CN101401937A - 共表达prrsv orf5及orf6双基因核酸疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV) ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT－PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES－ORF5及ORF6，将重组质粒转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT－PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS－PAGE和Western blot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。
Description
1、技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说是一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合症的共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因的核酸疫苗，用于对猪提供针对猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫保护作用。
2、背景技术
猪繁殖与呼吸综合症可引起妊娠母猪流产、死产等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。自2006年6月初以来，在我国湖北、湖南、江西、安徽等十几个省份相继出现高致病性PRRSV为主要病原的猪“无名高热综合症”，给我国的养猪业造成了严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合症病毒为单股正链RNA病毒，长约15Kb。ORF5编码约25ku的糖蛋白GP5，能诱导机体产生中和抗体及特异性细胞免疫。ORF6编码M蛋白，该蛋白位于病毒囊膜内。M-GP5聚合物在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染中起重要作用。目前用于预防PRRS的弱毒苗和灭活苗已在我国广泛应用，但是猪繁殖与呼吸综合症仍未得到有效控制。核酸疫苗可将病毒保护性抗原的基因以质粒的方式导入动物体，其表达蛋白既可刺激产生体液免疫又可产生细胞免疫，本发明中将PRRSV ORF5及ORF6基因同时插入真核重组表达载体构建的核酸疫苗尚未见报道。
3、发明内容
本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合症的共表达PRRSVORF5及ORF6双基因的核酸疫苗，使猪繁殖与呼吸综合症难以防治的现状得以突破。
本发明的目的是按以下方式实现的：
共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因的核酸疫苗，是在哺乳动物真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了PRRSV ORF5及ORF6完整基因，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6双基因核酸疫苗，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV的GP5及M蛋白。
上述核酸疫苗通过以下方法构建而成：
1)ORF5及ORF6的扩增
根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF5及ORF6的引物，引物序列如下：
P5s：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’
P5r：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’扩增702bp。
P6s：5’-AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3’
P6r：5’-AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3’扩增607bp。
以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增ORF6基因。
2)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的构建
将ORF6的PCR产物和pIRES质粒经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF6插入pIRES，构建pIRES-ORF6重组质粒；再将ORF5的PCR片段与pIRES-ORF6重组质粒经XbaI和NotI双酶切，将ORF5插入pIRES-ORF6，构建pIRES-ORF5及ORF6重组质粒。
3)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的转染
将pIRES-ORF5及ORF6转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系。通过RT-PCR检测ORF5及ORF6的转录情况，通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和免疫活性，通过间接免疫荧光试验进一步检测目的蛋白在细胞内的表达情况。上述试验均证明了目的基因的转录及目的蛋白的表达。
本发明的有益效果是：该核酸疫苗首次在哺乳动物细胞真核表达载体中插入了PRRSV ORF5及ORF6基因，突破了PRRSV常规灭活疫苗及弱毒疫苗的局限性，避免了弱毒疫苗使用后毒力返强情况的发生，弥补了灭活疫苗免疫后不能产生细胞免疫的缺陷，又可使针对GP5的抗体优先产生，改变了PRRSV感染后针对GP5的中和抗体产生慢而且产生量少的不足。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。
4、附图说明
附图1是pIRES-ORF5及ORF6转染后细胞中GP5蛋白和M蛋白的SDS-PAGE
检测结果；
附图1标记说明：其中1)是蛋白质分子量标准；2)是pIRES-ORF5及ORF6转染细胞的上清；3)是pIRES转染细胞。
附图2pIRES-ORF5及ORF6转染细胞的间接免疫荧光检测结果。
附图2标记说明：A质粒转染的细胞；B病毒感染的细胞；C阴性对照。
5、具体实施方式
1)PCR引物设计合成
根据pIRES MCSA、MCSB多克隆位点的序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF6基因阅读框架，同时在起始密码子的前面加入Kozak序列，分别设计了针对ORF5及ORF6的引物P5s及P5r，P6s及P6r。
P5s：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’
P5r：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’扩增702bp。
P6s：5’-AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3’
P6r：5’-AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3’扩增607bp。
2)病毒RNA的提取
将PRRSV SD1株接种Marc-145细胞，当细胞出现75％左右病变并开始脱落时，冻融3次收集病毒液，用Trizol试剂盒提取病毒总RNA，操作方法按说明书进行。
3)反转录
取提取的RNA 7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、RNase Inhibitor 1μL、ddH2O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。以此合成的cDNA为模板进行PCR反应。
4)PCR扩增
以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增ORF6基因。10×PCR Buffer 5μL，25pmol及L上、下游引物各2μL，10mmol及L dNTPs 4μL，1∶200稀释的质粒模板2μL，水34μL，Taq E 1μL。
ORF5基因扩增条件：预变性：95℃ 5min；变性：94℃ 1min退火：50℃ 1min延伸：72℃ 1min共30 Cycles最终延伸72℃ 10min。
ORF6基因扩增条件：预变性：95℃ 5min；变性：94℃ 1min退火：59.6℃1min延伸：72℃ 1min共30 Cycles最终延伸72℃ 10min。
5)pIRES-ORF6真核重组表达载体的构建
将ORF6 PCR产物和pIRES经EcoR I和NheI 37℃双酶切5h，胶回收双酶切产物，并在16℃保温90min进行连接获pIRES-ORF6。将pIRES-ORF6转化感受态细胞DH5α后按照上海生工质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。后经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。
6)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的构建及鉴定
将ORF5 PCR产物和pIRES-ORF6经Xba I和Not I双酶切，胶回收双酶切产物，并在16℃保温90min进行连接获pIRES-ORF5及ORF6。将pIRES-ORF5及ORF6转化感受态细胞DH5α后按照上海生工质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。并进行PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒用WizardPureFection PLasmid DNA Putification System试剂盒进行纯化，紫外分光光度计测定其含量。
7)pIRES-ORF5及ORF6重组质粒的转染
将对数生长期的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)用胰酶及EDTA常规消化，以1×108个及mL铺于D-多聚赖氨酸(1mg及mL)包被的6孔板中，每孔2mL，培养18～24h。待细胞铺满90％及以上时，用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染试剂盒转染。在无菌1.5mL离心管中配置：溶液A：1μg pIRES-ORF5及ORF6质粒，溶液B：5μL Lipofectamine 2000，分别溶于250μL DMEM(无血清)培养基。在5min内将溶液A溶液B混合，轻轻摇动，室温放置30min后，加入0.5mL DMEM培养基，轻轻摇动。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。37℃5％CO2中保温6h，后加入含血清的DMEM培养液。24h传代至新鲜培养基中，48h后加入筛选抗生素。48h后加入700μg及mL G418的选择培养基，对转染的CHO细胞进行加压筛选，以获得稳定转染的CHO细胞。每4d换液1次，加压筛选至对照组(未转染的CHO细胞)全部死亡。将G418浓度降为350μg及mL，继续培养至转染组细胞生长汇合，即可转至30cm2的培养瓶中持续加压筛选培养。加压筛选后20d内，对照组细胞全部死亡；自加压后12d开始，转染pIRES-ORF5及ORF6的细胞开始增殖，第15～23d汇片达80％左右，未见细胞漂浮，表明已筛选出稳定转染的CHO细胞。
8)基因的转录鉴定
收集筛选后稳定表达的细胞，按常规方法提取细胞总RNA，用1中介绍的引物RT-PCR分别检测ORF5、ORF6基因的转录情况。均可扩增出与预期大小一致的条带。
9)SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和免疫活性
收集筛选后稳定表达的细胞上清液按1∶1比例与2×SDS(2.0mL Tris-Cl0.5mol及L pH6.8，10％SDS，2.0mL 1％溴酚蓝，2.0mL甘油)上样缓冲液，沸水中煮15min，进行SDS-PAGE。将转膜后的硝酸纤维素膜放在一个平皿中，用15mL1×PBS洗两次，每次10min。加封闭液(5％脱脂奶粉)，浸过膜即可，室温下轻振2h。然后用20mL 1×PBST洗3次，每次10min，再用15mL 1×PBS洗10min。加10mL用封闭液按1∶100稀释的PRRS高免血清，室温下轻振2h。重复清洗步骤，
SEQUENCE LISTING
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
aatctagagc cgccaccatg ttgga 25
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
gcgcggccgc tcactggcgt gtag 24
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
agctagccgc caccatgggg tcgtcc 26
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
agaattctgg caccagctga ttgactgg 28
Claims (1)
1.共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，其特征在于通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将PRRSV SD1株的完整ORF5及ORF6插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6双基因核酸疫苗；该共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗是通过以下方法构建而成：
1)ORF5及ORF6的扩增：
根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF5及ORF6的引物，引物序列如下：
P5s：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’
P5r：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’扩增702bp；
P6s：5’-AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3’
P6r：5’-AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3’扩增607bp；
以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增ORF6基因；
2)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的构建：
将ORF6的PCR产物和pIRES质粒经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF6插入pIRES，构建pIRES-ORF6重组质粒；再将ORF5的PCR片段与pIRES-ORF6重组质粒经Xba I和Not I双酶切，将ORF5插入pIRES-ORF6，构建pIRES-ORF5及ORF6重组质粒；
3)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的转染：
将重组质粒pIRES-ORF5及ORF6转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT-PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS-PAGE和Westernblot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性，并通过间接免疫荧光检测到转染质粒的CHO细胞内有PRRSV特异性的蛋白表达。
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