CN101745107B

CN101745107B - 一种重组复制缺陷型腺病毒载体h5n1亚型流感基因工程疫苗

Info

Publication number: CN101745107B
Application number: CN2008102393334A
Authority: CN
Inventors: 乔传玲; 吴运谱; 杨焕良; 陈艳; 辛晓光; 陈化兰
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2028-12-10
Also published as: CN101745107A

Abstract

本发明提供了一种重组复制缺陷型腺病毒载体H5N1亚型流感病毒基因工程疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，在E1区携带有H5N1亚型流感病毒膜糖蛋白编码基因HA及用于筛选重组病毒的绿色荧光蛋白示踪基因EGFP，所述H5N1亚型流感膜糖蛋白编码基因HA来自流感病毒株A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株。

Description

一种重组复制缺陷型腺病毒载体H5N1亚型流感基因工程疫苗

技术领域

本发明涉及重组基因工程疫苗，具体地，本发明涉及一种用于预防动物H5N1亚型流感的重组基因工程疫苗，更具体地，本发明所涉及的疫苗以H5N1亚型流感毒株糖蛋白HA作为抗原基因，以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体。本发明还涉及该疫苗的HEK293细胞病毒培养物。

背景技术

高致病性H5N1亚型禽流感是危害世界养禽业发展的重要疾病，可导致感染禽群100％的死亡，被世界动物卫生组织列为I类烈性传染病。禽流感的广泛传播与流行给世界养禽业造成严重损失，H5N1亚型流感病毒感染人并且致人死亡事件的出现，引起了国际粮农组织、世界卫生组织和世界各国政府及人民的高度关注。

用流感疫苗进行免疫是预防和控制H5N1亚型流感发生的有效途径之一。H5N1流感病毒疫苗现在仍然广泛采用以鸡胚进行生产，这些疫苗虽然有较好的免疫效果，但存在生产成本昂贵、且运输和贮存必须依赖于低温＂冷链＂，给药方式单一且在流感大流行时受到鸡胚供应的限制等因素的限制。

有效免疫接种，消除H5N1亚型流感病毒的传染源与切断传播途径，有赖于发展新一代H5N1亚型的基因工程重组疫苗。联合缺失腺病毒早期区基因E1和E3的重组复制缺陷型腺病毒具有宿主范围广，对外界环境有一定的抵抗能力，可免疫途径多样等优点，具有作为基因工程H5N1亚型流感毒疫苗的优良载体的潜力。而且，这种E1和E3联合缺失的重组复制缺陷型腺病毒还具有一个突出优点：由于E1和E3区编码多种与对抗机体免疫防卫有关的蛋白质，联合缺失这两个区域的重组病毒疫苗可望更有效地刺激免疫应答，并成功地克服在新生动物中可能存在的来自于母体的免疫干扰。研究和开发基于复制缺陷型腺病毒的重组流感病毒疫苗将有望有效预防、控制H5N1亚型流感的流行并为预防新的流感大流行提供物质储备。

本研究所对获得表达H5N1亚型流感病毒HA基因的重组复制缺陷型腺病毒进行了免疫效力评估，表明了其应用潜力。

以腺病毒载体进行动物疫苗的研究，其优势在于：(1)病毒粒子相对稳定，安全性较好；(2)腺病毒基因组较大(36Kb)，切除致瘤部分〔如E1、E3)区后，可以插入相当大的外源基因；(3)病毒感染的宿主细胞极为广泛，而且由于它是DNA病毒，不会受其它RNA信息的干扰。不依赖宿主细胞增殖；(4)腺病毒载体很容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；(5)重组腺病毒的靶细胞是分裂或者不分裂的细胞，且含有目的基因的重组腺病毒DNA是游离于细胞基因组外的(不整合入宿主基因组)，目的蛋白可得到瞬时的高水平表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预防动物H5N1亚型流感的重组疫苗，这种疫苗的疫苗种毒是以H5N1亚型流感毒株A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)糖蛋白HA作为保护性抗原的E1、E3联合缺失的复制缺陷型重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP。

本发明提供的用于预防动物H5N1亚型流感的重组疫苗，其特征在于以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，在载体E1区携带有H5N1亚型流感病毒膜糖蛋白编码基因HA基因。

本发明提供的用于预防动物H5N1亚型流感的重组疫苗中的E1区还进一步携带用于筛选重组病毒的绿色荧光蛋白示踪基因EGFP。

本发明提供的用于预防动物H5N1亚型流感的重组疫苗中的HA基因是来自于流感病毒株A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的免疫原性基因。

本发明的疫苗以人腺病毒为载体。人腺病毒有多个血清型，本发明载体采用5型人腺病毒(Ad-5)。使其缺失部分早期基因表达E1编码区和E3编码区，利用整合腺病毒E1区基因序列的HEK293细胞反式提供E1区的功能，使得E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。将腺病毒骨架质粒与重组腺病毒穿梭质粒共转染HEK293细胞内，在HEK293细胞内的重组酶Cre酶的作用，将通过核糖体进入位点序列(IRES)相连接的HA基因及示踪基因EGFP整合到腺病毒的骨架质粒的E1区，并在HEK293细胞反式补偿E1区功能下增殖并包装产生成熟腺病毒粒子。在本发明的疫苗中，所述的H5N1亚型流感病毒糖蛋白来源于流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株HA基因的ORF，或是编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。在本发明的疫苗中，所述的HA基因及示踪基因EGFP均处于MCMV启动子和来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号转录元件的控制之下。rAd-H5HA-EGFP在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因HA，其基因组在连续传代过程中保持稳定。

本发明构建的表达A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)表面糖蛋白HA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP细胞培养物已根据布达佩斯条约，于2008年5月23日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏。保藏中心地址为：中国武汉大学珞瑜山，保藏号为CCTCC-V200805。

本发明的重组病毒的基本特性：a：具有较为典型的腺病毒细胞病变(图5A为重组病毒形成的典型细胞病变；图5B为重组腺病毒荧光显微镜观察结果)；b：PCR鉴定表明在连续传代培养过程中，重组腺病毒基因组稳定存在(图5C)；c：Western blotting分析结果表明表达的HA蛋白能够被H5N1亚型流感病毒抗血清特异性识别，表达的HA蛋白分子量约为74Ku，与天然HA的分子量相仿(图5D)；d：对重组病毒进行大量增殖与纯化后，测定其感染性滴度，结果表明该重组病毒经过大量增殖与纯化后能够满足实际使用的需求。

在rAd-H5HA-EGFP免疫组中，分别以初免10⁸TCID₅₀(半数细胞培养物感染量)、10⁷TCID₅₀剂量的rAd-H5HA-EGFP肌肉注射接种7周龄雌性BALB/c小鼠，3周后分别以2×10⁸TCID₅₀、2×10⁷TCID₅₀进行加强免疫，同时设载体病毒rAd-EGFP对照组、PBS对照组。初次免疫后2周、3周及加强免疫3周后采血，利用血凝抑制(Hemagglutinin Inhibition，HI)试验方法测定血清中的HI抗体(图6)。在初次免疫后2周即可检测到HI抗体，rAd-H5HA-EGFP高剂量(10⁸TCID₅₀)初次免疫后3周HI抗体约为1：80，加强免疫(2×10⁸TCID₅₀)后3周达1：120，而各对照组HI抗体检测均呈阴性。加强免疫后3周分别用10⁶EID₅₀同源病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株(简称SW/FJ/1/01)和异源病毒A/Chicken/HuNan/77/2005(H5N1)(简称CK/HuN/77/05)进行攻毒，攻毒后每天监测小鼠的体重变化，并于攻毒后4天和6天随机剖杀每组中的3只小鼠，采集脑、脾、肺、肾进行脏器病毒滴定。

结果SW/FJ/1/01病毒攻击后所有的免疫小鼠在第4天和6天各脏器均无病毒复制，且小鼠体重正常增长；而对照组小鼠在攻毒后均能够在肺脏中检测到病毒，且出现体重下降。CK/HuN/77/05病毒攻击后第4天和6天，所有的免疫小鼠肺脏中检测到的病毒含量相比对照组显著下降，小鼠体重均增重，无死亡；而对照组小鼠在攻毒后4天能从脾、肺、肾中检测到病毒，6天后在肺中仍可检测到病毒，且小鼠体重减轻显著，对照组小鼠均出现死亡，死亡率分别为80％(4/5)及100％(5/5)。表明rAd-H5HA-EGFP以10⁸TCID₅₀初免、2×10⁸TCID₅₀加强免疫后能够使免疫小鼠完全抵御同源和异源H5N1亚型流感病毒的攻击；以10⁷TCID₅₀初免、2×10⁷TCID₅₀加强免疫，小鼠能够完全抵御同源病毒的攻击，对异源病毒的攻击也能够提供良好的免疫保护效果。

关于序列表的说明

序列1是HA序列；

序列2是穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP序列。

附图说明

图1为EGFP序列；

图2A为本发明表达H5N1亚型流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)HA基因的重组复制缺陷型腺病毒穿梭质粒的构建流程；

图2B显示pDC315-H5HA-EGFP的PCR鉴定，其中M是DNA分子量标准，1显示以质粒pDC315-H5HA-EGFP为模板的PCR产物，2显示水对照；

图2C显示pDC315-H5HA-EGFP的双酶切鉴定，其中M是DNA分子量标准，1是利用SalI和SmaI的双酶切：pDC315-H5HA-EGFP/SalI+SmaI，2是利用NheI和SmaI的双酶切：pDC315-H5HA-EGFP/NheI+SmaI；

图3为腺病毒骨架载体质粒pBHGlox△E1，E3Cre的图谱；

图4为E1，E3联合缺失的复制缺陷型腺病毒rAd-H5HA-EGFP结构特征，

重组复制缺陷型病毒rAd-H5HA-EGFP缺失部分E1编码区和E3编码区，E1和E3区基因产物对于病毒对抗机体免疫至关重要。连接有Kozak翻译调控序列的全长HA糖蛋白基因及由IRES序列链接的EGFP基因均处于MCMV启动子和SV40polyA信号的控制之下，插入缺失的E1区中；

图5是重组腺病毒构建、筛选及鉴定有关结果；

图5A显示重组病毒出毒时的典型细胞病变(100×)；

图5B显示重组病毒荧光显微镜观察(100×)；

图5C显示重组腺病毒的PCR鉴定结果，其中M是DNA分子量标准，1表示以重组病毒rAd-H5HA-EGFP的DNA为模板的PCR产物，2表示以HEK293细胞的DNA为模板PCR产物；

图5D显示重组病毒rAd-H5HA-EGFP的Western blot分析，其中M是蛋白质分子量标准(170、130、95、72、55、43、34Ku)，1是rAd-EGFP感染的HEK293；2是rAd-H5HA-EGFP感染的HEK293。

图6为rAd-H5HA-EGFP肌肉注射免疫接种BALB/c小鼠后，采用HI试验方法测定血清中的HI抗体的结果；

图7A显示SW/FJ/1/01病毒攻毒后小鼠的体重变化；

图7B显示CK/HuN/77/05攻毒后小鼠的体重变化；

图8显示Ck/HuN/77/05攻毒后小鼠的存活率。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述。

实施例1：构建本发明表达流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)HA基因的重组复制缺陷型腺病毒

A.获得免疫原

取A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)(购自哈尔滨兽医研究所农业部动物流感实验室)在SPF鸡胚(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)增殖48小时后收获尿囊液，加入Trizol试剂(Gibco BRL)提取RNA，用通用引物uni12(序列为：5′-AGCAAAAGCAGG-3′)逆转录获得流感病毒HA基因cDNA。

B.制备、收集和验证重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP以在以上A中获得的cDNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增HA基因，所用引物：上游引物HAF：5′CCC GTC GAC ATG GAGAAA ATA GTG CTT CTT CTT GC 3′；下游引物HAR：5′TCC CCCGGG TTA AAT GCA AAT TCT GCA TTG TAA CG3′；PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，然后94℃1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环。首先将HA基因PCR产物及真核载体pIRES2-EGFP均用SalI和SmaI酶切，回收相应片断，HA基因(序列1)定向克隆到pIRES2-EGFP(购自BD Biosciences Clontech，EGFP序列见图1)中获得重组质粒pHA-IRES-EGFP；再用NotI酶切重组质粒pHA-IRES-EGFP，用DNA聚合酶I(Klenow)大片段进行补平后，再用NheI酶切，得到线性化片段HA-IRES-EGFP(长度约为3.1kb)；用AccI酶切腺病毒穿梭载体pDC315(购自Microbix biosystem，加拿大)，并用DNA聚合酶I(Klenow)大片段补平，再用NheI酶切得到线性化的pDC315质粒片段；将HA-IRES-EGFP片段定向克隆到穿梭质粒pDC315中得到重组穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP(质粒序列见序列2)，构建过程如图2A，以PCR鉴定及酶切图谱分析确认其插入有正向单拷贝外源基因，鉴定结果见图2B及图2C。随后，此重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒pBHGlox△E1，E3Cre(Microbix biosystem，加拿大，该质粒图谱见图3)一起共转染HEK293细胞(ATCC NO：CRL-1573^TM)，因重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP含有腺病毒左侧的反向末端重复序列(LITR)、腺病毒包装信号(ψ)等顺式作用元件以及目的基因HA及由IRES连接的示踪基因EGFP和腺病毒基因组的左端一段序列；骨架质粒pBHGloxΔE1，E3Cre与重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP的3′端略微重叠，然后继续向右，包含有大部分的腺病毒基因组序列。两者共转染入可以表达腺病毒E1区的HEK293细胞并发生同源重组，后经多轮筛选、噬斑纯化、荧光显微镜观察及目的基因鉴定等一系列鉴定后获得复制缺陷型重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP(重组腺病毒构建示意图见图4)。以细胞病变(CPE)和荧光显微镜观察以及对该重组腺病毒进行了PCR鉴定，结果如图5A、图5B及图5C。利用构建好的腺病毒穿梭质粒与腺病毒的骨架质粒共转染HEK293细胞，转染后7-8天后在HEK293细胞上形成腺病毒病变：细胞肿胀，变圆。接种HEK293细胞后至出现腺病毒感染所形成的典型细胞病变：出现葡萄串样变化，病变细胞呈条带状(图5A)。病毒增殖后期细胞变圆，葡萄串样聚集，形态正常细胞零星分布(图5A)，荧光显微镜观察可见强烈荧光信号(图5B)。利用PCR方法检测到目的基因的存在(图5C)。具体操作如下：按常规方法培养HEK293细胞，将重组病毒rAd-H5HA-EGFP以感染复数m.o.i＝5病毒量感染HEK293细胞，待所述细胞病变达80-90％时收获；按Wizard

Genomic DNAPurification System说明书(Promega，美国)进行重组病毒DNA的提取，将重组病毒感染的细胞培养物置于洁净的

微量管中，室温下13000g离心3分钟，以使得基因组DNA与微量管结合，将微量管与收集管分离，弃去收集管中的液体后，并向微量管中加入650μL的

SV洗液，13000g离心1分钟，总共洗四次。13000g离心2分钟后，将微量管置于一洁净收集管中，加入250μL室温无核酸酶(Nuclease-free)的水(为了提高DNA的产量可以将水温升至65℃)。将微量管置于洗脱管中，13000g离心1分钟。再次加入250μL不含核酸酶的水，室温温育2分钟，13000g离心1分钟弃微量管，洗脱液总体积近500μL。所得DNA保存于-20℃或-70℃备用，作重组病毒的PCR鉴定。在重组病毒的PCR鉴定中，以所获得的DNA为模板，使用与扩增HA基因过程中相同的引物及PCR反应条件进行PCR反应，以此来验证HA基因是否已重组到腺病毒的基因组中。

C.重组病毒的基本特性

按照B中所述方法制备DNA。分别选取第4、9及14代rAd-H5HA-EGFP重组病毒基因组DNA为模板进行HA基因的的PCR扩增与测序，结果表明重组病毒在连续传代过程中遗传性状稳定(图略)。

Westrnblotting分析重组病毒rAd-H5HA-EGFP的表达：分别接种重组病毒rAd-H5HA-EGFP、载体病毒rAd-EGFP于HEK293细胞，病变80％左右时收获感染细胞，加入等体积的2×SDS电泳上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH＝6.8、200mmol/L二硫苏糖醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)裂解细胞，置于沸水中煮沸10分钟，使蛋白质充分变性后在标准条件下进行SDS-PAGE电泳和电转移，将分离的蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶/PBS(5％脱脂乳，溶于0.1mol/L的PBS，pH7.4)溶液将硝酸纤维素膜4℃封闭过夜，后用PBS洗涤3次，加入用封闭液配制的1：100倍稀释的H5N1亚型流感病毒多克隆抗血清，37℃作用1小时，再用充分体积的PBS漂洗3次，用Tris-HCl缓冲液(150mmol/L，NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)洗涤一次10分钟。加入IRDyeTM 700DX标记兔抗鸡IgG(Roch land，美国)(用含5％脱脂乳的Tris-HCl缓冲液作1：3000稀释)，37℃摇床孵育1小时。用PBST于摇床洗膜洗涤3次，每次洗涤10分钟。吸净洗涤液后。采用红外荧光扫描成像系统(LI-COR，美国)拍摄照片。Western-blotting分析结果证实HA蛋白能够获得有效表达，并具有天然蛋白的生物学活性(图5D)。

实施例2 rAd-H5HA-EGFP的增殖与纯化

HEK293细胞长至80％-90％饱和时，以感染复数m.o.i＝5～10接种重组病毒rAd-H5HA-EGFP。3-4天后，当细胞病变达到70～90％时，收集细胞液于离心管中，以3500g离心15分钟收获细胞，转移上清至一无菌烧杯中保存备用，并用10ml上清重悬细胞沉淀经过-80℃/25℃(水浴的最高水温不得超过25℃)冻融水浴破碎细胞沉淀3次，再次3500g离心15分钟去除细胞碎片，分离上清并将其与所保留的上清混合，重组病毒的纯化过程按Sartorius AG公司腺病毒纯化试剂盒AdenoPACK^TM100RT说明书进行，将所得的重组病毒小量分装并冻存于-80℃。

实施例3 rAd-H5HA-EGFP感染性滴度的测定(TCID₅₀)

取用培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Media，简称DMEM)+10％ FBS(胎牛血清)预培养的HEK293细胞的1个T75细胞瓶，待细胞生长至80％，收集细胞并用胰酶消化细胞并计数。用5％ FBS的DMEM制备细胞悬液，每板需要11mL浓度为1×10⁵/mL的细胞悬液。按每孔100μL(即约1×10⁴个细胞)加入一块96孔板(如果加做一组重复试验，另加一块96孔板)。无菌操作进行腺病毒样品稀释：取10μL高浓度重组腺病毒液连续10倍倍比稀释，稀释液用5％ FBS的DMEM。另做一组重复试验，再按上述步骤进行第2组稀释。检测过程采用北京本元正阳基因技术有限公司生产的快速腺病毒感染性滴度(TCID₅₀)检测试剂盒，操作及检测结果的计算按试剂盒说明书进行。检测结果表明经纯化及浓缩后的病毒效价(TCID₅₀)为2.26×10¹⁰/mL。

实施例4 BALB/c小鼠免疫效力实验

将6周龄的雌性BALB/c小鼠(n＝100)(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)饲养于洁净负压隔离器内，饲养观察1周后用于动物试验，攻毒实验在生物安全三级实验室完成。以纯化的重组病毒采用肌肉注射途径进行免疫接种，单次免疫方案仅在第0天一次接种重组病毒，而初次/加强免疫方案分别在第0，21天进行免疫接种。实验组接种小鼠与对照组小鼠均在接种后42天后(具体免疫与攻毒方案见表1)，以10⁶EID₅₀(半数鸡胚感染量)剂量的同源病毒SW/FJ/1/01(购自哈尔滨兽医研究所农业部动物流感实验室)和异源病毒Ck/HuN/77/05(购自哈尔滨兽医研究所农业部动物流感实验室)通过滴鼻感染途径进行攻击，在14天的观察期内，每天监测小鼠的体重变化(见图7A及图7B)，同时在攻毒后的第4天及第6天分别剖杀各试验组的3只小鼠，采集脑、脾、肺、肾进行病毒含量滴定，结果见表2，异源病毒攻击后各组小鼠的存活率见图8，同源病毒攻击后免疫组和对照组均未出现小鼠死亡。

表1 rAd-H5HA-EGFP小鼠免疫与攻毒方案

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 一种重组复制缺陷型腺病毒载体H5N1亚型流感基因工程疫苗

<130> IB087246

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1779

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 6978

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

Claims

1.一种重组复制缺陷型腺病毒载体H5N1亚型流感病毒基因工程疫苗，其特征在于以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad-5)为载体，在所述载体的E1区携带有H5N1亚型流感病毒膜糖蛋白编码基因HA，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，所述E1区还携带有用于筛选重组病毒的绿色荧光蛋白示踪基因EGFP。

2.按照权利要求1所述的疫苗，其中，所述HA来自于流感病毒株A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株。

3.按照权利要求1所述的疫苗，其中，所述HA和所述示踪基因EGFP通过核糖体进入位点序列(IRES)相连接。

4.按照权利要求2所述的疫苗，其中，所述的HA基因及示踪基因EGFP均处于MCMV启动子和来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号转录元件的控制之下。

5.重组人5型腺病毒rAd-H5HA-EGFP，其保藏号为CCTCC-V200805。