CN101353670B - 牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株、其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组转移载体，其构建方法。本发明还公开了用该重组转移载体与IBRV基因组DNA共转染后所得到的重组毒株IBRV46。本发明重组转移载体中gE基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表达盒。本发明重组毒株可用于制备预防和治疗传染性鼻气管炎病毒的疫苗。也可制备成诊断试剂，按照常规的分子生物学方法或血清学方法，将gE基因缺失毒株的感染与野毒株的感染加以区分。此外，还可以进一步将其进行改构或将其非必需基因缺失，得到突变毒株并进一步制备成疫苗等。

Description

牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株、其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种重组毒株，尤其涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株，该重组毒株的构建方法。本发明还涉及该重组毒株作为牛传染性鼻气管炎病毒疫苗、诊断试剂或作为病毒载体用于外源基因表达的应用，属于基因工程领域。

背景技术

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，又称牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type1)，可引起的牛的以上呼吸道炎症为特征的急性接触性传染病。在临床上表现多种病型，如上呼吸道黏膜炎症、脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜脑炎、乳房炎、流产等。IBRV在牛多种细胞如鼻甲、气管、肾、睾丸、肺、皮肤细胞和兔、猪、狗、绵羊、山羊、马和人二倍体肾细胞(WI-38)培养物中生长良好，并产生细胞病变，感染细胞有核内包涵体。病毒核酸为线性双股DNA，基因组全长为135 301nt，G+C含量为72％，编码区占84％。病毒编码30～40种结构蛋白，其中有11种为糖蛋白。IBRV gE基因全长为1728bp，编码575个氨基酸残基，为病毒复制的非必需基因。

由牛传染性鼻气管炎病毒感染引起的牛传染性鼻气管炎(IBR)是引发养牛业重大经济损失的疾病之一。本病最初在欧洲发生，1930年以前随着牛的输出而传到美国，曾作为牛生殖器官感染症而蔓延，1955年Miller在美国首次报道，1956年Madin等分离到病毒，1964年Huck确认了本病毒属于疱疹病毒。本病呈世界性分布，主要经济损失在于延缓育肥牛的生长和增重及奶牛产奶量下降和流产等，对养牛业危害极大。由IBRV引发的呼吸道疾病在美国每年可造成5亿美元的经济损失，在北美则高达10亿美元。我国于1980年从新西兰进口牛中发现本病，随后在国内部分地区的农牧场及奶牛场发现均有不同程度的感染和发病。国内陈永涧(1982)、崔言顺(1999)、杨春明(2003)、肖定汉(2004)、朱远茂等(2005)等对我国部分地区牛只进行了血清学调查，发现国内牛只的IBR抗体阳性率从0.12％到66.7％不等。而肖定汉等(2005)对14个牛场在1991-1995和1996-1999年间进行的调查表明，IBR血清抗体阳性率从8.03％(114头)升高到65.4％(557头)。近年在进口牛只检疫中，广东出入境检疫局罗琼等(2005)检测了5000多只澳大利亚进口种牛，其中1505头血清样品呈现IBR抗体阳性，并有两头分离到病毒。由此可知，国内无IBRV感染的牛场受内(国内部分地区感染牛)和外来(携带病毒的进口牛只)的双重压力，该病的防治形势不容乐观。在IBR阳性率不断升高的情况下，使用IBR疫苗来防控本病的重要性已日渐突出。

Madin等于1956年首次分离出IBRV后，同年就报道了第一个减毒活疫苗，充分体现了用疫苗防控IBR的重要性，至今已开发出了多种常规的活苗和灭活苗。但这些常规疫苗都存在致潜伏感染、散播病毒、无法区别野生毒与疫苗毒等缺点，已逐步被安全性更好的基因缺失标记疫苗所替带。尽管现有疫苗的免疫效果令人不太满意，但一般说来，疫苗可阻止临床症状的出现和减少感染后病毒的排出。使用传统的弱毒疫苗或灭活疫苗的缺点是不能区别疫苗接种和自然感染所诱生的抗体，这样会干扰以血清学检测来消灭本病的防制措施的实施。而利用缺乏特定糖蛋白的基因缺失和亚单位疫苗，则可以解决这一问题。欧洲已于1995年开发出了gE基因缺失疫苗，利用gE-ELISA可区分自然感染和疫苗免疫牛。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)TK基因缺失苗于1984年首先在美国报道(Kit等，1990)，采用鼻内、肌肉及静脉内试用接种均无致病性，其唯一的缺点是疫苗病毒仍具有潜伏感染性。1994年澳大利亚学者Smith构建了一株BHV-1的TK基因缺失苗，肌肉接种和静脉接种后能诱导机体产生良好的免疫原性，且无明显的副作用。同年荷兰学者van Engelenburg等构建了IBRV gE单基因和gE、TK双基因缺失毒株，首次证实了gE单基因缺失就可在很大程度上降低IBRV的毒力，且病毒增殖滴度未见下降，但gE和TK双基因缺失毒株增殖滴度有一定下降。其中IBRV gE基因缺失毒株成了欧洲后来生产并应用的IBRV gE基因缺失疫苗，也就是说欧洲主要是使用IBRV gE基因缺失疫苗。此后，美国的Belknap等(1999)构建了gE、gG和US2三基因缺失毒株，免疫与攻毒试验表明该毒株可使犊牛产生良好的免疫保护。目前已有多种IBRV单基因、双基因乃至三基因缺失疫苗的问世，如美国已普遍使用IBRV TK基因缺失疫苗，荷兰于1998年5月在全国范围内启动扑灭计划，推广使用IBRV gE基因缺失疫苗。此外，欧洲的比利时也使用了IBRV gE基因缺失疫苗，启动了IBR扑灭计划(Ackermann等，2006)。牛传染性鼻气管炎病毒的第一代基因缺失疫苗是TK基因缺失疫苗，而第二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力较TK基因缺失疫苗又得到进一步降低，同时可以建立相应的血清学鉴别诊断方法。目前，IBRV gE基因缺失疫苗在欧洲已获得广泛应用(van Drunen Little-van den Hurk，2006)。

我国于1980年发现IBR后，中国兽药监察所周泰冲等(1981)研制了IBR弱毒冻干疫苗，所用种毒为IBRV Bartha-Nu/67，是由中国兽药监察所于1978年从匈牙利引进的IBRV弱毒。该种毒是目前国内进行IBR病毒中和试验所用的病毒，是国内进行IBR研究的一个参考毒株。用IBRV Bartha-Nu/67制备的弱毒疫苗接种黑白花小乳牛2周后，中和抗体滴度可达1∶8以上，符合匈牙利IBR弱毒疫苗效力检验标准。中国农业科学院兰州兽医研究所李崇华等(1988)利用从四川牦牛体内分离的IBR85-Y毒株制备了IBR油乳剂灭活苗，免疫牦牛后用ELISA可测到较高水平的抗体。但这些疫苗都未投入使用。这些都是国内早期IBR传统疫苗的研究。

在借鉴国外研究的基础上，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所张桂红等(1998)构建了IBRV TK基因缺失毒株，在TK基因缺失部位插入了LacZ表达盒，用PCR可鉴别TK基因缺失毒株与野生型毒株。牛传染性鼻气管炎病毒的TK基因缺失疫苗是第一代基因缺失疫苗，而第二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力较TK基因缺失疫苗又得到进一步降低，同时可以建立相应的血清学鉴别诊断方法。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组转移载体，该重组转移载体将gE基因的大部分序列缺失。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)重组转移载体，包括启动子、牛传染性鼻气管炎病毒基因、终止子等，该重组转移载体中gE基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表达盒。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组转移载体的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种构建上述牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组转移载体的方法，包括：

(1)按照常规方法提取IBRV基因组DNA；

(2)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，以IBRV基因组DNA为摸板，按照常规PCR方法进行扩增，得到上游同源重组臂；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，以IBRV基因组DNA为摸板，按照常规PCR方法进行扩增，得到下游同源重组臂；

(3)将所扩增的上、下游同源重组臂分别克隆于T Easy载体后测序；利用限制性内切酶AsuII与NsiI酶切正向插入的上游同源重组臂质粒，回收质粒部分；同时用HindIII与NsiI酶切正向插入的下游同源重组臂质粒，回收相应的下游同源重组臂片段；先用回收的质粒和片段进行连接，再用Klenow大片段酶补平，用T₄DNA连接酶连接，将连接产物转化感受态细菌，筛选出gE基因缺失1134bp的转移载体；

(4)将LacZ表达盒插入转移载体上游同源重组臂的下游，将下游同源重组臂定向插入LacZ表达盒的下游，即得。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组毒株。

本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组毒株(IBRV46)，该重组毒株中牛传染性鼻气管炎病毒的gE基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失。

将本发明的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组转移载体与IBRV基因组共转染后，筛选，即得。

本发明牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组毒株的微生物保藏号是：CGMCC NO.2102；分类命名是：Infectious bovine rhinotracheitis virus；保藏时间是：2007年7月6日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

本发明牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组毒株主要具有以下几方面的应用前景：

1、制备预防和治疗传染性鼻气管炎病毒的疫苗。

2、可制备成诊断试剂，按照常规的分子生物学方法或血清学方法，将gE基因缺失毒株的感染与野毒株的感染加以区别开来。这对流行病学的调查和传染性鼻气管炎病毒的预防和治疗极为重要。

3、可以进一步将其进行改构或缺失，例如，可将TK(胸苷激酶)及其它病毒非必需基因缺失，得到突变毒株并进一步制备成疫苗等。

5、将其作为外源基因的表达载体。

总之，本发明牛传染性鼻气管炎病毒gE基因缺失毒株(IBRV46)的成功构建，为IBRV gE基因缺失疫苗及鉴别诊断试剂、IBRV多基因缺失毒株构建及疫苗与IBRV表达外源基因重组病毒构建等的研究奠定了坚实的基础。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

本发明利用我国从匈牙利引进的IBRV Bartha-Nu/67弱毒株构建了IBRV gE基因缺失毒株IBRV46，该毒株的gE基因编码核苷酸包括起始密码子ATG在内的1134bp已被成功缺失(gE基因全长为1728bp)。IBRV gE基因缺失毒株IBRV46的构建过程如下：

1.IBRV基因组DNA模板的制备

参照Pignatti等报道的方法抽提IBRV基因组DNA，并略做改进。用IBRVBartha-Nu/67接种牛胎鼻甲细胞单层，待细胞出现80％病变后，用预冷的0.01M pH7.4PBS洗两遍细胞单层，刮取细胞后低速离心，将细胞悬浮于PBS中，置-70℃保存备用。取上述悬浮细胞液1ml，加入9倍DNA提取液(10mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTApH8.0，0.5％Triton X-100)，于室温作用20min后加入2M NaCl使终浓度至0.2M，4℃3400r/min离心10min。取上清液加RNase A至100μg/ml，Proteinase K至100μg/ml，SDS至0.5％，37℃水浴30min。等量酚、酚/氯仿各抽提一次，两倍无水乙醇于4℃放置20min，4℃12000r/min离心15min。70％乙醇洗2次，然后溶解于50μl TE(pH8.0)，紫外分光光度计测定病毒DNA含量。

2.gE基因缺失转移载体的构建

参照已发表的IBRV全基因组序列(Benebank登录号为NC 001847)，分别设计两对引物，用于扩增构建gE基因缺失转移载体的上下游同源重组臂。扩增上游同源重组臂的引物为：

gIF 5’-GCG CGT CGG CGA CTC AAG CCA T-3’120234～120255(SEQID NO：1)；gIR 5’-GAC CGT GTC GAC CGA AGC CGA g-3’121842～121821(SEQ ID NO：2)，扩增片段为1609bp。

扩增下游同源重组臂的引物为：gESmalF 5’-CCC CCG GGC TTT ACG TCTTTG TGC T-3’(SEQ ID NO：3)，gENsiR 5’-CCA TGC ATG GGC CGG GGC ACTACC T-3’(SEQ ID NO：4)，扩增片段为1609bp。PCR反应条件：93℃预变性3min；95℃45s，65℃45s，72℃3min，30个循环后，72℃延伸10min。取扩增产物电泳，用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆于T Easy Vector后测序。利用限制性内切酶AsuII与NsiI酶切正向插入的上游同源重组臂质粒，回收质粒部分；同时用HindIII与NsiI酶切正向插入的下游同源重组臂质粒，回收相应的下游同源重组臂片段。然后先用回收的质粒和片段进行连接，再用Klownow大片段酶补平，用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化感受态细菌，筛选出gE基因缺失的转移载体，缺失1134bp。

同时构建在gE基因缺失部分插入LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体。构建LacZ表达盒所用的引物为：LdgEF：5’-TTT TCg AAT gCT TCg CgA TgT ACg ggCCAg-3’，LdgER：5’-ATT CCC ggg gCA TCC CCA gCA TgC CTg CTA T-3’。利用pcDNA3.1(+)作为模板，用上述引物扩增带有完整CMV启动子和poly A的片段，将其克隆入T easy Vector后用HindIII与XbaI双酶切，回收质粒部分。同时用HindIII与XbaI双酶切pcDNA3.1HisLacZ质粒，回收LacZ片段，将其定向插入带有完整CMV启动子和BGA poly A片段的质粒中，获得LacZ表达盒。先利用AsuII与NsiI位点将LacZ表达盒插入gE基因缺失转移载体上游同源重组臂的下游，然后利用SmaI与NsiI位点将下游同源重组臂定向插入LacZ表达盒的下游，即获得了带有LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体。

3.转染用IBRV基因组DNA的制备

参照Morgan等(1990)报道的方法制备IBRV基因组DNA。用IBRV Bartha-Nu/67接种牛胎鼻甲细胞单层，待细胞出现80％病变后，用预冷的0.01M pH7.4PBS洗两遍细胞单层，加入细胞裂解液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0，100mMNaCl，SDS至0.5％，Proteinase K至200μg/ml)4ml(100cm²玻璃培养瓶)作用20min。然后将细胞裂解物加入10ml离心管中，在37℃下孵育3h。用等酚抽提1次，用等量酚/异戊醇(24∶1)抽提2次，加两倍无水乙醇于-20℃保存备用。用于转染时，在16℃以12 000g离心15min，用75％乙醇洗2次，每次离心5分钟。将上清液倒掉，干燥15min，用适量去离子水悬浮，于37℃下孵育1h，即可用于转染。

4.IBRV基因组的磷酸钙沉淀法转染

核酸-磷酸钙沉淀的制备：取2只1.5ml离心管，分别标记为A管和B管。在A管中分别加入2M CaCl₂、IBRV基因组DNA、线性化的转移载体质粒，最后加去离子水至300ul，其中CaCl₂终浓度为140mM，IBRV基因组DNA含量为5μg，线性化的转移载体质粒DNA含量为2μg。B管加2×HBSP(1.5mM Na₂HPO₄，10mM KCl，280mM NaCl，12mM Glucose，50mM Hepes，pH7.05)300ul。A管各成份充分混匀后，将B管溶液缓慢逐滴加入A管(约1-2分)，用吸管吹打6次后，在室温下孵育30分钟。用MEM冲洗牛鼻甲细胞单层(60mm培养平皿)2次，将上述制备的核酸-磷酸钙沉淀加到细胞单层上吸附2h。然后加入5％胎牛血清的MEM培养液，过夜。次日用0.01M、pH7.4PBS洗培养平皿1次，加25％DMSO(用1×HBSP配制)，作用4min。将DMSO吸出，用MEM洗2次，加入含2％胎牛血清的MEM培养液，继续培养。待观察到细胞病变后收取培养皿，经3次冻融后于-20℃结冻保存。

5.IBRV gE基因缺失重组病毒的筛选与鉴定

重组病毒的筛选策略是先用带有LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体质粒与IBRV基因组共转染后，利用加X-gal底物的方法进行蓝白斑筛选，首先筛选出表达LacZ基因的IBRV gE基因缺失重组病毒，即蓝斑病毒。然后制备表达LacZ基因的IBRVgE基因缺失重组病毒基因组DNA，与不带有LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体质粒共转染，筛选出不带LacZ表达盒的gE基因缺失重组病毒，即白斑病毒。筛选方法如下：

用0.2μm针式滤器将有病变的转染细胞培养液滤过，按1∶10作倍比稀释，接种MDBK细胞的24孔培养板，于37℃吸附1h，然后将病毒液吸出，每孔加0.5ml的1％甲基纤维素。待出现病变后，将甲基纤维素吸出，用MEM液洗3次，然后每孔加1％琼脂糖(含X-gal的浓度为150μg/ml)，在室温下待凝固后继续培养。根据病毒蚀斑的颜色来筛选重组病毒。用上述方法筛选到了一株gE基因缺失重组病毒，命名为IBRV46。

用PCR对重组病毒进行了鉴定，上游引物为5’-CgC gTg TgT CTT ggT TTC Tg-3’，下游引物为5’-Tgg TCg gCA AgC Tgg TgT AT-3’，从IBRV gE基因未缺失毒株DNA中可扩增出长为1668bp片段，从gE基因缺失的IBRV 46毒株中可扩增出约500bp的片段，说明gE基因已被成功缺失。用Reed-Muench法测定病毒滴度，IBRV46的TCID₅₀为10^7.3/ml，gE基因未缺失弱毒株的TCID₅₀为10^7.5/ml，病毒滴度未见下降，符合制备疫苗的要求。

                     序列表

Claims (4)

1.一种牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus)重组毒株IBRV46，其特征在于：其微生物保藏号是：CGMCC NO.2102。

2.权利要求1的牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株IBRV46在制备预防、治疗或诊断牛传染性鼻气管炎的药物或试剂中的用途。

3.一种预防牛传染性鼻气管炎的疫苗组合物，含有权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株IBRV46和药学上可接受的载体或佐剂。

4.权利要求1的牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株IBRV46作为外源基因的表达载体的应用。