterios de aceptacion.

Intervalo de densidad de celulas de siembra (PCD) para frasco rodante:

La densidad de celulas de siembra (PCD) es 1,0 x 107 celulas totales por cada frasco rodante con un volumen de trabajo de 400 mL. Para el intervalo bajo 7 x 106 se evaluo (Tabla 4) asimismo con tftulos aceptables. El intervalo alto fue evaluado en el proceso convencional (Tabla 11).

Intervalo de la multiplicidad de infeccion (MOI) para frascos rodantes:

La MOI diana de 0,1 es ideal para la propagacion de EU PRRS 94881 dentro de este sistema de crecimiento. Los niveles bajo y alto de la MOI de 0,01 y 0,3, respectivamente, se examinaron en los biorreactores de 30 L. En el frasco rodante, debido a limitaciones en el tiempo, solo se evaluaron las dianas 0,1 MOI y 0,005 MOI (Tabla 10).

5 Analisis

Los parametros recomendados del procesos simultaneo en los frascos rodantes se esbozan en la Tabla 16. Solamente se testaron parametros diana y se consideraron por si eran cnticos o no cnticos para el proceso. Las definiciones son como sigue: Parametros cnticos son aquellos parametros que son cnticos para los atributos de calidad del producto final y parametros no cnticos son aquellos parametros que se pueden controlar directamente 10 dentro del intervalo definido o que tienen un amplio intervalo operativo, de modo que una desviacion desde el punto establecido no es cntica. Parametros no cnticos ayudan a controlar los parametros cnticos dentro del intervalo definido.

Tabla 16: Sumario de los parametros del proceso simultaneo en frascos rodantes para EU PRRS 94881 MLV.

Parametro

Limite Inferior Testado Limite Superior Testado Intervalo aceptable Diana Crftico/No Cntico

MOI

0,005 0,1@ 0,005 -0,3y 0,10 NC

Densidad de siembra de celulas por cada frasco rodante

7 x 106 celulas 2,0 x 107 celulas n° 7,0 x 106 celulas a 2,0 x 107 celulas 1,0 x 107 celulas NC

Tiempo de la 1a Recoleccion (Dias post- infeccion)

Dfa 5 Dfa 7 Dfa 5 - Dfa 7 PI Dfa 5 - 7 PI Cntico **

Temperatura

NE 37°C 36 + 1°C 36 °C NC

Tiempo de 2a Recoleccion (Dias post re-alimentacion)

Dfa 2 Dfa 2 NE 2 Cntico

Tiempo de 3a Recoleccion (Dias post re-alimentacion)

Dfa 2 Dfa 2 2-3 2 Cntico

15 ** El criterio de primera-Recoleccion se decide por el tiempo del consumo completo de dextrosa en el periodo de 5-7

dfas PI.

# basado en el proceso convencional en frascos rodantes @ testado en la escala del biorreactor de 30 L, 300 L y frasco rodante & testado en la escala del biorreactor de 30 L 20 Conclusiones

El desarrollo del proceso simultaneo en frasco rodante se consiguio con exito y es equivalente al proceso en biorreactor descrito anteriormente en terminos de potencia medida como TCID50/mL. Los parametros cnticos para R-I, R-II y R-III en el objetivo se reprodujeron con exito en el proceso simultaneo en frascos rodantes.

Las realizaciones preferidas para el proceso simultaneo en frascos rodantes para EU PRRS 94881 MLV son como 25 sigue para la propagacion del virus, RECOLECCION-I: La composicion del medio MEM con 1,4 g/L de bicarbonato de sodio; Celulas de siembra a 1 x 107 / frasco rodante de 850 cm2 Corning con 400 mL de medio suplementado con 20 mL de suero bovino fetal al 5% v/v (intervalo: 7 x106 - 2 x107 /frasco rodante); Temperatura controlada a 36 ± 1°C; la velocidad de sacudidor del frasco rodante es 0,5 RPM; y la MOI diana es 0,1.

Para el criterio de recoleccion-I, comenzar el muestreo para las mediciones de dextrosa duera de lmea el dfa 5 PI. 30 La Recoleccion-I debena realizarse cuando la dextrosa es < 0,1 g/L, lo cual ocurre habitualmente entre los 5-7 dfas PI. Sin embargo, si se ha de realizar una segunda recoleccion, re-alimentar primero RECOLECCION II.

II. Primera Re-Alimentacion- RECOLECCION-II

Re-alimentar con 400 mL de composicion de medio MEM, y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio suplementado con 20 mL de suero de bovino fetal (al 5% v/v). Realizar la re-alimentacion bajo las mismas condiciones que el primer ajuste del medio de recoleccion (veanse los parametros de primera recoleccion anteriores). El control de la temperatura ha 5 de permanecer en un punto establecido de 36 ± 1°C. La velocidad de sacudidor del frasco rodante es 0,5 RPM. La segunda recoleccion de fluidos virales se produce el dfa 2 post-re-alimentacion.

III. Segunda Re-Alimentacion - RECOLECCION-IM:

Re-alimentar con 400 mL de composicion de medio MEM, neomicina y 1,4 g/L de bicarbonato de sodio suplementado con 20 mL de suero de bovino fetal irradiado (al 5% v/v). Realizar la re-alimentacion bajo las mismas 10 condiciones que el ajuste del medio de la primera recoleccion (veanse los parametros de la segunda recoleccion anteriores). El control de la temperatura ha de permanecer en un punto establecido de 36 ± 1°C. La velocidad de sacudidor del frasco rodante es 0,5 RPM. La tercera recoleccion de fluidos virales se produce el dfa 2 post-re-alimentacion.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para la produccion a escala comercial de virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV), que comprende:

   a) al mismo tiempo, sembrar un medio de cultivo a gran escala con una lmea de celulas de mairnfero que es permisiva a una infeccion por el PRRSV en un biorreactor e infestar dichas celulas de mamffero con un PRRSV;

   b) propagar el virus durante 5 a 7 dfas post-infeccion;

   c) llevar a cabo una primera etapa de recoleccion separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado;

   d) reponer el medio en dicho biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 dfas;

   e) llevar a cabo una segunda etapa de recoleccion separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado;

   f) reponer el medio en dicho biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 dfas; y

   g) llevar a cabo una tercera etapa de recoleccion separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1 que comprende, ademas, al menos una etapa de re-alimentacion y de recoleccion subsiguientes a la tercera etapa de recoleccion, que comprende reponer el medio en dicho biorreactor y propagar el virus durante 1 a 4 dfas, y realizar una cuarta etapa de recoleccion separando el medio de dicho biorreactor y aislando del mismo el virus propagado.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la multiplicidad de infeccion (MOI) diana es 0,01 a 0,30.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichas celulas de mamffero se siembran a una densidad de aproximadamente 7 x 108 a 1,0 x 109 por biorreactor de 300 L.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que dicha densidad de siembra de celulas es aproximadamente 1,0 x 109 por biorreactor de 300 L.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que dicha infeccion es con aproximadamente 7 x 108 partmulas de virus por biorreactor de 300 L.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende vigilar la concentracion de dextrosa de dicho medio, en el que dicha primera etapa de recoleccion se realiza el primer dfa cuando la concentracion de dextrosa del medio disminuye a menos de 0,1 g/L.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha segunda recoleccion se realiza 1 o 2 dfas post-re-alimentacion con medio.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha tercera recoleccion se realiza 1 a 4 dfas post la segunda re- alimentacion con medio.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el medio de cultivo se anade al biorreactor el dfa antes o el mismo dfa antes de la adicion de dicha lmea de celulas de mamnfero y dicho PRRS.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el medio de cultivo se anade al biorreactor un dfa antes de la adicion de dicha lmea de celulas de mamffero y dicho PRRS.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la temperatura de dicho biorreactor se ajusta entre 34°C y 38°C.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho medio comprende suero de ternero fetal irradiado al 5% v/v.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho PRRS se selecciona del grupo consistente en la cepa de PRRSV ECACC 11012501, ECACC 11012502, VR 2332, la cepa del virus Lelystad (Agente Lelystad (CDI-NL-2.91), u otras cepas tales como las depositadas bajo los Numeros de Acceso eCaCC 04102703, ECaCc 04102702, ECACC 04102704, N° de Acceso ante CNCM I-1140, N° de Acceso ante CNCM I-1387, N° de Acceso ante CNCM I- 1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 y VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I- 1387, CNCM I-1388 o ECACC V93070108; deposito ATCC VR-2332, deposito ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 y ATCC VR 2402.
15. 15. Un metodo de produccion a escala comercial para la preparacion de un PRRSV, que comprende:

    a. una siembra simultanea tanto de celulas de mamffero permisivas a la infestacion por dicho PRRSV como de

    10

    15

    20

    dicho PRRSV en un biorreactor que contiene un medio adecuado para el crecimiento de dichas celulas; y

    b. realizar tres etapas consecutivas de recoleccion, en donde se recolecta PRRSV, en donde, despues de cada una de las primera y segunda recolecciones, se repone el medio, y en donde:

    i. la primera recoleccion se realiza el primer dfa en el que la concentracion de dextrosa del medio desciende a menos de 0,1 g/L;

    ii. la segunda recoleccion se realiza 1 o 2 dfas despues de la adicion del medio tras la primera recoleccion; y

    iii. la tercera recoleccion se realiza entre 1 y 4 dfas despues de la adicion del medio tras la segunda recoleccion.
16. 16. Un metodo para la produccion a escala comercial de virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV), que comprende:

    a) al mismo tiempo, sembrar un medio de cultivo a gran escala con una lmea de celulas de mairnfero que es permisiva a una infeccion por el PRRSV en frascos rodantes e infestar dichas celulas de mamffero con un PRRSV;

    b) propagar el virus durante 5 a 7 dfas post-infeccion;

    c) llevar a cabo una primera etapa de recoleccion separando el medio de dicho frasco rodante y aislar del mismo el virus propagado;

    d) reponer el medio en dicho frasco rodante y propagar el virus durante aproximadamente 2 dfas;

    e) llevar a cabo una segunda etapa de recoleccion separando el medio de dicho frasco rodante y aislar del mismo el virus propagado;

    f) reponer el medio en dicho frasco rodante y propagar el virus durante aproximadamente 2 dfas; y

    g) llevar a cabo una tercera etapa de recoleccion separando el medio de dicho biorreactor y aislar del mismo el virus propagado.