CN101300363A - 用于用具有改善的免疫原性的prrsv抗原免疫接种动物的方法和组合物 - Google Patents

用于用具有改善的免疫原性的prrsv抗原免疫接种动物的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

相对于由用野生型(wt)或糖基化的GP5免疫的猪产生的中和抗体的水平，用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要表面蛋白GP5的低糖基化变体攻击的猪显示出PRRSV－中和抗体的产生增加。本发明提供了在猪中获得针对PRRSV的改善的免疫应答的方法，对于获得改善的免疫应答来说有用的组合物，以及编码PRRSV主要表面蛋白GP5的低糖基化变体的分离的多核苷酸。

Description

用于用具有改善的免疫原性的PRRSV抗原免疫接种动物的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2005年8月30日提交的美国临时专利申请号60/712,357的优先权。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明在来自U.S.Department of Agriculture的NationalResearch Initiative Competitive Grant#2004-01576下和在National Center for Research Resources Project#P20RR15636的National Institute of Health COBRE项目下得到了政府的支持。
政府具有本发明的某些权利。
附录
不可应用
发明背景
发明领域
总体而言，本发明涉及包含具有改善的免疫原性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的组合物和关于其使用的方法。本文描述的组合物和方法导致猪针对PRRSV抗原的改善的免疫应答，从而提供了猪针对PRRSV感染的改善的保护。
相关技术
PRRSV是影响猪的在经济上重要的病原体。用PRRSV感染大母猪和小母猪可以导致生殖失败。PRRSV还在所有年龄的猪中引起呼吸系统疾病。可以给猪接种疫苗以保护其不被PRRSV感染。然而，目前商购可得的疫苗(其中大多数是活的减毒疫苗)在某种程度上是无效的并因此应当进行改良。针对PRRSV的完整的免疫保护机制并不清楚；然而，已清楚地显示，PRRSV中和抗体对于这种保护是重要的。不幸的是，PRRSV自身(以其野生型形式)或衍生自其的目前的活疫苗以及时的方式和以有效的(即，保护性的)水平诱导病毒特异性中和抗体的能力很差。
美国专利号6,500,662，“Infectious cDNA clone of NorthAmerican porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus and uses thereof”(Calvert等人，2002年12月31日)描述了感染性北美PRRSV cDNA克隆的开发及其作为疫苗的用途。然而，美国专利号6,500,662并未公开包含低糖基化的PRRSV抗原的PRRSV疫苗。
在另一项研究中，将来自各种北美PRRSV毒株的GP5蛋白(或ORF5蛋白)的序列彼此进行比较，并且与被称为Lelystad毒株的代表性的欧洲PRRSV分离株相比较，揭示了在GP5共有序列的天冬酰胺44(N44)和天冬酰胺51(N51)处的N-联糖基化位点在所检查的所有PRRSV分离株中都是保守的(Pirzadeh等人，Can.J.Vet Res.，1998，62：170-177)。然而，位于GP5共有序列的天冬酰胺31(N31)处的N-糖基化位点在某些北美PRRSV分离株中不存在并且在欧洲PRRSVLelystad毒株分离株中不存在。来自四(4)种北美PRRSV毒株和Leylstad毒株的重组GST-GP5融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)中作为不溶性包含体而产生，复性，并在兔中用作免疫原。在大肠杆菌中产生的此类重组蛋白质保留了其天然的N-糖基化位点但不使它们糖基化。
用包含CMV启动子与IAF-Klop北美PRRSV分离株的GP5基因的融合物的DNA疫苗接种猪也显示出，在被免疫的动物中提供了针对PRRSV攻击的保护(Pirzadeh和Dea，1998，J.General Virology，79，989-999)。这种特别的GP5基因分离物编码包含N31、N44和N51天冬酰胺残基的GP5蛋白，所述天冬酰胺残基当在用DNA疫苗免疫的猪中表达时可能是糖基化的。用大肠杆菌产生的GST-GP5免疫接种猪不保护受病毒攻击的猪的肺，所述GST-GP5保留IAF-Klop毒株的GP5基因的天然的N-糖基化位点但不使它们糖基化。
包含导致表达低糖基化的PRRSV蛋白质的突变的欧洲PRRSV感染性克隆也已得到描述(Wissink等人，2004，J.Gen.Virol.85：3715-23)。这篇特别的参考文献报道，包含在PRRSV Lelystad毒株GP(5)蛋白的天冬酰胺残基53(N53)处的突变(该突变阻止那个位点的N-联糖基化)的PRRSV是感染性的，并且可以产生感染性的PRRSVLelystad毒株病毒颗粒。相反地，包含在PRRSV Lelystad毒株GP(5)蛋白的N46处的突变(该突变阻止那个位点的N-联糖基化)的PRRSV是非感染性的，并且不产生感染性的PRRSV Lelystad毒株病毒颗粒。Wissink等人推测，欧洲PRRSV GP2a蛋白中的N-聚糖位点，以及照此类推，GP5蛋白的N53位点，可以在天然宿主中在许多不同的水平上发挥作用，包括受体相互作用或免疫屏蔽。
在除PRRSV外的病毒中，聚糖残基已涉及各种作用。一般而言，N-联糖基化对于蛋白质的正确折叠、靶向作用和生物活性是重要的(Helenius，A.和M.Aebi.，Annu.Rev.Biochem.73：1019-1049，2004.；Williams，D.B.和Glycoconj J.，12：iii-iv，1995；Zhang，等人，Glycobiology 14：1229-46，2004)。在许多有包膜病毒中，包膜蛋白通过添加糖部分进行修饰，并且包膜蛋白的N-联糖基化起着病毒糖蛋白的不同作用，例如受体结合、膜融合、穿透到细胞内和病毒出芽(Braakman，I.和E.van Anken，Traffic 1：533-9，2000；Doms等人Virology 193：545-62，1993)。近期研究已证实汉坦病毒糖蛋白的N-联糖基化在蛋白质折叠和细胞内运输中(Shi，X.和R.M.Elliott，J.Virol.78：5414-22，2004)以及在流感病毒血凝素(HA)蛋白的生物活性和抗原性中的作用(Abe，Y.，等人，J.Virol.78：9605-11，2004)。此外，已变得显而易见的是，病毒包膜蛋白的糖基化是由几种不同的有包膜病毒所使用的用于病毒免疫逃避和持续的主要机制，以逃避、阻断或最小化病毒中和抗体应答。这种效应的例子已对于SIV(Reitter，J.N.等人，Nat.Med.4：679-84，1998)和HIV-1(Wei，X.等人，Nature 422：307-12，2003)，HBV(Lee，J.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.303：427-32，2003)，流感(Skehel，J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1779-83，1984)和动脉炎病毒LDV(Chen，Z.等人Virology 266：88-98，2000)进行了报道。
发明概述
正是考虑到上述问题才发展了本发明。证实了，相对于由用野生型(wt)或糖基化的GP5免疫的猪产生的中和抗体的水平，PRRSV主要表面蛋白GP5的低糖基化的变体增加了由被免疫的猪产生的PRRSV-中和抗体的水平。
本发明首先提供了在猪中引发针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫应答的方法，其包括施用包含编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的多核苷酸的组合物，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。在该方法的某些实施方案中，相应于在SEQ ID NO：1中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。该多核苷酸可以包括感染性PRRSV RNA分子或编码感染性PRRSV RNA分子的DNA分子。所述感染性PRRSV RNA分子是北美PRRSV衍生物或欧洲PRRSV衍生物。备选地，该多核苷酸可以包括这样的DNA分子，在所述DNA分子中将在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码低糖基化的GP5蛋白的所述多核苷酸有效地连接。在本发明的某些优选实施方案中，该启动子是CMV启动子。备选地，所述多核苷酸可以是病毒载体。可以使用的代表性病毒载体包括痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体。
各种类型和来源的PRRSV序列可以用于获得编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的多核苷酸，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP 5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。在本发明的某些实施方案中，编码低糖基化的PRRSVGP5多肽变体的所述多核苷酸通过直接合成、诱变北美PRRSV分离株GP5核苷酸序列或诱变共有北美PRRSV GP5核苷酸序列来获得。北美PRRSV分离株GP5核苷酸序列可以选自编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的GP5蛋白的核苷酸。所述共有北美PRRSV GP5核苷酸序列编码与SEQ ID NO：14至少85％同一的共有GP5蛋白。在本发明的其他实施方案中，编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的多核苷酸通过直接合成、诱变欧洲PRRSV分离株GP5核苷酸序列或诱变共有欧洲PRRSV GP5核苷酸序列来获得。所述欧洲PRRSV分离株GP5核苷酸序列编码与SEQ ID NO：15至少85％同一的GP5蛋白。
使指定的N-联糖基化位点失活的各种方法可以用于有效地实践本发明的方法。使相应于天冬酰胺51的N-联糖基化位点失活的一种优选方法是用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换天冬酰胺密码子。这种替换密码子可以编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。在更优选的实施方案中，相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。在其他实施方案中，相应于天冬酰胺34的N-联糖基化位点被失活。这个天冬酰胺34N-联糖基化位点可以通过下述方法被失活：用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34的密码子。所述编码另一种氨基酸的密码子可以编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。在其他优选的实施方案中，相应于在参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个N-联糖基化位点可以通过下述方法被失活：用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码天冬酰胺34和天冬酰胺51的密码子。编码天冬酰胺34和天冬酰胺51的密码子这两者可以用编码丙氨酸或谷氨酰胺残基的密码子替换，以使那些糖基化位点失活。备选地，这2个密码子可以用编码丙氨酸残基的密码子替换，以使这两个糖基化位点失活。备选地，所述N-联糖基化位点之一通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一个密码子而被失活，而另一个N-联糖基化位点通过其他技术来失活。
在优选实施方案中，该方法使用感染性PRRSV RNA分子，其是编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体蛋白的北美PRRSV衍生物，在所述变体蛋白中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。在更优选的实施方案中，相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。相应于在参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个N-联糖基化位点可以通过下述方法被失活：用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码天冬酰胺34和天冬酰胺51的密码子。编码天冬酰胺34和天冬酰胺51的密码子这两者可以用编码丙氨酸或谷氨酰胺残基的密码子替换，以使那些糖基化位点失活。备选地，这2个密码子可以用编码丙氨酸残基的密码子替换，以使那个糖基化位点失活。
为了实践这种方法，包含该多核苷酸的组合物通过皮下注射、静脉内注射、皮内注射、肠胃外注射、肌内注射、无针注射、电穿孔、口服递送、鼻内递送、口鼻递送、或其任何组合来施用。施用的组合物可以进一步包含治疗上可接受的承载体(carrier)。这种治疗上可接受的承载体选自蛋白质、缓冲液、表面活性剂和聚乙二醇聚合物，或其任何组合。
施用的组合物可以进一步包含佐剂。这种佐剂可以是氢氧化铝、Quil A、氧化铝凝胶悬浮液、矿物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副产物、分枝杆菌和CpG寡脱氧核苷酸，或其任何组合。施用的组合物还可以包含第二种佐剂，例如白介素1(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、γ干扰素(g-IFN)、细胞坏死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激复合物(ISCOM)和脂质体。
猪的针对PRRSV抗原的所述改善的免疫应答包括由所述猪产生的PRRSV中和抗体增加。PRRSV中和抗体的产生增加通常在通过本发明的方法和组合物免疫猪后观察到。改善的免疫应答可以在大母猪(sow)、小母猪(gilt)、公猪(boar)或小猪(piglet)中获得。
本发明还提供了在猪中引发针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫应答的方法，其包括给所述猪施用包含低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的组合物，在所述变体中相应于在SEQ IDNO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。低糖基化的PRRSV GP5多肽变体蛋白可以在细菌、酵母或哺乳动物表达系统中通过在先前描述的方法中使用的相同多核苷酸来产生。
本发明还提供了组合物，其包含编码低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的多核苷酸和治疗上可接受的承载体，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。在某些实施方案中，所述组合物包含其中相应于在SEQ ID NO：1中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个N-联糖基化位点均被失活的多核苷酸。在优选实施方案中，这种组合物可以包含感染性北美PRRSV RNA分子或编码感染性北美PRRSV RNA分子的DNA分子。在其他实施方案中，所述多核苷酸包含这样的DNA分子，在所述DNA分子中将在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码所述低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸有效地连接。在某些优选实施方案中，该启动子是CMV启动子。在另外其他的实施方案中，组合物中的多核苷酸包括病毒载体。可以在所述组合物中使用的病毒载体可以是痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体中的任何一种。
在所述组合物的多核苷酸中，N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺51的密码子而被失活。所述编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。在这种组合物的其他实施方案中，另外的N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码天冬酰胺34的密码子而被失活。该编码另一种氨基酸的密码子可以编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。因此，本申请提供了包含编码低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体蛋白的多核苷酸的优选组合物，在所述变体蛋白中相应于在SEQ ID NO：1的北美参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。2个所述N-联糖基化位点可以通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密码子来失活。这些编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子可以编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
在所述组合物中使用的治疗上可接受的承载体可以是蛋白质、缓冲液、表面活性剂和聚乙二醇聚合物，或其任何组合。所述组合物进一步包含至少一种佐剂。这种佐剂可以是氢氧化铝、Quil A、氧化铝凝胶悬浮液、矿物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副产物、分枝杆菌和CpG寡脱氧核苷酸，或其任何组合。所述组合物可以进一步包含选自白介素1(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、γ干扰素(g-IFN)、细胞坏死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激复合物(ISCOM)和脂质体的第二种佐剂。
本发明还提供了组合物，其包含低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体和治疗上可接受的承载体，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。在优选实施方案中，相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的N-联糖基化位点被失活。低糖基化的PRRSVGP5多肽变体蛋白可以在细菌、酵母或哺乳动物表达系统中通过在先前描述的方法中使用的相同多核苷酸来产生。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码低糖基化的北美PRRSVGP5多肽变体，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。在某些实施方案中，提供了其中相应于在SEQ ID NO：1中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个N-联糖基化位点均被失活的多核苷酸。在优选实施方案中，这种分离的多核苷酸可以包括感染性北美PRRSV RNA分子或编码感染性北美PRRSV RNA分子的DNA分子。在其他实施方案中，所述分离的多核苷酸包括这样的DNA分子，在所述DNA分子中将在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码所述低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸有效地连接。在某些优选实施方案中，该启动子是CMV启动子。在另外其他的实施方案中，所述分离的多核苷酸包括病毒载体。可以在所述组合物中使用的病毒载体可以是痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体中的任何一种。
在所述分离的多核苷酸中，N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺51的密码子而被失活。所述编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。在其他优选的实施方案中，另外的N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码天冬酰胺34的密码子而被失活。该编码另一种氨基酸的密码子可以编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。因此提供了编码低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体蛋白的优选多核苷酸，在所述变体蛋白中相应于在SEQ ID NO：1的北美参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。2个所述N-联糖基化位点可以通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密码子来失活。这些编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子可以编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
本发明还提供了分离的多肽，其是低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体，其中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。分离的低糖基化的PRRSV GP5多肽变体蛋白可以在细菌、酵母或哺乳动物表达系统中通过在先前描述的方法中使用的相同多核苷酸来产生，并且通过层析法或其他技术进行纯化。
本发明的进一步的特征和优点以及本发明的各种实施方案的结构和操作在下文参考附图详细描述。
附图简述
引入说明书并构成说明书的一部分的附图图解说明了本发明的实施方案，并且连同说明书一起用于说明本发明的原理。在附图中：
图1图解说明了PRRSV GP5和M蛋白的瞬时表达。A.双顺反子构建体的示意图，其显示了位于来自脑心肌炎病毒的IRES(IE)的侧翼的GP5和M编码区。所述编码区处于在GP5编码区紧上游存在的T7 RNA聚合酶启动子(黑色矩形)的控制下。弯箭头显示了通过来自该载体的T7 RNA聚合酶进行的转录的位置和方向。B.在用该双顺反子载体转染的细胞中的GP5和M蛋白的表达。用模拟物(mock)转染的细胞(泳道1)或用质粒转染的细胞(泳道2-7)如在材料和方法中所述的进行放射性标记，用抗Gp5抗体(泳道1-5)或抗M抗体(泳道6-7)进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质不进行处理(-)(泳道1、2、6和7)或用Endo H(泳道3)、PNGase F(泳道4)进行处理(+)，并通过电泳进行分析。泳道5包含来自用衣霉素处理(+)的转染的细胞的经免疫沉淀的蛋白质。显示了具有以千道尔顿表示的相对分子量(Mr)的蛋白质的迁移率。
图2图解说明了使用双顺反子质粒的WT-GP5及其突变体的糖基化分析。A.该双顺反子载体和在所显示的氨基酸位置34、44和51处具有3个推定的糖基化位点的PRRSV GP5的示意图。B.在本研究中使用的各种突变体。C.wt和突变型GP5的表达及其对Endo H的敏感性。该实验如图1的图例中所述的来进行，蛋白质用抗GP5抗体进行免疫沉淀，用Endo H进行消化(+)或不进行消化(-)，并通过电泳进行分析。箭头显示了突变型GP5蛋白。在右侧显示了具有以千道尔顿表示的相对分子量(Mr)的蛋白质的迁移率。
图3图解说明了编码突变型GP5的突变体病毒的表征。A.wt(FL-12)和各种突变体PRRSV在MARC-145细胞中的单步生长动力学。在6孔平板中的细胞用MOI为3的PRRSV进行感染，在感染后的指定时间收集培养物上清液，并测定病毒滴度。显示了来自3次独立实验的平均滴度与标准差(误差条)。B.突变体病毒的噬斑形态。空心箭和箭头显示了较不清晰的噬斑。C.反式互补(Trans-complementation)以回收突变体PRRSV。从表达wt GP5蛋白的细胞中回收的突变体病毒的定量分析。显示了来自3次独立实验的平均病毒得率与标准差(由误差条表示)。
图4图解说明了掺入突变型病毒粒子内并在经突变体病毒感染的细胞中合成的GP5的检查。A.使来自受感染的细胞的培养物上清液的经放射性标记的病毒粒子形成粒状沉淀，使GP5蛋白免疫沉淀，用(+)或不用(-)Endo H进行处理，并通过电泳进行分析。在泳道1和2中用或不用Endo H进行消化的GP5由白色括号显示。B.对用各种突变体病毒感染的细胞进行放射性标记，使GP5免疫沉淀，用(+)或不用(-)Endo H进行处理，并通过电泳进行分析。在泳道2和3中用或不用Endo H进行消化的GP5由白色括号显示。在每一图版右侧显示了具有以千道尔顿表示的相对分子量(Mr)的蛋白质的迁移率。
图5图解说明了北美PRRSV GP5N-末端氨基酸序列与北美PRRSVGP5参考N-末端序列(SEQ ID NO：1；毒株NVSL 97-7895)的比对。显示了200个氨基酸的蛋白质比对的前60个N-末端氨基酸。在所述蛋白质中的天冬酰胺34“NSS”和天冬酰胺51“NGT”N-联糖基化位点以粗体显示。位于参考GP5蛋白的残基29和35之间的其他N-联糖基化位点加有下划线。
图6图解说明了欧洲PRRSV GP5 N-末端氨基酸序列与北美PRRSVGP5参考N-末端序列(SEQ ID NO：1；毒株NVSL 97-7895)的比对。显示了约200个氨基酸的蛋白质的完整GP5蛋白的比对，其中在所述蛋白质中的天冬酰胺51“NGT”N-联糖基化位点以粗体显示(即SEQ IDNO：15中的天冬酰胺53)。
优选实施方案的详述
定义：
如本文所使用的，“可接受的承载体”指对于组合物的其他成分无害并且对于其将应用至的材料无害的承载体。“治疗上可接受的承载体”指对于组合物的其他成分无害并且对于其的人或其他动物接受者无害的承载体。在组合物的其他成分的情况下，“无害的”意指该承载体不会与其他成分反应或使其他成分降解，或者干扰它们的功效。对成分的功效的干扰不包括仅仅是对成分进行稀释。在动物的情况下，“无害的”意指该承载体对于植物或动物是没有伤害的或不是致命的。
如本文所使用的，“佐剂”指与抗原联合使用的任何材料，其增强那种抗原诱导免疫应答的能力。
如本文所使用的，“施用”指给受试者提供多核苷酸、多肽或其组合物的任何方式。施用方式的非限制性例子包括皮下注射、静脉内注射、皮内注射、肠胃外注射、肌内注射、无针注射、电穿孔、口服递送、鼻内递送、口鼻递送、或其任何组合。
如本文所使用的，“抗原”指在宿主中诱导免疫应答的任何实体。
如本文所使用的，“共有序列”指通过下述方式形成的氨基酸、DNA或RNA序列：使2个或更多个同源序列进行比对，并衍生出表示共同的氨基酸、DNA或RNA序列的新序列。
如本文所使用的，“低糖基化的PRRSV GP5多肽变体”指这样的PRRSV GP5蛋白，其中包含一个或多个N-联糖基化位点的原始或非变体氨基酸序列已被改变，以便减少在所得到的GP5变体蛋白中的N-联糖基化位点的数目。在这个定义下，在大肠杆菌中表达原始或非变体GP 5蛋白以产生具有包含相同数目的糖基化位点的原始GP5序列的GP5蛋白，不会导致产生低糖基化的PRRSV GP5多肽变体。
如本文所使用的，“免疫应答”指结合、降解或者抑制特定抗原的抗体和/或细胞(例如T淋巴细胞)的产生。相关短语例如“改善的免疫应答”涉及使用导致经免疫的宿主针对抗原的应答的任何可测量的改善的方法和组合物。例如，免疫应答的可测量的改善包括但不限于，相对于在对照动物中观察到的产生水平，中和抗体的产生增加(即，抗体滴度增加)，所述对照动物已用缺乏提供改善的免疫应答的结构修饰的抗原免疫。
“感染性RNA分子”指编码所有对于当被引入许可宿主细胞内时产生功能性病毒粒子来说的必需元件的RNA分子。
如本文所使用的，“感染性克隆”指编码感染性RNA分子的DNA分子。
如本文所使用的，“北美PRRSV”指包含与北美PRRSV分离株相关的多核苷酸序列的任何PRRSV，所述北美PRRSV分离株例如为但不限于，NVSL 97-7895毒株(Truong等人，Virology，325：308-319以及其中包含的参考文献)或者IAF-Klop、MLV、ATCC VR-2332、ATCCVR-2385、IAF-BAJ、IAF-DESR、IAF-CM、IAF 93-653、IAF 93-2616、IAF 94-3182、IAF 94-287毒株(在Pirzadeh等人Can.J.Vet Res，62：170-177以及其中包含的参考文献中描述)。对于本发明，包含与北美PRRSV分离株相关的多核苷酸序列的PRRSV是包含这样的多核苷酸序列的PRRSV，即在所述多核苷酸序列中GP5编码区编码与SEQ IDNO：1具有至少85％的蛋白质序列同一性的多肽。
如本文所使用的，“欧洲PRRSV”指包含与欧洲PRRSV分离株相关的多核苷酸序列的任何PRRSV，所述欧洲PRRSV分离株例如为但不限于，Lelystad毒株(Wissink等人，J.Gen.Virol.85：3715，2004以及其中包含的参考文献)。对于本发明，包含与欧洲PRRSV分离株相关的多核苷酸序列的PRRSV是包含这样的多核苷酸序列的PRRSV，即在所述多核苷酸序列中GP5编码区编码与SEQ ID NO：15具有至少85％的蛋白质序列同一性的多肽。
如本文所使用的，“同一性百分比”指序列中在2个经最佳比对的DNA、RNA或蛋白质区段的指定长度内相同的元素(即，氨基酸或核苷酸)的数目。为了计算“同一性百分比”，将相同元素的数目除以在经比对的区段的指定长度中的元素总数目，并乘以100。当同一性百分比关于蛋白质进行使用时，应当理解某些氨基酸残基可能不是相同的，尽管如此却是保守的氨基酸置换，其反映了具有相似化学性质的氨基酸残基(例如，酸性或碱性、疏水性、亲水性、氢键供体或接纳体残基)的置换。此类置换可能不改变分子的功能性质。因此，由于保守置换，可以增加蛋白质序列的同一性百分比。
引言
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖蛋白5(GP5)是最丰富的包膜糖蛋白，并且是体内中和抗体的主要诱导物。3个推定的N-联糖基化位点(N34、N44和N51)位于GP5膜外结构域(ectodomain)上，其中还存在主要中和表位。为了确定这些推定的糖基化位点中的哪些在PRRSV生活周期中使用，以及聚糖部分在诱导中和抗体中的作用，我们产生了在这些位点上包含单个和多个氨基酸置换的一组GP5突变体。野生型(wt)以及突变型蛋白质的瞬时表达和后续生物化学研究揭示，成熟的GP5在所有3个位点处包含高甘露糖类型的糖部分。随后将这些突变掺入全长cDNA克隆中以回收感染性PRRSV。我们的结果证实，涉及N44残基的突变不导致感染性后代的产生，这表明N44是对于病毒感染性来说最关键的氨基酸残基。在N34、N51和N34/51处携带突变的病毒生长至比wt PRRSV更低的滴度，并且在MARC 145细胞中显示出减少的致细胞病变效应。在血清中和测定法中，突变体病毒显示出对于被wt PRRSV特异性抗体中和的敏感性增强。此外，用突变体病毒接种猪诱导了显著更高水平的针对突变体以及wt PRRSV的中和抗体，从而暗示GP5的膜外结构域中聚糖残基的丧失增强了这些病毒对于体外中和的敏感性以及附近的中和表位的免疫原性。这些结果应当对于开发保护功效增强的PRRSV疫苗具有重大意义。
中和抗体已知是针对PRRSV的保护的主要关联物。我们已发现PRRSV GP5蛋白中糖基化位点的清除导致下述能力的显著增强：(1)经修饰的PRRSV毒株被PRRSV恢复期抗血清中和的能力，和(2)当用于接种猪时，这种经修饰的PRRSV毒株产生空前水平的PRRSV-中和抗体的能力。将这种概念应用至用于针对PRRSV感染进行免疫的任何活的(wt或减毒的)病毒将在其使用中具有显著影响，以赋予针对PRRSV感染的有效保护。
目前，存在用于针对PRRSV感染进行免疫的3种主要方法：(1)活的减毒疫苗，(2)灭活的疫苗(其基于在体外生长并经化学方法灭活的wt PRRSV)，和(3)采用以全身方式对兽群的所有动物用强毒wt PRRSV有目的地进行感染。存在关于这3种方式中的哪一种最有效的许多讨论和辩论。不管用于免疫的方法如何，我们的发明都将是有益的。对活PRRSV进行遗传改变以修饰其蛋白质的糖基化水平可以在下述毒株中进行：减毒的PRRSV疫苗株，或用于产生灭活疫苗的wtPRRSV毒株，或用于通过大量感染直接接种兽群的wt PRRSV毒株。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于巢状病毒目(Nidovirales)中的动脉炎病毒科(Arteriviridae)，其还包括马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶升高症病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和猿出血热病毒(SHFV)。该病毒基因组是长度为约15.0kb的线性、正链RNA分子，并且在5’-末端处具有帽结构和在3’-末端处具有poly(A)尾。在病毒基因组中编码8个开放读码框(ORF)。前2个开放读码框(ORFla和ORFlab)编码参与多蛋白加工以及基因组转录和复制的病毒非结构(NS)多蛋白。在ORF2-7中编码的病毒结构蛋白从6个亚基因组加帽和多腺苷酸化的mRNA表达，所述mRNA作为在5’-末端处具有共同的引导序列的mRNA的3’-共末端嵌套组而合成。主要病毒包膜蛋白是糖蛋白5(GP5)，其在病毒基因组的ORF5中编码。GP5是大小约25kDa的糖基化的跨膜蛋白质。它具有推定的N-末端信号肽并且具有3个潜在的N-联糖基化位点，所述N-联糖基化位点位于包含成熟蛋白质的前40个残基的小的膜外结构域中。在EAV和LDV中，主要包膜糖蛋白与ORF6基因产物即病毒基质(M)蛋白形成二硫键连接的异二聚物。PRRSV GP5和M蛋白之间类似的相互作用已被观察到，但相互作用的方式仍未被限定。已假定GP5和M蛋白的异二聚物的形成可能在感染性PRRSV的装配中起关键作用。除了其在病毒装配中的作用外，GP5看起来参与病毒进入易感宿主细胞中。GP5被假定与宿主细胞受体——唾液酸粘附素相互作用，以便进入猪肺泡巨噬细胞(PAM)(PRRSV的体内靶细胞)中。GP5在受体识别中的作用得到了N-末端膜外结构域中存在主要中和表位的支持，从而暗示GP5膜外结构域在感染过程中的重要作用。
GP5膜外结构域的N-联聚糖对于蛋白质的正确机能可能是关键的。一般而言，N-联糖基化对于蛋白质的正确折叠、靶向作用和生物活性是重要的。在许多有包膜病毒中，包膜蛋白通过添加糖部分进行修饰，并且包膜蛋白的N-联糖基化起着病毒糖蛋白的不同作用，例如受体结合、膜融合、穿透到细胞内和病毒出芽。近期研究已证实汉坦病毒糖蛋白的N-联糖基化在蛋白质折叠和细胞内运输中以及在流感病毒血凝素(HA)蛋白的生物活性和抗原性中的作用。此外，已变得显而易见的是，病毒包膜蛋白的糖基化是由几种不同的有包膜病毒所使用的用于病毒免疫逃避和持续的主要机制，以逃避、阻断或最小化病毒中和抗体应答。这种效应的例子已对于SIV和HIV-1，HBV，流感，和更重要地，在PRRSV的情况下，动脉炎病毒LDV进行了报道。
近期关于PRRSV的反向遗传系统的开发已由几个实验室(包括我们的实验室)报道。显然，使用感染性克隆的突变研究已导致更好地理解动脉炎病毒的病毒基因组的转录和复制机制。因此，为了检查N-联糖基化在PRRSV的GP5生物活性(在产生感染性病毒或在体内引发中和抗体方面)中的重要性，我们已构建了一系列突变型GP5蛋白，其中每个潜在的N-联糖基化位点已个别地或以各种组合进行了突变。就其糖基化模式、在感染性病毒回收中和在由通过实验接种针对wtPRRSV或针对突变体病毒而产生的抗体所进行的交叉中和中的作用来检查所得到的突变型蛋白质。我们的数据显示，所有3个推定的糖基化位点可用于具有高甘露糖类型聚糖的糖基化，并且在残基44处的GP5蛋白的糖基化对于感染性PRRSV的回收来说是关键性的。非常重要的是，来自中和以及抗体应答研究的数据表明，由PRRSV的天然感染可能涉及基于聚糖屏蔽机制的免疫逃避，如先前对于其他病毒所描述的，从而帮助解释了在被PRRSV感染的动物中观察到的相当无效的保护性体液免疫应答。
N-联糖基化位点和失活方法
糖蛋白中的N-联糖基化通常在Asn-Xaa-Ser/Thr(NXS/T)序列处发生，其中Xaa(X)是除Pro外的任意氨基酸残基。可以在N-联糖基化位点处引入各种突变以提供其失活。优选的失活方法包括用编码除天冬酰胺外的任意氨基酸的残基置换天冬酰胺残基。在本发明更优选的实施方案中，用丙氨酸或谷氨酰胺残基置换天冬酰胺残基。
此处还考虑了使N-联糖基化位点，特别是使相应于SEQ ID NO：1的GP5参考蛋白的天冬酰胺34和/或51的N-联糖基化位点失活的其他方法。在Xaa位置处某些氨基酸例如脯氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸的置换也可以用于使N-联糖基化位点失活(Kasturi等人，Biochem J.323(2)：415-9，1997)。备选地，用任意非羟基氨基酸(即除丝氨酸或苏氨酸外的任意氨基酸)置换N-联糖基化位点的最终羟基氨基酸位置(即，NXS/T序列的丝氨酸或苏氨酸残基)也可以用于使N-联糖基化位点失活。已用于使N-联糖基化位点失活的非羟基氨基酸的例子包括半胱氨酸(Kasturi等人，J.Biol.Chemistry270(24)，14756-14761，1995)。
除了氨基酸置换外，本发明还考虑了使N-联糖基化位点失活的其他类型的突变，例如氨基酸插入或氨基酸缺失。技术人员将会意识到，N-联糖基化位点可以通过将导致那个糖基化位点失活的缺失而容易地被失活，所述缺失去除NXS/T序列中的关键氨基酸(即，天冬酰胺残基)。X残基或丝氨酸/苏氨酸残基的缺失可以类似地使某些N-联糖基化位点失活，其中在天然存在的序列中该S或T残基后面不是另一个S或T残基。当X是非羟基氨基酸(即，不是丝氨酸或苏氨酸)时，在N残基的羧基末端处插入任意氨基酸残基可以使N-联糖基化位点失活。在X残基的羧基末端处插入任意非羟基氨基酸也可以使N-联糖基化位点失活。
总之，应当理解，用于实践本发明的突变的关键特征在于它使在GP5蛋白中的天冬酰胺34和/或天冬酰胺51位点处的N-联糖基化失活。尽管不受理论的限制，但据信这些突变的关键特征在于它们阻止蛋白质的某些区域(即，相应于在SEQ ID NO：1的GP5参考蛋白中的天冬酰胺34和/或天冬酰胺51位点的残基)中的糖基化。通过阻止这些位点处的糖基化，去除通常屏蔽野生型病毒的关键表位的糖残基，从而允许引发改善的免疫应答。因此，预期许多不同类型的突变(即，氨基酸置换、插入或缺失)可以用于使鉴定的N-联糖基化位点失活并获得将引发改善的免疫应答的抗原。
本发明的PRRSV多核苷酸和多肽的描述
本发明的方法可以用各种不同的多核苷酸进行实践，所述多核苷酸可以来源于自各种不同的来源。所有多核苷酸的共同特征在于它们编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体，其中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34、天冬酰胺51、或者天冬酰胺34和天冬酰胺54的N-联糖基化位点被失活。为了鉴定相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺54的N-联糖基化位点，可以将非变体且正常糖基化的PRRSV GP5多肽序列与SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白进行比对。此类比对的例子在图5和6中显示。在这种比对中使用的具体序列在表1中描述。
表1.序列描述
  描述   GenBank登录号(参考)   序列ID NO：
  GP5蛋白北美PRRSV毒株NVSL 97-7895   AAS59265.1(Truong，H.M.，等人Virology325(2)，308-319，2004)   SEQ ID NO：1
  GP5蛋白北美PRRSV毒株1.IAF-KlopGP5蛋白   AAC41206.1   SEQ ID NO：2
  GP5蛋白北美PRRSV毒株IAF-BAJ   AAC41209.1   SEQ ID NO：3
  GP5蛋白北美PRRSV毒株IAF-DESR   AAC41212.1   SEQ ID NO：4
  GP5蛋白北美PRRSV毒株IAF 93-653   AAC41215.1   SEQ ID NO：5
  GP5蛋白北美PRRSV毒株IAF 93-2616   AAC41218.1   SEQ ID NO：6
  GP5蛋白北美PRRSV毒株94-3182   AAC41221.1   SEQ ID NO：7
  GP5蛋白北美PRRSV毒株94-287   AAC41224.1   SEQ ID NO：8
  GP5蛋白北美PRRSV毒株IAF-CM   AAC28399.1(其中Ser 106按照Pirzadeh，B.，等人Can.J.Vet.Res.62(3)，170-177(1998))   SEQ ID NO：9
  GP5蛋白北美PRRSV毒株ONT-TS   AAC41227.1   SEQ ID NO：10
  GP5蛋白北美PRRSV毒株VR-2332   AAD12129.1   SEQ ID NO：11
  GP5蛋白北美PRRSV毒株VR-2385   AAA67155.1   SEQ ID NO：12
  GP5蛋白北美PRRSV毒株MLV   AAD27656.1   SEQ ID NO：13
  GP5蛋白北美PRRSV毒株共有   Pirzadeh，B.，等人Can.J.Vet.Res.62(3)，170-177(1998)   SEQ ID NO：14
  GP5蛋白欧洲PRRSV毒株LV   AAA47105.1   SEQ ID NO：15
  PRRSV感染性克隆DNA北美PRRSV毒株NVSL 97-7895   AAS59265.(Truong，H.M.，等人Virology325(2)，308-319，2004)   SEQ ID NO：16
  PRRSV感染性克隆DNA北美PRRSV毒株VR-2332   AY150564.(Nielsen，H.S.，等人，J.Virol.77(6)，3702-3711，2003)   SEQ ID NO：17
为了鉴定可以在本发明的方法中被失活和使用的相应于在SEQ IDNO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的N-联糖基化位点，使所需北美PRRSV分离株(图5)或欧洲PRRSV分离株(图6)的GP5蛋白与SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白(北美毒株NVSL 97-7895)进行比对。通过使用SEQ ID NO：1的GP5蛋白作为参考蛋白，技术人员可以容易地鉴定任何GP5蛋白中的N-联糖基化位点，并随后构建本发明的低糖基化的GP5蛋白变体。因此显而易见的是，术语“相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的(天冬酰胺34和/或天冬酰胺51)充当在任何GP5蛋白中的N-联糖基化位点的描述符。
低糖基化的GP5蛋白可以得自北美PRRSV分离株，包括但不限于SEQ ID NO：1-13，在氨基酸序列水平上与北美PRRSV共有序列例如SEQ ID NO：14至少85％同一的北美PRRSV分离株，或北美PRRSV共有序列。低糖基化的GP5蛋白也可以得自欧洲PRRSV分离株，包括但不限于SEQ ID NO：15，在氨基酸序列水平上与欧洲PRRSV共有序列例如SEQ ID NO：15至少85％同一的欧洲PRRSV分离株，或欧洲PRRSV共有序列。为了获得编码低糖基化的GP5变体的多核苷酸，可以通过标准定点诱变技术来诱变来自上文列出的任何来源的多核苷酸，从而使得它们将编码低糖基化的GP5变体多肽。备选地，可以构建完全合成的DNA序列，其编码所需的低糖基化的GP5变体多肽。这通常通过使用序列分析程序例如“回译(back translate)”来完成，所述“回译”将多肽序列转变成相应的多核苷酸序列(GCG WisconsinPackageTM，Accelrys，Inc，San Diego，CA)。需要时，可以将合适的“密码子偏倚”掺入“回译”程序中以提供合成基因的设计，所述合成基因掺入了适合于在所需表达宿主(即，哺乳动物或酵母)中使用的密码子。
相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的N-联糖基化位点存在于图5中所显示的所有代表性的北美PRRSV分离株中和存在于代表性的欧洲PRRSV Lelystad毒株(图6)中。在这些示例性且非限制性的北美和欧洲PRRSV毒株中，这个位置处的N-联糖基化位点包含序列“NGT”。然而，还预期其他PRRSV变体可以包含在这个位置(即，NXS或T)处的其他在结构上可互换的N-联糖基化位点，所述N-联糖基化位点也可以经由本文教导的方法被失活。这个N-联糖基化位点可以通过用编码其他氨基酸残基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密码子置换在相应的多核苷酸序列中的天冬酰胺51来失活。在这些情况下，在低糖基化的北美PRRSV GP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列例如“QGT”、“AGT”或“XGT”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相应于天冬酰胺51的N-联糖基化位点被失活的北美PRRSV GP5蛋白分离株的这些或其他低糖基化的变体也可以与其中其他N-联糖基化位点被失活的其他低糖基化的GP5变体相组合。使N-联糖基化位点失活的其他方法包括NXS/T序列的“X”或“S/T”残基的氨基酸置换，氨基酸缺失或氨基酸插入，并且在上文得到描述。
准确地相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点仅存在于本文显示的某些代表性的北美PRRSV分离株(图5)中。更特别地，代表性的北美PRRSV分离株IAF-BAJ(SEQ IDNO：3)、94-3182(SEQ ID NO：7)和94-287(SEQ ID NO：8)的GP5蛋白包含准确地相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点，并且包含N-联糖基化位点“NSS”。当然预期本文未显示的其他PRRSV GP5分离物也将包含相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点，并且这些其他GP5蛋白的低糖基化的变体也可以使用本文描述的方法来获得。SEQ ID NO：3、7和8的这个N-联糖基化位点或包含天冬酰胺34N-联糖基化位点的其他PRRSV分离株，可以通过用编码其他氨基酸残基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密码子置换在相应的多核苷酸序列中的天冬酰胺34来失活。在其中天冬酰胺34处的N-联糖基化位点是“NSS”的这些情况下，在低糖基化的北美PRRSV GP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列例如“QSS”、“ASS”或“XSS”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。备选地，“NSS”序列的丝氨酸残基可以被置换为非羟基氨基酸(即，非丝氨酸或非苏氨酸)。在这些情况下，在低糖基化的北美PRRSVGP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列“NSX”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。“NSS”序列的2个丝氨酸残基之间(即，丝氨酸35和36之间)的非羟基氨基酸的插入也可以用于使这个特定的糖基化位点失活。
在缺乏准确地相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点的其他北美PRRSV分离株中，也可以使位于残基30(图5SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、11、13中的“NAS”)和残基33(图5SEQ ID NO：3、8中的“NNS”；SEQ ID NO：6、10中的“NSS”；SEQ ID NO：11、13中的“NDS”)处的其他N-联糖基化位点失活。换言之，位于相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的残基30和33的氨基酸位置处的在其他北美分离株中的N-联糖基化位点也可以在本发明的方法中被失活和使用。不受理论限制，位于SEQ IDNO：1的GP5参考蛋白的残基29和35之间的PRRSV GP5蛋白的特定区域看起来是高变区(图5)，其可以耐受各种不同的氨基酸序列(图5；还参见Pirzadeh等人，Can.J.Vet Res.，1998，62：170-177)。尽管某些天然存在的PRRSV分离株在这个区域中不包含N-联糖基化位点(即，SEQ ID NO：5、12的北美分离株；SEQ ID NO：15的欧洲分离株)，但其他分离株在这个区域中可以包含1-3个糖基化位点。因此，本文考虑了在位于SEQ ID NO：1的GP5参考蛋白的残基29和35之间的区域中给定GP5蛋白的任何一个糖基化位点的失活，作为用于引发针对PRRSV GP5蛋白的改善的免疫应答的组合物或方法。此外，本文还考虑了在位于SEQ ID NO：1的GP5参考蛋白的残基29和35之间的区域中给定GP5蛋白的超过一个或所有糖基化位点的失活，作为用于引发针对PRRSV GP5蛋白的改善的免疫应答的组合物或方法。
北美和欧洲PRRSV序列的比对显示，相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺51的N-联糖基化位点也存在于代表性的欧洲PRRSV分离株中。在这种特定的情况下，N-联糖基化位点包含序列“NGT”，并且SEQ ID NO：1参考序列的天冬酰胺51相应于SEQ ID NO：15的天冬酰胺53。这个N-联糖基化位点可以通过用编码其他氨基酸残基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密码子置换在相应的欧洲PRRSV多核苷酸序列中的天冬酰胺53来失活。在这些情况下，在低糖基化的欧洲PRRSV GP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列例如“QGT”、“AGT”或“XGT”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相应于天冬酰胺51的N-联糖基化位点被失活的欧洲PRRSV分离株的这些或其他低糖基化的变体也可以与其中其他N-联糖基化位点被失活的其他低糖基化的GP5变体相组合。
低糖基化的GP5变体蛋白可以由PRRS病毒编码，所述PRRS病毒可以用于制备活的、杀死的、或减毒的疫苗以用于保护猪不受PRRSV感染。在本发明的优选实施方案中，本发明的低糖基化的GP5变体蛋白可以被改造成感染性PRRSV克隆，其能够生产感染性PRRSV RNA。关于可以进行改造以编码低糖基化的GP5变体蛋白的感染性北美PRRSV克隆的描述在美国专利号6,500,662，Nielsen等人，J.Virol.77：3702-11，2003，和Truong等人，Virology 325：308-19，2004中找到。可以进行诱变以获得用于在疫苗中使用的PRRSV病毒的北美PRRSV感染性克隆序列包括但不限于，北美毒株NVSL 97-7895(SEQ IDNO：16)和毒株VR-2332(SEQ ID NO：17)。关于可以进行改造以编码低糖基化的GP5变体蛋白的感染性欧洲PRRSV克隆的描述在美国专利号6,268,199中找到。在其中疫苗包含活的或减毒的PRRSV的实施方案中，相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的N44的N-联糖基化位点(即，图5和6中的“NLT”序列)不被失活，因为这个位点的糖基化是PRRSV的感染性所必需的。在欧洲PRRSV分离株的情况下，相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的N44的N-联糖基化位点是NLT序列，其从代表性的欧洲PRRSV毒株Lelystad(SEQ ID NO：15；图6)的天冬酰胺46开始。欧洲PRRSV毒株的N46N-联糖基化位点也是感染性所必需的，并且在其中使用活的或减毒的PRRSV疫苗的本发明实施方案中不被失活。
备选地，低糖基化的GP5变体蛋白可以与DNA疫苗一起引入猪内。此类DNA疫苗通常包含这样的DNA分子，其中在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码所述低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸有效地连接。可以用于驱动低糖基化的GP5变体蛋白表达的启动子包括但不限于，CMV(巨细胞病毒)即时早期启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)长末端重复启动子和SV40(猿猴病毒40)T-抗原启动子。在某些优选实施方案中，这种启动子是CMV启动子。
在另外其他的实施方案中，表达低糖基化的GP5变体蛋白的分离的多核苷酸包括除PRRSV外的病毒载体。除PRRSV外的病毒载体包括但不限于，痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体。此类载体在各种出版物例如美国专利号7,041,300(关于TGEV载体)和6,692,750(关于甲病毒载体)中得到描述。
治疗上可接受的承载体和佐剂
在本发明的实践中，低糖基化的GP5变体多肽或编码低糖基化的GP5变体多肽的多核苷酸可以与治疗上可接受的承载体或赋形剂相组合。此类承载体的非限制性例子包括生理盐水或其他类似的盐水溶液，蛋白质例如血清白蛋白，缓冲液例如基于碳酸盐、磷酸盐、膦酸盐或Tris的缓冲液，表面活性剂例如NP40或Triton X100，和聚乙二醇聚合物。此类承载体的任何组合可以在本发明的组合物和方法中使用。用于包含活的或减毒的PRRSV病毒的组合物的优选承载体是浓度为50-100mg/ml的d1-α-生育酚乙酸酯。
还考虑了在包含低糖基化的GP5变体多肽或编码低糖基化的GP5变体多肽的多核苷酸的组合物中使用佐剂。此类佐剂通常在性质上是是水性或油性的。可以使用的佐剂包括但不限于，氢氧化铝、Quil A、氧化铝凝胶悬浮液、矿物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副产物、分枝杆菌和CpG寡脱氧核苷酸，或其任何组合。可以使用的各种类型的CpG佐剂在美国专利号6,977,245和6,406,705中得到描述。
还考虑了使用加强细胞免疫应答的其他佐剂(即，T辅助细胞(Th.sub.1和Th.sub.2)亚群增强剂)。此类佐剂包括但不限于，白介素1(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、γ干扰素(g-IFN)、细胞坏死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激复合物(ISCOM)和脂质体。
组合物的施用可以通过皮下注射、静脉内注射、皮内注射、肠胃外注射、肌内注射、无针注射、电穿孔、口服递送、鼻内递送、口鼻递送、或其任何组合来完成。无针注射通常用装置例如Agro-Jet
Figure A20068004053200321
注射器(Medical International Technologies，Montreal，Canada)来实现。
实施例
实施例1.
下列实施例举例说明了编码各种低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的各种PRRSV多核苷酸的构建，用于引发针对PRRSV抗原的改善的免疫应答的包括此类多核苷酸的组合物，以及使用所述多核苷酸和组合物在猪中引发针对PRRSV抗原的改善的免疫应答的方法。
材料和方法
细胞、培养基和抗体。MARC-145细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中进行繁殖，所述DMEM包含10％胎牛血清(FBS)以及100个单位的青霉素、20个单位的链霉素和20个单位的卡那霉素/ml生长培养基。这些细胞用于RNA电穿孔、病毒感染、病毒生长和噬斑测定法。将幼仓鼠肾(BHK-21)细胞在含有Earl盐的极限必需培养基(MEM)中维持，所述MEM包含5％FBS和上述抗生素。BHK-21细胞用于GP5的瞬时表达，随后为免疫荧光测定法(IFA)或放射性标记和免疫沉淀实验。所有细胞维持于37℃和5％CO2的环境中。针对PRRSV GP5和M蛋白质的兔多克隆抗体由Carl A.Gagnon(Universityof Quebec，Montreal，Canada)友情提供。针对核衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(SDOW17)购自National Veterinary ServicesLaboratories(NVSL，Ames，IA，USA)。抗小鼠Alexa-488得自MolecularProbes，Inc.(Eugene，Oregon，USA)。
编码GP5和PRRSV感染性克隆的质粒的遗传操作
用EcoRV和BstZ17 I限制酶消化在pBR322中的全长PRRSV感染性cDNA克隆(FL12；SEQ ID NO：16)，并且使用相同的酶位点在pBR322中克隆包含PRRSV的ORF2的大部分、全部ORF3-7和完整3’UTR的～4.9kbp片段。这种中间质粒充当用于诱变的模板，以在GP5内的潜在的N-联糖基化位点(N34、N44和N51)处引入突变(图2)。使用标准技术，使用合成引物(表2)通过重叠延伸PCR进行诱变。
表2.在这项研究中使用的引物及其序列。
加下划线的密码子序列指明了突变的位点。
  引物   核苷酸序列
  GP5-N34A-ForGP5-N44A-ForGP5-N51A-ForGP5-N34/44A-ForGP5-N44/51A-ForGP5-N34/51A-ForGP5-N34/44/51A-ForPRRSV-13177-ForPRRSV-14473-Rev   5’GCCAACAGCGCCAGCAGCTCTC 3’(SEQ ID NO：18)5’GTTGATTTACGCCTTGACGCTATG 3’(SEQ ID NO：19)5’GTGAGCTGGCTGGCACAGATTG 3’(SEQ ID NO：20)5’GCCAACAGCGCCAGCAGCTCTCATCTTCAGTTGATTTACGCCTTGACGCTATG 3’(SEQ ID NO：21)5’GTTGATTTACGCCTTGACGCTATGTGAGCTGGCTGGCACAGATTG 3’(SEQ IDNO：22)5’GCCAACAGCGCCAGCAGCTCTCATCTTCAGTTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCTGGCTGGCACAGATTG 3’(SEQ ID NO：23)5’GCCAACAGCGCCAGCAGCTCTCATCTTCAGTTGATTTACGCCTTGACGCTATGTGAGCTGGCTGGCACAGATTG 3’(SEQ ID NO：24)5’CTACCAACATCAGGTCGATGGCGG 3’(SEQ ID NO：25)5’GTCGGCCGCGACTTACCTTTAGAG 3’(SEQ ID NO：26)
用BsrG I和BstE II限制酶消化PCR产物并放回到中间质粒中。通过测序鉴定并验实包含所需突变的克隆。对GP5的完整编码区进行测序以确定所述克隆中不存在另外的突变。使用相同的限制酶位点将来自在GP5编码区中包含突变的中间质粒的EcoRV-Pac I片段移回到全长cDNA克隆中。用PRRSV特异性的内部引物再次测序在全长克隆中的GP5编码区，以证实突变的存在。
将wt GP5和独个突变体克隆入双顺反子载体中，其中GP5是第一个顺反子，随后为脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(IRES)和M编码序列(图1A)。还将全长GP5克隆入CMV启动子驱动的载体(pcDNA 3.0，Clonteoh Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)中以用于互补作用研究。为此，将GP5编码区进行PCR扩增、克隆和测序。
体外转录和电穿孔
用Ac1I消化全长质粒，并使用mMESSAGE mMACHINE Ultra T7TM试剂盒按照制造商(Ambion，Inc.，Austin，Tx，USA)的建议以及如先前所述，将线性化的DNA用作模板以产生加帽的RNA转录物。用DNA酶I处理反应混合物以消化DNA模板，并用苯酚和氯仿进行提取，并且最后用异丙醇进行沉淀。通过下列过程来分析体外转录物的完整性：乙二醛琼脂糖凝胶电泳，随后为溴化乙锭染色。
用约5.0μg体外转录物连同5.0μg从MARC-145细胞中分离的总RNA一起对MARC-145细胞进行电穿孔。使用Bio-Rad Gene PulserXcellTM(Bio-Rad，Inc.，Hercules，CA，USA)，以250V、950μF，在4.0mm杯池中，将在400μl包含1.25％DMSO的DMEM中的约2×106细胞脉冲1次。在正常生长培养基中稀释细胞，在60-mm细胞培养板中铺板。将小部分的经电穿孔的细胞在24孔平板中进行铺板，以在电穿孔后48小时时检查N蛋白的表达，这将指明基因组的复制和转录。一旦使用间接免疫荧光测定法(IFA)证实了N蛋白的表达后，在电穿孔后48小时收集来自在60-mm平板中的大量经电穿孔的细胞的上清液，进行澄清，并在首次用于实验的MARC-145细胞上传代。使用IFA就致细胞病变效应(CPE)以及N蛋白的表达来观察受感染的细胞。来自显示出CPE和阳性荧光的受感染细胞的上清液被归属为包含感染性病毒。在证实后，培养病毒原种并以小的等分试样冷冻于-80℃以用于进一步的研究。在所有实验中，包含wt PRRSV基因组的FL12和包含聚合酶缺陷型PRRSV基因组的FL12pol用作对照。
蛋白质的代谢放射性标记和分析
用MOI为3.0的重组痘苗病毒(vTF7-3)感染在6孔平板中的BHK-21细胞，并随后用在T7 RNA聚合酶启动子下的编码wt或各种突变型GP5的双顺反子质粒DNA进行转染。使用Lipofectamine2000TM按照制造商的方案(Life Technologies，USA)进行DNA转染。在转染后16小时，细胞用PBS洗涤2次，并且在无甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中饥饿1小时，并用包含100μCi Expre35S35S Protein LabelingMix(NEN Life Sciences，Boston，MA)/ml培养基的0.6ml无甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM放射性标记3小时。在放射性标记后，细胞在冷PBS中洗涤3次，并在300μl放射免疫沉淀测定法(RIPA)缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1％Triton X-100、0.1％SDS、1％脱氧胆酸钠和1x蛋白酶抑制剂)中制备细胞提取物。将经澄清的细胞提取物于40℃与兔抗-GP5或抗-M蛋白抗体一起孵育过夜。添加在100μl RIPA缓冲液中的约4.0mg蛋白A sepharose(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的浆状物，并进一步孵育2小时。经免疫沉淀的复合物用500μl RIPA缓冲液洗涤3次并用于进一步的分析。
对于内切糖苷酶H(Endo H)处理，将经免疫沉淀的复合物重悬浮于20μl 1x变性缓冲液(0.5％SDS、1.0％β-巯基乙醇)中并煮沸10分钟。收集上清液，调整至1x G5缓冲液(0.05M柠檬酸钠，pH5.5)，并与100个单位的Endo H(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)一起于37℃孵育16小时。类似地加工未消化的对照样品，但不添加Endo H。在Endo H消化后，使样品与等体积的2xSDS-PAGE样品缓冲液相混合，煮沸5分钟，并在变性条件下与蛋白质标准(Protein Plus Precision Standard，Bio-Rad，Inc)一起通过SDS-12％PAGE进行解析。凝胶用10％乙酸固定15分钟，用水洗涤3次，用0.5M水杨酸钠处理30分钟，干燥，并最终于-70℃暴露于X光片。对于肽N-糖苷酶F(PNGase F)(New England Biolabs，Inc)消化，将经免疫沉淀的复合物重悬浮于1x G7缓冲液(0.05M磷酸钠pH7.5，1.0％NP-40)中，并通过于37℃与2个单位的该酶一起孵育16小时来进行消化。为了检查在衣霉素(Sigma，St.Louis，MO)存在下的GP5合成，将经转染的细胞用2.0μg衣霉素/ml培养基处理1小时，并如上所述在该药物存在下进行3小时的放射性标记。
为了获得经放射性标记的由细胞外病毒粒子或细胞内病毒表达的GP5，用wt或突变体PRRSV感染MARC-145细胞。在感染后48小时，使细胞饥饿1小时，并用100μCi Expre35S35S Protein LabelingMix/ml培养基放射性标记24小时，所述培养基包含90％无甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM和10％常规的DMEM。在进行标记后，收获培养物上清液，清除细胞碎片，并于4℃在100,000xg下使细胞外病毒粒子形成粒状沉淀3小时。将病毒粒状沉淀重悬浮于200μl RIPA缓冲液中，用抗-GP5抗体进行免疫沉淀，并使用或不使用Endo H处理来检查所述蛋白质。对于由细胞内病毒表达的GP5的免疫沉淀，如上所述进行感染，并在感染后24小时，使细胞饥饿1小时，在制备细胞提取物之前如上所述进行2小时的放射性标记。
病毒生长动力学和噬斑测定法
用MOI为3.0PFU/细胞的突变体或wt PRRSV感染MARC-145细胞，并于37℃在孵育箱中进行孵育。在感染后的各个时间点上，收集来自受感染细胞的培养物上清液的等分试样，并且测定上清液中的病毒滴度并表示为组织培养感染量50/ml(TCID50/ml)。进行3次病毒生长动力学。为了检查突变体病毒的噬斑形态，使用MARC-145细胞来进行噬斑测定法。细胞用10倍系列稀释的独个病毒于37℃感染1小时。受感染的细胞单层用PBS洗涤，并用包含0.8％Seaplaque琼脂糖(FMC Bioproducts，Rockland，ME USA)的DMEM-5％FBS覆盖。96小时后，去除琼脂糖塞子，并使细胞单层与染色溶液(20％甲醛、9.0％乙醇和0.1％结晶紫)一起于室温孵育30分钟。细胞用水轻轻洗涤以去除过量染料，并风干，以检查和计数噬斑。
通过反式表达wt GP5对于病毒回收的互补(complementation)
用pcDNA-GP5转染BHK-21细胞。在转染后40小时，收获细胞，并与衍生自编码突变型GP5的全长PRRSV cDNA的加帽的体外转录物一起进行电穿孔。用新鲜培养基稀释经电穿孔的细胞，并在6孔平板中铺板。在电穿孔后48小时收集来自经电穿孔的细胞的上清液，离心以去除细胞碎片，并用于感染首次用于实验的MARC-145细胞。在转染后48小时，如上所述通过IFA就N蛋白的来表达检查受感染的MARC-145细胞。计数阳性细胞的数目以确定在上清液中产生的假颗粒(pseudo-particles)的数目。由3次独立实验计算阳性细胞的平均数目，并呈现为转染到细胞内的每微克体外转录的RNA产生的假颗粒数目。
血清中和(SN)测定法
使用先前描述的荧光病灶中和测定法(fluorescence focusneutralization assay)测定血清样品中的PRRSV中和抗体的滴度。在200 TCID50的攻击病毒存在下将系列稀释的测试血清在包含5％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中于37℃孵育60分钟，所述攻击病毒由FL12(wt PRRSV)或者编码GP5突变体的病毒FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A中的任何一种组成。将混合物加入至包含汇合的MARC-145细胞的96孔微量滴定板中，所述MARC-145细胞先前已播种了48小时。于37℃在包含5％CO2的增湿气氛中孵育24小时后，细胞用50％甲醇和50％丙酮的溶液固定10分钟。用PBS充分洗涤后，通过如下方式来检测PRRSV的N蛋白的表达：以1∶500的稀释度用单克隆抗体SDOW17，随后与1∶100稀释度的缀合有FITC的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO，USA)一起孵育。中和滴度表示为抑制90％存在于对照孔中的病灶的最高稀释度的倒数。
用GP5突变体和wt PRRSV进行的猪的实验性接种
将GP5突变体病毒(FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A)和FL12(wt PRRSV)的高滴度原种(通过在MARC 145细胞中传代3次获得)用于感染年幼的猪。21日龄的最近断奶的猪购自具有不存在PRRSV感染的证明记录的无特定病原体的兽群。如通过ELISA(Iddex Labs，Portland，ME)所测试的，所有动物对于抗PRRSV抗体是阴性的。每组3只猪用FL12wt PRRSV或突变体FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A进行感染。在所有情况下，接种物由在2ml中稀释的105 TICD50组成，并在颈中通过肌内施用。接种后(PI)15天监控经接种的动物的直肠温度。在接种后第4、7和14天时通过在MARC 145细胞上的常规分离来测量病毒血症。每周抽取一次血清样品，共接种后49天的时间段。血清样品用于检测关于每种突变体和wt PRRSV的同源和异源交叉中和滴度。
结果
PRRSV GP5的表达和表征
PRRSV毒株97-7895的GP5具有3个推定的糖基化位点(N34、N44和N51)。为了检查GP5的糖基化模式，首先产生了这样的双顺反子载体，其中将位于来自EMCV的IRES的侧翼的GP5和M蛋白编码区置于T7RNA聚合酶启动子的控制下(图1A)。关于构建所述双顺反子载体的基本原理是，GP5和M蛋白已知(对于LDV和EAV)或假定(对于PRRSV)彼此相互作用，并且此类相互作用可能对于GP5的蛋白质折叠、糖基化、细胞内运输和/或其他生物活性是重要的。
通过所述双顺反子质粒的转染来瞬时表达GP5和M，随后为放射性标记和用抗GP5抗体的免疫沉淀，这揭示了2个主要的蛋白质种类。以～25.5kDa的质量迁移的蛋白质种类是GP5的完全糖基化形式(图1B，泳道2)。因为每个N-联糖基化给蛋白质添加～2.5kDa的分子量，所以这指表明所有3个潜在的糖基化位点可能用于GP5的糖基化。19.0kDa的蛋白质种类是病毒的M蛋白，因为它还被抗M抗体免疫沉淀(泳道7)。所述结果表明，GP5和M蛋白在表达这2种蛋白质的细胞中彼此相互作用。在用去除高甘露糖类型的寡糖链的酶Endo H处理后，GP5的大小减少为～18kDa，而M蛋白的大小保持不变(泳道3)。用从蛋白质主链上去除所有类型的糖的酶PNGase F处理GP5(泳道4)，或者在衣霉素存在下合成GP5(泳道5)导致比用Endo-H处理的蛋白质略微更快的电泳迁移率进行迁移的蛋白质。这是预料之中的，因为衣霉素处理或用PNGase F消化将产生未糖基化的蛋白质，而Endo-H处理将导致在每个N-联糖基化位点处保留N-乙酰葡糖胺残基的蛋白质。应当指出，用抗M抗体免疫沉淀出了～30kDa分子量的显著蛋白质种类。这种蛋白质的身份是未知的，但它可能是与M蛋白相互作用的细胞蛋白质。
来自上文研究的结果暗示，未糖基化和完全糖基化形式的GP5分别具有18.0kDa和25.5kDa的表观分子大小。看起来所有3个潜在的糖基化位点均用于产生完全糖基化形式的GP5。添加至这些位点的聚糖部分是高甘露糖类型的，因为它们对于经由Endo H的消化敏感。此外，所述结果表明，未糖基化和完全糖基化形式的GP5看起来均与M蛋白相互作用。
用于GP5的糖基化的N-联糖基化位点的分析
为了更精确地确定所有还是一些在GP5中的潜在N-联糖基化位点用于糖部分的添加，在双顺反子质粒中产生一系列突变体，其中所有3个潜在的糖基化位点N34、N44和N51(图2A)个别地或以各种组合被改变成丙氨酸(图2B)。在经质粒转染的细胞中，对蛋白质进行放射性标记并用抗GP5抗体进行免疫沉淀。免疫复合物不进行处理或用Endo H进行处理并通过SDS-PAGE进行检查。如由图2C中呈现的数据可见的，携带单个突变(N34A、N44A或N51A)的突变型GP5蛋白作为约23.0kDa的蛋白质种类进行迁移(泳道4、6和8，箭头)。Endo H处理后，这些蛋白质作为～18.0kDa的蛋白质种类进行迁移(分别为泳道5、7和9)，其类似于Endo H处理后的wt GP5(泳道3)。所述蛋白质的电泳迁移率的较小差异最可能反映了下述事实：与将包含2个此类残基的单重突变体相比较，在Endo H处理后wt蛋白质将保留所有3个N-乙酰葡糖胺残基。双重突变体(N34/44A、N44/51A和N34/51A)产生以接近于～20.5kDa蛋白质进行迁移的蛋白质种类(泳道10、12和14)，并且在Endo H处理后，所述蛋白质的大小减少为18.0kDa(泳道11、13和15)。三重突变体(N34/44/51A)产生作为18.0kDa蛋白质进行迁移(泳道16)并且对于Endo H消化具有抗性(泳道17)的蛋白质。
因此，根据上述突变研究，显而易见的是，所有3个潜在的糖基化位点用于糖基化以产生完全成熟的PRRSV GP5。看起来所有3个糖基化位点通过高甘露糖类型的聚糖部分进行修饰。
具有GP5突变体的感染性PRRSV病毒的回收
为了评估N-联糖基化在感染性PRRSV的产生中的重要性，将突变型GP5蛋白的编码区插入全长cDNA克隆中。将从该克隆产生的加帽的体外转录物电穿孔到MARC-145细胞中，并检查感染性PRRSV的产生。我们的结果显示，从用在N34、N51和N34/51处包含突变的全长转录物电穿孔的细胞中容易地回收到感染性病毒。然而，在类似的病毒回收条件下，回收其他突变体病毒的重复尝试是不成功的。尽管回收的病毒的生长动力学类似于wt病毒，但在N34和N51处包含突变的FL-N34A和FL-N51A病毒的总得率在MARC-145细胞中低大约1个对数，而具有双重突变(N34/51A)的FL-N34/51A的总得率比wt PRRSV低几乎1.5个对数(图3A)。来自受感染细胞的RNA的RT-PCR扩增，随后进行核苷酸测序，表明这些病毒是稳定的，包含所需突变，并且在完整的GP5区域中没有检测到其他突变(数据未显示)。
在MARC-145细胞上进行病毒噬斑测定法，以监控突变体病毒的噬斑表型。由wt PRRSV产生的噬斑是清晰且明显的，而突变体病毒产生具有不同表型的噬斑。FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A病毒产生较不明显的噬斑，并且噬斑内的许多细胞看起来是正常的(图3B，空心箭头)。此外，FL-N51A、FL-N34/51A产生其中病毒不能清除细胞单层的某些噬斑(图3B，实心箭头)。这些数据指出，与wt PRRSV相比较，回收的突变体病毒实际上具有较低的致细胞病变性。
因为我们不能回收具有突变体模板FL-N44A、FL-N31/44A、FL-N44/51A和FL-N31/44/51A的感染性PRRSV，所以GP5编码区中的突变可能影响RNA模板的某些其他功能，例如基因组RNA包装成颗粒。为了解决这点，我们检查了反式表达wt GP5的细胞是否能够支持突变型RNA模板的包装，所述突变型RNA模板在产生感染性PRRSV方面具有其他方面的缺陷。将经pcDNA-GP5转染的BHK-21细胞用体外转录物进行电穿孔，并且在电穿孔后48小时，收集培养物上清液并用于感染首次用于实验的MARC-145细胞以确定PRRSV假颗粒的产生。如果产生了假颗粒，那么就可以预期在这些受感染的MARC-145细胞中观察到N蛋白的表达。只有当首次用于实验的MARC-145细胞接受全长壳体化的突变型RNA基因组时，N的表达才是可能的，所述突变型RNA基因组在假颗粒进入细胞中后开始复制。在先前不能被回收的所有突变体中，我们能够回收包含2种突变型全长基因组(FL-N44A和FL-N34/44A)的假颗粒(图3C)。受突变体病毒感染的培养物中每个发绿色荧光的细胞代表一个感染性假颗粒。因为这些颗粒在包膜上只包含功能性wtGP5，但在基因组中包含非功能性突变型GP5的编码序列，所以它们不能产生感染性颗粒以散布至周围细胞。回收具有其他突变型模板(FL-N44/51A和FL-N31/44/51A)的假感染性颗粒的多重尝试是不成功的。
从这些实验中产生的感染性假颗粒数目的定量评估暗示，电穿孔到细胞内的每微克突变型RNA产生约1000个颗粒(图3D)。这比用编码wt GP5的RNA获得的那种小约100倍。如此低水平的感染性假颗粒的产生可能是由于下述事实：如通过在这些细胞中的N蛋白表达可见的，只有约5-10％的表达wt GP5的细胞接受了全长转录物。还可能的是，转染的细胞中wt GP5的低水平表达可能促成了这些假病毒粒子的低水平产生。
掺入突变体病毒内的GP5和在受感染细胞中表达的GP5的检查
为了确定掺入从转染的细胞产生的感染性病毒粒子中的GP5蛋白的性质，我们从用wt和突变体病毒感染的细胞中产生了经放射性标记的PRRSV。通过超速离心使培养物上清液中存在的细胞外病毒粒子形成粒状沉淀，并且使用抗GP5抗体通过免疫沉淀和后续的电泳分析来检查在这些病毒粒子中存在的GP5。结果显示，掺入病毒粒子中的wtGP5作为～25-27kDa的蛋白质种类的宽阔地扩散的条带进行迁移(图4A，泳道1)，其对于Endo H消化具有部分抗性(泳道2)。掺入病毒粒子中的突变型GP5(N34A和N51A)对于Endo H敏感。基于在EndoH消化后产生的产物的大小，看起来这些单位点突变体中只有1个聚糖部分是敏感的，而其他的是具有抗性的。相反地，双重突变体GP5(N43/51A)对于Endo H具有抗性。此外，来自突变体病毒的GP5的Endo H消化也产生非常少量的GP5蛋白主链，这表明这些病毒掺入了包含Endo H抗性的以及Endo H敏感的聚糖部分的GP5蛋白。
因为在用双顺反子载体转染的细胞中，wt以及突变型GP蛋白完全是Endo H敏感的(图1和2)，所以我们对于在PRRS病毒粒子上的GP5大部分包含Endo H抗性形式的观察结果感到惊讶。为了检查Endo H抗性形式的蛋白质是否也在受感染细胞中合成，对用wt或突变型PRRSV感染的MARC-145细胞进行放射性标记，用抗GP5抗体来免疫沉淀GP蛋白，并采用或不采用Endo H消化通过电泳进行分析。此类实验的结果显示于图4B中。大多数wt GP5在所有3个位点处包含Endo H抗性聚糖(泳道2和3)，而2种单重突变体仅在1个位点处包含Endo H抗性聚糖(泳道4-7)。双重突变体中的某些聚糖部分是有抗性的，而其他的对Endo H敏感(泳道8和9)。尽管Endo H抗性模式类似于对于病毒粒子相关GP5所观察到的那种，但它不同于在表达GP5和M蛋白的细胞中观察到的那种(图1和2)。这些结果表明，其他病毒蛋白质可能在GP5上的聚糖的进一步修饰中起作用。GP5的低糖基化对于PRRSV被特异性抗体中和的能力的影响。
参与与病毒受体的相互作用的病毒糖蛋白的糖基化水平已知影响病毒粒子与病毒中和抗体反应的能力。为了测试这种现象是否在PRRSV的情况下发生，将具有改变的糖基化模式的PRRSV GP5突变体(FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A)与PRRSV wt(FL12)在它们被恢复期抗血清中和的能力方面进行比较。对于这点，我们使用来自已用wt PRRSV感染的4只动物的恢复期抗血清(感染后47天)。类似剂量(2,000 TCID50)的感染性PRRSV GP5突变体(FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A)以及感染性克隆衍生的wt PRRSV(FL12)在根据我们的标准测定法规程施行的血清中和测定法中用作攻击病毒，并且4种抗wt PRRSV(FL12)血清的组用作参考。表3显示了获得的不同的终末点血清中和滴度。通常，在感染后47-54天收集的PRRSV wt-恢复期血清样品包含中等水平的wt PRRSV中和活性(1∶8-1∶32，表3和4)，这反映了中和抗体应答相对较弱和缓慢的特征，这是被wt PRRSV感染的典型特征。然而，低糖基化的PRRSV突变体(其在GP5膜外结构域上缺乏1个或2个聚糖部分)在SN测定法中用作攻击病毒似乎显著增强了参考血清的终末点，其中终末点滴度增强为6-22倍(表3)。这个观察结果清楚地暗示，1个且特别是2个聚糖部分的去除增加了中和表位对特异性抗体的易接近性。这些结果看起来表明，在受wtPRRSV感染的恢复期血清中存在大量的PRRSV中和抗体，所述中和抗体是以其他方式无法检测的，因为在SN测定法中通常使用包含完全糖基化的GP5的wt PRRSV。
表3.PRRSV GP5的糖基化模式的改变对于感染性病毒粒子与中和抗体反应的能力的影响。
Figure A20068004053200441
表3中的数字相应于显示中和的终末点稀释度的倒数(SN终末点)。
GP5的低糖基化对于PRRSV在体内诱导中和抗体的能力的影响
已报道了一种显著影响，其中从病毒包膜糖蛋白中去除碳水化合物导致产生高滴度的针对突变体病毒的中和抗体，当这种突变体用于体内接种宿主时；在某些情况下还诱导比wt病毒自身更高滴度的针对wt病毒的抗体。我们用相同剂量的wt PRRSV FL12或具有改变的糖基化模式的每种突变体感染了猪群体。有趣的是，在感染后4、7和10天通过评估直肠温度和评估病毒血症来进行的对于感染的临床/病毒学评估表明，在所有群体中具有与先前对于FL12所描述的类似的感染模式，对于任一突变体没有毒力减弱或加重的证据(数据未显示)。然而，在48天的时间段过程中从这些动物中对血清顺次取样表明了wt PRRSV和突变体之间在它们的诱导PRRSV中和抗体应答的动力学方面的显著差异(表4A和4B)。突变体发展出早期的且比由wt PRRSV发展出的那种更强的同源中和抗体应答，至在突变体的情况下PRRSV中和抗体应答的特征性地迟缓且不足的性质看起来已被校正的程度(表4B)。突变体-同源的中和抗体的表观的动力学(表4B)表明更规则的中和抗体血清转化，这与对于其他病毒感染例如流感或伪狂犬病病毒但不是对于PRRSV所描述的相一致。最重要的是下述事实：用GP5糖基化突变体进行感染诱导了wt PRRSV特异性中和抗体应答，其显著高于使用wt PRRSV自身时的应答。突变体病毒FL-N34A和FL-N51A诱导了为wt PRRSV自身水平的5倍(p＜0.05)的针对wt PRRSV的中和抗体滴度水平，而突变体FL-N34/51诱导了为wt PRRSV自身水平的6倍(p＜0.01)的wt PRRSV中和抗体滴度水平(表4B)。
表4.PRRSV GP5的糖基化模式的改变对于PRRSV毒株诱导针对wtPRRSV的中和抗体(4A)或感染同源毒株(4B)的能力的影响
(*)表4A和B中的数字相应于所述组(n＝3)的SN终末点的几何平均值。
Figure A20068004053200451
讨论
在本研究中，我们检查了PRRSV的GP5的糖基化在回收感染性病毒中的影响，其在突变体病毒被抗体中和的能力以及在体内诱导中和抗体中的作用。我们发现GP5中所有3个潜在的糖基化位点(N34、N44和N51)被用于聚糖部分的添加。我们的结果揭示出，在N44位点处的聚糖添加对于回收感染性病毒是最关键的。此外，我们的结果显示出，包含低糖基化形式的GP5的PRRSV对于经由抗体的中和极度敏感，并且突变体病毒诱导显著更高水平的不仅针对同源突变体病毒而且还针对wt PRRSV的中和抗体。
通过使用在单个或多个位点处具有改变的突变体证实了所有3个潜在的N-联糖基化位点用于GP5中聚糖的添加(图2)。生物化学研究显示，当与M蛋白一起在经转染的细胞中表达时，PRRSV GP5蛋白包含Endo H敏感的高甘露糖类型的聚糖。下列观察结果是引起兴趣的：掺入病毒粒子中的大多数GP5对于Endo H有抗性(图4A)，而在经转染的细胞中于M蛋白存在下表达的GP5是完全Endo H敏感的。可能的是，当在M蛋白存在下在经转染的细胞中表达时，GP5主要积聚在ER或高尔基体内侧区域(cis-Golgi region)中，并因此保持为EndoH敏感的。然而，在受PRRSV感染的细胞中，GP5可能与另外的病毒蛋白质相互作用，并且通过与其他病毒蛋白质形成复合物而促进了越过ER或高尔基体内侧的GP5运输。与这种相互作用一致，我们观察到，在受wt或突变型PRRSV感染的细胞中，GP5蛋白也对Endo H有抗性。我们提出，在受感染细胞的ER中合成的GP5被运输至高尔基体中间和/或外侧区域，在那里大多数GP5分析在被掺入PRRSV病毒粒子中之前获得Endo H抗性。使用动脉炎病毒(包括PRRSV)的几项研究暗示，GP5和M蛋白形成异二聚物，这可能在病毒感染性中起关键作用。在EAV和LDV中，GP5和M蛋白通过形成二硫桥而产生的直接相互作用已得到证实。此类相互作用可能在N-联寡糖侧链的进一步加工之前发生，据推测在GP5被运输出ER或高尔基体内侧区室外之前。
有趣的是注意到，掺入wt和突变体病毒粒子内的GP5的Endo H抗性模式是不同的。尽管wt PRRSV中的大多数GP5分子是Endo H抗性的，但单位点突变体病毒粒子(FL-N34A和FL-N51A)中的大部分GP5分子是Endo H敏感的(图4A)。此外，在这些突变体的2个聚糖部分中，只有1个是敏感的，而另一个是抗性的。双重突变体(FL-N34/51A)病毒粒子还掺入了包含聚糖的GP5，所述聚糖中的某些也是对Endo H敏感的。这些数据与下述解释一致：wt以及突变型PRRSV病毒粒子掺入了在不同位点处包含不同聚糖部分的GP5分子的混合群体。证实了差异糖基化形式的GP5掺入wt PRRSV病毒粒子中的先前研究进一步巩固了我们的解释。根据掺入病毒粒子中的GP5的Endo H敏感性的模式，尝试推测N44位点可能包含Endo H抗性聚糖，尽管在这个位点处具有Endo H敏感性聚糖的某些GP5分子被掺入病毒粒子中。在GP5中的各个位点处的这种罕见的聚糖模式和各种形式的GP5掺入病毒粒子中与在受PRRSV感染的动物中所见的免疫应答模式是否具有关联仍有待研究。
在近期研究中，显示出，在Lelystad PRRSV的GP5中的2个N-联糖基化位点(N46和N53)中，N46残基的糖基化是病毒颗粒产生所强烈需要的。对于N46处的突变，感染性病毒得率减少约100倍。我们的结果暗示，在N44处的聚糖添加(对于北美PRRSV)对于回收感染性PRRSV是绝对必需的。那么可能的是，PRRSV的欧洲和北美分离株可能在它们关于对于产生感染性病毒来说N-联糖基化的需求方面有一定差异。在这点上，应当指出，Lelystad病毒只包含2个N-联糖基化位点，而在这项研究中我们所使用的北美分离株包含3个此类位点。
GP5是参与PRRSV中和抗体产生和保护性免疫的最重要的PRRSV糖蛋白。我们的结果揭示出，在GP5膜外结构域中残基34和51处聚糖的不存在，在产生存活的PRRSV突变体的同时，增强这些突变体对经由抗体的中和的敏感性以及附近的中和表位的免疫原性。在突变型PRRSV的GP5中聚糖的不存在的直接效应为病毒对经由恢复期血清的中和的敏感性增加，所述恢复期血清来自用wt PRRSV感染的猪(表3)。使用HIV-1和SIV的研究已显示，gp160的可变环中聚糖的获得或去除修饰它们对中和的敏感性。因此，已假定聚糖在病毒包膜糖蛋白的生物合成过程中起至少2种类型的必需作用。在一种情况下，聚糖的缺乏引起糖蛋白的缺陷，并因此引起在病毒毒株的总体存活力中的缺陷。我们假定，PRRSV GP5的N44处的聚糖发挥类似的作用。在第二种情况下，聚糖潜在地用于针对经由抗体的中和屏蔽病毒蛋白质。对于PRRSV GP5，N34和N51处的聚糖可能具有类似的作用。在HIV的情况下，“聚糖屏蔽”被假定是解释中和免疫应答逃避的主要机制，因此确保HIV的体内持续。这引起与PRRSV的某些平行比较。已知在个体动物中持续数月的被PRRSV的感染在病毒特异性中和免疫应答的诱导方面呈现罕见行为。充分确定，用PRRSV感染的动物通常需要比正常时间更长的时间以建立可检测的PRRSV中和抗体应答。建立后，这种PRRSV中和应答很弱，并且从动物到动物显著不同。中和抗体应答中的延迟已被假定是由于附近的免疫优势诱骗(decoy)表位(氨基酸位置27-30)的存在而引起的，其引发强烈的、早期的、非保护性的免疫应答，所述免疫应答掩盖和/或减缓了针对中和表位(氨基酸位置37-45)的应答(26，38)。尽管这是关于PRRSV中和抗体应答的非典型特征的似乎合理的解释，但它仍有待测试。在我们的实验室中，诱骗表位的删除已一致地证实对于回收感染性PRRSV是毁灭性的(Ansari等人，未公开的数据)，从而使得难以测试这种假设。
可能的是，通过对于HIV和SIV提出的“聚糖屏蔽”现象可以设想备选或补充机制以解释PRRSV中和应答的罕见性质。在我们的研究中使用缺乏1个或2个聚糖部分的突变型PRRSV第一次提供了在受wtPRRSV感染的动物血清中存在大量的PRRSV中和抗体的证据，所述中和抗体是以其他方式无法检测的，因为在SN测定法中使用wt PRRSV。由于中和表位被GP5上的聚糖部分封闭或屏蔽，PRRSV中和抗体尽管存在于宿主应答中，但不能与感染性PRRSV病毒粒子反应。
对于乳酸脱氢酶升高症病毒(LDV)已描述了关于动脉炎病毒中经由糖蛋白的糖基化的中和逃避的1个重要先例。由于其主要糖蛋白VP-3的重大聚糖屏蔽，LDV对抗体中和具有高度抗性，然而，由于VP-3的膜外结构域上2个糖基化位点的丧失，某些天然存在的LDV毒株对于中和是高度易感的。有趣的是，这种中和敏感性表型与宿主中的高度向神经性相关联，所述高度向神经性通过这些可容易中和的LDV毒株而获得。此类致神经病性增强可能反映了病毒糖蛋白与神经细胞中的受体的相互作用的促进，这可能是由于不存在聚糖屏蔽。在用于用PRRSV进行接种的年幼猪模型中，无法检测到任何突变型PRRSV和wtPRRSV之间的病原性差异，尽管我们将观察限制于温度和病毒血症测量。可能的是，在不同的实验条件下(即，在妊娠大母猪模型中)，可能观察到这些突变型PRRSV的病原性中的某些改变。天然存在的低糖基化的PRRSV毒株的发现是否是共同事件是未知的，尽管先前报道已暗示其存在。
在我们的实验中显著的观察结果是，当在体内感染猪时，在它们于感染晚期引起相当大的wt PRRSV中和应答的能力方面，GP5突变体可以胜过wt PRRSV(表4A)。在平行场景中，我们不仅观察到针对同源PRRSV突变体的更高的中和滴度，而且还观察到针对wt PRRSV的相当大的滴度(表4A)。此外，应答更早地发生，中和滴度在感染后14天时可检测，这个观察结果在使用wt PRRSV感染时通常不显著(表4B)。来自用PRRSV突变体感染的猪的血清对于wt PRRSV的中和增加暗示，聚糖掩蔽中和表位，所述中和表位在当聚糖存在时不诱导中和抗体。这种观察结果对于更佳的、更有效的PRRSV疫苗的设计具有重大意义，暗示新的、合理设计的疫苗应当携带在GP5的糖基化模式中的修饰，以便增强中和抗体的产生。此外，研究碳水化合物从免疫上突出的PRRSV糖蛋白中的这种去除对于增加的SN滴度可能具有的影响将是重要的，所述SN滴度不仅针对同源免疫毒株而且还针对不同的无关PRRSV毒株。
实施例2.在北美和欧洲PRRSV分离株中的N-联糖基化位点的鉴定
为了鉴定可以在本发明的方法中被失活和使用的相应于SEQ IDNO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的N-联糖基化位点，使所需北美PRRSV分离株(图5)或欧洲PRRSV分离株(图6)的GP5蛋白与SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白(北美毒株NVSL 97-7895)相比对。在这个实施例中，采用Jotun-Hein的比对方法(Hein，J.J.，Methods in Enzymology，第183卷：第626-645页，1990)使用来自DNASTAR，Inc.(Madison，WI，USA)的MegAlignTM程序来进行比对。多重序列比对参数是缺口罚分11和缺口长度罚分3。对于成对比较，使用2的Ktuple值。
在图5中，明显地看出，相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺51的N-联糖基化位点存在于所示的所有北美PRRSV分离株中，并且包含N-联糖基化位点“NGT”。这个N-联糖基化位点可以通过下述方法被失活：用编码其他氨基酸残基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密码子置换相应的多核苷酸序列中的天冬酰胺51。在这些情况下，低糖基化的北美PRRSV GP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列例如“QGT”、“AGT”或“XGT”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相应于天冬酰胺51的N-联糖基化位点被失活的北美PRRSV分离株的这些或其他低糖基化的变体也可以与其中其他N-联糖基化位点被失活的其他低糖基化的GP5变体相组合。
由图5还可明显地看出，准确地相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点仅存在于某些北美PRRSV分离株中。更特别地，北美PRRSV分离株IAF-BAJ(SEQ ID NO：3)、94-3182(SEQ ID NO：7)和94-287(SEQ ID NO：8)的GP5蛋白包含准确地相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点，并且包含N-联糖基化位点“NSS”。SEQ ID NO：3、7和8的这个N-联糖基化位点可以通过下述方法被失活：用编码其他氨基酸残基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密码子置换相应的多核苷酸序列中的天冬酰胺34。在这些情况下，低糖基化的北美PRRSV GP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列例如“QSS”、“ASS”或“XSS”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。
在缺乏准确地相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-联糖基化位点的其他北美PRRSV分离株中，也可以使位于残基30(图5SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、11、13中的“NAS”)和残基33(图5SEQ ID NO：3、8中的“NNS”；SEQ ID NO：6、10中的“NSS”，SEQ ID NO：11、13中的“NDS”)处的其他N-联糖基化位点失活。换言之，位于相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的残基30和33的氨基酸位置处的在其他北美分离株中的N-联糖基化位点也可以在本发明的方法中被失活和使用。
在图6中，明显地看出，相应于SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白的天冬酰胺51的N-联糖基化位点也存在于代表性的欧洲PRRSV分离株中，并且包含N-联糖基化位点“NGT”。这个N-联糖基化位点可以通过下述方法被失活：用编码其他氨基酸残基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密码子置换相应的多核苷酸序列中的天冬酰胺51。在这些情况下，低糖基化的欧洲PRRSV GP5蛋白变体中的相应氨基酸序列将包含序列例如“QGT”、“AGT”或“XGT”，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相应于天冬酰胺51的N-联糖基化位点被失活的欧洲PRRSV分离株的这些或其他低糖基化的变体也可以与其中其他N-联糖基化位点被失活的其他低糖基化的GP5变体相组合。
考虑到前文所述，将可看出完成和达到了本发明的几个优点。
选择并描述实施方案以便最佳地解释本发明的原理及其实践应用，由此使得本领域技术人员能够在各种实施方案中最佳地利用本发明，并且考虑适合于特定用途的各种修饰。
因为可在本文描述和举例说明的构建和方法中进行各种修饰而不背离本发明的范围，所以希望在前文说明书中包含的或在附图中显示的所有内容应当被解释为举例说明性的而不是限制性的。因此，本发明的宽度和范围不应受任何上文描述的示例性实施方案的限制，而是应当只根据所附的下述权利要求及其等价形式来限定。
本文公开了各种专利和非专利参考文献，每个所述参考文献明确地整体引入本文作为参考。
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Met Leu Gly Arg Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Lys Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 l10
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu
        195                 200
<210>2
<2111>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>2
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Ala Val Gly Leu Ile Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Val Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro
        195                 200
<210>3
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>3
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Asn Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Val Tyr
            100                  105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro
        195                 200
<210>4
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>4
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Val Gly Tyr Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Ser Thr Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Glu Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Val
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Val Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Gly Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>5
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>5
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Val Ala Leu Val Asn Ala Asn
            20                  25                  30
Thr Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Ala Ile Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Arg Gln Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Arg Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>6
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>6
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asp Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly Gln Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ile Thr Lys Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>7
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>7
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Pro Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Ala Arg Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Val Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro
        195                 200
<210>8
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>8
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Lys Gly Lys Val Glu Val Glu Gly Gln Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>9
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>9
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Ala Val Gly Leu Ile Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Ser Val Leu Ser Ser Val Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro
        195                 200
<210>10
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>10
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Trp Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Phe His His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>11
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>11
Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>12
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>12
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn
            20                  25                  30
Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Cys Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Ser Arg Pro
        195                 200
<210>13
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>13
Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Gly Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>14
<211>200
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒共有序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa可以为Ser，Asp，Asn或Thr
<220>
<221>misc_feature
<222>(58)..(58)
<223>Xaa可以为Lys，Asn，Glu，Asp，或Ala
<220>
<221>misc_feature
<222>(94)..(94)
<223>Xaa可以为Ile或Val
<220>
<221>misc_feature
<222>(164)..(164)
<223>Xaa可以为Gly，Arg，Lys，或Gln
<400>14
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1               5                   10                  15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Asn Xaa Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Xaa Lys Phe Asp Trp Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Xaa Thr Val
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala
        115                 120                 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145                 150                 155                 160
Ile Glu Lys Xaa Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
                165                 170                 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val
            180                 185                 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
        195                 200
<210>15
<211>201
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>15
Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys
1               5                   10                  15
Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala
            20                  25                  30
Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr
        35                  40                  45
Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Ser His Phe Gly Trp
    50                  55                  60
Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Ala Val Ser Thr Ala Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Cys Ser
            100                 105                 110
Val Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg
        115                 120                 125
Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr
    130                 135                 140
Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro
145                 150                 155                 160
Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val
                165                 170                 175
Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr
            180                 185                 190
Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala
        195                 200
<210>16
<211>15414
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>16
atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat tgtcaggagc tgcgaccatt    60
ggtacagccc aaaactagct gcacagaaaa cgcccttctg tgacagccct cttcagggga    120
gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ccggagttgc actgctttac ggtctctcca    180
accctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt    240
ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc    300
tgaatctcca agttcctgag cttggagtgc tgggcctatt ttacaggccc gaagagccac    360
tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgttgagtg ctcccccgcc ggggcctgct    420
ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa    480
gaatggtgcg ggtcgcagct gagatttaca gagccggcca gctcacccct gcagtcttga    540
aggctctaca agtttatgaa cggggttgcc gctggtaccc tatagtcgga cctgtccctg    600
gagtggccgt ttttgccaac tccctacatg tgagtgataa acctttcccg ggagcaactc    660
atgtgctaac caacctgcca ctcccgcaga ggcctaagcc tgaagacttt tgcccttttg    720
agtgtgctat ggctgacgtc tatgatattg gtcatggcgc cgtcatgtat gtggccaaag    780
ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaggcgaa atttgaaact gtccctaggg    840
agttgaagtt gatcgcgaac caactccaca tctccttccc gccccaccac gcagtggaca    900
tgtctaagtt tgtgttcata gcccctggga gtggtgtctc tatgcgggtc gagtgcccac    960
acggctgtct ccccgctaat actgtccctg aaggtaactg ctggtggcgc ttgtttgact    1020
cgctcccact ggacgttcag aacaaagaaa ttcgccgtgc caaccaattc ggctatcaaa    1080
ccaagcatgg tgtcgctggc aagtacctac aacggaggct gcaagctaat ggtctccgag    1140
cagtgactga tacagatgga cccattgtcg tacagtattt ctctgttagg gagagctgga    1200
tccgccactt cagactggcg gaagagccta gcctccctgg gtttgaagac ctcctcagaa    1260
taagggtaga gcccaatacg tcgccattga gtgacaaggg tggaaaaatc ttccggtttg    1320
gcagtcacaa atggtacggt gctggaaaga gagcaaggaa agcacgctct ggtatgacca    1380
ccacagtcgc tcaccgcgcc ttgcccgctc gtgaaatcca gcaagccaaa aagcacgagg    1440
atgccggcgc tgataaggct gtgcatctca ggcactattc tccgcctgcc gacgggaact    1500
gtggttggca ctgcatttcc gccatcgcca accgaatggt gaattccaaa tttgaaacta    1560
ctcttcccga gagggtgaga ccttcagatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaaca    1620
ccatccaaat tctcaagctc cctgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gttggcgcca    1680
aatacgtgct taagctggaa ggcgagcatt ggactgtctc tgtgaccctt gggatgtccc    1740
cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gctgttgtga gcataagagc ggacttggtc    1800
ccccagatgc ggtcgaagtt ttcggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg    1860
taatgcactt gcctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca    1920
actgtccggc ttccccggtc actactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca    1980
gaggaggaga gcaccctgat caggtgcgct taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg    2040
ttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg    2100
caaggattga tcagtacctc catggtgcaa caagtcttga agaatgcttg attaggcttg    2160
agagggtttg cccgccgagc gctgcggaca ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg    2220
gggttggggc ttcaactcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg    2280
ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca aagactcagt ccctctgacc gccttctcgc    2340
tgtccaattg ctactatcct gcacaaggtg acgaggttcg tcaccgtgag aggctaaact    2400
ccgtactctc taagctggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac    2460
ctggcccgcg acccgcacta ccgaacgggc tcgtcgaact taaagaccag atggaggagg    2520
atctgctgaa actagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc    2580
aggttgatct gaaagcttgg gtcaaaaact acccacggtg gacaccgcca ccccctccac    2640
caagagttca gcctcgaaaa acaaagtctg tcaagagctt gccagggaac aaacctgtcc    2700
ccgctccacg caggaaggtc agatctgatt gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg    2760
ttcctgacgg tcgggaagat ttgactgttg gtggccccct tgatctttcg acaccatccg    2820
agccgatgac acctctgagt gagcctgcac ttatgcccgc gttgcaatat atttctaggc    2880
cagtgacatc tttgagtgtg ctggccccag ttcctgcacc gcgtagaact gtgtcccgac    2940
cggtgacgcc cttgagtgag ccaatttttg tgtctgcacc gcgacacaaa tttcagcagg    3000
tggaagaagc gaatctggcg gcaacaacgc tgacgcacca ggacgaacct ctagatttgt    3060
ctgcatcctc acagactgaa tatgaggctt ctcccctaac accactgcag aacatgggta    3120
ttctggaggt gggggggcaa gaagctgagg aagttctgag tgaaatctcg gatacactga    3180
atgacatcaa ccctgcacct gtgtcatcaa gcagctccct gtcaagtgtt aagatcacac    3240
gcccaaaaca ctctgctcaa gccatcattg actcgggcgg gccctgcagt gggcatctcc    3300
gaagggaaaa agaagcatgc ctcagcatca tgcgtgaggc ttgtgatgcg gctaagctta    3360
gtgaccctgc cacgcaggaa tggctttctc gcatgtggga tagggttgac atgctgactt    3420
ggcgcaacac gtctgcttac caggcgttcc gcatcttaga tggtaggttt gagtttctcc    3480
caaagatgat actcgagaca ccgccgccct acccgtgtgg gtttgtgatg ctgcctcaca    3540
cgcctgcacc ttccgtgggt gcagagagtg accttaccat tggttcagtc gccactgaag    3600
atgttccacg catcctcggg aaaatagaaa acgccggcga gatgcccaac caggggctct    3660
tgacatcctt cggggaagaa ccggtgtgcg accaacctgt caaggactcc tggatgtcgt    3720
cgcgggggtt tgacgagagc acaacggctc cgtccgctgg tacaggtggt gctgacttac    3780
ccaccgattt gccaccttca gatggtttgg atgcggacga gtgggggccg ttacggacgg    3840
taagaaagaa agctgaaagg ctcttcgacc aattgagccg tcaggttttt aacctcgtct    3900
cccatctccc tgttttcttc tcacacctct tcaaatctga cagtggttat tctccgggtg    3960
attggggttt tgcagctttt actttatttt gcctcttttt gtgttacagc tacccattct    4020
ttggttttgt tcccctcttg ggtgtttttt ctgggtcttc tcggcgtgtg cgcatggggg    4080
tttttggctg ttggttggct tttgctgttg gcctgttcaa gcctgtgtcc gacccagtcg    4140
gcactgcttg tgagtttgac tcgccagagt gtaggaacgt ccttcattct tttgagcttc    4200
tcaaaccttg ggaccctgtt cgcagccttg ttgtgggccc cgtcggtctc ggccttgcca    4260
ttcttggcag gttactgggc ggggcacgct acatctggca ttttttgctt aggcttggca    4320
ttgttgcaga ttgtatcttg gctggagctt atgtgctttc tcaaggtagg tgtaaaaagt    4380
gctggggatc ttgtgtaaga actgctccta atgaaatcgc cttcaacgtg ttccctttta    4440
cgcgtgcgac caggtcgtca ctcatcgacc tgtgcgatcg gttttgtgcg ccaaaaggca    4500
tggaccccat tttcctcgct actgggtggc gcgggtgctg gaccggccga agtcccattg    4560
agcaaccctc tgaaaaaccc atcgcgttcg cccagttgga tgaaaagagg attacggcta    4620
gaactgtggt cgctcagcct tatgatccta accaagccgt aaagtgcttg cgggtgttac    4680
aggcgggtgg ggcgatagtg gccgaggcag tcccaaaagt ggtcaaggtt tccgctattc    4740
cattccgagc tccctttttt cccaccggag tgaaggttga tcctgagtgc aggatcgtgg    4800
tcgaccccga cacttttact acagctctcc ggtctggtta ctccaccaca aacctcgtcc    4860
ttggtgtggg ggactttgcc caactgaatg gattaaaaat caggcaaatt tccaagccct    4920
cgggaggagg cccgcacctc attgctgccc tgcatgttgc ttgctcgatg gcgttgcaca    4980
tgcttgctgg agtttatgta actgcagtgg ggtcttgcgg taccggcacc aacgatccgt    5040
ggtgcactaa cccattcgcc gtccctggct acggacctgg ctccctctgc acgtccagat    5100
tgtgcatctc ccaacatggc cttaccctgc ccttgacagc acttgtggca ggattcggtc    5160
ttcaggaaat tgccctagtc gttttgattt tcgtttccat cggaggcatg gctcataggt    5220
tgagttgtaa ggctgatatg ctgtgcgtct tacttgcaat cgccagctat gtttgggtac    5280
cccttacctg gttgctctgt gtgtttcctt gctggttgcg ctggttctct ttgcaccctc    5340
tcaccattct atggttggtg tttttcttga tgtctgtaaa tatgccttcg ggaatcttaa    5400
ccgtggtgtt attggttgct ctttggcttc taggccgtta tactaatgtt gttggtcttg    5460
ttacccccta tgatattcat cattacacca atggcccccg cggtgttgcc gccttggcta    5520
ccgcaccaga tgggacttac ttggccgctg tccgccgcgc tgcgttgact ggccgcaccg    5580
tgctgtttac cccgtctcag cttgggtccc ttcttgaggg cgctttcaga actcgaaagc    5640
cctcactgaa caccgtcaat gtggtcgggt cctccatggg ctctggcgga gtgttcacta    5700
tcgatgggaa aattaagtgc gtgactgccg cacatgtcct tacgggtaat tcagctaggg    5760
tttccggggt cggcttcaat caaatgcttg actttgatgt aaaaggggac ttcgccatag    5820
ctgattgccc gaattggcaa ggggctgctc ctaagaccca attctgcgag gatggatgga    5880
ctggccgcgc ctattggctg acatcctctg gcgtcgaacc cggtgtcatt gggaatggat    5940
tcgccttctg cttcaccgcg tgcggcgatt ccgggtcccc agtgatcacc gaagccggtg    6000
agcttgtcgg cgttcacaca ggatcaaaca aacaaggagg aggcattgtt acgcgcccct    6060
ctggccagtt ttgcaatgtg gcacccatca agctgagcga attaagtgag ttctttgctg    6120
gacctaaggt cccgctcggt gatgtgaagg ttggcagcca cataattaaa gacatatgcg    6180
aggtaccttc agatctttgc gccttgcttg ctgccaaacc cgaactggaa ggaggcctct    6240
ccaccgtcca acttctgtgt gtgtttttcc tcctgtggag aatgatggga catgcctgga    6300
cgcccttggt tgctgttggg ttttttatct tgaatgaggt tctcccagct gtactggtcc    6360
ggagtgtttt ctcctttgga atgtttgtgc tatcttggct cacaccatgg tctgcgcaag    6420
ttctgatgat caggcttcta acagcagctc ttaacaggaa cagattgtca ctcgcctttt    6480
acagccttgg tgcagcgacc ggttttgtcg cagatctggc ggcaactcaa gggcacccgt    6540
tgcaggcagt aatgaattta agtacctatg ccttcctgcc tcggataatg gtcgtgacct    6600
caccagtccc agtgattgcg tgtggtgttg tgcacctcct tgccataatt ttgtacttgt    6660
ttaagtaccg ctgcctgcac aatgtccttg ttggcgatgg tgcgttctct gcggctttct    6720
tcttgcgata ctttgccgag gggaaattga gggaaggggt gtcgcaatcc tgcgggatga    6780
atcatgagtc gctgactggt gccctcgcta tgagacttaa tgacgaggac ttggattttc    6840
ttacgaaatg gactgatttt aagtgttttg tttctgcatc caacatgagg aatgcggcgg    6900
gccagttcat cgaggctgcc tatgctaaag cacttagaat tgaacttgcc cagttggtgc    6960
aggttgataa ggttcgaggt actttggcca aacttgaagc ttttgctgat accgtggcac    7020
cccaactctc gcccggtgac attgttgttg ctcttggcca tacgcctgtt ggcggtatct    7080
tcgacctaaa ggttggtagc accaagcata ccctccaagc cattgagacc agagttcttg    7140
ccgggtccaa aatgaccgtg gcgcgtgtcg ttgatccaac ccccacaccc ccacccgcac    7200
ccgtgcctat cccccttcca ccgaaagttc tggagaatgg tcccaacgcc tggggggatg    7260
aggatcgttt gaataagaag aagaggcgca ggatggaagc cgtcggcatc tttgttatgg    7320
gtggaaagaa atatcagaaa ttttgggaca agaactccgg tgatgtgttt tatgaggagg    7380
tccatgataa cacagacgcg tgggagtgcc tcagagttga caaccctgcc gactttgacc    7440
ctgagaaggg aactctgtgc gggcatacta ccattgaaga taagacttac agtgtctacg    7500
cctccccatc tggcaagaaa ttcctggtcc ccgtctaccc agagagcaaa aaaaaccaat    7560
gggaagctgc gaagctttcc gtggaacagg cccttggcat gatgaatgtc gacggtgaac    7620
tgacagccaa agaagtggag aaactgaaaa gaataattga caaactccag ggcctgacta    7680
aggagcagtg tttaaactgc tagccgccag cggcttgacc cgctgtggtc gcggcggctt    7740
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gcttatagac gtcttaatct ccggcgctga tgcatctccc aagttactcg cccgccacgg    7980
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<210>17
<211>15451
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<400>17
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gcaaccctct gaaaaaccca tcgcgtttgc ccaattggat gaaaagaaga ttacggctag    4620
gactgtggtc gcccagcctt atgaccccaa ccaagccgta aagtgcttgc gggtattgca    4680
ggcgggtggg gcgatggtgg ctaaggcggt cccaaaagtg gtcaaggttt ccgctgttcc    4740
attccgagcc cccttctttc ccactggagt gaaagttgac cctgattgca gggtcgtggt    4800
tgaccctgac actttcactg cagctctccg gtctggctac tccaccacaa acctcgtcct    4860
tggtgtaggg gactttgccc agctgaatgg attaaaaatc aggcaaattt ccaagccttc    4920
agggggaggc ccacatctca tggctgccct gcatgttgcc tgctcgatgg ctctgcacat    4980
gcttgctggg atttatgtga ctgcggtggg ttcttgcggc accggcacca acgacccgtg    5040
gtgcgctaac ccgtttgccg tccctggcta cggacctggc tctctctgca cgtccagatt    5100
gtgcatttcc caacacggcc ttaccctgcc cttgacagca cttgtggcgg gattcggtat    5160
tcaagaaatt gccttggtcg ttttgatttt tgtttccatc ggaggcatgg ctcataggtt    5220
gagctgtaag gctgacatgc tgtgtgtttt gcttgcaatt gccagctatg tttgggtacc    5280
tcttacctgg ttgctttgtg tgtttccttg ctggttgcgc tgtttttctt tgcaccccct    5340
caccatccta tggttggtgt ttttcttgat ttctgtgaat atgccttcag gaatcttggc    5400
catggtgttg ttggtttctc tttggcttct tggtcgttat actaatgttg ctggccttgt    5460
caccccctac gacattcatc attacaccag tggcccccgc ggtgttgccg ccttggctat    5520
cgcaccagat gggacctact tggccgctgt ccgccgcgct gcgttgactg gccgcaccat    5580
gctgtttacc ccgtcccagc ttgggtctct acttgagggt gctttcagaa ctcgaaagcc    5640
ctcactgaac accgtcaatg tgatcgggtc ctccatgggc tctggcgggg tgtttaccat    5700
cgacgggaaa gtcaagtgcg taactgccgc acatgtcctt acgggcaatt cagctcgggt    5760
ttccggggtc ggcttcaatc aaatgcttga ctttgacgta aagggagatt tcgctatagc    5820
tgattgcccg aattggcaag gggctgcccc caagacccaa ttctgcacgg atggatggac    5880
tggccgtgcc tattggctaa catcctctgg cgtcgaaccc ggcgtcattg gaaaaggatt    5940
cgccttctgc ttcaccgcat gtggcgattc cgggtcccca gtgatcaccg aggccggtga    6000
gcttgtcggc gttcacacgg gatcgaataa acaagggggg ggcattgtta cgcgcccctc    6060
aggccagttt tgtaatgtgg cacccatcaa gctaagcgaa ttaagtgaat tctttgctgg    6120
gcctaaggtc ccgctcggtg atgtgaaggt cggcagccac ataattaaag acataagcga    6180
ggtgccttca gatctttgtg ccttgcttgc tgccaaacct gaactggaag gaggcctctc    6240
caccgtccaa cttctttgtg tgttttttct cctgtggaga atgatgggac atgcctggac    6300
gcccttggtt gctgtgagtt tctttatttt gaatgaggtt ctcccagccg tcctggtccg    6360
gagtgttttc tcctttggaa tgtttgtgct atcctggctc acgccatggt ctgcgcaagt    6420
tctgatgatc aggcttctga cagcagctct taacaggaac agatggtcac ttgccttttt    6480
cagcctcggt gcagtgaccg gttttgtcgc agatcttgcg gccactcagg ggcatccgtt    6540
gcaggcagtg atgaatttga gcacctatgc attcctgcct cggatgatgg ttgtgacctc    6600
accagtccca gtgatcacgt gtggtgtcgt gcacctactt gccatcattt tgtacttgtt    6660
taagtaccgt ggcccgcacc atatccttgt tggcgatgga gtgttctctg cggctttctt    6720
cttgagatac tttgccgagg gaaagttgag ggaaggggtg tcgcaatcct gcggaatgaa    6780
tcatgagtct ctgactggtg ccctcgctat gagactcaat gacgaggact tggatttcct    6840
tatgaaatgg actaatttta agtgctttgt ttctgcgtcc aacatgagga atgcagcggg    6900
tcaatttatc gaggctgcct atgctaaagc acttagagta gaactggccc agttggtgca    6960
ggttgacaaa gttcgaggta ctttggccaa acttgaagct tttgctgata ccgtggcacc    7020
tcaactctcg cccggtgaca ttgttgtcgc tctcggccac acgcctgttg gcagtatctt    7080
cgacctaaag gttggtagca ccaagcatac cctccaagcc attgagacca gagtccttgc    7140
tgggtccaaa atgaccgtgg cgcgcgtcgt cgacccgacc cccacgcccc cacccgcacc    7200
cgtgcccatc cccctcccac cgaaagttct ggagaatggc cccaacgctt ggggggatga    7260
ggaccgtttg aataagaaga agaggcgcag gatggaagcc ctcggcatct atgttatggg    7320
cgggaaaaag taccagaaat tttgggacaa gaattccggt gatgtgtttt atgaggaggt    7380
ccataataac acagatgagt gggagtgtct cagagttggc gaccctgccg actttgaccc    7440
tgagaaggga actctgtgtg gacatgtcac cattgaaaac aaggcttacc atgtttacac    7500
ctccccatct ggtaagaagt tcttggtccc cgtcaaccca gagaatggaa gagtccaatg    7560
ggaagctgca aagctttccg tggagcaggc cctaggtatg atgaatgtcg acggcgaact    7620
gactgccaaa gaactggaga aactgaaaag aataattgac aaactccagg gcctgactaa    7680
ggagcagtgt ttaaactgct agccgccagc gacttgaccc gctgtggtcg cggcggcttg    7740
gttgttactg aaacagcggt aaaaatagtc aaatttcaca accggacctt caccctggga    7800
cctgtgaatt taaaagtggc cagtgaggtt gagctaaaag acgcggttga gcacaaccaa    7860
cacccggttg cgagaccgat cgatggtgga gttgtgctcc tgcgttccgc ggttccttcg    7920
cttatagacg tcttgatctc cggtgctgat gcatctccca agttacttgc ccatcacggg    7980
ccgggaaaca ctgggatcga tggcacgctc tgggattttg agtccgaagc cactaaagag    8040
gaagtcgcac tcagtgcgca aataatacag gcttgtgaca ttaggcgcgg cgacgctcct    8100
gaaattggtc tcccttacaa gctgtaccct gttaggggta accctgagcg ggtgaaagga    8160
gttctgcaga atacaaggtt tggagacata ccttacaaaa cccccagtga cactggaagc    8220
ccagtgcacg cggctgcctg ccttacgccc aacgccactc cggtgactga tgggcgctcc    8280
gtcttggcca cgaccatgcc ccccgggttt gagttatatg taccgaccat accagcgtct    8340
gtccttgatt accttgactc taggcctgac tgccctaaac agctgacaga gcacggctgc    8400
gaagatgccg cactgaaaga cctctctaaa tatgacttgt ccacccaagg ctttgtttta    8460
cctggagttc ttcgccttgt gcggaaatac ctgtttgccc atgtaggtaa gtgcccaccc    8520
gttcatcggc cttctactta ccctgctaag aattctatgg ctggaataaa tgggaacagg    8580
ttcccaacca aggacattca gagcgtccct gaaatcgacg ttctgtgcgc acaggctgtg    8640
cgagaaaact ggcaaactgt caccccttgt actcttaaga aacagtattg cgggaagaag    8700
aagactagga ccatactcgg caccaataac ttcatcgcac tagcccaccg agcagtgttg    8760
agtggtgtta cccagggctt catgaaaaag gcgtttaact cgcccatcgc cctcggaaag    8820
aacaagttta aggagctaca gactccggtc ctgggcaggt gccttgaagc tgatctcgca    8880
tcctgcgatc gatccacgcc tgcaattgtc cgctggtttg ccgccaacct tctttatgaa    8940
cttgcctgtg ctgaagagca tctaccgtcg tacgtgctga actgctgcca cgacttactg    9000
gtcacgcagt ccggcgcagt gactaagaga ggtggcctgt cgtctggcga cccgatcacc    9060
tctgtgtcta acaccattta tagtttggtg atctatgcac agcatatggt gcttagttac    9120
ttcaaaagtg gtcaccccca tggccttctg ttcttacaag accagctaaa gtttgaggac    9180
atgctcaagg ttcaacccct gatcgtctat tcggacgacc tcgtgctgta tgccgagtct    9240
cccaccatgc caaactatca ctggtgggtt gaacatctga atttgatgct ggggtttcag    9300
acggacccaa agaagacagc aataacagac tcgccatcat ttctaggctg tagaataata    9360
aatgggcgcc agctagtccc caaccgtgac aggatcctcg cggccctcgc ctatcacatg    9420
aaggcgagta atgtttctga atactatgcc tcagcggctg caatactcat ggacagctgt    9480
gcttgtttgg agtatgatcc tgaatggttt gaagaacttg tagttggaat agcgcagtgc    9540
gcccgcaagg acggctacag ctttcccggc acgccgttct tcatgtccat gtgggaaaaa    9600
ctcaggtcca attatgaggg gaagaagtcg agagtgtgcg ggtactgcgg ggccccggcc    9660
ccgtacgcta ctgcctgtgg cctcgacgtc tgcatttacc acacccactt ccaccagcat    9720
tgtccagtca caatctggtg tggccatcca gcgggttctg gttcttgtag tgagtgcaaa    9780
tcccctgtag ggaaaggcac aagcccttta gacgaggtgc tggaacaagt cccgtataag    9840
cccccacgga ccgttatcat gcatgtggag cagggtctca ccccccttga tccaggtaga    9900
taccaaactc gccgcggatt agtctctgtc aggcgtggaa ttaggggaaa tgaagttgaa    9960
ctaccagacg gtgattatgc tagcaccgcc ttgctcccta cctgcaaaga gatcaacatg    10020
gtcgctgtcg cttccaatgt attgcgcagc aggttcatca tcggcccacc cggtgctggg    10080
aaaacatact ggctccttca acaggtccag gatggtgatg ttatttacac accaactcac    10140
cagaccatgc ttgacatgat tagggctttg gggacgtgcc ggttcaacgt cccggcaggc    10200
acaacgctgc aattccccgt cccctcccgc accggtccgt gggttcgcat cctagccggc    10260
ggttggtgtc ctggcaagaa ttccttccta gatgaagcag cgtattgcaa tcaccttgat    10320
gttttgaggc ttcttagtaa aactaccctc acctgtctag gagacttcaa gcaactccac    10380
ccagtgggtt ttgattctca ttgctatgtt tttgacatca tgcctcaaac tcaactgaag    10440
accatctgga ggtttggaca gaatatctgt gatgccattc agccagatta cagggacaaa    10500
ctcatgtcca tggtcaacac aacccgtgtg acctacgtgg aaaaacctgt caggtatggg    10560
caggtcctca ccccctacca cagggaccga gaggacgacg ccatcactat tgactccagt    10620
caaggcgcca cattcgatgt ggtcacattg catttgccca ctaaagattc actcaacagg    10680
caaagagccc ttgttgccat caccagggca agacacgcta tctttgtgta tgacccacac    10740
aggcagctgc agggcttgtt tgatcttcct gcaaaaggca cacccgtcaa cctcgcagtg    10800
caccgcgacg ggcagctgat cgtgctggat agaaataaca aagaatgcac ggttgctcag    10860
gctctaggca acggggataa atttagggcc acagacaagc gtgttgtaga ttctctccgc    10920
gccatttgtg ctgatctaga agggtcgagc tctccgctcc ccaaggtcgc acacaacttg    10980
ggattttatt tctcacctga tttaacacag tttgctaaac tcccagtaga acttgcacct    11040
cactggcccg tggtgacaac ccagaacaat gaaaagtggc cagatcggct ggttgccagc    11100
cttcgcccta tccataaata cagccgcgcg tgcatcggtg ccggctatat ggtgggccct    11160
tcggtgtttc taggcactcc tggggtcgtg tcatactatc tcacaaaatt tgttaagggc    11220
gaggctcaag tgcttccgga gacggttttc agcaccggcc gaattgaggt agactgccgg    11280
gaatatcttg atgatcggga gcgagaagtt gctgcgtccc tcccacacgc tttcattggc    11340
gacgtcaaag gcactaccgt tggaggatgt catcatgtca cctccagata cctcccgcgc    11400
gtccttccca aggaatcagt tgcggtagtc ggggtttcaa gccccggaaa agccgcgaaa    11460
gcattgtgca cactgacaga tgtgtacctc ccagatcttg aagcctatct ccacccggag    11520
acccagtcca agtgctggaa aatgatgttg gacttcaaag aagttcgact aatggtctgg    11580
aaagacaaaa cagcctattt ccaacttgaa ggtcgctatt tcacctggta tcagcttgcc    11640
agctatgcct cgtacatccg tgttcctgtc aactctacgg tgtacttgga cccctgcatg    11700
ggccccgccc tttgcaacag gagagtcgtc gggtccaccc actggggggc tgacctcgcg    11760
gtcacccctt atgattacgg cgctaaaatt atcctgtcta gcgcgtacca tggtgaaatg    11820
ccccccggat acaaaattct ggcgtgcgcg gagttctcgt tggatgaccc agttaagtac    11880
aaacatacct gggggtttga atcggataca gcgtatctgt atgagttcac cggaaacggt    11940
gaggactggg aggattacaa tgatgcgttt cgtgcgcgcc aggaagggaa aatttataag    12000
gccactgcca ccagcttgaa gttttatttt cccccgggcc ctgtcattga accaacttta    12060
ggcctgaatt gaaatgaaat ggggtccatg caaagccttt ttgacaaaat tggccaactt    12120
tttgtggatg ctttcacgga gttcttggtg tccattgttg atatcattat atttttggcc    12180
attttgtttg gcttcaccat cgccggttgg ctggtggtct tttgcatcag attggtttgc    12240
tccgcgatac tccgtacgcg ccctgccatt cactctgagc aattacagaa gatcttatga    12300
ggcctttctt tcccagtgcc aagtggacat tcccacctgg ggaactaaac atcctttggg    12360
gatgctttgg caccataagg tgtcaaccct gattgatgaa atggtgtcgc gtcgaatgta    12420
ccgcatcatg gaaaaagcag ggcaggctgc ctggaaacag gtggtgagcg aggctacgct    12480
gtctcgcatt agtagtttgg atgtggtggc tcattttcag catctagccg ccattgaagc    12540
cgagacctgt aaatatttgg cctcccggct gcccatgcta cacaacctgc gcatgacagg    12600
gtcaaatgta accatagtgt ataatagcac tttgaatcag gtgtttgcta tttttccaac    12660
ccctggttcc cggccaaagc ttcatgattt tcagcaatgg ttaatagctg tacattcctc    12720
catattttcc tctgttgcag cttcttgtac tctttttgtt gtgctgtggt tgcgggttcc    12780
aatactacgt actgtttttg gtttccgctg gttaggggca atttttcttt cgaactcaca    12840
gtgaattaca cggtgtgtcc accttgcctc acccggcaag cagccacaga gatctacgaa    12900
cccggtaggt ctctttggtg caggataggg tatgaccgat gtggggagga cgatcatgac    12960
gagctagggt ttatgatacc gcctggcctc tccagcgaag gccacttgac tagtgtttac    13020
gcctggttgg cgttcttgtc cttcagctac acggcccagt tccatcccga gatattcggg    13080
atagggaatg tgagtcgagt ttatgttgac atcaaacatc aactcatctg cgccgaacat    13140
gacgggcaga acaccacctt gcctcgtcat gacaacattt cagccgtgtt tcagacctat    13200
taccaacatc aagtcgacgg cggcaattgg tttcacctag aatggcttcg tcccttcttt    13260
tcctcgtggt tggttttaaa tgtctcttgg tttctcaggc gttcgcctgc aaaccatgtt    13320
tcagttcgag tcttgcagat attaagacca acaccaccgc agcggcaagc tttgctgtcc    13380
tccaagacat cagttgcctt aggcatcgcg actcggcctc tgaggcgatt cgcaaaatcc    13440
ctcagtgccg tacggcgata gggacacccg tgtatgttac catcacagcc aatgtgacag    13500
atgagaatta tttacattct tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt    13560
ctgagatgag tgaaaaggga tttaaggtgg tatttggcaa tgtgtcaggc atcgtggctg    13620
tgtgtgtcaa ttttaccagc tacgtccaac atgtcaagga gtttacccaa cgctccctgg    13680
tggtcgacca tgtgcggttg ctccatttca tgacacctga gaccatgagg tgggcaactg    13740
ttttagcctg tctttttgcc attctgttgg caatttgaat gtttaagcat gttggagaaa    13800
tgcttgaccg cgggctgttg ctcgcgattg ctttctttgt ggtgtatcgt gccgttctgt    13860
tttgctgtgc tcgccaacgc cagcaacgac agcagctccc atctacagct gatttacaac    13920
ttgacgctat gtgagctgaa tggcacagat tggctagcta acaaatttga ttgggcagtg    13980
gagagttttg tcatctttcc cgttttgact cacattgtct cctatggtgc cctcactacc    14040
agccatttcc ttgacacagt cgctttagtc actgtgtcta ccgccgggtt tgttcacggg    14100
cggtatgtcc taagtagcat ctacgcggtc tgtgccctgg ctgcgttgac ttgcttcgtc    14160
attaggtttg caaagaattg catgtcctgg cgctacgcgt gtaccagata taccaacttt    14220
cttctggaca ctaagggcag actctatcgt tggcggtcgc ctgtcatcat agagaaaagg    14280
ggcaaagttg aggtcgaagg tcatctgatc gacctcaaaa gagttgtgct tgatggttcc    14340
gtggcaaccc ctataaccag agtttcagcg gaacaatggg gtcgtcctta gatgacttct    14400
gtcatgatag cacggctcca caaaaggtgc ttttggcgtt ttctattacc tacacgccag    14460
tgatgatata tgccctaaag gtgagtcgcg gccgactgct agggcttctg caccttttga    14520
tcttcctgaa ttgtgctttc accttcgggt acatgacttt cgcgcacttt cagagtacaa    14580
ataaggtcgc gctcactatg ggagcagtag ttgcactcct ttggggggtg tactcagcca    14640
tagaaacctg gaaattcatc acctccagat gccgtttgtg cttgctaggc cgcaagtaca    14700
ttctggcccc tgcccaccac gttgaaagtg ccgcaggctt tcatccgatt gcggcaaatg  14760
ataaccacgc atttgtcgtc cggcgtcccg gctccactac ggtcaacggc acattggtgc  14820
ccgggttaaa aagcctcgtg ttgggtggca gaaaagctgt taaacaggga gtggtaaacc  14880
ttgtcaaata tgccaaataa caacggcaag cagcagaaga gaaagaaggg ggatggccag  14940
ccagtcaatc agctgtgcca gatgctgggt aagatcatcg ctcagcaaaa ccagtccaga  15000
ggcaagggac cgggaaagaa aaataagaag aaaaacccgg agaagcccca ttttcctcta  15060
gcgactgaag atgatgtcag acatcacttt acccctagtg agcggcaatt gtgtctgtcg  15120
tcaatccaga ccgcctttaa tcaaggcgct gggacttgca ccctgtcaga ttcagggagg  15180
ataagttaca ctgtggagtt tagtttgcct acgcatcata ctgtgcgcct gatccgcgtc  15240
acagcatcac cctcagcatg atgggctggc attcttgagg catctcagtg tttgaattgg  15300
aagaatgtgt ggttaacggc actgattgac attgtgcctc taagtcacct attcaattag  15360
ggcgaccgtg tgggggtgag atttaattgg cgagaaccat gcggccgaaa ttaaaaaaaa  15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                                 15451
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<400>18
gccaacagcg ccagcagctc tc                                           22
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>合成的
<400>19
gttgatttac gccttgacgc tatg                                         24
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>合成的
<400>20
gtgagctggc tggcacagat tg                                                        22
<210>21
<211>53
<212>DNA
<213>合成的
<400>21
gccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttacg ccttgacgct atg                      53
<210>22
<211>45
<212>DNA
<213>合成的
<400>22
gttgatttac gccttgacgc tatgtgagct ggctggcaca gattg                               45
<210>23
<211>74
<212>DNA
<213>合成的
<400>23
gccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttaca acttgacgct atgtgagctg               60
gctggcacag attg                                                                 74
<210>24
<211>74
<212>DNA
<213>合成的
<400>24
gccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttacg ccttgacgct atgtgagctg               60
gctggcacag attg                                                                 74
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>合成的
<400>25
ctaccaacat caggtcgatg gcgg                                                      24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>合成的
<400>26
gtcggccgcg acttaccttt agag                                                      24

Claims (66)

1.在猪中引发针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫应答的方法，其包括施用包含编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的多核苷酸的组合物，从而引发所述猪针对PRRSV抗原的改善的免疫应答，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
2.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括感染性PRRSV RNA分子。
3.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括编码感染性PRRSV RNA分子的DNA分子。
4.权利要求2或权利要求3的方法，其中所述感染性PRRSV RNA分子是北美PRRSV衍生物或欧洲PRRSV衍生物。
5.权利要求2的方法，其中所述感染性PRRSV RNA分子是编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体蛋白的北美PRRSV衍生物，在所述变体蛋白中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
6.权利要求5的方法，其中相应于在SEQ ID NO：1中的天冬酰胺51的N-联糖基化位点被失活。
7.权利要求5的方法，其中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。
8.权利要求7的方法，其中2个所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密码子而被失活。
9.权利要求8的方法，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
10.权利要求9的方法，其中所述密码子编码丙氨酸残基。
11.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括DNA分子，在所述DNA分子中将在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码低糖基化的GP5蛋白的所述多核苷酸有效地连接。
12.权利要求11的方法，其中所述启动子是CMV启动子。
13.权利要求1的方法，其中所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺51的密码子而被失活。
14.权利要求13的方法，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
15.权利要求1的方法，其中相应于天冬酰胺34的所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34的密码子而被失活。
16.权利要求15的方法，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
17.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸编码低糖基化的PRRSVGP5多肽变体蛋白，在所述变体蛋白中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。
18.权利要求17的方法，其中2个所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密码子而被失活。
19.权利要求18的方法，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
20.权利要求17的方法，其中所述N-联糖基化位点之一通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一个密码子而被失活。
21.权利要求1的方法，其中所述组合物通过皮下注射、静脉内注射、皮内注射、肠胃外注射、肌内注射、无针注射、电穿孔、口服递送、鼻内递送、口鼻递送、或其任何组合来施用。
22.权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包含治疗上可接受的承载体。
23.权利要求22的方法，其中所述承载体选自蛋白质、缓冲液、表面活性剂和聚乙二醇聚合物，或其任何组合。
24.权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包含佐剂。
25.权利要求24的方法，其中所述佐剂选自氢氧化铝、Quil A、氧化铝凝胶悬浮液、矿物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副产物、分枝杆菌和CpG寡脱氧核苷酸，或其任何组合。
26.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括选自痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体的病毒载体。
27.权利要求1的方法，其中所述猪的针对PRRSV抗原的所述改善的免疫应答包括由所述猪产生的PRRSV中和抗体增加。
28.权利要求1的方法，其中所述猪是大母猪、小母猪、公猪或小猪。
29.权利要求1的方法，其中编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸通过直接合成、诱变北美PRRSV分离株GP5核苷酸序列或诱变北美PRRSV共有GP5核苷酸序列来获得。
30.权利要求29的方法，其中所述北美PRRSV分离株GP5核苷酸序列编码选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13的肽。
31.权利要求29的方法，其中所述共有北美PRRSV GP5核苷酸序列编码与SEQ ID NO：14至少85％同一的共有GP5蛋白。
32.权利要求1的方法，其中编码低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸通过直接合成、诱变欧洲PRRSV分离株GP5核苷酸序列或诱变共有欧洲PRRSV GP5核苷酸序列来获得。
33.权利要求32的方法，其中所述欧洲PRRSV分离株GP5核苷酸序列编码与SEQ ID NO：15至少85％同一的GP5蛋白。
34.权利要求33的方法，其中所述欧洲PRRSV GP5核苷酸序列是SEQ ID NO：15。
35.在猪中引发针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫应答的方法，其包括给所述猪施用包含低糖基化的PRRSV GP5多肽变体的组合物，从而引发所述猪针对PRRSV抗原的改善的免疫应答，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
36.组合物，其包含编码低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的多核苷酸和治疗上可接受的承载体，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
37.权利要求36的组合物，其中所述多核苷酸包括感染性北美PRRSV RNA分子。
38.权利要求36的组合物，其中所述多核苷酸包括编码感染性北美PRRSV RNA分子的DNA分子。
39.权利要求36的组合物，其中所述多核苷酸包括DNA分子，在所述DNA分子中将在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码所述低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸有效地连接。
40.权利要求39的组合物，其中所述启动子是CMV启动子。
41.权利要求36的组合物，其中所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺51的密码子而被失活。
42.权利要求41的组合物，其中所述编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
43.权利要求36的组合物，其中所述多核苷酸编码低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体蛋白，在所述变体蛋白中相应于在SEQ ID NO：1的北美参考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个所述N-联糖基化位点均被失活。
44.权利要求43的组合物，其中2个所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密码子而被失活。
45.权利要求44的组合物，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
46.权利要求43的组合物，其中所述N-联糖基化位点之一通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一个密码子而被失活。
47.权利要求36的组合物，其中所述治疗上可接受的承载体选自蛋白质、缓冲液、表面活性剂和聚乙二醇聚合物，或其任何组合。
48.权利要求34的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种佐剂。
49.权利要求48的组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、Quil A、氧化铝凝胶悬浮液、矿物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副产物、分枝杆菌和CpG寡脱氧核苷酸，或其任何组合。
50.权利要求48的组合物，其中所述组合物进一步包含选自白介素1(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、γ干扰素(g-IFN)、细胞坏死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激复合物(ISCOM)和脂质体的第二种佐剂。
51.权利要求36的组合物，其中所述多核苷酸包括选自痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体的病毒载体。
52.组合物，其包含低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体和治疗上可接受的承载体，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5共有蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
53.分离的多核苷酸，其编码低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体，在所述变体中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
54.权利要求53的分离的多核苷酸，其中相应于在SEQ ID NO：1中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2个N-联糖基化位点均被失活。
55.权利要求53的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括感染性北美PRRSV RNA分子。
56.权利要求53的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码感染性北美PRRSV RNA分子的DNA分子。
57.权利要求53的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括DNA分子，在所述DNA分子中将在哺乳动物细胞中具有活性的启动子与编码所述低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体的所述多核苷酸有效地连接。
58.权利要求57的分离的多核苷酸，其中所述启动子是CMV启动子。
59.权利要求53的分离的多核苷酸，其中相应于天冬酰胺51的所述N-联糖基化位点通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺51的密码子而被失活。
60.权利要求59的分离的多核苷酸，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
61.权利要求53的分离的多核苷酸，其中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺34的N-联糖基化位点被失活。
62.权利要求61的分离的多核苷酸，其中通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34的密码子来失活。
63.权利要求61的分离的多核苷酸，其中所述编码另一种氨基酸的密码子编码丙氨酸或谷氨酰胺残基。
64.权利要求61的分离的多核苷酸，其中所述N-联糖基化位点之一通过用编码除天冬酰胺外的氨基酸的密码子替换编码所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一个密码子而被失活。
65.权利要求53的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括选自痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体和TGEV载体的病毒载体。
66.分离的多肽，其是低糖基化的北美PRRSV GP5多肽变体，其中相应于在SEQ ID NO：1的参考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一个N-联糖基化位点被失活。
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