BG105701A

BG105701A - Вирусна ваксина със заличен bhv-1 ген

Info

Publication number: BG105701A
Application number: BG105701A
Authority: BG
Inventors: Shafiqul CHOWDHURY
Original assignee: Kansas State University Research Foundation
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2002-03-29
Also published as: ES2269101T3; EE200100396A; HRP20010476A2; NO20013697D0; NO20013697L; HK1042512B; US6284251B1; CN1364193A; EP1155119A4; WO2000044884A1; DK1155119T3; CZ20012589A3; HRP20010476B1; HK1042512A1; ATE342731T1; AU2615200A; CA2359177A1; JP2002535000A; NZ512125A; DE60031374D1

Abstract

Жизненоспособен рекомбинантен вирус, както и ваксина, се получават чрез заличаване на част от кодовата област на природния гликопротеин Е (gE) на волски херпесвирус 1 (BHV-1), последвано от вмъкване на плазмид, включващ чужда бета-галактозидаза (бета-gal), на мястото на гликопротеин Е. Заличаванетона гликопротеин Е гена устойчиво отслабва действието на вируса и служи като имунологичен маркер, чрез който се различават ваксинираните животни от заразените. Продуцирането на бета-галактозидаза позволява лесно да се оценява репликирането на вируса gE 3.1IBRбета във ваксинираните животни и служи като фенотипен маркер, който го разграничава от репликирането на необлагороден вид вирус при заразени животни.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение най-общо се отнася до ваксини спрямо рекомбинантен волски херпесвирус и съответни методи. По-специално, настоящото изобретение с предпочитание се отнася до строежа на инфекциозен рекомбинантен волски херпесвирус тип 1 CBHV-13 със заличена част от кодовата област на природния гликопротеин Е С gE3 и на мястото на гликопротеин

Е, вмъкнат ген на Функционална /?-галактозидаза. Заличаването на кодовата област на природния гликопротеин Е отслабва дей ствието на вируса и служи като генотипичен или имунологичен • · · · · · • 4 маркер, чрез които се различават инфекцията, причинена от рекомбинантен вирус със заличен гликопротеин Е от тази, при чинена от необлагороден вид вирус. В допълнение, вмъкването на ген на /?-галактозидаза осигурява фенотипичен метод за анализиране на наличието на инфекция, причинена от рекомбинантен вирус със заличен гликопротеин Е посредством активността на /?-галактозидазата в клетките-домакин.

Предшестващо състояние на техниката

Волският херпесвирус тип 1 CBHV-13, известен, съшо така, като инфекциозен волски ринотрахеитен вирус СIBRV), се свързва с различни клинични забодявания, включващи ринотрахеит, конюнктивит, генитални инфекции и спонтанен аборт, ентерит, енцефалит и смесени системни инфекции при добитъка. Геномът на волския херпесвирус тип 1 CBHV-13 се състои от линейна молекула на dsDNA с около 140 kb. Тя е съставена от уникална дълга Си ) област и уникална къса Си 3 област, които са свързани с вътрешни и крайни обратими повтарящи се последователности Ссъответно, I и Т ). В генома на волския

R R херпесвирус тип 1 CBHV-13 са кодирани приблизително 770 протеина CMisra et al., Proteins Specified Bovine Herpesvirus 1 ((Infectious Bovine Rhinotracheitis, 40 JU. Virol. 367-3788 (1981)). Като някои други животински херпесвируси, геномът на волския херпесвирус тип 1 CBHV-1J е кодиран за гена на ями·

•••••••••••а ~ ········♦·· 3 • ···· ··· • · · · · · · · · · • · ··· ··· ······· ·· · ·· ··· гликопротеин С g? Е. Описана е генната последователност на гликопротеин Е във волския херпесвирус тип 1 CBHV-13, която съдържа 575 аминокиселинни остатъка, за два различни щама CLeung-Taek, Р. et al., The Complete DNA Sequence and the Genetic Organization of the Short Unique Region CU 5 of the s

Bovine Herpesvirus Type 1 Strain (ST strain), 199 Virology 409-421 (1994); Rebordosa, X. et al., Mapping, Cloning and Sequencing of a Glycoprotein-Encoding Gene From Bovine Herpesvirus Type 1 Homologous to the gE Gene From HSV-1, 149 Gene 203-209 (1994)). Предвидените аминокиселини в гликопротеин Е включват области на хидрофобни аминокиселини при крайния азотен атом Спредполагаема последователност на сигнали} и близо до крайния въглероден атом Странсмембранна последователност? , което е типично за клас I интегрални мембранни протеини. Показано е, че гликопротеин Е във волския херпесвирус тип 1 и неговите хомолози в други херпесни вируси са разпределени за in vitro репликиране, но заличаването на цялата кодираща последователност на гликопротеин Е на генома на псевдорабен вирус CPRV3 е отговорно за понижена отровност на живите ваксини от щамове Norden и Bartha (Petrovskis, Е. A., Deletion in Vaccine Strains of Pseudorabies Virus and Their Effect on Synthesis of Glycoprotein gp 63, 60 J.Virol. 1166-1169 (1986) и за изменение на невроинвазивността CCard, J. Р. et al., Pseudorabies Virus Envelope Glycoprotein gl Influences Both Neurotropism and е · · · · · · ····· ·· · ·· ···

Virulence During Infection of the Rat Visual System, 66 J.

Virol. 3032-3041 (1992)). Следователно, за пълен патогенен

потенциал на вирусите в животните се изисква проявление на гликопротеин Е гена, но не се изисква за растеж на тъканна култура CKritas et al., Invasion and Spread of Single Glycoprotein Deleted Mutants of Aujeszky’s Disease Virus (ADV) in the Trigeminal Nervous Pathway of Pigs After Intranasal Inoculation, 50 Vet. Micobiol. 323-334 (1994); Kritas et al., Role of Envelope Glycoproteins gl, gp63 and gill in the Invasion and Spread of Aujeszky’s Disease Virus in the Olfactory Nervous Pathway of the Pig, 75 J. General Virol. 2319-2327 (1994)).

Напоследък, гликопротеин Е генно-заличените мутанти на псевдорабен вирус и инфекциозен волски ринотрахеитен вирус представляват голям интерес, породен от тяхната приложимост като диференциални маркиращи ваксини. Понастоящем, маркиращата ваксина със заличен гликопротеин Е се използва за извличане на инфекциозен волски ринотрахеитен вирус в Европа. Този щам на маркиращата ваксина със заличен гликопротеин Е в Европа обаче, е лишен от /?-галактозидазен маркер, което позволява да се използват методи за in situ хистохимична детекция за откриване на ензимната активност на /?-галактозидазата и in situ хистохимични методи или имуномаркиращи методи за откриване на /?-галактозидазен протеин. Кодиращата област на /?-галактозидазата служи също и като генотипичен маркер на • ·· ·· ··»· ·· * ···· ·· · ···· • ···· · · · • · · · й · ··· · • · ··· ··· ··· ···· ·· · ·· ··· рекомбинантния вирус. Този вирус може лесно да бъде открит посредством хибридизация с петно Southhern и посредством PCR тестове може да бъде определена генетичната чистота на ваксинния вирус от необлагородения вид. Следователно, това, което е необходимо, е авирулентен щам на инфекциозен волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин Е, съдържащ подходящ фенотипичен/хистохимичен/генотипичен /?-галактозида зен маркер.

Техническа същност на изобретението

Рекомбинантният волски херпесвирус BHV-1 С gEA3.1IBR/?? е конструиран с широко скроени рамки на гликопротеин Е CORF) и включва част от заличени генно-кодиращи последователности на гликопротеин Е и на тяхно място, вмъкнат химерен репортер/маркер ген. Вмъкнатият β-галактозидазен C/?-gal) ген не играе регулираща роля при репликирането на вируса, а служи като фенотипичен маркер за gEA3.1lBR/3 вируса.

За да се конструира този рекомбинантен волски херпесвирус BHV-1, кодиращата област на гликопротеин Е гена на волския херпесвирус, се клонират фланговите насочени нагоре и насочени надолу последователности. За да се осъществи заличаване в кодиращата област на гликопротеин Е гена на волския херпесвирус, горната клонирана деоксирибонуклеинова киселина се усвоява с подходящи ензими за освобождаване на две * ·· ·♦···· ·· • · · е · · · ··· • · · · · · · • · · · · · ··« • · · · · · · ······· ·· · 9 9 9 трети амино то тази област и свързване към β-галактозидазен ген. Полученият плазмил на деоксирибонуклеинова киселина се свързва с деоксирибонуклеинова киселина с пълна дължина, необлагороден щам на инфекциозен волски ринотрахеитен вирус Cooper в MDBK клетките. Рекомбинантните вируси с изразена βгалактозидаза Ссини плаки? се пречистват от плаки и се ана

лизират посредством петниста хибридизация за генно охарактеризиране и посредством емуномаркиране за реактивоспособност спрямо пептидно поликлонално антитяло на гликопротеин Е гена на волския херпесвирус при запий. Един рекомбинантен вирус, gE&3.1IBR/3, се охарактеризира in. vitro за растежни свойства и in vivo при телета за патогенни свойства. Способността на рекомбинантния вирус да индуцира антитела, неутрализиращи волския херпесвирус в заразени телета, се изследва посред ством тестове за понижаване на плаката.

Регулирането и проявлението на химерния /?-галактозидазен ген са уникални за този рекомбинантен волски херпесвирус в две направления. Първият уникален аспект на този рекомбинантен вирус се отнася до това, че /3-галактозидазният ген се регулира посредством силен човешки цитомегаловирус с непосредствено близък CHCMV-IE) промотор Сне посредством регулираща последователност, получавана от волския херпесвирус?. Вторият уникален аспект на този рекомбинантен вирус се отнася до това, че /?-галактозидазният ген се изразява като генно кодиран волски херпесвирус, както в ранната, така и в късна7 та Фази на инфекцията. Ire vitro и in vivo свойствата на този рекомбинантен вирус със заличен гликопротеин Е се анализира посредством сравняване с изходния щам на инфекциозен волски ринотрахеитен вирус Cooper.

При опитити с тъканна култура, вирусът gEA3.1IBR/? нараства до по-нисък титър, отколкото необлагородения вид Сизходен щам Cooper) в по-ранните времена след инфектирането, а в по-късните времена на инфекцията рекомбинантният вирус нараства до почти еднакъв титър с този на необлагородения вид щам. Рекомбинантният вирус обикновено развива значително помалки плаки в сравнение с изходния необлагороден вид щам Cooper. Възможно е това да се дължи на липсата на разпрост ранение на вируса от клетка в клетка и е в съгласие с резултатите за другите херпесни вируси.

При опитите с животни, заразените с gEA3.1IBR/3 телета се размножават приблизително 100 пъти по-малко в сравнение с тези, заразени с вируса на изходния необлагороден вид щам Cooper, докато трае разпространението на вируса. Продължителността на разпространение на вируса е също с два дни пократка за телетата, заразени с gEA3.1IBR/3. Докато телетата, заразени с вируса gEA3.1IBR/? остават здрави, телетата, заразени с вируса на изходния необлагороден вид щам Cooper показват както типични симптоми на инфекциозния волски ринотрахеитен вирус BHV-1, така и увреждания. Резултатите от се румното неутрализиране показват, че при заразените телета, и ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· · ·· необлаг©роденият вид, и инфекциозният волски ринотрахеитен

вирус със заличен гликопротеин Е, индуцират сравнимо, неутрализиращо волския херпесвирус BHV-1 антитяло. В литературата се съобщава, че инфекциозния волски ринотрахеитен вирус със заличена тимидинкиназа СТЮ нараства както in vitro, така и in vivo със значително по-нисък титър СChowdhury, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet.

Microbiol. 13-23 (1996)). Взети заедно, тези резултати пока-

зват, че дори рекомбинантният вирус gEA3.1IBR/3 расте относително бързо в сравнение с инфекциозния волски ринотрахеитен вирус със заличена тимидинкиназа, така че вирус gEA3.1IBR(? действително е авирулентен за телетата. Отслабените свойства на рекомбинантния вирус gEA3.1IBR/3 са сравнени със свойствата, показани посредством: 13 заличаване на тимидинкиназа във волския херпесвирус, както е показано в Chowdhury, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996); 2? заличаване на гликопротеин Е в псевдорабен вирус, както е показано в Kritas et al., Invasion and Spread of Single Glycoprotein Deleted Mutants of Aujeszky’s Disease Virus (ADV) in the Trigeminal Nervous Pathway of Pigs After Intranasal Inoculation, 50 Vet. Micobiol. 323-334 (1994); Kritas et al., Role of Envelope Glycoproteins gl, gp63 and gill in the Invasion and Spread

• ·· ·· · ·	·· • ·	···· •	·· · • · · ·	9
• ·	• ·	•	• · ·
··· ····	··	•	• · · · ·

of Aujeszky’s Disease Virus in the Olfactory Nervous Pathway of the Pig, 75 J. General Virol. 2319-2327 (1994); и 33 ваксина в Европа срещу инфекциозен волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин, както е показано в Kaashoek et al., An Inactivated Vaccine Based on a Glycoprotein ENegative Strain of Bovine Herpesvirus 1 Induces Prospective Immunity and Allows Serological Differentiation, 13 Vaccine 342-346 (1995); Van Englenburg et al., A Glycoprotein E Deletion Mutant of Bovine Herpesvirus 1 Infects the Same Limited Number of Tissues in Calves as Wild-Type Virus, but for a Shorter Period, 76 J. Gen. Virol. 2387-2392 (1994).

Това изследване показва, също така, че заличаването на гликопротеин Е ORF последователностите и вмъкването на Функционален /9-галактозидазен ген на мястото на гликопротеин Е на вируса, стабилно отслабва действието на вируса. Практическо приложение на този вирус е неговото използване като животоспасяваща ваксина, насочена срещу инфекциозен волски ринотрахеитен вирус. Заличаването на генния гликопротеин Е служи като имунологичен маркер за отличаване на ваксинираните животни от заразените животни. Още повече, продуцирането на β-галактозидаза позволява лесна оценка на възпроизвеждането на вируса gEA3.1IBR/3 в носния епителиум на ваксинираните животни в сравнение със сега използвания в Европа щам на ваксината със заличен гликопротеин Е, при които липсва този Фенотипичен /?-галактозидазен маркер, както и различаването от инфекцията причинена от необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус.

Описание на приложените фигури

На фигура 1 е показана диаграма на конструкцията на волски херпесвирус BHV-1 сьс заличен гликопротеин CgEA3.1IBR/33 и векторното вмъкване/заличаване на плазмид, съдържащ функционален β-галактозидазен ген, заместващ гликопротеин Е кодиращата област на крайните две трети амино.

На фигура 2 е показано възпроизвеждането на Southern петнистата хибридизация при очакваното заличаване на гликопротеин Е кодиращата област и вмъкването на последователности от /?-галактозидаза на мястото на гликопротеин Е.

На фигура 3 е показан волски херпесвирус BHV-1 с открит гликопротеин Е в необлагородения вид изходен щам Cooper, но не открит в рекомбинантния вирус С gEA3.1IBR/33 със заличен гликопротеин Е.

На Фигура 4 е представена графика, която илюстрира резултата от едноетапния растежен експеримент, при сравняване на скоростта на растеж на инфекциозния волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин Е със скоростта на растеж на инфекциозния волски ринотрахеитен необлагороден вид вирус в MDBK клетките, като всяка точка отговаря на среден резултат, получен за всяка група телета.

iHiilllitMiMMl ·· ···· • · · • · Ф

• ···· • · ·· фигура 5 представлява графика, сравняваща дневните клинични резултати за телета, заразени с инфекциозния волски ринотрахеитен вирус сьс заличен гликопротеин Е с дневните клинични резултати за телета, заразени с необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус като всяка точка отговаря на среден резултат, получен за всяка група телета.

фигура 6 представлява графика, сравняваща дневните ректални температури за телета, заразени с инфекциозния волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин Е с дневните ректални температури за телета, заразени с необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус като всяка точка отговаря на среден резултат, получен за всяка група телета.

фигура 7 представлява графика, сравняваща вирусния секрет от носа наа телета, заразени с инфекциозния волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин Е с вирусния секрет от носа на телета, заразени с необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус като всяка точка отговаря на среден резултат, получен за всяка група телета.

Примери за изпълнение на изобретението

В следващите примери е описана конструкция на инфекциозния рекомбинантен волски херпесвирус BHV-1 със заличена кодираща област на природния гликопротеин Е, при което действието на вируса отслабва, като на мястото на гликопротеин ♦ ♦♦ ·♦ ···· ·· ·· ♦ · ·· · · · · • · · · · · · ·· · · · ··· ··· ···· ·· · ·· Φ··

Е е вмъкнат функционален /?-галактозидазен ген, метод за имунизиране на животни срещу болести, причинени от волски херпесвирус BHV-1, при използване на рекомбинантен волски херпесвирус BHV-1 като ваксина, и метод за откриване и различаване на инфекцията, причинена от този рекомбинантен вирус и необлагородения вид вирус при животни, както генотипично, така и Фенотипично. Тези примери са дадени само за илюстрация и по никакъв начин не ограничават обхвата на настоящото

изобретение.

Пример 1

Материали и методи

При този експеримент се създава и охарактеризира рекомбинантен инфекциозен волски ринотрахеитен вирус IBRV със

заличен гликопротеин Е и вмъкната /3-галактозидаза. Конструираният рекомбинантен вирус съдържа химерен ген Сдълъг 4.5 КЮ, които заменя кодиращата област на гликопротеин Е на волския херпесвирус BHV-1. Предпочита се, химерният ген да е съставен от HCMV-IE промотор и от негови удължени последователности, свързани с кодиращите последователности на /З-г ала ктозидазния ген, които са свързани с εν₄θ полиаденилираните места. Предпочита се, кодиращите последователности на β-галактозидазата да са бактериални, обаче, счита се, че всякакви кодиращи последователности на /?-галактозидазния ген вършат работа.

• ··	·· ····
·· · ·	• · ·	• ·	• ·
• ·	• · ·	• ·
• ·	♦ · ·	• ·
··· ····	·· ·	··	• ·

За създаване и охарактеризираме на рекомбинантен волски херпесвирус BHV-1, от American Type Culture Collection се получава Cooper (Colorado-1) щам на инфекциозния волски ринотрахеитен вирус IBRV. Вирусите се размножават и титруват във волски Madin-Darby бъбречни клетки при използване на метода на Chowdhury S. I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995), даден в настоящото изобретение за сравнение. Вирусната деоксирибонуклеинова киселина се изолира посредством използване на натриев додецилсулФат и протеин К лизис, екстракция с Фенол/хлороФорм и утаяване с етанол, както е описано в Chowdhury S. I. et al., Equine Herpesvirus Type 1 (EHV-1) Induced Abortions and Paralysis in a Lipizzaner Stud.: A Contribution to the Classification of Equine Herpesviruses, 90 Arch. Virol. 273-288 (1986), като този метод е даден в настоящото изобретение за сравнение.

Антипептиден заешки поликлонален серумен волски херпесвирус BHV-1 с гликопротеин с е синтезира на базата на регионална хидропатия и антигенност. Синтезирани са остатъци, съдържащи глик©протеинов пептид 378-398, както е описано в Leung-Taek, Р. et al., The Complete DNA Sequence and the Genetic Organization of the Short Unique Region (U ) of the s

Bovine Herpesvirus Type 1 Strain (ST strain), 199 Virology 409-421 (1994), последователността и генната организация на

• ··	··	····	е·	•
·· · · • ·	• •		• а • ·	• · • ·	• а •
• · ··· ····	•	··	• · •	• · • е	• • · ·

които са дадени за сравнение в настоящото изобретение. 9флуоренилметоксикарбониловият CFMOC) химизъм, както е описан в Abdelmagid et al., Fine Mapping of Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) Glycoprotein D (gD) Neutralizing Epitopes by Type-Specific Monoclonal Antibodies and Sequence Comparison With BHV-5 gD, 206 Virology 242-253 (1995), се използва за осъществяване на синтезата на гликопротен Е пептид, които метод е даден за сравнение в настоящото изобретение. За улесняване на свързването към дефектния спрямо ключалката хемоцианин CHLH3, допълнителен независим цистеин CCD Смаркиран с С се добавя към крайния въглероден атом на пептида. 17 mer пептид (H]-TSDRLVRAVTDHTRPEC*-[OHJ се свързва към KLH и антисера се получава, както е описано в Kyte, J., Doolittle, R. F., A Simple method for Displaying the Hydropathic Character of Protein, 157 J. Mol. Biol., 105-132 (1982), които метод е даден за сравнение в настоящото изобретение.

SDS-PAGE и Western blot на лъжливи и заразени с вирус клетъчни протеини се получават при редукционни условия, както е описано в Chowdhury S. I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995) и Laemli, U.K., Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, 227 Nature (london) 680-685 (1970), който метод е даден за сравнение в настоящото изобретение.

• ·· ·· ft··· ··· • ft·· ·· ····· • ···· ··· ft ft········ • ft ······ ··· ft··· ·· · ·····

Конструирането на рекомбинантни плазмиди се осъществява чрез получаване на плазмидите pBHVlHK и pBHVIHF от Dr. W. Lawrence (U. Pennsylvania, Philadelphia, USA). Съответно, плазмидите съдържат Hindi11 и HinduI-F Фрагменти на деоксирибонуклеиновата киселина на волския херпесвирус BHV-1. 4.4 Kb Xhol/HindiII подфрагмент от плазмид pBHVlHK, съдържаш цели gD, gl и части, за предпочитане, две трети от кодиращата област на гликопротеин Е с крайна аминогрупа, се субклонира на Xhol/Hindlll местата на плазмид pGEM7Z (pBHVlgE5’). След това, 1.15 Kb HinduI/Bsu36I (с тъп край от Klenow) фрагмент от pBHVIHF, съдържащ една трета от кодиращата област на гликопротеин Е с крайна карбоксилна група и цялата US9 ORF кодираща последователност се субклонира на Hindi II/HinclI местата на плазтд pBluescript KS (pBHVlgE3‘).И накрая, за събиране на цялата кодираща област на гена на гликопротеин Е и неговите Флангови последователности, 4.4 Kb HindiIl/Xbal векторен Фрагмент на pBHVlgES, съдържаш HindiIl/Xhol Фрагмент, се клонира в HindiIl/Xbal местата на плазмид pBHVlgE3’. Полученият клон се означава като pBHVlgE5’3’.

За заличаване на кодиращата област на гликопротеин Е, деоксирибонуклеиновата киселина на pBHVlgES’3’частично се усвоява с AsuII и след това отново се усвоява за завършване с Hindlll. По-големият Фрагмент се пречиства от gel и се свързва с 4.5 Kb PstI фрагмента Сзавършен с Т4 полимераза? на pCMV/З Сполучен от Clontech, Palo Alto, СА, USA), които • ·· ·· «··· ·· · ·· · · · · · · ф * · • · · · · ··« • · · · · · ··· · • · · · · ·«· ··· ···· ·· · ·· ΦΦ· съдържа регулирани от CMV промотор /З-gal последователности. Полученият плазмид със заличен гликопротеин Е и вмъкнат /3gal, pBHVlgEA/З, е със заличени 1 КЬ последователности от деоксирибонуклеиновата киселина на волския херпесвирус BHV-1, включващи генни последователности, кодиращи първите 372 аминокиселини и вмъкнат /3-галактозидазен ген посредством регулиране от CMV промотор. /?-Галактозидазният ген се свързва накрая на вирусните 3.32 КЬ възходящи последователности Свключващи целите gD и gl генни последователности и последователности на промотора гликопротеин Е? и 1.15 КЬ нисходяши последователности Ссъдържащи една трета краен карбокси на кодиращата област на гликопротеин Е и целите последователности на US9 гена?, които се изискват за рекомбинация с вирусната деоксирибонуклеинова киселина.

За получаване на инфекциозен волски ринотрахеитен рекомбинантен вирус със заличен гликопротеин Е, линеаризпраният pBHVlgEA/? САТСС Accession No. VR-2637) и деоксирибонуклеиновата киселина на необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус Сщам Cooper) по цялата си дължина, се котрансфектират посредством липофекция в Madin-Darby волски бъбречни CMDBK) клетки. Правилното вмъкване на /3-галактозидазата на мястото на гликопротеин Е по цялата дължина на ин фекциозния волски ринотрахеитен вирус и последващото заличаване на специфичните краини последователности на волския херпесвирус BHV-1 в плазмида с възпроизвеждане на вирусна-

• ·· ·· ··»· ·· * ♦••••••е··· 4*7 • ••••••a If • · · · · * · · ··· ··♦· ·· · а» ··· та деоксирибонуклеинова киселина. Специфичната крайна последователност на вируса става част от новосинтезпраната вирусна деоксирибонуклеинова киселина, осигурявайки заличаване в кодиращата област, както и вмъкване в същата област. Рекомбинантните вируси, изразяващи /3-галактозидаза, се пречистват трикратно от плаки посредством сканиране за сини плаки, при Bluo-Gal наслояване, както е описано в Chowdery, S. I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996), които метод е даден в настоящото изобретение. След това, посредством петниста хибридизация и посредством имуномаркпране с антипептиден заешки поликлона лен серум спрямо гликопротеин Е на волския херпесвирус BHV-1, се охарактеризират различни рекомбинантни изолати. Използва се метода на петниста хибридизация на Chowdery, S. I.,

Construction and Characterization of an Attenuated Bovine

Herpesvirus Type (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet.

Microbiol. 13-23 (1996), които метод е даден в настоящото изобретение. Използва се метода на имуномаркиране на Chowdhury S. I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995), които метод е даден в настоящото изобрете ние.

ф фф	99	9999		99
99 Ф 9	•	•	9	Ф	•	е Ф
• Ф	•	•	9	Ф	•
• ·	Ф	•	9	Ф	9
··· ФФФФ	99	Ф		99	99

Резултати

Анализът на деоксирибонуклеинова киселина от два рекомбинантни вируса, pBHVlgEA/? САТСС Accession No. VR-2637) и gEA3.5lBR/3, посредством Southern петниста хибридизация за очаквано заличаване и вмъкване на последователности от /?-галактозидаза на мястото на гликопротеин Е, е показан на фигура 2. Отсъствието на последователности на 1Kb AsuII-HindlII Фрагмента, кодиращи първите 372 аминокиселини на аминовиия край на гликопротеин Е и присъствието на последователности от /3-галактозидаза в изолатите от gEA3.1IBR/? и gEA3.5lBR/3 показват, че очакваната рекомбинация се осъществява на специфичен по отношение на мястото начин за тези изолати. В съгласие с установеното досега, 92-95 КЬ гликопротеин Е на волския херпесвирус BHV-1 се открива в необлагородения вид изходен щам Cooper с помощта на антипептиден заешки поликлонален серум спрямо гликопротеин Е на волския херпесвирус BHV-1, но липсва в рекомбинантния вирус gEA3.1IBR/3 със заличен гликопротеин Е. Този резултат е показан на фигура 3 и този изолат се използва за по-нататъшно изследване. Още повече, gEAO.lIBR/? може отново да бъде превърнат в необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус посредством котрансфекция с плазмид, включващ крайни последователности и изходна последователност от гликопротеин Е от необлагородения вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус. Това в значителна степен обръща процеса на котрансфекция, използван за

• ·· • ·	·· ···· • · · • · ·	·· • · • ·	··
• ·	• · ·	• ·
·· ····	• е ·		··

получаване на gEA3.1IBR/3.

Кинетиката на проявлението на /3-галактозидазата в

Madin-Darby волски бъбречни CMDBK3 клетки, заразени с виру са, се определя хистохимично, 3, 6, 12 и 24 часа след зара

зяването. Активността на /?-галактозидазата се определя не по-рано от три часа и не по-късно от 24 часа след заразяването. Това показва, че регулираният от CMV-IE промотор β-τ&лактозидазен ген на gEA3.1IBR/3 вируса се проявява, както в ранен, така и в късен период. Оше повече, даже ако химерният ген се регулира от чужд промотор на човешкия херпесвирус HCMV-IE и съдържа невирусни последователности на /9-галактозата, както и удължители, които са чужди за /?-галактозата и за волския херпесвирус BHV-1, той се регулира и проявява като автентичен волски херпесвирусен ген. Следователно, /?-галактозидазата е чужда Сне присъства в природното състояние на волския херпесвирус BHV-1? за волския херпесвирус BHV-1, и HCMV-IE и неговите последователности са чужди и за волския херпесвирус BHV-1 и за /?-галактозидазата, които регулират/ подобряват.

Заличаването на гликопротеин Е служи като имунологичен маркер за различаване на ваксинираните животни и заразените животни. Реакцията на антителата, индуцирана от щама на ваксината, е липса на специфично антитяло за гликопротеин Е, се отличава от реакцията, индуцирана от инфекцията с необлагородения вид волски херпесвирус BHV-1, която съдържа специ·· ···· • · . . · · · ······· ·· ·

Фично антитяло за гликопротеин Е. Така заразените животни от ваксинирано стадо могат да се идентифицират и сортират. Този серологичен маркер е важен за елиминирането на волския херпесвирус BHV-1 от стадото.

Плазмидът С pBHVl gEA/D, използван за получаване на рекомбинантен вирус, и полученият рекомбинантен вирус, gEA3.1IBR/3, се прилагат с American Type Culture Collection (ATCC). Плазмидът CpBHVlgEA/?? се означава ATCC Accession No. 203607, а рекомбинантният вирус, gEA3.1IBR/3 се означава ATCC Accession No. VR-2637.

Пример 2

Материали и методи

Този експеримент определя патогенността на gEA3.1IBR/3 вируса при телета и сравнява получените резултати с патогенността на изходния щам Cooper на инфекциозния волски ринотрахеитен вирус. Десет шестмесечни телета от породата Holstein, незаразени с инфекциозния волски ринотрахеитен вирус и с вируса на волска вирусна диария, се разделят безразборно на две групи СА и ВЗ, всяка включваща по пет телета. Двете групи се изолират при идентични условия. Преди експеримента всички телета са здрави и остават серонегативни до започване на експеримента.

Всяко теле от група А се инокулира през носа с реком·· ♦ ··· бинантен инфекциозен волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин Е. Всяко теле от група А се инокулира през носа с изходния щам Cooper на инфекциозния волски ринотрахеитен вирус. Ваксината съдържа 1x10 TCID от съответния вирус за животно. Пялата ваксинация се извършва ареозолно посредством пулверизатор DEVILBIS модел 50 от Delvis Co., Somerset, Pennsylvania c 2 ml ваксина за ноздра в продължение на от 30 секунди до една минута. Ежедневно, в продължение на 14 дни след ваксинирането, се провежда интензивно клинично наблюдение на всички телета. Всеки ден се отчитат ректалните температури. Особено внимание се отделя на следните условия: поведение Сдепресия?, апетит, кашляне, секрети от очите и носа, хиперемия или увреждане на носната и устната лигавици, конюнктивит и ненормално дишане. Всяко условие се отчита ин дивидуално и ежедневните клинични данни за всяко теле, както и средните дневни клинични резултати за всяка група, се обработват компютърно като се прибавят всички резултати за всяко условие. Параметрите са следните:

Секрет от носа: Нормален=0; Умерено сериозен=1; Тежко сериозен=2; Леко микропурулентен=2; Умерено микропурулентен=3; и Тежко микропурулентен=4

Поведение Сдепресия?: Няма=0; Меко=1; Умерено=2; Тежко=3

Хиперемия/зачервяване на лигавицата на носа=1

Язви на лигавицата на носа=2 · -...... - ^; ?ЖТОИдИ| . ........ .··, ·· · : :: . · ^;

Z * · · · · ’ ··· ···· ·· · ··

Конюнктивит=2

Кашляне=2

Затруднено дишане=2

Дневна ректална температура: 39. 7-39.99°С=1; 40.0-40.5°С=2;

40.6-41.0°С=3; над 41.0°С=4.

Резултати

Телетата от група В, заразени с изходния щам Cooper на инфекциозния волски ринотрохеитен вирус Снеоблагороден вид инфекциозен волски ринотрахеитен вирус2), показват типични признаци на инфекция: депресия, понижен апетит, секрети от носа и очите, язви на носа/плаки в носа и кашляне. Тези клинични резултати, получени в разстояние на няколко дни, са представени на фигура 5. Телетата, заразени с рекомбинантния gEA3.1IBR/9 вирус Сгрупа АЗ, обаче, не показват никакви клинични признаци Ссъщо показано на фигура 53 и тяхното поведение и апетитът остават нормални. На фигура 6 са сравнени средните ректални температури на телетата от всяка група СА и ВЗ. В продължение на няколко дни са регистрирани високи ректални температури от 39.7°С - 40. 5°С за телета, заразени с изходния щам Cooper Сгрупа ВЗ. Ректални температури, повисоки от 38.9°С никога не са измервани за телета, заразени с gEA3.1IBR/5 Сгрупа АЗ.

• Ф ···· • ···· • · · · фф ф ··

Пример 3

Материали и методи

При този експеримент се сравнява кинетиката на растежа на gEA3.1IBR/? вируса в MDBK клетките и изходния инфекциозен волски ринотрахеитен вирус от щама Cooper в MDBK клетките. Серия от репликирани култури на MDBK клетки се заразяват по-

отделно с пет образуващи плаки звена CPFU)/клетки или от рекомбинантен gEA3.1IBR/3, или от изходен щам Cooper. Заразените култури се обират през подходящи интервали след заразяването и вирусът се извлича за използване при анализа за титруване на вируса.

Резултати

Резултатите от едноетапния експеримент за растеж са показани на фигура 4. Кривите за растежа на вируса показват, че проявленията на преждевременно развитите вируси с времето са еднакви за gEA3.1IBR/9 и за изходния щам Cooper. Рекомбинантният вирус, обаче, се проявява по-рано след заразяването.

Пример 4

Материали и методи

При този експеримент се изолира и количествено се измерва вирусът от всяко животно в групите А и В (от Пример 3 4 по-горе. Тампон от памучна лента се вкарва във всяка носна кухина. Тампонът се завърта три пъти около лигавицата. Вирусът се извлича от тампона в 3 ml срела СМЕМ, съдържаща 100 pg/ml Gentamycin, 3% об./об. FBS, Amphotericin В при 25 pg/ mD в продължение на 1 час при стайна температура. Пробите се пречистват посредством центрофугиране при 1000 g в продължение на пет минути и се съхраняват при -70°С. Изолирането на вируса в MDBK клетките се провежда при използване на 100 μΐ 1:10 разредена суспензия на тампона. Положителните вирусни проби се титруват в микротитърни плочки. Културната среда последователно се разрежда десеткратно и 50 μΐ от всеки разтвор се прибавя към всяко от осемте гнезда Св плоча от 96 гнездаЗ, съдържащи 1.5 х 10 MDBK клетки. След 5 дни при 37°С плочките се разчитат микроскопеки за цитопатичен ефект CCPED. Вирусните титри се изчисляват в ΤΟΙϋ^θ, съгласно метода на Reed, L.J. and Muench, Η., 27 Am.J.Hyg. 493 (1938), даден за сравнение.

Резултати

Количеството на вируса, изолиран от носните тампони, показва, че gEA3.1IBR/3 вирусът расте по-малко ефикасно в носните епителиалнти клетки, в сравнение с неговия изходен щам Cooper. Разпределението на вируса в носните секрети е показано на Фигура 7. Разпределението на този вирус е приблизително 15 до 550 пъти по-слабо за вируса gEA3.1IBR/? ви·· • · ·ί • ·· • · ·· • ·· • ···· ·· руса в сравнение с необлагородения вид волски херпесвирус BHV-1 Сизходен щам Cooper?. Времетраенето на разпространението на вируса е също два дни по-кратко за заразените с gEA3.1IBR/? телета, в сравнение с необлагородения вид вирус.

Пример 5

Материали и методи

При този експеримент се определят титрите на волския херпесвирус BHV-1, неутрализиращ антителата в серума на телета от групите А и В Сот Примери 3 и 4 по-горе?. Кръвни проби се взимат на тринадесетия ден след заразяването от всяко теле от двете групи А и В. Титрите на волския херпесвирус BHV-1, неутрализиращ антителата в серума, се определят по метода на понижаване на плаките при използване на плочки с 12 гнезда, както е описано от Chowdhury, S.I., et al., Molecular Biological Characterization of Equine Herpesvirus 1 (EHV-1) Isolated From Ruminant Hosts, 11 Virus Res. 127139 (1988), които метод е даден за сравнение.

Резултати

И необлагороленият вид вирус Сизходен щам Cooper) и инфекциозният волски ринотрахеитен вирус със заличен гликопротеин CgEA3.1IBR/3? , индуцират волски херпесвирус BHV-1, неутрализиращ антителата в телетата. Обаче, sera в телетата.

• ·· • · · · • · • · • · • · · · · · · заразени с необлагородения вид вирус, ·· имат слабо повишени неутрализиращи титри С1:20 - 1:35 със среден титър 1:303, в сравнение с титрите на антителата със заличен гликопротеин

С1:11 - 1:30 със среден титър 1:163.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Рекомбинантен волски херпесвирус тип I с отслабено действие, съдържащ волски херпесвирус тип I, при които част от кодиращата област на природния гликопротеин Е е заличена и е заместена с генетичен заместител, характеризиращ се с това, че споменатият заместител включва кодираща област на друг /?-галактозидазен ген, като споменатият рекомбинантен вирус проявява /3-галактозидаза в клетките-домакин.
2. Вирус, съгласно претенция 1, характеризираш се с това, че споменатият заместител, включващ човешки цитоме галовирус, е непосредствено ранен промотор и представлява подобрена последователност на споменатия човешки цитомега ловирус, който е непосредствено ранен промотор.
3. Вирус, съгласно претенция 2, характеризираш се с това, че споменатата заличена част включва около две трети от споменатата кодираща област на природен гликопротеин Е.
4. Вирус, съгласно претенция 2, характеризираш се с това, че споменатият заместител е свързан с местата за полиаденилиране.
5. Вирус, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият друг /3-галактозидазен ген се изразява като автентичен ген на волския херпесвирус тип I.
6. Вирус, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатата заличена природна кодираща област служи ·· ···· • ····· · · · :

A* · · · · · · ·,« ···· ·· · ·· ··· като генотипичен маркер.
7. Вирус, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият генетичен заместител служи като Фенотипичен маркер.
8. Вирус, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатата заличена природна кодираща област служи като имунологичен маркер.
9. Вирус, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че кодиращите последователности на споменатата /?-галактозидаза се проявява в споменатите клетки-домакин, както в ранните, така и в късните стадии на заразяването.
10. Ваксина, ефективна при индуциране на волския херпесвирус тип I, неутрализиращ антителата, характеризираща се с това, че включва рекомбинантния вирус, съгласно претенция 1.
11. Ваксина, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че споменатата заличена част включва две трети от споменатата кодираща област на природен гликопротеин Е.
12. Ваксина, съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че споменатият заместител включва човешки цитомегаловирус, като непосредствено ранен промотор и подобрена последователност на споменатия човешки цитомегаловирус, които е непосредствено ранен промотор.
13. Ваксина, съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че споменатият заместител е свързан с местата за

SV._ полиаденилиране.
14. Ваксина, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че споменатият друг /3-галактозидазен ген се изразява като автентичен ген на волския херпесвирус тип I.
15. Ваксина, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че кодиращите последователности на споменатата /?-галактозидаза се проявява в споменатите клетки-домакин, както в ранните, така и в късните стадии на заразяването.
16. Ваксина, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че споменатата кодираща област на заличения природен гликопротеин Е служи като генотипичен маркер.
17. Ваксина, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че споменатите вмъкнати кодиращи последователности на β-галактозидазата служат като Фенотипичен маркер.
18. Ваксина, съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че споменатата заличена природна кодираща област служи като имунологичен маркер.
19. Метод за различаване на животни, заразени с рекомбинантна вирусна ваксина, съгласно претенция 10, от животни носещи необлагородения вид волски херпесвирус тип 1, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

СаЗ взимане на течна проба от животното;

СбЗ анализиране на всяка проба; и

СвЗ разделяне на животните на групи според резултатите от споменатия анализ.

е· ······ • · · · * • ·· · • е · ·· • · ·· « ···· ·· · •· · •· е· •· ·· ·
20. Метод, съгласно претенция

19, етап СбЗ, характеризиращ се с това, че извършва анализ за наличие на /3-галакто зидаза.
21.

Метод, съгласно претенция

20, характеризираш се с това, че споменатото разделяне в етап СвЗ се базира на при съствие или отсъствие на проявлението на /?-галактозидаза.
22. Метод, съгласно претенция 19, етап СбЗ, характери зиращ се с това, че извършва анализ на реакцията на включено антитяло, специфично към гликопротеин Е.
23. Метод, съгласно претенция 22, характеризираш се с това, че споменатото разделяне в етап СвЗ се базира на при съствие или отсъствие на реакция на антитялото, специфично към гликопротеин Е.
24. Метод, съгласно претенция 19, етап СбЗ, характеризиращ се с това, че извършва анализ, включващ in situ хистохимични методи за откриване на ензимна активност на /?-галак тозидазата.
25. Метод, съгласно претенция 19, етап СбЗ, характеризираш се с това, че извършва анализ, включващ in situ имунохистохимични методи за откриване на протеин /?-галактозидаза.
26. Метод, съгласно претенция 19, характеризираш се с това, че споменатият анализ, съгласно етап СбЗ, включва имунен анализ за откриване на протеин /?-галактозидаза.
27. Метод, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че споменатият анализ, съгласно етап СбЗ, включва in ·· ···· situ хистохимични методи за откриване на гликопротеин Е.
28. Рекомбинантен вирус, характеризиращ се с това, че има АТСС Accession No. VR-2367.
29. Плазмид, характеризиращ се с това, че има АТСС Accession No. 203607.
30. Метод за имунизиране на говеда против волски херпесвирус тип I, характеризиращ се с това, че включва имунизиране на споменатите говеда с рекомбинантна вирусна ваксина, съгласно претенция 10.