CN103370077B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒的商业化规模生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述用于制备PRRS病毒的有效商业化规模生产方法。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒的商业化规模生产方法
发明领域
本发明涉及活的减毒猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的商业化规模生产，该病毒可用于制备基于该病毒的疫苗；涉及该病毒用于治疗猪的用途。
发明背景
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)被许多人视为目前影响全世界养猪业的最重要的疾病。1987年，该综合征首先在美国描述为“神秘猪疾病”且迅速传遍全球。其引起生殖力严重降低，致使因继发性感染引起的死亡率增加，且导致饲料转化率及平均日增重降低。不幸的是，已证明难以控制引起PRRS的病毒。
PRRS病毒(PRRSV)为一种归类于动脉炎病毒家族(family Arteriviridae)的包膜单链RNA病毒(Cavanaugh,1997)。其引起广泛的猪疾病，该猪疾病首先于1987年在美国描述为“神秘猪疾病”(Hill,1990)。该疾病在所有年龄组的猪中均表现为呼吸疾病，引起一些较年轻的猪死亡以及在繁殖适龄母猪中产生严重的生殖问题。
PRRSV可经由受感染猪与易感染猪之间的直接接触传播且常常如此。在极短距离内也可能通过空气或经由精液传播。一旦感染，病毒可在成年猪血液中保留约两周至四周，且在受感染猪中保留1至2个月或更长时间。受感染公猪可持续将病毒排在精液中长达100天以上。此长期病毒血症显著提高传播的可能性。此外，PRRS病毒可在妊娠期倒数第三期期间穿过胎盘，感染子宫内的仔猪且引起死胎或产下弱仔猪。
所有类型及规模的畜群，包括健康状态良好或一般的或者来自室内或室外单元的畜群，均可感染PRRS病毒。感染畜群可能遭遇严重的生殖力降低，以及断乳后肺炎程度提高且生长缓慢。生殖期通常持续两至三个月；然而，断乳后问题经常变成地方病。生殖疾病的特征为在妊娠后期影响种猪与小母猪的流产爆发。在妊娠约109天及112天过早产下小猪。死胎及产下弱仔猪的数目增加且引起断乳前死亡率显著增加。
传统上已在养殖场，特别是连续流动养殖场中见到呼吸期。然而，也可在肥育畜中见到作为猪呼吸疾病综合征(porcine respiratory disease complex；PRDC)的一部分的由PRRS病毒引起的呼吸问题。生长速率会降低，不能出售的猪的百分比增加，且断乳后死亡率升高。诊断结果指示存在与PRRS病毒相关联的高程度肺炎，以及一般视为继发感染原的多种其他微生物。细菌分离株可尤其包括猪链球菌(Streptococcus suis)、猪嗜血杆菌(Haemophilussuis)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、猪肺炎霉浆菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)。通常涉及的病毒剂包括猪流感病毒及猪呼吸道冠状病毒。患病猪很少对高水平的药物治疗起反应，且全进/全出(all-in/all-out)系统已无法控制该疾病。
PRRSV病毒以两种称为“美国”型与“欧洲”型的基因型存在，这种基因型共享约50％序列同源性(Dea S等人，(2000).Arch Virol 145:659-88)。此两种基因型也可以其免疫性质而加以区分。有关各种分离株的大部分序列信息是基于结构蛋白，即仅占病毒基因组约4％的包膜蛋白GP5，而关于非结构蛋白(nsp)所知甚少。PRRSV的分离及疫苗的制造已在多个公开案中描述(WO92/21375、WO 93/06211、WO 93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930)。
疫苗接种为减轻PRRS负担的关键方法，因为自PRRS感染恢复的猪将发展免疫反应，此免疫反应在正常情况下将保护猪免遭相同病毒株再次感染。然而，因为PRRS病毒在阳性单链RNA病毒中常发生高速率突变，故其具有变化的能力；因此，可能出现新的病毒株。在这种状况下，病毒株之间的交叉保护可能不存在，且在先前已感染的农场中可能观察到新的爆发。因此，持续需要其他疫苗。
制备减毒活病毒疫苗的最常用方法为在除天然宿主以外的基质(通常为含有可感染病毒的细胞系的细胞培养物)中连续传代病毒，直至其减毒(也即毒性或致病能力降低)至足以用作疫苗。对于第一代，将细胞培养物用所选接种物感染。获得明显的病毒复制迹象(例如受感染细胞中病毒诱发的细胞病变效应[CPE])后，使用第一代的细胞培养物的等分试样或受感染细胞或两者来感染第二细胞培养物。重复此过程，直至病毒基因组中的一或多个关键突变引起充分减毒，使得病毒可安全地用作疫苗。减毒程度通常由将天然宿主暴露于逐渐更大传代水平的病毒来凭经验确定。
以上程序基本上可靠且已成功地用于研发许多疫苗供人类及兽医学使用。然而，当开始工业规模生产时，仍然需要提供一种有效且成本有效的PRRSV制备方法。
发明内容
本发明涉及一种制备用于制造该等疫苗的活PRRS病毒的新方法。本文所述的方法可用于大规模生产任何PRRS病毒，包括但不限于根据布达佩斯条约的规定保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC11012501及ECACC 11012502(各自于2011年1月25日保藏)下的PRRSV94881 PRRSV株94881，或上述病毒株之一的任何后代或子代。
更具体地，本发明涉及一种商业化规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，其包括：
a)将含有允许PRRSV感染的哺乳动物细胞系的大规模培养基接种至生物反应器中的同时，用PRRSV感染哺乳动物细胞。
b)感染后使病毒繁殖5至7天；
c)通过自生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第一次收获步骤；
d)补充生物反应器中的培养基，且使病毒繁殖1至4天；
e)通过自生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第二次收获步骤；
f)补充生物反应器中的培养基，且使病毒繁殖1至4天；及
g)通过自生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第三次收获步骤。
在某些实施方案中，该方法在第三次收获步骤之后可进一步包括至少一次再进料及收获步骤，其包含补充生物反应器中的培养基且使病毒繁殖1至4天，且通过自生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第四次收获步骤。
优选地，在制备方法中，目标感染倍率(MOI)为0.01至0.30，且哺乳动物细胞以每个300L生物反应器中约7×108至1.0×109个细胞的密度种植。更具体地，细胞种植密度为每个300L生物反应器中约1.0×109个细胞。在具体实施方案中，MOI为约7×108个病毒粒子。
该方法可包括监测培养基的右旋糖浓度，其中第一次收获步骤在培养基的右旋糖浓度降至小于0.1g/L的第一天进行。
在商业化制备方法中，第二次收获优选地在培养基再进料后1或2天进行，且第三次收获在培养基第二次再进料后1至4天进行。
在具体实施方案中，在添加哺乳动物细胞系及PRRS的前一天或同一天，将培养基添加至生物反应器中。优选地，在添加哺乳动物细胞系及PRRS的前一天将培养基添加至生物反应器中。生物反应器的温度设定在34℃与38℃之间。
在具体实施方案中，培养基包含5体积％的经照射的胎牛血清。
该方法可用于商业化规模生产任何PRRSV，包括但不限于选自以下的PRRSV：根据布达佩斯条约的规定各自于2011年1月25日保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号ECACC 11012501及ECACC 11012502下的PRRSV 94881PRRSV株94881；VR 2332、莱利斯塔病毒株(Lelystad virusstrain)(莱利斯塔物质(Lelystad Agent)(CDI-NL-2.91))或其他株，诸如保藏在登录号ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCMI-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402下的病毒株，或上述病毒株之一的任何后代或子代。
也涵盖一种用于制备PRRSV的商业化规模生产方法，其包括：
a.将允许PRRSV感染的哺乳动物细胞与PRRSV同时接种至含有适于细胞生长的培养基的生物反应器中；及
b.进行三次收获PRRSV的连续收获步骤，其中分别在第一次及第二次收获后补充培养基，且其中：
i.第一次收获在培养基的右旋糖浓度降至小于0.1g/L的第一天进行；
ii.第二次收获在第一次收获后添加培养基之后1或2天进行；及
iii.第三次收获在第二次收获后添加培养基之后1至4天进行。
也涵盖一种替代性方法，其使用等同于上述生物反应器工艺的并行滚瓶工艺。更具体地，本发明涉及一种商业化规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，其包括：a)将含有允许PRRSV感染的哺乳动物细胞系的大规模培养基接种至滚瓶中，同时用PRRSV感染所述哺乳动物细胞；b)感染后使病毒繁殖5至7天；c)通过自该滚瓶移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第一次收获步骤；d)补充该滚瓶中的培养基，且使病毒繁殖约2天；e)自该滚瓶移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第二次收获步骤；f)补充该滚瓶中的培养基，且使病毒繁殖约2天；及g)通过自该生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第三次收获步骤。
本发明的另一方面涉及一种PRRSV MLV，其包含根据本文所述的方法制备的PRRSV，将其用可接受的佐剂或载体调配以递送至猪。
附图说明
图1：大规模生产PRRSV 94881的并行工艺。
图2：300L生物反应器的并行工艺的定义及时间表。
图3：300L生物反应器中三个并行操作的病毒效价及右旋糖概况。
图4：300L生物反应器中三个并行操作的病毒效价及谷氨酰胺概况。
图5：300L生物反应器中三个并行操作的病毒效价及溶解氧(DO)概况。
图6：显示RT-PCT时间PCR结果，其描绘以PRRSV 94881接种的动物中病毒血症百分比的。
图7：滚瓶制备PRRSV 94881的并行工艺。
图8：滚瓶工艺的并行工艺的定义及时间表。
发明详述
本发明提供大规模生产用于制备疫苗及其他组合物的活的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法。在典型制备方法中，病毒生长在允许PRRSV感染的细胞系上。然而，在这种一般方法中，细胞系在感染PRRSV之前生长至汇合或接近汇合。在本发明中，本发明者出人意料地证明细胞系在用PRRSV感染之前不需要种植及生长，而是可将PRRSV及细胞系同时添加至细胞培养工艺中。因此，当以商业化规模大量制备病毒时，本发明提供节约时间、成本及材料的显著优点。术语商业化规模是指超过10L的细胞培养物体积。举例而言，商业化规模是指活PRRSV的10L至3000L范围内的制备规模。在更具体实施方案中，所述体积为30L至约300L。
本发明的方法可用于制备任何PRRSV株，包括但不限于以ATCC VR2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108保藏的PRRSV株。在尤其优选的实施方案中，本发明的方法用于制备根据布达佩斯条约规定各自于2011年1月25日保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(Porton Down,Salisbury,30Wiltshire,SP4 0JG,英国)登录号ECACC 11012501(亲本株)及ECACC 11012502(高代数减毒MSV)下的PRRSV株94881(其由Bioscreen GmbH,Mendelstrasse 11,48149,Muenster,Germany保藏)，或上述病毒株之一的任何后代或子代。生长的病毒可为呈减毒格式的任何上述病毒。或者，病毒可经遗传修饰，以包含一种或多种异源核苷酸，该核苷酸编码一或多种猪疾病的其他抗原决定子。
技术人员应了解存在多种允许PRRSV感染的细胞系。例示性细胞为猪肺泡巨噬细胞，如来源于MARC-145细胞的这种细胞。可感染PRRSV的其他细胞包括经转染的以下细胞：MA-104细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；及除MA-104细胞或MARC-145细胞以外的非洲绿猴肾细胞，如VERO细胞。此外，细胞可为来自猪类动物的原生细胞，其已适于长期生长在培养物中。尤其适合的宿主细胞为类人猿细胞系MA-104、VERO细胞或猪肺泡巨噬细胞。PRRSV优先在肺泡肺巨噬细胞中生长(Wensvoort等人，1991)。一些细胞系(如CL2621)及自猴肾细胞系MA-104克隆的其他细胞系(Benfield等人，1992；Collins等人，1992；Kim等人，1993)也容易感染病毒，且可用于本文所述的大规模生产方法中。
在以下实施例1中所示的本发明的例示性方法中，提供一种制备PRRSV94881 MLV的并行工艺。虽然此程序针对PRRSV 94881 MLV而显示，但技术人员应了解此程序可容易地用于需要大规模生产的任何PRRSV。
由本发明制备方法制备的病毒可用于目前使用PRRSV的任何应用。在一个具体实施方案中，根据本文所述的方法制备的病毒用以制备PRRSV MLV。
根据本发明方法生长的病毒株可为毒性PRRS病毒、减毒PRRS病毒或实际上已被修饰以赋予其他所需性质的PRRS病毒。这可由经典繁殖及选择技术来达成，如在适合的宿主细胞中持续繁殖以扩展减毒表型。或者，病毒株可通过适合的基因工程改造技术，使这些病毒株的基因组的核酸序列定向突变来进行遗传修饰。PRRSV的基因组已得到完全或部分定序(Conzelmann等人，1993；Meulenberg等人，1993a；Murthaugh等人，1995)，且编码除RNA依赖型RNA聚合酶(ORF 1a及1b)之外的六种结构蛋白，包括四种称为GP2(ORF2)、GP3(ORF3)、GP4(ORF4)及GP5(ORF5)的包膜糖蛋白、一种非糖基化膜蛋白M(ORF6)及核衣壳蛋白N(ORF7)(Meulenberg等人，1995,1996；van Nieuwstadt等人，1996)。欧洲型及美国型PRRSV株的免疫表征及核苷酸定序已鉴别出PRRSV株位于结构病毒蛋白内的次要抗原差异(Nelson等人，1993；Wensvoort等人，1992；Murtaugh等人，1995)。
实际上，本发明中生长的例示性病毒为PRRSV 94881病毒。虽然减毒株使用本文所述的方法生长，但病毒可容易成为被制成嵌合病毒的PRRSV94881病毒，其中修饰ECACC登录号为11012502的PRRSV 94881病毒或实际上保藏在ECACC登录号11012501下的亲本株的骨架，以用来自不同PRRS病毒株的相应ORF置换ORF 1a、ORF 1b、ORF 2、ORF 3、ORF 4、ORF 5、ORF 6或ORF 7中一种或多种的内源性序列。例如，不同PRRS病毒株可为不同的欧洲型株，如莱利斯塔病毒株(莱利斯塔物质(CDI-NL-2.91))，或其他株，如保藏在登录号ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下的病毒株，或实际上可为美国型株，如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。
用于制备经修饰序列的重组技术为本领域的技术人员所熟知，且通常采用构筑病毒基因组的全长互补DNA副本(感染性克隆)，接着可藉由DNA重组及操纵方法(如定点诱变等)对其进行修饰。以此方式，可修饰例如病毒蛋白的抗原位点或酶性质。欧洲及北美基因型PRRS病毒株的感染性克隆已在文献中报导且可使用本发明的方法生长。
优选地，本发明的疫苗为经修饰的活疫苗，其包含在适合的载体中的一或多种这种活株，但也可使用钝化的病毒来制备灭活疫苗(KV)。MLV通常调配成允许每一剂给予101至107个病毒粒子，优选地每一剂103至105个粒子，更优选地每一剂104至105个粒子(4.0-5.0log10TCID50)。KV可基于每一剂103至1010个病毒粒子的预钝化效价调配。疫苗可包含可药用的载体，例如生理盐溶液。疫苗可包含或可不包含佐剂。适合的佐剂的一个实例为α-生育酚乙酸酯，其可以商品名Diluvac获得。或者，可使用例如基于明矾(alum)的佐剂。
猪可经由口鼻途径感染PRRSV。肺中的病毒由肺的肺泡巨噬细胞吸收，且在这些细胞中在9小时内完成PRRSV复制。PRRSV在12小时内自肺行进至肺淋巴结，且在3天内行进至周围淋巴结、骨髓及脾。在这些部位，仅少数细胞对病毒抗原呈染色阳性。病毒在血液中存在至少21天且通常时间长得多。7天后，在血液中发现PRRSV抗体。受PRRS感染猪中病毒与抗体的组合存在表明尽管存在抗体，但病毒感染可持续长时间，尽管感染程度低。在至少7周内，肺中的肺泡细胞群体不同于正常SPF肺。
疫苗可以活病毒的冷冻干燥制剂形式提供，其用溶剂重组，产生注射用溶液。因此，在本发明的收获步骤后，病毒可合并且冷冻干燥。溶剂可例如为水、生理盐水或缓冲液或辅助溶剂。溶剂可含有佐剂，例如α-生育酚乙酸酯。重组的疫苗接着可注射至猪中，例如以肌内或皮内注射液的方式注射至颈中。对于肌内注射，可应用2ml体积，对于皮内注射，其通常为0.2ml。因此，在另一方面中，本发明为一种疫苗产品，其在分离的容器中包含病毒的冷冻干燥组合物及重组用溶剂，且任选地进一步含有包含使用说明书的活页或标签。
由本发明方法制备的病毒制备的疫苗不仅可包含一或多种上述株，而且也可包含对PRRS或其他猪病毒性或细菌性疾病(如猪环状病毒或经典猪瘟病毒)具有活性的其他组分。因此，本发明进一步涉及所述疫苗，其特征在于其含有至少一种对非PRRS的猪疾病具有活性的其他抗原。此外，疫苗可包含某些可药用或可兽用的佐剂。一种此类佐剂为α-生育酚。因此，新型疫苗组合物、特别是包含PRRSV 94881的PRRS病毒疫苗，可通过添加佐剂进一步改良。这种改良包含制备与加强疫苗功效的佐剂组合的疫苗，使得在给予佐剂与疫苗的组合时，可见临床反应/结果优于单独给予疫苗。例如，本发明的疫苗组合物可包含PRRSV 94881病毒疫苗及选自以下的佐剂：MCP-1、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus sonmus)级分、卡波普(Carbapol)TM及其组合。在一些实施方案中，包含PRRSV 94881病毒疫苗的病毒疫苗可为重组亚单位疫苗或者可为活减毒病毒疫苗。存在的一种例示性活疫苗为PRRS MLV，且PRRSV 94881可以类似于PRRS MLV的方式调配。
除上述外，疫苗组合物也可含有其他成分，只要其他成分不干扰MCP-1、睡眠嗜血杆菌级分、卡波普TM或其他卡波姆(carbomer)或基本的病毒疫苗即可。这种其他成分包括例如粘合剂、着色剂、干燥剂、消毒剂、湿润剂、稳定剂、赋形剂、粘着剂、增塑剂、增粘剂、增稠剂、贴附材料、软膏基质、角蛋白脱除剂、碱性物质、吸附促进剂、脂肪酸、脂肪酸酯、高级醇、表面活性剂、水及缓冲剂。优选的其他成分包括缓冲剂、软膏基质、脂肪酸、消毒剂、碱性物质或表面活性剂。
本发明中所用的佐剂的含量或量可变化，且可考虑到例如所用PRRS病毒疫苗的性质及剂型来确定。佐剂可占例如1至100重量％。将佐剂组分(单独的组分或组合其他成分)与病毒疫苗组分混合在一起来制备本发明的基于PRRSV 94881的组合物。组合物可使病毒疫苗与佐剂作为一种调配物存在，或者佐剂与疫苗存在于可同时或依序给予的不同调配物中。
在给予生物体时，佐剂组分可与病毒疫苗分开给予。或者，本发明的佐剂连同病毒疫苗一起作为单一疫苗组合物给予。病毒疫苗可为任何病毒疫苗。更具体的实施方案涵盖使用包含PRRSV 94881的PRRS病毒疫苗。此外，该种疫苗可与如PRRS MLV及/或PRRS的其他疫苗组合。此仅仅为一种例示性的PRRS病毒疫苗，且其他这样的疫苗可补充有本文所述的佐剂。
本文所述的免疫原性组合物尤其有利于诱导产生对PRRS病毒的抗体反应。具体地，本文中显示当组合给予佐剂与PRRS病毒疫苗时，相比于单独给予疫苗，使用这种特定佐剂(特别是MCP-1)可增强对PRRS病毒的免疫反应。显示该给予可减轻临床症状的严重程度，如与PRRSV感染有关的肺病变、厌食症、皮肤变色、嗜睡、呼吸征象、干瘪仔猪、咳嗽、腹泻及其组合。实际上，相比于在缺乏该佐剂下由单独给予疫苗所产生的症状严重程度的减轻，在疫苗与佐剂的组合下观察到与PRRS病毒感染有关的临床症状严重程度的减轻更多。
因此，相比于因单独给予PRRS病毒疫苗而产生的结果，组合物尤其增强了患病动物中的临床结果。在具体实施方案中，增强的临床结果为：与未接受免疫原性组合物和佐剂的组合的动物相比，肺病变百分比降低。在其他实施方案中，增强的临床结果为与未接受免疫原性组合物和佐剂的组合的动物相比，动物中的病毒血症降低。
因此，一方面，本发明涉及一种经改良的疫苗，更具体地还涉及经改良的PRRS病毒疫苗，其中所述改良包含将选自MCP-1、睡眠嗜血杆菌级分、卡波普及其组合的佐剂与病毒疫苗混合。本发明的疫苗组合物可进一步包含可药用的载体。此外，疫苗可包含其他活性成分，包括HS、ORF 5、INFα、聚ICLC、IL-12，以进一步增强PRRS疫苗的功能。这样的佐剂可单独添加或与MCP-1组合添加。
本发明的疫苗组合物可藉由调配技术中已知的任何方法调配成例如液体制剂、悬浮液、软膏、散剂、洗剂、油包水乳液、水包油乳液、乳液、乳膏、泥敷剂、贴剂及凝胶剂，且优选地用作药物。因此，根据本发明的另一方面，提供一种包含以上疫苗组合物的药物组合物。本发明的疫苗组合物在经皮给予时可显著诱导抗体产生。相应地，在本发明的另一优选实施方案中，疫苗组合物可以以经皮制剂形式提供。
此外，如上所述，本发明中的病毒及佐剂可呈单一疫苗组合物形式一起给予生物体，或呈与疫苗的抗原性PRRS病毒组分分开且不同的佐剂制剂形式给予，其中相比于生物体中响应于PRRS病毒疫苗单独给予所产生的抗体量，佐剂的作用响应于PRRS病毒疫苗所产生的抗体量显著增加。因此，根据本发明的另一方面，提供一种使针对PRRS病毒产生的抗体量增加的方法，该方法包括向生物体同时或依次给予免疫有效量的PRRS病毒疫苗及有效作为免疫佐剂的量的选自MCP-1、睡眠嗜血杆菌级分、卡波普及其组合的佐剂，该佐剂单独使用或与选自HS、ORF 5、INFα、聚ICLC、IL-12及其组合的另一组分组合。
当将佐剂及PRRS病毒疫苗给予生物体时，动物的临床结果增强。佐剂的有效量及PRRS病毒疫苗的免疫有效量可由本领域的普通技术人员通过考虑例如以下因素来适当确定：抗原物质的类型及性质、生物体物种、年龄、体重、疾病严重程度、疾病类型、给药时间时间及给药时间方法；并且使用针对生物体中抗原物质产生的抗体的量作为指标。
PRRS病毒疫苗、佐剂或其组合可通过根据例如患者情况及疾病性质而选择的任何适合方法给予生物体。这种方法的实例包括腹膜内给予、经皮给予(例如皮下注射、肌内注射、皮内注射及贴剂)、经鼻给予、经口给予、经粘膜给予(例如直肠给予、阴道给予及角膜给予)。其中优选肌内给予。
PRRSV MLV的一个例示性治疗剂量为约两毫升(2mL)。技术人员将认识到，剂量可基于个别个体的品种、体型及其他身体因素以及PRRSV MLV的特定制剂及给药时间途径而变化。优选地，PRRSV MLV以单一剂量给予；然而，其他剂量可为适用的。此外，技术人员经由本发明将认识到，剂量及给药次数受个别猪的年龄及身体情况以及此行业所共同的其他考虑因素及给予PRRSV MLV的特定条件影响。
在某些其他实施方案中，疫苗可为包含两种或两种以上PRRS病毒的多价疫苗，其中至少一种PRRS病毒为保藏在ECACC登录号11012502下的减毒94881病毒。其他PRRS病毒可为一或多种选自以下的病毒：保藏在登录号莱利斯塔病毒株下的PRRSV株(莱利斯塔物质(CDI-NL-2.91))，或其他株，如保藏在登录号ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下的株，或实际上可为美国型株，诸如北美PRRS病毒pT7P129A；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402。
基于PRRS病毒的疫苗可用以接种仔猪与种猪两者。在本发明的一个方面中，特定给药方案基于猪的年龄及所选择给予的抗原。本发明发现PRRSV感染(自野生型暴露与疫苗接种两者)在年龄更大的动物中的清除快得多，基于此将使任何年龄的猪接受最有效的剂量。因此，在某些方面，优选接种年龄更大的动物，但接种较年轻的猪(包括三周龄及更年轻的猪)有助于诱导主动免疫且仍非常有益。动物年龄可为控制PRRS的一个重要因素，且可为影响疫苗接种及发展有效免疫反应的因素。因此，年龄、疾病管理、畜牧业、先天性免疫及主动免疫是重要的且需要在控制策略中加以考虑。
PRRSV 94881疫苗可以任何传统方式给予，且在一些优选方法中给药时间是经鼻给予。优选地，所给予的PRRSV疫苗在单次给药后如同一样，提供治疗PRRSV感染或降低其严重程度或发病率的益处。然而，若选择其他抗原或组合或多价疫苗，则应了解其可以在初始给药时间后可以以传统方式给予，包括一或多个增强剂量。本领域的技术人员将能够基于所选PRRSV疫苗及将给予抗原的动物的年龄范围来确定适当的剂量。
实施例1：
PRRSV 94881 MLV制备的例示性规模扩大
PRRSV 94881的规模增大的300L生物反应器工艺，使用64-84代之间的MA104细胞。这些细胞在850cm2滚瓶(Corning)中扩增。细胞在300L气升式生物反应器中培养的同时被病毒感染。在整个培养过程中，监测培养基的右旋糖/乳酸盐浓度(g/L)。在收获时，弃去流体且保留病毒样品。
培养基组成如表1中所示：
表1
组分 量
经γ照射的胎牛血清 5％
无酚红粉末的MEM 9.6g/L
硫酸新霉素(Neomycin Sulfate) 30mg/L
碳酸氢钠 1.4g/L
盐酸 调节pH值
制备无酚红培养基的MEM、新霉素及1.4g/L碳酸氢钠且过滤。在将培养基置于生物反应器中的同时，将FBS添加至培养基中。所添加新霉素的量如下计算：体积(L)×30mg/L÷效能(以mg/g计)。
PRRSV 94881生长的并行工艺包含将AK MA104细胞种植于生物反应器中且同时用PRRSV 94881病毒种子感染该细胞。图1概述该并行工艺。在图2中，提供图1中概述的并行工艺的时间表。
在并行工艺中，270L体积的培养基经无菌过滤至生物反应器中。培养基在细胞及血清添加的同一天或前一天添加至容器中。若在细胞及血清添加的前一天将培养基添加至生物反应器中，则推荐启动温度控制以使得培养基维持在35℃，pH值处于控制模式下以使pH值维持在7.25±0.1，DO处于监测模式下且搅动设定在35rpm。在添加细胞及经照射的胎牛血清(IFBS)的那天，温度控制设定在36℃。在添加培养基之后及细胞接种之前，将IFBS添加至生物反应器中。IFBS的目标浓度为5体积％，每个生物反应器270L体积中有14.0L体积的IFBS。
进行三轮300L生物反应器操作。生物反应器参数为：温度设定点为36℃，控制模式下pH值设定点为7.25，DO监测，及搅拌器为35rpm。表2、3及4显示记录来自OIT的DO％、来自YSI的右旋糖及乳酸盐以及来自NOVA的pH值和L-谷氨酰胺的数据。PD效价仅供参考。QC效价为正式效价。
表2显示在感染7天期间批次001PD-X的结果。每日获取样品且操作在PI第7天终止。pH值设定在7.25且在操作期间保持恒定，除了在PI第4天其降至7.0以下之外。在PI第4天，葡萄糖自前一天的0.74降至0.4，谷氨酰胺开始消耗且效价开始上升约1log。当葡萄糖完全消耗(≤0.1g/L)时，在PI第5天观察到峰值效价。也在PI第5天，DO降至30％且开始控制以避免DO一夜降至零。PI第6天效价下降，接着在PI第7天增至7.4。样品在PI第7天混浊。
表3显示批次002PD-X的结果(R0PI为培养物再进料的点)。基于批次001PD-X的效价结果，收获日设定在PI第5天。批次002PD-X PI第1天至PI第5天与批次001PD-X一致。收获生物反应器，接着在PI第5天再进料。确定第二次收获的生长曲线。每日获取样品，持续5天。右旋糖至第R2PI天完全消耗。效价持续5天处于峰值(0.5log的变化在分析误差范围内)。谷氨酰胺至第R5PI天完全消耗。DO探针在再进料后失效。无法测量DO含量(很可能接近0)。在第R4PI天，细胞仍然附着，因为瓶中样品澄清。在第R5PI天，在样品瓶上观察到有些混浊，表明细胞可能已开始自弹簧脱落。
表4显示批次003PD-X的结果。基于批次002PD-X的效价结果，收获-II之日设定在PI第1天或PI第2天。决定在PI第2天收获流体以灵活用于制备。第三次收获持续7天的生长曲线。每日获取样品。右旋糖至第2R2PI天完全消耗。效价处于峰值，持续4天，接着降至7.0，持续2天(0.5log的变化在分析误差范围内)，接着在PI第7天降至6.2。谷氨酰胺至第2R5PI天完全消耗。DO在第2R2PI天脱除控制，以监测细胞死亡。
300L规模的病毒繁育的第一次收获(收获-I，H-I)阶段：收获-I(批次001PD-X)的生长曲线显示尽管右旋糖至PI第5天完全消耗(≤0.1g/l)，但病毒粒子持续生长至PI第7天。当右旋糖为约1g/L的初始浓度一半时(PI第4天)，谷氨酰胺开始消耗，且接着在右旋糖耗尽后，谷氨酰胺似乎为能量的主要来源。开始2-3天谷氨酰胺读数的不一致可归因于NOVA仪器的波动，因为培养基仅含有2mmol/L。DO含量在右旋糖/谷氨酰胺代谢及病毒繁育期间一致地下降。
病毒繁育动力学表明PI 5-7天收获病毒。PI第4天与PI第7天之间的QC效价变化在分析变化范围内(±0.71log/ml)。收获-I标准为右旋糖完全消耗(≤0.1g/l)时的时间，其与30L资料(研究号6127-1310-09K-198)一致。因此，由PI第4天开始的右旋糖离线测量将需要追踪右旋糖含量。表2显示在300L生物反应器中在右旋糖耗尽后PRRSV 94881病毒稳定3天(PI 5-7天)。然而，若进行第二次收获，则基于表3及4的结果，推荐在右旋糖浓度<0.1g/L(使用YSI测量)的第一天进行收获-I，以确保细胞附着至生物反应器中的弹簧(载体)。
300L规模的病毒繁育的第二次收获(收获-II，H-II)阶段：对于批次002PD-X及003PD-X，在PI第5天进行收获-I后，添加新鲜培养基及5％血清以产生第二收获病毒流体(表3及4)。根据与第一收获材料所设定的相同程序，将含IFBS(5体积％)的MEM培养基(270-280L)添加至生物反应器中。在批次002PD-X上，在5天内收获-II的生长曲线，且在再进料后1天达到峰值效价(参见表3)。效价稳定4天。再进料后1天的病毒效价可与第一次收获的效价相当。右旋糖含量在PI第2天完全消耗。再进料后4天的范围可用于第二次收获标准。然而，在PI第4天进行第二次收获可能对第三次收获有影响，因为在PI第4天获取的流体样品上观察到有些混浊，表明细胞死亡或自弹簧脱离。因此，对于批次003PD-X，在PI第2天进行收获-II。基于批次003PD-X的资料，若将进行第二次再进料及第三次收获，则推荐收获II目标日为PI第1-2天。
300L规模的病毒繁育的第三次收获(收获-III，H-III)阶段：对于在PI第2天进行的收获II后的批次003PD-X(表4)，再添加培养基及血清至容器中以产生第三次收获病毒流体(表4)。根据与第一收获材料所设定的相同程序，将含IFBS(5体积％)的MEM培养基(270-280L)添加至生物反应器中。在7天内绘制收获-III的生长曲线，且在再进料后1天达到峰值效价(参见表4)。效价稳定4天。再进料后1天的病毒效价可与第二次收获的效价(表3及4)相当。右旋糖在PI第1天完全消耗。再进料后4天的范围可用于第三次收获标准。
以下三个图代表在300L生物反应器中进行的三次操作的右旋糖、谷氨酰胺及DO概况与效价。这些图的目的在于显示三次试验的一致性。
图3显示以300L规模进行的所有三次操作的右旋糖消耗及病毒效价的概述。三次操作的收获-I概况非常一致，至PI第5天右旋糖完全消耗(≤0.1g/l)，且其与所进行的三次操作时的峰值效价一致。第一次再进料后，对于批次002PD及003PD，在PI第1天右旋糖小于0.3g/l，且效价已处于峰值。在PI第2天，右旋糖完全消耗且病毒效价保持在峰值。对于批次003PD中的收获III，当第二次再进料在第R2PI天进行时，右旋糖至第2R1PI天降至小于0.1g/L且效价处于峰值。
图4显示以300L规模进行的所有三次操作的谷氨酰胺消耗及病毒效价的概述。如针对收获-I的概况所见，三次操作非常一致。谷氨酰胺至PI第5天降至其初始浓度2mmol/L的一半，且其与所进行的三次操作时的峰值效价一致。第一次再进料后，对于批次002PD及003PD，谷氨酰胺至PI第2天降至其初始浓度的一半，且效价自PI第1天已处于峰值。对于批次003PD中的收获III，第二次再进料在第R2PI天进行。至PI第5天，谷氨酰胺缓慢消耗至0，且病毒效价一致，接着细胞开始死亡且效价在PI第7天下降。
如针对收获-I概况所见，三次操作非常一致，DO至PI第5天降至30％，且其与所进行的三次操作时的峰值效价一致。在第一次再进料后，批次002PD-X的DO探针失效，因此资料不可用，在批次003PD-X时，DO在PI第1天下降，与峰值效价一致。对于批次003PD中的收获-III，当在第R2PI天进行第二次再进料时，DO迅速减少，直至PI第3天，此时细胞开始死亡，且DO至PI第5天消耗至0且病毒效价一致，接着细胞开始死亡且效价在PI第7天下降。
表5：300L生物反应器操作中并行工艺的条件及结果的概述*。
*目标条件(0.1MOI、每个300L生物反应器总计7.0×109个细胞、pH 7.25及36℃)
(H1)：表示感染后的第一次收获。
(H2)：表示感染后的第二次收获。
(H3)：表示感染后的第三次收获。
将来自批次001PD-X的病毒流体漂白且弃去。保留来自批次002PD-X收获-I的一公升流体，且添加SGS(25体积％)以用于研究的目的，将其余流体漂白且弃去。将来自批次003PD-X收获II的两公升流体保持在冷冻下以用于浓缩的目的，将其余流体漂白且弃去。
300L规模的种植细胞密度(PCD)的范围：目标种植细胞密度(PCD)为每个300L生物反应器在270-280L的工作体积中总计7.0×109个细胞。基于来自30L最终工艺转移报告(6127-1310-09K-198)的资料，总细胞种植范围在每个30L生物反应器7.0×108-1.0×109之间。由于时间限制，仅仅评估目标细胞种植密度。
300L规模的感染倍率(MOI)的范围：对于PRRSV 94881在此生长系统内的繁育，0.1的目标MOI为理想的。在30L生物反应器中分别检查0.01的低MOI水准及0.3的高MOI水准。
风险分析：所推荐的300L生物反应器并行工艺参数概述于表6中。仅测试目标参数且考虑其对工艺而言是关键的还是非关键的。范围以30L规模评估。定义如下：
·关键参数为对最终产物的品质而言关键的那些参数；
·非关键参数为在规定范围可直接控制内或具有宽操作范围，因此与设定点的偏差非关键的那些参数。非关键参数有助于将关键参数控制在规定范围内；
·“仅供参考”参数为进行监测以获得关于工艺的额外信息，但与最终产物的属性不直接相关的参数。
表6：PRRSV 94881 MLV的300L生物反应器并行工艺参数的概述
*在30L规模下的检查范围内非关键
**第一次收获标准由PI 5-7天的时期内右旋糖完全消耗的时间决定。然而，若进行第二次收获，则收获-I应在右旋糖为0.1g/L的第一天
***流体稳定5天。然而，若进行第三次收获，则收获应在第1天与第2天之间进行
#基于30L资料，按比例扩大
结论及工艺推荐：成功实现并行工艺自30L按比例扩大至300L生物反应器。收获-I的收获日及效价在30L生物反应器范围内。收获-II也为成功的，其中效价与收获-I相当。第二次收获的效价保持稳定4天。实现额外(第三次)收获，其中效价可与收获-I及II相当。第三次收获的效价稳定至少4天。
PRRSV 94881 MLV的优选的300L生物反应器并行工艺推荐如下：
病毒繁育，收获-I：培养基组合物为无酚红的MEM、30mg/L新霉素及1.4g/L碳酸氢钠。将MA104细胞以7×109个/300L弹簧生物反应器的密度种植于270-280L补充有14.0L 5体积％胎牛血清的培养基中(范围：7×109-1×1010/300L弹簧生物反应器)。生物反应器的温度控制在36±1℃。DO设定在“监测模式”下。一旦DO含量降至10-30％，即在10％的设定点启动DO控制。在控制模式下设定pH 7.2。用于高pH值(添加CO2)的PID参数为：
气流流速设定在2.0SLPM；CO2流速设定在2.0SLPM；O2流速设定在2.0SLPM；N2流速设定在2.0SLPM且总气体鼓泡速率应在2.0SLPM。
目标MOI为0.1(范围7×108-1×109个病毒粒子/300L弹簧生物反应器)。
对于收获-I标准，在PI第4天开始进行右旋糖测量的离线取样。DO趋势可用作指示物。收获-I应在右旋糖≤0.1g/L时(范围+/-2天)进行，其通常在PI 5-7天之间出现。然而，若进行第二次收获，则推荐收获-I在右旋糖浓度≤0.1g/L的第一天。
第一次再进料-收获-II：第一次收获后，向生物反应器再进料270-280L补充有l4.0L胎牛血清(5体积％)的下述培养基组合物：无酚红的MEM、新霉素及1.4g/L碳酸氢钠。在与第一次收获培养基所设定相同的条件下进行再进料(参见以上第一次收获参数)。pH值仍控制在7.2的设定点。用于高pH值(添加CO2)的PID参数为：
温度控制保持在36±1℃的设定点。DO控制设定在“监测模式”下。
第二次再进料-收获-III：在第二次收获后，即刻向生物反应器再进料270-280L补充有1.40L经照射的胎牛血清(5体积％)的下述培养基组合物：无酚红的MEM、新霉素及1.4g/L碳酸氢钠。在与第一次收获培养基所设定的相同条件下进行再进料(参见以上第二次收获参数)。pH值控制仍在7.2的设定点下。用于高pH值(添加CO2)的PID参数为：
温度控制保持在36±1℃的设定点。DO设定在“监测模式”下。当前测试结果显示对于第三次收获病毒流体，最佳时间在再进料后第1天-第4天之间。
应了解以上工艺为例示性的且可进一步修改，以提高产率及/或降低操作生物处理器的成本。举例而言，参数变化可包括但不限于：降低第二次及第三次收获的血清浓度，降低细胞种植密度，添加细胞及种子于同一瓶中且搅拌，因此可缩短收获I的病毒繁育。此外，可通过针对可能的收获IV可再进行一次再进料，从而进一步改良病毒产率。进料所消耗的培养基组分，例如但不限于，葡萄糖及谷氨酰胺。
实施例2
在一具体实施方案中，使用根据上述方法制备的PRRSV 94881来确定PRRSV 94881在接种猪中的功效。在此研究中，4至13日龄的仔猪经肌内接种2ml中包含107.6TCID 50的组合物(研究第0天)。在第13天，仔猪断奶且监测各种疾病参数，直至第90天。研究参数包括监测病毒血症、组织及分泌物中病毒的存在、临床观察、肺病变及增重。
各研究组：在研究第0、14、28、56及90天，对接种、警哨(sentinel)及对照称重。对于接种组与警哨组，在第0天与第14天之间每隔一天对血液取样，且至第90天，一周取样一次；且对于对照组，在整个研究时期期间一周取样一次，直至第90天。
对于接种组与警哨，在第0天与第14天之间每隔一天获取鼻、口腔及粪便拭子，且至第56天，一周获取一次，且对于对照，在整个研究时期期间一周获取一次，直至第56天。
在疫苗接种组中的2只猪中，第0天至第14天每隔一天评定尸检且第14天至第90天一周评定一次，剩余猪在第90天评定。在警哨组中，5只猪在第56天评定，剩余猪在第90天评定。对照组2只猪在第0天至第14天每隔一天评定，在第14天与第56天之间一周评定一次，且剩余猪在第90天评定。
每天进行临床观察。
使用PRRSV欧洲型特异性引物，对来自血液、口腔、粪便及鼻拭子以及肺灌洗液的样品进行定量RT-PCR。
自这些研究，资料显示除了几只猪跛行外，仔猪均显示正常健康。死后剖析，尸检无异常，除了1-2只动物显示腹股沟淋巴结轻微增大以外。重要的是，可见在接种组中未观察到肺病变。
图6显示与用含有保藏在ECACC登录号11012502下的减毒PRRS病毒株的组合物接种的组相比，警哨组中具有病毒血症的动物的百分比，表明根据本发明方法制备的PRRS病毒向猪提供保护性免疫力的功效。
实施例3
以下设备及试剂(表7)用于研发欧洲型PRRS 94881的并行滚瓶工艺：
表7：设备
自SAFC获得含酚红培养基的MEM及1.4g/L碳酸氢钠。表8描述培养基组成以及血清浓度。此培养基用以繁殖病毒，包括所有滚瓶再进料。
表8：MEM培养基组成。
目录/项目号 组分 批号 每个滚瓶的量
700754 经γ照射的胎牛血清，美国 10D837 20mL(5体积％)
62892-1000M3056 含酚红的MEM 10L259 400mL
三次收获的并行工艺：
并行工艺将具有血清、AK-MA104细胞及欧洲型PRRS 94881病毒种子的培养基添加于容器中。接着混合容器的内含物且分配至滚瓶中(TOI等于PP0天)。图7说明并行工艺方法且图8说明工艺定义及时间表。
滚瓶及培养基制备：
此处呈现的实验为一批5个滚瓶。实际的批次规模可变化。
在无菌条件下，将2000mL MEM培养基及100mL经照射的胎牛血清添加至容器中。接着添加5×107个AK-MA104细胞及0.1MOI的欧洲型PRRS病毒种子。混合这些物质，且在无菌条件下，每850cm2Corning滚瓶分配约400mL。接着滚瓶在0.5rpm的速度的滚筒架中在37℃培育。在两次培养基再进料下进行至多三次收获。
收获标准及可接受的效能：
用于收获滚瓶的标准是基于来自经实施例1及2验证的300L生物反应器工艺关键参数的设定点/目标，如下表9中所示。
收获-I在PI第5-7天及右旋糖含量≤0.1g/L时进行。收获II在再进料后PI第2天进行且收获III在第二次再进料后PI第2天进行。
所有三次滚瓶收获的效能应≥105.5TCID50/mL。
表9：欧洲型PRRS 94881 MLV的收获标准/可接受的效能
参数 可接受的目标
第一次收获的时间(感染后天数) PI第5-7天
第一次收获的右旋糖含量 ≤0.1g/L
第二次收获的时间(再进料后天数) 2
第三次收获的时间(再进料后天数) 2
效能 ≥105.5TCID50/mL
*关键参数为对最终产物的品质而言关键的那些参数
滚瓶操作
表10：用于研发欧洲型PRRS 94881并行滚瓶工艺的初始实验及效价结果
表10显示经设计的初始实验，该实验基于以下参数(其来自实施例1及2中描述的工艺)来定义并行滚瓶工艺，且工作种子病毒报告显示于表11。
表11：经评估以定义并行滚瓶工艺的参数
MA-104细胞以3.5×106至1×107(参见表10第2栏)的范围内的细胞种植密度种植于15个滚瓶中。滚瓶按字母顺序标记。每三个滚瓶一组具有相同细胞种植密度且在0.005至0.1范围内具有相同MOI(表10第3栏)。
评估三个细胞种植密度及两个MOI(表11)。三个滚瓶为一组的滚瓶组具有相同细胞种植密度及相同MOI(表10第1栏)。滚瓶根据上述滚瓶及培养基制备设定，且在0.5RPM速度的滚筒架中在培育箱中于37℃行走(walk)培育。
滚瓶A、D、G、J及M收获I在PI第5天进行，接着再进料且培育2天。接着进行H-II，滚瓶再进料且培育，并在2天后进行第三次并且是最终的收获。
滚瓶B、E、H、K及N的H-I在PI第6天进行，接着再进料且培育2天。接着进行H-II；滚瓶再进料一次且再培育。2天后进行第三次并且是最终的收获。
最终，滚瓶C、F、I、L及O的H-I在PI第7天进行，接着再进料且培育2天。接着进行H-II，滚瓶再进料且再培育，并在2天后进行第三次并且是最终的收获。
将滚瓶传统工艺(滚瓶P、Q、R及S)用作此实验的对照。研发此工艺使之包含两次收获。在这些实验中将第三次收获物添加至工艺中，且收获-I范围为至PI第5天。
MA104细胞以2×107种植于850cm2滚瓶且培育3天(滚瓶P、Q、R及S)。3天后，滚瓶S以胰蛋白酶处理且通过Vi-cell计数细胞。将细胞计数用于滚瓶P、Q及R的病毒MOI计算。将计算量的病毒添加至滚瓶中，滚瓶在滚筒架中于37℃培育。3天后，对滚瓶P进行收获-I，接着再进料且在37℃培育。3天后，获得第二次收获，且第二次再进料，且再培育3天以进行第三次并且是最终的收获。
在滚瓶Q在PI第4天且滚瓶R在PI第5天的H-I后，滚瓶Q及R遵循相同程序。
传统滚瓶工艺比实施例1及2中描述的并行工艺长，且需要更多工作，因为细胞在感染病毒之前需要生长3天。此外，与并行工艺相比，其需要双倍细胞种植密度，但MOI较低。本发明的工艺在三次收获中产生高度一致的效价。
并行工艺的H-I收获时间(TOH)仅仅根据目标日决定，无论右旋糖消耗情况如何。在收获日获取样品以测量右旋糖及获得效价。
基于效能可接受的效价的标准(表9)，滚瓶A、B、C、D、E及F显示收获I、II及III的效价不一致。
细胞种植密度为7×106且目标MOI为0.1的滚瓶G、H及I在第一次收获时右旋糖含量在≤0.1g/L的目标内。滚瓶G及H的效价结果可接受。对于收获-II，所有滚瓶G、H及I均具有高6及低7log的效价。对于收获-III，滚瓶G及H分别具有可接受的6.6及6.5的效价。对于大部分收获，组G、H及I是可接受的。
下一组实验J、K及L在效价方面是最有希望的。对于所有滚瓶，右旋糖在H-I消耗，且效价在基于表9的可接受的准则内。在第二次及第三次收获时，除了两个滚瓶外，效价也符合表9上的准则。滚瓶J、K及L的H-III再延长一天，显示效价仍可接受(表10)。
最后的滚瓶M、N及O具有高细胞种植密度及低MOI，滚瓶N及O的效价结果显示一致。
表12：并行滚瓶工艺与生物反应器工艺之间的参数比较
参数 300L生物反应器 滚瓶组J、K及L
培养基加血清的工作体积(mL) 283500 400
细胞种植密度/毫升 2.53×104 2.5×104
MOI 0.1 0.1
基于表9，显示于表10中的滚瓶J、K及L的TCID50/mL结果符合收获I、II及III的所有标准。滚瓶J、K及L中细胞种植密度/毫升的比率等同于300L生物反应器每毫升的细胞种植密度(表12)。基于这些资料，选择滚瓶J、K及L的参数用于确认试验(表13)。
表13：并行滚瓶工艺研发确认操作的设定及收获-I时的右旋糖浓度
表13显示表11上评估的所选并行工艺的确认操作。
总共15只滚瓶各设定为：400mL具有血清及欧洲型PRRS 94881 MSV+4种子的培养基中，细胞种植密度为1×107且MOI为0.1。分开滚瓶且5个一组，分为3组。对于J1至J5滚瓶，在PI第5天进行收获-I，对于K1至K5，在PI第6天进行收获-I，且对于L1至L5滚瓶，在PI第7天进行收获-I。测量每个滚瓶的右旋糖。接着汇集收获物且获取样品以获得效价。随后再进料且进行收获II及最终的收获III。
在收获-I时，平均所有15只滚瓶的右旋糖在生物反应器工艺所设定的≤0.1g/L的收获标准以内，此证实该工艺在滚瓶中是一致的。
表14：并行滚瓶工艺的条件及TCID50结果的概述
表14显示对于本发明的并行滚瓶工艺，滚瓶J、K及L组在H-I、H-II及H-III时的条件及病毒效价(TCID50/mL)的概述。
为模拟滚瓶工艺，汇集组J的各别滚瓶的样品(表13)且汇集的样品用于获得效价。相同程序应用于滚瓶K及L的H-I、H-II及H-III。
对于J、K及L，H-1汇集样品的右旋糖为0.0g/L。H-I、H-II及H-III的效价在6.5至7.7的范围内，其与300L生物反应器工艺(表15)相当。
表15：并行300L生物反应器验证工艺的条件及TCID50/mL结果的概述*
*样品含有SGS作为稳定剂
表15显示在cGMP条件下进行的三个验证操作的参数及效价(TCID50/mL)。所有三个批次均具有相同种植细胞密度、相同MOI。所有三个批次的收获I时的右旋糖均为0.0g/L。所有收获均具有可接受标准以内的结果。
滚瓶的种植细胞密度(PCD)的范围：
目标种植细胞密度(PCD)为每个滚瓶在400mL工作体积中总计1.0×107个细胞。对于低范围，评估7×106(表10)，也具有可接受的效价。在传统工艺上评估高范围(表10)。
滚瓶的感染倍率(MOI)的范围：
对于欧洲型PRRS 94881在此生长系统内的繁育，0.1的目标MOI为理想的。在30L生物反应器中分别检查0.01的低MOI水准和0.3的高MOI水准。在滚瓶中，由于时间限制，仅仅评估目标0.1MOI及0.005MOI(表10)。
分析
推荐的滚瓶并行工艺数概述于表16中。仅测试目标参数且考虑其对工艺而言为关键还是非关键。定义如下：关键参数为对最终产物的品质而言关键的那些参数；且非关键参数为在规定范围可直接控制内或具有宽操作范围，因此与设定点的偏差非关键的那些参数。非关键参数有助于将关键参数控制在规定范围内。
表16：欧洲型PRRS 94881 MLV的并行滚瓶工艺参数的概述
**第一收获的标准由PI第5-7天的时期内右旋糖完全消耗的时间决定。
#基于传统滚瓶工艺
@以30L、300L生物反应器规模及滚瓶测试
&以30L生物反应器的规模测试
结论
成功实现并行滚瓶工艺的研发，且从TCID50/mL测得的效能来看，其等同于上述生物反应器工艺。在并行滚瓶工艺中成功再现H-I、H-II及H-III的关键目标参数。
用于欧洲型PRRS 94881 MLV的病毒繁育收获-I的滚瓶并行工艺的优选实施方案如下：含1.4g/L碳酸氢钠的MEM培养基组合物；在每个850cm2Corning滚瓶中，将1×107个细胞种植补充有20mL 5体积％胎牛血清的400mL培养基中(范围：每个滚瓶7×106-2×107个细胞)；温度控制在36±1℃；滚瓶架速度为0.5RPM；且目标MOI为0.1。
对于收获-I标准，在PI第5天开始取样以进行离线右旋糖测量。收获-I应在右旋糖≤0.1g/L时进行，其通常在PI第5-7天之间出现。然而，若进行第二次收获，则首先对收获II再进料。
II.第一次再进料-收获-II
再进料MEM及1.4g/L碳酸氢钠的培养基组合物400mL，其补充有20mL的胎牛血清(5体积％)。在与第一次收获培养基所设定相同的条件下进行再进料(参见上述第一次收获参数)。温度控制保持在36±1℃的设定点。滚瓶架速度为0.5RPM。病毒流体的第二次收获在再进料后第2天进行。
III.第二次再进料-收获-III
再进料MEM、新霉素及1.4g/L碳酸氢钠的培养基组合物400mL，其补充有20mL经照射的胎牛血清(5体积％)。在与第一次收获培养基所设定相同的条件下进行再进料(参见上述第二次收获参数)。温度控制保持在36±1℃的设定点。滚瓶架速度为0.5RPM。病毒流体的第三次收获在再进料后第2天进行。

Claims (16)

1.一种商业化规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，其包括：
a)在生物反应器中用允许PRRSV感染的哺乳动物细胞系接种大规模培养基的同时，用PRRSV感染所述哺乳动物细胞；
b)感染后使病毒繁殖5至7天；
c)通过自所述生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第一次收获步骤；
d)补充所述生物反应器中的培养基，且使病毒繁殖1至4天；
e)通过自所述生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第二次收获步骤；
f)补充所述生物反应器中的培养基，且使病毒繁殖1至4天；及
g)通过自所述生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第三次收获步骤。
2.权利要求1的方法，其在第三次收获步骤之后进一步包括至少一次再进料及收获步骤，该步骤包括补充所述生物反应器中的培养基且使病毒繁殖1至4天，且通过自所述生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第四次收获步骤。
3.权利要求1的方法，其中目标感染倍率(MOI)为0.01至0.30。
4.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞以每个300L生物反应器中7×109个至1.0×1010个的密度种植。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞种植密度为每个300L生物反应器中1.0×1010个。
6.权利要求5的方法，其中所述MOI为0.07。
7.权利要求1的方法，其包括监测所述培养基的右旋糖浓度，其中所述第一次收获步骤在培养基的右旋糖浓度降至小于0.1g/L的第一天进行。
8.权利要求1的方法，其中所述第二次收获在用培养基再进料后1或2天进行。
9.权利要求1的方法，其中所述第三次收获在用培养基第二次再进料后1至4天进行。
10.权利要求1的方法，其中在添加所述哺乳动物细胞系及所述PRRSV的前一天或同一天，先将培养基添加至生物反应器中。
11.权利要求1的方法，其中在添加所述哺乳动物细胞系及所述PRRSV的前一天，将培养基添加至生物反应器中。
12.权利要求1的方法，其中所述生物反应器的温度设定在34℃至38℃。
13.权利要求1的方法，其中所述培养基包含5体积％经照射的胎牛血清。
14.权利要求1的方法，其中所述PRRSV选自：PRRSV株94881、VR2332、莱利斯塔物质CDI-NL-2.91，或保藏在登录号ECACC 04102703、ECACC04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108；ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCCVR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402下的株。
15.一种用于制备PRRSV的商业化规模生产方法，其包括：
a.将允许所述PRRSV感染的哺乳动物细胞与所述PRRSV两者同时接种至含有适于所述细胞生长的培养基的生物反应器中；及
b.进行三次收获PRRSV的连续收获步骤，其中分别在第一次及第二次收获后补充培养基，且其中：
i.第一次收获在培养基的右旋糖浓度降至小于0.1g/L的第一天进行；
ii.第二次收获在第一次收获后添加培养基之后1或2天进行；及
iii.第三次收获在第二次收获后添加培养基之后1至4天进行。
16.一种商业化规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，其包括：
a)在滚瓶中用允许PRRSV感染的哺乳动物细胞系接种大规模培养基的同时，用PRRSV感染所述哺乳动物细胞；
b)感染后使病毒繁殖5至7天；
c)通过自所述滚瓶移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第一次收获步骤；
d)补充所述滚瓶中的培养基，且使病毒繁殖2天；
e)通过自所述滚瓶移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第二次收获步骤；
f)补充所述滚瓶中的培养基，且使病毒繁殖2天；及
g)通过自所述生物反应器移除培养基且自其分离所繁殖的病毒，进行第三次收获步骤。
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