CN102174508A - 山羊痘病毒复制非必需区的筛选方法及其通用转移载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种山羊痘病毒复制非必需区的筛选方法及其通用转移载体，是通过PCR方法扩增山羊痘病毒基因组某两区域两端基因片段，然后将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因表达盒插入上述片段中，构建2个山羊痘病毒通用转移载体，由上述转移载体获得稳定表达外源基因的重组病毒，从而确定所选区域为山羊痘病毒的复制非必需区，上述通用转移载体含有1个独特的酶切位点Sal I，可插入其它目的基因表达盒。利用本发明提供的两个通用转移载体所获得的重组病毒，不仅具有与亲本病毒相近的生长性能，而且由于基因组中多个毒力相关基因被定向敲除，因此安全性更佳，具备开发成为基因工程减毒疫苗株的潜力。

Description

山羊痘病毒复制非必需区的筛选方法及其通用转移载体

技术领域

本发明涉及一种动物疫病的弱毒疫苗病毒载体的制备，更具体涉及地到制备重组山羊痘病毒所应当事先掌握的病毒复制非必需区的筛选方法以及山痘病毒通用转移载体的构建，属于生物技术领域。

背景技术

山羊痘是由山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，病畜以发热、全身性起痘、呼吸道和消化道损伤以及淋巴结肿大为特征。该病暴发与流行不仅可给当地养羊业和农村经济造成巨大的经济损失，还严重影响着国际贸易，因此被OIE列为需要报告的疫病，也被我国列为一类动物疫病。

接种弱毒疫苗是防控山羊痘的有效手段。另外，GTPV宿主范围仅限于羊及小反刍兽，对人类和其它动物不具感染性和致病性，作为活病毒载体研制重组多价疫苗有着明显的优势。表达口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒等病原体保护性抗原的重组GTPV可以同时提高针对GTPV和上述病原体感染的免疫保护。因此，研制GTPV载体在防治羊及其他小反刍兽疫病方面具有广阔的应用前景，而筛选出病毒复制非必需区是构建GTPV载体的前提和基础。

AV41是目前我国广泛使用的弱毒株，免疫原性良好，具备开发疫苗载体的潜在价值。但其在对我国南方省份地方品种山羊、进口纯种羊和改良羊使用中，存在不良反应大，可引起全身发痘和孕羊流产等安全性问题，严重影响了当地山羊痘的防控工作。我国是山羊痘多发的国家，研制安全、高效的新型疫苗对于控制乃至消灭该病尤为重要。

随着DNA重组技术的发展，基因工程疫苗的研究取得了快速发展。采用基因工程技术构建的新型基因缺失(陷)山羊痘弱毒疫苗有望具有更低的毒力和更高的安全性。近年来，人们发现GTPV基因组中的胸苷激酶(TK)基因、核糖核苷酸还原酶(RR)基因和γ-干扰素受体(γ-IFN R)基因是病毒复制非必需基因，在人工缺失(陷)上述基因所获得的重组病毒不仅具有与亲本病毒基本相近的生长特性和免疫原性，而且致病性有一定程度的降低。然而，研究发现提高痘病毒活疫苗安全性最有效的方法是直接删除大段编码毒力相关基因的病毒基因组片段。例如，由Paoletti等利用痘苗病毒哥本哈根株构建的基因工程减毒株NYVAC。该毒株基因组中6条片段，包括与宿主范围相关C7L和K1L基因，以及与毒力和致病性相关的TK、HA、VGF和RR基因等16个非必需基因，均被通过分子手段精确删除。研究发现NYVAC在人细胞中复制能力显著降低，对实验动物致病力显著减弱，但仍能诱导针对外源基因和其自身良好的免疫反应，是一株十分理想的弱毒疫苗株和病毒载体。这提示我们，可以通过同时删除多个GTPV复制非必需基因，甚至大段基因组区段来达到致弱病毒的目的。2002年，GTPV全基因组序列的解析为我们借助生物信息学分析结果，通过选择性地缺失或缺陷某些基因从而获取毒力更低、安全性更好的弱毒疫苗株奠定了基础。

GTPV基因组为一个共价闭合的双链DNA，大小约149kb。其基因组至少有147个ORF，基因组中央编码区(ORF24～ORF123)主要为痘病毒家族保守基因，编码病毒复制所需的必需因子(分别参与病毒转录、RNA编辑、病毒DNA复制、病毒粒子的构建和装配等)，在基因数目和排列顺序上高度保守；而位于中央编码区两侧区域的基因(ORF1～ORF23以及ORF124～ORF156)与病毒感染的宿主范围、毒力、组织嗜性等特性有关。通过全基因组序列比对和检索，我们发现GTPV基因组左侧ORF5～ORF19共计15个ORF的编码产物基本均与GTPV调控宿主免疫应答，抑制宿主细胞凋亡等生物活性相关，其中有9个负责调节宿主的免疫反应，1个参与核酸代谢，1个调控病毒与宿主的相互作用，2个为凋亡抑制蛋白，另外还有2个ORF不完整。而位于GTPV基因组右侧的ORF149编码一个serpin样蛋白，具有抑制凋亡作用；ORF151编码一个Kelch样蛋白，具有免疫调节作用；ORF152编码一个未知功能的蛋白，与痘苗病毒A52蛋白同源。因此，我们推测GTPV ORF5～ORF19以及ORF149～ORF151两段基因组区域可能是病毒复制非必需区，能够被删除而不会明显影响病毒的存活，但却能显著降低病毒对宿主的致病力。

筛选病毒复制非必需区是构建重组山羊痘病毒的前提与基础，良好的复制非必需区不仅可使以其制备重组病毒保持良好的生长能力和免疫原性，而且能显著降低毒株的致病性从而提高其安全性。公开文献报道了一些有关山羊痘病毒载体的构建和重组山羊痘病毒的制备方法，我们经过检索文献，列出了以下的相关文献报道：

1、中国专利，名称：小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗，申请(专利)号：CN200810166154.2申请日：2008.10.08，公开号：CN101422607公开(公告)日：2009.05.06申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所地址：黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号，发明(设计)人：步志高；胡森；陈伟业，摘要：小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗，其包括：(1)GPV弱毒疫苗，其作为载体；(2)PPRV疫苗的病毒囊膜表面融合蛋白F基因或血凝素蛋白H基因，其作为目的免疫基因；和(3)筛选基因，其包括gpt，和报告基因eGFP。这两种疫苗分别命名为GPV-PPRV-F(CGMCC No.2621)和GPV-PPRV-H(CGMCC No.2619)。该发明还提供所述疫苗的制备方法和应用。重组山羊痘病毒活载体疫苗可以联合使用，用于同时预防GP、绵羊痘和PPR。

2、中国专利，名称：山羊痘疫苗株表达载体，申请(专利)号：CN200710180005.7申请日：2007.10.24 公开(公告)号：CN101418314公开(公告)日：2009.04.29 申请(专利权)人：石河子大学，地址：新疆维吾尔自治区石河子市新疆石河子北四路发明(设计)人：陈创夫；郭志儒；李有文；魏风 专利代理机构：石河子恒智专利代理事务所 代理人：王勇 摘要：本发明提供用于在重组山羊痘病毒中表达外源蛋白的表达载体，在表达载体中的VV I1L启动子或VV P11启动子下游，插入外源基因，通过与山羊痘病毒亲本株同源重组获得12个表达外源蛋白的重组羊痘病毒，载体中能与山羊痘病毒亲本株发生同源重组的侧翼序列是羊痘病毒G14-STV-44-55疫苗株，含TK基因或IFNR-γ基因或RR小亚基基因，利用这些表达载体可以用不同的方法，构建表达不同外源蛋白的重组山羊痘病毒，这些重组病毒即可以作为重组活载体疫苗，用于疾病的防治、研究不同生物活性蛋白质的表达、加工、结构与功能的关系。主权项：1、一种用于在重组山羊痘病毒中表达外源蛋白的表达载体，其特征在于，在表达载体中的VV I1L启动子如序列表中的<210>10或VV P11启动子如序列表中的<210>11下游，插入外源基因，通过与山羊痘病毒亲本株同源重组获得12个表达外源蛋白的重组羊痘病毒。

3、中国期刊：【题名】山羊痘基因工程标记疫苗的初步研究，【作者】王芳 刘胜旺 邵昱昊 陈洪岩【机构】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室，哈尔滨，【刊名】中国比较医学杂志.2007，17(8).-I0015-I0015，【文摘】为了有效地预防和根除山羊痘，研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒(goat pox virus，GPV)疫苗株AV41胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因克隆、鉴定的基础上，构建转移载体。将痘苗病毒(Vaccinia Virus，VV)晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点，经酶切、PCR鉴定出，命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸(bovine testes，BT)细胞，待出现80％以上的细胞病变时收获病毒，经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定，获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒，命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示，LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲本株相似，保持原有疫苗株的生长特性，而且在BT细胞和羔羊睾丸(lamb testes，LT)细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物，为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定基础。

4、中国期刊：【题名】表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定，【作者】南文金[1，2] 王清华[1] 吴晓东[1] 赵永刚[1] 王志亮[1]【机构】[1]中国动物卫生与流行病学中心，[2]扬州大学兽医学院，【刊名】中国动物检疫.2009，26(2).-31-34，【文摘】在包含山羊痘病毒(Goatpox virus，GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因，构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp，这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞，验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后，在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因，构建重组质粒PtkPgpt-egfpP，该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP，利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。

5、中国期刊：【题名】山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定，【作者】郑敏[1] 刘棋[1] 金宁一[2] 施开创[1] 梁媛[1] 莫胜兰[1] 屈素洁[1] 陆文俊[1] 胡博[2]【机构】[1]广西动物疫病预防控制中心，[2]军事医学科学院军事兽医研究所【刊名】畜牧兽医学报.2010，31(1).-65-70，【文摘】通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体。采用PCR方法，克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242bp的基因片段，以及ORF18～ORF19间1 355bp的片段。接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂，构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg。然后采用脂质体介导法，将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞，通过空斑纯化筛选阳性重组病毒，并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性。结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg。该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代，并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同。表明上述区域是GTPV的复制非必需区。

上述文献均表明，在构建重组山羊痘病毒时，筛选恰当的病毒复制非必需区极为关键。为了做到这些，目前本领域的技术人员仍然不断通过试验找到更好的方法，来获得安全、低毒的基因工程山羊痘减毒疫苗株及山羊痘活载体疫苗。

发明内容

本发明的目的在于筛选出GTPV的复制非必需区，以此开发出毒力更小、安全性更好的山羊痘活病毒载体。通过构建通用的转移质粒载体，不仅可以将外源目的基因导入GTPV基因组，而且能同时定向敲除掉多个病毒毒力相关基因，以期获得安全、低毒的基因工程山羊痘减毒疫苗株或者山羊痘活载体疫苗。

本发明目的是通过以下技术方案来实现：

一种GTPV复制非必需区片段的筛选方法，其包括下述步骤：

(1)根据病毒基因组某区域两端序列设计引物，以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为材料，通过PCR扩增该区域两侧基因组片段分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；

(2)将两侧重组臂相连，然后在两个重组臂中间插入报告基因和筛选基因的表达盒，构建转移载体质粒；

(3)将转移载体质粒与GTPV AV41株共转染原代牛睾丸细胞或者非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，然后筛选重组GTPV；

(4)通过病毒复制效率证实所选基因组区域为GTPV的复制非必需区。

上述步骤(1)所述的基因组区域是包括病毒基因组ORF5到ORF19(参照Genbank登录号为NC_004003的Pellor株GTPV全基因组序列，位于2162nt～13249nt)的片段，或者是包括ORF149到ORF151(位于142573nt～145807nt)的基因组片段。

上述步骤(1)所述的同源重组左侧臂是病毒基因组ORF3到ORF6(位于1281nt～2941nt)的基因组片段，同源重组右侧臂是ORF19到ORF20(位于12316nt～13865nt)的基因组片段。

上述步骤(1)所述的同源重组左侧臂还可以是病毒基因组ORF148到ORF149的基因组片段(位于141772nt～143440nt)，同源重组右侧臂还可以是ORF151到ORF152(位于144942nt～146012nt)的基因组片段。

上述步骤(2)所述的报告基因是EGFP。

上述步骤(2)所述的筛选基因是gpt。

重组GTPV的通用转移载体，其包括：(1)上述的同源重组左侧臂和右侧臂；(2)筛选基因为黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因；(3)报告基因为绿色荧光蛋白(EGFP)基因；(4)在gpt基因侧翼含有独特的单一酶切位点Sal I，或者插入其它目的基因。

上述其它目的基因可以是病毒、细菌或者寄生虫的抗原基因、致病基因、肿瘤相关基因，人、畜、禽免疫调节基因以及其它动物的免疫基因。

重组GTPVvLF-Eg和vRF-Eg，由上述通用转移载体所获得；并且vLF-Eg基因组缺失了ORF5到ORF19共15个ORF，而vRF-Eg基因组缺失了ORF149到ORF151共3个ORF。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明确定了GTPV基因组中的两个病毒复制非必需区；利用本发明提供的两个通用转移载体获得重组病毒，不仅具有与亲本病毒相近的生长性能，而且由于基因组中多个毒力相关基因被定向敲除，因此安全性更佳，具备开发成为基因工程减毒疫苗株的潜力。

此外，从以上的背景技术中我们看到，其中文献1的专利“小反刍兽疫重组山羊痘病毒活载体疫苗”和文献3：“山羊痘基因工程标记疫苗的初步研究”以及文献4：“表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定”均选择已知的病毒复制非必需基因——TK基因(ORF66)作为构建重组病毒的同源重组臂；文献2，专利“山羊痘疫苗株表达载体”则选择TK基因、IFNR-γ基因和RR小亚基基因等非必需基因作为同源重组臂。这些文献所涉及的病毒复制非必需区很有限，所获得重组病毒只有1个毒力基因被插入缺失，因此对病毒毒力的影响较小，安全性提高程度不够。本发明人2010年发表文献5“山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定”，已证明ORF8到ORF18之间的基因组区域是病毒复制非必需区，可以据此构建删除9个ORF，长达7kb基因组片段的重组山羊痘病毒。与之相比，本发明进一步提出ORF5到ORF19的基因组区域是山羊痘病毒的复制非必需区，所涉及的区域比前者更大，包含的毒力相关基因更多。同时，本发明还提供了另外一个复制非必需区，即ORF149到ORF151基因组的区域。因此，根据本发明所构建的重组山羊痘病毒可以缺失更多的毒力相关基因，在保持生长性能基本不变的情况下，安全性更高，更具有应用前景。

附图说明

图1是同源重组臂克隆以及重组转移载体构建流程图。

图2所示为山羊痘病毒重组转移载体质粒pLF-Eg序列。

图3所示为山羊痘病毒重组转移载体质粒pRF-Eg序列。

图4是重组病毒PCR鉴定结果。

图5是重组病毒生长曲线图。

图6是重组病毒vLF-Eg(B～E)和vRF-Eg(G～J)稳定性试验结果图。

图1所示为4个同源重组臂的扩增、克隆过程以及重组转移载体pLF-Eg和pRF-Eg的构建流程图。首先提取AV41株GTPV基因组DNA，利用4对特异性引物对分别扩增出4条同源重组臂，然后克隆到pMD-18 T载体上，分别获得pMD-LR、pMD-LR和pMD-RR等4个质粒。用内切酶EcoRⅠ消化pMD-LL，回收大片段再连接获得pMD-LLt；接着用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化pMD-LR获得1.48kb的LR片段；将其与Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化pMD-LLt获得的载体相连接，构建中间质粒pMD-Lfragment。用HindⅢ消化pMD-RL，获取1.14kb的RL大部分片段；用HindⅢ消化pMD-RR获得载体，将上步获得的RL片段插入构建中间质粒pMD-Rfragment。用Sal Ⅰ和Xba Ⅰ消化质粒pTK-Eg，获得pEL-EGFP-p75-gpt表达盒；然后插入用Sal Ⅰ和Spe Ⅰ消化的pMD-Lfragment载体中，即构建转移载体质粒pLF-Eg(SEQ ID No.1)。用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化pTK-Eg获得pEL-EGFP-p75-gpt表达盒；然后插入同样用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化的pMD-Rfragment载体中，即获得转移载体质粒pRF-Eg(SEQ ID No.2)。

图2所示为山羊痘病毒重组转移载体质粒pLF-Eg序列(SEQ ID No.1)，其中，有下划线并加粗：左侧重组臂；有下划线但未加粗：右侧重组臂；有阴影并加粗：EGFP基因；有阴影未加粗：gpt基因；有边框并加粗：痘苗病毒pE/L启动子；有边框但未加粗：痘苗病毒p7.5启动子；正常印刷体：骨架序列，关键酶切位点用大写字母表示，其中单一酶切位点Sal I用粗体、斜体大写字母表示。

图3所示为山羊痘病毒重组转移载体质粒pRF-Eg序列(SEQ ID No.2)，其中，有下划线并加粗：左侧重组臂；有下划线但未加粗：右侧重组臂；有阴影并加粗：EGFP基因；有阴影未加粗：gpt基因；有边框并加粗：痘苗病毒pE/L启动子；有边框但未加粗：痘苗病毒p7.5启动子；正常印刷体：骨架序列，关键酶切位点用大写字母表示，其中单一酶切Sal I用粗体、斜体大写字母表示。

图4所示为重组病毒PCR鉴定结果。泳道1为GTPV AV41株用EGFP引物对扩增，无目的条带；泳道2为GTPV AV41株用LL引物对扩增，有1.66kb左右目的条带；泳道3为GTPVAV41株用RL引物对扩增，有1.66kb左右目的条带；M1为DNA标准DL2000；M2为DNA标准λ-EcoRT14 I；泳道4～5为F1和F10代vLF-Eg用EGFP引物对扩增，有大小为0.72kb的目的条带；泳道6～7为F1和F10代vRF-Eg用EGFP引物对扩增，有大小为0.72kb的目的条带；泳道8～9为F1和F10代vLF-Eg用LL引物对扩增，无目的条带；泳道10～11为F1和F10代vRF-Eg用LR引物对扩增，无目的条带。

图5所示为重组病毒生长曲线。结果表明，两株重组病毒与亲本病毒的生长曲线基本一致。在48h～96h期间，病毒处于快速增殖期，病毒滴度迅速升高，vRF-Eg增速较慢，毒价比亲本毒低1个数量级，而vLF-Eg与亲本毒几乎一致；96h～120h期间，病毒生长趋缓，vRF-Eg与亲本毒滴度仍相差1个数量级左右；120h以后，病毒增殖缓慢，毒价不再增加。

图6所示为重组病毒vLF-Eg和vRF-Eg稳定性试验结果。其中(A)为健康细胞；(F)为GTPV亲本株；(B～E)分别为F1代、F5代、F10代和F15代vLF-Eg，病毒携带的绿色荧光蛋白EGFP基因能稳定持续表达；(G～J)分别为F1代、F5代、F10代和F15代vRF-Eg，病毒携带的绿色荧光蛋白EGFP基因同样能稳定持续表达。

具体实施方式

1 引物设计

(1)左侧复制非必需区(ORF5～ORF19)

同源重组左侧臂(LL)：上游引物为5’-AATTTTACAGCTGAGCAA TC-3’，下游引物为5’-ACGAAGGATTTAATTCAACA-3’。扩增跨度为1.66kb的片段，位于GTPV基因组左侧ORF3到ORF6区域(参照Genbank登录号为的Pellor株GTPV基因组全序列，位于1281nt～2941nt)。同源重组右侧臂(LR)：上游引物为5’-TACTGGGTTGTTGAAT GGTT-3’，下游引物为5’-AAATCTGAATGGGCTAGAAA-3’。扩增跨度为1.55kb的片段，位于GTPV基因组左侧ORF19到ORF20区域(位于12316nt～13865nt)

(2)右侧复制非必需区(ORF149～ORF151)

同源重组左侧臂(RL)：上游引物为5’-TTTCTTATCCGCATTAGA TG-3’，下游引物为5’-AGATAGTTCTGCTCCTTCTT-3’。扩增跨度为1.67kb的片段，位于GTPV基因组右侧ORF148到ORF149区域(位于141772nt～143440nt)。

同源重组右侧臂(RR)：上游引物为5’-ATTCAGGCGGAAATCCA ATA-3’，下游引物为5’-ATGGCGAATCTCGTTGTAAG-3’。扩增跨度为1.07kb的片段，位于GTPV基因组右侧ORF151到ORF152区域(位于144942nt～146012nt)

2、重组臂的扩增、克隆

原代犊牛睾丸(bovine testicle，BT)细胞的制备：选用初生犊牛，以无菌手术摘取睾丸，剥弃鞘膜及白膜，剪成1～2mm小块，用Hank’S液洗3次，按睾丸组织量的10倍加入0.25％胰酶溶液，置37℃水浴中消化，至睾丸组织块呈蓬松状，弃胰酶液，用吸管吹打法分散细胞并用细胞生长液10％MEM稀释成每毫升含100万左右个细胞，分装，放37℃5％CO₂的培养箱中静置培养，2～4d即可长成单层。

GTPV的增殖：以0.25％胰蛋白酶消化BT细胞，加入含10％犊牛血清的MEM培养液分装于细胞培养瓶静止培养，24h贴壁形成单层后，倾去培养液。将GTPV AV41种毒用维持液稀释后，取1mL病毒稀释液加入细胞单层上，于37℃吸附2h，补加10mL含2％犊牛血清的MEM维持液，37℃继续培养，病变达80％以上收获。

病毒滴度的测定：用含有2％犊牛血清的MEM维持液将收获的种毒以10^-1～10^-7系列稀释后按每孔100μL接种已长成80-90％的BT细胞的96孔板，每滴度接8孔。5％ CO₂ 37℃培养7d，每天观察并记录出现病变孔数，按Karber法计算病毒滴度。

病毒基因组DNA的提取：采用商业化病毒核酸提取试剂盒提取，具体操作按产品说明书进行。

PCR：首先配制PCR反应液，包括5μL Ex PCR Buffer(10×)、200μmol/L dNTP混合物、1.5mmol/L MgCl₂、上游引物和下游引物各20pmol、5U Ex Taq酶、100ng病毒DNA模板，补蒸馏水至50μL。降落式PCR反应参数为94℃预变性3min；94℃变性1min；57℃退火1min；72℃延伸1min，10个循环；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min；20个循环；72℃再延伸10min。

扩增产物克隆鉴定：将扩增产物分别用商业化凝胶DNA回收试剂盒回收，与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞。挑取LB平板上的白色菌落，接种于4mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养过夜。取菌液进行常规小量质粒提取，通过PCR、酶切鉴定和测序分析，将片段插入方面与预期相符的阳性质粒分别命名为pMD-LL、pMD-LR、pMD-LR和pMD-RR。

3、GTPV转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg的构建

左侧复制非必需区两侧重组臂的相连：首先用内切酶EcoR Ⅰ消化pMD-LL，回收大片段再连接，从而去除LL片段部分序列(包含1个Spe Ⅰ位点)以及其pMD18-T载体上部分酶切位点，获得pMD-LLt；接着用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化pMD-LR，回收1.48kb的LR片段；然后用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化pMD-LLt，回收载体，与前面回收的LR片段相连接，即获得同时包含两侧同源重组臂的中间质粒pMD-Lfragment。

右侧复制非必需区两侧重组臂的相连：用HindⅢ消化pMD-RL，获取1.14kb的RL大部分片段；然后同样用HindⅢ消化pMD-RR，将上步获得的RL片段插入，鉴定方向即可获得中间质粒pMD-Rfragment。

转移载体质粒pLF-Eg的构建：用Sal Ⅰ和XbaⅠ消化包含报告EGFP和筛选基因gpt表达盒的质粒pTK-Eg，获得pEL-EGFP-p75-gpt表达盒；然后插入用Sal Ⅰ和Spe Ⅰ消化的pMD-Lfragment载体中，即获得转移载体质粒pLF-Eg。

转移载体质粒pRF-Eg的构建：用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化pTK-Eg获得pEL-EGFP-p75-gpt表达盒；然后插入同样用Sal Ⅰ和Pst Ⅰ消化的pMD-Rfragment载体中，即获得转移载体质粒pRF-Eg。

4、表达EGPF的重组GTPV的构建

质粒的大量提取：采用Qiagen公司的无内毒素大量质粒提取试剂盒EndoFree Plasmid Maxi Kit提取转染用质粒，具体按说明书进行。

同源重组：6孔板中BT细胞(或者Vero细胞)长满90％时，按MOI(感染复数)值为0.05，感染GTPV AV41株2h。在接毒时，培养液使用含2％血清，但不含抗生素的OPTI-MEM。然后采用脂质体Lipofectamine 2000进行转染。具体是先取两个离心管，分别先加入250μL无血清、无抗生素的OPTI-MEM。A管中加入10μL Lipofectamine 2000并混匀，B管中加入4μg质粒并混匀，室温下静置20min。然后将质粒与脂质体缓慢混合，室温静置5min，然后将质粒-脂质体混合物按500μL/孔比例加入到6孔板中。37℃5％CO₂培养8～12h，吸弃液体，用PBS洗涤1遍。最后，加入新鲜维持液置37℃5％CO₂培养。第3d，细胞开始出现病变，大约第7d，80％的细胞出现CPE，即收获重组病毒。将细胞吹下后，-80℃反复冻融三次，-20℃冻存。

重组病毒的加压筛选和纯化：6孔板中BT细胞长满80％时，用gpt选择培养基(MEM，2％血清，25μg/mL MPA，250μg/mL xanthine，15μg/mL hypoxanthine)事先处理12～24h。将收取的转染病毒液取出，反复冻融3次，超声裂解5min，每次10s，间隔10s。每孔细胞加入200μL病毒液，感作1～2h后，更换为gpt选择培养基37℃5％CO₂培养。第3～4d出现CPE后，置荧光显微镜检查是否有荧光斑出现。用含胰酶的无菌滤纸片挑出有荧光的蚀斑；转至12孔板继续进行筛选和蚀斑纯化。如此重复3～5个循环。

重组病毒的鉴定：对于缺失ORF5～ORF19的重组病毒用PCR方法(采用左侧重组臂LL引物对和EGFP引物对，EGFP1：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGA-3’和EGFP2：5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’，体系和程序同前)进行鉴定，结果亲本毒株AV41可以扩增出1.66kb的LL条带(用LL引物对)，但扩增不出0.72kb的EGFP基因条带(用EGFP引物对)；而重组病毒可以扩增出EGFP基因条带但扩增不出1.66kb的LL条带。对于缺失ORF149～ORF151的重组病毒同样采用PCR方法(采用左侧重组臂RL引物对和EGFP引物对)进行鉴定，结果亲本毒株AV41可以扩增出1.66kb的RL条带但没有EGFP基因条带，而重组病毒可以扩增出EGFP基因条带但没有1.66kb的RL条带。另外，还可以用荧光方法进行鉴定，重组病毒感染的细胞呈现明亮的绿色荧光，而AV41感染的细胞无绿色荧光。最后分别将获得的两株重组病毒命名为vLF-Eg和vRF-Eg。

重组病毒生长曲线的测定：将两重组病毒vLF-Eg、vRF-Eg与AV41亲本病毒各接种1块有BT细胞单层的12孔细胞培养板(10⁴ TCID₅₀/孔)，37℃吸附2h，用DMEM洗涤3次，弃去上清液，加入DMEM维持液，于37℃5％CO₂培养。分别在接种后病毒生长24、48、72、96、120和144h时，收集细胞，测定病毒的TCID₅₀。结果表明，两株重组病毒与亲本病毒的生长曲线基本一致。在48h～96h期间，病毒处于快速增殖期，病毒滴度迅速升高，vRF-Eg增速较慢，毒价比亲本毒低1个数量级，而vLF-Eg与亲本毒几乎一致；96h～120h期间，病毒生长趋缓，vRF-Eg与亲本毒滴度仍相差1个数量级左右；120h以后，病毒增殖缓慢，毒价基本不再增加。

重组病毒稳定性试验：将两重组病毒vLF-Eg、vRF-Eg分别在BT细胞上连续传15代，观察荧光信号，并测定病毒滴度。结果两重组病毒在连传15代期间，绿色荧光蛋白始终能被稳定遗传并正确表达，病毒滴度亦保持稳定。

表1 重组病毒vLF-Eg和vRF-Eg各代次病毒滴度

Claims (9)

1.一种山羊痘病毒(GTPV)复制非必需区片段的筛选方法，其包括下述步骤：

(1)根据病毒基因组某区域两端序列设计引物，以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为材料，通过PCR扩增该区域两侧基因组片段分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；

(2)将两侧重组臂相连，然后在两个重组臂中间插入报告基因和筛选基因的表达盒，构建转移载体质粒；

(3)将转移载体质粒与GTPVAV41株共转染原代牛睾丸细胞或者非洲绿猴肾细胞，Vero细胞，然后筛选重组GTPV；

(4)通过病毒复制效率证实所选基因组区域为GTPV的复制非必需区。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(1)所述的基因组区域是包括病毒基因组ORF5到ORF19，即，参照Genbank登录号为NC_004003的Pellor株GTPV全基因组序列，位于2162nt～13249nt的片段；或者是包括ORF149到ORF151，即位于142573nt～145807nt的基因组片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(1)所述的同源重组左侧臂是病毒基因组ORF3到ORF6，位于1281nt～2941nt，的基因组片段，同源重组右侧臂是位于12316nt～13865nt的ORF19到ORF20，的基因组片段。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(1)所述的同源重组左侧臂还可以是病毒基因组ORF148到ORF149的基因组片段，位于141772nt～143440nt；同源重组右侧臂还可以是ORF151到ORF152的基因组片段，位于144942nt～146012nt。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(2)所述的报告基因是EGFP基因。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(2)所述的筛选基因是gpt基因。

7.重组GTPV的通用转移载体，其特征在于：(1)具有权利要求3和4所述的同源重组左侧臂和右侧臂；(2)筛选基因为黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因；(3)报告基因为绿色荧光蛋白(EGFP)基因；(4)在gpt基因侧翼含有独特的单一酶切位点Sal I，或者插入其它目的基因表达盒。

8.根据权利要求7所述的通用转移载体，其特征在于，所述的其它目的基因可以是病毒、细菌或者寄生虫的抗原基因、致病基因、肿瘤相关基因，人、畜、禽免疫调节基因以及其它动物的免疫基因。

9.重组GTPV vLF-Eg和vRF-Eg，其特征在于，由权利要求7和8所述的通用转移载体所获得；并且vLF-Eg基因组缺失了ORF5到ORF19共15个ORF，而vRF-Eg基因组缺失了ORF149到ORF151共3个ORF。

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