CN102107004A

CN102107004A - 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102107004A
Application number: CN2011100008156A
Authority: CN
Inventors: 吕凤林; 曹政; 田菲菲; 杨力
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2011-01-05
Publication date: 2011-06-29

Abstract

一种猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗及其制备方法，涉及生物医药领域，本发明目的在于公开一种猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗(PRRS VLP疫苗)，本发明目的还在于公开该疫苗的制备方法。本发明PRRS VLP疫苗含有猪繁殖与呼吸病毒M、N、GP5三种结构蛋白组成的VLP，可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答。药效实验表明，经此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐剂，制备的注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型免疫接种不同动物群体后，可安全、有效预防PRRSV感染，为不同种群母猪、小猪、育肥猪安全、有效免疫防控PRRSV感染提供了理想疫苗。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗及其制备方法

发明领域

本发明属于生物制药领域，特别是涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗(PRRS VLP疫苗)及其制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是导致母猪流产和小猪呼吸系统疾病的一种病毒，1991年在荷兰被分离出来并命名为莱利斯塔德病毒(Lelystad Virus)，1992年在美国也分离出一株能造成相同症状的病毒，随后该病毒被正式命名为猪繁殖与呼吸综合症病毒，并确立了以Lelystad Virus(LV)为代表的欧洲株和以ATCC VR2332株为代表的美洲株。在1995年末在中国大陆也出现了一种临床表现为体温升高、皮肤发红，并伴随高致病率和死亡率的疫情，当时被称作“猪高热病”。当1996年该病毒被分离出来后证实该疫情是由变异的美洲株PRRSV引起的，遂确定为猪繁殖与呼吸综合症，又称“蓝耳病”。在2006-2007年，在中国大陆爆发的大规模蓝耳病疫情，致病率与死亡率远高于以往疫情，这导致了当时中国猪肉价格的飞涨，并对生猪养殖产业造成严重打击。当该高致病性蓝耳病病毒被分离出来，并利用分子生物学方法研究后，发现造成这次疫情的PRRSV在Nsp2编码区缺少90个核苷酸，相应编码蛋白有30个氨基酸的却失，并且有证据表明这是在中国大陆发生突变的一类毒株，其30个氨基酸的缺失虽然与其高致病性没有关系，却是高致病性毒株的一个明显标志。同时在中国爆发的高致病性蓝耳病的另一个特征是多种病原体的共同感染与继发感染，有证据表明，在PRRSV感染的同时也发现了猪瘟、猪伪狂犬病、猪流感、猪细小病毒、猪链球菌的共同感染，以及继发的猪霍乱沙门氏菌、猪胸膜肺炎放线菌肺炎、副猪嗜血杆菌感染。其中最重要的一点是高致病性PRRSV与可以造成仔猪多系统综合症的猪2型圆环病毒(PCV-2)的双重感染，这些共同感染和继发感染造成了病猪的主要临床症状与疫情的大规模传播。

PRRSV与马动脉炎病毒(EAV)小鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)等非常相似，国际上将其划为一个新的病毒群，即动脉炎病毒科(Arteriviridae)，与冠状病毒(Coronaviridae)共同组成尼多病毒目(Nidovirales)(又称网巢病毒目、成套病毒目、套式病毒目)。包含有以Lelystad Virus(LV)为代表的欧洲株(A亚群)、和以ATCC VR2332株为代表的美洲株(B亚群)，中国所分离的PRRSV都为变异美洲株，属于B亚群。

PRRSV是一类小型有包膜病毒，直径45nm-65nm。属于单股正链RNA病毒，基因组全长15Kb，除去5’端和3’端两个非转录区(5’UTR、3’UTR)，共有8个开放阅读框(ORF)。其中ORF1占基因组全长80％，分为ORF1a和ORF1b两个部分，共编码12个非结构蛋白(NSP)，包括RNA依赖的RNA聚合酶(反转录酶)以及其他未知蛋白。基因组余下的20％包含ORF2-ORF7六个开放阅读框，其中ORF2编码糖基化结构蛋白GP2、ORF3编码糖基化结构蛋白GP3、ORF4编码糖基化结构蛋白GP4、ORF5编码糖基化结构蛋白GP5、ORF6编码非糖基化结构蛋白M、ORF7编码核蛋白N。其中最主要的结构蛋白为GP5、M、N三种。其中N蛋白长15kD，至少有5个抗原决定簇，其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇，具有一个糖基化位点，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys和His 3种碱性氨基酸组成，可能和RNA基因组间的相互作用有关。N蛋白之间形成同源二聚体，对病毒的组装至关重要。M蛋白约18kD，在PRRSV中非常保守，在病毒包膜表面三次跨膜，并且N末端的16个氨基酸残基暴露在膜外，虽然M蛋白的功能还没有完全研究清楚，但已有研究推测，M蛋白在PRRSV的组装和出芽时扮演重要角色。同时M蛋白能刺激T淋巴细胞的增生，诱导产生的抗体具有中和作用。GP5蛋白约25kD，是一个糖基化蛋白，含有4个糖基化位点，且非常不保守，三次跨膜，并有一个70个氨基酸残基的胞外区。有6个抗原决定簇，有证据表明GP5与PRRSV的抗体识别过程中起关键作用，是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性，同时GP5还可诱导细胞凋亡，是公认的PRRSV的主要保护性抗原。

众所周知，疫苗是防控传染病最有效的手段，在中国，早在2000年就CH-1a毒株的灭活疫苗被批准上市，2007年CH-1a毒株的减毒活苗也被批准上市。然而，这两种疫苗的使用却没有达到预期效果，而且还有证据表明，许多PRRSV病例都是由于减毒活苗的使用而引起的。在我国爆发高致病性蓝耳病后，利用JXA1毒株制备的灭活苗被推出，该疫苗的使用却没有得到预期的免疫保护效果。由于PRRSV的GP5蛋白是公认的保护性抗原，与此同时许多基因工程疫苗也被加以研究。比如Lowe J F等用含编码ORF5的质粒进行DNA免疫，可使接种猪产生抗ORF5的特异性中和抗体，接种猪免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。Xue Q等用编码PRRSV ORF5、ORF7和编码猪细胞因子IL2、IFNγ的真核表达质粒联合接种仔猪，诱导出体液免疫和细胞免疫反应。Qiu H J等以PRVBarthaK61株为载体，构建表达PRRSV主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病病毒疫苗，免疫仔猪后可以对PRRSV强毒攻击有保护效果。以及一些其他重组病毒疫苗、亚单位疫苗都对PRRSV产生一定的保护效果，但都由于保护力差、安全性低等种种原因还处于研发阶段。因此克服目前PRRSV活苗、灭活苗、以及基因工程疫苗的低安全性、低保护力等缺点，寻找新的技术策略、研发一种安全、高效、非复制的病毒疫苗，在能较好地保护PRRSV攻击的同时，并能较好地避免共同感染和继发感染的发生，是安全、有效免疫防控PRRSV的重大科学前提。

病毒样颗粒(Virus-like pratical，VLP)是由病毒主要结构蛋白组成不含病毒核酸的病毒粒子空壳。由于VLP大小、结构及表面抗原和多肽表位与真正的病毒几乎没有区别，因此能被宿主抗原提呈细胞所识别，引起免疫应答和效应，且无潜在的副作用。首先，与活苗及灭活苗相比，病毒样颗粒疫苗没有不安全因素；与亚单位疫苗相比，VLP是多个抗原蛋白组成，具有很强的免疫原性；与有良好口碑的病毒体(Virosome)相比，VLP既不是由活病毒制备而来，没有潜在的危险性、也不需要大量的繁殖病毒，没有安全性低、成本高以及制备周期长等不足；由此VLP疫苗被当今誉为病毒类疫苗发展的新里程碑。目前的乙肝VLP疫苗(Recombivax HB，Merck)、乳头瘤VLP疫苗(Gardisil，Merck)和流感VLP疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多个品种在临床研究中。虽然目前对PRRS VLP形成的机制与效率问题还不明确，但已有证据表明PRRSV的N蛋白M蛋白在病毒包装中扮演重要角色，而且GP5蛋白作为一个主要的表面蛋白，对PRRSV的免疫原性起决定作用。同时在本实验室的前期工作中以证明PRRSV的N蛋白、M蛋白、GP5蛋白可以组装VLP并诱导实验动物良好的免疫应答。

发明内容：

本发明目的在于公开一种猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗(PRRS VLP疫苗)，本发明目的还在于公开该疫苗的制备方法。

本发明目的是通过如下方案实现的：

本发明PRRS VLP疫苗含有猪繁殖与呼吸综合症病毒M、NP、GP5三种结构蛋白组成的VLP。

本发明RS VLP疫苗涉及以下核酸序列：①PRRSV M蛋白的核酸序列；②PRRSV N蛋白的核酸序列；③PRRSV GP5蛋白的核酸序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-1(SH)/GP5、PRRSVHB-2(SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSVSY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

本发明PRRS VLP疫苗涉及以下氨基酸序列：①PRRSV M蛋白的氨基酸序列；②PRRSV N蛋白的氨基酸序列；③PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-1(SH)/GP5、PRRSV HB-2(SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSVBJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSVSY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

本发明PRRS VLP疫苗含有猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒(PRRS VLP)，并携带有以下表面蛋白：①PRRSV的GP5蛋白，所述GP5蛋白核酸序列包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-1(SH)/GP5、PRRSV HB-2(SH)/GP5、PRRSVEm2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSVJXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

本发明PRRS VLP疫苗包含一个携带有RSV主要结构蛋白的重组真核表达载体、鸡成纤维细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞；其中，所述真核表达载体选自：①pHWD2000；②pOPI3CAT；③pCAGGS；④pcDNA6/TR；⑤pCMV-HA；所述鸡成纤维细胞选自：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；所述哺乳动物细胞选自：①VERO细胞；②293细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤；BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；所述昆虫细胞选自：①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。

其中，本发明pHWD2000载体是由pHW2000载体改造得到，包括去掉pHW2000载体上游的pCMV启动子，并用鸡β-actin蛋白启动子替换，同时在鸡β-actin蛋白启动字上游插入hCMV-IE增强子，改造后的pCWD2000可以在真核系统中高效表达外源基因，同时pCWD2000有着较小的分子量，可以携带较大的外源基因片段。

其中，本发明PRRS VLP疫苗可不含有佐剂，也可以含有如下佐剂中的一种或几种：①氢氧化铝或磷酸铝；②新型纳米铝佐剂；

③P3BSK4(N-palmitoyl-S-[2，3-bis(palmitoy-loxy)-(2RS)-propul]-[R]-propyl-[R]-cysteinyl-[S]-seryl-[S]-(lysyl)3-lysine)；

④水凝胶佐剂：季胺化的壳聚糖。⑤rLT(重组不耐热性肠毒素)等。

本发明PRRS VLP疫苗可制成多种临床适用的剂型，包含但不限于注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型。

本发明PRRS VLP疫苗包括如下几种：PRRSV CH-1a/GP5疫苗、PRRSVBJ-4/GP5疫苗、PRRSV HB-1(SH)/GP5疫苗、PRRSV HB-2(SH)/GP5疫苗、PRRSV Em2007/GP5疫苗、PRRSV NB-04/GP5疫苗、PRRSV BJ0706/GP5疫苗、PRRSV JX143/GP5疫苗、PRRSV JXA1/GP5疫苗、PRRSV HUN4/GP5疫苗、PRRSV SY0608/GP5疫苗、PRRSV JXwn06/GP5疫苗、PRRSV Bjsy06/GP5疫苗、PRRSV NX06/GP5疫苗。

本发明PRRS VLP疫苗的制备方法包括如下步骤：

以构建重组pHWD2000真核表达载体为例：①构建pHWD2000真核表达载体；②含有编码PRRSV M蛋白核酸序列的重组真核表达载体；③含有编码PRRSV N蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；④含有编码重组PRRSV GP5蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；⑥提供一种用于表达的细胞系，将含有编码PRRSV M、NP、GP5的核酸序列的重组真核表达载体pHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5同转化用于表达的细胞系，经转染后可以释放PRRS VLP；⑦提供用于纯化PRRS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度离心纯化方法以及柱层析纯化方法。

其中该方法所述PRRS VLP可激发体液与细胞双重的免疫应答；其中所述PRRS VLP所包含GP5蛋白包括来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-1(SH)/GP5、PRRSV HB-2(SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSVBJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSVSY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

其中，本发明方法涉及一个PRRS VLP表达宿主细胞系，其中，所指细胞为鸡成纤维细胞或哺乳动物细胞，鸡成纤维细胞有：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；哺乳动物细胞选自：①VERO细胞；②293细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；⑨Tn5细胞；⑩SF9 Cell细胞。

其中，本发明制备PRRS VLP细胞培养方法包括如下步骤：在细胞培养基中加入浓度为2-100μg/mL的糖胺聚糖，优选10μg/mL；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素，优选肝素。

其中，本发明制备PRRS VLP时的纯化方法包括如下步骤：蔗糖梯度离心法，所述蔗糖梯度离心法选用最佳蔗糖浓度为1.19g/mL；或柱层析纯化方法，用Sepharose6FFTM分子筛并进行DEAE-SepharoseFFTM离子交换。

其中，蔗糖梯度离心的步骤为：①收集规模化生产的PRRS VLP细胞培养液，4℃5000rmp离心10min，去除细胞及杂质；②取上清液100000g 4℃离心2h，沉淀用HNE buffer悬浮，HNE buffer的组成为25mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，5mM EDTA；③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL；0.45g/mL蔗糖3mL；1.19g/mL蔗糖1mL；4℃100000g离心2h；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰；杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS；杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的VLP原液为疫苗原液。

本发明产品及方法中所述的百分含量均为质量体积百分含量。

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒体疫苗，主要包括PRRS VLP。该VLP包含有PRRSV的结构蛋白M、N以及主要表面抗原GP5，可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答。经此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐剂，制备的注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型免疫接种不同动物群体后，可安全、有效预防PRRSV感染，为不同种群母猪、小猪、育肥猪安全、有效免疫防控PRRSV感染提供了理想疫苗。本发明进行了药效实验，分别通过注射、滴鼻、饮水等途径免疫小猪与怀孕母猪产生好的体液免疫与细胞免疫应答及天然免疫与获得性免疫应答以及黏膜免疫应答效果，且没有免疫损伤或由疫苗接种而导致的发病迹象，具有安全性。本发明猪繁殖与呼吸综合症病毒体疫苗免疫无PRRSV免疫背景的小猪、母猪与育肥猪两次，进一步通过VR2332、CH-1a型毒株以及我国不同地区临床分离的PRRSV及高致病性PRRSV流行野株攻毒，有95％以上的免疫保护效果。用本发明猪繁殖与呼吸综合症病毒体疫苗接种不同地区、种群的母猪、小猪，第1、第21天各免疫一次，分别采用注射、滴鼻、饮水剂型疫苗免疫，均显示各地区、各种群母猪、小猪没有出现由疫苗接种引发的发病现象，具有安全性。并能产生好的双重免疫应答和免疫保护力，其保护率达90％以上，由此表明研发的猪繁殖与呼吸综合症病毒体疫苗对不同地区、种群的猪群都具有较好的免疫保护效果。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：本发明PRRS VLP疫苗检定实验

本发明实施例8制备的PRRS VLP疫苗注射剂、滴鼻剂、饮水剂型外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过3日龄乳鼠脑内接种，以及3日龄小猪颈部肌肉注射试验无发病现象；通过Lorry法测定蛋白含量均在剂量范围；通过电镜观察VLP直径约45-65nm，与天然病毒一致；ELISA测定DNA含量均在50EU以下；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在3200以上。

实验例2：本发明PRRS VLP疫苗对实验猪体内的免疫应答效果实验

本发明实施例8制备的PRRS VLP疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水疫苗剂型，并用PBS、铝盐、纳米铝、P3BSK4、rLT、为对照组，分别按各自途径免疫3日龄小猪，以及后备母猪其免疫剂量按实施例8疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天采集各组小猪及母猪的外周血、分离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在6400以上，采用MTT法测定中和抗体效价在3200以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在160以上。结果显示，本发明PRRS VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量好于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；制备的PRRS VLP疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂型血清抗体效价高于滴鼻、饮水剂型，喷鼻、饮水剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型。

实验例3：本发明PRRS VLP疫苗对实验猪体内的免疫保护效果实验

本发明实施例8制备的PRRS VLP疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水剂型为实验组，并用PBS、铝盐、纳米铝、P3BSK4、rLT、及PRRSVCH-1a灭活病毒为对照组，分别按各自途径免疫3日龄小猪、后备母猪，其免疫剂量按实施例8疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天各试验组、对照组实验猪用10^5.0TCID₅₀临床分离PRRSV毒株分别颈部肌肉注射攻毒观察保护效果。结果显示，本发明PRRS VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，而对照组PRRSV CH-1a灭活病毒疫苗保护率达60％、其他各对照组保护率为0％。由此制备的PRRS VLP疫苗在小猪和母猪体内具有高效的免疫保护效果。

实验例4：本发明PRRS VLP疫苗对怀孕母猪的免疫应答及免疫保护效果实验

本发明实施例8制备的PRRS VLP疫苗加入或不加入相应佐剂制备的注射、滴鼻、饮水剂型，并用PBS、铝盐、纳米铝、P3BSK4、rLT和PRRSV CH-1a灭活病毒疫苗为对照组，分别按各自途径免疫怀孕60天母猪，其免疫剂量按实施例8疫苗高剂量组，免疫两次(0，21天)；当末次免疫后14天采集各组母猪的外周血、分离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价在12800以上，采用MTT法测定中和抗体效价在6400以上，采用流失细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在200以上。当母猪分娩后观察没有早产、流产、弱仔情况。结果显示，本发明PRRS VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量高于低剂量组免疫应答效果，而对照组没有产生双重免疫应答；本发明PRRS VLP疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于滴鼻、饮水剂型，滴鼻、饮水剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型。由此制备的PRRS VLP疫苗在怀孕母猪体内具有好的免疫应答效果。

上述PRRS VLP疫苗通过各自方法免疫配种前母猪，配种后21天进行2次免疫，在怀孕80天各试验组、对照组怀孕母住用10^5.0TCID₅₀临床分离PRRSV毒株分别颈部肌肉注射攻毒，待母猪自然生产后观察保护效果。结果显示，本发明PRRS VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90％以上，而对照组PRRSV CH-1a灭活病毒疫苗保护率达78％、其他各对照组保护率达为0％。由此制备的PRRS VLP疫苗对怀孕母住具有高效的免疫保护效果。

实验例5：本发明PRRS VLP疫苗的安全性实验

(1)无菌、支原体试验：将实施例8制备的PRRS VLP疫苗接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25℃、35℃。结果显示，PRRS VLP疫苗都未见细菌生长。将PRRS VLP疫苗用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示PRRS VLP疫苗无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色。结果显示，RS VLP疫苗无支原体生长。

(2)溶血性试验：选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释PRRS VLP疫苗(由实施例8制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明PRRS VLP疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，PRRS VLP疫苗无溶血反应。

(3)急性毒性试验：取实施例8制备的PRRS VLP疫苗0.5ml腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明PRRS VLP疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例8制备的PRRS VLP疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，PRRS VLP疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。

(4)过敏试验研究：取实施例8制备的PRRS VLP疫苗皮下接种体重为250～350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉分别给予相同PRRS VLP疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，PRRS VLP疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，PRRS VLP疫苗在动物体内无过敏反应。

(5)兔热源质试验：取预检合格的体重为2～3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，各家兔2次平均温度在38.6-39.5℃。将实施例8制备的PRRS VLP疫苗预热至38℃，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉分别缓缓注入0.5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示：PRRS VLP疫苗给予家兔个体升温均未超过0.2℃，3只家兔升温总和未超过0.4℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的PRRS VLP疫苗无热源质。

(6)免疫病理损伤试验：由实施例8制备的PRRS VLP疫苗通过小猪、母猪、种猪及育肥猪外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，PRRSVirosome疫苗免疫接种在实验乳猪、母猪、种猪及育肥猪体内Th2/Th1免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象，因此具有安全性。

实验例6：本发明PRRS VLP疫苗稳定性实验

由实施例8制备的PRRS VLP疫苗，分别置于2-8℃、室温(20-25℃)、37℃1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、pH值、无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示：PRRS VLP疫苗放置2-8℃24个月内均无变色分层等现象，pH值在7.0-7.2之间无变化，电镜观察粒径大小保持一致，且注射或滴鼻给小鼠或实验猪表现正常；PRRS VLP疫苗放置室温25℃3个月内均有好的稳定性；PRRS VLP疫苗放置室温37℃1个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，PRRS VLP疫苗放置2-8℃理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

实施例1：本发明猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗的基因及蛋白构成

以PRRSV的M蛋白核酸与蛋白序列、PRRSV的N蛋白的核酸与蛋白序列、PRRSV的CH-1a/GP5、BJ-4/GP5、HB-1(SH)/GP5、HB-2(SH)/GP5、Em2007/GP5、NB-04/GP5、BJ0706/GP5、JX143/GP5、JXA1/GP5、HUN4/GP5、SY0608/GP5、JXwn06/GP5、Bjsy06/GP5、NX06/GP5蛋白的核酸与蛋白序列，见图所示。

实施例2.本发明猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗的表达载体构建

以构建重组pHWD2000表达载体为例：利用PCR的方法扩增PRRSV M蛋白基因核酸序列、N蛋白基因序列、GP5蛋白基因序列并插入到pHWD2000载体中，构成重组pHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5表达载体，并包含Bsa I酶切位点。

实施例3.细胞培养及细胞批库建立

以UMNSAH/DF-1细胞培养并建库为例：UMNSAH/DF-1细胞来源于American Type Culture Collection(ATCC)。培养基采用Dulbecco′s modified Eagle medium(DMEM)，添加青霉素及链霉素，不加或加入一定量胎牛血清(10-2％)在细胞工厂或细胞发酵罐进行培养，建立细胞工作种子批库，并及对传代后的外援源因子、致瘤性及稳定性等全面检定，细胞使用代数控制在60代以内，均符合疫苗生产介质的要求。

所述细胞培养及细胞批库建立包括但不限于：①UMNSAH/DF-1细胞；②人二倍体细胞；③Vero细胞；④CHO细胞；⑤Hep-2细胞；⑥MDCK细胞。

实施例4.质粒转染及稳定高表达细胞系筛选与建库

PRRS VLP疫苗：选用实施例3细胞库中UMNSAH/DF-1细胞，采用脂质体法将实施例2构建的表达质粒转染UMNSAH/DF-1细胞，并筛选稳定高表达RS VLP的细胞系，具体是：①在35mm孔中，加入pHWD2000-N 1.0μg、pHWD2000-M 1.0μg、pHWD2000-GP5 1.0μg；②加入5μL OptiMEM配置的脂质体，室温孵育45min。然后加入到被OptiMEM润洗过的宿主细胞中，孵育5h；③离心去除载体-脂质体混合物，并向细胞中加入DMEM进行培养；④pHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5三种重组载体在细胞系中共表达，可自组装PRRS VLP；⑤通过加压筛选表达PRRS VLP的UMNSAH/DF-1细胞株。结果显示，在UMNSAH/DF-1细胞15代时筛选到稳定高表达PRRS VLP的细胞株，经细胞系稳定表达与产量、VLP大小与结构、外源因子与致瘤性、染色体完整性等传代至40代没有表型改变。由此，建立了稳定高表PRRS VLP的UMNSAH/DF-1细胞系。进一步建立具有PRRS VLP的三级细胞种子批库，经对全面检定符合疫苗生产要求，放置液氮中保存备用。

所述稳定高表PRRS VLP的细胞系包括但不限于：①UMNSAH/DF-1细胞；②人二倍体细胞；③Vero细胞；④CHO细胞；⑤Hep-2细胞；⑥MDCK细胞。

实施例5.PRRS VLP规模化生产

取稳定表达PRRS VLP的UMNSAH/DF-1工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入10-2％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体30L细胞发酵罐放大培养生产使得细胞密度达到1×10^7-8以上时，收集细胞培养PRRS VLP疫苗原液。

PRRS VLP规模化生产方法包括如下方法：

①人二倍体细胞：取稳定表达PRRS VLP的二倍体细胞工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入10-2％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养PRRS VLP疫苗原液。

②Vero细胞：取稳定表达PRRS VLP的Vero细胞工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养PRRS VLP疫苗原液。

③CHO细胞：取稳定表达PRRS VLP的CHO细胞工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养PRRS VLP疫苗原液。

④Hep-2细胞：取稳定表达PRRS VLP的Hep-2细胞工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养PRRS VLP疫苗原液。

⑤MDCK细胞：取稳定表达PRRS VLP的MDCK细胞工作批库细胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10％胎牛血清、加入10μg/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养PRRS VLP疫苗原液。

实施例6.PRRS VLP疫苗的纯化

①收集规模化生产的PRRS VLP细胞培养液，4℃5000rmp离心10min，去除细胞及杂质；②取上清液100000g 4℃离心2h，沉淀用少量HNE buffer(25mMTris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，5mM EDTA)悬浮。③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL；0.45g/mL蔗糖3mL；1.19g/mL蔗糖1mL；4℃100000g离心2h；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰。杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS。杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的VLP原液为疫苗原液。

实施例7.PRRS VLP疫苗原液的检定

PRRS VLP原液的外观为澄清液体；pH值为7.0-7.2；通过血平板进行杂菌鉴定结果为阴性；通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性；通过PAGE-SDS电泳检测结果显示目的条带清晰、无其他杂带；采用Reed&Muench法计算抗血清中和效价均高于1∶2800。

实施例8.PRRS VLP疫苗剂型配制

①注射剂型配制：将纯化PRRS VLP不加佐剂，配制10ug/0.5ml的低剂量、20ug/1.0ml高剂量的无佐剂注射剂型；将纯化PRRS VLP蛋白加入氢氧化铝或磷酸铝配置7.5ug(蛋白)/0.5mg(铝盐)/0.5ml、15μg(蛋白)/1.0mg(铝盐)/0.5ml有佐剂疫苗剂型；将纯化PRRS VLP蛋白加入纳米铝佐剂，分别配制5.0ug/0.5ml低剂量、10ug/1.0ml高剂量的有佐剂注射猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗剂型。以上注射疫苗溶液装入吸顶瓶，放2-8℃备用。

②喷鼻剂型配制：将纯化PRRS VLP不加佐剂吸附，配制7.5μg/0.2ml低剂量、15μg/0.2ml高剂量的无佐剂喷鼻疫苗剂型；将纯化PRRS VLP加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶黏膜佐剂与传递系统，配制5.0μg/0.2ml、10μg/0.2ml有佐剂喷鼻疫苗剂型；将纯化PRRS VLP蛋白加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶与10μgrLT黏膜佐剂及传递系统，配制4.0μg/0.2ml、8μg/0.2ml有佐剂喷鼻猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗剂型。以上喷鼻疫苗溶液装入定量喷鼻装置，放2-8℃备用。

③饮水剂型配制：将纯化PRRS VLP 10μg、20μg分别加入5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素和0.1％脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调PH7.2，喷雾干燥，配制10μg/剂低剂量、20μg/剂高剂量的无佐剂舌下含片剂型；将纯化PRRS VLP蛋白7.5μg、15μg与15μgrLT分别加入5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素和0.1％脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调PH7.2，喷雾干燥，配制7.5μg/剂低剂量、15μg/剂高剂量的有佐剂猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒疫苗饮水剂型；以上以上饮水疫苗装入密封塑料袋内，放2-8℃备用。

Claims

1.一种PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗含有猪繁殖与呼吸综合症病毒M、N、GP5三种结构蛋白组成的VLP。

2.如权利要求1所述的PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗涉及以下核酸序列：

①PRRSV M蛋白的核酸序列；②PRRSV N蛋白的核酸序列；③PRRSV GP5蛋白的核酸序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括来自来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSVHB-1(SH)/GP5、PRRSV HB-2(SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSVNB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSVHUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

3.如权利要求1所述的PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗涉及以下氨基酸序列：①PRRSV M蛋白的氨基酸序列；②PRRSV N蛋白的氨基酸序列；③PRRSVGP5蛋白的氨基酸序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括来自来自PRRSVCH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSVBJ-4/GP5、PRRSV HB-1(SH)/GP5、PRRSV HB-2(SH)/GP5、PRRSVEm2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSVJXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

4.如权利要求1-3任一所述的PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗含有猪繁殖与呼吸综合症病毒样颗粒(PRRS VLP)，并携带有以下表面蛋白：①PRRSV的GP5蛋白；其中，所述PRRSV GP5蛋白包括来自来自PRRSV CH-1a、BJ-4、HB-1(SH)、HB-2(SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亚型的PRRSV CH-1a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSVHB-1(SH)/GP5、PRRSV HB-2(SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSVNB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSVHUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。

5.如权利要求1-3任一述的PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗包含一个携带有PRRSV主要结构蛋白的重组真核表达载体、鸡成纤维细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞；其中，所述真核表达载体选自：①pHWD2000；②pOPI3CAT；③pCAGGS；④pcDNA6/TR；⑤pCMV-HA；所述鸡成纤维细胞选自：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；所述哺乳动物细胞选自：①VERO细胞；②293细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤；BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；所述昆虫细胞选自：①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。

6.如权利要求5所述的PRRS VLP疫苗，其特征在于其中所述的pHWD2000载体是由pHW2000载体改造得到，包括去掉pHW2000载体上游的pCMV启动子，并用鸡β-actin蛋白启动子替换，同时在鸡β-actin蛋白启动字上游插入hCMV-IE增强子，改造后的pCWD2000可以在真核系统中高效表达外源基因，同时pCWD2000有着较小的分子量，可以携带较大的外源基因片段。

7.如权利要求1-6任一所述的PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗不含有佐剂，或含有如下佐剂中的一种或几种：①铝盐：氢氧化铝或磷酸铝；②新型纳米铝佐剂；③P3BSK4(N-palmitoyl-S-[2，3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propul]-[R]-propyl-[R]-cysteinyl-[S]-seryl-[S]-(lysyl)3-lysine)；④水凝胶佐剂：季胺化的壳聚糖、⑤rLT：重组不耐热性肠毒素。

8.如权利要求1-6任一所述的PRRS VLP疫苗，其特征在于该疫苗制成多种临床适用的剂型：注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型。

9.如权利要求1-6任一所述的PRRS VLP疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

①构建pHWD2000真核表达载体；②含有编码PRRSV M蛋白核酸序列的重组真核表达载体；③含有编码PRRSV N蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；④含有编码重组PRRSV GP5蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；⑤提供一种用于表达的细胞系，经转染后可以释放PRRS VLP；⑥提供用于纯化PRRS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度离心纯化方法以及柱层析纯化方法。

10.如权利要求9所述的PRRS VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中构建重组表达载体的方法包括如下步骤：将编码PRRSV M蛋白、N蛋白、GP5蛋白的DNA片断被插入到pHWD2000载体中，构成重组pHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5表达载体。

11.如权利要求9所述的PRRS VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的表达宿主细胞系中所指细胞为：鸡成纤维细胞或哺乳动物细胞，鸡成纤维细胞有：①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；哺乳动物细胞选自：①VERO细胞；②293细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧Hep-G2细胞；⑨Tn5细胞；⑩SF9 Cell细胞。

12.如权利要求9所述的PRRS VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中细胞培养方法包括如下步骤：在细胞培养基中加入浓度为2-100μg/mL的糖胺聚糖；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素。

13.如权利要求9所述的PRRS VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的纯化方法包括如下步骤：蔗糖梯度离心法，蔗糖浓度为1.19g/mL；或柱层析纯化方法，用Sepharose6FFTM分子筛并进行DEAE-SepharoseFFTM离子交换。

14.如权利要求13所述的PRRS VLP疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的蔗糖梯度离心的步骤为：①收集规模化生产的PRRS VLP细胞培养液，4℃5000rmp离心10min，去除细胞及杂质；②取上清液100000g 4℃离心2h，沉淀用HNE buffer悬浮，HNE buffer的组成为25mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，5mM EDTA；③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用HNE buffer配制，体系采用0.3g/mL蔗糖3mL；0.45g/mL蔗糖3mL；1.19g/mL蔗糖1mL；4℃100000g离心2h；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰；杂蛋白去除可达95％以上；⑥采用DEAE-SepharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2-0.5M氯化钠、pH6.5-7.5的PBS；杂蛋白去除可达99％以上，纯化后的VLP原液为疫苗原液。