EA016517B1 - Рекомбинантная псевдоаденовирусная наночастица, фармацевтическая композиция для профилактики или терапии гриппа (варианты), способ профилактики или терапии гриппа - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной псевдоаденовирусной наночастице, несущей экспрессирующую кассету, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует однодоменное мини-антитело, связывающееся с вирусом гриппа, и применимой для профилактики и терапии гриппа. Предусмотрены фармацевтические композиции как содержащие только указанные псевдоаденовирусные наночастицы, так и содержащие дополнительно кодируемые ими однодоменные мини-антитела против вируса гриппа, например, относящегося к типу А (и характеризующегося антигенными формулами H1N(1-9), H3N(1-9) или H5N(1-9)) или к типу В. Композиции предпочтительно вводят интраназально.

Description

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к использованию однодоменных мини-антител (наноантител) в комбинации с аденовирусной системой внутриклеточной доставки и экспрессии кодирующих наноантитела генов для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, в частности гриппа. Получаемые наноантитела также могут быть использованы для диагностики соответствующих инфекционных заболеваний.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Вирус гриппа является опасным инфекционным агентом, вызывающим острые респираторные заболевания, течение которых может происходить с различными легочными (например, пневмония) и внелегочными осложнениями, некоторые из которых могут привести к смертельному исходу. Клиническая картина заболевания может варьировать в зависимости от штамма вируса гриппа, возраста и иммунного статуса хозяина. В среднем, в мире за сезон вирусом гриппа бывает вызвано 3-5 млн случаев острых респираторных заболеваний (из них 200-500 тыс. случаев со смертельным исходом) (Αοτίά Неа11й ОгдашхаΙίοη. Αρτίί, 2009). Кроме сезонных эпидемий, вирус гриппа может вызывать также пандемии. Например, пандемии вируса гриппа были зарегистрированы в 1918, 1957 и 1968 гг. (Деева Э.Г. Грипп. На пороге пандемии. М., ГЭОТАР-Медиа, 2008). Во время пандемий вирусом было поражено более 50% человеческой популяции. В результате пандемии вируса гриппа 1918 г. погибло около 100 млн человек (ίοΐιηδοη апб Мие11ег (2002), Ирбайпд 111е ΑοοοιιηΙδ: όίοΠαΙ ΜοΠαΙίΙν οί 1Пе 1918-1920 8раш5Й 1пПиепха Рапбеш1е Ви11ебп οί 111е ΗίδΙοίΎ οί Меб1еше 76:105-115). Одной из причин возникновения пандемий вируса гриппа является его высокая антигенная изменчивость (антигенный шифт и антигенный дрейф), затрагивающая мажорные белки его оболочки - гемагглютинин и нейраминидазу, на которые происходит формирование иммунного ответа. Поэтому зачастую в организме хозяина нет антител, способных нейтрализовать новый (с измененными антигенами) вирус гриппа, т.е. предсуществующий иммунитет отсутствует. Эффективным способом снижения уровня заболеваемости вирусом гриппа является иммунизация. Однако современные препараты, предназначенные для иммунизации, зачастую содержат антигенный материал (или набор антигенов), отличный от набора антигенов циркулирующего штамма вируса гриппа. Достижение соответствия между антигенным набором вакцинного препарата и циркулирующего штамма является затруднительным по нескольким причинам. Во-первых, вирусы гриппа постоянно претерпевают изменение: каждые 3-5 лет преобладающий штамм вируса гриппа заменяется разновидностью, которая подверглась достаточному антигенному дрейфу, чтобы иметь способность уклониться от уже сформировавшегося иммунного ответа. В связи с этим набор антигенов, входящих в состав вакцинного препарата, должен меняться ежегодно в соответствии с данными о циркулирующих штаммах вируса гриппа, регистрируемыми Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Во-вторых, время, затрачиваемое на изготовление новой вакцины, составляет около 6 месяцев. То есть, чтобы иметь достаточное количество вакцины к началу периода сезонной иммунизации против вируса гриппа, необходимо начать работу над ней еще в предыдущем сезоне. Зачастую предварительные оценки ВОЗ, касающиеся штамма, который будет циркулировать в следующем сезоне, оказываются неточными, а сроки получения новой актуальной вакцины оказываются слишком жесткими. Таким образом, в условиях возникновения новых пандемий проведение стандартных профилактических мероприятий, направленных на индукцию протективного адаптивного иммунитета, может быть неэффективным.

В таких случаях целесообразно применять иные профилактические или терапевтические средства. В настоящее время на фармацевтическом рынке присутствуют 2 класса препаратов, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа: препараты-блокаторы ионных каналов (направлены на белок вируса гриппа М2) и препараты-ингибиторы нейраминидазы вируса гриппа. Ремантадин и амантадин функционируют посредством блокирования активности белка М2 образовывать ионные каналы, что является ключевым моментом на ранней фазе цикла размножения вируса, и предотвращают тем самым проникновение вируса гриппа внутрь клетки. Оба препарата эффективны при лечении заболеваний, вызванных вирусом гриппа типа А, но характеризуются побочными эффектами со стороны ЦНС, печени и почек. Также в экспериментах ίη νίίτο и ίη νίνο было показано, что штаммы вируса гриппа, ранее чувствительные к этим препаратам, могут впоследствии стать к ним резистентными. Озельтамивир и цанамивир являются блокаторами действия нейраминидазы, предотвращая выход новых вирусных частиц из инфицированной клетки и их распространение в организме. Озельтамивир является ингибитором нейраминидаз вирусов гриппа типа А и В. Цанамивир характеризуется сходным действием, но меньшей эффективностью при пероральном приеме. Хотя озельтамивир приводит к облегчению общей симптоматики заболевания, количество носовых выделений (насморк) не уменьшается.

Таким образом, можно заключить, что в настоящее время нет терапевтических или профилактических препаратов против вируса гриппа, сочетающих в себе эффективность и безопасность. Недавние вспышки заболеваний, вызванные вирусом гриппа типа Α Η5Ν1 (еЫекеп) и Η1Ν1 (кМпе) подтверждают высокую потребность в подобных препаратах.

Одним из наиболее быстрых и эффективных способов защиты от патогенов, наряду с антибиотикотерапией, является пассивная иммунизация. Этот способ заключается в том, что вместо антигена хозяину вводят антитела, полученные к протективному антигену патогена, которые способны защищать организм

- 1 016517 хозяина от развития инфекции.

Специальные строго контролируемые исследования показали, что отчетливое противовирусное и терапевтическое действие при гриппе оказывают лишь донорская сыворотка и противогриппозный гамма-глобулин, содержащие высокие титры антител. Гамма-глобулин необходимо назначать по возможности в более ранние сроки внутримышечно: детям по 0,15-0,2 мг/кг, взрослым по 6 мг. В тех же дозах можно использовать нормальный (плацентарный) гамма-глобулин и сывороточный полиглобулин (А.П. Казанцев, В.С. Матковский. Справочник по инфекционным болезням. М., Медицина, 1979, с. 49).

До конца 1960-х гг. в СССР сравнительно широко применялась гипериммунная лошадиная сыворотка для профилактики и лечения гриппа. Интраназальное (внутриносовое) вдувание сухой сыворотки, смешанной с норсульфазолом, создавало опасность массовой аллергизации населения, и от этого препарата пришлось отказаться. Но сама идея использования противовирусных антител, содержащихся в крови людей, остается и реализуется в виде препаратов крови, называемых в настоящее время иммуноглобулинами.

В России выпускаются 2 вида иммуноглобулинов. Один из плацентарной и абортной крови называется иммуноглобулин человека нормальный, содержит все антитела, которые присущи женщинам детородного возраста в период сбора крови в определенной местности. Но его, к сожалению, не удается полностью освободить от некоторых гормонов и других биологически активных веществ. Этого недостатка лишен другой препарат - специфический противогриппозный иммуноглобулин из крови доноров, специально и многократно вакцинированных против гриппа.

Помимо противогриппозных антител, специально стимулируемых вакцинацией, в донорском иммуноглобулине содержатся антитела ко многим широко распространенным инфекционным агентам, в том числе и к респираторным вирусам. Иммуноглобулины обычно вводят внутримышечно. С целью профилактики гриппа нормальный иммуноглобулин человека (специально отобранные серии с высоким титром антител) применяют также интраназально в виде капель или в мелкодисперсном виде (спрее). До недавнего времени иммуноглобулины человеческой крови считались полностью безопасными, не обладающими каким-либо нежелательным побочным действием на организм человека. В последние годы появились сообщения о формировании антител к введенному человеческому белку, особенно при использовании плацентарного препарата, в котором происходит агрегация белковых молекул. Высказываются также опасения, что у часто болеющих детей возможна аллергизация организма. Все эти опасения требуют строгой обоснованности показаний к применению иммуноглобулина, особенно плацентарного. Только высокая вероятность развития заболевания у человека, находившегося в контакте с источником инфекции, оправдывает профилактическую инъекцию препарата. При этом не следует забывать о возможности побочных реакций, клиническое проявление которых разнообразно: от небольшого повышения температуры тела или появления сыпи до развития тяжелого состояния и анафилактического шока.

В определенной степени преодолеть эти недостатки позволяет использование иммуноглобулинов, полученных генно-инженерными методами. В недавних работах было показано, что для защиты животных от действия белка-токсина сибирской язвы (апйтах) можно использовать ксЕу - моноклональные одноцепочечные антитела (которые могут быть легко гуманизированы). Однако применение ксЕу для лечения людей имеет существенные ограничения. ксЕу имеют короткое время полужизни в организме, которое составляет только 10,4 мин. Более того, даже стабилизированные путем конъюгирования с ПЭГ антитела не являются достаточно эффективными. Они имеют увеличенное до 108 ч время полужизни, но для достижения эффективности действия, равной 60%, необходимо использование экстремально высоких доз препарата [МаЬгу В., 1пГсс1 1ттип. 2005; 73:8362-8368]. Использование специфических антител к вирусу гриппа для профилактики и лечения вызываемых им заболеваний является одним из наиболее перспективных подходов. Одноцепочечные мини-антитела (ксЕу) представляют собой минимальный фрагмент молекулы иммуноглобулина, который обладает достаточно хорошей антигенсвязывающей активностью. Они включают только вариабельные домены легких (УЬ) и тяжелых (УН) цепей иммуноглобулина, ковалентно соединенные гибким пептидным линкером, и полностью лишены константных доменов исходного мышиного антитела. Гуманизированные одноцепочечные мини-антитела не отторгаются организмом человека и не вызывают аллергической реакции. Однако данный тип антител имеет ряд недостатков: высокие затраты на их производство и ограниченность генно-инженерных манипуляций.

Другой тип антител, который может применяться для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа, - это однодоменные мини-антитела, полученные на основе антител животных семейства Верблюдовых. Эти антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен этого антитела. Генерируемые одноцепочечные мини-антитела, в отличие от большинства чисто рекомбинантных антител, обычно обладают весьма высоким сродством к заданному антигену благодаря тому, что первая стадия их получения протекает в организме животного (из сем. Верблюдовые), где происходит их аффинное созревание ίη νίνο. По сравнению с традиционными антителами верблюжьи мини-антитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при созда

- 2 016517 нии новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.

Характерными особенностями однодоменных мини-антител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии, являются следующие [см. обзор: Тиллиб С.В. Верблюжьи наноантитела - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].

1) Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.

2) Малый размер, —2x4 нм, 13-15 кДа (улучшенная проницаемость клеток).

3) Структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления скрытых эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.

4) Высокая растворимость и стабильность (в широком диапазоне температур и кислотности среды).

5) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий Е.соН (в количестве 1-10 мг из 1 л культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.

6) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптаций для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

7) Низкая иммуногенность; возможность экономично гуманизировать антитела без заметной потери их специфической активности.

Возможность получения рекомбинантных однодоменных мини-антител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства СашеНбае функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина (без легких цепей), специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом [Нашегк-Сак1егтап С., А1аг1юис11 Т., Миу1бегшап8 8., е! а1. №11ига11у оссштшд ап11Ьоб1ек беуо1б οί ΙίβΙιΙ сйашк. Ыа1иге 1993; 363:446448]. Техническая реализация отбора однодоменных мини-антител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага (фаговый дисплей).

Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для отбора из больших рекомбинантных библиотек пептидов и белков, экспрессирующихся в составе поверхностного белка нитчатых фагов [Впккейе В & 6о1бк1еш N.1. Т1е ике οί рйаде бкр1ау рерббе НЬгапек йог Ьакю апб 1тап81а1юпа1 текеатсй. Ме11обк Мо1 ΒίοΙ. 2007; 383:203-13; 81бйи 8.8. & Ко1бе 8. Р1аде бкр1ау ίοΓ епдшеетшд апб апа1ухшд рго1еш ш1егас1юп йИегГасек. Сигг Орш 81гис1 Вю1. 2007; 17:481-7]. Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов [НоодепЬоош Н.В. 8е1есбпд апб кстеешпд тесошЬшап! апбЬобу НЬгапек. N1 Вю1ес1шо1. 2005; 23:1105-16]. Обычно, вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула в случае правильного сочетания доменов способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменениями. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к аггрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании однодоменных мини-антител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.

Однодоменные мини-антитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцию антигенов (как в исследовательских, так и в диагностических целях), блокирование активности белка-антигена, специфическую доставку за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом.

Также было показано [Ушске С., Ьопк В., 8аегепк Ό., е1 а1.//1. Вю1. СНет. 2009.У. 284. № 5. Р. 32733284], что можно гуманизировать такие верблюжьи мини-антитела без заметной потери их специфиче- 3 016517 ской активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования мини-антител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний |Аеко1о\\'кк| 1., А1ходагау V., Веуе1! 1. е! а1. 8тд1е ботат ап!1Ьоб1ек: рготшпд ехрептеп!а1 апб Шегареибс !оо1к ίη ίηίεοΐίοπ апб 1ттипйу. Меб. МюгоЬю1. 1ттипо1. 2009; 198, 157-174].

Так, было показано (международная патентная публикация АО 2007/052242; Ргепбегдак! Ра(г1ск; Сотрокйюп апб те!1об Гог !ке !геа!теп! οί уиа1 шГес!юп иктд сатейб кеауу скат ап!1Ьоб1ек), что такие антитела способны ингибировать нейраминидазу вирусов гриппа различных штаммов и защищать птиц от развития заболеваний, вызываемых данными вирусами. Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества фармацевтической композиции и способу введения его в организм выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.

Недостатками прототипа являются:

1) всем препаратам (в том числе и антителам), представляющим собой белковые препараты, свойственен такой общий недостаток, как быстрая деградация в организме за счет действия протеолитических ферментов и клеток иммунной системы. Период полураспада чужеродного белка в организме в среднем составляет 2-3 ч. Это приводит к необходимости введения в организм больших доз препаратов для достижения положительного эффекта;

2) для достижения заявляемого эффекта используется схема, состоящая как минимум из 2 этапов: введение препарата, содержащего антитело, а затем его совместное введение с препаратом, ингибирующим ФНО-α. Такая схема служит для предотвращения возникновения различных иммунных реакций на чужеродный белок (антитело). Зачастую повторное введение является затруднительным для пациентов.

Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке эффективной и универсальной фармацевтической композиции, служащей для профилактики и терапии гриппа, что и явилось задачей настоящего изобретения.

Раскрытие настоящего изобретения

Указанная выше задача настоящего изобретения решается тем, что разработку препарата проводят с использованием в качестве носителя для действующего вещества (антитела) рекомбинантной псевдоаденовирусной наночастицы (РПАН), экспрессирующей гены однодоменных мини-антител, способных связывать и/или нейтрализовывать вирус гриппа. Также для решения задачи предложены композиции, содержащие РПАН, несущие гены одного или нескольких однодоменных мини-антител, и композиции, состоящие как из РПАН, так и из однодоменных мини-антител (белков).

Выбор путей реализации с целью получения фармацевтической композиции с заявляемыми свойствами обусловлен следующими факторами.

1) Предлагаемое техническое решение предусматривает использование РПАН в качестве носителя для действующего вещества вакцины и адъюванта. РПАН - это природная, биосовместимая наноструктура, созданная на основе аденовируса. Каждая РПАН содержит ДНК, заключенную в гетерогенную по составу белков оболочку. При этом в состав ДНК РПАН осуществляют одну или несколько вставок чужеродной ДНК, которая представляет собой ген антитела против патогенного организма. Также в состав ДНК РПАН осуществляют вставку целевого гена в составе экспрессирующей кассеты. При введении в организм РПАН проникают в различные типы клетки, где осуществляют экспрессию встроенных в ДНК генов. В этой связи РПАН являются широко используемым инструментом для доставки генов в клетки человека и животных [В. Наггор, е! а1., Абуапсеб Эгид Эекуегу Ве\зе\\ъ. V. 58,1. 8, 2006, Р. 931-947].

Наряду с вышеперечисленным, РПАН отличаются высокой эффективностью экспрессии целевого гена в различных типах клеток, безопасностью для человека и животных, большой пакующей емкостью вектора и т.д.

Таким образом, использование РПАН в качестве носителя для действующего вещества заявляемой композиции позволяет доставлять в организм гены целевых белков, что, в свою очередь, обеспечивает продление периода циркуляции продукта целевого гена в организме.

2) В качестве носителя используют РПАН, полученные на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа. Известно, что такие РПАН используются на практике наиболее часто. В настоящее время на основе РПАН разрабатываются вакцины против различных бактериальных (туляремия, туберкулез, бруцеллез и др.) и вирусных (вирус иммунодефицита человека, папилломавирус человека, вирус бешенства, вирус Эбола и др.) патогенов человека [Аапд 1., Ткогкоп Ь., 8юкек В.А., 8ап!окиокко М., Ниудеп К., 2дашасх А., Нк! М., Хшд Ζ. 8тд1е тисока1, Ьи! по! рагеп!ега1, пптиш/абоп \νί11ι гесотЫпап! абепоу1га1-Ьакеб уассше ртоу1бек ро!еп! рто!ес!юп Ггот ри1топагу !иЬегси1ок1к. 1. 1ттипо1. 2004 Ыоу 15; 173(10):6357-65.; Ктскагбкоп 1.8., Уао М.К., Тгап Κ.Ν., Сгоу1е М.А., З!гопд 1.Е., Ее1бтапп Н., КоЬшдет С.Р. Епкапсеб рто!ес!юп адате! ЕЬо1а У1тик теб1а!еб Ьу ап ппргогеб абепоутак-Ьакеб уассте. РЬо8 Опе. 2009; 4(4):е5308. ЕриЬ 2009 Арг 23.; Ь1 А.Н., Ζΐκπίβ Υ., Аапд З.Н., Ьщ Ь., Уапд Е. ВесотЫпап! герйсабопбеГесбуе абепоуиик Ьакеб таЫек уассше. Ζкοπддиο Υί Хие Ке Хие Υиаπ Хие Вао. 2003 Эес; 25(6):6504.;Ьеек С/Υ., Вбддк Ό.Ε, Аи X., Эау1к Β.Ό., Мооге З.М., Согбоп С., Х1апд Ζ., Ег!1 Н.С., Тапд Э.С., Ей Ζ.Ε. 1пбисбоп оГ рто!ес!1уе пптипбу Ьу !орю аррбсабоп оГ а тесотЬтап! абепоу1гик ехртекктд таЫек У1тик д1усорго!еш. Vе! МютоЬю1. 2002 Арг 2; 85(4):295-303]. Так, были получены РПАН, содержащие нуклеотид

- 4 016517 ную последовательность гемагглютинина вируса гриппа человека, для дальнейшего использования в качестве вакцины для человека и животных против патогенного штамма вируса гриппа (Уассше. 2005, V. 23, р. 1029-1036). Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Η5Ν1 включали в ДНК РПАН на основе аденовируса человека 5-го серотипа также с целью использования полученного продукта как вакцины для человека, млекопитающих животных и птиц (Уассше 2007, 1. оГ Упо1оду, 2006, V. 80, № 4, р. 19591964). Также РПАН использовали для генной терапии опухолей в случае, когда в ДНК РПАН был клонирован ген опухолевого супрессора р53 (И8 7033750). Кроме того, два препарата РПАН на основе аденовируса человека 5-го серотипа разрешены к применению в онкологии.

Поскольку в природе проникновение аденовирусов в организм осуществляется через слизистые оболочки респираторного тракта, в последнее время данный тип вектора активно используется при разработке на его основе мукозальных (назальных) вакцин (международная патентная публикация \νϋ 2010/037027; Того Нато16о е! а1.; ΙιηιηιιηίζαΙίοη оГ ηνίηηβ Ьу тисова1 αώηίηίβΐηΐίοη оГ иои-герНсаНид уесЮгеб уассшев).

3) С помощью РПАН может быть решена проблема нестабильности препаратов антител (вводимых в организм в виде белков).

4) РПАН стабильны, могут быть лиофилизованы, могут храниться при 4°С длительное время без потери активности.

5) Технологии получения рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц в промышленных масштабах являются экономически оправданными и позволяют получать препараты РПАН с высоким титром (в среднем 10¹⁰ БОЕ/мл). Процесс получения нового вида РПАН занимает несколько недель, что может позволить быстро реагировать на меняющуюся эпидемиологическую обстановку в максимально сжатые сроки [К. Наггор, е! а1., Абгамсеб Итид ОеНуету Кеу1е^5, V. 58, 1.8, 2006, Р. 931-947].

6) Использование такой конструкции позволяет обеспечивать наработку протективного уровня антител уже через 96 ч после введения. Более того, протективный уровень антител поддерживается в организме не менее 2 недель [Кавиуа К., Мо1 ТЬег. 2005 БеЬ;11(2):237-44; 8оГет-Ро6ев1а С., ИтГес! ^тиш 2009 Арг; 77(4): 1561-8; СЫисЫо1о М.1., 1. 1пГес1 Όίβ. 2006 №ν 1; 194(9): 1249-57].

Использование вакцины, представляющей собой РПАН, несущую в составе ДНК ген антитела, способного нейтрализовать вирус гриппа типа актуального штамма, позволяет обеспечить уже через 48-96 ч защиту организма от циркулирующего на данный момент штамма вируса гриппа. Использование композиции, состоящей из нескольких РПАН, позволяет обеспечить уже через 48-96 ч защиту организма как от циркулирующего на данный момент штамма вируса гриппа, так и от штамма, наиболее часто вызывающего пандемии. Более того, использование фармацевтической композиции, состоящей из нескольких РПАН и белковых препаратов соответствующих однодоменных мини-антител, позволяет обеспечить защиту организма как от циркулирующего на данный момент штамма вируса гриппа, так и от штамма, наиболее часто вызывающего пандемии, непосредственно после введения препарата.

Настоящее изобретение объединяет преимущества различных упомянутых подходов и относится к рекомбинантной псевдоаденовирусной наночастице, несущей экспрессирующую кассету, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует однодоменное мини-антитело, связывающееся с вирусом гриппа.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа типа А, характеризующийся антигенной формулой Η1Ν(1-9).

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа типа А, характеризующийся антигенной формулой Η3Ν(19) или Η5Ν(1-9).

В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа типа В.

Несмотря на то что, главным образом, в иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается некоторый акцент на борьбу с вирусами гриппа наиболее актуальных в настоящее время типов и антигенных формул, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты заявленных объектов настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или терапии гриппа, представляющей собой суспензию раскрытых выше рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц в фармацевтически приемлемом растворителе или наполнителе.

Применение такой фармацевтической композиции позволяет добиться транзиторной экспрессии у пациента однодоменных мини-антител, которые за счет своих уникальных свойств, подробно описанных выше, способны обеспечивать достаточно надежную иммунную защиту против вируса гриппа. Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что применение такой фармацевтической композиции эффективно в основном для профилактики инфекции.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения указанные псевдоаденовирусные наночастицы несут экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотид

- 5 016517 ные последовательности, которые кодируют однодоменные мини-антитела одного, двух или трех видов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или терапии гриппа, представляющей собой суспензию раскрытых выше рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц и однодоменных мини-антител, связывающихся с вирусом гриппа того же типа и антигенной формулы (тех же типов и антигенных формул), что и однодоменные мини-антитела, кодируемые экспрессирующими кассетами, содержащимися в указанных рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастицах, в фармацевтически приемлемом растворителе или наполнителе.

Применение такой фармацевтической композиции позволяет обеспечить достаточно надежную иммунную защиту против вируса гриппа не только в порядке профилактики, но и после инфицирования пациента вирусом гриппа. Разумеется, чем на более ранней стадии инфекции будет применена заявленная фармацевтическая композиция, тем более эффективным окажется такое лечение.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция содержит однодоменные мини-антитела одного, двух или трех видов и раскрытые выше рекомбинантные псевдоаденовирусные наночастицы, несущие экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют однодоменные миниантитела того же вида (тех же видов).

Термин фармацевтически приемлемый для целей настоящего изобретения означает, что растворитель или наполнитель не оказывает каких-либо неблагоприятных действий на пациентов, которым его вводят. Такие фармацевтически приемлемые растворители и наполнители хорошо известны из предшествующего уровня техники (Кеш1пд1ои'8 Рйаттасеикса1 8сюпсс5. 18111 οάίΐίοη. А.В. Сеииаго, Ек., МаскРиЬНккшд Сотраиу [1990]; Ркагтасеикса1 ЕотшкИюп Оеуе1ортеп1 οί Рерккек апк Рго!ешк, 8. Егок)аег аик Ь. Ноудаагк, Екк., Тау1ог & Егапск [2000]; НапкЬоок оГРкагтасеикса1 ЕхшрхеШк, 3гк екШоп, А. К1ЬЬе, Ек., Ркаттасеикса1 Ргекк [2000]).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу профилактики или терапии гриппа, предусматривающему введение нуждающемуся в этом пациенту профилактически или терапевтически эффективного количества одной из раскрытых выше фармацевтических композиций.

Если иное не оговорено специально, термин лечение и использован как родовой для обозначения нанесения на участок тела пациента или введение в его организм лекарственного средства по любым показаниям и не предназначен для проведения различий между профилактическими, терапевтическими, диагностическими, паллиативными или иными процедурами. Термин терапевтически эффективное количество означает такое количество нанесенного лекарственного средства, которое обеспечивает необходимый терапевтический эффект, например, в данном случае - проявление противовирусной активности. В термин терапевтически эффективное количество входит понятие о единичной дозе лекарственного средства, использованного в ходе лечения в течение времени, требуемого для достижения желаемого терапевтического эффекта. Значение сходного термина профилактически эффективное количество отличается лишь тем, что в этом количестве лекарственное средство должно быть применено не для купирования развившегося заболевания (здесь - гриппа), а для недопущения его развития.

В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию вводят интраназально.

В соответствии с более конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения интраназальное введение осуществляют в форме капель или в форме спрея (аэрозоля).

Авторы настоящего изобретения исходят из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных мини-антител могут быть затем адаптированы или форматированы различным образом для последующего практического использования в составе заявленных в соответствии с настоящим изобретением фармацевтических композиций.

Так, однодоменные мини-антитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных мини-антител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные мини-антитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или далее с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных мини-антител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов [СопгаШ К.Е., Ьаиетегеук М., ОТупк Ь., Миу1кегтапк 8. Сате1 ктдк-коташ апкЬоЛек ак токи1аг Ьш1кшд иш1к ш ЫкресШс апк Ь1уа1еп1 апкЬоку сопк1гис1к. 1. Вю1 Скет. 2001 Маг 9; 276 (10): 7346-50; 211апд 1., Тапка 1., Нката Т., КЫеи Ν.Η., То В., Топд-8еушс Н., 81опе Е., Впккоп 1.В., МасКепх1е С.В. РегиатепхаЦоп оГ ктд1е-котат апкЬоЛек Ггот ркаде кЬгапек: а поуе1 к1га1еду Гог 1ке гар1к депегакоп оГ Ыдк-ау1кку апкЬоку геадеШк. 1. Мо1 Вю1. 2004 1ап 2; 335 (1): 49-56; С.’ог1ех-Ве1а1похо V., Васктапп Ν., 8еп1ег Р.Э., ОТетегу и., Эе Ваекекег Р., Миу1кегтапк 8., Реуе1к Н. ЕГПаеп! сапсег Легару νίΐΐι а папоЬоку-Ьакек соп]ида1е. Сапсег Век. 2004 Арг 15; 64 (8): 28537; Вага1 Т.К, Мадех 8., 8к^1ешаик В., СопгаЛ К., Vаийο11еЬеке В., Раук Е., Мцу1кегтапк 8. Эе Вае1кекег Р. Ехрептеп1а1 Легару оГ АГпсап Цурапокопиакк \νίΛ а папоЬоку-сопщдаЮк 1штап 1гурапо1укс ГасЮг. №11 Мек. 2006 Мау; 12 (5): 580-4; Сорр1е!егк К., Оге1ег Т., 811епсе К., Наагк Н.Э., Ьаитегеук М., Сак!ее1к Р.,

- 6 016517

Вс1гпасг1 Е., 1опск11ссгс Н., \У1е1е С.У., 8!ае1епк Ь., Нок!еп8 1., Веуе!к Н., Вешай! Е., Е1е\\'аи! Ό., ВоШетк Р. Еотша!!ей ап!1-!итог песгсЮк Гас!ог а1рка УНН рто!еш8 йепуей Ггот сатеййк 81ю\\' киретюг ро!епсу апй !агде!шд !о шПатей )от!к ш а титте тойе1 оГ со11адеп-тйисей аНкгШк. АйктШк Вкеит. 2006 1ип; 54 (6): 1856-66]; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы [НатЬиту Р.В., Ζΐιοί'ΐβ Т., К1т Р.8., е! а1. А к\У1!с11 Ье!\\'ееп 1\то-. !11гее- апй Гоит-йтаийей сойей сойк ίπ СС№4 1еисше /|ррег ти!ап!к. 8с1епсе, 1993, 262:1401-1407; 8ЫтакЫ Т., 8ихиуата К., Окато!о Н. е! а1. Шсгеакей су!о!охюйу оГ ко1иЬ1е Еак йдапй Ьу Гикшд 18о1еисше /|ррег тоРГ. Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттишс. 2004, 322: 197-202; СйепсЫк А., Сийкоу А., Котагоу А., Ыа!ата]ап У. Веадеп!к апй те!йойк Гог ртойисшд Ьюасйуе 8есте!ей рерййек. 2010. И8 Ра!еп! Аррйсайоп 20100305002], последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы |Эеуеу 8.М., \Уа1Ье1 В., ЬеЬейепко Ε.Ν., ЗсйиЫдет А.Р., Р1иск!йип А. Эекщп оГ ти1йуа1еп! сотр1ехек икшд !ке Ьатпа8е*Ьат8!аг тойи1е. №а! Вю!ескпо1. 2003, 21(12): 1486-92].

Для модулирования свойств препарата однодоменного мини-антитела, например увеличения времени жизни 1п у1уо (в крови пациента), в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности, последовательности белков (таких, например, как сывороточный альбумин) или другое однодоменное мини-антитело, специфически связывающееся с мажорным и долгоживущим белком в крови человека (например, альбумином или иммуноглобулином) [С1ЬЬк ν.ν. №апоЬой1ек. 8с1 Ат. 2005 Аид; 293 (2): 78-83; Нагткеп М.М., Уап 8о1! С.В., Еу!еп Н.Р., Уап 8е!!еп М.С. Рго1опдей ш у1уо текШепсе йтек оГ 11ата 8шд1е-йоташ апйЬойу Ггадтеп!к ш р1дк Ьу Ьшйшд !о рогсше 1ттипод1оЬи1т8. Уассше. 2005 8ер 30; 23 (41): 4926-34; Сорр1е!ег8 К., Эге1ег Т., 8йепсе К., Наагй Н.Э., Ьаи\уегеу8 М., Сак!ее18 Р., Ве1тпаег! Е., 1опсккееге Н., \У1е1е С.У., 8!ае1епк Ь., Нок!еп8 1., Веуе!к Н., Ветаи! Е., Е1е\\т.11 Ό., ВоШетк Р. Еотшайей ап!1-!итог песго818 Гас!ог а1рка УНН рто!еш8 йепуей Ггот сатеййк 81ю\\' киретюг ро!епсу апй !атде!шд !о шПатей |о1 п!к ш а титте тойе1 оГ со11адеп-шйисей аййпйк. Аг!кг1!1к Вкеит. 2006 1ип; 54 (6): 1856-66].

Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных мини-антител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином однодоменные миниантитела как первичные, исходно получаемые, минимальные аминокислотные последовательности однодоменных мини-антител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптаций или форматирования и их варианты. Полным эквивалентом термина однодоменные мини-антитела для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение нанотело (наноантитело), введенное фирмой АВЬУ№Х (ΝΛΝΟΒΟΩΥ™).

Термин вариант антитела для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного однодоменного мини-антитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно от 1 до 15 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного миниантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного мини-антитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе ВЬА8Т 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Та

- 7 016517 ким образом, примеры консервативных замен включают замену А1а на 8ег или ТНг. замену Лтд на С1п. Н18 или Бук, замену Акп на С1и, С1п, Бук, Ηΐδ или Акр. замену Акр на Акп, С1и или С1п, замену Сук на 8ет или А1а, замену С1п на Акп, С1и, Бук, Н1к, Акр или Агд, замену С1и на Акп, С1п, Бук или Акр, замену С1у на Рго, замену Н1к на Акп, Бук, С1п, Агд или Туг, замену 11е на Беи, Ме!, Уа1 или РНе, замену Беи на 11е, Ме!, Уа1 или РНе, замену Бук на Акп, С1и, С1п, Н1к или Агд, замену Ме! на 11е, Беи, Уа1 или РНе, замену РНе на Тгр, Туг, Ме!, 11е или Беи, замену 8ет на ТНг или А1а, замену ТНг на 8ет или А1а, замену Тгр на РНе или Туг, замену Туг на Н1к, РНе или Тгр и замену Уа1 на Ме!, 11е или Беи.

Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное однодоменное мини-антитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, тот же функциональный полипептид исходного однодоменного мини-антитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке, и установления активности экспрессируемого продукта.

Организация вариабельных доменов неканонических антител (УНН, наноантител) в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (УН) классических антител (у человека УН-домены иммуноглобулинов подкласса 1дС3 имеют особо выраженную гомологию с УН и УНН верблюдовых). В обоих случаях У-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (РК, Ггатегогк гедюпк), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, СБК, от сотр1етеп!ап!у бе!егт1шпд гедюпк). В обоих случаях домены формируют типичную для У-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (-листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти [Раб1ап Е.А. Х-Кау сгук!а11одгарйу оГ ап!1Ьоб1ек. Абу. Рго!ет СНет. 1996; 49: 57-133. Миу1бегтапк 8., СатЬШаи С., \Уупк Б. Кесодпйюп оГ апйдепк Ьу кшд1е-ботат апйЬобу Ггадтеп!к: !йе кирегДиоик 1ихигу оГ раиеб боташк. Т1В8 2001; 26: 230-235]. В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны У-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием УНН в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки СБК1 и СБК.3 заметно увеличены в случае УНН. Часто в гипервариабельных участках УНН обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в СБК1 и СЭК3, реже в СБК2 и СБК3). При исследовании кристаллических структур УНН было показано, что эти цистеиновые остатки формируют дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком УНН являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Уа137РНе, С1у44С1и, Беи45Агд, Ттр47С1у, согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае УН домена является высоко консервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом УБ легкой цепи. УНН-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию УНН и УБ. Эти замены также объясняют высокую растворимость УНН, наноантитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка [Тиллиб С.В. Верблюжьи наноантитела - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].

Именно гипервариабельные районы мини-антител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, и именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности мини-антител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности мини-антител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках (указанных в перечне последовательностей как СЭК) на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты (консервативных замен).

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.

Полипептиды однодоменных мини-антител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном (см. табл. 1). Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав экспрессирующих кассет, содержащихся в заявленных в соответствии с настоящим изобретением рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастицах, подпадающих под объем настоящего изобретения.

- 8 016517

Таблица 1

Универсальная таблица кодирования аминокислот

А!а	8си есс дса	аланин
Αι-β	ае.а ас<2, са.и сцс сца с£.ц	аргинин
Азп	ааи аас	аспаргин
Азр	§аи дас	аспаргиновая кислота
Суз	и§и ирс	цистеин
О1п	саа са&	глутамин
С1и	.саа	глутаминовая кислота
О1у	ёеи ёёс да с.ае	глицин
ΗΪ8	саи сас	гистидин
Не	аии аис аиа	изолейцин
Ьеи	ииа ии£ сии сис сиа си&	лейцин
Буз	ааа аа£	лизин
Ме!	айв	метионин
РЬе	иии иис	фенилаланин
Рго	сси ссс сса сс&	пролин
Зег	а&и а§с иси исс иса ис§	серин
ТЬг	аси асе аса ас§	треонин
!гт	иаа иа§ и§а	стоп-кодон
Тгр		триптофан
Туг	иаи иас	тирозин
Уа1	Вии §ис виа вив	валин

Краткое описание фигур

На фиг. 1 проиллюстрированы результаты фингерпринтного анализа последовательностей отобранных однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3. Приведены электрофореграммы параллельных переваров амплифицированных ДНК-последовательностей частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (ΗίπίΙ-Η, ΜβρΙ-Μδ, ВзаКК.). Справа в каждом случае дорожка с маркерными фрагментами ДНК (М). Видно, что фингерпринты последовательностей этих трех мини-антител заметно отличаются.

На фиг. 2 проиллюстрированы результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранными однодоменными мини-антителами (ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3) иммобилизованного в лунках иммунологической плашки препарата вируса гриппа. В качестве контрольных использовали ячейки с иммобилизованным белком овальбумином кур.

На фиг. 3 представлены графики зависимости выживаемости мышей после интраназального введения рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 и последующего заражения их вирусом гриппа птиц А/Ма11аг6 6ι.ιο1</ΡΛ/10218/84(Η5Ν2) от времени после заражения. Одинарная сплошная линия - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, одинарная пунктирная - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ2 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, одинарная штрихпунктирная - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Л65ΗΝ3 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, двойная сплошная - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Л6-ии11, не содержащий вставку целевого гена в экспрессирующей кассете в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, двойная пунктирная - 20 мкл интраназально 1х РВ8.

На фиг. 4 представлены графики зависимости изменения массы тела мышей после интраназального введения рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 и последующего заражения их вирусом гриппа птиц Л/Ма11аг6 6ιιο1</ΡΛ/10218/84(Η5Ν2) от времени после заражения. Одинарная сплошная линия - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Ά65-ΗΝ1 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, одинарная пунктирная - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ2 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, одинарная штрихпунктирная - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ3 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, двойная сплошная - 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Л6-ии11, не содержащий вставку целевого гена в экспрессирующей кассете в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, двойная пунктирная - 20 мкл интраназально 1х РВ8.

- 9 016517

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1.

Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител.

Иммунизация.

Двугорбого верблюда Сате1ц§ Ьаскгапик (самку 6 лет) последовательно иммунизировали 4 раза путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом неполного адъюванта Фройнда. В качестве антигена использовали препарат инактивированного вируса гриппа птиц А/Ма11агк киск/РА/10218/84(Н5Н2) из музея ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России и препарата вируса гриппа птиц Н5Ы2 (штамм А/17/Утка/Потсдам/86/92), полученного от ФГУП НПО Микроген Минздравсоцразвития России, г. Иркутск. Вторую иммунизацию проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще две иммунизации. Взятие крови (150 мл) проводили через 6 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного солевого раствора (РВ8), содержащего гепарин (100 ед./мл) и ЭДТА (3 мМ).

Выделение В-лимфоцитов.

Кровь разводили в 2 раза стандартным солевым раствором (РВ8), содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Н|51орас.|ис-1077. 81дта) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800х д. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Нк!орадие, после чего промывали раствором РВ8, содержащим 1 мМ ЭДТА.

Выделение РНК из В-лимфоцитов.

Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента ΤΚΙζοΙ (1пуйгодеп). Затем, на колонке с олиго(кТ)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (ЕррепкогГ) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.

Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице поли(А)+РНК, выделенной из Влимфоцитов.

Реакцию обратной транскрипции проводили в 40 мкл по стандартному протоколу [8атЬгоок е! а1., 1989] с использованием обратной транскриптазы Н-М-МиЬУ, 1 мкг РНК и 1 мкг праймера олиго(кТ)15 в качестве затравки.

Амплификация фрагментов кДНК, кодирующих вариабельные домены антител.

Продукты обратной транскрипции (1 мкл) использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции объемом 50 мкл, содержащей два праймера САГЬ001 (5'-д1сс1ддс1дс1с11с1асаадд-3'; 8ЕО ΙΌ N0: 1) и САЬЬ002 (5'-дд1асд1дс1дйдаас1дйсс-3'; 8ЕО ΙΌ N0: 2) в количестве 20 пикомолей в следующих условиях 95°С, 90 с, (95°С - 30 с, 59°С - 120 с, 72°С - 90 с) х 30 циклов, 72°С, 300 с. Продукты амплификации разделяли в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Продукты амплификации размером 600-800 п.н., соответствующие неканоническим антителам, выделялись из геля с помощью набора ΡΙАЕХ II (ΟΙΑΟΕΝ, США) и использовались в качестве матрицы в аналогичной реакции амплификации с праймерами 5'-ссадссддсса!ддс!да!д!дсадс!дд!ддад!с!дд-3' (8ЕО ΙΌ N0: 3) и 5'-ддас!ад!дсддссдс!!даддадасдд!дасс!ддд1-3' (8Е0 ΙΌ N0: 4), содержащими дополнительные последовательности, соответствующие участкам узнавания рестрикционных эндонуклеаз, соответственно NсοI и №В.

Создание библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител.

Полученные продукты амплификации клонировали по сайтам NсοI и Шк в фагмидный вектор рНЕШ и, используя в качестве фага-помощника бактериофаг М13К07 (№\ν Епд1апк Вю1аЬ§, США), получали фаговую библиотеку с поверхностной экспрессией вариабельных доменов одноцепочечных антител, как описано [Натега-Сайегтап е! а1., 1993; Nдиуеп е! а1, 2001; 8аегеп§ е! а1., 2004; ЯоФЬаиег е! а1., 2006].

Пример 2.

Селекция однодоменных мини-антител, специфически узнающих вирус гриппа.

Селекцию однодоменных мини-антител проводили методом фагового дисплея с использованием препарата инактивированного вируса гриппа птиц А/Ма11агк киск/РА/10218/84(Н5№), иммобилизованного на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией МIСЯ0^0N 600 (Стешет Вю-0пе). Для блокировки использовали 1% БСА (81дта-А1кксй, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Вю-Яак, США) в РВ8. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген однодоменного миниантитела внутри, а экспрессирующееся однодоменное мини-антитело - в составе поверхностного фагового белка ρΙΙΙ) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано в публикациях Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции наноантител методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Ас!а №1Ц.1гае 2010; 2 (3): 100-108; Натега-Сайегтап С., А!агйоисй Т., Мцу1кегтап§ 8. е! а1. книге 1993; 363: 446-448.; Nдиуеп У.К., ЭеыпуЮг А., Миу1кегтап§ 8. Аку. Iттипο1. 2001; 79: 261-296; 8аегеп§ И., Кшпе 1.,

- 10 016517

Возшаиз Е., ^етпету и., Миу16еттап8 3., Сопга!й К. 1. ΒίοΙ. Сйет. 2004; 279: 51965-51972; Во!йЬаиег и., 2о1дйа6г К., ТПЙЬ 3., е! а1. №Шге Ме!йо6з 2006; 3: 887-889].

Последовательности клонов отобранных однодоменных мини-антител, находящихся в составе плазмиды ρΗΕΝ4, группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных мини-антител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (ΗίπίΙ, ΜκρΙ, КзаГ). Были отобраны три группы последовательностей однодоменных мини-антител (ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3), характеризующихся паттернами рестрикции, приведенными на фиг. 1.

Последовательности кДНК однодоменных мини-антител (3ЕО Ш ΝΟ: 5-7) были определены для представителей каждой из этих трех групп. В указанных последовательностях подчеркнуты соответственно (слева направо) гипервариабельные участки СЭК.1, СЭК2 и СЭК.3 антигенузнающих последовательностей отобранных однодоменных мини-антител (наноантител). В наноантителе ΗΝ1 (3Е0 ПЭ ΝΟ: 5) несколько более чем у двух других наноантител, распространен в сторону Ν-конца участок СЭК.1. Во всех трех наноантителах присутствует дополнительная пара аминокислотных остатков цистеина в гипервариабельных участках (соответственно в СЭК.2 и СЭК.3 в ΗΝ1 наноантителе (3Е0 ΙΌ ΝΟ: 5) и в СЭК.1 и СЭК.3 - в случае ΗΝ2 и ΗΝ3 наноантител (3Е0 ΙΌ ΝΟ: 6 и 7)), что является характерным часто обнаруживаемым отличием наноантител от вариабельных доменов классических антител. Было показано, что эти дополнительные остатки цистеина образуют между собой связь, которая стабилизирует получающуюся при этом конформацию мини-антитела.

Продукция наноантител.

Последовательности кДНК каждого из трех вариантов отобранных однодоменных мини-антител, ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3, переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор - модифицированный вектор ρΗΕΝ6 [Сопга!й К.Е., Ьаитегеуз М., Оа11еш М., Ма!адпе А., Бтете ЕМ., К1ппе 1., \Ууп8 Ь., МиуИеттапз 3. Ве!а-1ас!атазе 1пй1Ьйог8 бепгеб Ггот мпДе-боташ апйЬобу Ггадтепй ейсйеб т !йе Сатейбае, Ап11т1сгой Адеп!з Сйето!йег. 2001; 45:2807-12], позволяющий присоединение к С-концу однодоменного миниантитела (П18)6-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом, кодируемым в векторе ρΗΕΝ6). Благодаря наличию на Ν-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (ре1В) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное мини-антитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных мини-антител проводили в Е.сой (штамм ВЬ21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-Э-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 ч при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменные мини-антитела выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Νί-ΝΤΑагарозе с использованием системы для очистки ^IΑΕxρ^е88^οш8ΐ (ΟΙΑΟΕΝ. США).

Демонстрация связывания однодоменных мини-антител с вирусом гриппа.

Способность однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 связывать вирус гриппа проверяли с использованием метода иммуноферментного анализа с иммобилизованным рекомбинантным инактивированным вирусом гриппа птиц А/Ма11аг6 6^Ε/ΡΑ/10218/84(Η5Ν2), по стандартному протоколу. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур (неспецифический белок). Детекцию связавшихся с вирусом гриппа однодоменных мини-антител проводили с помощью анти-НА антител мыши, вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата АБТС (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновой кислоты, 3фта).

На фиг. 2 представлены результаты анализа, из которых следует, что однодоменные мини-антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 специфически связываются с препаратом вируса гриппа, но не связываются с овальбумином или БСА, использованным в качестве блокирующего агента.

Отобранные последовательности однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 затем клонировали в геном рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы.

Пример 3.

Создание плазмидных конструкций ρ3йиίι1е-СΜV-ΗN1, ρ3йиΐί1е-СΜV-ΗN2 и ρ3йиΐί1е-СΜV-ΗN3 с участками генома аденовируса человека 5-го серотипа для получения рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц, несущих экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют однодоменные мини-антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 соответственно, связывающиеся с вирусом гриппа.

Для получения плазмидных конструкций ρ3йиίι1е-СΜV-ΗN1, ρ3йиΐί1е-СΜV-ΗN2 и ρ3йи!!1е-СΜVΗΝ3 в качестве вектора используют плазмидную конструкцию ρ3йиΐΐ1е-СΜV с участками генома аденовируса человека 5-го серотипа для получения рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц, входящую в набор к системе АбЕазу Абепо\зга1 уес!от зуз!ет (3!га!адепе Са!. №. 240009). Плазмидную конструкцию ρ3йи!!1е-СΜV гидролизуют по сайту для эндонуклеазы рестрикции ЕсоЯУ, а затем осуществляют вставку нуклеотидных последовательностей однодоменных мини-антител, получая, соответственно, конструкции ρ3йи!!1е-СΜV-ΗN1, ρ3йи!!1е-СΜV-ΗN2 и ρ3йи!!1е-СΜV-ΗN3. Нуклеотидные последовательности однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 для вставки в ρ3йи!!1е-СΜV получают пу

- 11 016517 тем гидролиза соответствующих плазмидных конструкций рЛЬ-ΗΝΊ, ρΑΕ-ΗΝ2 и рЛЬ-НЫЗ по сайтам для эндонуклеазы рестрикции ЕсоВУ. Наличие генов однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 в составе соответствующих плазмидных конструкций ρ81ιιι111οί.’Μν-ΗΝ1. ρί>1ιιι111οί.’Μν-ΗΝ2 и р8йий1е0Μν-ΗΝ3 подтверждают рестрикционным анализом при использовании эндонуклеазы ЕсоВ1, ΝοΐΙ и ЕсоВУ и методом ПЦР.

Пример 4.

Получение рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3, несущих экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют однодоменные мини-антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 соответственно, связывающиеся с вирусом гриппа.

Получение рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 проводят согласно методике ЛбЕаку Лбепо\зга1 νесΐο^ куйет (81га1адепе Са1. Νο. 240009). Наличие генов однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 в составе соответствующих рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 подтверждают методом ПЦР.

Далее определяют титры препаратов рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 методом бляшкообразования на культуре клеток 293 (клетки эмбриональной почки человека).

Пример 5.

Нейтрализация вируса гриппа однодоменными мини-антителами ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 в культуре клеток ίη νίίτο.

Постановку реакции вирус-нейтрализации проводят с использованием линии клеток МОСК, культивируемых в 96-луночных культуральных планшетах Ήοδί3Γ, США) до конфлюэнтности клеточного монослоя 80%. Перед проведением реакции в культуральных планшетах с клетками среду заменяют на бессывороточную. Для проведения реакции используют вирус гриппа птиц Л/МаПагб 6ικ1</ΡΑ/10218/84(Η5Ν2) в дозе, равной 100 ТЦД50 на лунку. Разведения вируса и исследуемых антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 производят в бессывороточной среде ЭМЕМ. В лунки 96-луночного планшета вносят по 50 мкл суспензии вируса, затем добавляют в каждую лунку равные объемы двукратных разведений сывороток, начиная с 1:10. Планшет инкубируют при 37°С 1 ч. После инкубации смесь вируса и сывороток добавляют в каждую лунку планшета с клетками для адсорбции вируса на клетках. Клетки инкубируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 2 ч. Затем из планшетов отбирают бессывороточную среду и заменяют ее на содержащую эмбриональную сыворотку КРС среду МЕМ с 0,2% БСА и трипсином в концентрации 1 мкг/мл. Результаты реакции вирус-нейтрализации учитывают через 72 ч по наступлению ЦПД в культуре клеток по методу Рида и Менча. Антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 обеспечивают нейтрализацию вируса гриппа в интервале концентраций от 0,009 до 2,5 мкг/мл.

Пример 6.

Нейтрализация вируса гриппа однодоменными мини-антителами ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3, экспрессируемыми рекомбинантными псевдоаденовирусными наночастицами Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 в культуре клеток ίη νίίτο.

Экспрессию однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 производят в клетках линии А549. Для этого клетки А549 рассевают на лунки 48-луночного планшета ΉοδίΗΓ, США) в количестве 104 клеток на лунку, после чего к клеткам добавляют бессывороточную среду 293ΑΟΤ (Ιηνίίτο^η, США) и инкубируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 20-24 ч. Затем клетки трансдуцируют препаратами рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 в дозе 5 БОЕ/клетку. Клетки инкубируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 2 ч, после чего из лунок отбирают среду и заменяют ее новой порцией среды 293ΑΟΤ. Трансдуцированные клетки инкубируют в течение 72 ч, затем производят отбор культуральной среды. Таким образом, получают препараты культуральной среды, содержащей экспрессированные рекомбинантными псевдоаденовирусными наночастицами Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 однодоменные мини-антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3.

Постановку реакции вирус-нейтрализации проводят с использованием линии клеток МОСК, культивируемых в 96-луночных культуральных планшетах Ήοδί3Γ, США) до конфлюэнтности клеточного монослоя 80%. Перед проведением реакции в культуральных планшетах с клетками среду заменяют на бессывороточную. Для проведения реакции используют вирус гриппа птиц Α/Майагб 6^Ε/ΡΑ/10218/84(Η5Ν2) в дозе, равной 100 ТЦД50 на лунку. Разведения вируса и культуральной среды, содержащей исследуемые антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 производят в бессывороточной среде ЭМЕМ. В лунки 96-луночного планшета вносят по 50 мкл суспензии вируса, затем добавляют в каждую лунку равные объемы двукратных разведений сывороток, начиная с 1:10. Планшет инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После инкубации смесь вируса и сывороток добавляют в каждую лунку планшета с клетками для адсорбции вируса на клетках. Клетки инкубируют при 37°С и 5% СО2 в течение 2 ч. Затем из планшетов отбирают бессывороточную среду и заменяют ее на содержащую эмбриональную сыворотку КРС среду МЕМ с 0,2% БСА и трипсином в концентрации 1 мкг/мл. Результаты реакции вирус-нейтрализации учитывают через 72 ч по наступлению ЦПД в культуре клеток по методу Рида и Менча. Препараты культуральной среды, содержащей экспрессированные рекомбинантными псевдоаденовирусными наночастицами Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 однодоменные мини-антитела ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 обеспечивают ней

- 12 016517 трализацию вируса гриппа в разведении 1:100.

Пример 7.

Применение рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых вирусом гриппа.

С целью профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа мышей линии Ва1Ь/с, самок весом 18 г разделяют на 5 групп по 50 мышей в каждой группе:

первой группе мышей вводят 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, второй группе мышей вводят 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ2 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, третьей группе мышей вводят 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ3 в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, четвертой группе мышей вводят 20 мкл интраназально препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Αά-ηπ11, не содержащий вставку целевого гена в экспрессирующей кассете в дозе 10⁷ БОЕ/мышь, пятой группе мышей 20 мкл интраназально 1х РВ8.

Через 72 ч после введения вышеуказанных препаратов мышей заражают 25 ЛД50 адаптированным по своим вирулентным свойствам для модели мышей вирусом гриппа птиц Л/МаПагб 6ικ1</ΡΑ/10218/84(Η5Ν2). Заражение производят интраназально под легким эфирным наркозом. В течение 14 дней после заражения учитывают выживаемость мышей и изменение их веса.

Протекция мышей против вируса Α/МаИагб ά^ΕΦΑ/10218/84(Η5Ν2) составляет 95-100% в группах, которым вводили препараты рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 (см. фиг. 3). Также у этих мышей не наблюдается уменьшение массы тела. Кривые уменьшения массы тела у мышей каждой из пяти вышеуказанных групп после инфекции вирусом гриппа представлены на фиг. 4.

Таким образом, интраназальное введение однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 полностью защищает от заражения вирусом гриппа.

Пример 8.

Применение фармакологической композиции, состоящей из однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 и рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых вирусом гриппа.

С целью проведения профилактики и терапии заболеваний, вызываемых вирусом гриппа мышей линии Ва1Ь/с, самок весом 18 г разделяют на 36 групп по 20 мышей в каждой группе:

1, 2 и 3 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг однодоменных мини-антител ΗΝ1 и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65ΗΝ1;

4, 5 и 6 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг однодоменных мини-антител ΗΝ2 и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65ΗΝ2;

7, 8 и 9 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг однодоменных мини-антител ΗΝ3 и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65ΗΝ3;

10, 11 и 12 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг БСА и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1;

13, 14 и 15 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг БСА и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ2;

16, 17 и 18 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг БСА и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ3;

19, 20 и 21 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг однодоменных мини-антител ΗΝ1 и 10 БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ηυ11;

22, 23 и 24 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг однодоменных мини-антител ΗΝ2 и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ηυ11;

25, 26 и 27 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг однодоменных мини-антител ΗΝ3 и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ηυ11;

28, 29 и 30 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально препарата, содержащего 3 мкг БСА и 10⁷ БОЕ рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ηυ11;

31, 32 и 33 группа - каждому животному вводят 20 мкл интраназально 1хРВ8;

34, 35 и 36 группа - интактные мыши.

- 13 016517

В группах 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31 и 34 через 1 ч после введения вышеуказанных препаратов мышей заражают 25 ЛД50 адаптированным по своим вирулентным свойствам для модели мышей вирусом гриппа птиц А/Ма11атб биск/РА/10218/84(Н5№). Заражение производят интраназально под легким эфирным наркозом. В течение 14 дней после заражения учитывают выживаемость мышей и изменение их массы тела.

В группах 2, 4, 8, 11, 14, 17, 21, 23, 26, 29, 32 и 35 через 72 ч после введения вышеуказанных препаратов мышей заражают 25 ЛД50 адаптированным по своим вирулентным свойствам для модели мышей вирусом гриппа птиц А/Ма11атб биск/РА/10218/84(Н5№). Заражение производят интраназально под легким эфирным наркозом. В течение 14 дней после заражения учитывают выживаемость мышей и изменение их массы тела.

В группах 3, 6, 9, 12, 15, 18, 22, 24, 27, 30, 33 и 36 через 14 дней после введения вышеуказанных препаратов мышей заражают 25 ЛД50 адаптированным по своим вирулентным свойствам для модели мышей вирусом гриппа птиц А/Ма11атб биск/РА/10218/84(Н5№). Заражение производят интраназально под легким эфирным наркозом. В течение 14 дней после заражения учитывают выживаемость мышей и изменение их массы тела.

Протекция мышей против вируса А/Ма11атб 6ι.ιο1</ΡΑ/1Ο218/84(Η5Ν2) составляет 95-100% в группах 1-9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 22 и 25 (см. табл.1). Также у этих мышей не наблюдается уменьшение массы тела (см. табл. 2).

Таблица 2 Выживаемость и изменение веса мышей после интраназального введения фармакологической композиции, состоящей из однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 и рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц А65-НЫ1, А65-НЫ2 и А65-НЫ3, и последующего заражения их вирусом гриппа птиц А/Ма11атб биск/РА/10218/84(Н5Ы2)

- 14 016517

11	5	100
12	6	100
13	20	50
14	6	100
15	6	100
16	20	50
17	5	100
18	5	100
19	4	100
20	35	0
21	35	0
22	5	100
23	35	0
24	35	0
25	5	100
26	35	0
27	35	0
28	35	0
29	35	0
30	35	0
31	35	0
32	35	0
33	35	0
34	35	0
35	40	0
36	35	0

Таким образом, интраназальное введение фармакологической композиции, состоящей из однодоменных мини-антител ΗΝ1, ΗΝ2 и ΗΝ3 и рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц Α65-ΗΝ1, Α65-ΗΝ2 и Α65-ΗΝ3 полностью защищает от заражения вирусом гриппа.

Таким образом, заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции доказали свою применимость для терапии и профилактики гриппа.

Claims (12)

1. Рекомбинантная псевдоаденовирусная наночастица, несущая экспрессирующую кассету, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует однодоменное мини-антитело, связывающееся с вирусом гриппа типа А или типа В.

2. Псевдоаденовирусная наночастица по п.1, причем вирус гриппа типа А характеризуется антигенной формулой Η1Ν(1-9).

3. Псевдоаденовирусная наночастица по п.1, причем вирус гриппа типа А характеризуется антигенной формулой Η3Ν(1-9).

4. Псевдоаденовирусная наночастица по п.1, причем вирус гриппа типа А характеризуется антигенной формулой Η5Ν(1-9).

5. Фармацевтическая композиция для профилактики или терапии гриппа, представляющая собой суспензию рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц по любому из пп.1-4 в фармацевтически приемлемом растворителе или наполнителе.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой указанные псевдоаденовирусные наночастицы несут экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют однодоменные мини-антитела одного, двух или трех видов.

7. Фармацевтическая композиция для профилактики или терапии гриппа, представляющая собой суспензию рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц по любому из пп.1-4 и однодоменных мини-антител, связывающихся с вирусом гриппа того же типа и антигенной формулы (тех же типов и антигенных формул), что и однодоменные мини-антитела, кодируемые экспрессирующими кассетами, содержащимися в указанных рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастицах, в фармацевтически приемлемом растворителе или наполнителе.

- 15 016517

8. Фармацевтическая композиция по п.7, содержащая однодоменные мини-антитела одного, двух или трех видов и рекомбинантные псевдоаденовирусные наночастицы по любому из пп.1-4, несущие экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют однодоменные мини-антитела того же вида (тех же видов).

9. Способ профилактики или терапии гриппа, предусматривающий введение нуждающемуся в этом пациенту профилактически или терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.5-8.

10. Способ по п.9, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят интраназально.

11. Способ по п.10, в котором интраназальное введение осуществляют в форме капель.

12. Способ по п.10, в котором интраназальное введение осуществляют в форме спрея.