CN105274142A - 复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。所述复制型重组人55型腺病毒载体是以同源重组技术将人55型腺病毒基因组环化，以同源重组及双抗性筛选技术敲除Ad55的E3基因，且可以整合入外源基因表达框，将E3基因缺失的Ad55载体质粒线性化后，转染哺乳动物细胞可成功拯救并大量生产，进一步经密度梯度离心得到纯化的重组Ad55载体，以该载体携带外源基因可在靶细胞内实现高效表达，且外源报告基因的活性可反映病毒的生长特性。本发明基于人Ad55的复制型载体可潜在地应用于：抗人55型腺病毒疫苗研发；抗人55型腺病毒药物及中和抗体筛选；抗其他病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，其基因组约35-40kb，已知人腺病毒共7个亚群(A-G)，60多个血清型，其中3、4、7、14型感染可导致急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年来，出现了由人11型与14型腺病毒重组产生的55型腺病毒(以下简称Ad55)，因人群普遍缺乏针对这种病毒的免疫力，很容易引起呼吸道传染病疫情，尤其是入伍新兵、寄宿制学校、托幼机构等在封闭环境中生活的群体。目前，尚无针对腺病毒感染的特效治疗药物，亦无可在普通人群中使用的腺病毒疫苗。因此，构建基于Ad55病毒的复制型报告病毒，对于研发抗人55型腺病毒的疫苗、药物及中和抗体至关重要。
同时，由于Ad55尚未大规模流行，人群中针对Ad55的中和抗体阳性率较低。因此，基于Ad55的基因载体可潜在的携带抗原基因或治疗性基因在普通人群中使用。腺病毒载体具有一系列优势，包括：1.安全性，腺病毒遗传背景相对清楚，基因组不整合至宿主染色体因而不会导致插入突变，删除其E1或E3基因可进一步降低腺病毒的致病力；2.有效性，腺病毒可高效感染分裂期及静息期细胞，携带的外源基因可长期高水平表达，具备较大的容纳外源基因的能力；3.生产工艺成熟，腺病毒可在宿主细胞中复制增长到很高的滴度因而容易大规模生产，理化性状稳定因而可方便地运输、储存等。因此，腺病毒载体已广泛用作基因表达载体、重组疫苗载体和基因治疗载体等，全球范围内已有数百项临床试验以腺病毒作为基因载体，居各类载体之首(24.8％)。我国具自主知识产权的基因治疗药物今又生(重组人p53腺病毒注射液)，即使用复制缺陷型的人5型腺病毒载体。
然而，多数人体内由于既往腺病毒感染而产生一定水平的抗腺病毒免疫反应，包括抗腺病毒中和抗体和杀伤性T细胞(CTL)。研究表明非洲和南美等发展中国家和地区的人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率很高，甚至超过90％。我们的研究也表明广东地区人群中Ad5中和抗体阳性率高达75％。这些中和抗体会抑制腺病毒载体产品进入机体细胞，使其难以行使免疫或治疗功能。此外，针对腺病毒载体的CTL反应亦可杀死靶细胞而抑制治疗性基因的持续表达。
为克服预存抗腺病毒免疫反应，研究者已开发一系列技术：
1)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应。但是免疫抑制剂不具有特异性，往往带来显著的毒副作用，尤其是在免疫缺陷的人群。
2)修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开预存中和抗体。腺病毒表面蛋白经修饰或改造之后，掩盖其中和表位，从而可有效的进入靶细胞发挥生物学功能。但是，包裹的腺病毒粒子在细胞内释放效率被削弱，而改造表面蛋白的腺病毒载体使用一次即可产生新的抗载体免疫反应，不能重复使用。
3)以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术。PBMC分离并清洗之后，可经离心感染技术高效感染腺病毒载体。该技术可有效应用于经血液途径免疫或输送治疗性基因，但其应用范围有限。
4)采用在人群中流行率较低的稀有血清型腺病毒作为载体。人群中针对稀有血清型腺病毒的预存免疫反应往往较低，因而这些载体在临床中具有极大的应用潜力。
因此，基于人55型的腺病毒载体，一方面可为抗腺病毒疫苗、药物或中和抗体研究提供技术平台，另一方面也可作为肿瘤、遗传性疾病的基因治疗载体及抗其他传染性疾病如HIV、流感等的疫苗载体。
此外，腺病毒基因组长达35-40Kb，较少出现单酶切位点，在目标区域敲除特定基因或整合外源序列有一定操作难度。目前常用的技术是在目标区域找到合适酶切位点(往往并非单一酶切位点)并进行部分酶切，使部分基因组在该位点断裂，与含重组臂并带有目的序列的质粒同源重组。该技术的缺陷在于，部分酶切往往导致多数基因组质粒未被有效切开，重组克隆难以通过抗性筛选高效获得。因此，本发明开发了一种基于基因组部分酶切以及双抗性筛选的重组技术，使得在目标区域整合入特定外源序列的操作更加简便易行。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种复制型人Ad55重组腺病毒载体及其制备方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)以人55型腺病毒基因组为模板，分别扩增人55型腺病毒基因组两端反向重复序列(ITR)作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A(即pAd55)；
(2)以Ad55基因组为模板，扩增人55型腺病毒E3区两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B(即pAd55ΔE3-Kana)；
(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的步骤(2)所述基因组质粒B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒，并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。
或者，一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)以人55型腺病毒基因组为模板，分别扩增人55型腺病毒基因组两端ITR区序列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A(即pAd55)；
(2)以Ad55基因组为模板，扩增人55型腺病毒E3区两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与如步骤(1)所述环化的基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B(即pAd55ΔE3-Kana)；
(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的基因组质粒B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒；
(4)将Ad55基因的E3区两端序列连接至卡那抗性载体，并将外源序列插入至E3区两端序列之间，构建携带外源基因表达框的穿梭质粒，再与线性化后的基因组质粒C同源重组，在原E3区整合唯一酶切位点，得到E3区缺失并整合外源序列的基因组质粒，线性化后再转染哺乳动物细胞，离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。
在其中一个实施例中，所述步骤(1)为：
以Ad55基因组为模板，PCR得到Ad55基因组两端ITR区序列的重组臂L-arm及R-arm；
L-arm连接至pUC载体得到pUC-L；R-arm以EcoRI+XbaI双酶切后连接至EcoRI+XbaI双酶切的pUC-L得到环化穿梭质粒pUC-(L+R)；
pUC-(L+R)以BamHI+EcoRI线性化后，与Ad55基因组共转化感受态细胞，得到pAd55质粒。
在其中一个实施例中，所述步骤(2)为：
以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delE3及R-delE3；
L-delE3以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delE3；R-delE3以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)；
pVax-delE3(L+R)以EcoRI线性化，pAd55以EcoRI经部分酶切线性化，共转化感受态细胞，涂至氨苄、卡那双抗性平板，提取阳性克隆继续转化感受态细胞，得到去除E3基因并在E3区引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒pAd55ΔE3-Kana。
在其中一个实施例中，所述步骤(3)为：
以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delK及R-delK；
L-delK以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI酶切的pVax载体得到pVax-L-delK；R-delK以EcoRV+XbaI双酶切后连接至EcoRV+XbaI双酶切的pVax-L-delK得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax-delK(L+R)；pVax-delK(L+R)质粒以SpeI+XbaI酶切，回收delK(L+R)片段；pAd55ΔE3-Kana以SwaI线性化；delK(L+R)片段和线性化的pAd55ΔE3-Kana共转染感受态细胞，同源重组得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒。
在其中一个实施例中，所述步骤(4)为：
以pVAX质粒为模板，PCR得到VAX骨架；
以Ad55基因组为模板，PCR得到E3区上下游同源重组臂SE3L及SE3R；
Vax骨架以SpeI切，SE3L以XbaI切后加磷酸化，连接得到p-SE3L；pSE3L以SpeI+EcoRV切，SE3R以SpeI切，连接得到pSE3LR；
将外源基因表达框连接得到pSE3LR，得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒；
携带外源基因表达框的目标穿梭质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd55ΔE3以SwaI线性化后乙醇沉淀回收；共转化感受态细胞，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd55ΔE3-外源基因表达框质粒。
本发明还提供了所述制备方法得到的复制型重组人55型腺病毒载体。
本发明还提供了上述的复制型重组人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒药物或中和抗体的应用。
本发明还提供了上述的复制型重组人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒的疫苗中的应用。
本发明还提供了上述的复制型重组人55型腺病毒载体在生物学报告示踪系统中的应用。
本发明提供了一种Ad55的复制型重组腺病毒载体的构建方法，该方法将Ad55环化形成基因组质粒，通过双抗性筛选技术敲除与Ad55毒力相关的E3基因，并可在E3区整合外源基因表达框。本发明所得到的该重组载体能够在293、A549、Vero等但不仅限于这些细胞系中能够复制扩增并大量生产，并可以密度梯度离心技术浓缩纯化，该重组载体还可在靶细胞内高效表达外源基因。此外，本发明涉及的双抗性筛选技术亦可应用于Ad55或其他腺病毒特定基因的敲除。由于Ad55是稀有血清型腺病毒，本发明所述该重组载体可作为疫苗或基因治疗载体可有效突破人群中普遍存在的抗腺病毒预存免疫，提升疫苗或基因治疗的效果，此外还可以应用于药物及中和抗体的研发，以及用作报告示踪系统等。
附图说明
附图1是Ad55基因组环化的过程示意图，及环化穿梭质粒、pAd55基因组质粒的酶切鉴定结果。
附图2是双抗性筛选技术敲除pAd55中E3基因的原理，及敲除E3穿梭质粒、pAd55ΔE3-Kana质粒的酶切鉴定结果。
附图3是敲除pAd55ΔE3-Kana中Kana基因的过程示意图，以及敲除卡那基因穿梭质粒、pAd55ΔE3质粒的鉴定结果。
附图4是构建携带外源基因表达框的pAd55ΔE3质粒的过程示意图及酶切鉴定结果。
附图5是Ad55ΔE3等重组Ad55病毒的生产及纯化结果。
附图6是Ad55ΔE3-EGFP感染293细胞之后的噬斑形成结果。
附图7是Ad55ΔE3-SEAP、Ad55ΔE3-Luci以不同剂量感染293细胞之后的外源基因表达结果。
附图8是Ad55ΔE3免疫小鼠后产生抗Ad55中和抗体的检测结果。
具体实施方式
本发明公开一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备技术，本发明还公开敲除腺病毒特定基因的双抗性筛选技术。本发明所述腺病毒载体的制备方法和构建思路适用于针对腺病毒及其他病原体疫苗的研发，抗腺病毒药物及中和抗体的筛选，以及生物学研究中的报告示踪系统。本发明还可应用于在腺病毒基因组中定点敲除其他特定序列的相关技术。
本发明术语“人55型腺病毒”指本领域普通技术人员已知的55型腺病毒，实施例中用到的Ad55基因组也来源于这些已知的人55型腺病毒。本发明所述复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用，并不局限于本发明实施例所采用的目前已经的人55型腺病毒。不局限于本发明实施例所采用的特定临床分离株。
本发明术语“双抗性筛选技术”是指经同源重组在腺病毒基因组质粒特定区域整合包含第二种抗性基因的外源片段，而不局限于实施例所优选的抗性基因，也不局限于实施例所敲除的E3区域。本领域普通技术人员应当理解并熟练掌握该操作原理，并理解该技术亦可应用于其他血清型腺病毒基因的敲除。
本发明术语“外源序列”是指非55型腺病毒来源的任何DNA序列。本领域普通技术人员应当理解，外源序列可以是外源基因表达框，也可以是shRNA或miRNA的表达框等。
在以下实施例中，根据本领域技术人员的理解，外源基因表达框的表达框转录方向与L4基因转录方向可以一致或相反。外源基因表达框，可包含真核启动子、外源基因编码序列、转录终止子。所述外源基因编码序列可以是但不仅限于绿色荧光蛋白、分泌型碱性磷酸酶、荧光素酶、其他病毒抗原、shRNA等的编码序列。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
实施例1：Ad55基因组的环化以及pAd55基因组质粒的构建。
1.环化穿梭质粒的构建。
以Ad55基因组为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到重组臂L-arm及R-arm。
L-arm引物序列：
L-armF，AAGCTTGCGATCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG；1(SEQIDNO.1)L-armR，TCTAGATGATCTGAATTCAGTATTTCGTTTCCAGTCTCAGC(SEQIDNO.2)。
L-arm扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；57℃，30秒；72℃，40秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为700bp。
R-arm引物序列：
R-armF，ATGGAATTCACAGATGGATCCAGCATGAATAATTCTTGA(SEQIDNO.3)；
R-armR，ATTTCTAGAGCGATCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGAT(SEQIDNO.4)。
R-arm扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，40秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为680bp。
L-arm连接至pUC载体(宝生物工程(大连)有限公司)得到pUC-L；R-arm以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pUC-L得到环化穿梭质粒pUC-(L+R)。
2.Ad55基因组环化得到pAd55基因组质粒。
pUC-(L+R)以BamHI+EcoRI线性化后，与Ad55基因组共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd55基因组质粒。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如附图1所示。
所得到的pAd55质粒中的腺病毒基因组末端引入2个AsiSI酶切位点，以AsiSI酶切线性化pAd55质粒可释放出腺病毒基因组末端。
实施例2：Ad55E3基因的敲除及pAd55-E3-Kana质粒的构建。
1.E3基因敲除穿梭质粒的构建。
以Ad55基因组为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delE3及R-delE3。
L-delE3引物序列：
L-delE3F，GGTGAATTCTTTGTGGAGGAGTTTACTCCCTCTG(SEQIDNO.5)；
L-delE3R，GATACTAGTATTTAAATAGGAAAAGTTTCGTTCTTCTGGTTG(SEQIDNO.6)。
L-delE3扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；63℃，30秒；72℃，30秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为500bp。
R-delE3引物序列：
R-delE3F，GATTCTAGATTTAAATGGACTAAGAGACCTGCTACCCATG(SEQIDNO.7)；
R-delE3R，TGTGAATTCCAGTCTTAACAAGTGGTGTGGTGG(SEQIDNO.8)。
R-delE3扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，20秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为400bp。
L-delE3以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体(Invitrogen)得到pVax-L-delE3；R-delE3以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)。
2.双抗性筛选法得到敲除E3基因的pAd55ΔE3-Kana质粒。
pVax-delE3(L+R)以EcoRI线性化，pAd55以EcoRI部分酶切，部分酶切体系及条件为：pAd55质粒，5微克；EcoRI酶，1微升；10*H缓冲液，5微升；去离子水，39微升；配制3个体系，分别在37℃孵育1分钟、5分钟、10分钟；然后以乙醇沉淀法回收。线性化的pVax-delE3(L+R)及部分酶切的pAd55质粒共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)，涂至氨苄、卡那双抗性平板，能够生长的克隆即为阳性克隆。手工提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)，手工提取质粒并进行酶切鉴定，得到去除E3基因并在E3区引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒pAd55ΔE3-Kana。穿梭质粒的构建及双抗性筛选的示意图及结果如附图2所示。
实施例3：卡那抗性基因的敲除及pAd55ΔE3质粒的构建。
1.卡那抗性基因敲除的穿梭质粒的构建。
以Ad55基因组为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delK及R-delK。
L-delK引物序列：
L-delKF，GGTACTAGTTTTGTGGAGGAGTTTACTCCCTCTG(SEQIDNO.9)；
L-delKR，GATGAATTCATTTAAATAGGAAAAGTTTCGTTCTTCTGGTTG(SEQIDNO.10)。
L-delK扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；63℃，30秒；72℃，30秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为500bp。
R-delK引物序列：
R-delKF，GATATCATTTAAATGGACTAAGAGACCTGCTACCCATG(SEQIDNO.11)；
R-delKR，TGTTCTAGACAGTCTTAACAAGTGGTGTGGTGG(SEQIDNO.12)。
R-delK扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，20秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为400bp。
L-delK以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体(Invitrogen)得到pVax-L-delK；R-delK以EcoRV+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delK得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax-delK(L+R)。
2.去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒的构建。
pVax-delK(L+R)质粒以SpeI+XbaI酶切，回收delK(L+R)片段；pAd55ΔE3-Kana以SwaI线性化；参照实施例1中所述方法共转染BJ5183(Stratagene)，同源重组得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒。具体构建过程及鉴定结果参见附图3。
实施例4：携带外源基因的穿梭质粒及pAd55ΔE3-EGFP等重组Ad55腺病毒基因组质粒的构建。
1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK553-EGFP。
1)以pVAX质粒(Invitrogen)为模板，以下列引物PCR得到VAX骨架：
VaxF，GATATCCACCGGCGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGAC(SEQIDNO.13)；
VaxR，TAATAACTAGTCAATAATCAATGTCAACGCG(SEQIDNO.14)。
扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；63.5℃，30秒；72℃，2分钟；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为2000bp。
2)以Ad55基因组为模板，以下列引物PCR得到E3区上下游同源重组臂SE3L及SE3R：
SE3L引物序列：
SE3LF，GGTTCTAGAGTATACGTCCAAATGACTAATGCAGGTGC(SEQIDNO.15)；
SE3LR，GATGAATTCACTAGTAGGAAAAGTTTCGTTCTTCTGGTTG(SEQIDNO.16)。
SE3L扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，30秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为510bp。
SE3R引物序列：
SE3RF，AGAACTAGTACATGTGATATCGGACTAAGAGACCTGCTACCCATG(SEQIDNO.17)；
SE3RR，CTTTGGGTGAAGCCATTTGGGG(SEQIDNO.18)。
SE3R扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，30秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为506bp。
3)构建携带重组臂的穿梭质粒pSE3LR。
Vax骨架以SpeI切，SE3L以XbaI切后加磷酸化，连接得到pSE3L；pSE3L以SpeI+EcoRV切，SE3R以SpeI切，连接得到pSE3LR。
4)构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK553-EGFP等。
以pGA1-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。
CMV，AGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG(SEQIDNO.19)；
BGH，GCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG(SEQIDNO.20)。
扩增程序：95℃,5分钟；95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，1分钟45秒；循环25个；72℃，5分钟；12℃，∞。扩增产物为1737bp。
pSE3LR以SpeI+EcoRV切，CMV-EGFP-BGH以SpeI切，连接得到目标穿梭质粒pGK553-EGFP。
按照常规方法，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、荧光素酶(Luciferase，简称以下Luci)基因分别以PCR得到，以HindIII+XbaI切；pGK553-EGFP以HindIII+XbaI切后回收载体；分别连接得到pGK553-SEAP、pGK553-Luci。
2.构建携带外源基因表达框的基因组质粒pAd55ΔE3-EGFP等。
如实施例3所述同源重组流程，pGK553-EGFP质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd55ΔE3以SwaI线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd55ΔE3-EGFP质粒。pAd55ΔE3-SEAP、pAd55ΔE3-Luci构建过程类似。具体构建过程及鉴定结果参见附图4，pAd55ΔE3-EGF、pAd55ΔE3-SEAP、pAd55ΔE3-Luci以HindIII酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳得到完全符合预期的DNA条带。
实施例5：Ad55ΔE3病毒的拯救与生产
pAd55ΔE3以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，转染293细胞。转染体系及过程为：线性化的pAd55ΔE3质粒4微克，Lipo2000脂质体8微升，分别与400微升Opti-MEM培养基混匀；5分钟后，将两种体系混合，混匀，避光静置20分钟；六孔板中的293细胞长至六成满，吸走培养基，以PBS漂洗两次，加入转染体系，37度培养箱孵育8小时；吸走转染体系，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，37度培养箱孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次，离心去除细胞碎片；上清感染10厘米皿中长至八成满的293细胞；2-3天后，收集细胞及培养上清，在在37度水浴及液氮中反复冻融3次，离心去除细胞碎片；上清感染6-10个15厘米皿中长至八成满的293细胞；2-3天后，收集细胞，在37度水浴及液氮中反复冻融3次，离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管(氯化铯的密度梯度为)；4℃,35000转，离心4小时；吸出病毒条带，经过柱法脱去病毒液中的盐分，洗脱，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒粒子浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。Ad55ΔE3的生产及纯化结果如附图5所示，经密度梯度离心后，可见产生两个病毒条带，其中上层条带为病毒粒子空壳，下层条带为完整病毒粒子；取下层条带过柱纯化，得到纯化的病毒粒子；并通过测定纯化病毒样品在260nm、280nm的吸光值，推算出病毒粒子数。
实施例6：Ad55ΔE3-EGFP病毒的拯救及噬斑形成实验。
按照实施例5所述方法拯救并生产Ad55ΔE3-EGFP病毒，并在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成。六孔板中293细胞长至九成满后，以1X107Vp感染。感染后4小时，吸走培养基，并铺上1％的琼脂糖凝胶。37℃培养箱内放置5、7、9天后，在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成与生长。结果如附图6所示。Ad55ΔE3-EGFP病毒感染293细胞后可高效表达EGFP蛋白，因此，Ad55ΔE3-EGFP可潜在的用于标记被Ad55病毒感染的特定细胞群。
实施例7：Ad55ΔE3-SEAP、Ad55-LuciΔE3病毒的拯救及外源基因表达鉴定。
按照实施例1-5所述方法拯救并生产Ad55ΔE3-SEAP、Ad55ΔE3-Luci病毒，SEAP及Luci的表达及检测过程如下：
1.Ad55ΔE3-SEAP的感染及表达检测。
293细胞铺至96孔板，36小时后长至九成满；Ad55ΔE3-SEAP以无血清无酚红培养基稀释至5X105、5X106、5X107、5X108vp/ml，取200微升加至96孔板；37℃培养箱内放置24小时后，每孔取50微升培养上清，加至96孔黑色板；以AppliedBiosystem公司的phospha-lightTMsystem进行检测，在上述96孔黑色板中加入AssayBuffer50微升，混匀，静置5分钟；加入CSPD(1:33.33)稀释液50微升/孔，混匀，锡箔纸遮掩避光30min；在在荧光照度计上读取发光值。同时，以Ad5-SEAP作为阳性对照，以Ad55ΔE3感染细胞作为阴性对照。
2.Ad55ΔE3-Luci的感染及表达检测。
293细胞铺至96孔板，26小时后长至八成满；Ad55ΔE3-Luci以含血清DMEM培养基稀释至5X105、5X106、5X107、5X108vp/ml，取200微升加至96孔板；37℃培养箱内孵育24小时后，吸走培养基，加入50微升PLB缓冲液(Promega公司的promega报告基因检测系统)；细胞裂解后，每孔取20微升至白色不透明96孔板；加入LARII缓冲液，混匀，在荧光照度计上读取发光值。同时，以Ad5-Luci作为阳性对照，以Ad55ΔE3感染细胞作为阴性对照。
SEAP及Luci的检测结果如附图7所示，两种报告基因的表达量均与病毒粒子数成正比，表明这两种病毒载体所携带的报告基因可潜在的应用于反映抗病毒中和抗体、药物对病毒的抑制作用。
实施例8：Ad55ΔE3在小鼠中免疫原性的评估。
按照附图8所示的免疫方案，对Ad55ΔE3在小鼠中的免疫原性进行了评估。
6-8日龄C57/Bl6小鼠随机分为三组，每组10只；第0天，分别免疫Ad5ΔE1ΔE3、Ad55ΔE3、甲醛灭活的Ad55ΔE3，免疫方式为肌肉注射；第21天，每组小鼠取5只，摘眼球取血并分离血清；其余五只按照初次免疫方案加强免疫1次；第35天，各组小鼠摘眼球取血并分离血清。
以实施例7所述的Ad55ΔE3-SEAP以及Ad5-SEAP作为报告病毒检测小鼠血清中抗Ad55以及Ad5的中和抗体滴度。如实施例7所述，293细胞铺至96孔板并在36小时后长至九成满；小鼠血清以无酚红无血清培养基按照1:4的比例进行梯度稀释；分别以1X107Vp的Ad55ΔE3-SEAP及Ad5-SEAP与血清共孵育，37℃培养箱内孵育1小时，加至细胞培养板；37℃培养箱内孵育24小时后，每孔取50微升培养上清，加至96孔黑色板；以AppliedBiosystem公司的phospha-lightTMsystem进行检测，在荧光照度计上读取发光值；根据读数计算中和抗体的滴度。小鼠免疫Ad55ΔE3后产生的中和抗体滴度如图8所示，Ad55ΔE3在初免后即可诱导产生抗Ad55中和抗体；而加强免疫后抗体水平显著提升；Ad55ΔE3产生的中和抗体水平显著高于灭活的Ad55病毒；抗Ad55中和抗体与抗Ad5抗体没有交叉作用。该结果不但说明Ad55ΔE3可潜在的应用于抗Ad55疫苗研发，也说明Ad55ΔE3-SEAP可用作抗Ad55疫苗或抗体的检测工具。同时，由于抗Ad5抗体对Ad55ΔE3-SEAP没有中和作用，说明基于Ad55的基因载体可潜在的突破人群中广泛存在的抗Ad5中和抗体，从而具有更加广泛的应用范围。
同理，上述复制型重组人55型腺病毒载体可应用于生物学报告示踪系统中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以Ad55基因组为模板，分别扩增基因组两端反向重复序列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A；
(2)以Ad55基因组为模板，扩增E3基因两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B；
(3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的步骤(2)所述基因组质粒B同源重组，得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒，并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：
以Ad55基因组为模板，PCR得到Ad55基因组两端ITR区序列的重组臂L-arm及R-arm；
L-arm连接至T载体得到pT-L；R-arm以EcoRI+XbaI双酶切后连接至EcoRI+XbaI双酶切的pT-L得到环化穿梭质粒pT-L+R；
pT-L+R以BamHI+EcoRI线性化后，与Ad55基因组共转化感受态细胞，得到pAd55质粒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为：
以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delE3及R-delE3；
L-delE3以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI双酶切的pVax载体得到pVax-L-delE3；R-delE3以EcoRI+XbaI双酶切后连接至EcoRI+XbaI双酶切的pVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)；
pVax-delE3(L+R)以EcoRI线性化，pAd55以EcoRI经部分酶切线性化，共转化感受态细胞，涂至氨苄、卡那双抗性平板，提取阳性克隆继续转化感受态细胞，得到去除E3基因并在E3区引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒pAd55ΔE3-Kana。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)为：
以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delK及R-delK；
L-delK以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI双酶切的pVax载体得到pVax-L-delK；R-delK以EcoRV+XbaI双酶切后连接至EcoRV+XbaI双酶切的pVax-L-delK得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax-delK(L+R)；
pVax-delK(L+R)质粒以SpeI+XbaI酶切，回收delK(L+R)片段；
pAd55ΔE3-Kana以SwaI线性化；delK(L+R)片段和线性化的pAd55ΔE3-Kana共转染感受态细胞，同源重组得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒。
5.一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将Ad55基因的E3区两端序列连接至卡那抗性载体，并将外源基因表达框插入至E3区两端序列之间，得到携带外源基因表达框的穿梭质粒；
(2)如步骤(1)所述穿梭质粒线性化后，与线性化后的如权利要求1-4任一项所述的制备方法中步骤(3)所述pAd55ΔE3质粒同源重组，得到E3区缺失并整合外源序列的基因组质粒，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法为：
以pVAX质粒为模板，PCR得到VAX骨架；
以Ad55基因组为模板，PCR得到E3区上下游同源重组臂SE3L及SE3R；
Vax骨架以SpeI切，SE3L以XbaI切后加磷酸化，连接得到p-SE3L；pSE3L以SpeI+EcoRV切，SE3R以SpeI切，连接得到pSE3LR；
将外源基因表达框连接得到pSE3LR，得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒；
携带外源基因表达框的目标穿梭质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；
pAd55ΔE3以SwaI线性化后乙醇沉淀回收；共转化感受态细胞，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd55ΔE3-外源基因表达框质粒。
7.根据权利要求1-6任一项所述制备方法得到的复制型重组人55型腺病毒载体。
8.权利要求7所述的复制型重组人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒药物或中和抗体的应用。
9.权利要求7所述的复制型重组人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒的疫苗中的应用。
10.权利要求7所述的复制型重组人55型腺病毒载体在生物学报告示踪系统中的应用。
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