CN106916851A - 一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用。所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体由如下方法制备得到：将Ad14基因组质粒化，敲除其E3和E1基因，进而将其E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。本发明所描述的复制缺陷型14型腺病毒载体可潜在地应用于：抗人14型腺病毒感染的疫苗研发；抗人14型腺病毒感染的中和抗体和药物筛选；作为基因载体应用于其它病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。

Description

一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
腺病毒(Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度为34-38kb。目前报道的腺病毒有69个基因型，可分为A-G七个亚群。腺病毒不仅会引起无症状的感染，而且会诱发呼吸道疾病、眼部疾病和胃肠炎等。B亚群的3、7型和E亚群的4型腺病毒常诱发严重的呼吸道疾病。14型腺病毒自1955年从荷兰军队中被首次发现，长达半个世纪的时间里，并没有引起严重的呼吸道疾病和大范围的流行；然而，自2006年美国军队报道14型腺病毒出现后，14型腺病毒在美国频繁的引起感染和死亡。随后，在欧洲的爱尔兰地区和北美的加拿大都出现的14型腺病毒引起的感染和死亡。2011年，我国甘肃一所中学中也爆发了14型腺病毒的感染。针对14型腺病毒的流行和高致病性，目前尚无用于预防、治疗14型腺病毒感染的疫苗和药物；因此，研发抗14型腺病毒的疫苗和药物对人类健康具有重大意义。
自20世纪70年代，美军中就开始使用肠衣包被的4型和7型腺病毒活疫苗，起到了很好的保护效果。由于4型和7型腺病毒疫苗起到了很好的预防效果，1996年停止了腺病毒疫苗的生产，到了1999年，库存中的腺病毒疫苗使用殆尽，美军中再次爆发了腺病毒感染引起的呼吸道疾病，不得不重新启动4型和7型腺病毒疫苗的生产；由于目前的腺病毒疫苗只有美军中使用的4型和7型腺病毒活疫苗，对于最近爆发的14型腺病毒无确切的预防效果；另一方面，该疫苗主要成分为野生型腺病毒，残余活病毒从肠道排出后极易污染水源，造成病毒的扩散，因其安全隐患而不能应用于普通人群。因此，研制安全有效的复制缺陷型14型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。
复制缺陷型的腺病毒载体被广泛用于疫苗研发和基因治疗，不仅安全性高，而且可以在体内诱发强的免疫反应；腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因则可以对抗宿主的免疫系统，E1和E3基因同时敲除后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，具有减毒表型，而其主要的表面抗原如Hexon、Fibre等则不受影响。复制缺陷型的腺病毒疫苗不仅安全性高，而且可以在体内诱发针对腺病毒的免疫反应。复制缺陷型腺病毒可在互补细胞株，如表达Ad5 E1基因的293细胞、PerC6细胞中生产。但是，B亚群腺病毒敲除E1和E3基因后在这些生产细胞株中难以获得有效产量，主要原因是Ad5 E1B 55K不能与B亚型腺病毒E4Orf6相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA的出核并提升病毒晚期蛋白的表达。
有研究报道，Ad26和Ad35的E4 ORF6替换为Ad5的E4 ORF6，同时敲除E1基因，仍可在293和PerC6细胞中复制并获得有效产量。目前尚无方法大量获得复制缺陷型的Ad14。E4基因包含了Orf1、Orf2、Orf 3、Orf 4、34K(Orf6)、Orf6/7等读码框，其编码的蛋白均可能与E1基因编码蛋白相互作用，在腺病毒复制与包装过程中起重要作用。
利用腺病毒载体进行的基因治疗已被大规模进行临床试验，目前，全球以腺病毒载体进行的临床试验比例已达22.2％，居各类载体之首。腺病毒载体的使用主要集中在Ad2和Ad5，由于人自然感染腺病毒，大多数人体中存在抗Ad2和Ad5抗体，限制了传统的腺病毒载体的使用。非洲、南美及我国等发展中国家和地区的人群中Ad2和Ad5中和抗体很高，阳性率甚至高达90％，中和抗体的存在限制了腺病毒进入机体细胞，使其无法行使免疫或者治疗功能。为了逃避体内预存抗腺病毒抗体的免疫反应，研究者尝试了一系列的策略：1)修饰或者改造腺病毒表面的衣壳蛋白，使其可以逃逸预存的免疫反应；2)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应；3)开发无预存抗体反应的黑猩猩腺病毒CV-68，63等稀有腺病毒载体4)我们此前开发的以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术；等等。Ad14尚未在人群中大规模流行，人体内缺少针对Ad14的中和抗体，因此基于人14型腺病毒的载体是Ad2、Ad5等载体的良好的替代品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述问题，提供一种复制缺陷型人14型腺病毒载体。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以解决：
一种复制缺陷型人14型腺病毒载体，由如下方法制备得到：将Ad14基因组质粒化，敲除Ad14的E1、E3基因，再将Ad14基因组中的E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。
优选地，所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体，还在Ad14的E1基因区域整合外源基因表达框。
一种复制缺陷型人14型腺病毒载体的制备方法，包含如下步骤：
S1.PCR扩增获得Ad14基因组的左右两端，连接至氨苄抗性质粒得到pT-Ad14(L+R)，线性化后与Ad14基因组重组，得到基因组质粒pAd14；
S2.PCR扩增获得Ad14 E3基因的左右臂并反向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与部分酶切线性化的pAd14同源重组，得到去除E3基因的基因组质粒pAd14ΔE3-Kana；
S3.PCR扩增Ad14 E3基因的左右臂并同向连接到卡那霉素抗性质粒上，线性化后与线性化的pAd14ΔE3-Kana进行重组，得到去除卡那抗性基因的基因组质粒pAd14ΔE3；
S4.PCR扩增Ad14 E1基因的左右臂并反向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与部分酶切线性化的pAd14ΔE3同源重组，得到去除E1基因的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana；
S5.PCR扩增Ad14 E1基因的左右臂并同向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3-Kana进行重组，得到去除卡那抗性基因的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3；
S6.PCR扩增Ad14 E4基因连接至氨苄抗性质粒得到p14E4，PCR扩增得到Ad5基因组E4开放阅读框2至6/7区域，取代Ad14 E4基因中相应区域得到p14E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3同源重组，得到敲除E1、E3并改换E4的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3(5E4)。
优选地，步骤S1.的具体方法为：
以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到Ad14基因组左右两端L-Ad14和R-Ad14作为重组臂连接到线性化的T载体上，得到pT-Ad14(L+R)，同时在pT-Ad14(L+R)的左右臂之间引入了EcoRI、BamHI作为酶切位点，EcoRI+BamHI双酶切pT-Ad14(L+R)线性化后与Ad14基因组重组，得到pAd14。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S1.的具体方法为：
以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到Ad14基因组左右两端L-Ad14和R-Ad14作为重组臂连接到线性化的T载体上，得到pT-Ad14(L+R),同时在pT-Ad14(L+R)的左右臂之间引入了EcoRI、BamHI作为酶切位。pT-Ad14(L+R)使用EcoRI+BamHI双酶切进行线性化，然后与Ad14基因组重组，得到pAd14。
优选地，步骤S2.的具体方法为：
以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂L-ΔE3及R-ΔE3，反向连接至pVax载体得到pVax-ΔE3(L+R)，线性化后，与经EcoRI部分酶切线性化的pAd14同源重组，经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E3基因同时在E3基因区引入唯一的线性化酶切位点swaI的质粒pAd14ΔE3-Kana。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S2.的具体方法为：
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E3基因的左右臂L-ΔE3，R-ΔE3和以pVax载体为模板PCR获得pVax的骨架使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pVax-ΔE3(L+R)。pVax-ΔE3(L+R)使用EcoRI+EcoRV进行双酶切，pAd14使用EcoRI进行有限酶切，将两者回收得到的片段进行同源重组得到pAd14ΔE3-Kana。
优选地，步骤S3.的具体方法为：
以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂L-ΔK(E3)及R-ΔK(E3)，正向连接至pVax载体得到pVax-ΔK(E3)，线性化后与经SwaI线性化的pAd14ΔE3-Kana进行重组，得到敲除E3和卡那抗性基因，同时引入Swal单酶切位点的pAd14ΔE3。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S3.的具体方法为：
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E1基因的左右臂L-ΔK(E3)、R-ΔK(E3)和以pVax载体为模板PCR获得pVax的骨架使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pVax-ΔK(E3)。pVax-ΔK(E3)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pAd14ΔE3-Kana使用SwaI进行酶切进行线性化，将两者酶切回收的片段共进行同源重组得到pAd14ΔE3。
优选地，步骤S4.的具体方法为：
根据步骤S2相同的原理，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-ΔE1及R-ΔE1，反向连接至pVax载体得到pVax-ΔE1(L+R)，线性化后与PacI酶切线性化的pAd14ΔE3同源重组，经氨苄、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E1基因并在E1基因区引入唯一的线性化酶切位点PmeI的质粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S4.的具体方法为：
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E1基因的左右臂L-ΔE1，R-ΔE1和以pVax载体为模板PCR获得pVax的骨架使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pVax-ΔE1(L+R)。pVax-ΔE1(L+R)使用EcoRI+EcoRV进行双酶切，pAd14ΔE3使用PacI进行有限酶切，将两者回收得到的片段进行同源重组得到pAd14ΔE1ΔE3-Kana。
优选地，步骤S5.的具体方法为：
根据步骤S3相同的原理，PCR扩增得E1基因同源重组臂L-ΔK(E1)及R-ΔK(E1)，正向连接至pVax载体得到pVax-ΔK(E1)，线性化后与经PmeI线性化的pAd14ΔE1ΔE3-Kana进行重组，得到敲除E1和卡那抗性基因同时引入PmeI单酶切位点的pAd14ΔE1ΔE3。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S5.的具体方法为：
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E1基因的左右臂L-ΔK(E1)、R-ΔK(E1)和以pVax载体为模板PCR获得pVax的骨架使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pVax-ΔK(E1)。pVax-ΔK(E1)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pAd14ΔE1ΔE3-Kana使用PacI进行酶切进行线性化，将两者酶切回收的片段共进行同源重组得到pAd14ΔE1ΔE3。
优选地，步骤S6.的具体方法为：
分别以Ad5、Ad14基因组为模板，PCR扩增得到Ad5 E4 Orf2-6和Ad14 E4，将Ad14E4连接至T载体得到p14E4，进一步以p14E4为模板PCR去除Ad14 E4 Orf2-6，然后与Ad5 E4Orf2-6连接得到p14E4(5E4)，线性化后与线性化的如权利要求8所述pAd14ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S6.的具体方法为：
分别以Ad5、Ad55基因组为模板，PCR扩增Ad5 E4 Orf2-6、Ad14 E4基因，Ad14 E4基因连接至T载体得到p14E4。以p14E4为模板PCR获得其骨架序列，与Ad5 E4 Orf2-6使用Exnase酶连接得到p14E4(Ad5Orf2-6)。EcoRI线性化p14E4(Ad5Orf2-6)和PsiI线性化的pAd14ΔE1ΔE3进行重组得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)
一种复制缺陷型人14型腺病毒载体的制备方法，还包含如下步骤：
S7.以Ad14基因组为模板PCR得到E1区同源重组臂L-SE1、R-SE1，酶切并连接至pVax载体得到pSE1LR；以pGA1-EGFP为模板PCR得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与pSE1LR经酶切、连接得到pGK141-EGFP，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3(5E4)同源重组得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP，进一步线性化后转染细胞，经培养、离心纯化得到Ad14ΔE1ΔE3(5E4)以及Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
优选地，步骤S7.的具体方法为：
分别以pVax、Ad14基因组、pGA1-EGFP为模板PCR得到pVax骨架、E1区上下游同源重组臂L-SE1、R-SE1以及外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，pVax骨架、SE1L、SE1R连接得到pSE1LR；CMV-EGFP-BGH与pSE1LR经酶切、连接得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒pGK141-EGFP；
pGK141-EGFP线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3(5E4)同源重组得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP；
AsisI酶切pAd14ΔE1ΔE3(5E4)和pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP进行线性化，然后转染293细胞进行病毒拯救、扩增培养，纯化得到Ad14ΔE1ΔE3(5E4)和Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
更为优选地，在其中一个实施例中，步骤S7.的具体方法为：
分别以pVax、Ad14基因组、pGA1-EGFP为模板PCR得到Vax骨架、E1区上下游同源重组臂L-SE1、R-SE1以及外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，pVax骨架、L-SE1、R-SE1使用Exnase酶进行三片段连接得到pSE1LR；CMV-EGFP-BGH使用SpeI进行酶切，pSE1LR使用SpeI+EcoRV进行酶切，两者连接得到穿梭质粒pGK141-EGFP。
pGK141-EGFP使用Bstz17I+SgrAI进行酶切进行线性化,pAd14ΔE1ΔE3(5E4)使用PmeI进行线性化，两者进行同源重组得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
pAd14ΔE1ΔE3(5E4)、pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP使用AsisI酶切进行线性化，乙醇沉淀回收后转染293细胞进行病毒拯救、扩增培养，以CsCl2密度梯度离心法纯化得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)和Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在制备疫苗中的应用。
所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在制备中和抗体中的应用。
所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在生物学报告示踪系统中的应用。
所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在制备抗人14型腺病毒的疫苗中的应用。
所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在制备抗人14型腺病毒药物中的应用。
有益效果：(1)本发明成功制备得到了复制缺陷型人14型腺病毒载体，所述的载体能够在293、PerC6等辅助细胞株中大量生产，并可以密度梯度离心浓缩纯化；且在正常人体细胞不具备复制能力，因此具备减毒表型；(2)该重组载体还可在靶细胞内高效表达外源基因；(3)本发明所述重组载体可作为疫苗或基因治疗载体，还可应用于药物及中和抗体的研发，以及报告示踪系统等；实施例试验数据表明所述制缺陷型人14型腺病毒载体可在免疫小鼠的早期诱发更高水平的针对Ad14的中和抗体。
附图说明
附图1是利用同源重组对Ad14的基因组环化的原理，及环化的穿梭质粒、pAd14的酶切鉴定结果。
附图2是使用氨苄、卡那霉素进行双抗筛选敲除Ad14 E3基因的原理，及敲除Ad14E3的穿梭质粒、pAd14ΔE3-Kana质粒的PCR鉴定结果。
附图3是敲除pAd14ΔE3-Kana质粒中卡那霉素抗性的原理，及敲除Ad14 E3区那霉素抗性的穿梭质粒、pAd14ΔE3质粒的酶切结果。
附图4是使用氨苄、卡那霉素进行双抗筛选敲除pAd14ΔE3中E1基因的原理，及敲除pAd14ΔE3中E1基因的穿梭质粒的PCR鉴定、pAd14ΔE1ΔE3-Kana质粒的酶切结果。
附图5是敲除pAd14ΔE1ΔE3-Kana质粒中卡那霉素抗性的原理，及敲除pAd14ΔE3中E1区卡那霉素抗性的穿梭质粒、pAd14ΔE1ΔE3质粒的酶切结果。
附图6是pAd14ΔE1ΔE3中E4基因中ORF2-6替换为Ad5 E4基因ORF2-6相应序列的原理，置换Ad14E4基因中ORF2-6的穿梭质粒及pAd14ΔE1ΔE3(5E4)的酶切结果。
附图7是构建携带外源基因表达框的pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP的过程示意图及酶切结果。
附图1～7中M1代表2000bp DNA Marker，M2代表15000bp DNA Marker。
附图8是复制缺陷型Ad14载体的生产及纯化结果。
附图9是复制缺陷型Ad14载体在293和A549细胞中形成病毒噬斑的结果。
附图10是复制缺陷型Ad14ΔE1ΔE3(5E4)免疫小鼠后的中和抗体效价水平。
具体实施方法
本发明公开了一种复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法。本发明所述腺病毒载体的制备方法和构建思路适用于针对腺病毒及其他病原体疫苗的研发，抗腺病毒药物及中和抗体的筛选，以及生物学研究中的报告示踪系统。
本发明术语“人55型腺病毒”指本领域普通技术人员已知的55型腺病毒，实施例中用到的Ad55基因组也来源于这些已知的人55型腺病毒。本发明所述复制缺陷型人55型腺病毒载体不局限于实施例所采用的特定临床分离株。
本发明术语“外源序列”是指非55型腺病毒来源的任何DNA序列。本领域普通技术人员应当理解，外源序列可以是外源基因表达框，也可以是shRNA或miRNA的表达框等。
在以下实施例中，根据本领域技术人员的理解，外源基因表达框可包含真核启动子、外源基因编码序列、转录终止子。所述外源基因编码序列可以是但不仅限于绿色荧光蛋白、其他病毒抗原、shRNA等的编码序列。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
实施例1：Ad14基因组的环化。
1.构建环化Ad14基因组的穿梭质粒pT-Ad14(L+R)。
以Ad14的基因组为模板，PCR获得Ad14基因组的左臂(L-Ad14)和右臂(R-Ad14)。
L-Ad14引物：
L-Ad14-F,CCTGCCGTTCGACGATGCGATCGCATCATCAATAATAT ACCTTATAGATGG
L-Ad14-R,GATCCACATACGAATTCCGGTAATCGAAACCTCCACG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；57℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
R-Ad14引物：
R-Ad14-F,GAATTCGTATGTGGATCCTGGGAACCACCAGTAATGTCA
R-Ad14-R,CGCGGATCTTCCAGAGATGCGATCGCATCATCAATAA TATACCTTATAGATGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；57℃30s；72℃，1min；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
2.构建pAd14。
pT-Ad14(L+R)使用EcoRI+BamHI进行酶切线性化，然后和Ad14的基因组共转化BJ5183感受态细胞进行重组，氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14，使用不同的酶切方式进行鉴定，pAd14在基因组的两侧引入了两个AsisI酶切位点，方便后续对改造后的Ad14的基因组进行线性化进行病毒拯救。
实施例2：E3基因的敲除及pAd14ΔE3-Kana质粒的构建。
1.构建E3基因敲除的穿梭质粒pVax-ΔE3(L+R)。
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E3基因的左臂(L-ΔE3)和右臂(R-ΔE3)。
L-ΔE3引物：
L-ΔE3-F,GATATCTAGAGTGAATTCGTCCAAATGACTAATGCAGG TGC
L-ΔE3-R,CCAGTAGAAGCGCCGGATTTAAATAGGAAAAGTTTCG TTCTTCTGGTTG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，50s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
R-ΔE3引物：
R-ΔE3-F,ATTATTGACTAGAGTAATTTAAATGGACTAAGAGACCT GCTACCCATG
R-ΔE3-R,GAATTCACTCTAGATATCCCACTTTTAGCTGTAGAGAC CCG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
L-ΔE3、R-ΔE3和Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pVax-ΔE3(L+R)。
2.构建pAd14ΔE3-Kana
pVax-ΔE3(L+R)使用EcoRI+EcoRV进行双酶切，pAd14使用EcoRI进行酶切，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄、卡那双抗平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14ΔE3-Kana，使用不同的酶切方式进行鉴定，pAd14ΔE3-Kana在E3基因区引入的卡那基因的两侧引入了两个SwaI酶切位点，方便后续克隆操作。
实施例3：构建pAd14ΔE3-Kana质粒中卡那抗性基因敲除的质粒pAd14ΔE3。
1.构建敲除E3区卡那抗性基因的穿梭质粒pVax-ΔK(E3)。
以Ad14基因组为模板，PCR获得E3基因的左臂L-ΔK(E3)和右臂R-ΔK(E3)。
L-ΔK(E3)引物：
L-ΔK(E3)-F,TGATTATTGACTAGAGTATACGTCCAAATGACTAATG CAGGTGC
L-ΔK(E3)-R:GATATCATTTAAATACTAGTAGGAAAAGTTTCGTTCT TCTGGTTG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，50s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
R-ΔK(E3)引物：
R-ΔK(E3)-F,ACTAGTATTTAAATGATATCGGACTAAGAGACCTGC TACCCATG
R-ΔK(E3)-R,ACCGCCCAGTAGAAGCGCCGGTGCCACTTTTAGCT GTAGAGACCCG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
L-ΔK(E3)、R-ΔK(E3)和经Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pVax-ΔK(E3)。
2.构建pAd14ΔE3
pVax-ΔK(E3)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pAd14ΔE3-Kana使用SwaI进行酶切进行线性化，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14ΔE3，提取质粒进行酶切鉴定。利用pVax-ΔK(E3)重组敲除卡那抗性基因的同时在E3区引入了单一的酶切位点SwaI，穿梭质粒及pAd14ΔE3的构建流程见附图3。
实施例4：E1基因的敲除及pAd14ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建
1.构建E1基因敲除的穿梭质粒pVax-ΔE1(L+R)。
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E1基因的左臂(L-ΔE1)和右臂(R-ΔE1)。
L-ΔE1引物：
L-ΔE1-F,GATATCTAGAGTGAATTCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG
L-ΔE1-R,CGCCCAGTAGAAGCGCCGGGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；62℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
R-ΔE1引物:
R-ΔE1-F,CCAGATATACGCGTGTATAGTTTAAACGAGACCGGATC ATTTGGTTATTG
R-ΔE1-R,GAATTCACTCTAGATATCGGGAAATGCAAATCTGTGAG GG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
L-ΔE1、R-ΔE1和Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pVax-ΔE1(L+R)。
2.构建pAd14ΔE1ΔE3-Kana
pVax-ΔE1(L+R)使用EcoRI+EcoRV进行双酶切，pAd14ΔE3使用PacI进行酶切线性化，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄、卡那双抗平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14ΔE1ΔE3-Kana，使用不同的酶切方式进行鉴定，pAd14ΔE1ΔE3-Kana在E1基因区引入的卡那基因的两侧引入了两个PmeI酶切位点，方便后续克隆操作。
实施例5：构建pAd14ΔE1ΔE3-Kana中卡那抗性基因敲除的质粒pAd14ΔE1ΔE3。
1.构建敲除E1区卡那抗性基因的穿梭质粒pVax-ΔK(E1)。
以Ad14的基因组为模板，PCR获得E1基因的左臂L-ΔK(E1)和右臂R-ΔK(E1)。
L-ΔK(E1)引物：
L-ΔK(E1)-F,ACCGCCCAGTAGAAGCGCCGGTGGGGGTGGAGTG TTTTTGCAAG
L-ΔK(E1)-R,ACTAGTGTTTAAACGATATCGTAATCGAAACCTCCA CGTAATGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
R-ΔK(E1)的引物序列：
R-ΔK(E1)-F,GATATCGTTTAAACACTAGTGAGACCGGATCATTTG GTTATTG
R-ΔK(E1)-R,CCAGATATACGCGTGTATACGGGAAATGCAAATCTG TGAGGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min 30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
L-ΔK(E1)、R-ΔK(E1)和经Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pVax-ΔK(E1)。
2.构建pAd14ΔE1ΔE3
pVax-ΔK(E1)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pAd14ΔE1ΔE3-Kana使用PmeI进行酶切进行线性化，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14ΔE1ΔE3，提取质粒进行酶切鉴定。利用pVax-ΔK(E1)重组敲除卡那抗性基因的同时在E1区引入了单一的酶切位点PmeI，穿梭质粒及pAd14ΔE1ΔE3的构建流程见附图5。
实施例6:改造Ad14 E4基因构建并构建pAd14ΔE1ΔE3(5E4)
1.构建整合Ad5 E4 ORF2-6的穿梭质粒p14E4(5ORF2-6)。
1)以Ad14的基因组为模板PCR获得Ad14的E4基因。
Ad14 E4引物:
E4-F,AGAGTGCACCATATGGAATTCGGACTAAGAGACCTGCTAC CCATG
E4-R,GCTGTGTGGTAATTGGCTGTGGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；62℃30s；72℃，4min 30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
对PCR获得E4基因片段的末端进行加磷，然后和平末端的T载体连接得到p14E4。
2)以Ad5基因组为模板，利用下列引物PCR扩增Ad5 E4 ORF2-6。
5(ORF2-6)-F,CATTCAAAACTAACAATGCAGAAACCCGCAGACAT G
5(ORF2-6)-R,GAGTCTGGATCACGGCTACATGGGGGTAGAGTCAT AATCG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；62℃30s；72℃，2min；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
3)以p14 E4为模板利用下列引物PCR获得p14 E4的骨架。
p14E4-F,CCGTGATCCAGACTCCGGAG
p14E4-R,TGTTAGTTTTGAATGAGTCTGCAAA
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，5min；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
5(ORF2-6)和p14 E4的质粒骨架使用Exnase进行两片段连接得到p14E4(5Orf2-6)。
2.构建质粒pAd14ΔE1ΔE3(5E4)
p14E4(5Orf2-6)使用EcoRI进行线性化，pAd14ΔE1ΔE3使用PsiI进行线性化，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)，提取质粒进行酶切鉴定，pAd14ΔE1ΔE3(5E4)的具体构建过程见附图6。
实施例7:构建携带EGFP等外源基因的穿梭质粒及复制缺陷型Ad14基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP
1.构建携带E1基因两侧重组臂的穿梭质粒pSE1LR。
以Ad14的基因组为模板PCR获得E1基因的左臂(L-SE1)和右臂(R-SE1)
L-SE1引物：
L-SE1-F,ACCGCCCAGTAGAAGCGCCGGTGGGGGTGGAGTGTTT TTGCAAG
L-SE1-R,ACTAGTGTTTAAACGATATCGTAATCGAAACCTCCACGT AATGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
R-SE1引物：
R-SE1-F,GATATCGTTTAAACACTAGTGAGACCGGATCATTTGGTT ATTG
R-SE1-R,CCAGATATACGCGTGTATACGGGAAATGCAAATCTGTG AGGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min30s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
L-SE1、R-SE1和经Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pSE1(L+R)。
2.构建携带EGFP等外源基因的穿梭质粒pGK141-EGFP。
以pGA1-EGFP为模板，PCR扩增获得CMV-EGFP-BGH
引物序列：
CMV-EGFP-BGH-F,AGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG
CMV-EGFP-BGH-R,GCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；65℃30s；72℃，1min 50s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。
CMV-EGFP-BGH表达框使用SpeI进行酶切，pSE1(L+R)使用HindIII+XbaI进行双酶切，两者连接得到pGK141-EGFP。
3.构建pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP
pGK141-EGFP使用BstZ17I+SgrAI进行线性化，pAd14ΔE1ΔE3(5E4)使用PmeI进行线性化，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP，提取质粒进行酶切鉴定，pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒的具体构建过程见附图7。
实施例8:复制缺陷型Ad14载体的拯救和生产
pAd14ΔE1ΔE3(5E4)、pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP分别使用AsisI进行酶切线性化，使用乙醇沉淀法回收，使用Lipofectamine2000转染293细胞，转染8h后，将培养基更换为含5％FBS的DMEM培养基进行培养，培养第7天开始每天注意观察细胞是否发生了病变；当发现细胞明显病变后，收集细胞及培养上清，在液氮罐和37℃水浴锅中进行反复冻融3次，离心去除细胞碎片，取适量上清感染10cm细胞培养皿中的293细胞；感染2-3天观察到出毒现象后，收集细胞和上清，反复冻融3次后，离心去除细胞碎片收集上清。取上清去感染8-10个15cm细胞培养皿中的293细胞进行扩大培养，感染2-3天观察到出毒现象后，收集细胞和上清，反复冻融3次后，离心去除细胞碎片收集上清。将上清加入到氯化铯梯度离心管中，配平后，4℃，30000rpm离心4h；离心后小心吸出病毒条带，脱盐，分装；取适量病毒进行病毒定量，测定OD260浓度,病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；纯化获得的病毒于-80℃储存。复制缺陷型Ad14载体的生产及纯化结果见附图8。
实施例9：复制缺陷型Ad14在293和A549细胞中复制能力测定
采用噬斑实验测定复制缺陷型Ad14载体在辅助细胞293和非辅助细胞A549中的复制能力。在12孔细胞板中接种293或者A549细胞，待到细胞密度接近100％时，将收获的的P1代Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP病毒原液梯度稀释后分别感染293或者A549细胞，每个病毒浓度做两个重复。病毒感染细胞2h后，吸去培养基，每孔铺上1ml左右的1.2％的琼脂糖凝胶(含1.2％琼脂糖，5％胎牛血清，1×MEM培养基，1×青链霉素抗生素)。培养9-12天左右，利用荧光显微镜观察病毒携带的绿色荧光表达，并寻找病毒克隆的形成，拍照记录。结果如附图9所示，Ad14ΔE3-EGFP只删除了E3基因，在293和A549细胞中都能形成明显的病毒噬斑，具有复制能力；Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP同时删除了E1和E3基因，只能在辅助细胞293中形成病毒噬斑，却无法在人正常的A549细胞形成病毒噬斑。以上结果表复制缺陷型Ad14载体可在辅助细胞293中复制，却无法在人的正常细胞如A549细胞中复制，具有减毒表型。此外，复制缺陷型Ad14载体可在感染的细胞中表达携带的报告基因，运用于生物示踪系统中。
实施例10：复制缺陷型Ad14载体在小鼠中免疫原性评价
设计复制缺陷型Ad14在小鼠体内的免疫原性评价方案，如附图，按照设计的免疫方案对复制缺陷型Ad14的免疫原性进行评价。
选取6-8周龄的Balb/c小鼠分为3组，每组6只。采取肌注免疫的方式，第1组免疫Ad5ΔE1ΔE3，第2组免疫热灭活的Ad14ΔE3-EGFP，第3组免疫Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。免疫后第14天，眼眶采血分离血清，测定抗Ad14的中和抗体。与免疫灭活的Ad14ΔE3-EGFP相比，免疫Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP可诱导更高水平的抗Ad14中和抗体。免疫后第42天后，再次进行眼眶采血，测定血清中抗Ad14的中和抗体效价。结果如图10所示，此时，免疫Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP和灭活的Ad14ΔE3-EGFP可诱导针对Ad14的中和抗体相同水平的中和抗体效价。这些结果说明，与灭活的Ad14ΔE3-EGFP相比，Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP可在免疫小鼠的早期诱发更高水平的针对Ad14的中和抗体。
实施例仅表达了本项发明的几种实施方式，这些实施例的描述清晰、具体，这些实施例的表述不可理解为对本项发明专利的限制。需要强调的是，对于本研究领域的科研技术人员，在根据本项发明构思的前提下，还能够做出若干变化和改进，这些属于本项发明的保护范围。因此，本项专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司
<120> 一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用
<130>
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgccgttc gacgatgcga tcgcatcatc aataatatac cttatagatg g 51
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatccacata cgaattccgg taatcgaaac ctccacg 37
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaattcgtat gtggatcctg ggaaccacca gtaatgtca 39
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcggatctt ccagagatgc gatcgcatca tcaataatat accttataga tgg 53
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> L-ΔE3-R
<400> 5
gatatctaga gtgaattcgt ccaaatgact aatgcaggtg c 41
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccagtagaag cgccggattt aaataggaaa agtttcgttc ttctggttg 49
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attattgact agagtaattt aaatggacta agagacctgc tacccatg 48
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaattcactc tagatatccc acttttagct gtagagaccc g 41
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgattattga ctagagtata cgtccaaatg actaatgcag gtgc 44
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gatatcattt aaatactagt aggaaaagtt tcgttcttct ggttg 45
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
actagtattt aaatgatatc ggactaagag acctgctacc catg 44
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
accgcccagt agaagcgccg gtgccacttt tagctgtaga gacccg 46
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gatatctaga gtgaattcgg ggtggagtgt ttttgcaag 39
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgcccagtag aagcgccggg tttaaacgta atcgaaacct ccacgtaatg g 51
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccagatatac gcgtgtatag tttaaacgag accggatcat ttggttattg 50
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaattcactc tagatatcgg gaaatgcaaa tctgtgaggg 40
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
accgcccagt agaagcgccg gtgggggtgg agtgtttttg caag 44
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
actagtgttt aaacgatatc gtaatcgaaa cctccacgta atgg 44
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gatatcgttt aaacactagt gagaccggat catttggtta ttg 43
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccagatatac gcgtgtatac gggaaatgca aatctgtgag gg 42
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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agagtgcacc atatggaatt cggactaaga gacctgctac ccatg 45
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gctgtgtggt aattggctgt ggg 23
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
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cattcaaaac taacaatgca gaaacccgca gacatg 36
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
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gagtctggat cacggctaca tgggggtaga gtcataatcg 40
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
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ccgtgatcca gactccggag 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgttagtttt gaatgagtct gcaaa 25
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
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accgcccagt agaagcgccg gtgggggtgg agtgtttttg caag 44
<210> 28
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<213> 人工序列
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actagtgttt aaacgatatc gtaatcgaaa cctccacgta atgg 44
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gatatcgttt aaacactagt gagaccggat catttggtta ttg 43
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ccagatatac gcgtgtatac gggaaatgca aatctgtgag gg 42
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agatatacgc gttgacattg attattgact ag 32
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gctggttctt tccgcctcag aag 23

Claims (10)

1.一种复制缺陷型人14型腺病毒载体，其特征在于，由如下方法制备得到：将Ad14基因组质粒化，敲除其E3和E1基因，进而将其E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。
2.根据权利要求1所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体，其特征在于，还在Ad14的E1基因区域整合外源基因表达框。
3.权利要求1或2所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.PCR扩增获得Ad14基因组的左右两端，连接至氨苄抗性质粒得到pT-Ad14(L+R)，线性化后与Ad14基因组重组，得到基因组质粒pAd14；
S2.PCR扩增获得Ad14 E3基因的左右臂并反向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与部分酶切线性化的pAd14同源重组，得到去除E3基因的基因组质粒pAd14ΔE3-Kana；
S3.PCR扩增Ad14 E3基因的左右臂并同向连接到卡那霉素抗性质粒上，线性化后与线性化的pAd14ΔE3-Kana进行重组，得到去除卡那抗性基因的基因组质粒pAd14ΔE3；
S4.PCR扩增Ad14 E1基因的左右臂并反向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与部分酶切线性化的pAd14ΔE3同源重组，得到去除E1基因的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana；
S5.PCR扩增Ad14 E1基因的左右臂并同向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3-Kana进行重组，得到去除卡那抗性基因的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3；
S6.PCR扩增Ad14 E4基因连接至氨苄抗性质粒得到p14E4，PCR扩增得到Ad5基因组E4开放阅读框2、3、4、6和6/7，取代Ad14 E4基因中相应区域得到p14E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd14ΔE1ΔE3同源重组，得到敲除E1、E3并改换E4的基因组质粒pAd14ΔE1ΔE3(5E4)。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体方法为：以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到Ad14基因组左右两端L-Ad14和R-Ad14作为重组臂连接到线性化的T载体上，得到pT-Ad14(L+R)，同时在pT-Ad14(L+R)的左右臂之间引入了EcoRI、BamHI作为酶切位点，EcoRI+BamHI双酶切pT-Ad14(L+R)线性化后与Ad14基因组重组，得到pAd14。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体方法为：以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂L-ΔE3及R-ΔE3，反向连接至pVax载体得到pVax-ΔE3(L+R)，线性化后，与经EcoRI部分酶切线性化的pAd14同源重组，经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E3基因同时在E3基因区引入唯一的线性化酶切位点swaI的质粒pAd14ΔE3-Kana。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体方法为：以Ad14基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂L-ΔK(E3)及R-ΔK(E3)，正向连接至pVax载体得到pVax-ΔK(E3)，线性化后与经SwaI线性化的pAd14ΔE3-Kana进行重组，得到敲除E3和卡那抗性基因，同时引入Swal单酶切位点的pAd14ΔE3；所述步骤S4的具体方法为：根据步骤S2相同的原理，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-ΔE1及R-ΔE1，反向连接至pVax载体得到pVax-ΔE1(L+R)，线性化后与PacI酶切线性化的pAd14ΔE3同源重组，经氨苄、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E1基因并在E1基因区引入唯一的线性化酶切位点PmeI的质粒pAd14ΔE1ΔE3-Kana。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5的具体方法为：根据步骤S3相同的原理，PCR扩增得E1基因同源重组臂L-ΔK(E1)及R-ΔK(E1)，正向连接至pVax载体得到pVax-ΔK(E1)，线性化后与经PmeI线性化的pAd14ΔE1ΔE3-Kana进行重组，得到敲除E1和卡那抗性基因同时引入PmeI单酶切位点的pAd14ΔE1ΔE3；所述步骤S6的具体方法为：分别以Ad5、Ad14基因组为模板，PCR扩增得到Ad5 E4 Orf2-6和Ad14 E4，将Ad14 E4连接至T载体得到p14E4，进一步以p14E4为模板PCR去除Ad14 E4 Orf2-6，然后与Ad5 E4 Orf2-6连接得到p14E4(5E4)，线性化后与线性化的如权利要求8所述pAd14ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征还在于，可经同源重组整合入外源序列，还包括以下步骤：
S7.以Ad14基因组为模板PCR得到E1区同源重组臂L-SE1、R-SE1，酶切并连接至pVax载体得到pSE1LR；以pGA1-EGFP为模板PCR得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与pSE1LR经酶切、连接得到pGK141-EGFP，线性化后与线性化的步骤S6得到的pAd14ΔE1ΔE3(5E4)同源重组得到pAd14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP，进一步线性化后转染细胞，经培养、离心纯化得到Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
9.权利要求1或2所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在制备疫苗、中和抗体或生物学报告示踪系统中的应用。
10.权利要求1或2所述的复制缺陷型人14型腺病毒载体在制备抗人14型腺病毒的疫苗或抗人14型腺病毒药物中的应用。
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