CN102559611B

CN102559611B - 一种无筛选标记的双表达重组mva病毒及其构建方法

Info

Publication number: CN102559611B
Application number: CN201110404845.3A
Authority: CN
Inventors: 陈瑾; 郑其升; 侯继波; 侯红岩
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Agricultural Science and Technology Transfer Center Co.,Ltd.
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2031-12-08
Also published as: CN102559611A

Abstract

本发明提供了一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法，本发明的双表达重组MVA病毒以MVA病毒为载体，载体上包括两个单独表达的抗原基因GP5基因（核苷酸序列为SEQ ID NO.1）和M基因（核苷酸序列为SEQ ID NO.2），其中GP5基因的N33、N34、N51位上的氨基酸N突变为氨基酸A。本发明的重组MVA病毒，无筛选标记基因存在，提高疫苗的安全性，适用于在单基因表达效果有限的疫病的预防和治疗，克服常规苗和单基因表达的基因工程疫苗的缺点，更加有利于重组病毒向安全、有效地新型疫苗发展。本发明具有编码表达优化的GP5和M抗原基因的重组MVA病毒非常适用于制备新型的PRRS疫苗。

Description

一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒，属于基因工程技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS病毒引起的猪的一种传染病。该病的主要特征是引起妊娠母猪的早产、流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔猪，仔猪主要表现为咳嗽、呼吸困难、呼吸急促。鉴于最近几年的高致病性猪蓝耳病的广泛快速流行，所以必须加大对其疫苗研制的力度，从根本上控制疾病的流行和发生。经典的PRRS疫苗对高致病性猪蓝耳病只能起到部分保护作用，针对高致病性猪蓝耳病的弱毒和灭活疫苗都已经开始应用，但也存在一定的缺点和不足，所以在研究有效的常规疫苗的同时，也应加大对基因工程疫苗的研制，来丰富PRRSV的防治手段。

GP5（E蛋白）具有中和表位，为病毒的主要免疫保护型抗原；GP5的生物学功能非常重要，主要在病毒感染、细胞结合及病毒吸附中起作用，也是淋巴细胞增生性应答的靶点。虽然GP5在PRRSV感染的细胞内表达水平较低，但却是病毒主要的免疫原性蛋白。在不同毒株间GP5基因是各结构蛋白中变异最大的(KaPur V, Elam MR.,Pawlovich TM,et al.,1996.Genetic variation in procine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern Uniteg States. J Gen Virol.,77, 1271~1276; Anderyev VG, Wesley RD,Mengeling WL,et al.,1997. Genetic variation and phylogenic relationships of Porcinere Porduetive and Piratoyrdisease syndrome (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame 5.ArehVirol.142，993~1001; Pirzadeh B,Dea S. 1997.Monoclonal antibodies to the ORF5 product of porcine reproductive and respiratory syndrom virus define linear neutralizing determinants. J Gen Virol. 78,1867~1873; Rowland R R, Stenffern M, Ackerman T, et al.,1999b. The evolution of procine reproductive and respiratory syndrom virus: quasispecise and emergence of a virus subpopulation during infection of pigs with VR-2332. Virology.259(2),262~266.)，在同一基因型毒株间GP5氨基酸的同源性在88%~99%之间，而欧美毒株间氨基酸同源性仅为52~55%(Dea S,Gagnon CA, Mardassi H,et al.,2000a.Current knowledge on the structural proteins of procine reproductive and respiratory sydrome (PRRS) virus:comparison of the North American and European isolates.Arch.Virol. 145,659~688.)。ORF5是目前认为构建PRRS重组病毒弱毒活疫苗和DNA疫苗的最佳候选基因，这是对GP5所诱导抗体达到保护效应的表面认识，如用ORF5全基因来构建新一代PRRSV疫苗，也许ADE现象不可避免； GP5暴露在囊膜表面的N端鉴定了2个抗原表位，即表位A和表位B（Rodriguez M J, Sarraseca J, Fominaya E, et al. Identification of an immunodominant epitope in the C terminus of glycoprotein 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Gen Virol, 2001; 82: 995-999）。研究发现PRRSV北美洲型分离株的一个主要的中和表位位于GP5外区中部37~45aa(Ostrowski M, Galeota J A, Jar A M, et al. Identification of neutralizing and non-neutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain. J Virol, 2002; 76: 4241~4250.)，即B表位，并且这个表位与在同一个区域LDV的中和表位(Plagemann PGW.2001.Complexity of the single linear neutralization epitope of the mouse arterivirus lactate dehydrogenaseelevating virus.Virology.290，11~20.)有着相当高的氨基酸同源性。PRRSV的抗体依赖增强作用(ADE )与GP5蛋白有关，也许是因为GP5的表位A诱导的增强性抗体参与了这一过程，PRRSV抗体这把所谓的“双刃剑”可能就是GP5上的A表位和B表位各占一面，只不过两个表位在不同时间发挥各自的作用，从而在抗体效应上表现出两面性，即抗体的ADE与表位A有关，抗体的中和效应与表位B有关（Davey M. Smith, Matthew C. Strain, Simon D.W. Frost, et al. Lack of neutralizing antibody response to HIV-1 predisposes to superinfection. Virology, 2006; 355: 1~5）。如能将表位A缺失或改造，可能会有更好的免疫效果( G.W. Plagemann, R. R. R. Rowland, K. S. Faaberg. The primary neutralization epitope of porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain VR-2332 is located in the middle of the GP5 ectodomain. Arch Virol, 2002; 147: 2327~2347。可见，对构建新一代PRRSV疫苗来说，A表位的存在是有害无益，所以， GP5的B表位是构建有效PRRSV疫苗的表位之一(Sol M. Cancel-Tirado, Richard B. Evans, Kyoung-Jin Yoon. Monoclonal antibody analysis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus epitopes associated with antibody-dependent enhancement and neutralization of virus infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2004; 102: 249–262)。欧洲型和北美型分离株在GP5分别含2和3个潜在的N-糖基化位点，己证实北美型分离株三个潜在的糖基化位点(N34、N44、N5l)均被寡聚糖残基所占，对GP5的三个糖基化位点进行突变，发现N44对病毒的感染性是必要的，N34、N51、N34N51突变体的滴度比野毒的滴度低，在Marc-145细胞上的病变减轻，对中和抗体敏感性增强，同时突变病毒产生的中和抗体滴度明显升高，表明去掉GP5胞外区糖基化位点增强了病毒对中和抗体的敏感性同时提高了附近中和表位的免疫原性 (Ansari I.H., Kwon B.J., Osorio F.A., Pattnaik A.K. Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies. J. Virol. 2006. 3994~4004.)。病毒糖基化的和非糖基化的GP5蛋白都可以与具有中和活性的单抗反应，这表明糖基化与中和表位无必然联系。Israrul H.等利用PRRSV反向遗传系统构建了一系列PRRSV GP5蛋白糖基化位点发生点突变的突变株，研究结果表明，第45位N-糖基化位点的突变将导致不能产生具有感染力的子代病毒，说明PRRSV GP5蛋白第45位的天冬酰胺的糖基化对于维持病毒的感染力是必须的；N33位和/或N51位N-糖基化位点的突变将导致病毒滴度的降低，但在中和试验中对PRRSV野毒的特异性抗体表现出更高的敏感性，更令人鼓舞的是，与野毒株相比，用这些突变株免疫猪能产生针对于PRRSV野毒的更高水平的中和抗体，这表明在N33与N51位的糖基化的突变既提高了病毒在中和试验中对抗体的敏感性，也增强了糖基化位点附近抗原表位的免疫原性（Israrul H. Ansari, Byungjoon Kwon, Fernando A., et al. Influence of N-Linked Glycosylation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus GP5 on Virus Infectivity, Antigenicity, and Ability To Induce Neutralizing Antibodies. J virol, 2006; 80: 3994~4004）。

基质蛋白(M蛋白)由ORF6编码，分子量大小约为18~19KD。在欧美毒株之间M基编码的氨基酸同源性为78~81%，是欧美毒株间较为保守的蛋白(Dea S,Gagnon,CA.,Mardassi H.et al.,1996.Antigenic variability among North American and European strains of procine reproductive and respiratory syndrom virus as defined by monoclonal antibodies to the matrix protein .J Clin.Microlo,34,1488~1493.)。而在北美洲型分离株之间M蛋白的氨基酸序列同源性大于96%，是所有结构蛋白基因中最保守的。M蛋白是一个非糖基化的膜蛋白。在PRRSV感染后约10天就可以从猪血清中检测到针对M蛋白的抗体反应，表明该蛋白具有很强的免疫原性，另外还有研究表明猪只感染PRRSV后产生的T细胞增殖反应主要是针对M蛋白的，也就是说，这个蛋白可能是引起细胞免疫反应的主要蛋白。己有报道证明无论在体内还是在体外，PRRSV的中和作用都直接与抗GP5蛋白的抗体有关(Gonin P., Pirzadeh B., Gagnon C.A., Dea S. Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein. J Vet Diagn Invest. 1999, 11: 20~26)。而且GP5对T淋巴细胞增殖反应的刺激作用也仅次于M蛋白，表明GP5在诱导PRRSV特异性细胞免疫中也具有重要作用(Bautista E.M., Molitor T.W. IFN gamma inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in macrophages. Arch Virol. 1999, 144(6):1191~200.)。

由于近年来高致病性蓝耳病在近年的广泛快速流行，所以必须加大对其疫苗研制的力度，从根本上控制疾病的流行和发生。传统的灭活苗对变异株的高致病性毒株没有起到保护效果，针对高致病性猪蓝耳病的弱毒和灭活疫苗在应用中均存在一定的缺点：常规活疫苗（灭活苗和弱毒苗）的有效性在控制疾病流行时的作用是公认的，并且在控制急性疾病的传播上有一定的作用，但从长远的控制和根除疾病，两者都存在一定的缺点和不足，如：毒力反强、散毒、动物免疫的应激反应、多次免疫、免疫保护期短等。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种新的无筛选标记的双表达重组MVA病毒。

本发明的无筛选标记的双表达重组MVA病毒，以MVA病毒为载体，载体上包括两个单独表达的抗原基因GP5基因和M基因，其中GP5基因的N33、N34、N51位上的氨基酸N突变为氨基酸A，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

本发明的无筛选标记的双表达重组MVA病毒的构建方法，包括下列步骤：

1）在pIIIdHR载体的自有启动子的下游的引入MVA病毒特异启动子VP7.5，启动子VP7.5的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，构建双表达转移载体pIII-VP7.5；

2）获得正常型的GP5基因和M基因，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4；

3）点突变步骤2）中获得的GP5基因的33、34位氨基酸和51位氨基酸，将氨基酸N突变为氨基酸A；

4）使用步骤1）中获得的双表达转移载体pIII-VP7.5与步骤3）中获得的点突变GP5基因及步骤2）中获得的M基因，构建含有突变型GP5基因和正常型M基因的双表达重组病毒载体；

5）双表达重组病毒载体的鉴定、大量制备、筛选和纯化，得到含有两个单独表达的抗原基因GP5（核苷酸序列为SEQ ID NO.3）和M基因（核苷酸序列为SEQ ID NO.2）的重组MVA病毒载体。

本发明所使用的病毒载体是基于改良的安卡拉牛痘病毒（vaccinia virus Ankara ,MVA），该病毒是一种高度减毒（attenuated）的牛痘病毒株，已证实该病毒在经过长期的CEF传代后有较好的减毒作用，具有对人和动物毒副作用小的特点。该病毒MVA在人体和大多数哺乳类细胞中不能有效增殖，但研究发现，MVA的病毒DNA在人体细胞中可以正常复制，同时，也能够合成早期和晚期的病毒蛋白。用携带报告基因的重组病毒感染细胞表明，在同一启动子的作用下，MVA产生的β-半乳糖苷酶与复制型痘苗病毒Western Reserve株（WR）的产量接近（A.L. Phelps, A.J. Gates, M. Hillier. Comparative efficacy of modified vaccinia Ankara (MVA) as a potential replacement smallpox vaccine. Vaccine, January 2007; 25: 34~42）。动物实验（鸡、兔和小鼠）显示，MVA对新生动物不产生任何副作用，甚至对于免疫缺陷的动物同样没有副作用。

Leonard yuen等在研究利用痘病毒表达外源基因时曾在外源基因的末端引入了一个双向终止序列5‘ATTTT TATAAAAAT’3，这对提高表达水平有利（Leonard Yuen, Bernard Moss. Oligonucleotide sequence signaling transcriptional termination of vaccinia virus early genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 6417~6421）。所以本发明在外源基因的末端引入这个双向终止序列，来加强外源基因的表达水平。

本发明是通过重组MVA来完成的，所述转移载体通过和MVA病毒的同源重组来表达外源的抗原（通过改造可表达一个或多个抗原或相应优势表位）。本发明的双表达载体，无筛选标记基因存在，提高疫苗的安全性，适用于在单基因表达效果有限的疫病的预防和治疗，克服常规苗和单基因表达的基因工程疫苗的缺点，更加有利于重组病毒向安全、有效地新型疫苗发展。本发明具有编码表达优化的GP5和M抗原基因的重组MVA病毒非常适用于制备新型的PRRS疫苗。

附图说明

图1为PCR扩增痘病毒的特异启动子VP7.5基因的电泳图；M为DL2000，VP7.5

为PCR扩增得到的目的片段；

图2为不同Tm值扩增的PRRSV的GP5和M基因的电泳图；1为GP5基因的水对照；2为Tm59℃扩增GP5基因；3为Tm60.1℃扩增GP5基因；4为Tm57.8℃扩增GP5基因；5为Tm58.7℃扩增GP5基因；6为M基因的水对照；M为DL2000；

图3为GP5基因点突变后的电泳鉴定；1、2为N33、N34位氨基酸突变后鉴定，3、4为N33、N34、N51位氨基酸突变后鉴定；

图4为构建好的pIII-N51的 PmeI、AscI双酶切鉴定图；M1为DL15000，M2为DL2000，1，2为质粒pIII-N51酶切结果；

图5为转移载体pIII-N51-VP7.5-M的ＳacＩ、ＸholＩ双酶切鉴定；M为DL2000，1, 2为pIII-N51-VP7.5-M酶切后电泳；

图6-1、6-2为第一轮蚀斑纯化后重组病毒rMVA-GP5-M的高免猪血清鉴定结果；

图6-3为第一轮蚀斑纯化后重组病毒MVA野毒的高免猪血清鉴定结果

图7-1为纯化好的重组病毒rMVA-GP5-M的M单抗的鉴定图；

图7-2为纯化好的重组病毒rMVA-GP5-M的GP5单抗的鉴定图；

图7-3为纯化好的野毒MVA的GP5+M单抗鉴定图；

图8为Western blot鉴定重组病毒rMVA-GP5-M的外源基因表达图；1为Marker 橙色为40kDa，下边依次为30、24和16 kDa，2为PRRSV的GP5和M单抗鉴定；3为MVA野毒；4为重组病毒rMVA-GP5-M的GP5和M单抗鉴定；

图9是本发明的双表达重组MVA病毒的构建流程图。

具体实施方式

以下叙述本发明的具体实施例，应该说明的是本实施例只对本发明有说明作用，而没有限制作用。在实施例中详细描述了抗原基因的获得和转移载体的构建，但并不意味着抗原基因的克隆构建仅限于实施例中的叙述，任何以其它基因工程方法克隆相应基因权利要求书中所述抗原基因都应包括在本发明所要要求的权利范围之内。

实施例1 构建双表达的重组MVA病毒

一）构建含有两个启动子的双表达载体pIIIdHR-VP7.5

以pIIIdHR质粒为基础，在pIIIdHR载体的自有启动子的下游的MCS下游引入的痘苗病毒特异启动子VP7.5，构建成双表达转移载体。

在其多克隆区的酶切位点中选择BssHII酶切位点，利用同尾酶BssHII和MluI设计引物插入VP7.5启动子序列，上游：BssH II启动子序列16个碱基；下游：Mlu I + Nhe I+ Sac I+ Stu I+ Xho I+互补序列23个碱基，设计引物如下：

上游：

TTGGCGCGCTCACTAATTCCAAACC

下游：

CGACGCGTCTAGCTAGCTA CGAGCTCG AAAGGCCTTCGCTCGAGCGG TTATGATCTACTTCCTTACCGTG，通过PCR获得VP7.5启动子序列，将获得的片段连接T载体，获得的单菌落经酶切鉴定阳性的质粒，送测序，测序结果正确的质粒，即为T-VP7.5质粒（核苷酸序列为SEQ ID NO.3）。

在将经BssHII和MluI双酶切后获得VP7.5片段，将pIIIdHR转移载体质粒经BamHI酶切，产物脱磷后回收处理，两个片段在T4 ligase等作用下发生连接反应，酶切和PCR鉴定获得的阳性菌落，即为含有可以双表达外源基因的无筛选标记载体pIII-VP7.5。其结果如图1所示。

二）获得GP5基因和M基因

比较GenBank中公布的高致病性猪蓝耳病的基因序列，设计引物。序列如下，

GP5上游：

5‘-3’GGGTTTAAACATGTTGGGGAAGTGC

GP5下游：

5‘-3’TTGGCGCGCCATTTTTATAAAAATCTAGAGACGACCCCATAG

在GP5基因的上下游分别引入Pme I， Asc I酶切位点，送上海Invitrogen公司合成。

同理设计M基因的引物，

M上游：5‘-3’CCGCTCGAGATGGGGTCGTCTCTAGAC

M下游：5‘-3’CGAGCTCTTATTTGGCATATTTAACAAGG

上下游分别加入Xho I、Sac I酶切位点。

取500uL PRRS病毒液，提取RNA。以此RNA为模板进行反转录，反应条件为：(30μL体系) RNA 7μL，dNTP 12μL，AMV 2.5μL，5×AMV buffer 6μL，抑制剂 1.5μL，引物 1μL，室温作用10min，42℃作用1h 后取出，冰浴作用2~20min ，以此产物为模板进行PCR。

PCR反应体系为：（反应总体积30uL）10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP (2.5mmol/L) 2μL、上、下游引物各1μL、La Taq酶0.5μL L、cDNA3μL、加水至30μL。

PCR反应条件: 95℃作用4 m in，然后94℃变性30 sec，59℃（GP5）/60℃（M）退火30sec，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增的PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。片段大小正确后，胶回收试剂盒纯化后，T载体连接，送测序，测序验证序列正确后，即获得了正确的GP5（核苷酸序列为SEQ ID NO.4）和M基因序列（核苷酸序列为SEQ ID NO.2）。

其结果如图2所示，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，图中“1”为蛋白质分子量扩增GP5基因的空白水对照；“2、3”分别是在59.0和60.1℃的Tm下的GP5基因条带。条带“4、5”为，57.8和58.7℃的Tm下的M基因条带。“M”为DL2000的Marker。结果显示均扩增到了与预期大小一致的基因条带，最后确定以后扩增GP5和M基因的最佳退火温度为60.1和58.7℃。GP5和M基因产物送测序后结果显示，获得了正确的GP5和M基因序列（附10、11）。

三）点突变GP5基因的33、34位氨基酸和51位氨基酸

将上述获得的GP5基因，通过Taraka生物公司的Probest点突变试剂盒要求，设计引物2对，分别用于突变33、34位氨基酸和51位氨基酸，引物序列如下：

突变33、34位氨基酸：

上游：5’-3’85-121:CGTCAACGCCAGCAACGGCGGCAGCTCTCATATTCAG

下游：3' -5’ 54-83:CCACATAGCACGGCAAGATAGAACGACACGA

突变51位氨基酸：

上游：5’-3’ 147- 176GCTGGGTGGCACAGATTGGCTGGCACAAAA

下游：3' -5’ -146 GTCAACTAAATATTGAATTGCGATACACT

将测序获得的正确GP5基因按照说明书进行点突变，首先突变33/34位氨基酸，利用试剂盒提供酶，进行PCR，反应体系为：pybest酶 0.25uL，10x Pyrobest buffer 5uL，dNTP 4uL，上下游引物各1uL，模板基因1uL，加水补至50uL。

反应条件：94℃ 30sec

55℃ 30sec

72℃ 5min 30个循环

PCR产物电泳回收，回收后进行Blunting Kination反应

DNA 10uL

10xBK buffer 2uL

Enzyme 1uL

水 7uL

37℃反应10min，70℃反应10min。

Ligation反应，5uL上述样品，5uL Ligation Solution I，混合均匀，用连接酶连接16℃，1hour。反应液全量转化至100uL感受态细胞中。转化后，挑取单个菌落，酶切或PCR鉴定，有阳性片段的，回收后菌液测序，序列证实被正确突变的标记为N33N34，进行下步点突变。

GP5基因的51位氨基酸，突变操作按照上述操作，仅引物更换为N51点突变专用引物。获得阳性片段后测序，突变后经测序正确的含3个糖基化位点均突变的GP5序列命名为N51。在转移载体的构建中将GP5基因3个氨基酸替换后的GP5基因序列命名为N51-T（仅突变2个的称为N33N34）。

结果如图3所示，经过Pme I、 Asc I双酶切后，获得了和GP5基因大小相符的条带，将上述克隆送测序，结果显示点突变正确获得了突变3个氨基酸的GP5序列（核苷酸序列为SEQ ID NO.1）。

四）构建含有突变型GP5基因和正常型M基因的重组病毒载体

1）将pIIIdHR质粒和T-N51均经限制性内切酶Pme I， Asc I双酶切后，分别回收酶切产物，在T4 ligase等作用下发生连接反应，获得阳性重组质粒命名为：转移载体pIIIdHR-N51。

结果如图4所示，其中M1：为DL15000 Marker，M2：为DL2000 Marker，1,2： pIII-N51质粒酶切后电泳，小片段即为点突变后的GP5基因。证实GP5及N51基因插入。

2）将测序正确的M基因片段和经Xho I、 Sac I双酶切后回收的pIIIdHR-N51载体片段，在T4 ligase作用下发生连接反应，酶切和PCR鉴定获得的阳性菌落，命名为pIIIdHR-N51-VP7.5-M。

结果如图5所示，经过双酶切，在两株载体上均酶切出了547bp的条带，与M基因大小一致，证明M基因插入，因为在载体上没有ＳacＩ、ＸholＩ的酶切位点，可以切出目的片段，证明酶切位点已经引入，即VP7.5基因也被正确插入。故完成转移载体的构建。

五）重组病毒载体的鉴定、大量制备、筛选和纯化

构建完成转移载体质粒用于将来后续的重组病毒筛选，将鉴定好的转移载体，利用分子克隆3中质粒的大量提取和纯化方式进行提取，得到纯度和浓度合适的质粒进行转染。

转染操作按照脂质体转染试剂盒进行。将BHK-21细胞铺6孔板，铺板后12-16小时，将0.01MOI的MVA野毒感染BHK-21细胞，感做1小时，后弃去上清，按照脂质体转染试剂盒说明操作，转染后6-8小时换液，转染后48~72小时收获还有细胞病变的转染毒。

将转染毒梯度稀释，接入到长满单层的RK-13细胞上，设细胞对照孔，接毒后每天观察病变，将带有明显特异性病变的孔收毒，反复冻融后收获病毒，在以此为种毒接入RK-13细胞，进行蚀斑纯化3-6轮，直至得到纯化的蚀斑毒。

将得到的纯化的蚀斑毒再回复至BHK-21细胞上，采用终点稀释法获得纯化的重组MVA病毒，并进行IFA，WB和PCR鉴定。证明获得阳性重组病毒，此病毒将是新型HP-PRRSV的疫苗候选。

其结果如下：

如图6-1、6-2、6-3所示，在高免猪血清的作用下，有阳性的结果，且成病变聚团状，说明有阳性的重组蚀斑存在，可以继续纯化。

如图7-1、7-2、7-3所示，纯化好的蚀斑经GP5和M单抗鉴定后均有蛋白表达，且表达的比例较高，基本达到纯化目标。

图8为Western blot鉴定重组病毒rMVA-GP5-M的外源基因表达图，结果显示，和PRRSV一样，在重组病毒rMVA-GP5-M中，GP5和M基因均得到较好的表达。

Organization Applicant

----------------------

Street :

City :

State :

Country :

PostalCode :

PhoneNumber :

FaxNumber :

EmailAddress :

<110> OrganizationName : 江苏省农业科学院

Application Project

-------------------

<120> Title : 一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法

<130> AppFileReference :

<140> CurrentAppNumber :

<141> CurrentFilingDate : ____-__-__

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

atgttgggga agtgcttgac cgcgtgctgt tgctcgcgat tgcttttttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct atcttgctgt gctcgtcaac gccagcaacg gcggcagctc tcatattcag 120

ttgatttata acttaacgct atgtgagctg ggtggcacag attggctggc acaaaaattt 180

gactgggcag tggagacttt tgtcatcttc cccgtgttga ctcacattgt ttcctatggg 240

gcactcacca ccagccattt ccttgacaca gttggtctgg ccactgtgtc caccgccgga 300

tattatcacg ggcggtatgt cttgagtagc atttacgcag tctgtgctct ggctgcgctg 360

atttgctttg tcattaggct tgcgaagaac tgcatgtcct ggcgctactc ttgtaccaga 420

tataccaact tccttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcccgtcatt 480

gtggagaaaa ggggtaaggt tgaggtcgaa ggtcacctga tcgacctcaa gagagttgtg 540

cttgatggtt ccgcggcaac ccctttaacc agagtttcag cggaactatg gggtcgtctc 600

tagattttta taaaaatggc gcgccaa 627

<212> Type : DNA

<211> Length : 627

SequenceName : 1

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

ccgctcgaga tggggtcgtc tctagacgac ttctgcaatg atagcacagc tccacagaag 60

gtgcttttgg cgttttccat tacctacacg ccagtgatga tatatgctct aaaggtaagt 120

cgcggccgac tgctagggct tctgcacctt ttgatcttcc tgaattgtgc ttttaccttc 180

gggtacatga cattcgtgca ctttgagagc acaaataggg tcgcgctcac tatgggagca 240

gtagttgcac ttctttgggg agtgtactca gccatagaaa cctggaaatt catcacctcc 300

agatgccgtt tgtgcttgct aggccgcaag tacattctgg cccctgccca ccacgtcgaa 360

agtgccgcgg gctttcatcc gattgcggca aatgataacc acgcatttgt cgtccggcgt 420

cccggctcca ctacggtcaa cggcacattg gtgcccgggt tgaaaagcct cgtgttgggt 480

ggcagaaaag ctgttaagca gggagtggta aaccttgtta aatatgccaa ataagagctc 540

g 541

<212> Type : DNA

<211> Length : 541

SequenceName : 2

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

ttggcgcgct cactaattcc aaacccaccc gctttttata gtaagttttt cacccataaa 60

taataaatac aataattaat ttctcgtaaa agtagaaaat atattctaat ttattgcacg 120

gtaaggaagt agatcataac tcgaggctag gccatggagc tcagcgctag catcacgcgt 180

gcg 183

<212> Type : DNA

<211> Length : 183

SequenceName : 3

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName :

<400> PreSequenceString :

atgttgggga agtgcttgac cgcgtgctgt tgctcgcgat tgcttttttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct atcttgctgt gctcgtcaac gccagcaaca acaacagctc tcatattcag 120

ttgatttata acttaacgct atgtgagctg aatggcacag attggctggc acaaaaattt 180

gactgggcag tggagacttt tgtcatcttc cccgtgttga ctcacattgt ttcctatggg 240

gcactcacca ccagccattt ccttgacaca gttggtctgg ccactgtgtc caccgccgga 300

tattatcacg ggcggtatgt cttgagtagc atttacgcag tctgtgctct ggctgcgctg 360

atttgctttg tcattaggct tgcgaagaac tgcatgtcct ggcgctactc ttgtaccaga 420

tataccaact tccttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcccgtcatt 480

gtggagaaaa ggggtaaggt tgaggtcgaa ggtcacctga tcgacctcaa gagagttgtg 540

cttgatggtt ccgcggcaac ccctttaacc agagtttcag cggaactatg gggtcgtctc 600

tagattttta taaaaatggc gcgccaa 627

<212> Type : DNA

<211> Length : 627

SequenceName : 4

SequenceDescription :

Claims

1.一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒，其特征在于，以MVA病毒为载体，载体上包括两个单独表达的抗原基因GP5基因和M基因，其中GP5基因的N34、N35、N51位上的氨基酸N突变为氨基酸G，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，

所述的无筛选标记的双表达重组MVA病毒的构建方法包括如下步骤：

一)构建含有两个启动子的双表达载体pIIIdHR-VP7.5

以pIIIdHR质粒为基础，在pIIIdHR载体的自有启动子的下游的MCS下游引入的痘苗病毒特异启动子VP7.5，构建成双表达转移载体；

在其多克隆区的酶切位点中选择BssHII酶切位点，利用同尾酶BssHII和MluI设计引物插入VP7.5启动子序列，上游：BssH II启动子序列16个碱基；下游：Mlu I+Nhe I+Sac I+Stu I+Xho I+互补序列23个碱基，设计引物如下：

上游：

TTGGCGCGCTCACTAATTCCAAACC

下游：

CGACGCGTCTAGCTAGCTA CGAGCTCG AAAGGCCTTCGCTCGAGCGGTTATGATCTACTTCCTTACCGTG，通过PCR获得VP7.5启动子序列，将获得的片段连接T载体，获得的单菌落经酶切鉴定阳性的质粒，送测序，测序结果正确的质粒，即为T-VP7.5质粒，T-VP7.5质粒核苷酸序列为SEQ ID NO.3；

在将经BssHII和MluI双酶切后获得VP7.5片段，将pIIIdHR转移载体质粒经BamHI酶切，产物脱磷后回收处理，两个片段在T4ligase等作用下发生连接反应，酶切和PCR鉴定获得的阳性菌落，即为含有可以双表达外源基因的无筛选标记载体pIII-VP7.5；

二)获得GP5基因和M基因

比较GenBank中公布的高致病性猪蓝耳病的基因序列，设计引物，序列如下，

GP5上游：

5‘-3’ GGGTTTAAACATGTTGGGGAAGTGC

GP5下游：

5‘-3’ TTGGCGCGCCATTTTTATAAAAATCTAGAGACGACCCCATAG

在GP5基因的上下游分别引入Pme I，Asc I酶切位点，送上海Invitrogen公司合成；

同理设计M基因的引物，

M上游：5‘-3’ CCGCTCGAGATGGGGTCGTCTCTAGAC

M下游：5‘-3’ CGAGCTCTTATTTGGCATATTTAACAAGG

上下游分别加入Xho I、Sac I酶切位点；

取500uL PRRS病毒液，提取RNA，以此RNA为模板进行反转录，反应条件为：30μL体系，RNA7μL，dNTP12μL，AMV2.5μL，5×AMV buffer6μL，抑制剂1.5μL，引物1μL，室温作用10min，42℃作用1h后取出，冰浴作用2～20min，以此产物为模板进行PCR；

PCR反应体系为：反应总体积30uL，10×PCR缓冲液2.5μL、2.5mmol/L的dNTP2μL、上、下游引物各1μL、La Taq酶0.5μL L、cDNA3μL、加水至30μL；

PCR反应条件:95℃作用4m in，然后94℃变性30sec，GP559℃/M60℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min，扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，片段大小正确后，胶回收试剂盒纯化后，T载体连接，送测序，测序验证序列正确后，即获得了正确的GP5和M基因序列，GP5的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，M基因序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；

三)点突变GP5基因的34、35位氨基酸和51位氨基酸

将上述获得的GP5基因，通过Taraka生物公司的Probest点突变试剂盒要求，设计引物2对，分别用于突变34、35位氨基酸和51位氨基酸，引物序列如下：

突变34、35位氨基酸：

上游：5’-3’ 85-121:CGTCAACGCCAGCAACGGCGGCAGCTCTCATATTCAG

下游：3'-5’ 54-83:CCACATAGCACGGCAAGATAGAACGACACGA

突变51位氨基酸：

上游：5’-3’ 147-176GCTGGGTGGCACAGATTGGCTGGCACAAAA

下游：3'-5’ -146GTCAACTAAATATTGAATTGCGATACACT

将测序获得的正确GP5基因按照说明书进行点突变，首先突变34/35位氨基酸，利用试剂盒提供酶，进行PCR，反应体系为：pybest酶0.25uL，10x Pyrobest buffer5uL，dNTP4uL，上下游引物各1uL，模板基因1uL，加水补至50uL；

反应条件：94℃ 30sec

55℃ 30sec

72℃ 5min 30个循环

PCR产物电泳回收，回收后进行Blunting Kination反应

37℃反应10min，70℃反应10min；

Ligation反应，5uL上述样品，5uL Ligation Solution I，混合均匀，用连接酶连接16℃，1hour，反应液全量转化至100uL感受态细胞中，转化后，挑取单个菌落，酶切或PCR鉴定，有阳性片段的，回收后菌液测序，序列证实被正确突变的标记为N34N35，进行下步点突变，

GP5基因的51位氨基酸，突变操作按照上述操作，仅引物更换为N51点突变专用引物，获得阳性片段后测序，突变后经测序正确的含3个糖基化位点均突变的GP5序列命名为N51，在转移载体的构建中将GP5基因3个氨基酸替换后的GP5基因序列命名为N51-T，仅突变2个的称为N34N35；

四)构建含有突变型GP5基因和正常型M基因的重组病毒载体

1)将pIIIdHR质粒和T-N51均经限制性内切酶Pme I，Asc I双酶切后，分别回收酶切产物，在T4ligase等作用下发生连接反应，获得阳性重组质粒命名为：转移载体pIIIdHR-N51；

2)将测序正确的M基因片段和经Xho I、Sac I双酶切后回收的pIIIdHR-N51载体片段，在T4ligase作用下发生连接反应，酶切和PCR鉴定获得的阳性菌落，命名为pIIIdHR-N51-VP7.5-M；

五)重组病毒载体的鉴定、大量制备、筛选和纯化

构建完成转移载体质粒用于将来后续的重组病毒筛选，将鉴定好的转移载体，利用分子克隆3中质粒的大量提取和纯化方式进行提取，得到纯度和浓度合适的质粒进行转染；

转染操作按照脂质体转染试剂盒进行，将BHK-21细胞铺6孔板，铺板后12-16小时，将0.01MOI的MVA野毒感染BHK-21细胞，感做1小时，后弃去上清，按照脂质体转染试剂盒说明操作，转染后6-8小时换液，转染后48～72小时收获还有细胞病变的转染毒；

将转染毒梯度稀释，接入到长满单层的RK-13细胞上，设细胞对照孔，接毒后每天观察病变，将带有明显特异性病变的孔收毒，反复冻融后收获病毒，在以此为种毒接入RK-13细胞，进行蚀斑纯化3-6轮，直至得到纯化的蚀斑毒；

将得到的纯化的蚀斑毒再回复至BHK-21细胞上，采用终点稀释法获得纯化的重组MVA病毒，并进行IFA，WB和PCR鉴定，证明获得阳性重组病毒，此病毒将是新型HP-PRRSV的疫苗候选。